KR101047207B1 - 항-약물 항체 분석 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포획(capture) 약물 항체 및 탐침(tracer) 약물 항체를 포함하는 이중 항원 가교 면역분석(double antigen bridging immunoassay)을 이용하여 샘플에서 약물 항체에 대한 항체를 면역학적으로 확인하는 방법으로서, 상기 포획 약물 항체가 2개 이상의 상이한 항체 부위에서 고체상에 접합된 약물 항체의 혼합물이고, 상기 탐침 약물 항체가 2개 이상의 상이한 항체 부위에서 검출가능한 표지에 접합된 약물 항체의 혼합물임을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

Description

항-약물 항체 분석{ANTI-DRUG ANTIBODY ASSAY}
본 발명은 항-약물 항체를 확인하는 방법 및 이러한 방법에 사용하기 위한 키트를 포함한다.
단일클론 항체를 사용한 표준 고체상 면역분석(solid phase immunoassay)은 고체상에 흡착된/고정된 항체(포획(capture) 항체), 항원, 및 효소에 접합된 상기 항원의 또 다른 에피토프에 대한 항체(탐침(tracer) 항체) 사이의 복합체 형성을 수반한다. 따라서, 고체상-포획 항체-항원-탐침 항체로 이루어진 샌드위치가 형성된다. 상기 샌드위치에 의해 촉진된 반응에서, 항체-접합 효소의 활성은 항온처리 배지 중의 항원 농도에 비례한다. 표준 샌드위치 방법은 포획 항체 및 탐침 항체가 한 항원의 상이한 에피토프에 결합하기 때문에 이중 항원 가교 면역분석으로도 지칭된다. 문헌(Hoesel, W., et al., J. Immunol. Methods 294 (2004) 101-110)에는 아미노 기 및 탄수화물 기에 커플링되어 있는 고정된 재조합 에리쓰로포이에틴(rhEPO)의 혼합물을 사용한 항-EPO 이중 항원 가교 분석이 기재되어 있다. 이중 항원 가교 ELISA와 같은 면역분석은 항체 약물에 대한 환자의 면역 반응을 조사하 는 데 있어서 공통된 유형의 분석이다. 문헌(Mire-Sluis, A.R., et al., J. Immunol. Methods 289 (2004) 1-16)에는 생물학적 제품에 대한 숙주 항체의 검출을 이용한 면역분석의 디자인 및 최적화에 대한 권장사항이 요약되어 있다. 이 문헌에 따르면, 잘 공지되어 있는 항-약물 항체 분석 포맷은 상당한 단점을 보인다. 항-약물 항체 분석은 예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 2005/045058호 및 제WO 90/006515호에 언급되어 있다. 항-이디오타입 항체 분석은 예를 들어, 미국 특허 제5,219,730호; 국제특허출원 공개 제WO 87/002778호; 유럽 특허 제0 139 389호; 및 유럽 특허 제0 170 302호에 언급되어 있다. 문헌(Wadhwa, M., et al., J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17)에는 생물학적 치료제에 의해 유도된 원치않는 항체의 검출, 측정 및 특징규명에 대한 방법이 기재되어 있다.
도 1은 항-약물 항체의 검출을 위한 가교 분석을 나타낸 것이다. 바이오티닐화된(biotinylated) 약물 항체(포획-BI; BI는 바이오티닐화된 것임을 표시함)가 스트렙타비딘으로 피복된 마이크로타이터 플레이트(SA-MTP)에 결합되어 있다. 항-약물 항체는 포획-BI를 디곡시제닌(digoxigenin)으로 표지된 탐침 약물 항체(탐침-DIG; DIG는 디곡시닐화된 것임을 표시함)와 가교시킨다. 고정된 복합체는 다중클론 항-디곡시제닌 호스-라디쉬 퍼록시다제(horse-radish peroxidase) 접합체(pAB<DIG>-POD)에 의해 검출된다. 다중클론 토끼 항-약물 항체(rpAB)가 표준물로 사용된다.
도 2는 실시예 1과 4의 접합체를 사용한 변이체 1의 가교 ELISA의 표준 곡선을 나타낸 것이다. 5% 인간 혈청과 함께 PBS-T-완충제(인산염 완충 식염수, 0.05 부피% Tween® 20) 중에 희석된 rpAB의 다양한 농도에 대한 광학 밀도(OD)가 표시되어 있다.
도 3은 실시예 2와 5의 접합체를 사용한 변이체 2의 가교 ELISA의 표준 곡선이다. 5% 인간 혈청과 함께 PBS-T-완충제 중에 희석된 rpAB의 다양한 농도에 대한 OD가 표시되어 있다.
도 4는 실시예 3과 6의 접합체를 사용한 변이체 3의 가교 ELISA의 표준 곡선이다. 5% 인간 혈청과 함께 PBS-T-완충제 중에 희석된 rpAB의 다양한 농도에 대한 OD가 표시되어 있다.
도 5는 실시예 1과 3의 접합체 및 실시예 4와 6의 접합체를 사용한 변이체 4의 가교 ELISA의 표준 곡선이다. 5% 인간 혈청과 함께 PBS-T-완충제 중에 희석된 rpAB의 다양한 농도에 대한 OD가 표시되어 있다.
도 6은 실시예 1, 2 및 3의 접합체 및 실시예 4, 5 및 6의 접합체를 사용한 변이체 5의 가교 ELISA의 표준 곡선이다. 5% 인간 혈청과 함께 PBS-T-완충제 중에 희석된 rpAB의 다양한 농도에 대한 OD가 표시되어 있다.
도 7은 고체 고정화를 위해 수동 흡착을 이용한 변이체 1의 가교 ELISA의 표준 곡선이다. 5% 인간 혈청과 함께 PBS-T-완충제 중에 희석된 rpAB의 다양한 농도에 대한 OD가 표시되어 있다.
본 발명은 이중 항원 가교 면역분석을 이용하여 샘플에서 약물 항체에 대한 항체를 면역학적으로 확인하는 방법 및 수단을 제공한다.
본 발명은 포획 약물 항체 및 탐침 약물 항체를 포함하는 이중 항원 가교 면역분석을 이용하여 샘플에서 약물 항체에 대한 항체를 면역학적으로 확인하는 방법으로서, 상기 포획 약물 항체가 고체상에 접합되는 항체 부위에서 상이한 2종 이상의 약물 항체를 포함하는 약물 항체의 혼합물이고, 상기 탐침 약물 항체가 검출가능한 표지에 접합되는 항체 부위에서 상이한 2종 이상의 약물 항체를 포함하는 약물 항체의 혼합물임을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 약물 항체와 그의 접합 파트너의 접합은 약물 항체의 아미노산 골격의 N-말단 및/또는 ε-아미노 기(라이신), 상이한 라이신의 ε-아미노 기, 카르복시 기, 설프히드릴 기, 히드록실 기 및/또는 페놀계 작용기, 및/또는 약물 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통한 화학적 결합에 의해 달성된다.
바람직하게는, 포획 약물 항체 혼합물은 아미노 기를 통해 접합 파트너에 접합된 약물 항체 및 탄수화물 구조를 통해 접합 파트너에 접합된 약물 항체를 포함한다.
바람직하게는, 포획 약물 항체 혼합물 및/또는 탐침 약물 항체 혼합물은 2종 이상의 상이한 아미노 기를 통해 접합 파트너에 접합된 약물 항체를 포함한다. 다양한 아미노 기를 통한 이러한 커플링은 제1 단계에서 화학적 보호제를 사용한 ε-아미노 기의 일부의 아실화 예를 들어, 시트라코닐화(citraconylation)에 의해 달성될 수 있다. 제2 단계에서, 접합은 잔존하는 아미노 기를 통해 달성된다. 그 후, 시트라코닐화는 제거되고 약물 항체는 잔존하는 자유 아미노 기를 통해 접합 파트너에 접합된다. 즉, 수득된 약물 항체는 시트라코닐화에 의해 보호되지 않은 아미노 기를 통해 접합 파트너에 접합된다.
적절한 화학적 보호제는 보호되지 않은 측쇄 아민에서 결합을 형성하고 이 결합은 N-말단에서의 결합보다 덜 안정하고 N-말단에서의 결합과 상이하다. 이러한 많은 화학적 보호제가 공지되어 있다(예를 들어, 유럽 특허출원 제0 651 761호 참조). 바람직한 화학적 보호제는 말레산 또는 시트라코닐산 무수물과 같은 환형 디카르복실산 무수물을 포함한다.
바람직하게는, 포획 약물 항체는 수동 흡착에 의해 고체상에 접합되므로 2개 이상의 상이한 항체 부위에서 고체상에 접합된다. 수동 흡착은 예를 들어, 문헌("Solid Phases in Immunoassay" 205-225; Diamandis, E.P., and Christopoulos, T.K. (Editors): Immunoassays (1996) Academic Press San Diego)에 기재되어 있다.
바람직하게는, 탐침 약물 항체 혼합물은 아미노 기를 통해 접합 파트너에 접합된 약물 항체 및 탄수화물 구조를 통해 접합 파트너에 접합된 약물 항체를 포함한다.
바람직하게는, 포획 약물 항체 대 탐침 약물 항체의 비는 1:10 내지 50:1이다(이 비는 상이할 수 있는 접합체의 분자량과 관계없이 항체 분자의 비를 의미함).
바람직하게는, 상기 혼합물에서 아미노 접합 약물 항체(탐침 또는 포획 약물 항체) 대 탄수화물 접합 약물 항체(탐침 또는 포획 약물 항체)의 비는 1:10 내지 10:1이다(이 비는 상이할 수 있는 접합체의 분자량과 관계없이 항체 분자의 비를 의미함).
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 포획 약물 항체는 특이적 결합 쌍을 통해 접합(고정)된다. 이러한 결합 쌍(제1 성분/제2 성분)은 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 아비딘/바이오틴, 항체/항원(예를 들어, 문헌(Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996) 참조), 렉틴/폴리사카라이드, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/단백질 A 및/또는 G 등이다. 바람직하게는, 포획 약물 항체는 바이오틴에 접합되고 고정화는 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 달성된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 탐침 약물 항체는 바람직하게는 특이적 결합 쌍을 통해 검출가능한 표지에 접합된다. 이러한 결합 쌍(제1 성분/제2 성분)은 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 아비딘/바이오틴, 항체/항원(예를 들어, 문헌(Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996) 참조), 렉틴/폴리사카라이드, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/단백질 A 및/또는 G 등이다. 바람직하게는, 탐침 약물 항체는 디곡시제닌 및 디곡시제닌에 대한 항체를 통해 검출가능한 표지에 접합된다. 별법으로, 탐침 약물 항체는 루테늄 비스피리딜 착물과 같은 전기화학발광 표지에 접합된다.
본 발명에 따른 용어 "약물 항체"는 개체의 샘플이 약물 항체의 투여 후 투여된 약물 항체를 포함한다고 추정되도록 상기 개체에게 투여될 수 있는 항체를 의미한다. 본 발명에 따라 수행된 한 분석에서, 약물 항체, 포획 약물 항체 및 탐침 약물 항체는 예를 들어, 동일한 발현 벡터를 사용하여 재조합적으로 제조한, 동일한 아미노산 서열을 포함하는 "동일한" 항체 분자를 포함한다. 약물 항체(단일클론 치료 항체)는 종양 질환과 같은 다양한 질환(예컨대, 비-호치킨(Hodgkin) 림프종, 유방암 및 결장직장암을 비롯한 혈액 및 고형 악성종양)의 치료에 널리 사용되고 있다. 이러한 항체는 예를 들어, 문헌(Levene, A.P., et al, Journal of the Royal Society of Medicine 98 (2005) 146-152)에 기재되어 있다. 이러한 항체는 예를 들어, CD20, CD22, HLA-DR, CD33, CD52, EGFR, G250, GD3, HER2, PSMA, CD56, VEGF, VEGF2, CEA, 레비스(Levis) Y 항원, IL-6 수용체 또는 IGF-1 수용체에 대한 항체이다. 치료 항체는 문헌(Groner, B., et al., Curr. Mol. Med. 4 (2004) 539-547; and Harris, M., Lancet Oncol. 5 (2004) 292-302)에도 기재되어 있다.
예시적 (바람직하게는 단일클론) 항체는 IL-6 수용체에 대한 항체(mAB IL-6R)이다. 이러한 항체는 예를 들어, 문헌(Mihara et al., Clin. Immunol. 98 (2001) 319-326; Nishimoto, N., et al, Blood 106 (2005) 2627-2632), 임상 시험 NCT00046774 또는 국제특허출원 공개 제WO 2004/096274호에 기재되어 있다.
예시적 (바람직하게는 단일클론) 항체는 IGF-1 수용체에 대한 항체(mAB IGF-1R)이다. 이러한 항체는 예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 2004/087756호 및 제WO 2005/005635호에 기재되어 있다.
항-약물 항체는 약물 항체의 가변 영역, 불변 영역 또는 당 구조와 같은 약물 항체의 임의의 영역에 대해 유도된 항체이다. 이러한 항-약물 항체는 항체 요법 과정 동안에 환자의 면역 반응으로서 발생될 수 있다(문헌(Pan, Y., et al., FASEB J. 9 (1995) 43-49) 참조).
단일클론 항체는 단백질이므로 다수의 반응성 측쇄를 함유한다. 항체의 이러한 반응성 화학적 기는 예를 들어, 아미노 기(라이신, 알파-아미노 기), 티올 기(시스틴, 시스테인 및 메티오닌), 카르복실산 기(아스파르트산, 글루탐산) 및 당 알코올 기이다.
본 발명에 따른 면역분석용 고체 지지체는 당업계의 현 기술수준에서 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌( Butler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23) 참조).
다양한 면역분석의 원리가 예를 들어, 문헌(Hage, D. S., Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R)에 기재되어 있다. 문헌(Lu, B., et al., Analyst 121 (1996) 29R-32R)에는 면역분석에서 사용되는 항체의 배향된 고정화가 기재되어 있다. 아비딘-바이오틴-매개 면역분석은 예를 들어, 문헌(Wilchek, M., and Bayer, E.A., Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469)에 기재되어 있다.
단일클론 항체 및 이의 불변 도메인은 단백질이므로 표면, 단백질, 중합체 예컨대, PEG, 셀룰로스 또는 폴리스티롤, 효소, 또는 결합 쌍의 구성원과 같은 결합 파트너에의 커플링을 위한 다수의 반응성 측쇄를 함유한다. 항체의 화학적 반응성 기는 예를 들어, 아미노 기(라이신, 알파-아미노 기), 티올 기(시스틴, 시스테인 및 메티오닌), 카르복실산 기(아스파르트산, 글루탐산), 및 당 알코올 기이다. 이러한 방법은 예를 들어, 문헌(Aslam M., and Dent A., Bioconjugation, MacMillan Ref. Ltd. 1998, pp. 50-100)에 기재되어 있다.
단백질의 가장 흔한 반응성 기들 중 하나는 아미노산 라이신의 지방족 ε-아민이다. 일반적으로, 거의 모든 항체들이 풍부한 라이신을 함유한다. 라이신 아민은 pH 8.0(pKa = 9.18) 이상의 상당히 우수한 친핵체이므로, 다양한 시약들과 용이하고 깨끗하게 반응하여 안정한 결합을 형성한다.
항체에서 또 다른 흔한 반응성 기는 황-함유 아미노산인 시스틴 및 이의 환원 생성물인 시스테인(또는 절반 시스틴)으로부터의 티올 잔기이다. 시스테인은 아민보다 더 강력한 친핵체이면서 일반적으로 단백질에서 가장 높은 반응성을 나타내는 작용기인 자유 티올 기를 함유한다. 티올은 일반적으로 중성 pH에서 반응성을 나타내므로 아민의 존재 하에 다른 분자에 선별적으로 커플링될 수 있다.
자유 설프히드릴 기는 상대적으로 반응성을 나타내는 기이므로, 자유 설프히드릴 기들을 가진 단백질은 종종 디설파이드 기 또는 디설파이드 결합으로서 산화된 형태의 상기 기들과 함께 존재한다. 면역글로불린 M은 디설파이드-결합 오량체의 일례이지만, 면역글로불린 G의 서브유니트(subunit)는 내부 디설파이드 가교에 의해 결합된다. 이러한 단백질에서, 디티오트레이톨(DTT)과 같은 시약을 사용한 디설파이드 결합의 환원이 반응성 자유 티올을 발생시키는 데 필요하다. 그러나, 이 방법 또한 이 항체에서 쇄 결합을 절단시키고 적절한 폴딩을 허용하는 쇄의 재조립(reassembly)은 불가능할 수 있다. 시스틴 및 시스테인 외에, 일부 단백질은 티오에테르 결합에서 황을 함유하는 아미노산 메티오닌도 갖는다. 메티오닌의 선별적인 변경은 일반적으로 달성하기 어렵고 약물 및 다른 분자들을 항체에 부착시키는 방법으로서 거의 사용되지 않는다. 문헌에는 반응성 아미노 기를 통해 다수의 설프히드릴 기를 도입하는 효율적인 방법을 제공하는 데 있어서 여러 티올화 가교 시약 예컨대, 트라우트 시약(Traut's reagent)(2-이미노티올란), 석신이미딜(아세틸티오) 아세테이트(SATA) 및 설포석신이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도]헥사노에이트(설포-LC-SPDP)의 사용이 기재되어 있다.
생체접합(bioconjugation) 기법은 화학적 또는 생물학적 수단을 이용하여 생체분자를 다른 생체 분자, 소분자 및 중합체에 연결시키는 기법이다. 이것은 항체 및 이의 단편, 핵산 및 이의 유사체(analog), 및 리포좀 성분(또는 다른 생물학적 활성 분자)을 서로 접합시키거나 유용한 성질을 부가하는 임의의 분자 기와 접합시키는 단계를 포함한다. 이 분자 기는 방사성핵종(radionuclide), 약물, 독소, 효소, 금속 킬레이트, 형광단, 햅텐 등을 포함한다.
항체에서 또 다른 흔한 반응성 기는 카르복실산(아스파르트산, 글루탐산)이다. 단백질은 C-말단 위치, 및 아스파르트산 및 글루탐산의 측쇄 내에서 카르복실산 기를 함유한다. 카르복실산이 물 중에서 상대적으로 낮은 반응성은 나타내기 때문에, 이 기를 사용하여 단백질 및 다른 생체분자들을 선별적으로 변경시키기 어렵다. 카르복실산 기를 사용한 단백질 및 다른 생체분자의 선별적 변경이 달성되는 경우, 카르복실산 기는 통상적으로 수용성 카르보디이미드의 사용에 의해 반응성 에스터로 전환되고 친핵성 시약 예컨대, 아민, 히드라지드 또는 히드라진과 반응한다. 아민-함유 시약은 단백질 상의 다른 아민의 존재 하에 활성화된 카르복실산과 선별적으로 반응하기 위해 약염기성을 나타내어야 한다. 단백질 가교는 pH가 8.0 이상으로 상승한 경우 일어날 수 있다.
소듐 페리오데이트는 탄수화물 부분(moiety) 내의 당의 알코올 부분을 알데히드로 산화시키는 데 사용될 수 있다. 각각의 알데히드 기는 카르복실산에 대해 전술한 바와 같이 아민, 히드라지드 또는 히드라진과 반응할 수 있다. 탄수화물 부분이 항체의 결정화가능성 단편(Fc) 영역 상에서 주로 발견되기 때문에, 접합은 항원-결합 부위에서 떨어져 있는 탄수화물의 부위-지정 변경을 통해 달성될 수 있다.
아민-반응성 시약은 단백질의 라이신 및 α-아미노 기와 주로 반응한다. 반응성 에스터, 특히 N-히드록시-석신이미드(NHS) 에스터는 아민 기의 변경에 가장 흔히 사용되는 시약 중 하나이다. 수성 환경에서 반응을 위한 최적 pH는 pH 8.0 내지 9.0이다. 이소티오시아네이트는 아민-변경 시약이고 단백질과 티오우레아 결합을 형성한다. 이소티오시아네이트는 (pH 9.0 내지 9.5의 최적 pH에서) 수성 용액 중에서 단백질 아민과 반응한다. 알데히드는 약한 수성 조건 하에 지방족 및 방향족 아민, 히드라진 및 히드라지드와 반응하여 이민 중간체(쉬프(Schiff) 염기)를 형성한다. 쉬프 염기는 약한 또는 강한 환원제(예컨대, 소듐 보로하이드라이드 또는 소듐 시아노보로하이드라이드)에 의해 선별적으로 환원되어 안정한 알킬 아민 결합을 유도할 수 있다.
아민을 변경시키는 데 사용되는 다른 시약은 산 무수물이다. 예를 들어, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물(DTPA)은 2종의 아민-반응성 무수물 기를 함유하는 이작용성 킬레이팅제이다. DTPA는 단백질의 N-말단 및 ε-아민 기와 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있다. 무수물 고리는 개방되어 배위 착물에서 금속에 강하게 결합할 수 있는 다가 금속-킬레이팅 아암(arm)을 생성한다.
티올-반응성 시약은 단백질 상의 티올 기에 커플링되어 티오에터에 커플링된 생성물을 형성하는 시약이다. 이 시약은 약산성 pH 내지 중성 pH에서 신속히 반응하므로 아민 기의 존재 하에 선별적으로 반응할 수 있다.
할로아세틸 유도체 예컨대, 요오도아세트아미드는 티오에터 결합을 형성하고 티올 변경에 사용되는 시약이다. 항체에서, 이 반응은 내재적으로 존재하는 시스테인 기에서 일어나거나 항체의 다양한 위치에서의 시스틴 디설파이드의 환원으로부터 발생된 시스테인 기에서 일어난다.
추가로 유용한 시약은 말레이미드이다. 말레이미드와 티올-반응성 시약의 반응은 요오도아세트아미드와 본질적으로 동일하다. 말레이미드는 약산성 pH 내지 중성 pH에서 신속히 반응한다.
아민, 히드라지드 및 히드라진은 알데히드 및 카르복실산-반응성 시약(아미드, 히드라존 또는 알킬 아민 결합의 형성)이다. 아민, 히드라지드 및 히드라진은 카르복실 기의 활성화 후 수용성 카르보디이미드에 의해 단백질의 카르복실산에 커플링될 수 있다. 아민-함유 시약은 라이신의 보다 높은 염기성 ε-아민의 존재 하에 카르보디이미드-활성화 단백질과 선별적으로 반응하여 안정한 아미드 결합을 형성하도록 약염기성을 나타내어야 한다.
아민, 히드라지드 및 히드라진은 항체 상의 탄수화물 잔기의 페리오데이트 산화에 의해 항체 상에서 발생될 수 있는 알데히드 기와 반응할 수도 있다. 이 추측에서, 쉬프 염기 중간체가 형성되는데, 상기 중간체는 소듐 시아노보로하이드라이드 수용성 환원제를 사용한 상기 중간체의 환원(약한 선별적 환원) 또는 소듐 보로하이드라이드 수용성 환원제를 사용한 상기 중간체의 환원(강한 환원)을 통해 알킬 아민으로 환원될 수 있다.
용어 "샘플"은 살아있는 생물체 또는 살아있었던 생물체로부터의 임의의 양의 물질을 포함하나 이로 한정되지 않는다. 이러한 살아있는 생물체는 인간, 마우스, 원숭이, 래트, 토끼 및 다른 동물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 물질은 임상적으로 관용적인 절차에서 가장 널리 사용되는 샘플 공급원인, 개체로부터 유래한 전혈, 혈청 또는 혈장을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
용어 "고체상"은 비-유체 물질을 의미하고 중합체, 금속(상자성, 강자성 입자), 유리 및 세라믹과 같은 물질로부터 만들어진 입자(미세입자 및 비드를 포함함); 실리카, 알루미나 및 중합체 겔과 같은 겔 물질; 중합체, 금속, 유리 및/또는 세라믹으로 만들어질 수 있는 모세관; 제올라이트 및 기타 다공성 물질; 전극; 마이크로타이터 플레이트; 고체 스트립; 및 큐빗, 튜브 또는 다른 분광계 샘플 용기를 포함한다. 분석의 고체상 성분은 "고체상"이 포획 약물 항체와 상호작용하기 위해 하나 이상의 작용 부분을 그의 표면 상에 함유한다는 점에서 상기 분석이 접촉할 수 있는 불활성 고체 표면과 구별된다. 고체상은 튜브, 스트립, 큐빗 또는 마이크로타이터 플레이트와 같은 정적 성분일 수 있거나 비드 또는 미세입자와 같은 비-정적 성분일 수 있다. 미세입자는 균일한 분석 포맷에 대한 고체상으로서 사용될 수도 있다. 단백질 및 다른 물질의 비-공유 또는 공유 부착을 허용하는 다양한 미세입자가 사용될 수도 있다. 이러한 입자는 폴리스티렌 및 폴리(메틸메타크릴레이트)와 같은 중합체 입자; 금 나노입자 및 금 콜로이드와 같은 금 입자; 및 실리카, 유리 및 금속 산화물 입자와 같은 세라믹 입자를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 참고로 도입되는 문헌(Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, May 1, 1998, 322A-327A)을 참조한다.
크로모겐(형광 또는 발광 기 및 염료), 효소, NMR-활성 기 또는 금속 입자, 햅텐, 예를 들어, 디곡시제닌은 검출가능한 표지의 예이다. 검출가능한 표지는 광활성화가능한 가교 기, 예를 들어, 아지도 또는 아지린 기일 수도 있다. 전기화학발광에 의해 검출될 수 있는 금속 킬레이트도 바람직한 신호-방출 기이고, 루테늄 킬레이트, 예를 들어, 루테늄 (비스피리딜)3 2+ 킬레이트가 특히 바람직하다. 적절한 루테늄 표지 기는 예를 들어, 유럽 특허 제0 580 979호, 및 국제특허출원 공개 제WO 90/05301호, 제WO 90/11511호 및 제WO 92/14138호에 기재되어 있다.
본 발명은 포획 약물 항체 및 탐침 약물 항체를 포함하는 이중 항원 가교 면역분석을 이용하여 샘플에서 약물 항체에 대한 항체를 면역학적으로 확인하는 방법을 제공하는데, 이때 상기 포획 약물 항체는 고체상에 접합되는 항체 부위에서 상이한 2종 이상의 약물 항체를 포함하는 약물 항체의 혼합물이고, 탐침 약물 항체는 검출가능한 표지에 접합되는 항체 부위에서 상이한 2종 이상의 약물 항체를 포함하는 약물 항체의 혼합물이다.
본 발명에 따른 방법에서 유용한 포획 약물 항체는 고체상에 접합된다. 접합은 바람직하게는 약물 항체의 아미노산 골격의 N-말단 및/또는 ε-아미노 기(라이신), 상이한 라이신의 ε-아미노 기, 카르복시 기, 설프히드릴 기, 히드록실 기 및/또는 페놀계 작용기, 및/또는 약물 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통한 화학적 결합에 의해 달성된다. 본 발명에 따른 방법에서 유용한 포획 약물 항체는 고체상에 접합된 2종 이상의 약물 항체의 혼합물인데, 이때 고체상에 접합된 상기 2종 이상의 약물 항체는 그들이 고체상에 접합되는 부위에서 상이하다. 예를 들어, 고체상에 접합된 2종 이상의 약물 항체의 혼합물은 아미노산 골격의 아미노산을 통해 고체상에 접합된 약물 항체, 및 약물 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통해 고체상에 접합된 약물 항체를 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어, 고체상에 접합된 2종 이상의 약물 항체의 혼합물은 약물 항체의 아미노산 골격의 상이한 아미노산 잔기를 통해 고체상에 접합된 약물 항체들을 포함할 수 있다. 표현 "상이한 아미노산 잔기"는 약물 항체의 아미노산 골격의 아미노산의 종류가 서로 상이한 아미노산 잔기(예컨대, 라이신과 아스파르트산 또는 티로신과 글루탐산), 또는 약물 항체의 아미노산 골격의 아미노산 잔기의 수가 서로 상이한 아미노산 잔기를 의미한다. 아미노산 잔기의 수가 상이한 아미노산 잔기를 의미하는 경우, 아미노산은 동일한 종류 또는 상이한 종류일 수 있다. 표현 "항체 부위에서 상이한" 및 "부위"는 부위의 종류, 예를 들어, 아미노산 또는 당 알코올 기의 종류가 상이하다는 것을 의미하거나, 약물 항체가 고체상에 접합된 아미노산 골격의 아미노산 수가 상이하다는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 방법에서 유용한 탐침 약물 항체도 마찬가지이다.
하기 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된 것이고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구의 범위에 기재되어 있다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 전술한 방법을 변경시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시예 1
D-바이오틴오일-아미노카프로산-N-히드록시석신이미드 에스터를 사용한 항체 mAB IL-6R의 바이오티닐화
IL-6 수용체에 대한 항체(mAB IL-6R)를 완충제(pH 8.5의 100 mM 인산칼륨 완충제(하기에서 K-PO4로 기재되어 있음))에 대해 투석하였다. 그 후, 항체 용액을 10 mg/㎖의 단백질 농도로 조절하였다. D-바이오틴오일-아미노카프로산-N-히드록시석신이미드 에스터를 DMSO에 용해시키고 1:5의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. 60분 후, L-라이신을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 150 mM NaCl로 보충된 pH 7.5의 25 mM K-PO4에 대해 투석함으로써 과량의 표지 시약을 제거하였다.
실시예 2
시트라콘산 무수물을 사용한 처리 후 D-바이오틴오일-아미노카프로산-N-히드록시석신이미드 에스터를 사용한 mAB IL-6R의 바이오티닐화
mAB IL-6R을 pH 8.4의 100 mM K-PO4에 대해 투석하였다. 그 후, 항체 용액을 20 mg/㎖의 단백질 농도로 조절하였다. 시트라콘산 무수물을 DMSO에 용해시키고 1:5의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. 120분 후, pH 8.4의 100 mM K-PO4로 평형화시킨 세파덱스® G25를 사용한 컬럼 상의 크로마토그래피로 반응을 정지시켰다. 항체 용액을 약 4 mg/㎖의 단백질 농도로 조절하였다. D-바이오틴오일-아미노카프로산-N-히드록시석신이미드 에스터를 DMSO에 용해시키고 1:5의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. 60분 후, L-라이신을 첨가하여 반응을 정지시켰다. pH 5.0의 200 mM 아세트산나트륨 완충제에 대해 투석함으로써 과량의 표지 시약을 제거하였다. 세파덱스® G25를 사용한 컬럼 상의 크로마토그래피를 이용하여 항체 용액을 150 mM NaCl로 보충된 pH 7.2의 25 mM K-PO4로 옮겼다.
실시예 3
바이오틴 히드라지드를 사용한 mAB IL-6R의 바이오티닐화
mAB IL-6R을 pH 5.5의 100 mM 아세트산나트륨 완충제에 대해 투석하였다. 그 후, 항체 용액을 20 mg/㎖의 단백질 농도로 조절하였다. 소듐 페리오데이트를 pH 5.5의 100 mM 아세트산나트륨 완충제에 용해시키고 10 mM의 최종 농도로 항체 용액에 첨가하였다. 30분 후, pH 5.5의 100 mM 아세트산나트륨 완충제로 평형화시킨 세파덱스® G25를 사용한 컬럼 상의 크로마토그래피로 반응을 정지시켰다. 항체 용액을 약 5 mg/㎖의 단백질 농도로 조절하였다. 바이오틴 히드라지드를 DMSO에 용해시키고 1:50의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. 120분 후, 소듐 보로하이드라이드를 15 mM의 최종 농도로 첨가하여 반응을 정지시켰다. 30분 후, 항체 용액을 150 mM NaCl로 보충된 pH 7.2의 25 mM K-PO4에 대해 투석하였다.
실시예 4
디곡시제닌 3-O-메틸카보닐-ε-아미노카프로산-N-히드록시석신이미드 에스터를 사용한 mAB IL-6R의 디곡시제닐화
mAB IL-6R을 디곡시제닐화 완충제(pH 8.5의 100 mM K-PO4)에 대해 투석하였다. 그 후, 항체 용액을 10 mg/㎖의 단백질 농도로 조절하였다. 디곡시제닌 3-O-메틸카보닐-ε-아미노카프로산-N-히드록시석신이미드 에스터를 DMSO에 용해시키고 1:5의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. 60분 후, L-라이신을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 150 mM NaCl로 보충된 pH 7.5의 25 mM K-PO4에 대해 투석함으로써 과량의 표지 시약을 제거하였다.
실시예 5
시트라콘산 무수물을 사용한 처리 후 디곡시제닌 3-O-메틸카보닐-ε-아미노카프로산-N-히드록시석신이미드 에스터를 사용한 mAB IL-6R의 디곡시제닐화
mAB IL-6R을 pH 8.4의 100 mM K-PO4에 대해 투석하였다. 그 후, 항체 용액을 20 mg/㎖의 단백질 농도로 조절하였다. 시트라콘산 무수물을 DMSO에 용해시키고 1:5의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. 120분 후, pH 8.4의 100 mM K-PO4로 평형화시킨 세파덱스® G25를 사용한 컬럼 상의 크로마토그래피로 반응을 정지시켰다. 항체 용액을 약 4 mg/㎖의 단백질 농도로 조절하였다. 디곡시제닌 3-O-메틸카보닐-ε-아미노카프로산-N-히드록시석신이미드 에스터를 DMSO에 용해시키고 1:5의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. 60분 후, L-라이신을 첨가하여 반응을 정지시켰다. pH 5.0의 200 mM 아세트산나트륨 완충제에 대해 투석함으로써 과량의 표지 시약을 제거하였다. 세파덱스® G25를 사용한 컬럼 상의 크로마토그래피를 이용하여 항체 용액을, 25 mM K-PO4 및 150 mM NaCl을 함유한 pH 7.2의 완충제로 옮겼다.
실시예 6
디곡시제닌-X-히드라지드를 사용한 mAB IL-6R의 디곡시제닐화
mAB IL-6R을 pH 5.5의 100 mM 아세트산나트륨 완충제에 대해 투석하였다. 그 후, 항체 용액을 20 mg/㎖의 단백질 농도로 조절하였다. 소듐 페리오데이트를 pH 5.5의 100 mM 아세트산나트륨 완충제에 용해시키고 10 mM의 최종 농도로 항체 용액에 첨가하였다. 30분 후, pH 5.5의 100 mM 아세트산나트륨 완충제로 평형화시킨 세파덱스® G25를 사용한 컬럼 상의 크로마토그래피로 반응을 정지시켰다. 항체 용액을 약 5 mg/㎖의 단백질 농도로 조절하였다. 디곡시제닌-X-히드라지드를 DMSO에 용해시키고 1:50의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. 120분 후, 소듐 보로하이드라이드를 15 mM의 최종 농도로 첨가하여 반응을 정지시켰다. 30분 후, 항체 용액을 150 mM NaCl로 보충된 pH 7.2의 25 mM K-PO4에 대해 투석하였다.
실시예 7
mAB IL-6R에 대한 항체의 검출을 위한 가교 ELISA
제1 단계에서 바이오티닐화된 mAB IL-6R을 스트렙타비딘으로 피복된 마이크 로타이터 플레이트(SA-MTP)의 웰에 접합(결합)시켰다. 접합되지 않은 (결합되지 않은) 항체를 통상의 완충제로 세정하여 제거하였다. 그 후, 샘플과 기준 표준물(5% 인간 혈청 중에 분산된 다중클론 토끼 항-mAB IL-6R 항체)을 상기 웰 내에서 항온처리하였다. 항-mAB IL-6R 항체는 고정된 mAB IL-6R에 결합되었다. 비결합된 물질을 세척한 후, 결합된 항-mAB IL-6R 항체를 디곡시제닐화된 mAB IL-6R로 검출한 후 호스-라디쉬 퍼록시다제 표지 항-디곡시제닌-항체와 함께 항온처리하였다(도 1 참조). 항체-효소 접합체는 ABTS® 기질의 착색 반응을 촉진하였다. 신호는 405 nm(기준 파장: 490 nm)에서 ELISA 판독기로 측정하였다. 각 혈청 샘플의 흡광도 값은 3회 반복하여 측정하였다.
5종의 상이한 변이체의 가교 ELISA를 수행하였다:
- 실시예 1과 4의 접합체를 사용한 변이체 1
- 실시예 2와 5의 접합체를 사용한 변이체 2
- 실시예 3과 6의 접합체를 사용한 변이체 3
- 실시예 1과 3의 혼합된 접합체 및 실시예 4와 6의 혼합된 접합체를 사용한 변이체 4
- 실시예 1 내지 3의 혼합된 접합체 및 실시예 4 내지 6의 혼합된 접합체를 사용한 변이체 5.
다양한 ELISA 변이체에서 얻어진 기준 표준 신호 및 곡선이 하기 표 1 및 도 2 내지 6에 나타나 있다.
다양한 ELISA 변이체에서의 기준 표준 신호
기준 농도
[ng/㎖]		 신호
변이체 1		 신호
변이체 2		 신호
변이체 3		 신호
변이체 4		 신호
변이체 5
0.00 0.031 0.033 0.048 0.039 0.039
0.78 0.064 0.066 0.077 0.072 0.068
1.56 0.097 0.102 0.106 0.102 0.097
3.13 0.162 0.168 0.166 0.164 0.160
6.25 0.288 0.295 0.287 0.287 0.279
12.50 0.545 0.567 0.538 0.544 0.529
25.00 1.055 1.069 1.048 1.065 1.035
50.00 2.092 2.087 2.140 2.085 2.030
다양한 표준 곡선을 이용한 샘플 분석은 하기 표 2에 나타나 있다.
혈청 샘플 분석
pAB 항-mAB IL-6R 균등물의 농도[ng/㎖]
샘플-ID 변이체 1 변이체 2 변이체 3 변이체 4 변이체 5
F262760-16 54.46 53.78 88.02 76.26 68.50
F825050-26 10.21 11.51 4.57 7.88 9.71
F963840-22 21.92 23.04 23.53 23.63 24.82
E597480-16 76.02 76.29 55.18 N/A N/A
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 모든 접합체가 항-mAB IL-6R 항체의 검출에 사용될 수 있다. 동일한 토끼 다중클론 항-mAB IL-6R 항체를 사용한 경우 모든 분석 변이체에 대한 기준 표준 곡선은 매우 유사하다(도 2 내지 6).
실시예 8
고체상에 고정시키기 위해 스트렙타비딘/바이오틴 상호작용을 이용한 항-mAB IGF-1R 항체의 검출을 위한 가교 ELISA
제1 단계에서, IGF-1R에 대한 바이오티닐화된 항체(mAB IGF-1R, 약물 항체)를 스트렙타비딘-피복 마이크로타이터플레이트(SA-MTP)의 웰에 접합(결합)시켰다. 비접합된 (비결합된) 항체를 통상의 완충제로 세척하여 제거하였다. 그 후, 샘플과 기준 표준물(5% 인간 혈청 중에 분산된 다중클론 토끼 항-mAB IGF-1R 항체)을 웰 내에서 항온처리하였다. 항-mAB IGF-1R 항체는 고정된 mAB IGF-1R에 결합되었다. 비결합된 물질을 세척한 후, 결합된 항-mAB IGF-1R 항체를 디곡시제닐화된 mAB IGF-1R로 검출한 후 호스-라디쉬 퍼록시다제 표지 항-디곡시제닌-항체와 함께 항온처리하였다. 항체-효소 접합체는 ABTS® 기질의 착색 반응을 촉진하였다. 신호는 405 nm 파장(기준 파장: 490 nm)에서 ELISA 판독기로 측정하였다. 각 혈청 샘플의 흡광도 값은 3회 반복하여 측정하였다.
3종의 상이한 변이체의 가교 ELISA를 수행하였다:
- 실시예 1과 4에 따라 제조된 접합체를 사용한 변이체 1
- 실시예 2와 5에 따라 제조된 접합체를 사용한 변이체 2
- 실시예 1과 2에 따라 제조된 혼합된 접합체 및 실시예 4와 5에 따라 제조된 혼합된 접합체를 사용한 변이체 3.
바이오티닐화 및 디곡시제닐화된 mAB IGF-1R의 모든 시약 변이체를 mAB IL-6R(실시예 1, 2, 4 및 5)에 대해 전술한 바와 같이 합성하였다.
다양한 ELISA 변이체에서 얻어진 기준 표준 신호는 하기 표 3에 나타나 있다.
다양한 ELISA 변이체에서의 기준 표준 신호
기준 농도
[ng/㎖]		 신호
변이체 1		 신호
변이체 2		 신호
변이체 3
0.00 0.126 0.056 0.110
0.31 0.161 0.092 0.147
0.63 0.205 0.131 0.191
1.25 0.286 0.203 0.267
2.50 0.440 0.348 0.425
5.00 0.772 0.660 0.744
10.00 1.349 1.223 1.321
20.00 2.113 2.060 2.133
다양한 표준 곡선을 이용한 샘플 분석은 하기 표 4에 나타나 있다.
혈청 샘플 분석
pAB 항-mAB IGF-1R 균등물의 농도[ng/㎖]
샘플-ID 변이체 1 변이체 2 변이체 3
840h_ 암컷 2.04 10.64 7.27
1008h_암컷 11.38 24.05 14.05
504h_수컷 51.17 67.76 60.49
상기 표 3은 모든 접합체가 항-mAB IGF-1R 항체의 검출에 사용될 수 있음을 보여준다. 동일한 토끼 다중클론 항-mAB IGF-1R 항체를 사용한 경우, 모든 분석 변이체에 대한 기준 표준 값은 매우 유사하다(표 3).
실시예 9
고체상에 접합(고정)시키기 위해 수동 흡착을 이용한 항-mAB IGF-1R 항체의 검출을 위한 가교-ELISA
마이크로타이터 플레이트(MTP)(Maxisorb®, Nunc)를 실온(RT)에서 탄산염 완충제(pH 9.6) 중의 mAB IGF-1R로 1시간 동안 피복하였다. PBS-Tween® 20으로 3회 세척한 후, MTP의 모든 웰을 실온에서 PBS/3% (중량/부피) BSA(소 혈청 알부민)로 1시간 동안 차단한 후 다시 세척하였다. 그 후, 샘플과 기준 표준물(5% 인간 혈청 중에 분산된 다중클론 토끼 항-mAB IGF-1R 항체)을 항온처리하였다. 항-mAB IGF-1R 항체는 고정된 mAB IGF-1R에 결합되었다. 비결합된 물질을 세척한 후, 결합된 항-mAB IGF-1R 항체를 디곡시제닐화된 mAB IGF-1R로 검출한 후 호스-라디쉬 퍼록시다제 표지 항-디곡시제닌-항체와 함께 항온처리하였다. 항체-효소 접합체는 ABTS® 기질의 착색 반응을 촉진하였다. 신호는 405 nm 파장(기준 파장: 490 nm)에서 ELISA 판독기로 측정하였다. 각 혈청 샘플의 광학 밀도는 3회 반복하여 측정하였다.
3종의 상이한 변이체의 가교 ELISA를 수행하였다:
- 실시예 4에 따라 제조된 접합체를 사용한 변이체 1
- 실시예 5에 따라 제조된 접합체를 사용한 변이체 2
- 실시예 4와 5에 따라 제조된 혼합된 접합체를 사용한 변이체 3
디곡시제닐화된 mAB IGF-1R의 모든 시약 변이체들을 mAB IL-6R(실시예 4 및 5)에 대해 전술한 바와 같이 합성하였다. 다양한 ELISA 변이체에서의 기준 표준 신호는 하기 표 5 및 도 7에 나타나 있다.
기준 표준 신호
기준 농도
[ng/㎖]		 신호
변이체 1		 신호
변이체 2		 신호
변이체 3
0.00 0.124 0.113 0.113
8.00 0.163 0.138 0.158
16.00 0.238 0.166 0.189
32.00 0.305 0.289 0.337
64.00 0.598 0.510 0.558
128.00 1.023 0.990 1.032
256.00 2.097 1.864 1.990
상기 표 5는 고체상에 mAB IGF-1R을 접합(고정)시키기 위해 수동 흡착을 이용한 본 발명에 따른 가교 분석이 항-mAB IGF-1R 항체의 검출을 위해 수행될 수 있음을 보여준다. 동일한 토끼 다중클론 항-mAB IGF-1R 항체를 사용한 경우 모든 3종의 분석 변이체에 대한 기준 표준 값은 매우 유사하다(표 5).

Claims (11)

  1. 포획(capture) 약물 항체 및 탐침(tracer) 약물 항체를 포함하는 이중 항원 가교 면역분석(double antigen bridging immunoassay)을 이용하여 샘플에서 약물 항체에 대한 항체를 면역학적으로 확인하는 방법으로서,
    i) 상기 포획 약물 항체가, 고체상(solid phase)에 접합된 항체 부위의 종류 또는 아미노산 골격의 아미노산 수가 상이한 2종 이상의 약물 항체를 포함하는 약물 항체의 혼합물이고,
    ii) 상기 탐침 약물 항체가, 검출가능한 표지에 접합된 항체 부위의 종류 또는 아미노산 골격의 아미노산 수가 상이한 2종 이상의 약물 항체를 포함하는 약물 항체의 혼합물이고,
    이때, 상기 항체 부위가 약물 항체의 아미노산 골격의 작용기 또는 약물 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기임을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    약물 항체와 그의 접합 파트너의 접합이 약물 항체의 아미노산 골격의 N-말단 아미노 기, 라이신의 ε-아미노 기, 카르복시 기, 설프히드릴 기, 히드록실 기 및 페놀계 작용기, 및 약물 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 항체 부위를 통한 화학적 결합에 의해 달성됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    탐침 약물 항체 혼합물이 약물 항체의 아미노산 골격의 아미노 기를 통해 그의 접합 파트너에 접합된 약물 항체 및 약물 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통해 그의 접합 파트너에 접합된 약물 항체를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    포획 약물 항체 혼합물이 약물 항체의 아미노산 골격의 아미노 기를 통해 그의 접합 파트너에 접합된 약물 항체 및 약물 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통해 그의 접합 파트너에 접합된 약물 항체를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    포획 약물 항체와 고체상의 접합이 수동 흡착에 의해 달성됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상이할 수 있는 접합체의 분자량과 관계없이 항체 분자의 몰비를 의미하는 비인 포획 약물 항체 대 탐침 약물 항체의 비가 1:10 내지 50:1임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상이할 수 있는 접합체의 분자량과 관계없이 항체 분자의 몰비를 의미하는 비인, 혼합물에서 약물 항체의 아미노산 골격의 아미노 기를 통해 그의 접합 파트너에 접합된 약물 항체 대 약물 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통해 그의 접합 파트너에 접합된 약물 항체의 비가 1:10 내지 10:1임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    포획 약물 항체가 특이적 결합 쌍을 통해 고정됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    포획 약물 항체가 바이오틴에 접합되고, 고정화가 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 달성됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    탐침 약물 항체가 특이적 결합 쌍을 통해 검출가능한 표지에 접합됨을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    탐침 약물 항체가 디곡시제닌에 접합되고 검출가능한 표지와의 연결이 디곡시제닌에 대한 항체를 통해 달성됨을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2312184T3 (es) 1997-03-21 2009-02-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agentes preventivos terapeuticos para el tratamiento de esclerosis multiple, que contienen anticuerpos anti-receptores de il-6 antagonistas.
UA80091C2 (en) 2001-04-02 2007-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist
GB2401040A (en) * 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
AU2013202747B2 (en) * 2007-12-15 2014-02-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Distinguishing assay
US8227195B2 (en) * 2007-12-15 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Distinguishing assay
PE20091174A1 (es) 2007-12-27 2009-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo
WO2010042031A1 (en) * 2008-10-07 2010-04-15 Gyros Patent Ab Semi-sequential assay for detection of an analyte in a sample
US8614297B2 (en) 2008-12-22 2013-12-24 Hoffmann-La Roche Inc. Anti-idiotype antibody against an antibody against the amyloid β peptide
US20120220051A1 (en) * 2009-07-08 2012-08-30 Anp Technologies, Inc. Immunogenicity Assay
DK2493922T3 (en) 2009-10-26 2017-04-24 Hoffmann La Roche Process for preparing a glycosylated immunoglobulin
EP2354792A1 (en) * 2010-02-08 2011-08-10 Biomonitor A/S Method for detecting anti-drug antibodies
RS54249B1 (en) * 2010-04-29 2016-02-29 Theradiag Sa PROCEDURE FOR DETECTION OF ANTI-MEDICINAL ANTIBODIES
EP2630495B1 (en) * 2010-10-18 2017-02-08 Nestec S.A. Methods for determining anti-drug antibody isotypes
CN103476793A (zh) 2010-11-08 2013-12-25 基因技术公司 皮下施用的抗-il-6受体抗体
BR112015032960B1 (pt) 2013-07-04 2021-01-05 F. Hoffmann-La Roche Ag imunoensaio suprimido por interferência para detectar anticorpos anti-fármaco em amostras de soro
MX2016010413A (es) 2014-02-11 2016-11-30 Genzyme Corp Ensayos para detectar la presencia o la cantidad de un anticuerpo antifarmaco.
EP2982987A1 (en) * 2014-08-08 2016-02-10 Proteomika, S.L. Lateral flow immunoassays for the detection of antibodies against biological drugs
WO2017102786A1 (en) * 2015-12-16 2017-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Three-step acid dissociation enzyme linked immunosorbent (tadelis) assay
CN109358192B (zh) * 2018-02-08 2020-05-12 中国科学院上海药物研究所 一种去除抗药抗体检测样品中游离药物的装置和方法、该装置的制备方法及应用
GB201905100D0 (en) 2019-04-10 2019-05-22 Antibody Innovation Ltd Polypeptides and methods of use
CA3148161A1 (en) * 2019-09-05 2021-03-11 Adverum Biotechnologies Anti-drug antibody assay
EP4139029A1 (en) 2020-04-23 2023-03-01 S.A. Lhoist Recherche Et Developpement Calcium and/or magnesium additive for membrane fouling control and system and process for membrane fouling control using the additive
WO2021214334A1 (en) 2020-04-23 2021-10-28 S.A. Lhoist Recherche Et Developpement System and process for membrane fouling control, a membrane fouling control additive, an upgrade kit and an upgrade method
JP7062803B1 (ja) 2021-03-31 2022-05-06 積水メディカル株式会社 抗薬物抗体測定方法
CA3240046A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Cdr-Life Ag Dual mhc-targeting t cell engager
US20240091262A1 (en) 2022-09-14 2024-03-21 Cdr-Life Ag Mage-a4 peptide dual t cell engagers

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987002778A1 (en) * 1985-10-22 1987-05-07 Cooper-Lipotech Solid-phase liposome immunoassay system
WO1990006515A1 (en) * 1988-12-09 1990-06-14 Centocor, Inc. Anti-idiotopic immunometric assay
US5219730A (en) 1982-09-28 1993-06-15 New York University Idiotype-anti-idiotype immunoassay

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5446827A (en) * 1977-09-19 1979-04-13 Mamoru Sugiura Measuring of immunoglobulin
US4671958A (en) * 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4828981A (en) 1983-08-24 1989-05-09 Synbiotics Corporation Immunoassays for determining Dirofilaria immitis infection using antiidiotype monoclonal antibody reagents
EP0170302A1 (fr) 1984-06-27 1986-02-05 l'Association internationale à but scientifique, dite: Institut international de pathologie cellulaire et moléculaire Procédé de dosage immunologique d'une substance dans un échantillon liquide au moyen d'anticorps anti-idiotypiques
US5238808A (en) 1984-10-31 1993-08-24 Igen, Inc. Luminescent metal chelate labels and means for detection
KR0143993B1 (ko) 1988-11-03 1998-07-15 리차아드 제이 매씨이 전기화학 발광성 분석
US5068088A (en) 1988-11-03 1991-11-26 Igen, Inc. Method and apparatus for conducting electrochemiluminescent measurements
EP0440044A1 (en) * 1990-01-31 1991-08-07 Abbott Laboratories Avoidance of human anti-mouse antibody interference in in vitro diagnostic testing
IL100866A (en) 1991-02-06 1995-10-31 Igen Inc Luminescence test method and device based on magnetic tiny particles, containing many magnets
AU654563B2 (en) * 1991-07-24 1994-11-10 Imperial Chemical Industries Plc Proteins
EP1170300A1 (en) 1992-07-13 2002-01-09 Bionebraska, Inc. Method for modification of recombinant polypeptides
US5756362A (en) * 1993-10-12 1998-05-26 Cornell Research Foundation, Inc. Liposome-enhanced immunoaggregation assay and test device
US6190870B1 (en) * 1995-08-28 2001-02-20 Amcell Corporation Efficient enrichment and detection of disseminated tumor cells
US7141436B2 (en) * 1999-11-03 2006-11-28 Science And Technology Corp. Immunoassay and reagents and kits for performing the same
US6627457B2 (en) * 2001-07-30 2003-09-30 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting pregnancy
TW200420554A (en) 2003-03-31 2004-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Kk A intra-airway administrating preparation
WO2004087756A2 (en) 2003-04-02 2004-10-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
US7579157B2 (en) 2003-07-10 2009-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Antibody selection method against IGF-IR
JP2005143504A (ja) * 2003-10-22 2005-06-09 Takeda Chem Ind Ltd 抗体およびその用途
WO2005045058A2 (en) 2003-10-27 2005-05-19 Monogram Biosciences, Inc. Detecting human anti-therapeutic antibodies
US8227195B2 (en) * 2007-12-15 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Distinguishing assay
US8021850B2 (en) * 2008-07-14 2011-09-20 Ribo Guo Universal tandem solid-phases based immunoassay
BR112017004810A2 (pt) * 2014-11-05 2017-12-12 Hoffmann La Roche imunoensaio

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5219730A (en) 1982-09-28 1993-06-15 New York University Idiotype-anti-idiotype immunoassay
WO1987002778A1 (en) * 1985-10-22 1987-05-07 Cooper-Lipotech Solid-phase liposome immunoassay system
WO1990006515A1 (en) * 1988-12-09 1990-06-14 Centocor, Inc. Anti-idiotopic immunometric assay

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