JP2011132145A - 固定化タンパク質の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】担体上に、リジン及びシステインを含まない介在タンパク質を介して配向が制御された形態で、共有結合により固定化された固定化タンパク質を作製する方法であって、介在タンパク質のカルボキシ末端又はアミノ末端のいずれか一方を担体の表面に共有結合により固定化し、その後、担体上に固定化された介在タンパク質中のアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基又はカルボキシ末端のカルボキシル基と固定化を目的とするタンパク質中のリジン残基の側鎖のアミノ基とをアミド結合を介して、少なくとも1か所で結合させることにより、目的タンパク質を共有結合により担体に結合させる、固定化タンパク質の作製方法。
【選択図】なし
Description
タンパク質は、アミノ酸の連鎖により構成されるが、通常、特定の立体構造を形成することにより、その機能、例えば、特異的認識結合機能や触媒機能など他の高分子では到底できない機能を発現する。そのようなタンパク質の機能を幅広く活用する手段として、担体と呼ばれる不溶性の基板、ビーズ、繊維、膜又は可溶性のポリマーなどに結合させること(固定化すること)が行われている。固定化したタンパク質は、クロマトグラフィーなどの物質分離やバイオセンサー、リアクター、除去剤、ウイルス分離など幅広い分野での利用が進んでいる。
当該技術分野の当業者にとって自明なこととして、目的タンパク質を担体に固定化する方法としては、固定化反応の形態に応じて、物理吸着と化学的結合の二つに大きく分けられること、また、化学結合の場合も、イオン結合など可逆的結合と共有結合などによる不可逆的結合に分けることができること、物理吸着や可逆的化学結合による固定化は、固定化方法としては、温和で且つ簡便であるが、固定化タンパク質が使用される環境条件として、溶液のpH、塩濃度、温度などの変化に対応できない場合が多く、その利用は非常に限定されること、従って、固定化タンパク質の幅広い用途を目指す場合、共有結合による固定化が望ましいことなどがあげられる。
抗体は、抗体医薬品としての利用に限らず、それぞれの分子種がそれぞれ、非常に特異的にある特定の物質を認識して結合することから、診断などを含む各種分析に幅広く利用されるだけでなく、抗体そのものをアフィニティリガンドとして利用することにより、分離精製用担体としても利用できる。各種分析や分離に抗体を利用する場合は、抗体分子を不溶性基板又は担体に固定化した形、すなわち、固定化抗体の形状とすることが便利である。たとえば、96穴イムノプレートに抗体分子をいわゆる物理吸着により固定化することにより、簡便なイムノアッセイ系を構築することができる。また、不溶性担体基材の表面に官能基を導入し、抗体のアミノ酸側鎖と化学的に結合させた形で固定化することが行われている。しかしながら、このような形態で抗体の固定化を行った場合、担体の表面上での抗体分子の結合様式を整えることは原理的に不可能であり、極端な場合は、抗体分子の物質認識能に必須な部位が利用できない形での固定化が生じ、物質認識能に大きく影響する可能性がある。このことを固定化された抗体の配向性という観点で考えると、分子としてまったく不均質な形での固定化抗体と言わざるを得ない。このような不均質な固定化により抗体分子の機能、すなわち、抗原との結合能力が、抗体分子の変性、無秩序な配向や化学修飾などにより、低下することが報告されている(非特許文献3〜5を参照)。従って、より均質な固定化抗体の製造が望まれている。
[1] 担体上に、リジン及びシステインを含まない介在タンパク質を介して配向が制御された形態で、共有結合により固定化された固定化タンパク質を作製する方法であって、介在タンパク質のカルボキシ末端を担体の表面にアミド結合を介して共有結合により固定化し、その後、担体上に固定化された介在タンパク質中のアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基と固定化を目的とするタンパク質中のリジン残基の側鎖のアミノ基とをアミド結合を介して、少なくとも1か所で結合させることにより、目的タンパク質を共有結合により担体に結合させる、固定化タンパク質の作製方法。
[2] 担体上に、リジン及びシステインを含まない介在タンパク質を介して配向が制御された形態で、共有結合により固定化された固定化タンパク質を作製する方法であって、介在タンパク質を、担体の表面にアミノ末端のαアミノ基を介して共有結合により固定化し、その後、担体上に固定化された介在タンパク質中のアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基又はカルボキシ末端のカルボキシル基と固定化を目的とするタンパク質中のリジン残基の側鎖のアミノ基とをアミド結合を介して、少なくとも1か所で結合させることにより、目的タンパク質を共有結合により担体に結合させる、固定化タンパク質の作製方法。
[3] 担体が不溶性担体である、[1]又は[2]の固定化タンパク質の作製方法。
[4] 介在タンパク質が抗体結合機能を有するタンパク質であり、目的タンパク質がイムノグロブリンである、[1]〜[3]のいずれかの固定化タンパク質の作製方法
[5] 介在タンパク質が、プロテインA、プロテインG及びプロテインLからなる群から選択されるタンパク質由来の抗体結合ドメインの改変タンパク質であり、リジン残基及びシステイン残基を含まない改変タンパク質である、[4]の固定化タンパク質の作製方法。
[6] 担体上に固体化する目的タンパク質が、ヒトポリクローナル抗体、抗IL8抗体、アバスチン、ハーセプチン及びリツキサンからなる群から選択される[1]〜[5]のいずれかの固定化タンパク質の作製方法。
抗体の配向制御固定化
本発明の固定化タンパク質は限定されず、特定の機能を有するあらゆるタンパク質が含まれる。その中でも、結合能を有するイムノグロブリンG、特にモノクローナル抗体があげられる。
[抗体及びモノクローナル抗体の入手方法]
抗体は、免疫系を有する生物が作り出すタンパク質であり、抗原に対して特異的に結合する機能を有することから、抗体の物質認識機能を人工的に利用することが幅広く行われている。また、一つの抗原を認識結合できる抗体としては、各種生物由来又は同一の生物種由来でも数多くのタンパク質分子が分離されている。それらのうちでも、利用価値の高い抗体は、市販されており、ある抗原に対して特異的に結合できる抗体については、多くは、市販品として入手できる。入手できない場合でも、免疫動物に対して目的抗原を免疫することにより、当業者であれば目的抗体を作製することができる。従って、固定化抗体を作製する際に、抗体の入手には、ほぼ制限がなく、入手できることから、抗体タンパク質の入手により本発明は制限を受けないことは自明である。
本発明において介在タンパク質として抗体との共有結合による配向制御固定化に利用されるタンパク質としては、すでに、本発明者らが発明している、リジン及びシステイン残基を全く含まず且つアミノ末端又はカルボキシ末端1箇所で担体と共有結合により結合した固定化タンパク質が挙げられる(特開2008-115151号公報、特開2008-115152号公報、特開2008-115153号公報、特開2008-266219号公報、特開2008-266221号公報、特開2008-280259号公報)。
一般式(1) R1-R2-R3-R4-R5
[式中、配列は、アミノ末端側からカルボキシ末端側に向かう配列を示し、
R1部分の配列は、固定化対象タンパク質の配列であり、リジン残基及びシステイン残基を含まないことを特徴とする配列であり;
R2部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成されるスペーサー配列であり;
R3部分の配列はシステイン−X(Xは、リジン又はシステイン以外のアミノ酸残基)で表される2残基のアミノ酸で構成される配列であり;
R4部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン残基及びシステイン残基を含まない配列であり、一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列であり;そしてR5部分の配列はタンパク質を精製するためのアフィニティータグ配列である]
リジン残基及びシステイン残基を全く含まない改変(変異)プロテインAドメイン又は改変プロテインGドメインのカルボキシ末端側1箇所で固定化したのち、マスク反応を施した固定化タンパク質を用い、これをカルボジイミドとスクシイミドで処理することにより、固定化された改変プロテインAドメイン又は改変プロテインGドメインのアスパラギン酸残基とグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基をスクシイミド化することができる。スクシイミド化されたカルボキシル基は、アミノ基と強い反応性を有し、反応によりアミド結合を形成する。従って、スクシイミド化した固定化担体を抗体タンパク質と混合することにより、抗体分子中のリジン残基のアミノ基又はアミノ末端のアミノ基は、改変プロテインAドメイン又は改変プロテインGドメインのアスパラギン酸残基とグルタミン酸残基の側鎖のスクシイミド化したカルボキシル基と反応して、アミド結合を形成することにより、共有結合で結合する。この反応は、改変プロテインAドメイン又は改変プロテインGドメインが、抗体分子のFcドメインと特異的に結合することから、非常に限定されたアミノ酸側鎖間で優先的に形成される。このことは、実施例において顕著に示され、抗体結合能を失った改変プロテインAドメインを用いた場合、抗体との結合反応がほとんど起こらないこと、さらに、介在タンパク質を固定化した担体と抗体タンパク質と混合した後、できるだけ速やかに、洗浄することにより、非特異的結合を避けることにより達成できる。固定化反応後、介在タンパク質中のスクシイミド化したカルボキシル基は、エタノールアミンなどで処理することによりマスクすることができる。
本発明に用いられる担体としては、タンパク質分子より大きければどのようなものでもよく、可溶性又は不溶性のいずれでもよい。
上記のように、抗体分子を固定化した固定化タンパク質を例に本発明を詳細に説明したが、上述のように、固定化目的タンパク質と介在タンパク質との組み合わせは無限にあり、リジン及びシステインを全く含まない介在タンパク質は、当業者であれば創製できることは自明であることから、本発明の固定化タンパク質は、対象となるタンパク質によって制限を受けず、どのようなタンパク質も適用が可能である。例えば、目的タンパク質として、Affibody(登録商標) Moleculeなる一群の小タンパク質が開発、販売されており、各々の小タンパク質はそれぞれ特異的にある目的タンパク質だけと結合することが公知である。Affibody(登録商標) Moleculeは、Staphylococcus aureus由来のプロテインAのBドメイン由来のタンパク質の配列を改変する事により創製されているが、その配列中には、リジン残基が含まれているが、元の機能を保ったままリジン残基部分を他のアミノ酸に変換することは、本発明者らがStaphylococcus aureus由来のプロテインAのAドメインを用いてすでに示しているように、当事者であれば達成できる(特開2008-115151号公報、特開2008-115152号公報、特開2008-115153号公報、特開2008-266219号公報、特開2008-266221号公報、特開2008-280259号公報)。従って、本発明の技術は、対象とするタンパク質によって制限を受けないことは明らかであり、一般性が保たれる。
ヒトポリクローナル抗体は、市販品を用いた。抗IL8ヒト型モノクローナル抗体は、CHO細胞としてATCCCRL-12445株を培養し、培養上清から精製したものを用いた。ヒトモノクローナル抗体、アバスチン、ハーセプチン、リツキサンは、医薬品として販売されているものを用いた。
介在タンパク質を導入した担体約0.1mLをスピンカラムに入れ、10mMのホウ酸緩衝液、pH8.5、0.4mLを加え、3000回転2分の遠心操作を行い、緩衝液をカラムに通し、担体を含んだカラムの洗浄工程とした。カラムから溶出される緩衝液は、1.5mLのエッペンドルフタイプの遠心チューブで受けた。溶出された緩衝液を廃棄し、スピンカラムに再度ホウ酸緩衝液を加え、同じように遠心工程を行い、この工程を3回繰り返すことにより、担体の洗浄を行った。
モノリス担体に改変プロテインA又は改変プロテインGを導入した担体を用いた場合の経過をまず詳細に示す。
抗体濃度:0.34mg/mL
アプライした抗体タンパク質総量 (これを、Aとする。): 0.34mg×0.8mL=0.272mg
非吸着タンパク質総量:
改変プロテインA担体: 0mg
改変プロテインG担体: 0mg
洗浄工程1溶出タンパク質:
改変プロテインA担体: 0.008mg
改変プロテインG担体: 0.068mg
洗浄工程2溶出タンパク質:
改変プロテインA担体: 0.072mg
改変プロテインG担体: 0.024mg
ブロッキング工程溶出タンパク質:
改変プロテインA担体: 0mg
改変プロテインG担体: 0mg
非固定化タンパク質総量 (これを、Uとする。)
改変プロテインA担体: 0.080mg
改変プロテインG担体: 0.092mg
固定化タンパク質総量 (これを、Bとする。)
改変プロテインA担体: 0.192mg
改変プロテインG担体: 0.180mg
固定化効率=100×(固定化タンパク質総量(B))/(アプライした抗体タンパク質総量(A)−非吸着タンパク質総量(U))
で計算されることから、
固定化効率 (E=100×B/(A−U)の計算式)
改変プロテインA担体: 約71%
改変プロテインG担体: 約66%
という結果であった。
上記と同様にして、担体基材、介在タンパク質、抗体の組み合わせを変えて各種実験を行った。抗体の固定化量の測定は、介在タンパク質を固定化した担体を0.4mL(スピンカラムの場合は、そのまま)、アプライする抗体タンパク質総量を約0.4mgとして行った。表1は、その結果をまとめたものであり、固定化されたタンパク質の総量(B)と、固定化効率(E)をまとめて示している。本測定においては、介在タンパク質の固定化量を最適化していないのと、その固定化量を測定していないが、介在タンパク質が同じ場合、固定化効率にばらつきが少ないため、固定化される抗体タンパク質の総量は、介在タンパク質の量に依存することが明らかである。
上記3で得られたヒト抗IL8ヒト型抗体を固定化したスピンカラムを用いて、市販品として売られているヒトIL8ペプチドを用いて、結合溶出実験を行った。
アプライしたペプチド総量: 0.1mg×0.8mL=0.08mg
非吸着ペプチド総量: 0.002
洗浄工程溶出ペプチド総量:0mg
溶出工程タンパク質総量:0.074mg
吸着効率=100×(アプライしたペプチド総量−非吸着IL8ペプチド総量)/アプライしたIL8ペプチド総量=約98%
溶出回収効率=100×溶出工程タンパク質総量/アプライしたペプチド総量=約93%
という結果であった。
2 介在タンパク質
3 固定化タンパク質(目的タンパク質)
4 固定化タンパク質の固定化部位(ドメイン)
5 固定化タンパク質の機能発現部位(ドメイン)
6 共有結合
7 架橋試薬による結合・修飾
Claims (6)
- 担体上に、リジン及びシステインを含まない介在タンパク質を介して配向が制御された形態で、共有結合により固定化された固定化タンパク質を作製する方法であって、介在タンパク質のカルボキシ末端を担体の表面にアミド結合を介して共有結合により固定化し、その後、担体上に固定化された介在タンパク質中のアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基と固定化を目的とするタンパク質中のリジン残基の側鎖のアミノ基とをアミド結合を介して、少なくとも1か所で結合させることにより、目的タンパク質を共有結合により担体に結合させる、固定化タンパク質の作製方法。
- 担体上に、リジン及びシステインを含まない介在タンパク質を介して配向が制御された形態で、共有結合により固定化された固定化タンパク質を作製する方法であって、介在タンパク質を、担体の表面にアミノ末端のαアミノ基を介して共有結合により固定化し、その後、担体上に固定化された介在タンパク質中のアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基又はカルボキシ末端のカルボキシル基と固定化を目的とするタンパク質中のリジン残基の側鎖のアミノ基とをアミド結合を介して、少なくとも1か所で結合させることにより、目的タンパク質を共有結合により担体に結合させる、固定化タンパク質の作製方法。
- 担体が不溶性担体である、請求項1又は2に記載の固定化タンパク質の作製方法。
- 介在タンパク質が抗体結合機能を有するタンパク質であり、目的タンパク質がイムノグロブリンである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の固定化タンパク質の作製方法
- 介在タンパク質が、プロテインA、プロテインG及びプロテインLからなる群から選択されるタンパク質由来の抗体結合ドメインの改変タンパク質であり、リジン残基及びシステイン残基を含まない改変タンパク質である、請求項4記載の固定化タンパク質の作製方法。
- 担体上に固体化する目的タンパク質が、ヒトポリクローナル抗体、抗IL8抗体、アバスチン、ハーセプチン及びリツキサンからなる群から選択される請求項1〜5のいずれか1項に記載の固定化タンパク質の作製方法。
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