JP5205465B2 - ペプチドハイブリッドを用いた配向性が調節された抗体単分子膜の製造方法 - Google Patents
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Description
1)カルボキシル基を含む固体基板のカルボキシル基を活性化させる工程と、
2)本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドを、工程1)のカルボキシル基が活性化した固体基板に付着させる表面処理工程と、
3)工程2)の表面処理された固体基板にタンパク質を結合させる工程と
からなるタンパク質単分子膜の製造方法、及びそれによって製造された本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理されたタンパク質固定用基板を提供する。
1)前記免疫センサーに固定された抗体に特異的に結合する抗原を加えた後、洗浄する工程と、
2)工程1)の洗浄された免疫センサーに試料を加えた後、洗浄する工程と、
3)前記抗体と抗原との間の抗原抗体反応を検出する工程と
を含む、試料中の抗体の検出方法を提供する。
H2N(CH2CH2O)nCH2CH2COXDC*AWHLGELVWC*T−CONH2
(n=1〜50;X=DD、DE、EEまたはED;C*:ジスルフィド結合;XDC*AWHLGELVWC*T:配列番号1ないし4;配列番号1:DDDC*AWHLGELVWC*T;配列番号2:DEDC*AWHLGELVWC*T;配列番号3:EEDC*AWHLGELVWC*T;配列番号4:EDDC*AWHLGELVWC*T)
(RTY) 4 K 2 KGNHCH2CH2(OCH2CH2)nOCH2CH22O−Cys−NH2
(n=1〜50;(RTY) 4 K 2 KG:構造式4)
H 2 NGHWRGWVS−NH(CH2CH2O)nCH2CH2CO−Cys−NH2
(n=1〜50;GHWRGWVS:配列番号5)
H2N(CH2CH2O)2CH2CH2COEDDC*AWHLGELVWC*T−CONH2
(C*:ジスルフィド結合;EDDC*AWHLGELVWC*T:配列番号4)
1)カルボキシル基を含む固体基板のカルボキシル基を活性化させる工程と、
2)本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドを工程1)の固体基板に付着させる表面処理工程と、
3)工程2)の表面処理された固体基板にタンパク質を結合させる工程と
からなるタンパク質単分子膜の製造方法、及びそれによって製造された本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理されたタンパク質固定用基板を提供する。
1)前記免疫センサーに固定された抗体に特異的に結合する抗原を加えた後に洗浄する工程と、
2)工程1)の洗浄された免疫センサーに試料を加えた後、洗浄する工程と、
3)前記抗体と抗原との間の抗原抗体反応を検出する工程と
を含む、試料中の抗体の検出方法を提供する。
本発明者等は、表1の配列番号1ないし5及び構造式4からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む構造式1ないし3で表わされるペプチドハイブリッドからタンパク質固定用ペプチドハイブリッドを製造した。
H2N(CH2CH2O)nCH2CH2COXDC*AWHLGELVWC*T−CONH2
(n=1〜50;X=DD、DE、EEまたはED;C*:ジスルフィド結合;XDC*AWHLGELVWC*T:配列番号1ないし4;配列番号1:DDDC*AWHLGELVWC*T;配列番号2:DEDC*AWHLGELVWC*T;配列番号3:EEDC*AWHLGELVWC*T;配列番号4:EDDC*AWHLGELVWC*T)
H2N(CH2CH2O)2CH2CH2COEDDC*AWHLGELVWC*T−CONH2
(C*:ジスルフィド結合;配列番号4:EDDC*AWHLGELVWC*T)
(RTY) 4 K 2 KGNHCH2CH2(OCH2CH2)nOCH2CH22O−Cys−NH2
(n=1〜50;(RTY) 4 K 2 KG:構造式4)
H 2 NGHWRGWVS−NH(CH2CH2O)nCH2CH2CO−Cys−NH2
(n=1〜50;GHWRGWVS:配列番号5)
ヒト(HIgG1、HIgG2、HIgG3)、ウサギ、マウス(MIgGA、MIgG1、MIgG2、MIgG3)、ヤギなど多様な由来及び異なるアイソタイプ(isotype)を有する様々な免疫グロブリンGと、抗体固定に用いた(3−アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTS)、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)及び1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、エタノールアミン、無水コハク酸−DMFなどの溶液は、シグマアルドリッチ(Sigma−Aldrich、米国)から購入した。C−反応性タンパク質(CRP)及びウサギ抗−CRP抗体は、Calbiochem(米国)から購入し、抗体標識に用いたCy3−モノ NHS エステルは、GEヘルスケア(GE Healthcare、韓国)から購入した。表面プラズモン共鳴の測定のためのCM−5 Auセンサーチップは、Biacore AB(スウェーデン)から、磁性微細粒子(Dynabeads MyOneTM カルボン酸)は、DYNAL(米国)から、ガラス板はコーニング(Corning、韓国)から購入した。
<3−1>タンパク質固定用ペプチドハイブリッドの配向性固定化
表面にカルボキシル基を有する固体基板に実施例1で得たタンパク質固定用ペプチドハイブリッドを固定化した。
実施例3−1の方法で得たタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理されたチップと実施例2の抗体とを結合させた。
実施例3−1ないし3−2で抗体結合力が確認された1aと抗体の間の結合親和力を測定した。
1aハイブリッドによって固定された抗体の抗原結合力を測定した。
実施例3−1の方法で得た1aタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理されたチップ上に、ウサギ抗−CRP抗体を5μg/mlの濃度で含むPBS緩衝溶液を、10μl/分の速度で流しながら固定した後、同一濃度のCRPを含むPBS緩衝溶液を流しながら、抗原抗体結合程度をBiacore 3000機器を用いて表面プラズモン共鳴法(SPR)によって測定した。20mM NaOH溶液を用いてチップ表面を再生させて、抗原抗体結合測定実験を繰り返した。
デキストランCM−5 Auセンサーチップ(Biacore AB、スウェーデン)上に、0.2M EDCと0.05M NHSとを混合した緩衝溶液を7μl/分の速度で流して、センサーチップ表面のカルボキシル基を活性化させた。続いて、5μg/mlの抗−CRP抗体を含むPBS緩衝液を同一速度で30分間流した。前記抗体は、NHSエステル形態で活性化したセンサーチップの上で、末端アミノ基の反応を通じて結合した。最後に、前記抗体と反応しない未反応表面を、pH8.5、1Mエタノールアミン溶液を用いて不活性化させた。
<5−1>1aタンパク質固定用ペプチドハイブリッドの配向性固定化
表面にカルボキシル基を有する磁性微細粒子に、実施例1で得て実施例3によって抗体結合力が確認された1aタンパク質固定用ペプチドハイブリッドを固定化した。
1aが導入された磁性微細粒子と抗体との結合を確認するために、磁性微細粒子の最終濃度は2mg/ml、実施例3−2で用いたものと同一の抗体は0.1mg/mlになるように混合した後、結合を誘導した。室温で1時間反応させた後、磁石を用いて磁性微細粒子を容器の底に引き寄せながら上澄み液を除去した後、再び緩衝液で5回反覆希釈して、反応しない抗体をすべて除去した。続いて、抗体を含んだ磁性微細粒子を、還元剤(2−メルカプトエタノール)を含むPAGEサンプル緩衝液(loading buffer)に入れて加熱し、抗体鎖を微細粒子で分離させた後、PAGEで分析した。
1aタンパク質固定用ペプチドハイブリッドの抗体結合力を測定した。
ガラス板を95%の硫酸と5%の過酸化水素(容積比3:1)との混合溶液で60℃で30分間処理した後、蒸留水とエタノールで洗浄した。洗浄したガラス板を1%APTSに浸して、室温で4時間反応させてアミノ基を導入した。アミノ基が導入されたガラス板を1M 無水コハク酸−DMF溶液中で37℃で4時間反応させて、ガラス板上にカルボキシル基を生成させた。ガラス板を蒸留水及びエタノールで洗浄して、窒素ガスを用いて乾燥した後、真空乾燥器に入れて保管した。カルボキシル基が導入されたガラス板を、0.1M EDCと0.025M NHSとの混合溶液で15分間処理して表面を活性化した。活性化したガラス板は、蒸留水で洗浄して窒素ガスで乾燥させた。1aタンパク質固定用ペプチドハイブリッド溶液の濃度が0.5mg/mlになるように、40%グリセロールを含むPBS緩衝溶液に溶解して、1μlずつをガラス板上に点滴して2時間反応させた。ガラス板に残っている未反応活性型のエステルは、pH8.5、1Mエタノールアミンを用いて不活性化させ、PBS緩衝溶液で洗浄した。
1aが導入されたガラス板と抗体との結合を、Cy3に標識された抗体を用いてその結合力を確認した。
Claims (20)
- 抗体に対する親和性を有し、配列番号1ないし4からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列からなるオリゴペプチド及び前記オリゴペプチドに共有結合で連結されたPEGからなる、抗体固定用ペプチドハイブリッド。
- 前記PEG(ポリエチレングリコール)が、分子量60ないし3000であることを特徴とする請求項1に記載の抗体固定用ペプチドハイブリッド。
- 前記ハイブリッドが、下記構造式1で表わされることを特徴とする請求項1または2に記載の抗体固定用ペプチドハイブリッド。
<構造式1>
- 前記ハイブリッドが、下記構造式1aで表わされることを特徴とする請求項1ないし3のいずれか一項に記載の抗体固定用ペプチドハイブリッド。
<構造式1a>
- 1)カルボキシル基がコーティングされた固体基板のカルボキシル基を活性化させる工程と、
2)請求項1ないし請求項4のいずれか一項の抗体固定用ペプチドハイブリッドを、工程1)のカルボキシル基が活性化した固体基板に付着させる表面処理工程と、
3)工程2)の表面処理された固体基板にタンパク質を結合させる工程と
からなるタンパク質単分子膜の製造方法。 - 前記固体基板が、CM−5 Auセンサーチップ、磁性微細粒子、ガラス板、金ナノ粒子、およびPLGAからなる群から選択される生分解性有機高分子ナノ粒子または各種(マイクロ)ウェルプレートからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項5に記載の製造方法。
- 請求項1ないし請求項4のいずれか一項の抗体固定用ペプチドハイブリッドのいずれか一つで表面処理されたタンパク質固定用基板。
- 請求項3または請求項4の抗体固定用ペプチドハイブリッドで表面処理された固体基板に、前記ハイブリッドを媒介にして抗体が固定された免疫センサー。
- 請求項8の免疫センサーに固定された抗体に試料を加えて、前記抗体と前記抗体に特異的に結合する抗原との間の抗原抗体反応を検出する工程を含む、抗原の検出方法。
- 前記抗原抗体反応検出が、SPR、酵素免疫分析、蛍光プローブを用いた蛍光分析法によって行われることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記抗原に特異的に結合する抗体発色酵素コンジュゲートを結合させて洗浄した後、前記発色酵素によって発色反応する基質を加えて前記発色を測定することによって行われることを特徴とする請求項9または10に記載の方法。
- 前記発色酵素が、HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)、GUS(β−グルクロニダーゼ)、AP(アルカリホスファターゼ)、β−Gal(β−ガラクトシダーゼ)及びルシフェラーゼからなる群から選択されることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 前記抗原に特異的に結合する抗体蛍光プローブコンジュゲートを結合させて洗浄した後、前記蛍光を測定することによって行われることを特徴とする請求項9または10に記載の方法。
- 前記蛍光プローブが、6−FAM、フルオレセイン、Cy3、Cy5及びローダミンからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 1)請求項8に記載の免疫センサーに固定された抗体に特異的に結合する抗原を加えた後に洗浄する工程と、
2)工程1)の洗浄された免疫センサーに試料を加えた後に洗浄する工程と、
3)前記抗体と抗原との間の抗原抗体反応を検出する工程と
を含む、試料中の抗体の検出方法。 - 工程3)の抗原抗体反応検出が、SPR、酵素免疫分析、および蛍光プローブを用いた蛍光分析法からなる群から選択されるいずれか一つによって行われることを特徴とする請求項15に記載の方法。
- 工程3)が、前記抗体に結合する2次抗体発色酵素コンジュゲートを結合させて洗浄した後、前記発色酵素によって発色反応する基質を加えて前記発色を測定することによって行われることを特徴とする請求項15または16に記載の方法。
- 前記発色酵素が、HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)、GUS(β−グルクロニダーゼ)、AP(アルカリホスファターゼ)、β−Gal(β−ガラクトシダーゼ)及びルシフェラーゼからなる群から選択されることを特徴とする請求項17に記載の方法。
- 工程3)が、前記抗体に結合する2次抗体蛍光プローブコンジュゲートを結合させて洗浄した後に前記蛍光を測定することによって行われることを特徴とする請求項15または16に記載の方法。
- 前記蛍光プローブが、6−FAM、フルオレセイン、Cy3、Cy5及びローダミンからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項19に記載の方法。
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