JP7062803B1 - 抗薬物抗体測定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
しかし、特許文献1の方法は、上記したように固相又は検出可能な標識に結合される抗体の部位が異なる、同じアミノ酸配列を有する薬物抗体を、捕獲薬物抗体用及びトレーサー薬物抗体用に、それぞれ2種以上ずつ、合計4種以上を調製することが必須であるため、両抗体の調製に高額な費用及び長い時間が必要になる。また、当該薬物抗体を使用したイムノアッセイ法の性能管理及び試薬の品質管理も複雑になる。
したがって、より簡便かつ安価な抗薬物抗体の測定方法に対するニーズが存在する。
本発明者らは、捕獲核酸及びトレーサー核酸を使用することにより、簡便かつ安価に抗薬物抗体を測定できることを見出し、本発明を完成した。捕獲核酸及びトレーサー核酸は、極めて簡便かつ安価に化学合成することが可能であり、かつ、多種多様な修飾も容易に行うことができる。更にアッセイ法の性能管理及び試薬の品質管理も簡便に行うことができる。
〔実施態様1〕
以下の工程を含む試料中の抗薬物抗体を検出する方法:
(i)試料と、捕獲核酸と、トレーサー核酸とを接触させて前記捕獲核酸、前記抗薬物抗体、及び前記トレーサー核酸の複合体(「捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体」と呼ぶことがある)を形成させる工程、
ここで、捕獲核酸及びトレーサー核酸は、前記抗薬物抗体が結合するエピトープを有する; 及び
(ii)前記捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体を検出する工程。
〔実施態様2〕
以下の工程を含む試料中の抗薬物抗体を検出する方法:
(i)試料と、捕獲核酸と、トレーサー核酸とを接触させて捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体を形成させる工程、
ここで、捕獲核酸及びトレーサー核酸は、前記抗薬物抗体が結合するエピトープを有する; 及び
(ii)増感法を用いて前記捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体を検出する工程。
〔実施態様3〕
以下の工程を含む試料中の抗薬物抗体を検出する方法:
(i)試料と、捕獲核酸と、トレーサー核酸とを接触させて捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体を形成させる工程、
ここで、捕獲核酸及びトレーサー核酸は、前記抗薬物抗体が結合するエピトープを有する;
(ii)前記捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体に、第1及び第2のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブを接触させて、前記捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体と、第1及び第2のオリゴヌクレオチドが自己凝集してなるオリゴヌクレオチドポリマーとのポリマー複合体を形成する工程; 及び
(iii)前記ポリマー複合体を検出する工程。
〔実施態様4〕
以下の工程を含む試料中の抗薬物抗体を検出する方法:
(i)試料と、前記抗薬物抗体が結合するエピトープを有する捕獲核酸と、前記抗薬物抗体が結合するエピトープを有するトレーサー核酸とを接触させる工程、
ここで、前記試料中に前記抗薬物抗体が含まれる場合には、捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体が形成される;
(ii)前記捕獲核酸を捕捉し、前記複合体の形成に関与せず遊離の状態で存在する前記トレーサー核酸を当該複合体と分離し、除去する工程; 及び
(iii)前記分離・除去工程の後、分離・除去されずに残存するトレーサー核酸を検出することにより、試料中の抗薬物抗体を検出する工程。
〔実施態様5〕
以下の工程を含む試料中の抗薬物抗体を検出する方法:
(i)試料と、前記抗薬物抗体が結合するエピトープを有する捕獲核酸と、前記抗薬物抗体が結合するエピトープを有するトレーサー核酸とを接触させる工程、
ここで、前記試料中に前記抗薬物抗体が含まれる場合には、捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体が形成される;
(ii)前記捕獲核酸を捕捉する工程、
ここで、前記捕捉工程は前記複合体の形成前、形成後、形成途中、又は形成と同時に行われる;
(iii)前記捕獲核酸を捕捉し、前記複合体の形成に関与せず遊離の状態で存在する前記トレーサー核酸を前記複合体と分離し、除去する工程; 及び
(iv)前記分離・除去工程の後、分離・除去されずに残存するトレーサー核酸を検出することにより、試料中の抗薬物抗体を検出する工程。
〔実施態様6〕
捕獲核酸を捕捉する工程が、捕獲核酸の固相への結合であり、分離・除去する工程が、捕獲核酸が結合した固相の洗浄である、実施態様4又は5に記載の方法。
〔実施態様7〕
検出される抗薬物抗体は、試料中にIgG、IgM、IgD、IgE、又はIgAのIgクラスの抗体が存在する場合、2以上のIgクラスを一の測定で検出する、実施態様1~6のいずれかに記載の方法。
〔実施態様8〕
捕獲核酸及びトレーサー核酸における前記抗薬物抗体が結合するエピトープが同じである、実施態様1~7のいずれかに記載の方法。
〔実施態様9〕
捕獲核酸及びトレーサー核酸は、核酸鎖の鎖長が同一であるか又はトレーサー核酸の核酸鎖の鎖長が捕獲核酸より1mer~60mer長いものである、実施態様1~8のいずれかに記載の方法。
〔実施態様10〕
トレーサー核酸は、核酸鎖の鎖長が捕獲核酸より10mer~50mer長いものである、実施態様1~9のいずれかに記載の方法。
〔実施態様11〕
試料と、捕獲核酸と、トレーサー核酸とを接触させる工程は、試料と捕獲核酸を接触させる第1の工程と、第1の工程の産物とトレーサー核酸を接触させる第2の工程を含む、実施態様1~10のいずれかに記載の方法:
ここで、前記試料中に前記抗薬物抗体が含まれる場合には、第1の工程で捕獲核酸-抗薬物抗体複合体が形成され、第2の工程で捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体が形成される。
〔実施態様12〕
前記第1の複合体を形成する工程と第2の複合体を形成する工程が同時に行われる、実施態様11に記載の方法。
〔実施態様13〕
前記捕獲核酸とトレーサー核酸の一方又は両方が化学修飾された核酸である、実施態様1~12のいずれかに記載の方法。
〔実施態様14〕
前記化学修飾された核酸が、ロックド核酸(LNA)、架橋核酸(BNA)、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、モルフォリノオリゴヌクレオチド、ボラノフォスフェートオリゴヌクレオチド、2’-O-メチル化RNA(2’-OMe)、2’-O-メトキシエチル化RNA(2’-MOE)、又は2’-F-RNAである実施態様13に記載の方法。
〔実施態様15〕
前記抗薬物抗体が抗核酸医薬抗体である実施態様1~14のいずれかに記載の方法
〔実施態様16〕
試料が血液由来成分である実施態様1~15のいずれかに記載の方法。
〔実施態様17〕
以下を含む、試料中の抗薬物抗体を検出するキット:
(1)捕獲核酸;
(2)トレーサー核酸; 及び
(3)第1及び第2のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブ;
ここで、捕獲核酸及びトレーサー核酸は、前記抗薬物抗体が結合するエピトープを有する。
〔実施態様18〕
捕獲核酸及びトレーサー核酸の前記抗薬物抗体に対するエピトープが同じである、実施態様17に記載のキット。
〔実施態様19〕
以下を特徴とする、捕獲核酸とトレーサー核酸とを含む二重抗原架橋イムノアッセイを用いて試料中の抗薬物抗体を免疫学的に測定するための方法:
ここで、捕獲核酸及びトレーサー核酸は、前記抗薬物抗体が結合するエピトープを有する。
従って、本発明の方法は、検出されるシグナルの強度を測定することにより、抗薬物抗体の測定方法、検出方法、定量測定方法、又は定性測定方法として使用することが出来る。
(1)捕獲核酸
(2)トレーサー核酸
(3)第1及び第2のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブ
ここで、捕獲核酸及びトレーサー核酸は、前記抗薬物抗体が結合するエピトープを有する。
各構成については、上述のとおりである。
まず、抗薬物抗体が含まれうる試料、捕獲核酸を準備する。最初に、ビオチン((図1-1)中、星印)で標識された捕獲核酸をストレプトアビジンコーティングプレート(固相)に結合させる。次に、抗薬物抗体と捕獲核酸を接触させる(図1-1)。捕獲核酸のエピトープに抗薬物抗体が結合し、捕獲核酸-抗薬物抗体複合体を形成する。
1. 材料及び方法
(1) 標的抗体
測定対象の抗体としては、抗5-メチルシトシン抗体(抗5-mC抗体)(アブカム、製品番号ab10805)を用いた。上記の標的抗体は、抗体希釈液を用いて0.1、0.5、1μg/mLに調製して用いた。標的抗体を含まないブランクサンプルも用意した。
(1-1)抗体希釈液の組成
1xPBS-TP[1xPBS[137mM Sodium Chloride、8.1mM Disodium Phosphate、2.68mM Potassium Chloride、1.47mM Potassium Dihydrogenphosphate]、0.02% Tween20、1.5ppm ProClin300]、1% BSA(ウシ血清アルブミン)
(2) 捕獲核酸
捕獲核酸としては、Hasegawaら(Anal Sci. 2016;32(6):603-6)が使用したM-DNA1の配列の3′末端がビオチン標識された以下のM-DNA1-3Bを用いた。M-DNA1-3Bの配列は、5′-TACGTTATCAGACTGATGTTGA-3′(配列番号1)である。核酸は日本遺伝子研究所に合成を依頼した(HPLC精製グレード)。上記の核酸は、Hasegawaらと同様に、5′末端から3番目の塩基(シトシン)は5-メチルシトシンである。M-DNA1-3BについてはTE(10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA(pH8.0))を用いて1pmol/μLに調製して用いた。
(3) トレーサー核酸
トレーサー核酸としては、捕獲核酸と同じ塩基配列(22塩基)及びシグナル増幅用プローブ(HCP-1)の一部と同じ塩基配列からなる、3′末端がアミノ修飾されたトレーサー核酸(AP-ADA-M-DNA1-ZYZ-3N)を用いた。核酸は日本遺伝子研究所に合成を依頼した(HPLC精製グレード)。上記の核酸は、Hasegawaらと同様に、5′末端から3番目の塩基(シトシン)は5-メチルシトシンである。
<AP-ADA-M-DNA1-ZYZ-3Nの配列>
5′- TACGTTATCAGACTGATGTTGAGATATAAGGAGTGGATACCGATGAAGGATATAAGGAGTG -(NH2)-3′(塩基部分は配列番号2)
(4) 標的抗体-捕獲核酸-トレーサー核酸複合体の形成(ブリッジング反応)
標的抗体50μLに、ブリッジング反応液を50μL加え、計100μLとし、600rpmで振盪しながら37℃で3時間反応させた。
(4-1)ブリッジング反応液の組成
1xPBS-TP[1xPBS[137mM Sodium Chloride、8.1mM Disodium Phosphate、2.68mM Potassium Chloride、1.47mM Potassium Dihydrogenphosphate]、0.02% Tween20、1.5ppm ProClin300]49.8μL、10pmol/μL AP-ADA-M-DNA1-ZYZ-3N 0.1μL、1pmol/μL M-DNA1-3B 0.1μL
(5)測定プレートのブロッキング
ストレプトアビジンが固定された測定プレート(Meso Scale Diagnostics、製品番号L45SA-1)に、ブロッキング液を150μL加え、600rpmで振盪しながら25℃で1時間反応させた後、1xPBS-TP 200μLで2回洗浄した。
(5-1)ブロッキング液の組成
1xPBS-TP[1xPBS[137mM Sodium Chloride、8.1mM Disodium Phosphate、2.68mM Potassium Chloride、1.47mM Potassium Dihydrogenphosphate]、0.02% Tween20、1.5ppm ProClin300]、3% BSA
(5-2)1xPBS-TPの組成
1xPBS[137mM Sodium Chloride、8.1mM Disodium Phosphate、2.68mM Potassium Chloride、1.47mM Potassium Dihydrogenphosphate]、0.02% Tween20、1.5ppm ProClin300
(6)測定プレートへの標的抗体-捕獲核酸-トレーサー核酸複合体の固定
ブリッジング反応後の反応液75μLをブロッキング後の測定プレートへ加え、600rpmで振盪しながら25℃で1時間反応させた後、1xPBS-TP 200μLで2回洗浄した。
(6-1)1xPBS-TPの組成
1xPBS[137mM Sodium Chloride、8.1mM Disodium Phosphate、2.68mM Potassium Chloride、1.47mM Potassium Dihydrogenphosphate]、0.02% Tween20、1.5ppm ProClin300
(7)検出補助反応
標的抗体-捕獲核酸-トレーサー核酸複合体固定後の測定プレートに、検出補助反応液を50μL加え、600rpmで振盪しながら40℃で1時間反応させた後、1xPBS-TP 200μLで2回洗浄した。
(7-1)検出補助液の組成
ハイブリダイゼーション液[189.3mM Tris-HCl (pH7.5)、2.4xPBS[328.8mM Sodium Chloride、19.44mM Disodium Phosphate、6.432mM Potassium Chloride、3.528mM Potassium Dihydrogenphosphate]、3.6mM EDTA(pH8.0)、0.12% Tween20]21μL、10x supplement-T[500mM Tris-HCl(pH8.0)、40mM EDTA(pH8.0)、8% Tween20、1.5ppm ProClin300]8μL、20pmol/μL HCP-2 0.42μL、Nuclease-Free Water 20.46μL
(7-2)1xPBS-TPの組成
1xPBS[137mM Sodium Chloride、8.1mM Disodium Phosphate、2.68mM Potassium Chloride、1.47mM Potassium Dihydrogenphosphate]、0.02% Tween20、1.5ppm ProClin300
(7-3)HCP-2の塩基配列
本実施例1に使用する核酸プローブ(HCP-2)は、自己凝集可能な一対のプローブのうちAP-ADA-M-DNA1-ZYZ-3Nの塩基配列の一部に相補的な配列を含み、5′末端がジゴキシゲニンで標識されている。
<HCP-2の塩基配列>
5′-(DIG)- GTCCTGATTGTTGCTTCATCGGTATCCACTCCTTATATC -3′(塩基部分は配列番号3)
(8)検出抗体反応
検出補助反応後の測定プレートに、検出抗体反応液を50μL加え、600rpmで振盪しながら30℃で30分間反応させた後、1xPBS-TP 200μLで2回洗浄した。
(8-1)検出抗体反応液の組成
1xPBS-TP (1% BSA)[1xPBS[137mM Sodium Chloride、8.1mM Disodium Phosphate、2.68mM Potassium Chloride、1.47mM Potassium Dihydrogenphosphate]、0.02% Tween20、1.5ppm ProClin300、1% BSA]49.7μL、100μg/mL Ru-Anti-DIG, Fab fragment 0.3μL
(8-2)Ru-Anti-DIG, Fab fragmentの調製
Anti-Digoxigenin, Fab fragments(メルク、製品番号11214667001)に、MSD GOLD SULFO-TAG NHS-Ester(Meso Scale Diagnostics、製品番号R91AO-1)を、第一級アミンを介して結合させることにより調製した。結合方法はMeso Scale Diagnostics社の製品添付プロトコールに従った。
(8-3)1xPBS-TPの組成
1xPBS[137mM Sodium Chloride、8.1mM Disodium Phosphate、2.68mM Potassium Chloride、1.47mM Potassium Dihydrogenphosphate]、0.02% Tween20、1.5ppm ProClin300
(9)検出
検出抗体反応後の測定プレートに0.5xRead Buffer[[MSD GOLD Read Buffer A(Meso Scale Diagnostics、製品番号R92TG-1)]を滅菌精製水で2倍希釈]150μLを加え、Meso QuickPlex SQ 120MMシステム(Meso Scale Diagnostics社製)を用いてRu-Anti-DIG, Fab fragmentからの発光量を測定し、標的抗体のシグナルを検出した。
(10)結果
測定結果を図2に示す。抗5-メチルシトシン抗体の濃度の上昇に応じてシグナルが増大した。
1.材料及び方法
(1) 標的抗体
測定対象の抗体としては、実施例1で使用した抗5-メチルシトシン抗体(抗5-mC抗体)(アブカム、製品番号ab10805)を用いた。上記の標的抗体は、抗体希釈液を用いて0.1、0.5、1μg/mLに調製して用いた。標的抗体を含まないブランクサンプルも用意した。
(1-1)抗体希釈液の組成
1xPBS-TP[1xPBS[137mM Sodium Chloride、8.1mM Disodium Phosphate、2.68mM Potassium Chloride、1.47mM Potassium Dihydrogenphosphate]、0.02% Tween20、1.5ppm ProClin300]、1% BSA
(2) 捕獲核酸
捕獲核酸としては、実施例1で使用したM-DNA1-3Bを使用した。M-DNA1-3BについてはTE(10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA(pH8.0))を用いて1pmol/μLに調製して用いた。
(3) トレーサー核酸
トレーサー核酸としては、実施例1で使用したAP-ADA-M-DNA1-ZYZ-3Nを用いた。
(4)標的抗体-捕獲核酸-トレーサー核酸複合体の形成(ブリッジング反応)
標的抗体50μLに、ブリッジング反応液を50μL加え、計100μLとし、600rpmで振盪しながら37℃で3時間反応させた。
(4-1)ブリッジング反応液の組成
1xPBS-TP[1xPBS[137mM Sodium Chloride、8.1mM Disodium Phosphate、2.68mM Potassium Chloride、1.47mM Potassium Dihydrogenphosphate]、0.02% Tween20、1.5ppm ProClin300]49.8μL、10pmol/μL AP-ADA-M-DNA1-ZYZ-3N 0.1μL、1pmol/μL M-DNA1-3B 0.1μL
(5)測定プレートのブロッキング
ストレプトアビジンが固定された測定プレート(Meso Scale Diagnostics、製品番号L45SA-1)に、ブロッキング液を150μL加え、600rpmで振盪しながら25℃で1時間反応させた後、1xPBS-TP 200μLで2回洗浄した。
(5-1)ブロッキング液の組成
1xPBS-TP[1xPBS[137mM Sodium Chloride、8.1mM Disodium Phosphate、2.68mM Potassium Chloride、1.47mM Potassium Dihydrogenphosphate]、0.02% Tween20、1.5ppm ProClin300]、3% BSA
(5-2)1xPBS-TPの組成
1xPBS[137mM Sodium Chloride、8.1mM Disodium Phosphate、2.68mM Potassium Chloride、1.47mM Potassium Dihydrogenphosphate]、0.02% Tween20、1.5ppm ProClin300
(6)測定プレートへの標的抗体-捕獲核酸-トレーサー核酸複合体の固定
ブリッジング反応後の反応液75μLをブロッキング後の測定プレートへ加え、600rpmで振盪しながら25℃で1時間反応させた後、1xPBS-TP 200μLで2回洗浄した。
(6-1)1xPBS-TPの組成
1xPBS[137mM Sodium Chloride、8.1mM Disodium Phosphate、2.68mM Potassium Chloride、1.47mM Potassium Dihydrogenphosphate]、0.02% Tween20、1.5ppm ProClin300
(7)自己凝集反応(PALSAR反応)
標的抗体-捕獲核酸-トレーサー核酸複合体固定後の測定プレートに、PALSAR反応液を50μL加え、600rpmで振盪しながら40℃で1時間反応させた後、1xPBS-TP 200μLで2回洗浄した。
本実施例に使用する自己凝集可能な一対のプローブ(シグナル増幅用プローブともいう)の配列は、5′末端がジゴキシゲニンで標識された以下のHCP-1及びHCP-2である。
<HCP-1の配列>
5′-(DIG)- CAACAATCAGGACGATACCGATGAAGGATATAAGGAGTG -3′(塩基部分は配列番号4)
<HCP-2の塩基配列>
5′-(DIG)- GTCCTGATTGTTGCTTCATCGGTATCCACTCCTTATATC -3′(塩基部分は配列番号3)
(7-1)PALSAR反応液の組成
ハイブリダイゼーション液[189.3mM Tris-HCl (pH7.5)、2.4xPBS[328.8mM Sodium Chloride、19.44mM Disodium Phosphate、6.432mM Potassium Chloride、3.528mM Potassium Dihydrogenphosphate]、3.6mM EDTA(pH8.0)、0.12% Tween20]21μL、10x supplement-T[500mM Tris-HCl(pH8.0)、40mM EDTA(pH8.0)、8% Tween20、1.5ppm ProClin300]8μL、20pmol/μL HCP-1 0.35μL、20pmol/μL HCP-2 0.42μL、Nuclease-Free Water 20.11μL
(7-2)1xPBS-TPの組成
1xPBS[137mM Sodium Chloride、8.1mM Disodium Phosphate、2.68mM Potassium Chloride、1.47mM Potassium Dihydrogenphosphate]、0.02% Tween20、1.5ppm ProClin300
(8)検出抗体反応
自己凝集反応後の測定プレートに、検出抗体反応液を50μL加え、600rpmで振盪しながら30℃で30分間反応させた後、1xPBS-TP 200μLで2回洗浄した。
(8-1)検出抗体反応液の組成
1xPBS-TP (1% BSA)[1xPBS[137mM Sodium Chloride、8.1mM Disodium Phosphate、2.68mM Potassium Chloride、1.47mM Potassium Dihydrogenphosphate]、0.02% Tween20、1.5ppm ProClin300、1% BSA]49.7μL、100μg/mL Ru-Anti-DIG, Fab fragment 0.3μL
(8-2)Ru-Anti-DIG, Fab fragmentの調製
Anti-Digoxigenin, Fab fragments(メルク、製品番号11214667001)に、MSD GOLD SULFO-TAG NHS-Ester(Meso Scale Diagnostics、製品番号R91AO-1)を、第一級アミンを介して結合させることにより調製した。結合方法はMeso Scale Diagnostics社の製品添付プロトコールに従った。
(8-3)1xPBS-TPの組成
1xPBS[137mM Sodium Chloride、8.1mM Disodium Phosphate、2.68mM Potassium Chloride、1.47mM Potassium Dihydrogenphosphate]、0.02% Tween20、1.5ppm ProClin300
(9)検出
検出抗体反応後の測定プレートに0.5xRead Buffer[[MSD GOLD Read Buffer A(Meso Scale Diagnostics、製品番号R92TG-1)]を滅菌精製水で2倍希釈]150μLを加え、Meso QuickPlex SQ 120MMシステム(Meso Scale Diagnostics社製)を用いてRu-Anti-DIG, Fab fragmentからの発光量を測定し、標的抗体のシグナルを検出した。
(10)結果
測定結果を図3に示す。抗5-メチルシトシン抗体の濃度の上昇に応じてシグナルが増大した。
上記実施例1~2より、本発明の方法は抗薬物抗体を検出できることが確認できた。
Claims (19)
- 以下の工程を含む試料中の抗薬物抗体を検出する方法:
(i)試料と、捕獲核酸と、トレーサー核酸とを接触させて前記捕獲核酸、前記抗薬物抗体、及び前記トレーサー核酸の複合体(「捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体」と呼ぶことがある)を形成させる工程、
ここで、捕獲核酸及びトレーサー核酸は、前記抗薬物抗体が結合するエピトープを有する; 及び
(ii)前記捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体を検出する工程。 - 以下の工程を含む試料中の抗薬物抗体を検出する方法:
(i)試料と、捕獲核酸と、トレーサー核酸とを接触させて捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体を形成させる工程、
ここで、捕獲核酸及びトレーサー核酸は、前記抗薬物抗体が結合するエピトープを有する; 及び
(ii)増感法を用いて前記捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体を検出する工程。 - 以下の工程を含む試料中の抗薬物抗体を検出する方法:
(i)試料と、捕獲核酸と、トレーサー核酸とを接触させて捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体を形成させる工程、
ここで、捕獲核酸及びトレーサー核酸は、前記抗薬物抗体が結合するエピトープを有する;
(ii)前記複合体の形成後に前記捕獲核酸を固相に結合させる工程;
(iii)前記捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体に、第1及び第2のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブを接触させて、前記捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体と、第1及び第2のオリゴヌクレオチドが自己凝集してなるオリゴヌクレオチドポリマーとのポリマー複合体を形成する工程; 及び
(iv)前記ポリマー複合体を検出する工程。 - 以下の工程を含む試料中の抗薬物抗体を検出する方法:
(i)試料と、前記抗薬物抗体が結合するエピトープを有する捕獲核酸と、前記抗薬物抗体が結合するエピトープを有するトレーサー核酸とを接触させる工程、
ここで、前記試料中に前記抗薬物抗体が含まれる場合には、捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体が形成される;
(ii)前記捕獲核酸を捕捉し、前記複合体の形成に関与せず遊離の状態で存在する前記トレーサー核酸を当該複合体と分離し、除去する工程; 及び
(iii)前記分離・除去工程の後、分離・除去されずに残存するトレーサー核酸を検出することにより、試料中の抗薬物抗体を検出する工程。 - 以下の工程を含む試料中の抗薬物抗体を検出する方法:
(i)試料と、前記抗薬物抗体が結合するエピトープを有する捕獲核酸と、前記抗薬物抗体が結合するエピトープを有するトレーサー核酸とを接触させる工程、
ここで、前記試料中に前記抗薬物抗体が含まれる場合には、捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体が形成される;
(ii) 前記複合体の形成後に前記捕獲核酸を捕捉し、前記複合体の形成に関与せず遊離の状態で存在する前記トレーサー核酸を前記複合体と分離し、除去する工程; 及び
(iii)捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体を含む試料に、第1及び第2のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブを接触させて、捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体と、第1及び第2のオリゴヌクレオチドが自己凝集してなるオリゴヌクレオチドポリマーとのポリマー複合体を形成する工程;
(iv)前記ポリマー複合体を検出することにより、試料中の抗薬物抗体を検出する工程。 - 捕獲核酸を捕捉する工程が、捕獲核酸の固相への結合であり、分離・除去する工程が、捕獲核酸が結合した固相の洗浄である、請求項4又は5に記載の方法。
- 検出される抗薬物抗体は、試料中にIgG、IgM、IgD、IgE、又はIgAのIgクラスの抗体が存在する場合、2以上のIgクラスを一の測定で検出される、請求項1~6のいずれかに記載の方法。
- 捕獲核酸及びトレーサー核酸における前記抗薬物抗体が結合するエピトープが同じである、請求項1~7のいずれかに記載の方法。
- 捕獲核酸及びトレーサー核酸は、核酸鎖の鎖長が同一であるか又はトレーサー核酸の核酸鎖の鎖長が捕獲核酸より1mer~60mer長いものである、請求項1~8のいずれかに記載の方法。
- トレーサー核酸は、核酸鎖の鎖長が捕獲核酸より10mer~50mer長いものである、請求項1~9のいずれかに記載の方法。
- 試料と、捕獲核酸と、トレーサー核酸とを接触させる工程は、試料と捕獲核酸を接触させる第1の工程と、第1の工程の産物とトレーサー核酸を接触させる第2の工程を含む、請求項1~10のいずれかに記載の方法:
ここで、前記試料中に前記抗薬物抗体が含まれる場合には、第1の工程で捕獲核酸-抗薬物抗体複合体が形成され、第2の工程で捕獲核酸-抗薬物抗体-トレーサー核酸複合体が形成される。 - 前記第1の複合体を形成する工程と第2の複合体を形成する工程が同時に行われる、請求項11に記載の方法。
- 前記捕獲核酸とトレーサー核酸の一方又は両方が化学修飾された核酸である、請求項1~12のいずれかに記載の方法。
- 前記化学修飾された核酸が、ロックド核酸(LNA)、架橋核酸(BNA)、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、モルフォリノオリゴヌクレオチド、ボラノフォスフェートオリゴヌクレオチド、2’-O-メチル化RNA(2’-OMe)、2’-O-メトキシエチル化RNA(2’-MOE)、又は2’-F-RNAである請求項13に記載の方法。
- 前記抗薬物抗体が抗核酸医薬抗体である請求項1~14のいずれかに記載の方法
- 試料が血液由来成分である請求項1~15のいずれかに記載の方法。
- 以下を含む、試料中の抗薬物抗体を検出するキット:
(1)捕獲核酸;
(2)トレーサー核酸; 及び
(3)第1及び第2のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブ;
ここで、捕獲核酸及びトレーサー核酸は、前記抗薬物抗体が結合するエピトープを有する。 - 捕獲核酸及びトレーサー核酸の前記抗薬物抗体に対するエピトープが同じである、請求項17に記載のキット。
- 以下を特徴とする、捕獲核酸とトレーサー核酸とを含む二重抗原架橋イムノアッセイを用いて試料中の抗薬物抗体を免疫学的に測定するための方法:
ここで、捕獲核酸及びトレーサー核酸は、前記抗薬物抗体が結合するエピトープを有する。
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