JPH04301570A - 相互に対する極めて高い特異的親和性を有するペプチド対をイン・ビトロ診断分野に使用する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は他のペプチド（ヘテロダ
イマー形成）に対する極めて高い親和性と自身（ホモダ
イマー形成）に対する低い親和性を有するある種のペプ
チドをイン・ビトロ（試験管内）診断の分野に用いるこ
とに関する。

【０００２】

【従来の技術】二つの（生体）分子が極めて相互作用し
やすいために相互に対して高い結合親和性を示すことが
できる例は多く知られている。ここで言及できる一例は
抗体・抗原間の特異的で方向性のある相互作用であり、
それに基づいて免疫学的方法が行われまたその実用化に
よりイン・ビトロ診断が極めて豊かなものとなっている
。かかる特異結合パートナー（例えばモノクローナル抗
体、レクチン、レセプターなど）の使用により、診断に
関連する高度に特異的な抗原を認識することが可能とな
った。特異性の問題のほかに、感度の問題も診断の為の
バイオコンプレックス検出にとって同程度に重要である
。

【０００３】様々な理由から、例えば共有結合的にまた
は吸着により固相に被分析物質（ａｎａｌｙｔｅ）の特
異結合パートナーを結合させる診断方法においては、こ
の特異結合パートナーを直接にではなく該被分析物質と
は反応しない別の特異結合対を介して前記固相（以下“
ユニバーサル固相”と記す）に結合させることが便利で
あることがわかっている。

【０００４】さらに、特異生体分子の使用がそれらの安
定性および有効性（ｐｏｔｅｎｃｙ）によって制限され
る方法においては、ある種の試薬例えば酵素接合体の場
合であってさえも、相当する間接的方法を用いた方がよ
いことがあること、すなわち、その特異結合パートナー
を信号発出成分に、被分析物質または第一特異結合パー
トナーとは反応しない別の特異結合対を介して結合する
ことが便利であることもわかっている。

【０００５】これによって、例えば各種被分析物質に対
する“ユニバーサル接合体”を用いることができる。

【０００６】“ユニバーサル固相”を得るには、例えば
マウス・免疫グロブリン特異試薬例えば抗−マウス抗体
または抗体特異試薬例えばプロテインＡが用いられそし
て常法により固相に適用される（Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａ
ｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎ
ｏａｓｓａｙｓ，　Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，　Ｅｌｓｅｖ
ｉｅｒ，　１９８８）。このアイデアの魅力は基本的に
、特に、このようにして調製された固相が各特異マウス
抗体を免疫反応故に方向性をもって再現性よく結合でき
ることにある。 このようにして調製された固相は原則として古典的静止
固相（“既製試薬（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ　ｒｅａ
ｇｅｎｔ）”）として、あるいは免疫反応の際の均一相
に用いることができる。

【０００７】免疫化学検出法および特異的不均一免疫化
学検出法それ自体は当業者に知られている。ここで述べ
得る既知の“ユニバーサル固相”の欠点は専ら抗体コー
ティングに限られるほか一部のアッセイ・セットアップ
に限られる（完全モノクローナルＥＬＩＳＡ方式、抗原
固相には用い得ない）ことである。

【０００８】さらに、認め得るＨＡＭＡ力価（ＨＡＭＡ
＝ヒト抗−マウス抗体）を有する検体が、モノクローナ
ル抗体をヒトにイン・ビボ（生体内）投与後に、かかる
アッセイ・デザイン、特に均一相で行われるものに対し
て極めて鋭敏に干渉することがある、従って誤った診断
が下されることがあることも知られている。

【０００９】前述のアイデアを実用化するためのもう一
つの系はビオチン／アビジンを用いたものである（例え
ば米国特許第４，２２８，２３７号）。高い生成結合力
を認め得る点でそれが特別な位置を占めることは明らか
である。この系の広範囲にわたる用途が総括論文に記載
されている（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ，　Ｖｏｌ．　１８４（１９９０），　Ａｖｉｄｉ
ｎ−Ｂｉｏｔｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｅｄ．　
Ｍｅｉｒ　Ｗｉｌｃｈｅｋ；Ｅ．Ａ．　Ｂａｙｅｒ）。

【００１０】しかしながら、このアビジン分子には、イ
ン・ビトロ診断における系のこの成分の性質から来る欠
点がある。すなわち、糖タンパク質アビジンは異常なほ
ど高い等電点（ｐＩ）を有し、ために中性ｐＨ、すなわ
ち生理学的条件のもとでは、強い陽荷電を有する分子と
して陰性に荷電した分子例えば核酸、リン脂質などと、
また荷電した表面とも強い非特異的な相互作用を示す。 さらに、糖タンパク質の微不均一性故に規定されたそし
て厳密に再現性ある生成物を得ることができないことも
知られている。さらにその分子の炭水化物部分は他の生
物学的分子（例えば“内生レクチン”）との望ましくな
い副作用のもととなり、これによって著しく感度が低下
する可能性がある。既述の引用文献には内生レクチンに
対するアビジンの望ましくない結合についての注釈が含
まれている。

【００１１】これらの欠点はストレプトミセス・アビジ
ニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｉｄｉｎｉｉ）な
る細菌からのアナローグであるストレプトアビジンを用
いることによって大方避けることができる。後者はほぼ
同レベルの対ビオチン親和性を有する。それは中性点近
くにｐＩを有し、さらに分子内に炭水化物を全くもたな
い。にもかかわらず、ストレプトアビジン／ビオチン系
についても基本的問題があり、鋭敏な干渉を生じ、また
イン・ビトロ診断に用いた場合には多分に信頼できない
結果を生じることがある。ビタミンであるビオチンがす
べての生細胞によって要求され、ためにすべての組織お
よび体液中に偏在することは知られている。すなわち、
例えばヒト血清中のビオチン濃度は約１０ｎｇ／ｍｌで
ある。この結果、すべての診断応用において、個人の生
理学的状態および個人の食癖（例えば多ビタミン製品の
摂取）に応じて様々な程度にビオチン含量が変動し得る
検体材料と試薬との間に競合が生じる。

【００１２】ストレプトアビジン／ビオチン系のイン・
ビボ使用にはもう一つの重大な潜在的干渉が伴う（Ｇ．
　Ｐａｇａｎｅｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｒａｄｉｏｌ
ｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｕｍｏｕｒ　ｐｒｅ
ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｂｙ　ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　
ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ａｄｖａｎ
ｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏ
ｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ
　ｃｌｉｎｉｃａｌｏｎｃｏｌｏｇｙ；ａｂｓｔｒａｃ
ｔｓ）。このための手順は、ビオチニル化抗体を投与後
、約３〜５日後にインジウム標識ストレプトアビジンを
投与するというものである。 アビジンおよびストレプトアビジンはいずれも高免疫原
性物質であって、ために投与後ヒトにおいて応答を招く
ことは知られている。このコンテキストではいわゆるＨ
ＡＳＡ、すなわちヒト抗−ストレプトアビジン抗体、が
挙げられ、それによって血清診断におけるアッセイ・デ
ザイン上深刻な問題を招くことがある。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、前述
の諸欠点をもたないイン・ビトロ診断用高親和性系を提
供することにある。さらに、個々の成分を確立された手
順でもって容易に、再現性よくかつ汚染されることなく
得ることも意図されている。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明方法は、ＤＮＡに
結合できまたそうすることによって転写を変調できるあ
る種のタンパク質のペプチド切片の極めて強力な相互作
用に基づいている。例えば、ｆｏｓ遺伝子生成物のｊｕ
ｎ遺伝子生成物への結合が起きると極めて強固なヘテロ
ダイマーが形成されることがわかった。さらにこの結合
は高濃度のカオトロピック物質（例えば尿素）、洗剤お
よび塩に対して、また低いｐＨ値および極めて高いｐＨ
値に対して抵抗性を示す。アミノ酸位２８５−３２４の
いわゆるｃ−Ｊｕｎプロテインのロイシン・ジッパーお
よび１６２−２０１位のｖ−Ｆｏｓプロテインのロイシ
ン・ジッパーより成る合成ペプチドについて、同等のヘ
テロダイマー結合強度が測定された。これらペプチドの
アミノ酸配列は次のとおりである： ｃ−Ｊｕｎ“ロイシン・ジッパー・ペプチド”：ＲＩＡ
ＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥ
ＱＶＡＱＬＫＱＫＶＭＮＹｖ−Ｆｏｓ“ロイシン・ジッ
パー・ペプチド”：ＬＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＬＥＤＫＫ
ＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＦＩＬＡＡＹ

【
００１５】以下の文字コードを用いた：Ａ＝アラニン、
Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン
酸、Ｇ＝グリシン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リジン、Ｌ
＝ロイシン、Ｍ＝メオチニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｑ＝
グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオ
ニン、Ｖ＝バリン、Ｙ＝チロシン。

【００１６】現在の知識水準によれば、７アミノ酸間隔
で規則的に配列されている（前式において下線を施して
ある）内部ロイシン残基は活性である。ｃ−ｊｕｎ遺伝
子生成物とは対照的に、ｃ−Ｊｕｎ“ロイシン・ジッパ
ー・ペプチド”はホモダイマー化を全く示さない。ｖ−
Ｆｏｓ“ロイシン・ジッパー・ペプチド”は完全なｖ−
ｆｏｓ遺伝子生成物と同様、大きなホモダイマー化傾向
を示さないが、（前述の如く）ｃ−Ｊｕｎ“ロイシン・
ジッパー・ペプチド”と極めて安定なヘテロダイマー複
合体を形成する（Ｅ．Ｋ．　Ｏ’ＳＨＥＡ　ｅｔ　ａｌ
．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４５，　６４６−６４８（１
９８９）およびＭ．　ＮＥＵＢＥＲＧ　ｅｔ　ａｌ．，
　Ｎａｔｕｒｅ　３４１，　２４３−２４５（１９８９
））。

【００１７】本発明にいう“ロイシン・ジッパー・ペプ
チド”は前述の如くに配列したロイシン残基を含むペプ
チドであり、そして好ましいペプチドはｃ−Ｊｕｎおよ
びｖ−Ｆｏｓ配列を含む。ｃ−Ｊｕｎおよびｖ−Ｆｏｓ
は格別に好ましい。

【００１８】意外にも“ロイシン・ジッパー・ペプチド
”は本発明に従って固相試薬、トラップ試薬としておよ
び検出試薬として用いた場合にはいずれの場合にも、複
合体安定性が極めて高いことからこのタイプの従来試薬
（プロテインＡ、プロテインＧ、ポリクローナルまたは
モノクローナル抗体）よりも優れていることがわかった
。

【００１９】本発明は相互に対する極めて高い特異的親
和性を有するペプチド（“ロイシン・ジッパー・ペプチ
ド”）対をイン・ビトロ診断領域に用いることに関する
。

【００２０】さらに、本発明は、固相に結合される特異
結合パートナーが“ロイシン・ジッパー”ペプチド対を
介して固相に結合される被分析物質の測定のための不均
一免疫化学的方法に関する。

【００２１】さらに本発明は、“ロイシン・ジッパー”
ペプチド対の一方のペプチドが吸着によりまたは共有結
合的に、直接にまたはスペーサーを介して固相に結合さ
れる、被分析物質の測定のための不均一免疫化学的方法
に用いるためのユニバーサル固相に関する。

【００２２】さらに本発明は、“ロイシン・ジッパー”
ペプチドの少なくとも一方のペプチドが検出のための特
異結合パートナーに結合され、そしてこの対の第二ペプ
チドが信号発出成分に結合される、免疫化学的方法に用
いるためのユニバーサル試薬に関する。

【００２３】さらに、本発明方法により、“ロイシン・
ジッパー”ペプチド対の第二ペプチドの１以上の分子を
検出のための特異結合パートナーに直接にまたは担体分
子または粒子を介して結合させることができ、またそう
することによって特異的に調整できる信号増加を得るこ
とができる。

【００２４】本発明は従ってさらに、“ロイシン・ジッ
パー”ペプチド対の第二ペプチドの１以上の分子が特異
結合パートナーに直接にまたは担体分子を介して結合さ
れる、イムノアッセイ信号の増加方法に関する。

【００２５】ＦｏｓおよびＪｕｎ“ジッパー・ペプチド
”および対応する完全な遺伝子生成物はいずれもそれら
の親水性の故に水に易溶なので、いずれのペプチドまた
は遺伝子生成物も固相へのカップリングに使用できる。 適当な固相は当業者に知られている。使用できる固相の
代表例は例えばプラスチック例えばポリスチレンまたは
ポリアミド例えばナイロン、などで作られたチューブま
たは成形品、メンブレン様構造または磁化できる粒子例
えば常磁性粒子などである。さらに、各ペプチドを吸着
によりまたは共有結合的に、直接にまたはスペーサー例
えば別のペプチドまたはタンパク質または比較的小さい
分子、を介して固相に結合させることができる。

【００２６】対応する相補“ジッパー・ペプチド”は例
えば抗体または抗原に自体当業者に知られた方法により
結合させることができる。抗体はモノ−またはポリクロ
ーナル−であってよい。本発明にいう抗原とはハプテン
であってもよい。

【００２７】本発明による他の使用例は、前記ペプチド
と他のリガンドおよび酵素、レセプター、サイトカイン
、リンホカイン、触媒抗体、ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）
抗体、コンプレクソン（ｃｏｍｐｌｅｘｏｎ）および他
の融合タンパク質との共有結合的連結である。共有結合
的連結は、スルクヒドリルおよびアミノ基を介して、ま
た適当なリンカーにより炭水化物残基を介して行うこと
ができる。

【００２８】これらの“ジッパー・ペプチド”のアミノ
酸配列は知られているので、現在の技術水準があれば、
またアミノ酸入手が容易であるのでバイオアベイラビリ
ティの問題は困難なものではない。技術水準として、短
時間のうちに規定された、再現性ある、そして特に汚染
されていないペプチドを与えることのできる自動ペプチ
ド合成装置がある。これによって、例えばその再現性が
被処理材料の品質に少なからず依存する時間のかかる単
離方法を使わずに済む。さらに本発明においては合成段
階にペプチドの所要の官能化を含ませることが重要であ
る。例えばロイシン・ジッパー配列の外でスルフヒドリ
ル基を介してＦｏｓジッパー・ペプチドを引き続きいず
れかの所要の担体タンパク質に共有結合的に連結させる
ことができるようにするために、例えば２個のグリシン
を介してＦｏｓジッパー・ペプチドのアミノ末端にシス
テインを合成により付加する。同様に適切な他の延長ペ
プチドに任意の所望の数のアミノ酸およびいくつかのシ
ステインを含ませるようにすることも可能であろう。こ
のようにして得られるシステインＳＨ基は次いで例えば
誘導体化および／またはモノクローナル抗体へのカップ
リングに用いることができる。

【００２９】これは、例えばマレイミド基を自体知られ
た方法により、例えばＮ−（ガンマ−マレイミドブチリ
ルオキシ）スクシンイミドと反応させることにより抗体
中に導入し、そしてＦｏｓロイシン・ジッパー・ペプチ
ドを末端システインＳＨ基を介してマレイミド二重結合
に付加させるというようにして行うことができる。この
場合に、カップリングはＭＡｂのアミノ基のうちの一つ
を介してＦｏｓペプチド中のシステインのＳＨ基に対し
て行われる。

【００３０】あるいはまた、その抗体のヒンジ領域（ジ
スルフィド橋）を介してＦｏｓまたはＪｕｎロイシン・
ジッパー・ペプチドを抗体に、連結することも可能であ
り、これは例えば自体既知の方法で末端システインＳＨ
基を介してＦｏｓロイシン・ジッパー・ペプチドのビス
−マレイミドを一官能化し、次いで未だ変化していない
導入済みの第二のマレイミド基を介して例えばジチオト
レイトールで還元してある抗体のヒンジ部チオール基に
付加することによって行うことができる。この第二の方
法には、ＦｏｓまたはＪｕｎロイシン・ジッパー・ペプ
チドの抗体への連結が抗原結合部位の外で標的のしぼら
れた仕方で行われるという長所がある。

【００３１】図１〜４はＪｕｎ−Ｆｏｓ相互作用のイン
・ビトロ診断への広範囲にわたる有益な使用についての
原理上の諸可能性を例示として概略的に示したものであ
る。既述の技術との本質的な差は、Ｊｕｎ／Ｆｏｓ相互
作用が二つの低分子量物質の高親和性系より成る点であ
る。比較的低い分子量のためにフレキシビリティの度合
が相当に高まり、従って注文にあった解決策が得られる
。それらの空間的要求が穏当であるので生体分子に対し
ペプチドをそれらの生物活性を失うことなく結合させる
ことができる。大きな立体障害により制限される方法の
制限はさほど厳しいものではない。さらにまた、低分子
量故に、合成が簡単であって、“カプラー成分”として
例えば理論上１分子あたり４結合部位というストレプト
アビジン化学量論よりも優れているだけでなく自由に設
計できる構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）が可能となる。 この直接の結果として、診断系感度は増加しかつその増
加はコントロール可能である。

【００３２】〔図の説明〕 図１：固相 これに関しては、ユニバーサル固相を提供するには以下
の手順が可能であり、またそれらは例えばポリスチレン
容器、磁性粒子、ラテックス粒子などの上で達成するこ
とができる：

【００３３】ａ）　　至適化されたコーティング法を用
いた吸着； ｂ）　　官能化された固相への化学的連結による共有結
合； ｃ）　　ジッパー・ペプチドを容易に吸着され得る担体
分子に予め共有結合的に連結した後吸着；ｄ）　　ジッ
パー・ペプチドが化学的に結合される担体分子に官能化
された固相を連結させることによる共有結合。

【００３４】特異固相は、特異結合パートナーで接合さ
れた相補ペプチドとの二次的反応におけるペプチドヘテ
ロダイマー形成を用いて調製される。

【００３５】図２：接合体 既知の方法により、ジッパー・ペプチドを所要の取込み
率をもって特異結合パートナーに接合させる。信号発出
は、第一のペプチドに相補的であっていずれかの望まし
い信号発出成分（例えば酵素、蛍光原、発光原、放射性
核種など）が連結されるペプチドとの二次的反応の後に
起きる。

【００３６】図３：増幅系 いずれかの所望の信号の増幅はジッパー・ペプチドを用
いて以下の方法により達成することができる：

【００３
７】ａ）　　抗原を認識する第一特異結合パートナーに
対する第二特異結合パートナーを数回ジッパー・ペプチ
ドで置換するかまたは立体的理由からペプチド担持担体
分子に連結する； ｂ）　　特異結合パートナーを信号発出成分と同じペプ
チドで置換する。これら二成分の“カップリング”は第
一のものに対して相補的なペプチドが所要の取込み率で
結合されている担体分子を用いて達成される；ｃ）　　
増幅は、ｂ）に記載の“カプラー成分”とペプチドを備
えた信号発出成分との間の前形成複合体を用いることに
よって行われる。

【００３８】図４：人工の対照血清／標準ジッパー・ペ
プチドに連結された第一特異結合パートナーが抗原を認
識する。二次的反応において、第一のものに対して相補
的であって、いずれかの所望の抗原性構造（例えばペプ
チド、タンパク質など）に接合され、そして信号発出成
分に連結した第二特異結合パートナーに向けられたペプ
チドとでヘテロダイマーを形成する。

【００３９】実施例および特許請求の範囲は本発明の開
示の一部を形成する。それら実施例は本発明の例示に役
立つものではあるがそれをいささかも限定するものでは
ない。

【００４０】実施例１ 段階１： マイクロタイタープレートのＪｕｎペプチドによるコー
ティング ０．１Ｍ炭酸ナトリウム中に１０μｇ／ｍｌ　Ｊｕｎペ
プチドを含有する溶液１５０μｌをデンマーク国ロスキ
ルデ（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ）のＮｕｎｃ社により供給され
たマイクロタイタープレートの１６ウエルの各々に入れ
る。希釈液を入れたアッセイプレートを２０℃で１８時
間放置し、次いでウエル内の溶液を吸引により除去し、
そしてそれらウエルをリン酸緩衝生食水（ＰＢＳ、ｐＨ
７．４）中の１０ｇ／リットルウシ血清アルブミン溶液
３００μｌを用いて３〜４回充填および吸引除去により
洗浄し、次にアッセイプレートをシリカゲル上２０℃で
乾燥する。

【００４１】段階２： マレイミド−抗体の調製 接合されるべき抗体（ＰＢＳ中４ｍｇ／ｍｌ濃度；２．
５ｍｌ）をホウ酸リチウム緩衝液（２．５ｍｌ）（調製
については下記参照）と混合する。ｐＨ７．５を有する
生成溶液に撹拌しながらジオキサン中のＧＭＢＳ（Ｎ−
ガンマ−マレイミドブチリルオキシ−スクシンイミド）
の１３ｍｇ／ｍｌ溶液０．４５ｍｌを添加する（ＩｇＧ
に対し３０倍モル過剰のＧＭＢＳに相当する）。室温で
１時間インキュベートした後、過剰の試薬をリン酸緩衝
食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２で平衡させたＳｅｐｈａ
ｄｅｘ　Ｇ−２５カラムでのゲル濾過により除去する。

【００４２】ホウ酸リチウム緩衝液、ｐＨ８．５の調製
１．２４ｇのホウ酸を水（８０ｍｌ）とジオキサン（２
０ｍｌ）の混合物に撹拌添加する。ホウ酸を溶解させな
がら固体水酸化リチウムを添加してｐＨ８．５に調節す
る。

【００４３】段階３： Ｆｏｓロイシン・ジッパー・ペプチドのマレイミド−抗
体へのカップリング 段階２における如く調製されたマレイミド−抗体（ＰＢ
Ｓ　２ｍｌ中に２ｍｇ）を１当量のＦｏｓロイシン・ジ
ッパー・ペプチド（ＰＢＳ　１００μｌ中に６４μｇ）
と共に室温で１時間インキュベートする。次いで塩化ナ
トリウム／クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．３（０
．４Ｍ塩化ナトリウムと０．０４Ｍクエン酸ナトリウム
）を用いてＡｃＡ３４カラム（直径２．５ｃｍ；高さ４
５ｃｍ）を通してのゲル濾過を行う。

【００４４】段階４： ペルオキシダーゼ−標識抗体および検出用ＴＭＢ基質の
調製 ＫＯＥＨＬＥＲとＭＩＬＳＴＥＩＮのモノクローナル抗
体調製方法（Ｎａｔｕｒｅ　２５６，　４９５，　１９
７５）により抗体を生成させ、そして同じ抗原特異性を
有する様々なモノクローナル抗体をＳＴＡＥＨＬＩ　ｅ
ｔ　ａｌ．　（Ｊ．　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　３２，　２９７−３０４，　１９
８０）により記載された方法により同定した。ゲルクロ
マトグラフィーによる精製およびリン酸緩衝食塩水（Ｐ
ＢＳ、ｐＨ７．４）に対する透析の後、モノクローナル
抗体画分含有プール（４ｍｇ／ｍｌのタンパク質）を、
ＴＡＮＡＭＯＲＩ　ｅｔ　ａｌ．　（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．　Ｍｅｔｈ．　６２，　１２３−１３１，　１９
８３）に記載の如く、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社から入手
したＮ−ガンマ−マレイミドブチリルオキシスクシンイ
ミド（ＧＭＢＳ）と引き続き反応させる。

【００４５】このようにして得られた抗体−ＰＯＤ接合
体の溶液の最終希釈液を各アッセイに用いるために作る
。接合体希釈媒質として使用されるのは、０．１Ｍ　２
−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパ
ンジオール（ＴＲＩＳ）、０．５％　ＲＴｗｅｅｎ　２
０、０．５〜１％安定化用タンパク質を含有する緩衝液
、ｐＨ７．４、である。従来技術により調製されたポリ
クローナル抗体も同様にして調節する。

【００４６】二つの貯蔵液から調製される過酸化水素お
よびテトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）を含有する基質
系または基質調製物を用いてＡｂ−ＩｇＧ／ＰＯＤ接合
体を検出する。

【００４７】貯蔵液１：ＴＭＢ二塩酸塩を二重蒸留水（
ｄｏｕｂｌｅ−ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　ｗａｔｅｒ）を撹
拌添加することにより５ｇ／リットル、すなわち１６ｍ
ｍｏｌ／リットル、の濃度となるように溶解し、そして
５Ｎ塩酸でｐＨ１．５に調節する。この溶液に撹拌しな
がらペニシリンＧを２００ｍｇ／リットル、すなわち０
．５６ｍｍｏｌ／リットル、の最終濃度となるように添
加する。

【００４８】貯蔵液２：１．４ｍｌの氷酢酸、１．５ｍ
ｌの１Ｎ　ＮａＯＨおよび２５０ｍｇ、すなわち３ｍｍ
ｏｌ、の尿素−過酸化水素アダクトの形のＨ２Ｏ２を９
００ｍｌの二重蒸留水に添加する。溶解完了後、容量を
二重蒸留水で１リットルにする。ＴＭＢ基質調製物：１
容量部の貯蔵液１と１０容量部の貯蔵液２とを混合する
。

【００４９】段階５： 本発明によるペプチドを用いたＥＬＩＳＡによる抗原測
定 段階３における如く調製された０．０１ｍｇ／ｍｌのＦ
ｏｓペプチド−抗体接合体を塩化ナトリウム／クエン酸
ナトリウム緩衝液中に含む溶液１０μｌを前述の如くペ
プチドでコーティングされたマイクロタイタープレート
のウエル内に入れる。適切な場合には１０〜３０分後に
吸引により溶液を除去しそしてそれらウエルを洗浄する
ことができる。それらのウエルに２０μｌの血清または
血漿、１０μｌのインキュベーション媒質（ＢＷ、ＯＳ
ＮＤ）を入れる。３７℃で３０分後にウエルの内容物を
吸引により除去し、そしてそれらウエルをＰＢＳ中に１
ｇ／リットルＲＴｗｅｅｎ　２０を含有する洗浄用緩衝
液で３回洗浄する。次いで接合体の最終希釈液１００μ
ｌをウエルに添加する。３７℃で３０分間インキュベー
ト後、ウエルの内容物を吸引により除去し、そして再び
３回洗浄する。 次に１００μｌのＴＭＢ基質調製物を各ウエルに添加し
、２０〜２２℃で３０分間インキュベートしそしてイン
キュベーションを１００μｌの１Ｎ硫酸を添加すること
により止める。呈色溶液の吸光度をＰＢＳを基準として
用いて４５０ｎｍの波長で測定する（Ｅ４５０）。

【００５０】実施例２ 段階１： マイクロタイタープレートのコーティング５０ｍＭ炭酸
塩緩衝液中に５μｇ／ｍｌ　ＪｕｎまたはＦｏｓペプチ
ドを含む溶液１５０μｌをロスキルデ（デンマーク）の
Ｎｕｎｃ社により供給されたマイクロタイタープレート
のウエルの各々に入れる。溶液添加したアッセイプレー
トを室温で一夜放置し、次いでウエル内溶液を吸引によ
り除去し、そしてそれらウエルを２５０μｌのリン酸緩
衝生食水を用いて充填および吸引除去することにより３
回洗浄する。次にそれらアッセイプレートを２０℃でシ
リカゲル上で放置乾燥する。

【００５１】段階２： マレイミド−抗体の調製 接合されるべき抗体（ＰＢＳ中４ｍｇ／ｍｌ濃度；１ｍ
ｌ）をホウ酸リチウム緩衝液（１ｍｌ）と混合する。ｐ
Ｈ８．０を有する生成溶液に撹拌しながらジオキサン中
のＧＭＢＳ（Ｎ−ガンマ−マレイミドブチリルオキシ−
スクシンイミド）の１３ｍｇ／ｍｌ溶液０．０１７ｍｌ
を添加する（ＩｇＧに対し３０倍モル過剰のＧＭＢＳに
相当する）。室温で１時間インキュベートした後、過剰
の試薬を５μＭ　ＴｉｔｒｉｐｌｅｘＩ含有リン酸緩衝
液、ｐＨ６．０で平衡させたＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２
５カラムでのゲル濾過により除去する。

【００５２】段階３： ＪｕｎまたはＦｏｓロイシン・ジッパー・ペプチドのマ
レイミド−抗体へのカップリング 段階２における如く調製されたマレイミド−抗体（５μ
Ｍ　Ｔｉｔｒｉｐｌｅｘ　Ｉ含有リン酸緩衝液（ｐＨ６
．０）２ｍｌ中に２ｍｇ）を１当量のＪｕｎまたはＦｏ
ｓロイシン・ジッパー・ペプチド（ＰＢＳ　１ｍｌ中に
１５ｍｇ）と共に室温で１時間インキュベートする。次
いで５０ｍＭ　ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）を用いてＳｅｐ
ｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（直径１ｃｍ；高さ１５ｃ
ｍ）を通してのゲル濾過を行う。

【００５３】段階３ａ）： 官能化されたＪｕｎまたはＦｏｓロイシン・ジッパー・
ペプチドのマレイミド−抗体へのカップリング２．１ｍ
ｇのＪｕｎまたはＦｏｓペプチドを０．２１ｍｌのＰＢ
Ｓにとり、そして９．５μｌのＳＡＭＳＡ貯蔵液（Ｓ−
アセチル−メルカプトコハク酸無水物；ＦＬＵＫＡ；ジ
オキサン１ｍｌ中に２２．２ｍｇ）と混合する。室温で
３０分間反応させた後、その溶液を６０μｌの１Ｍ　Ｎ
Ｈ２ＯＨ水溶液で処理しそして室温でさらに１５分間イ
ンキュベートする。その反応混合物を次いで５μＭ　Ｔ
ｉｔｒｉｐｌｅｘ　Ｉ含有リン酸緩衝液（ｐＨ６）を用
いてＢｉｏｇｅｌ　Ｐ２カラムで脱塩する。

【００５４】マレイミド−抗体に対する以後のカップリ
ング手順は段階３と同様にして行われる。

【００５５】段階４： 本発明によるペプチドを用いたＥＬＩＳＡによるＣＥＡ
測定 緩衝液（ＯＳＮＤ、Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ）中に段
階２における如く調製された０．０１ｍｇ／ｍｌのＦｏ
ｓペプチド−抗−ＣＥＡ抗体接合体を含むもの１００μ
ｌを前述の如くＪｕｎペプチドでコーティングされたマ
イクロタイタープレートのウエルに入れる。適切な場合
には、その溶液を３７℃で２時間後に吸引除去でき、ま
たそれらウエルをＥｎｚｙｇｎｏｓｔ洗浄用緩衝液（Ｏ
ＳＥＷ）で洗浄することができる。 ２０μｌの血清またはＣＥＡ標準および１００μｌの抗
−ＣＥＡ抗体最終希釈液（例えばポリクローナル、ウサ
ギ）（ペルオキシダーゼで標識された形のもの）をウエ
ルに入れる。３７℃で２時間の反応時間後、ウエル内容
物を吸引除去しそして洗浄用緩衝液による洗浄を再び行
う。最後に１００μｌのＴＭＢ基質調製物を各ウエルに
入れ、室温で３０分間インキュベートしそしてインキュ
ベーションを１００μｌの１Ｎ硫酸の添加により止める
。呈色溶液の吸光度をＰＢＳを基準として用いて４５０
ｎｍの波長で測定する。

【００５６】実施態様例Ａ 本発明によるペプチドを用いたＣＥＡ−ＥＬＩＳＡの標
準プロット

【表１】

【００５７】実施態様例Ｂ： ＣＥＡ　ＥＬＩＳＡの本発明によるペプチドとの相関と
他の市販ＣＥＡアッセイとの比較 実施態様例Ａと同様にして本発明ペプチドを用いたＥＬ
ＩＳＡによりＣＥＡ測定を行ったが、今度はＦｏｓペプ
チド−被覆マイクロタイタープレートとＪｕｎ−抗−Ｃ
ＥＡ接合体を用いた逆の系で行った。

【００５８】

【表２】

【００５９】結果：市販ＣＥＡアッセイキットと直接比
較することによりＣＥＡ濃度の極めて良好な相関が明ら
かとなった（相関係数　ｒ＝０．９９９）。

【００６０】段階５： 本発明ペプチドを用いたＥＬＩＳＡによるＡＦＰの測定
実施例２、段階３または３ａにおける如く調製されたＪ
ｕｎペプチド−抗−ＡＦＰ抗体接合体（ヒツジからの抗
−ＡＦＰ抗体）を実施例２、段階１における如くＦｏｓ
ペプチドでコーティングされたマイクロタイタープレー
トのウエルに１００μｌずつピペットでとり、そして３
７℃で２時間インキュベートする。それらウエルを洗浄
用緩衝液（ＯＳＥＷ、Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ）で３
回洗浄後、標準または検体を２０μｌずつ、そしてヒツ
ジからのペルオキシダーゼ−接合抗−ＡＦＰ抗体を添加
した緩衝液（ＯＳＮＤ、Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ）を
１００μｌ導入した。３７℃で２時間のインキュベーシ
ョンを再び洗浄段階（前記参照）をもって止め、そして
基質／発色原反応を実施例２、段階４における如く行う
。

【００６１】Ｊｕｎペプチド−抗−ＡＦＰ抗体は２５〜
０．５μｇ／ｍｌの濃度範囲で用いられるが、これは標
準Ｓ５（３００　ＩＵ／ｍｌ）についての４５０ｎｍに
おける測定信号が０．８Ｅの最小吸光度となるように選
択されたペルオキシダーゼ−接合抗−ＡＦＰ抗体の濃度
に適している。

【００６２】Ｊｕｎ／Ｆｏｓ　ＡＦＰアッセイの実施態
様例：Ａ）　　Ｊｕｎ−Ｆｏｓ相互作用の特異性ＩＪｕ
ｎ−Ｆｏｓ相互作用の特異性をチェックするために、様
々なペプチド被覆および未被覆マイクロタイタープレー
トを、ＪｕｎまたはＦｏｓペプチドが結合された、ある
いはペプチドが全く結合されていない抗−ＡＦＰ抗体と
組み合わせて、前述のアッセイ手順と同様に用いた。

【００６３】結果：“Ｆｏｓ固相”をＪｕｎ−抗−ＡＦ
Ｐ抗体と併用した場合にのみ、標準Ｓ５（３００　ＩＵ
　ＡＦＰ／ｍｌ）に対して標準Ｓ０（０　ＩＵ　ＡＦＰ
／ｍｌ）に対するよりも有意に高い測定信号を得ること
ができた（表３）。

【００６４】

【表３】

【００６５】Ｂ）　　Ｊｕｎ−Ｆｏｓ相互作用の特異性
ＩＩ前述のＪｕｎ／Ｆｏｓ　ＡＦＰアッセイに先立って
、１ウエルあたり各々１００μｌのＪｕｎまたはＦｏｓ
ペプチド含有緩衝液（緩衝液＝ＯＳＮＤ）を用いた３７
℃で１時間のインキュベーション段階を設けた。３回洗
浄後、以後のアッセイ手順は前述のとおりとした。

【００６６】結果：遊離Ｊｕｎペプチドを添加すること
によってのみＪｕｎ−抗−ＡＦＰ抗体のＦｏｓ−被覆固
相への結合を阻害することができた（表４）。

【００６７】

【表４】

【００６８】Ｃ）　　Ｊｕｎ／Ｆｏｓ　ＡＦＰアッセイ
の標準プロット：

【表５】

【図面の簡単な説明】

【図１】固相でのＪｕｎ−Ｆｏｓ相互作用のイン・ビト
ロ診断への使用についての原理上の諸可能性の例を概略
的に図示したものである。

【図２】接合体でのＪｕｎ−Ｆｏｓ相互作用のイン・ビ
トロ診断への使用についての原理上の諸可能性の例を概
略的に図示したものである。

【図３】（Ａ）〜（Ｃ）は増幅系でのＪｕｎ−Ｆｏｓ相
互作用のイン・ビトロ診断への使用についての原理上の
諸可能性の例を概略的に図示したものである。

【図４】人工の対照血清／標準でのＪｕｎ−Ｆｏｓ相互
作用のイン・ビトロ診断への使用についての原理上の諸
可能性の例を概略的に図示したものである。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　相互に対する極めて高い親和性を有す
   るペプチドである“ロイシン・ジッパー・ペプチド”の
   対のイン・ビトロ診断分野における使用。
2. 【請求項２】　　固相イムノアッセイにおいて“ロイシ
   ン・ジッパー”ペプチド対の一方のペプチドを吸着によ
   りまたは共有結合的に、直接にまたはスペーサーを介し
   て該固相に結合させ、そして“ロイシン・ジッパー”ペ
   プチド対の第二ペプチドを検出されるべき被分析物質を
   固定するための特異結合パートナーに結合させて被分析
   物質を検出する請求項１記載の使用。
3. 【請求項３】　　イムノアッセイにおいて、検出のため
   の特異結合パートナーを“ロイシン・ジッパー”ペプチ
   ド対の一方のペプチドに結合させ、そしてこの対の第二
   ペプチドを信号発出成分に結合させる請求項１記載の使
   用。
4. 【請求項４】　　“ロイシン・ジッパー”ペプチド対の
   第二ペプチドの１分子以上を直接にまたは担体分子を介
   して特異結合パートナーに結合させる請求項３記載の使
   用。
5. 【請求項５】　　抗原に対する特異結合パートナーを“
   ロイシン・ジッパー”ペプチドを介して、被分析物質の
   第二特異結合パートナーにより特異結合パートナーとし
   て認識される抗原性構造に連結させる請求項１記載の使
   用。
6. 【請求項６】　　固相に結合された特異結合パートナー
   を一対の“ロイシン・ジッパー”ペプチドを介して固相
   に結合させることより成る被分析物質測定のための不均
   一免疫化学的方法。
7. 【請求項７】　　固相がマイクロタイタープレートまた
   は磁気的に引きつけることのできる粒子である請求項６
   記載の方法。
8. 【請求項８】　　検出のための特異結合パートナーを、
   “ロイシン・ジッパー”ペプチド対の一方のペプチドに
   結合させ、そしてこの対の第二ペプチドに信号発出成分
   を担持させることより成る被分析物質測定のための不均
   一免疫化学的方法。
9. 【請求項９】　　“ロイシン・ジッパー”ペプチド対の
   第二ペプチドの１分子以上が特異結合パートナーに直接
   にまたは担体分子を介して結合される請求項８記載の方
   法。
10. 【請求項１０】　　イムノアッセイにおいて“ロイシン
    ・ジッパー”ペプチド対の一方のペプチドの１分子以上
    が検出のための特異結合パートナーに直接にまたは担体
    分子を介して結合され、そしてこの対の第二ペプチドが
    信号発出成分を担持する請求項１記載の使用。
11. 【請求項１１】　　“ロイシン・ジッパー”ペプチドの
    対の一方のペプチドが吸着によりまたは共有結合的に、
    直接にまたはスペーサーを介して、固相に結合されて成
    る、被分析物質測定のための不均一免疫化学的方法に用
    いるためのユニバーサル固相。
12. 【請求項１２】　　“ロイシン・ジッパー”ペプチドの
    対の少なくとも一方のペプチドが検出のための特異結合
    パートナーに結合され、そしてこの対の第二ペプチドが
    信号発出成分に結合されて成る免疫化学的方法に用いる
    ためのユニバーサル試薬。