WO2013172305A1 - Ｒｎａの検出方法及び検出用キット - Google Patents

Ｒｎａの検出方法及び検出用キット Download PDF

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WO2013172305A1
WO2013172305A1 PCT/JP2013/063297 JP2013063297W WO2013172305A1 WO 2013172305 A1 WO2013172305 A1 WO 2013172305A1 JP 2013063297 W JP2013063297 W JP 2013063297W WO 2013172305 A1 WO2013172305 A1 WO 2013172305A1
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probe
region
nucleic acid
rna
signal amplification
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PCT/JP2013/063297
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利彦 藤川
雅子 大澤
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エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting RNA, such as microRNA (microRNA, miRNA) and messenger RNA (mRNA), a detection kit, and a signal amplification probe used in the method, and particularly detects RNA with high sensitivity and ease.
  • RNA detection method a detection kit, and a signal amplification probe.
  • Micro RNA is a kind of small RNA transcribed in various eukaryotes including humans. After being transcribed as a primary transcription product (pri-miRNA) from a non-gene region or intron in the genome, and by processing, a hairpin microRNA precursor (pre-miRNA) is generated. It becomes RNA (mature-miRNA) (Non-patent Document 1). It has been clarified that this microRNA functions as a regulator in the process of translation from transcribed mRNA to protein (Non-patent Document 2). Currently, it is expected that more than 800 types of microRNAs exist on the human genome (Non-Patent Document 3), but many messengers (mRNAs) that are targets of their regulatory functions have not been identified.
  • Non-patent Document 4 studies so far have revealed that many microRNAs regulate the expression of genes involved in the generation, differentiation, and cell proliferation of multicellular organisms.
  • microRNAs that are thought to function in cell carcinogenesis and tumor suppression mechanisms have also been reported, and these have increased or decreased expression levels in cancer cells compared to normal cells.
  • Non-Patent Document 5 Therefore, in the future, it will be possible to perform profiling on canceration of cells and tissues by examining the expression level of microRNAs. In the future, identification and quantification of microRNAs in cells and tissues will be possible. Is expected to be one of the important items for cancer diagnosis.
  • Non-patent Document 6 Northern blot method
  • primer extension method Non-patent documents 7 and 8
  • invader method Non-patent document 9
  • signal amplification method of ribozyme Non-patent document 10
  • mirMASA bead-based technology Non-patent document 11
  • bead-based flow cytometry Non-patent document 12
  • real-time RT-PCR Non-patent documents 13 and 14
  • microarray Nano-patent document 15
  • a labeling method using gold particles has been attempted.
  • a kit using an RNase protection assay is also on the market (Non-patent Document 17).
  • messenger RNA is a nucleic acid that plays a part in gene expression and is synthesized by the action of RNA polymerase using DNA as a template (transcription). Subsequently, the target protein is synthesized by the ribosome using the genetic information of the messenger RNA (translation). It can be said that this is a very important factor for expressing a protein from DNA.
  • tRNAs transfer RNAs
  • rRNAs ribosomal RNAs
  • eukaryotic messenger RNAs have a CAP structure at the 5 'end and a poly A at the 3' end. These structures also have a function of controlling the degradation of the messenger RNA itself.
  • proteins have been used as biomarkers mainly as a biochemical approach.
  • it may be difficult to prepare an antibody for detecting a protein and a protein alone is not sufficient as a biomarker in terms of sensitivity and specificity.
  • studies have been conducted on whether the expression of messenger RNA that is a source of protein can be used as a biomarker related to diseases.
  • the expression of messenger RNA that is a source of protein can be used as a biomarker related to diseases.
  • the expression profile of messenger RNAs specific to a certain disease has been revealed.
  • RNA of a gene as a diagnostic agent related to myeloid leukemia has become a biomarker and is actually listed as an in-vitro diagnosis in Japan.
  • the usefulness of messenger RNA as a next-generation biomarker that replaces protein is expected to increase in the future.
  • the above method requires a step of converting the target messenger RNA from RNA to DNA by reverse transcription, or it must be amplified by PCR (such as real-time RT-PCR).
  • PCR such as real-time RT-PCR.
  • problems such as complicated operation (messenger array) that takes more than a day and difficult to analyze various target nucleic acids simultaneously (real-time PCR).
  • Patent Documents 1 and 2 disclose novel isothermal signal amplification methods that do not use enzymes.
  • This method is a method of self-assembling a pair of oligonucleotide probes each holding a complementary base sequence region to form an assembly of probes (probe polymer).
  • the present invention is applied to detection of a target nucleic acid in a sample.
  • This method uses, for example, a probe (assist probe) having both a target nucleic acid and a complementary base sequence and a probe and a complementary sequence to the probe polymer formation, or a complementary base sequence region of the probe to be used.
  • a method for effectively detecting a target nucleic acid by forming a probe polymer by directly or indirectly binding the probe and the target nucleic acid by forming a base sequence complementary to the target nucleic acid at one location of This is called the PALSAR method.
  • Patent Document 3 discloses a method for detecting a low-molecular nucleic acid containing microRNA.
  • this method has an advantage such as not modifying the microRNA, but has a problem in that the sensitivity and the reaction temperature are limited because the sensitivity is several hundreds amol level.
  • An object of the present invention is to provide an RNA detection method, a detection kit, and a signal amplification probe used in the method, which can detect RNA such as micro RNA and messenger RNA with high sensitivity and ease. .
  • the present inventors have conducted extensive research. As a result, surprisingly, in the signal amplification probe for hybridization reaction used in the pulsar method, one region of one signal amplification probe is selected.
  • Poly A which is a nucleic acid sequence in which adenine (A) is continuous at the 3 ′ end of the target RNA
  • a signal amplification probe having a region containing poly T sequence which is a nucleic acid sequence in which thymine (T) is continuous Is added, and then the RNA captured by the capture probe is reacted with the signal amplification probe to form a detection complex containing the probe polymer, and the probe polymer is detected to detect RNA with high sensitivity.
  • T thymine
  • RNA in the method for detecting RNA of the present invention, (A) a capture step of capturing RNA that may contain a poly A sequence at the 3 ′ end with a capture substance for capturing the RNA, ie, RNA A capture step of capturing with a capture substance for capturing; (B) reacting the captured RNA with one or more types of signal amplification probes capable of self-assembly, and the RNA; the capture substance; A detection complex forming step of forming a detection complex including a probe polymer formed by the signal amplification probe, and (C) detecting the probe polymer bound to the detection complex, Detecting a target RNA comprising the step of detecting the RNA, wherein one of the signal amplification probes in the signal amplification probe is poly-T It characterized by having a column.
  • the length of the poly T sequence of the signal amplification probe is preferably 11 to 26 bases.
  • the signal amplification probe having the poly T sequence preferably has the poly T sequence at the 3 ′ end.
  • At least one of the signal amplification probes is labeled with a labeling substance.
  • the capture substance includes a base sequence complementary to the RNA and is fixed to a carrier or a portion that can be fixed to the carrier is introduced.
  • the hybridization reaction is not particularly limited, but the nucleic acid is self-assembled by hybridization using a plurality of types of nucleic acid probes having complementary base sequence regions that can hybridize with each other. More preferably, it includes a self-assembly reaction that forms a self-assembly of chains.
  • RNA detection method of the present invention (A) a capture step of capturing RNA with a capture substance for capturing the RNA, (B) the captured RNA, A probe polymer formed by reacting the signal amplification probe and the second signal amplification probe, and the RNA, the capture substance, the first signal amplification probe, and the second signal amplification probe; And (C) detecting the RNA by detecting the probe polymer bound to the detection complex, and a method for detecting a target RNA.
  • the first signal amplification probe includes at least a nucleic acid region X, a nucleic acid region Y, and a nucleic acid region Z including a poly T sequence in this order from the 5 ′ end side.
  • the second signal amplification probe is a nucleic acid region X ′ complementary to at least the nucleic acid region X, a nucleic acid region Y ′ complementary to the nucleic acid region Y, and the nucleic acid in this order from the 5 ′ end. It is a nucleic acid probe including a nucleic acid region Z ′ complementary to the region Z.
  • the length of the poly T sequence of the first signal amplification probe is preferably 11 to 26 bases.
  • the length of the nucleic acid region X of the first signal amplification probe is 11 to 20 bases, the length of the nucleic acid region Y is 11 to 20 bases, and the length of the nucleic acid region Z is 11 to 26.
  • a base is preferred.
  • the first signal amplification probe and / or the second signal amplification probe is labeled with a labeling substance.
  • any of RNA having a poly A sequence that is a nucleic acid sequence in which adenine (A) such as mRNA is continuous and RNA having no poly A sequence can be detected.
  • A adenine
  • the poly A sequence of the target RNA and the poly T sequence of the signal amplification probe are hybridized to form a detection complex. By detecting, the target RNA can be detected.
  • RNA having no poly A sequence as a target RNA
  • micro RNA having no poly A sequence either before or after the step (A) (preferably before step (A))
  • step (D) By performing a poly A addition step of adding poly A to the 3 ′ end of the microRNA, the poly A sequence of the target RNA added with poly A and the poly T sequence of the signal amplification probe are hybridized, A detection complex is formed, and the target RNA can be detected by detecting the detection complex.
  • the RNA detection kit of the present invention is a RNA detection kit comprising a capture substance for capturing a target RNA and one or more types of signal amplification probes, wherein the plurality of types of signal amplification probes are used.
  • a plurality of types of signal amplification probes having complementary base sequence regions that can hybridize with each other and capable of forming a probe polymer by a self-assembly reaction, wherein one signal in the plurality of types of signal amplification probes
  • the amplification probe has a poly T sequence
  • the one kind of signal amplification probe is one kind of signal amplification probe having a poly T sequence and including three or more nucleic acid regions,
  • Each nucleic acid region of the signal amplification probe comprises a first region and a second region complementary to the first region adjacent to each other.
  • the plurality of types of signal amplification probes comprise a first signal amplification probe and a second signal amplification probe, and the first signal amplification probe comprises at least a nucleic acid region X in order from the 5 ′ end side, A nucleic acid probe comprising a nucleic acid region Y and a nucleic acid region Z containing a poly-T sequence, wherein the second signal amplification probe is a nucleic acid region X ′ complementary to at least the nucleic acid region X in order from the 5 ′ end side; A nucleic acid probe comprising a nucleic acid region Y ′ complementary to the nucleic acid region Y and a nucleic acid region Z ′ complementary to the nucleic acid region Z is preferred.
  • the signal amplification probe of the present invention is one or a plurality of signal amplification probes used in the RNA detection method of the present invention, and the plurality of signal amplification probes are complementary to each other so that they can hybridize with each other.
  • a plurality of types of signal amplification probes having a base sequence region and capable of forming a probe polymer by a self-assembly reaction, wherein one of the plurality of types of signal amplification probes has a poly T sequence.
  • the one type of signal amplification probe is a single type of signal amplification probe having a poly T sequence and including three or more nucleic acid regions, each nucleic acid region of the one type of signal amplification probe Includes a first region and a second region complementary to the first region adjacent to each other.
  • the length of the poly T sequence of the signal amplification probe is preferably 11 to 26 bases.
  • the signal amplification probe having the poly T sequence preferably has the poly T sequence at the 3 ′ end.
  • At least one of the signal amplification probes is labeled with a labeling substance.
  • a first example of the plurality of types of signal amplification probes is a pair of signal amplification probes including a first signal amplification probe and a second signal amplification probe, wherein the first signal amplification probe Is a nucleic acid probe including at least a nucleic acid region X, a nucleic acid region Y, and a nucleic acid region Z including a poly-T sequence in order from the 5 ′ end side, and the second signal amplification probe is at least in order from the 5 ′ end side.
  • a nucleic acid probe comprising a nucleic acid region X ′ complementary to the nucleic acid region X, a nucleic acid region Y ′ complementary to the nucleic acid region Y, and a nucleic acid region Z ′ complementary to the nucleic acid region Z.
  • a second example of the plurality of types of signal amplification probes is a plurality of dimer probes or a dimer formation probe that forms the dimer probe, and each dimer probe of the plurality of dimer probes is for two types of dimer formation.
  • a dimer formed from a probe, each dimer forming probe includes three regions, a 5 ′ side region, a central region and a 3 ′ side region, and the two types of dimer forming probes are complementary to each other in the central region.
  • the 3 ′ region and the 5 ′ region are non-complementary to each other, and each 5 ′ region of each dimer probe of the plurality of dimer probes is different from any 5 ′ region of any other dimer probe.
  • Complementary and characterized in that each 3 ′ region of each dimer probe is complementary to any 3 ′ region of any other dimer probe.
  • the length of the 5 ′ side region of the signal amplification probe is 11 to 20 bases, the length of the central region is 11 to 20 bases, and the length of the 3 ′ side region is 11 to 26 bases. Preferably it is.
  • a third example of the plurality of types of signal amplification probes includes a pair of dimer formation probes or a pair of dimer probes formed from the pair of dimer formation probes and one or more cross-linking probes.
  • Each of the dimer-forming probes includes three regions, a 5′-side region, a central region, and a 3′-side region, and the central regions of the pair of dimer-forming probes are complementary to each other, and the pair of dimer-forming probes
  • Each 3′-side region and 5′-side region of the forming probe are all non-complementary to each other, and each of the cross-linking probes includes two regions, a 5′-side region and a 3′-side region.
  • the 'side region is complementary to the 3' side region of each dimer forming probe
  • the 5 'side region of each cross-linking probe is the 5' side region of each dimer forming probe. Characterized in that each complementary.
  • the length of the 5 ′ side region of the signal amplification probe is 11 to 20 bases, the length of the central region is 11 to 20 bases, and the length of the 3 ′ side region is 11 to 26 bases. Preferably it is.
  • RNA detection method it is possible to provide an RNA detection method, a detection kit, and a signal amplification probe for a hybridization reaction that can be used for detecting a target RNA with high sensitivity and ease.
  • the present invention does not require a reverse transcription reaction and does not require an assist probe for linking the probe polymer and the target RNA, and can easily detect the target RNA.
  • simultaneous detection of a plurality of types of target RNA such as microRNA and mRNA is also possible.
  • FIG. 16 is a schematic explanatory diagram illustrating a binding mode of the signal amplification probe illustrated in FIG. 15. It is a schematic explanatory drawing which shows the probe polymer formed using the probe for signal amplification of FIG. It is a schematic explanatory drawing which shows the example of the 2nd aspect of the detection method of RNA of this invention, (a) is microRNA, (b) is the micro RNA to which poly A was added after the poly A addition process, (c) Is the microRNA captured by the capture substance after the capture step, and (d) is the detection complex after the detection complex formation step. 3 is a graph showing the results of Example 1.
  • Example 6 is a graph showing the results of Comparative Example 1.
  • 10 is a graph showing the results of Example 2.
  • 10 is a graph showing the results of Comparative Example 2. It is a graph which shows the correlation diagram of the result of Example 2 and Comparative Example 2.
  • 10 is a graph showing the results of Example 3. It is a graph which shows the result of Example 4.
  • 10 is a graph showing the results of Example 5.
  • the RNA detection method of the present invention comprises (A) a capture step of capturing RNA with a capture substance for capturing the RNA, (B) the captured RNA, and one or more types capable of self-assembly.
  • the amplification probe has a poly T sequence.
  • any of RNA having a poly A sequence that is a nucleic acid sequence in which adenine (A) such as mRNA is continuous and RNA having no poly A sequence can be detected.
  • A adenine
  • the poly A sequence of the target RNA and the poly T sequence of the signal amplification probe are hybridized to form a detection complex. By detecting, the target RNA can be detected.
  • RNA having no poly A sequence as a target RNA
  • micro RNA having no poly A sequence either before or after the step (A) (preferably before step (A))
  • step (D) By performing a poly A addition step of adding poly A to the 3 ′ end of the microRNA, the poly A sequence of the target RNA added with poly A and the poly T sequence of the signal amplification probe are hybridized, A detection complex is formed, and the target RNA can be detected by detecting the detection complex.
  • the target RNA is a messenger RNA having a poly A tail
  • the target RNA is a messenger RNA having a poly A tail
  • a capture step of reacting and capturing the messenger RNA (B) reacting the captured messenger RNA and one or more types of signal amplification probes; and reacting the messenger RNA, the capture substance, and the signal A detection complex comprising a probe polymer formed by an amplification probe; and (C) detecting the probe polymer bound to the detection complex, thereby detecting the messenger.
  • a method of detecting messenger RNA comprising a detection step of detecting RNA
  • the plurality of types of signal amplification probes are a plurality of types of signal amplification probes having complementary base sequence regions that can hybridize with each other and capable of forming a probe polymer by a self-assembly reaction
  • One signal amplification probe in the plurality of types of signal amplification probes has a poly T sequence
  • the one type of signal amplification probe has a poly T sequence and includes three or more nucleic acid regions.
  • Each nucleic acid region of the one type of signal amplification probe includes a first region and a second region complementary to the first region adjacent to each other.
  • RNA is detected using a pair of signal amplification probes consisting of a first signal amplification probe and a second signal amplification probe.
  • FIG. 1 is a schematic explanatory view showing an example of the first aspect of the RNA detection method of the present invention, in which (a) is a messenger RNA captured by a capture substance after the capture step, and (b) is a detection complex. The composite for detection after a body formation process is shown, respectively.
  • FIG. 2 is a schematic explanatory view showing an example of a pair of signal amplification probes used for probe polymer formation
  • FIG. 3 shows a probe polymer formed using the pair of signal amplification probes shown in FIG. It is a schematic explanatory drawing.
  • reference numeral 10a is a messenger RNA.
  • the present invention is preferably used for detection of messenger RNA having poly A at the 3 ′ end, and is preferably used for detection of messenger RNA of 300 to 7000 bases, and detection of messenger RNA of about 300 to 3000 bases. Is particularly preferably used. At the same time, various nucleic acid molecules can be detected.
  • a messenger RNA 10a having poly A and a capture substance 14 for capturing the target messenger RNA 10a are reacted to perform a capture step for capturing the messenger RNA 10a [step (A)].
  • the capture substance 14 may be any substance that can specifically bind to the target messenger RNA, and is not particularly limited.
  • the capture substance 14 includes a base sequence complementary to the target messenger RNA 10a and is fixed to the carrier 16 or the carrier 16 It is preferable that a portion that can be fixed to is introduced.
  • the carrier 16 for example, a substrate such as a fluorescent microparticle, a magnetic particle, a microplate, a microarray, a slide glass, or an electrically conductive substrate is preferably used.
  • FIG. 1 shows an example in which fine particles are used, the carrier 16 is not particularly limited in the present invention.
  • the carrier 16 is directly bonded to a capture nucleic acid probe containing a base sequence complementary to the target messenger RNA 10a, the capture nucleic acid probe and other organic substances can be used together with the capture nucleic acid probe.
  • the carrier 16 may be bound.
  • a carrier 16 may be used in which the capture nucleic acid probe further includes a capture region K, and a second capture probe having a region K ′ complementary to the capture region K is immobilized.
  • a detection complex forming step for forming a detection complex 30 including the probe polymer 22 formed by the first signal amplification probe 18a and the second signal amplification probe 18b is performed by detecting the probe polymer 22 bound to the detection complex 30 [Step (C)], and the messenger RNA is detected.
  • the first signal amplification probe 18a includes at least a nucleic acid region X, a nucleic acid region Y, and a nucleic acid region Z including a poly T sequence in this order from the 5 ′ end side.
  • a nucleic acid probe, and the second signal amplification probe 18b includes, in order from the 5 ′ end, at least a nucleic acid region X ′ complementary to the nucleic acid region X, a nucleic acid region Y ′ complementary to the nucleic acid region Y, and A nucleic acid probe comprising a nucleic acid region Z ′ complementary to the nucleic acid region Z.
  • the first signal amplification probe 18a and the second signal amplification probe 18b By causing the first signal amplification probe 18a and the second signal amplification probe 18b to react, as shown in FIG. 3, the first signal amplification probe 18a and the second signal amplification probe 18b become Self-assembly and an assembly (probe polymer 22) are formed.
  • the first signal amplification probe 18a used in the present invention has a nucleic acid region Z containing a poly T sequence, it can bind to a messenger RNA 10a having a poly A tail. Therefore, as shown in FIG. 1B, by reacting the captured messenger RNA 10a having a poly A tail, the first signal amplification probe 18a and the second signal amplification probe 18b, the messenger RNA 10a, A detection complex 30 including the capture substance 14 and a probe polymer 22 formed by the first signal amplification probe 18a and the second signal amplification probe 18b is formed, and the probe polymer 22 is detected. By doing so, messenger RNA can be detected with high sensitivity and ease.
  • the detection method of the probe polymer is not particularly limited, and for example, detection by fluorescence, luminescence, color development or the like is preferable.
  • FIG. 1 shows an example using the capture substance 14 immobilized on the carrier 16 in advance, but the timing for immobilizing the capture substance 14 on the carrier 16 is not particularly limited. After the formation, the capture substance 14 and the carrier 16 may be bound directly or indirectly.
  • each nucleic acid region in the first signal amplification probe 18a and the second signal amplification probe 18b is not particularly limited, but is preferably 5 bases or more, more preferably 8 bases or more, and nucleic acid regions X and X ′. Is preferably 11 to 20 bases, the nucleic acid regions Y and Y ′ are 11 to 20 bases in length, and the nucleic acid regions Z and Z ′ are particularly preferably 11 to 26 bases in length. .
  • the length of each nucleic acid region in each probe may be the same or different, but is preferably the same.
  • FIGS. 1 to 3 show examples using a pair of signal amplification probes in which the number of complementary nucleic acid regions is 3, but a pair of signals in which the number of complementary nucleic acid regions is 4 or more is shown. An amplification probe may be used.
  • a plurality of dimer probes capable of self-assembly or a dimer formation probe that forms the dimer probe can be mentioned.
  • the plurality of dimer probes are such that each 5 ′ region of one dimer probe of the plurality of dimer probes is complementary to any 5 ′ region of any of the other dimer probes, and one dimer of the plurality of dimer probes.
  • Each 3 'region of the probe is configured to be complementary to any 3' region of another dimer probe, and can self-assemble to form an assembly (probe polymer)
  • the nucleic acid probe described in Patent Document 5 is used.
  • first dimer probe 40a and second dimer probe 40b show an example in which two pairs of dimer probes (first dimer probe 40a and second dimer probe 40b) are used.
  • the first dimer probe 40a is formed by hybridizing two types of single-stranded nucleic acid probes (first dimer formation probe 41a and second dimer formation probe 41b).
  • the first dimer formation probe 41a includes three regions, a 5 ′ side region (region A), a central region (region B), and a 3 ′ side region (region C), and the second dimer formation probe 41b is 5 ′.
  • the first dimer-forming probe 41a and the second dimer-forming probe 41b include a side region (region D), a central region (region B ′), and a 3′-side region (region F). B and B ′) are complementary to each other and the 3 ′ region (regions C and F) and the 5 ′ region (regions A and D) are non-complementary to each other.
  • the second dimer probe 40b is formed by hybridizing two kinds of single-stranded nucleic acid probes (third dimer formation probe 41c and fourth dimer formation probe 41d).
  • the third dimer formation probe 41c includes three regions, a 5 ′ side region (region A ′), a central region (region E), and a 3 ′ side region (region C ′).
  • the fourth dimer formation probe 41d includes: 3 region including 5 ′ side region (region D ′), central region (region E ′) and 3 ′ side region (region F ′), the third dimer forming probe 41c and the fourth dimer forming probe 41d are Central regions (regions E and E ′) are complementary to each other and the 3 ′ side regions (regions C ′ and F ′) and the 5 ′ side regions (regions A ′ and D ′) are non-complementary to each other .
  • the region A ′ is a region having a base sequence complementary to the region A
  • the region C ′ is a region having a base sequence complementary to the region C
  • the region D ′ is complementary to the region D.
  • Region F ′ means a region having a base sequence
  • region F ′ means a region having a base sequence complementary to region F.
  • the 5 ′ region (regions A and D) of the first dimer probe 40a is complementary to the 5 ′ region (regions A ′ and D ′) of the second dimer probe 40b, and is 3 ′ side of the first dimer probe 40a.
  • the regions (regions C and F) are complementary to the 3 ′ region (regions C ′ and F ′) of the second dimer probe 40b, and by hybridizing the first and second dimer probes 40a and 40b, A signal probe polymer 50 can be formed (FIG. 5).
  • the 5′-side region and the 3′-side region of the first dimer-forming probe 41a are complementary to the 5′-side region and the 3′-side region of the third dimer-forming probe 41c, respectively.
  • the 5 ′ side region and the 3 ′ side region of the probe 41b are complementary to the 5 ′ side region and the 3 ′ side region of the fourth dimer formation probe 41d, respectively. If the 5 ′ region of one dimer probe is complementary to the 5 ′ region of another dimer probe and the 3 ′ region of one dimer probe is complementary to the 3 ′ region of another dimer probe It ’s good.
  • FIG. 6 is a schematic explanatory view showing another example (second example) of the second dimer probe used together with the first dimer probe 40a shown in FIG.
  • the 5 ′ side region is a region (region A ′) complementary to the 5 ′ side region of the first dimer formation probe 41a shown in FIG. 4, and the 3 ′ side region is shown in FIG.
  • the dimer-forming probe 41e which is a region complementary to the 3′-side region of the second dimer-forming probe 41b (region F ′), and the 5′-side region are 5 ′ of the second dimer-forming probe 41b shown in FIG.
  • Dimer formation which is a region complementary to the side region (region D ′) and the 3 ′ side region is a region complementary to the 3 ′ side region of the first dimer formation probe 41a shown in FIG. 4 (region C ′).
  • the dimer probe 40c formed by hybridizing the probe 41f for use can also be used as the second dimer probe.
  • FIG. 4 shows an example in which two types of dimer probes are used, but more types of dimer probes can be used if the positional relationship between complementary regions is devised (Patent Document 5).
  • FIG. 7 is a schematic explanatory view showing an example (third example) when three sets of dimer probes (first dimer probe 40a, second dimer probe 40d, and third dimer probe 40e) are used.
  • the first dimer probe 40a is configured in the same manner as in FIG.
  • the second dimer probe 40d is formed by hybridizing two types of single-stranded nucleic acid probes (dimer-forming probes 41g and 41h).
  • the dimer-forming probe 41g includes three regions, a 5 ′ side region (region G), a central region (region E), and a 3 ′ side region (region C ′), and the 3 ′ side region (region C ′) is the first. It is complementary to the 3 ′ side region (region C) of the dimer probe 40a.
  • the dimer-forming probe 41h includes three regions, a 5 ′ side region (region D ′), a central region (region E ′), and a 3 ′ side region (region H), and the 5 ′ side region (region D ′) is the first region. It is complementary to the 5 ′ side region (region D) of one dimer probe 40a.
  • the central region E of the dimer forming probe 41g is complementary to the central region E ′ of the dimer forming probe 41h.
  • the third dimer probe 40e is formed by hybridizing two types of single-stranded nucleic acid probes (dimer-forming probes 41j and 41k).
  • the dimer-forming probe 41j includes three regions, a 5 ′ side region (region A ′), a central region (region J), and a 3 ′ side region (region H ′).
  • the 5 ′ side region (region A ′) is the first region.
  • the 5 ′ side region (region A) of the 1 dimer probe 40a is complementary
  • the 3 ′ side region (region H ′) is complementary to the 3 ′ side region (region H) of the second dimer probe 40d.
  • the dimer-forming probe 41k includes three regions, a 5 ′ side region (region G ′), a central region (region J ′), and a 3 ′ side region (region F ′), and the 5 ′ side region (region G ′).
  • the 5 ′ side region (region G) of the second dimer probe 40d is complementary
  • the 3 ′ side region (region F ′) is complementary to the 3 ′ side region (region F) of the first dimer probe 40a.
  • the region J ′ is a region complementary to the region J.
  • one 5 ′ region and one 3 ′ region of the first dimer probe are complementary to one 5 ′ region and one 3 ′ region of the second dimer probe
  • the other 5 ′ side region and the other 3 ′ side region of the first dimer probe are complementary to one 5 ′ side region and one 3 ′ side region of the third dimer probe, and the other of the second dimer probe.
  • the 5 ′ side region and the other 3 ′ side region are configured to be complementary to the other 5 ′ side region and the other 3 ′ side region of the third dimer probe.
  • each 3′-side region of each dimer probe is made complementary to any 3′-side region of any other dimer probe, and each 5′-side region of each dimer probe is made to each other dimer probe.
  • a signal probe polymer that is an assembly of dimer probes by hybridizing these plural types of dimer probes using a plurality of types of dimer probes configured to be complementary to any 5′-side region of the probe Is formed.
  • the combination of dimer probes having a complementary relationship is not particularly limited, but as shown in FIG. 7, one 3 ′ side region and one 5 ′ side region in each dimer probe, It is preferable that each of the other dimer probes is configured to be complementary to one 3 ′ region and one 5 ′ region.
  • each complementary region of the dimer-forming probe is at least 5 bases, preferably at least 8 bases, more preferably 10 bases to 100 bases, more preferably 12 to 30 bases. Moreover, it is desirable that the lengths of complementary regions in each probe are the same.
  • a dimer-forming probe before dimer probe formation may be used instead of a dimer probe, but a dimer probe is preferably used.
  • any 3 ′ region (for example, regions C, F, H) of the second example of the signal amplification probe contains a poly T sequence and is complementary to this (for example, regions C ′, F ′).
  • H ′) contain a poly A sequence.
  • a pair of dimer formation probes or a pair of dimer probes formed from the pair of dimer formation probes, one or more types of cross-linking probes, And a plurality of types of signal amplification probes a pair of dimer formation probes or a pair of dimer probes formed from the pair of dimer formation probes, one or more types of cross-linking probes, And a plurality of types of signal amplification probes.
  • Each of the dimer forming probes includes three regions, a 5 ′ side region, a central region, and a 3 ′ side region, and the central regions of the pair of dimer forming probes are complementary to each other.
  • each of the 3′-side region and the 5′-side region of each of the probes for use is non-complementary to each other, and each of the bridging probes includes two regions of a 5′-side region and a 3′-side region,
  • the 5 ′ side region is complementary to any 5 ′ side region of the cross-linking probe
  • the 3 ′ side region of each dimer-forming probe is complementary to any 3 ′ side region of the cross-linking probe.
  • the cross-linking probe is configured to cross-link a dimer formed from the dimer-forming probe, and self-assembles to form an aggregate (probe polymer).
  • FIG. 8 shows a first example in which a pair of dimer forming probes and a pair of cross-linking probes are used.
  • (a) is formed from a pair of dimer formation probes (first dimer formation probe 61a, second dimer formation probe 61b) and a pair of dimer formation probes 61a and 61b. This is a dimer probe 60a.
  • the pair of dimer forming probes is composed of two kinds of single-stranded nucleic acid probes (first dimer forming probe 61a and second dimer forming probe 61b), and each dimer forming probe is used.
  • the probes 61a and 61b include at least three regions: a central region, a 5 ′ side region located 5 ′ from the central region, and a 3 ′ side region located 3 ′ from the central region.
  • the 5′-side region of the first dimer-forming probe 61a is indicated by region A
  • the central region is indicated by region B
  • the 3′-side region is indicated by region C
  • the 5′-side region of the second dimer-forming probe 61b is indicated by the region.
  • D the central area is indicated by area B ′
  • the 3 ′ side area is indicated by area F.
  • the central regions (regions B and B ′) of the first dimer formation probe 61a and the second dimer formation probe 61b are complementary to each other, and the first dimer formation probe 61a and the second dimer formation probe 61b
  • the four regions of the 5 ′ region (regions A and D) and the 3 ′ region (regions C and F) are all non-complementary to each other, and a pair of dimer probes 60a is formed by hybridizing the two regions.
  • a dimer probe formed by previously hybridizing a pair of dimer-forming probes may be used, or the dimer-forming probe may be used as it is, but a dimer probe is preferably used.
  • each pair of dimer forming probes is configured in the same manner as in the case of the one pair described above.
  • the same number of dimer probes are formed by a plurality of pairs of dimer forming probes.
  • FIG. 14A and 14B are schematic explanatory views showing an example of two pairs of dimer forming probes and two sets of dimer probes formed from the pair of dimer forming probes.
  • (a) is formed from a pair of dimer formation probes (first dimer formation probe 71a, second dimer formation probe 71b) and a pair of dimer formation probes 71a and 71b.
  • (B) is a second pair of dimer formation probes (first dimer formation probe 71c, second dimer formation probe 71d), and the pair of dimer formation probes 71c, 71d. Is a dimer probe 70b.
  • FIG. 14A and 14B are schematic explanatory views showing an example of two pairs of dimer forming probes and two sets of dimer probes formed from the pair of dimer forming probes.
  • (a) is formed from a pair of dimer formation probes (first dimer formation probe 71a, second dimer formation probe 71b) and a pair of dimer formation
  • the first set of first dimer forming probes 71a is shown as a region A, the central region is shown as region B, and the 3 ′ side region is shown as region C.
  • the first set of second dimer forming probes 71a The 5 ′ side region of 71b is a region D, the central region is a region B ′, the 3 ′ side region is a region F, the 5 ′ side region of the second pair of first dimer forming probes 71c is the region G, and the central region is The region E, the 3 ′ side region is indicated by a region H, the 5 ′ side region of the second pair of second dimer forming probes 71d is indicated by the region I, the central region is indicated by the region E ′, and the 3 ′ side region is indicated by the region J.
  • the central regions (regions B and B ′, regions E and E ′) of the first and second dimer forming probes in each set are complementary to each other, and 5 of each pair of the first and second dimer forming probes.
  • the four regions (regions A, C, D and F, regions G, H, I and J) of the 'side region and the 3' side region are all non-complementary to each other, and each pair of dimer forming probes 71a, By hybridizing 71b, 71c, 71d, two sets of dimer probes 70a, 70b are formed.
  • the 3 ′ side region and the 5 ′ side region of the dimer-forming probe to be used are all non-complementary to each other.
  • the cross-linking probe is one or more single-stranded nucleic acid probes capable of cross-linking a dimer probe formed from a dimer-forming probe, and includes at least two regions. Of the two regions, a region located on the 5 'side is referred to as a 5' side region, and a region located on the 3 'side is referred to as a 3' side region.
  • the 5′-side region of each dimer-forming probe is complementary to any 5′-side region of each cross-linking probe, and the 3′-side region of each dimer-forming probe is any of the cross-linking probes. Complementary to the 3 'region.
  • the cross-linking probe binds to the dimer-forming probe so as to cross-link one or more dimer probes formed from the dimer-forming probe, and an assembly of probes (probe polymer) is formed. Can be formed.
  • first dimer formation probe and second dimer formation probe and one pair of cross-linking probes (first cross-linking probe and second cross-linking probe) are used for a pair of dimer formation.
  • Each 5 ′ side region of the probe is complementary to any 5 ′ side region of any of the pair of cross-linking probes, and each 5 ′ side region of the pair of cross-linking probes is any of the pair of dimer forming probes.
  • each 3′-side region of the pair of dimer forming probes is complementary to any 3′-side region of the pair of cross-linking probes, and each of the pair of cross-linking probes 3
  • the 'side region is configured to be complementary to the 3' side region of either of the pair of dimer forming probes.
  • FIG. 8B shows an example of a pair of bridging probes (first bridging probe 62a and second bridging probe 62b) used together with the pair of dimer formation probes 61a and 61b shown in FIG. 8A. It is a schematic explanatory drawing.
  • a cross-linking probe used together with a pair of dimer forming probes 61a and 61b shown in FIG. 8A, for example, as shown in FIG.
  • the 5′-side region of the first cross-linking probe 62a is , Complementary to the 5′-side region (region A) of the first dimer-forming probe 61a, and the 3′-side region of the first cross-linking probe 62a is the 3′-side region (region C) of the first dimer-forming probe 61a.
  • the 5′-side region of the second cross-linking probe 62b is complementary to the 5′-side region (region D) of the second dimer formation probe 61b and is 3′-side of the second cross-linking probe 62b.
  • the region is preferably a pair of cross-linking probes that are complementary to the 3′-side region (region F) of the second dimer-forming probe 61b.
  • the signal probe polymer 68 can be formed by hybridizing the dimer formation probes 61a-61b shown in FIG. 8 (a) and the cross-linking probes 62a-62b shown in FIG. 8 (b) (FIG. 9).
  • the 5′-side region and the 3′-side region of the first dimer-forming probe 61a are complementary to the 5′-side region and the 3′-side region of the first bridging probe 62a, respectively, and the second dimer-forming probe 61b.
  • the 5 ′ side region and the 3 ′ side region of the second bridging probe 62b are complementary to the 5 ′ side region and the 3 ′ side region, respectively. It is sufficient that the 'side region is complementary to the 5' side region of one cross-linking probe and the 3 'side region of one dimer forming probe is complementary to the 3' side region of one cross-linking probe. .
  • FIG. 10 shows another example of a pair of cross-linking probes used together with the pair of dimer forming probes 61a and 61b shown in FIG. 8 (first cross-linking probe 62c and second cross-linking probe 62d) (second example). It is a schematic explanatory drawing which shows. As shown in FIG. 10, as another example of a pair of cross-linking probes, the 5′-side region of the first cross-linking probe 62c is complementary to the 5′-side region (region A) of the first dimer-forming probe 61a.
  • the 3′-side region of the first cross-linking probe 62c is complementary to the 3′-side region (region F) of the second dimer-forming probe 61b, and the 5′-side region of the second cross-linking probe 62d is the second dimer.
  • the 5′-side region (region D) of the forming probe 61b is complementary
  • the 3′-side region of the second cross-linking probe 62d is complementary to the 3′-side region (region C) of the first dimer-forming probe 61a.
  • a pair of cross-linking probes can be formed by hybridizing the dimer formation probes 61a-61b shown in FIG. 8 (a) and the cross-linking probes 62c-62d shown in FIG. 10 (FIG. 11).
  • n pairs (n is an integer of 2 or more) of a pair of dimer formation probes (that is, 2n dimer formation probes) and n pairs of crosslink probes (that is, 2n crosslink probes).
  • the 5′-side region of each dimer-forming probe is complementary to any 5′-side region of the cross-linking probe, and the 5′-side region of each cross-linking probe is any of the dimer-forming probes.
  • the 3 ′ side region of each dimer-forming probe is complementary to any 3 ′ side region of the cross-linked probe, and the 3 ′ side region of each cross-linked probe is It is preferable to configure so as to be complementary to any 3 ′ side region of the dimer-forming probe.
  • FIGS. 14C and 14D are schematic views showing an example of two pairs of bridging probes 72a to 72d used together with the two pairs of dimer forming probes 71a to 71d shown in FIGS. 14A and 14B. It is explanatory drawing.
  • (c) is a pair of cross-linking probes (first cross-linking probe 72a and second cross-linking probe 72b), and (d) is a second pair of cross-linking probes (first cross-linking probe 72c). , Second cross-linking probe 72d).
  • FIG. 14 is a pair of cross-linking probes (first cross-linking probe 72a and second cross-linking probe 72b)
  • first cross-linking probe 72c first cross-linking probe 72c
  • Second cross-linking probe 72d Second cross-linking probe 72d.
  • two pairs of cross-linking probes are used as the cross-linking probes used together with two pairs of dimer forming probes 71a-71d.
  • the 5′-side region of the probe is complementary to any 5′-side region of the cross-linking probe, and the 5′-side region of each cross-linking probe is complementary to any 5′-side region of the dimer-forming probe;
  • the 3′-side region of each dimer-forming probe is complementary to any 3′-side region of the cross-linking probe, and the 3′-side region of each cross-linking probe is complementary to any 3′-side region of the dimer-forming probe. It is preferable to configure so as to be suitable.
  • the 5′-side region of the first set of first cross-linking probes 72a is complementary to the 5′-side region (region A) of the first set of first dimer-forming probes 71a.
  • the 5′-side region of the first set of second bridging probes 72b is complementary to the 5′-side region (region D) of the first set of second dimer-forming probes 71b, and the second set
  • the 5′-side region of the first cross-linking probe 72c is complementary to the 5′-side region (region G) of the second set of first dimer-forming probes 71c, and 5 ′ of the second set of second cross-linking probe 72d.
  • the side region is complementary to the 5′-side region (region I) of the second set of second dimer-forming probes 71d, and the 3′-side region of the first set of first bridging probes 72a has four types of dimers. It is complementary to the 3 ′ region of any one of the forming probes 71a-71d (FIG. 14). Shows the case of being complementary to the region H).
  • the 3′-side region of the first set of second cross-linking probes 72b is the first set of first cross-links in the four types of dimer forming probes 71a-71d. It is complementary to any one 3 ′ region except the one selected by the probe 72a (FIG. 14 shows a case where it is complementary to the region J).
  • the side region is complementary to any one of the 3' side regions except for the one selected from the first and second bridging probes 72a-72b in the four types of dimer forming probes 71a-71d.
  • FIG. 14 shows a case where the second pair of second bridging probes 72d is complementary to the region C).
  • the 3′-side region of the second set of second cross-linking probes 72d is the first set of the four types of dimer formation probes 71a-71d.
  • First and second bridging probes 72a-72b and second set Two pairs of cross-linking probes are preferred that are complementary to one 3′-side region excluding the one selected by the first cross-linking probe 72c (FIG. 14 shows a case where it is complementary to the region F). is there.
  • the signal probe polymer 68 can be formed by hybridizing the dimer-forming probes 71a to 71d and the crosslinking probes 72a to 72d shown in FIG.
  • the 3′-side region of the first set of first cross-linking probes 72 a is complementary to the 3′-side region of the second set of first dimer formation probes 71 c
  • the 3′-side region of the cross-linking probe 72b is complementary to the 3′-side region of the second set of second dimer-forming probes 71d
  • the 3′-side region of the second set of first cross-linking probes 72c is one set.
  • the 3′-side region of the second set of second bridging probe 72d is 3 ′ of the first set of second dimer-forming probe 71b.
  • each complementary region of the dimer-forming probe and the crosslinking probe is at least 5 bases, preferably at least 8 bases, more preferably 10 bases to 100 bases, more preferably 12-30 bases. It is a base. Moreover, it is desirable that the lengths of complementary regions in each probe are the same.
  • any 3 ′ region (for example, region C, F, H, J) contains a poly T sequence and is complementary to this region (for example, region C).
  • ', F', H ', J') contain poly A sequences.
  • the non-complementary base sequence may be any base sequence that does not hybridize to each other, and the same base sequence is also included in the non-complementary base sequence.
  • FIG. 12 is a schematic explanatory view showing a third example of a pair of dimer formation probes and a pair of cross-linking probes used in the present invention.
  • reference numeral 60b denotes a dimer probe, in which a dimer is formed using two types of dimer formation probes 61c and 61d in which the 3 ′ side region and the 5 ′ side region have the same base sequence. showed that. That is, in the dimer probe 60a of FIG.
  • the region A and the region D have the same base sequence
  • the region C and the region F have the same base sequence.
  • the pair of cross-linking probes used together with the dimer probe 60b is the same, and one type of cross-linking probe 62c is used.
  • Signal probe polymer 68 can be formed by hybridizing dimer-forming probes 61c-61d and cross-linking probe 62c shown in FIG. 12 (FIG. 13).
  • the nucleic acid probe is a nucleic acid probe including three or more nucleic acid regions, and each nucleic acid region of the nucleic acid probe includes a first region and a second region complementary to the first region adjacent to each other.
  • the polymer of the nucleic acid probe can be formed by only one kind of nucleic acid probe.
  • the nucleic acid probe described in Patent Document 7 is used.
  • the nucleic acid region of the nucleic acid probe means a region composed of the first region and the second region. Further, the first region and the second region in each nucleic acid region are referred to as complementary regions, respectively.
  • FIG. 15 is a schematic explanatory view showing an example of one kind of self-assembling nucleic acid probe used in the present invention.
  • FIG. 16 is a schematic explanatory view showing a binding mode of the nucleic acid probe of FIG.
  • FIG. 17 is a schematic explanatory view showing a self-assembly (probe polymer) formed by the nucleic acid probe of FIG.
  • FIG. 15 is a schematic explanatory view showing an example of the fourth example of the signal amplification probe used in the present invention, and shows an example including three nucleic acid regions.
  • one kind of nucleic acid probe 80 capable of self-assembly has a nucleic acid region 80a, a nucleic acid region 80b, and a nucleic acid region 80c in order from the 5 ′ end, and the nucleic acid regions 80a, 80b, and 80c are mutually connected. Two complementary regions are included adjacent.
  • the nucleic acid region 80a includes a complementary region X and a complementary region X ′ having a base sequence complementary to the complementary region X
  • the nucleic acid region 80b is complementary to the complementary region Y and the complementary region Y.
  • a complementary region Y ′ having a base sequence is included adjacently
  • the nucleic acid region 80 c includes a complementary region Z and a complementary region Z ′ having a base sequence complementary to the complementary region Z adjacent to each other.
  • the complementary region X and the complementary region X ′, the complementary region Y and the complementary region Y ′, and the complementary region Z and the complementary region Z ′ are respectively complementary nucleic acid regions capable of hybridizing, and are shown in FIG.
  • complementary region X and complementary region X ′ are combined [FIG. 16 (a)]
  • complementary region Y and complementary region Y ′ are combined [FIG. 16 (b)]
  • complementary region Z and complementary region Z ′ are combined.
  • FIG. 16 (c) a nucleic acid probe having three nucleic acid regions (80a, 80b and 80c) is shown as a preferred example, but the number of nucleic acid regions is not particularly limited as long as it is three or more.
  • the nucleic acid probe 80 By subjecting the nucleic acid probe 80 to a hybridization reaction, as shown in FIG. 17, the nucleic acid probe 80 self-assembles, and a probe polymer 90 that is a self-assembly of the nucleic acid probe 80 can be formed.
  • the 3 'region (for example, the region Z') of the fourth example of the signal amplification probe includes a poly T sequence, and a region complementary to the 3 'region (for example, the region Z) includes a poly A sequence.
  • the length of each complementary region is preferably 2 or more bases, more preferably 3 to 50 bases, and further preferably 4 to 15 bases in terms of the number of bases. Moreover, it is desirable that the lengths of the complementary regions in the nucleic acid probe are the same.
  • the length of the poly T sequence of each signal amplification probe is preferably 11 to 26 bases.
  • FIG. 1 an example in which the nucleic acid region Z is all a poly T sequence is shown, but a first signal amplification probe 18 a having a nucleic acid region Z including a poly T sequence and other sequences may be used.
  • each nucleic acid region excluding the nucleic acid region containing the poly-T sequence of each signal amplification probe may be configured so that a predetermined region has a complementary base sequence so that a probe polymer is formed.
  • region is guanine or cytosine.
  • the signal amplification probe is usually composed of DNA or RNA, but may be a nucleic acid analog.
  • nucleic acid analogs include peptide nucleic acids (PNA, see International Publication No. 92/20702, etc.) and Locked Nucleic Acid (LNA, Koshkin AA et al. Tetrahedron1998.54, 3607-3630., Koshkin AA et al. J Am. Chem. Soc. 1998.120, 13252-13253, Wahlestedt Cet et al. PNAS 2000.97, 5633-5638, etc.).
  • PNA peptide nucleic acids
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • a pair of signal amplification probes is usually composed of the same type of nucleic acid, but for example, a pair of a DNA probe and an RNA probe may be used. That is, the type of nucleic acid of the probe can be selected from DNA, RNA, or a nucleic acid analog (for example, PNA or LNA).
  • the nucleic acid composition in one probe does not need to be composed of only one type, for example, only DNA, and if necessary, for example, an oligonucleotide probe (chimeric probe) composed of DNA and RNA is used. It is also possible and is included in the present invention.
  • probes can be synthesized by a known method.
  • a DNA probe it can be synthesized by the phosphoamidide method using a DNA synthesizer type 394 of Applied Biosystems Inc.
  • a phosphoric acid triester method there are a phosphoric acid triester method, an H-phosphonate method, a thiophosphonate method, etc., but they may be synthesized by any method.
  • the signal amplification probes labeled with the labeling substance 20 it is preferable to use one or both of the signal amplification probes labeled with the labeling substance 20.
  • Suitable examples of the labeling substance 20 include radioisotopes, biotin, digoxigenin, fluorescent substances, luminescent substances, and dyes.
  • the target RNA is microRNA
  • D a polyA addition step of adding polyA to the 3 ′ end of the microRNA,
  • A the microRNA, And a capture step for capturing the microRNA, and a capture step for capturing the microRNA
  • B reacting the captured microRNA and one or more types of signal amplification probes
  • a detection complex forming step for forming a detection complex including the microRNA, the capture substance, and a probe polymer formed by the signal amplification probe
  • C binding to the detection complex.
  • the signal amplification probes are a plurality of types of signal amplification probes that have complementary base sequence regions that can hybridize with each other and can form a probe polymer by a self-assembly reaction.
  • One signal amplification probe in the probe has a poly T sequence
  • the one type of signal amplification probe is one type of signal amplification probe having a poly T sequence and including three or more nucleic acid regions.
  • Each nucleic acid region of the one type of signal amplification probe includes a first region and a second region complementary to the first region adjacent to each other.
  • FIG. 18 is a schematic explanatory view showing an example of the second aspect of the RNA detection method of the present invention, where (a) is a microRNA, (b) is a microRNA added with polyA after the polyA addition step. , (C) shows the microRNA captured by the capture substance after the capture step, and (d) shows the detection complex after the detection complex formation step.
  • reference numeral 10b is a microRNA.
  • the present invention is preferably used for detection of short target nucleic acids, is preferably used for detection of microRNA having 17 to 63 bases, and is particularly preferably used for detection of microRNA having about 17 to 24 bases. At the same time, various nucleic acid molecules can be detected.
  • a poly A addition step of adding poly A to the 3 ′ end of the microRNA 10b is performed to obtain a micro RNA 12 to which poly A is added [step (D)].
  • step (D) step (D)
  • Step (c) a capture step of capturing the poly A-added microRNA 12 by reacting the micro RNA 12 to which the poly A has been added with a capture substance 14 for capturing the target microRNA 10 b.
  • Step (A) shows the case where the step (A) is performed after the step (D), but the step (D) is performed after the step (A). That is, the microRNA 10b and the capture substance 14 are reacted to generate the microRNA 10b.
  • Step (A)] followed by a poly A addition step for adding poly A to the 3 ′ end of the microRNA 10b [Step (D)] to capture the poly A-added microRNA 12 It may be captured by the substance 14.
  • steps (A) to (C) can be performed in the same manner as in the first embodiment described above.
  • a plurality of types of target nucleic acids can be detected simultaneously by using a plurality of capture substances 14 in combination.
  • the same signal amplification probe can be used, and it is only necessary to prepare a plurality of types of carriers 16 and capture substances 14, which is excellent in workability and low cost. .
  • Example 1 Detection of 12 types of microRNA using synthetic RNA
  • Six types of synthetic oligo RNAs hsa-miR-100, 155, 15b, 16, 21 and 23a / b) were used as target microRNAs.
  • the six types of synthetic RNAs were mixed in equal amounts, and each amount was adjusted to 0, 0.316 amol, 1 amol, 3.16 amol, 10 amol, or 31.6 amol, and used for the experiment.
  • HCP-1 and HCP-2 Two types of nucleic acid probes having a 5 ′ end labeled with biotin were used as signal amplification probes.
  • HCP-1 base sequence (5'-XYZ-3 ') 5'-CAACAATCAGGAC GATACCGATGAAG TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
  • the first hybridization reaction solution [12 types of spherical beads (1000 pieces each), 0.1 ⁇ L each (total 1.2 ⁇ L), 5 M TMAC (tetra-methyl ammonium chloride) 7
  • a PALSAR reaction solution [5 M TMAC 7.5 ⁇ L, 10 ⁇ Supplement 2.5 ⁇ L, 20 pmol / ⁇ L HCP-1, 2.5 ⁇ L, 20 pmol / ⁇ L HCP-2 2.0 ⁇ L, DW 10.5 ⁇ L] was added to make a total of 50 ⁇ L, and reacted at 44 ° C. for 60 minutes (detection complex forming step).
  • Example 1 Comparative Example 1 Using a commercially available miRNA detection kit, microRNA was detected using the same target microRNA as in Example 1. Using Vantage microRNA Labeling Kit (manufactured by Marligen) as a labeling reagent, Vantage miRNA Multiplex Detection Kit Pancreatic Cancer Panel 1 (manufactured by Marligen) as a detection reagent, and using the same six types of target microRNAs as in Example 1, Detection was performed. The reagent composition and reaction method were based on the protocol attached to Kit. The results are shown in Table 2 and FIG.
  • Example 2 Detection of miRNA using synthetic RNA and total RNA derived from cells
  • the synthetic oligo RNA (hsa-miR-21) used in Example 1 was used as a target microRNA.
  • the synthetic oligo RNA was adjusted to 0, 0.1 amol, 0.316 amol, 1 amol, 3.16 amol, 10 amol, 31.6 amol, 100 amol or 316 amol and used for the experiment (Example 2-1).
  • Example 2-2 to 2-11 As target microRNAs, 10 types of total RNA derived from cells (NCI-H650, MCF-7, CFPAC-1, LC-1F, A549, Hep-2, PC-14, HeLa, MDA-MB-435s, Alternatively, 10 ng each of BT549) was used (Examples 2-2 to 2-11). As a capture substance, spherical beads to which the capture probe (CP-has-miR-21) used in Example 1 was bound were used.
  • the poly A addition step was performed by the same method as in Example 1 using the target microRNA described above.
  • the first hybridization reaction solution [spherical beads (1000 pieces) 0.4 ⁇ L, 5 M TMAC 7.5 ⁇ L, 10 ⁇ Supplement [500 mM Tris-HCl (pH 8.0), 40 mM EDTA ( pH 8.0), 1% sarkosyl] 3.75 ⁇ L, DW 3.35 ⁇ L] was added to a total of 25 ⁇ L, and the mixture was reacted at 50 ° C. for 60 minutes (capture step).
  • a detection complex formation step was performed in the same manner as in Example 1 using 25 ⁇ L of the reaction solution after the capture step.
  • the reaction solution after the detection complex formation step was washed once with Wash Buffer [1 ⁇ PBS with 0.02% tween 20, 0.1% BSA and 0.05% NaN 3 ], and then the detection reagent [SA-PE (Invitrogen) 10 ng / 50 ⁇ L] was added, left at room temperature for 10 minutes, and then washed once with Wash Buffer. Thereafter, 100 ⁇ L of Wash Buffer was added, and the fluorescence of biotin and fluorescent microparticles was measured by flow cytometry (Luminex System, manufactured by Luminex) to detect the microRNA signal (detection step).
  • the results of Example 2-1 are shown in FIG.
  • Table 3 shows the results of quantitative values of Examples 2-2 to 2-11 calculated from the graph of FIG.
  • the correlation diagram of the results of Example 2 and Comparative Example 2 is shown in FIG.
  • the present invention was able to detect microRNA up to several amol level, and was able to detect microRNA with high sensitivity and ease. Furthermore, as shown in the results of Example 2 and Comparative Example 2, it was proved that the present invention shows a high correlation with the real-time PCR method.
  • Example 3 Two types of messenger RNA detection using cultured cell-derived total RNA A cell-derived total RNA (cell line RERF-LC-AI) containing beta-actin (BA) and GAPDH (G3P) as target messenger RNAs. used. The total amount of total RNA was adjusted to 0, 0.1 ⁇ g, 0.5 ⁇ g, 1 ⁇ g, or 2.5 ⁇ g and used in the experiment.
  • spherical beads fluorescent microparticles (Luminex bead, manufactured by Luminex)] each having two kinds of capture probes (CP-BA-1 or CP-G3P-1) bound thereto were used as capture substances.
  • the base sequence of CP-BA-1 5'-AAGGTGTGCACTTTTATTCAACTGGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGCCCTGGCTGCCTC -3 '(SEQ ID NO: 21)
  • CP-G3P-1 nucleotide sequence 5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATTGATGGTACATGACAAGGTGCGGCTCCCTAGGCCCCTCC -3 '(SEQ ID NO: 22)
  • HCP-1 and HCP-2 Two types of nucleic acid probes labeled with biotin at the 5 ′ end used in Example 1 were used as signal amplification probes.
  • 1st hybridization reaction solution 2000 kinds of 2 spherical beads, 0.2 ⁇ L each (0.4 ⁇ L in total), 5M TMAC (tetra-methyl ammonium chloride) 7.5 ⁇ L, 10 ⁇ Supplement [500 mM Tris-HCl 15 ⁇ L of (pH 8.0), 40 mM EDTA (pH 8.0), 1% sarcosyl] 2.5
  • PALSAR reaction solution [5M TMAC 7.5 ⁇ L, 10 ⁇ Supplement 2.5 ⁇ L, 20 pmol / ⁇ L HCP-1, 2.5 ⁇ L, 20 pmol / ⁇ L HCP-2 2.0 ⁇ L, D.W. 10 0.5 ⁇ L] was added to make a total of 50 ⁇ L and reacted at 44 ° C. for 60 minutes (detection complex formation step).
  • Example 4 Examination of ratio of two types of messenger RNA using total RNA derived from five types of cultured cells Total RNA derived from cells containing the target messenger RNAs Beta-Actin and GAPDH (cell lines RERF-LC-AI, A549, Hela, PC-14, Hep-2) were used. Each amount of total RNA was adjusted to 1 ⁇ g or 5 ⁇ g and used in the experiment.
  • spherical beads Fluorescent microparticles (Luminex bead, manufactured by Luminex)] to which the same two types of capture probes (CP-BA-1 or CP-G3P-1) as in Example 3 are respectively bound are used as capture substances. It was.
  • HCP-1 and HCP-2 Two types of nucleic acid probes labeled with biotin at the 5 'end as in Example 1 were used as signal amplification probes.
  • 1st hybridization reaction solution 2000 kinds of 2 spherical beads, 0.2 ⁇ L each (0.4 ⁇ L in total), 5M TMAC (tetra-methyl ammonium chloride) 7.5 ⁇ L, 10 ⁇ Supplement [500 mM Tris-HCl 15 ⁇ L of (pH 8.0), 40 mM EDTA (pH 8.0), 1% sarcosyl] 2.5
  • a PALSAR reaction solution [5M TMAC 7.5 ⁇ L, 10 ⁇ Supplement 2.5 ⁇ L, 20 pmol / ⁇ L HCP-1, 2.5 ⁇ L, 20 pmol / ⁇ L HCP-2 2.0 ⁇ L, D.W. 10 0.5 ⁇ L] was added to make a total of 50 ⁇ L and reacted at 44 ° C. for 60 minutes (detection complex formation step).
  • Example 5 Detection sensitivity of messenger RNA using cultured cell-derived total RNA Cell-derived total RNA (cell line CCRF-CEM) containing GAPDH as a target messenger RNA was used. Total RNA extracted from 10 7 cells was diluted and adjusted so that each amount would be 10 3 , 10 4 , 10 5 , 10 6 cells and used for the experiment.
  • a spherical bead [fluorescent microparticle (Luminex bead, manufactured by Luminex)] bound with a capture probe (CP-G3P-2) was used as a capture substance.
  • BL-1 5'-ACCCATGACGAACATGGGGGCATCAGCAGAGGGGGCAGAGATGATGACCCTTTTGGCTCC-3 '(SEQ ID NO: 24)
  • BL-2 5'- TGAGTCCTTCCACGATACCAAAGTTGTCATGGATGACCTTGGCCAGGGGTGCTAAGCAGT -3 '(SEQ ID NO: 25)
  • HCP-1 and HCP-2 Two types of nucleic acid probes (HCP-1 and HCP-2) used in Example 1 and labeled with biotin at the 5 'end were used.
  • RNA in 10 ⁇ L, first hybridization reaction solution [spherical beads (1000 each), 0.1 ⁇ L, 5 M TMAC (tetra-methyl ammonium chloride) 7.5 ⁇ L, 10 ⁇ Supplement [500 mM Tris-HCl (pH 8.0), 40 mM EDTA (PH 8.0), 1% ar sarkosyl] 2.5 ⁇ L, corrected to a total volume of 15 ⁇ L with D.W.] was added to 15 ⁇ L to make a total of 25 ⁇ L and reacted at 55 ° C. for 4 hours (capture step).
  • first hybridization reaction solution [spherical beads (1000 each), 0.1 ⁇ L, 5 M TMAC (tetra-methyl ammonium chloride) 7.5 ⁇ L, 10 ⁇ Supplement [500 mM Tris-HCl (pH 8.0), 40 mM EDTA (PH 8.0), 1% ar sarkosyl] 2.5 ⁇ L, corrected to a total volume of 15 ⁇ L with
  • a PALSAR reaction solution [5M TMAC 7.5 ⁇ L, 10 ⁇ Supplement 2.5 ⁇ L, 20 pmol / ⁇ L HCP-1, 2.5 ⁇ L, 20 pmol / ⁇ L HCP-2 1.75 ⁇ L, DW 10.75 ⁇ L] was added to make a total of 50 ⁇ L, and reacted at 44 ° C. for 60 minutes (detection complex forming step).
  • the present invention succeeded in detecting messenger RNA in an unlabeled state without performing reverse transcription reaction or PCR. Moreover, it was possible to detect housekeeping genes present at a constant ratio for each cell regardless of the target amount used. Furthermore, as shown in the results of Example 5, it was proved that GAPDH messenger RNA can be detected with high sensitivity from 10 3 cells with linearity.
  • 10a Messenger RNA
  • 10b Micro RNA
  • 12 Micro RNA added with poly A
  • 14 Capture substance
  • 16 Carrier
  • 18a First signal amplification probe
  • 18b Second signal amplification probe
  • 20 Labeling substance
  • 22, 50, 68, 90 Probe polymer
  • 30 Complex for detection
  • 40a First dimer probe
  • 40b, 40c, 40d Second dimer probe
  • 40e Third dimer probe
  • 41a to 41h 41j, 41k dimer formation probe
  • 60a, 60b dimer probe
  • 61a-61d dimer formation probe
  • 62a-62d cross-linking probe
  • 70a, 70b dimer probe
  • 71a-71d dimer formation probe
  • 72a 72d cross-linked probe
  • 80 nucleic acid probe, 0a, 80b, 80c: nucleic acid region.

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Abstract

　マイクロＲＮＡ及びメッセンジャーＲＮＡ等のＲＮＡを高感度且つ簡便に検出することができるＲＮＡの検出方法、検出用キット及び該方法に用いられるシグナル増幅用プローブを提供する。　（Ａ）ＲＮＡを、該ＲＮＡを捕捉するための捕捉物質により捕捉する捕捉工程と、（Ｂ）前記捕捉されたＲＮＡ及び自己集合可能なシグナル増幅用プローブを反応させ、前記ＲＮＡと、前記捕捉物質と、前記シグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーとを含む検出用複合体を形成する検出用複合体形成工程と、（Ｃ）前記検出用複合体に結合した前記プローブポリマーを検出することにより前記ＲＮＡを検出する検出工程とを含む標的ＲＮＡの検出方法であって、前記シグナル増幅用プローブの一つがポリＴ配列を含むようにした。

Description

ＲＮＡの検出方法及び検出用キット
　本発明は、マイクロＲＮＡ（microRNA、miRNA）及びメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）等のＲＮＡの検出方法、検出用キット及び該方法に用いられるシグナル増幅用プローブに関し、特に、ＲＮＡを高感度且つ簡便に検出することができるＲＮＡの検出方法、検出用キット及びシグナル増幅用プローブに関する。
　マイクロＲＮＡはヒトを含む様々な真核生物で転写されている低分子ＲＮＡの一種である。ゲノム上の非遺伝子領域やイントロン部分から一次転写産物（pri-miRNA）として転写され、プロセッシングにより、ヘアピン構造のマイクロＲＮＡ前駆体（pre-miRNA）を生成した後、２２塩基程度の成熟型のマイクロＲＮＡ（mature-miRNA）となる（非特許文献１）。このマイクロＲＮＡは、転写されたｍＲＮＡからたんぱく質への翻訳過程における調節因子として働いていることが明らかにされた（非特許文献２）。現在、ヒトゲノム上には８００種以上のマイクロＲＮＡが存在すると予想されているが（非特許文献３）、その調節機能の対象となるメッセンジャー（ｍＲＮＡ）が同定されていないものも多い。
　しかしこれまでの研究から、多くのマイクロＲＮＡが多細胞生物の発生や分化、細胞増殖などに関与している遺伝子の発現調節を行っていることが明らかになっている（非特許文献４）。また、細胞のがん化やがん抑制機構において機能していると考えられるマイクロＲＮＡも報告され、それらはがん細胞内での発現量が正常細胞と比較して増加もしくは減少しているものも多い（非特許文献５）。そこで、将来的にはマイクロＲＮＡの発現量を調べることで、その細胞や組織のがん化についてのプロファイリングを行うことも可能になると考えられ、今後は細胞や組織でのマイクロＲＮＡの同定、定量を行うことが癌の診断にとって重要な項目のひとつとなると予期される。
　これまでにマイクロＲＮＡ検出方法として、ノーザン・ブロット法（非特許文献６）、プライマー伸長法（非特許文献７及び８）、インベーダー法（非特許文献９）、リボザイムのシグナル増幅法（非特許文献１０）、mirMASAビーズベースの技術（非特許文献１１）、ビーズベースのフロー・サイトメトリー（非特許文献１２）、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（非特許文献１３及び１４）、マイクロアレイ（非特許文献１５）等が報告されており、金粒子を用いたラベル方法（非特許文献１６）が試みられている。また研究用試薬として、ＲＮアーゼプロテクションアッセイを用いたキットも発売されている（非特許文献１７）。
　しかしながら、上記の方法は、感度が充分でない（ノーザン・ブロット法）、標的となるマイクロＲＮＡ前駆体をＰＣＲによって増幅させる必要がある（リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ等）、検出までに時間がかかり操作が煩雑である（ビーズベースのフロー・サイトメトリー、インベーダー法）、多種の標的核酸を同時に解析するのが難しい（プライマー伸長法、インベーダー法）等の問題点がある。
　一方、メッセンジャーＲＮＡは遺伝子発現の一端を担う核酸であり、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメーラーゼの働きにより合成される（転写）。その後メッセンジャーＲＮＡの持つ遺伝情報を用いてリボソームにより目的タンパク質が合成される（翻訳）。ＤＮＡからタンパク質を発現させるために、非常に重要な要素であるといえる。真核生物のメッセンジャーＲＮＡは他のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）やリボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）とは異なり、５’末端にＣＡＰ構造、３’末端にポリＡを有する。これらの構造はメッセンジャーＲＮＡ自身の分解を制御する働きも持つ。
　これまで診断の分野においては、主に生化学的なアプローチとして、タンパク質をバイオマーカーとして用いてきた。しかし、タンパク質を検出するための抗体作成が困難な場合もあり、感度や特異性の面で必ずしもタンパク質だけでは、バイオマーカーとして不十分である。そこで、タンパク質を生み出す元となるメッセンジャーＲＮＡの発現が疾病などに関連するバイオマーカーとして用いることができるかどうか研究がなされてきた。メッセンジャーアレイを用いた数千数万のメッセンジャーＲＮＡの発現を検討した結果、ある疾病に特異的なメッセンジャーＲＮＡの発現プロファイルの存在が明らかとなってきた。また、多くのメッセンジャーＲＮＡから得られる発現プロファイルだけでなく、たった一つのメッセンジャーＲＮＡもバイオマーカーとなることがわかっている。例えば、骨髄性白血病関連診断薬としてある遺伝子のメッセンジャーＲＮＡがバイオマーカーとなっており、実際に日本において体外診として保険収載されている。これらのことからもわかるとおり、タンパク質に代わる次世代のバイオマーカーとしてのメッセンジャーＲＮＡの有用性は今後も増してくると考えられる。
　これまでにメッセンジャーＲＮＡ検出方法として、ＲＴ－ＰＣＲ法、ＴａｑＭａｎを含むリアルタイムＰＣＲ法、メッセンジャーアレイ、Ｂｒａｎｃｈｅｄ－ＤＮＡ法を用いた方法が報告されている。
　しかしながら、上記の方法は、標的となるメッセンジャーＲＮＡを逆転写によりＲＮＡからＤＮＡに変換する工程が必要であったり、ＰＣＲによって増幅させる必要がある（リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ等）、また、検出までに１日以上かかり操作が煩雑である（メッセンジャーアレイ）、多種の標的核酸を同時に解析するのが難しい（リアルタイムＰＣＲ）等の問題点がある。
　他方、特許文献１及び２は、酵素を使用しない新規な等温でのシグナル増幅方法を開示している。この方法は、互いに相補的塩基配列領域を保持させた一対のオリゴヌクレオチド・プローブを自己集合反応させてプローブ同士の集合体（プローブポリマー）を形成させる方法であり、該ポリマーを定量することにより、試料中の標的核酸の検出に応用するものである。この方法は、例えば、標的核酸と相補的塩基配列、及びプローブポリマー形成に使用するプローブと相補的な配列の両方を有するプローブ（アシストプローブ）を用いるか、もしくは使用するプローブの相補的塩基配列領域の１箇所を標的核酸と相補的塩基配列とすることにより、該プローブと標的核酸とを直接又は間接的に結合させ、プローブのポリマーを形成させることにより標的核酸を有効に検出する方法であって、パルサー（ＰＡＬＳＡＲ）法と呼ばれている。
　また、特許文献３は、マイクロＲＮＡを含む低分子核酸を検出する方法を開示している。しかしながら、この方法は、マイクロＲＮＡの修飾を行わないなど利点があるが、感度が数百ａｍｏｌレベルであるため感度面や反応温度に制限があるという問題があった。
　またさらに、特許文献４では、ＰＡＬＳＡＲ法を用いたメッセンジャーＲＮＡの検出を行っているが、この方法では逆転写反応が必須であった。
特許第３２６７５７６号公報 特許第３３１０６６２号公報 ＷＯ２０１０／０８７４０９号公報 国際公開２００４／０７２３０２号 国際公開０２／０３１１９２号 特開２００２－３５５０８１号公報 国際公開２００９／５４３２０号
Kim VN, Nam JW. Genomics of microRNA. Trends Genet. 2006 Mar; 22(3):165-73. Sontheimer, E., J. Assembly and function of RNA silencing complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2005 Feb; 6 127-138 Bentwich I, Avniel A, Karov Y, Aharonov R, Gilad S, Barad O, Barzilai A, Einat P, Einav U, Meiri E, Sharon E, Spector Y, Bentwich Z. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 2005 Jul; 37(7):766-70 Alvarez-Garcia I, Miska EA. MicroRNA functions in animal development and human disease. Development. 2005 Nov; 132(21):4653-62. Esquela-Kerscher A, Slack FJ. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nat Rev Cancer. 2006 Apr; 6(4):259-269 Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., and Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 2003 Feb; 9(2):175-179. Zeng, Y. and Cullen, B.R. Sequence requirements for micro RNA processing and function in human cells. RNA. 2003 Jan; 9(1):112-123. Raymond CK, Roberts BS, Garrett-Engele P, Lim LP, Johnson JM. Simple, quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA. 2005 Nov; 11:1737-1744 Allawi, H.T., Dahlberg, J.E., Olson, S., Lund, E., Olson, M., Ma, W.P., Takova, T., Neri, B.P., and Lyamichev, V.I. Quantitation of microRNAs using a modified Invader assay. RNA. 2004 Jul; 10(7):1153-1161. Hartig, J.S., Grune, I., Najafi-Shoushtari, S.H., and Famulok, M. Sequence-specific detection of MicroRNAs by signal-amplifying ribozymes. J. Am. Chem. Soc. 2004 Jan 28; 126(3): 722-723. Barad O, Meiri E, Avniel A, Aharonov R, Barzilai A, Bentwich I, Einav U, Gilad S, Hurban P, Karov Y, Lobenhofer EK, Sharon E, Shiboleth YM, Shtutman M, Bentwich Z, Einat P. MicroRNA expression detected by oligonucleotide microarrays: system establishment and expression profiling in human tissues. Genome Res. 2004 Dec; 14(12):2486-94. Lu J, Getz G, Miska EA, Alvarez-Saavedra E, Lamb J, Peck D, Sweet-Cordero A, Ebert BL, Mak RH, Ferrando AA, Downing JR, Jacks T, Horvitz HR, Golub TR. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 2005 Jun 9; 435(7043):834-8 Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT, Barbisin M, Xu NL, Mahuvakar VR, Andersen MR, Lao KQ, Livak KJ, Guegler KJ. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2005 Nov 27; 33(20):e179. Tang F, Hajkova P, Barton SC, Lao K, Surani MA. MicroRNA expression profiling of single whole embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 2006 Jan 24; 34(2):e9. Liu CG, Calin GA, Meloon B, Gamliel N, Sevignani C, Ferracin M, Dumitru CD, Shimizu M, Zupo S, Dono M, Alder H, Bullrich F, Negrini M, Croce CM. An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jan 29; 101(26):9740-4. Liang RQ, Li W, Li Y, Tan CY, Li JX, Jin YX, Ruan KC. An oligonucleotide microarray for microRNA expression analysis based on labeling RNA with quantum dot and nanogold probe. Nucleic Acids Res. 2005 Jan 31; 33(2):e17. mirVana miRNA Detection kit (Ambion Inc.)
　本発明は、マイクロＲＮＡ及びメッセンジャーＲＮＡ等のＲＮＡを高感度且つ簡便に検出することができる、ＲＮＡの検出方法、検出用キット及び該方法に用いられるシグナル増幅用プローブを提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を行った結果、驚くべきことに、パルサー法で用いられるハイブリダイゼーション反応のシグナル増幅用プローブにおいて、一つのシグナル増幅用プローブの１領域をチミン（Ｔ）が連続した核酸配列であるポリＴ配列を含む領域としたシグナル増幅用プローブを用い、必要に応じて標的ＲＮＡの３’末端にアデニン（Ａ）が連続した核酸配列であるポリＡを付加した後、捕捉用プローブで捕捉されたＲＮＡと該シグナル増幅用プローブを反応させ、プローブポリマーを含む検出用複合体を形成させ、該プローブポリマーを検出することにより、ＲＮＡを高感度で検出することができることを見出した。
　即ち、本発明のＲＮＡの検出方法は、（Ａ）３’末端にポリＡ配列を含み得るＲＮＡを、該ＲＮＡを捕捉するための捕捉物質により捕捉する捕捉工程、即ち、ＲＮＡを、該ＲＮＡを捕捉するための捕捉物質により捕捉する捕捉工程と、（Ｂ）前記捕捉されたＲＮＡ、及び自己集合可能な１種又は複数種のシグナル増幅用プローブを反応させ、前記ＲＮＡと、前記捕捉物質と、前記シグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーと、を含む検出用複合体を形成する検出用複合体形成工程と、（Ｃ）前記検出用複合体に結合した前記プローブポリマーを検出することにより、前記ＲＮＡを検出する検出工程と、を含む標的ＲＮＡを検出する方法であって、前記シグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブが、ポリＴ配列を有することを特徴とする。
　前記シグナル増幅用プローブのポリＴ配列の長さが１１～２６塩基であることが好ましい。
　前記ポリＴ配列を有するシグナル増幅用プローブが、３’末端に該ポリＴ配列を有することが好適である。
　前記シグナル増幅用プローブの少なくとも１つが標識物質で標識されてなることが好ましい。
　前記捕捉物質が、前記ＲＮＡに相補的な塩基配列を含み、且つ担体に固定されているか又は担体に固定可能な部分が導入されていることが好適である。
　本発明において、前記ハイブリダイゼーション反応としては、特に限定されないが、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有する複数種の核酸プローブを用いてハイブリダイゼーションさせることにより、核酸が自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応を含むことがより好適である。
　即ち、本発明のＲＮＡの検出方法の第１の例としては、（Ａ）ＲＮＡを、該ＲＮＡを捕捉するための捕捉物質により捕捉する捕捉工程と、（Ｂ）前記捕捉されたＲＮＡ、第１のシグナル増幅用プローブ及び第２のシグナル増幅用プローブを反応させ、前記ＲＮＡと、前記捕捉物質と、前記第１のシグナル増幅用プローブ及び前記第２のシグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーと、を含む検出用複合体を形成する工程と、（Ｃ）前記検出用複合体に結合した前記プローブポリマーを検出することにより、前記ＲＮＡを検出する工程と、を含む、標的ＲＮＡを検出する方法であって、前記第１のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ、及びポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、前記第２のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブであることを特徴とする。
　前記第１のシグナル増幅用プローブのポリＴ配列の長さが１１～２６塩基であることが好ましい。
　前記第１のシグナル増幅用プローブの前記核酸領域Ｘの長さが１１～２０塩基であり、前記核酸領域Ｙの長さが１１～２０塩基であり、前記核酸領域Ｚの長さが１１～２６塩基であることが好適である。
　前記第１のシグナル増幅用プローブ及び／又は前記第２のシグナル増幅用プローブが標識物質で標識されてなることが好ましい。
　本発明において、標的ＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ等のアデニン（Ａ）が連続した核酸配列であるポリＡ配列を有するＲＮＡ、及びポリＡ配列を有しないＲＮＡのいずれも検出可能である。標的ＲＮＡとしてポリＡ配列を有するＲＮＡを検出する場合は、該標的ＲＮＡのポリＡ配列とシグナル増幅用プローブのポリＴ配列がハイブリダイズし、検出用複合体が形成され、該検出用複合体を検出することにより標的ＲＮＡを検出することができる。また、標的ＲＮＡとしてポリＡ配列を有しないＲＮＡ、例えば、ポリＡ配列を有しないマイクロＲＮＡを検出する場合は、前記工程（Ａ）の前後いずれか（好ましくは工程（Ａ）の前）において、（Ｄ）該マイクロＲＮＡの３’末端にポリＡを付加するポリＡ付加工程を行うことにより、ポリＡ付加された標的ＲＮＡのポリＡ配列とシグナル増幅用プローブのポリＴ配列がハイブリダイズし、検出用複合体が形成され、該検出用複合体を検出することにより標的ＲＮＡを検出することができる。
　本発明のＲＮＡの検出用キットは、標的ＲＮＡを捕捉するための捕捉物質、及び１種又は複数種のシグナル増幅用プローブを含むＲＮＡの検出用キットであって、前記複数種のシグナル増幅用プローブは、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な複数種のシグナル増幅用プローブであって、該複数種のシグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブが、ポリＴ配列を有し、前記１種のシグナル増幅用プローブは、ポリＴ配列を有し且つ３以上の核酸領域を含む１種のシグナル増幅用プローブであって、該１種のシグナル増幅用プローブの各核酸領域が第１領域及び該第１領域に相補的な第２領域を隣接して含むことを特徴とする。
　前記複数種のシグナル増幅用プローブが、第１のシグナル増幅用プローブと第２のシグナル増幅用プローブとからなり、前記第１のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ、及びポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、前記第２のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブであることが好適である。
　本発明のシグナル増幅用プローブは、本発明のＲＮＡの検出方法に用いられる１種又は複数種のシグナル増幅用プローブであって、前記複数種のシグナル増幅用プローブは、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な複数種のシグナル増幅用プローブであって、該複数種のシグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブが、ポリＴ配列を有し、前記１種のシグナル増幅用プローブは、ポリＴ配列を有し且つ３以上の核酸領域を含む１種のシグナル増幅用プローブであって、該１種のシグナル増幅用プローブの各核酸領域が第１領域及び該第１領域に相補的な第２領域を隣接して含むことを特徴とする。
　前記シグナル増幅用プローブのポリＴ配列の長さが１１～２６塩基であることが好ましい。
　前記ポリＴ配列を有するシグナル増幅用プローブが、３’末端に該ポリＴ配列を有することが好適である。
　前記シグナル増幅用プローブの少なくとも１つが標識物質で標識されてなることが好ましい。
　前記複数種のシグナル増幅用プローブの第Iの例は、第１のシグナル増幅用プローブ及び第２のシグナル増幅用プローブからなる一対のシグナル増幅用プローブであって、前記第１のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ、及びポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、前記第２のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブであることを特徴とする。
　前記複数種のシグナル増幅用プローブの第IIの例は、複数のダイマープローブ又は該ダイマープローブを形成するダイマー形成用プローブであって、前記複数のダイマープローブの各ダイマープローブは２種のダイマー形成用プローブから形成されたダイマーであり、各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、該２種のダイマー形成用プローブは中央領域が互いに相補的であり且つ該３’側領域及び該５’側領域が互いに非相補的であり、前記複数のダイマープローブの各ダイマープローブの各５’側領域は他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的であり且つ各ダイマープローブの各３’側領域は他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的であることを特徴とする。
　前記シグナル増幅用プローブの前記５’側領域の長さが１１～２０塩基であり、前記中央領域の長さが１１～２０塩基であり、前記３’側領域の長さが１１～２６塩基であることが好適である。
　前記複数種のシグナル増幅用プローブの第IIIの例は、一対のダイマー形成用プローブもしくは該一対のダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを１組以上と、１以上の架橋プローブと、を含み、前記各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、前記各一対のダイマー形成用プローブの中央領域は互いに相補的であり、前記各一対のダイマー形成用プローブのそれぞれの３’側領域及び５’側領域は全て互いに非相補的であり、前記各架橋プローブは５’側領域及び３’側領域の２領域を含み、前記各架橋プローブの３’側領域は前記各ダイマー形成用プローブの３’側領域とそれぞれ相補的であり、前記各架橋プローブの５’側領域は前記各ダイマー形成用プローブの５’側領域とそれぞれ相補的であることを特徴とする。
　前記シグナル増幅用プローブの前記５’側領域の長さが１１～２０塩基であり、前記中央領域の長さが１１～２０塩基であり、前記３’側領域の長さが１１～２６塩基であることが好適である。
　本発明によれば、標的ＲＮＡを高感度且つ簡便に検出することができる、ＲＮＡの検出方法、検出用キット及び該方法に用いられるハイブリダイゼーション反応のシグナル増幅用プローブを提供することができる。本発明は逆転写反応が不要であり、且つプローブポリマーと標的ＲＮＡを繋ぐ為のアシストプローブを必要とせず、簡易に標的ＲＮＡを検出することができる。また、本発明によれば、マイクロＲＮＡとｍＲＮＡ等の複数種の標的ＲＮＡの同時検出も可能である。
本発明のＲＮＡの検出方法の第１の態様の例を示す概略説明図であり、（ａ）は捕捉工程後の捕捉物質により捕捉されたメッセンジャーＲＮＡ、（ｂ）は検出用複合体形成工程後の検出用複合体をそれぞれ示す。 プローブポリマー形成に用いられるシグナル増幅用プローブの第Iの例の一例を示す概略説明図である。 図２記載のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。 プローブポリマー形成に用いられるシグナル増幅用プローブの第IIの例の第１の例を示す概略説明図である。 図４記載のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。 プローブポリマー形成に用いられるシグナル増幅用プローブの第IIの例の第２の例を示す概略説明図である。 プローブポリマー形成に用いられるシグナル増幅用プローブの第IIの例の第３の例を示す概略説明図である。 プローブポリマー形成に用いられるシグナル増幅用プローブの第IIIの例の第１の例を示す概略説明図である。 図８記載のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。 プローブポリマー形成に用いられるシグナル増幅用プローブの第IIIの例の第２の例を示す概略説明図である。 図１０記載のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。 プローブポリマー形成に用いられるシグナル増幅用プローブの第IIIの例の第３の例を示す概略説明図である。 図１２記載のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。 プローブポリマー形成に用いられるシグナル増幅用プローブの第IIIの例の第４の例を示す概略説明図である。 プローブポリマー形成に用いられるシグナル増幅用プローブの第IVの例の一例を示す概略説明図である。 図１５記載のシグナル増幅用プローブの結合様式を示す概略説明図である。 図１５記載のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。 本発明のＲＮＡの検出方法の第２の態様の例を示す概略説明図であり、（ａ）はマイクロＲＮＡ、（ｂ）はポリＡ付加工程後のポリＡ付加されたマイクロＲＮＡ、（ｃ）は捕捉工程後の捕捉物質により捕捉されたマイクロＲＮＡ、（ｄ）は検出用複合体形成工程後の検出用複合体をそれぞれ示す。 実施例１の結果を示すグラフである。 比較例１の結果を示すグラフである。 実施例２の結果を示すグラフである。 比較例２の結果を示すグラフである。 実施例２及び比較例２の結果の相関図を示すグラフである。 実施例３の結果を示すグラフである。 実施例４の結果を示すグラフである。 実施例５の結果を示すグラフである。
　以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。
　本発明のＲＮＡの検出方法は、（Ａ）ＲＮＡを、該ＲＮＡを捕捉するための捕捉物質により捕捉する捕捉工程と、（Ｂ）前記捕捉されたＲＮＡ、及び自己集合可能な１種又は複数種のシグナル増幅用プローブを反応させ、前記ＲＮＡと、前記捕捉物質と、前記シグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーと、を含む検出用複合体を形成する検出用複合体形成工程と、（Ｃ）前記検出用複合体に結合した前記プローブポリマーを検出することにより、前記マイクロＲＮＡを検出する検出工程と、を含む標的ＲＮＡを検出する方法であって、前記シグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブが、ポリＴ配列を有することを特徴とする。
　本発明において、標的ＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ等のアデニン（Ａ）が連続した核酸配列であるポリＡ配列を有するＲＮＡ、及びポリＡ配列を有しないＲＮＡのいずれも検出可能である。標的ＲＮＡとしてポリＡ配列を有するＲＮＡを検出する場合は、該標的ＲＮＡのポリＡ配列とシグナル増幅用プローブのポリＴ配列がハイブリダイズし、検出用複合体が形成され、該検出用複合体を検出することにより標的ＲＮＡを検出することができる。また、標的ＲＮＡとしてポリＡ配列を有しないＲＮＡ、例えば、ポリＡ配列を有しないマイクロＲＮＡを検出する場合は、前記工程（Ａ）の前後いずれか（好ましくは工程（Ａ）の前）において、（Ｄ）該マイクロＲＮＡの３’末端にポリＡを付加するポリＡ付加工程を行うことにより、ポリＡ付加された標的ＲＮＡのポリＡ配列とシグナル増幅用プローブのポリＴ配列がハイブリダイズし、検出用複合体が形成され、該検出用複合体を検出することにより標的ＲＮＡを検出することができる。
　本発明のＲＮＡの検出方法の第１の態様として、標的ＲＮＡがポリＡテールを有するメッセンジャーＲＮＡの場合を以下に説明する。
　本発明のＲＮＡの検出方法の第１の態様は、標的ＲＮＡがポリＡテールを有するメッセンジャーＲＮＡであり、（Ａ）ポリＡテールを有するメッセンジャーＲＮＡ、及び前記メッセンジャーＲＮＡを捕捉するための捕捉物質を反応させ、前記メッセンジャーＲＮＡを捕捉する捕捉工程と、（Ｂ）前記捕捉されたメッセンジャーＲＮＡ、及び１種又は複数種のシグナル増幅用プローブを反応させ、前記メッセンジャーＲＮＡと、前記捕捉物質と、前記シグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーと、を含む検出用複合体を形成する検出用複合体形成工程と、（Ｃ）前記検出用複合体に結合した前記プローブポリマーを検出することにより、前記メッセンジャーＲＮＡを検出する検出工程と、を含むメッセンジャーＲＮＡの検出方法であって、前記複数種のシグナル増幅用プローブは、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な複数種のシグナル増幅用プローブであって、該複数種のシグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブが、ポリＴ配列を有し、前記１種のシグナル増幅用プローブは、ポリＴ配列を有し且つ３以上の核酸領域を含む１種のシグナル増幅用プローブであって、該１種のシグナル増幅用プローブの各核酸領域が第１領域及び該第１領域に相補的な第２領域を隣接して含むことを特徴とする。
　本発明の第Iの例としては、第１のシグナル増幅用プローブ及び第２のシグナル増幅用プローブからなる一対のシグナル増幅用プローブを用いて、ＲＮＡを検出するものである。
　図１は、本発明のＲＮＡの検出方法の第１の態様の例を示す概略説明図であり、（ａ）は捕捉工程後の捕捉物質により捕捉されたメッセンジャーＲＮＡ、（ｂ）は検出用複合体形成工程後の検出用複合体をそれぞれ示す。図２は、プローブポリマー形成に用いられる一対のシグナル増幅用プローブの一例を示す概略説明図であり、図３は、図２記載の一対のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。
　図１において符号１０ａはメッセンジャーＲＮＡである。本発明は、３’末端にポリＡを有するメッセンジャーＲＮＡの検出に好適に用いられるものであり、３００～７０００塩基のメッセンジャーＲＮＡの検出に好適に用いられ、３００～３０００塩基程度のメッセンジャーＲＮＡの検出に特に好適に用いられる。また、同時に多種の核酸分子を検出することも出来る。
　図１（ａ）に示した如く、ポリＡを有するメッセンジャーＲＮＡ１０ａと、標的メッセンジャーＲＮＡ１０ａを捕捉するための捕捉物質１４を反応させ、メッセンジャーＲＮＡ１０ａを捕捉する捕捉工程を行う［工程（Ａ）］。
　捕捉物質１４は、標的メッセンジャーＲＮＡと特異的に結合可能な物質であればよく、特に制限はないが、標的メッセンジャーＲＮＡ１０ａに相補的な塩基配列を含み、且つ担体１６に固定されているか又は担体１６に固定可能な部分が導入されていることが好適である。
　前記担体１６としては、例えば、蛍光微小粒子、磁気粒子、マイクロプレート、マイクロアレイ、スライドガラス、電気伝導性基板等の基板を用いることが好ましい。なお、図１は微小粒子を用いた場合の例を示したが、本発明において担体１６は特に限定されないものである。なお、図１では、標的メッセンジャーＲＮＡ１０ａに相補的な塩基配列を含む捕捉用核酸プローブに直接担体１６を結合させた例を示したが、他の核酸プローブや有機物等を介して捕捉用核酸プローブと担体１６とを結合せしめてもよい。例えば、捕捉用核酸プローブが捕捉領域Ｋをさらに有するように構成し、該捕捉領域Ｋに相補的な領域Ｋ’を有する第２の捕捉用プローブを固定化した担体１６を用いてもよい。
　次に、図１（ｂ）に示した如く、前記捕捉されたメッセンジャーＲＮＡ１０ａ、第１のシグナル増幅用プローブ１８ａ及び第２のシグナル増幅用プローブ１８ｂを反応させ、前記メッセンジャーＲＮＡ１０ａと、前記捕捉物質１４と、前記第１のシグナル増幅用プローブ１８ａ及び前記第２のシグナル増幅用プローブ１８ｂにより形成されたプローブポリマー２２と、を含む検出用複合体３０を形成する検出用複合体形成工程を行った後［工程（Ｂ）］、前記検出用複合体３０に結合した前記プローブポリマー２２を検出することにより、前記メッセンジャーＲＮＡを検出する検出工程を行い［工程（Ｃ）］、メッセンジャーＲＮＡを検出する。
　図２及び図１（ｂ）に示した如く、前記第１のシグナル増幅用プローブ１８ａは、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ、及びポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、前記第２のシグナル増幅用プローブ１８ｂは、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブである。前記第１のシグナル増幅用プローブ１８ａと前記第２のシグナル増幅用プローブ１８ｂを反応させることにより、図３に示した如く、第１のシグナル増幅用プローブ１８ａと第２のシグナル増幅用プローブ１８ｂが自己集合し、集合体（プローブポリマー２２）が形成される。
　本発明で用いられる第１のシグナル増幅用プローブ１８ａは、ポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを有している為、ポリＡテールを有するメッセンジャーＲＮＡ１０ａと結合可能である。よって、図１（ｂ）に示した如く、捕捉されたポリＡテールを有するメッセンジャーＲＮＡ１０ａ、第１のシグナル増幅用プローブ１８ａ及び第２のシグナル増幅用プローブ１８ｂを反応させることにより、メッセンジャーＲＮＡ１０ａと、前記捕捉物質１４と、第１のシグナル増幅用プローブ１８ａ及び前記第２のシグナル増幅用プローブ１８ｂにより形成されたプローブポリマー２２と、を含む検出用複合体３０が形成され、該プローブポリマー２２を検出することにより、高感度且つ簡便にメッセンジャーＲＮＡを検出することができる。プローブポリマーの検出方法は特に限定されず、例えば、蛍光、発光、発色等により検出することが好適である。
　なお、図１では、予め担体１６に固定化させた捕捉物質１４を用いた例を示したが、捕捉物質１４を担体１６に固定化させる時期は特に制限はなく、複合体形成時又は複合体形成後に捕捉物質１４と担体１６とを直接又は間接的に結合せしめてもよい。
　第１のシグナル増幅用プローブ１８ａ及び第２のシグナル増幅用プローブ１８ｂにおいて各核酸領域の長さは特に制限はないが、５塩基以上が好ましく、８塩基以上がより好ましく、核酸領域Ｘ及びＸ’の長さが１１～２０塩基であり、前記核酸領域Ｙ及びＹ’の長さが１１～２０塩基であり、前記核酸領域Ｚ及びＺ’の長さが１１～２６塩基であることが特に好ましい。それぞれのプローブにおける各核酸領域の長さは同じであっても異なっていてもよいが、同じであることが望ましい。また、図１～図３では、相補的な核酸領域の数が３である一対のシグナル増幅用プローブを用いた例を示したが、相補的な核酸領域の数が４以上である一対のシグナル増幅用プローブを用いてもよい。
　本発明に用いられるシグナル増幅用プローブの第IIの例として、自己集合可能な複数のダイマープローブ又は該ダイマープローブを形成するダイマー形成用プローブが挙げられる。該複数のダイマープローブは、複数のダイマープローブの１つのダイマープローブの各５’側領域は他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的であり且つ前記複数のダイマープローブの１つのダイマープローブの各３’側領域は他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的であるように構成されており、自ら自己集合して集合体（プローブポリマー）を形成することができるものであり、例えば、特許文献５記載の核酸プローブが用いられる。
　図４及び図５は２組のダイマープローブ（第１ダイマープローブ４０ａ，第２ダイマープローブ４０ｂ）を用いた場合の一例を示した。
　図４（ａ）に示した如く、第１ダイマープローブ４０ａは２種の一本鎖核酸プローブ（第１ダイマー形成用プローブ４１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ４１ｂ）をハイブリダイズさせることにより形成される。第１ダイマー形成用プローブ４１ａは、５’側領域（領域Ａ）、中央領域（領域Ｂ）及び３’側領域（領域Ｃ）の３領域を含み、第２ダイマー形成用プローブ４１ｂは、５’側領域（領域Ｄ）、中央領域（領域Ｂ’）及び３’側領域（領域Ｆ）の３領域を含み、第１ダイマー形成用プローブ４１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ４１ｂは、中央領域（領域Ｂ及びＢ’）が互いに相補的であり且つ該３’側領域（領域Ｃ及びＦ）及び該５’側領域（領域Ａ及びＤ）が互いに非相補的である。
　図４（ｂ）に示した如く、第２ダイマープローブ４０ｂは、２種の一本鎖核酸プローブ（第３ダイマー形成用プローブ４１ｃ及び第４ダイマー形成用プローブ４１ｄ）をハイブリダイズさせることにより形成される。第３ダイマー形成用プローブ４１ｃは、５’側領域（領域Ａ’）、中央領域（領域Ｅ）及び３’側領域（領域Ｃ’）の３領域を含み、第４ダイマー形成用プローブ４１ｄは、５’側領域（領域Ｄ’）、中央領域（領域Ｅ’）及び３’側領域（領域Ｆ’）の３領域を含み、第３ダイマー形成用プローブ４１ｃ及び第４ダイマー形成用プローブ４１ｄは、中央領域（領域Ｅ及びＥ’）が互いに相補的であり且つ該３’側領域（領域Ｃ’及びＦ’）及び該５’側領域（領域Ａ’及びＤ’）が互いに非相補的である。
　なお、本発明において、領域Ａ’は領域Ａに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｃ’は領域Ｃに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｄ’は領域Ｄに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｆ’は領域Ｆに相補的な塩基配列を有する領域を、それぞれ意味する。
　第１ダイマープローブ４０ａの５’側領域（領域Ａ及びＤ）は第２ダイマープローブ４０ｂの５’側領域（領域Ａ’及びＤ’）と相補的であり、第１ダイマープローブ４０ａの３’側領域（領域Ｃ及びＦ）は第２ダイマープローブ４０ｂの３’側領域（領域Ｃ’及びＦ’）と相補的であり、前記第１及び第２ダイマープローブ４０ａ及び４０ｂをハイブリダイズさせることにより、シグナルプローブポリマー５０を形成することができる（図５）。
　図４では、第１ダイマー形成用プローブ４１ａの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第３ダイマー形成用プローブ４１ｃの５’側領域及び３’側領域と相補的とし、第２ダイマー形成用プローブ４１ｂの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第４ダイマー形成用プローブ４１ｄの５’側領域及び３’側領域と相補的とした例を示したが、本発明において、ダイマープローブは、１つのダイマープローブの５’側領域が他のダイマープローブの５’側領域と相補的であり且つ１つのダイマープローブの３’側領域が他のダイマープローブの３’側領域と相補的であればよいものである。
　図６は、図４記載の第１ダイマープローブ４０ａと共に用いられる第２ダイマープローブの他の例（第２の例）を示す概略説明図である。
　図６に示した如く、５’側領域が図４記載の第１ダイマー形成用プローブ４１ａの５’側領域に相補的な領域（領域Ａ’）であり且つ３’側領域が図４記載の第２ダイマー形成用プローブ４１ｂの３’側領域に相補的な領域（領域Ｆ’）であるダイマー形成用プローブ４１ｅと、５’側領域が図４記載の第２ダイマー形成用プローブ４１ｂの５’側領域に相補的な領域（領域Ｄ’）であり且つ３’側領域が図４記載の第１ダイマー形成用プローブ４１ａの３’側領域に相補的な領域（領域Ｃ’）であるダイマー形成用プローブ４１ｆと、をハイブリダイズさせて形成させたダイマープローブ４０ｃを、第２ダイマープローブとして用いることもできる。
　また、図４では、２種類のダイマープローブを使用した例を示したが、相補的な領域の位置関係を工夫すれば、さらに多種類のダイマープローブを使用することもできる（特許文献５）。
　図７は、３組のダイマープローブ（第１ダイマープローブ４０ａ，第２ダイマープローブ４０ｄ，第３ダイマープローブ４０ｅ）を用いた場合の一例（第３の例）を示す概略説明図である。
　図７（ａ）において、第１ダイマープローブ４０ａは図４（ａ）と同様に構成されている。
　図７（ｂ）において、第２ダイマープローブ４０ｄは、２種の一本鎖核酸プローブ（ダイマー形成用プローブ４１ｇ，４１ｈ）をハイブリダイズさせることにより形成される。ダイマー形成用プローブ４１ｇは、５’側領域（領域Ｇ）、中央領域（領域Ｅ）及び３’側領域（領域Ｃ’）の３領域を含み、３’側領域（領域Ｃ’）が第１ダイマープローブ４０ａの３’側領域（領域Ｃ）と相補的である。ダイマー形成用プローブ４１ｈは、５’側領域（領域Ｄ’）、中央領域（領域Ｅ’）及び３’側領域（領域Ｈ）の３領域を含み、５’側領域（領域Ｄ’）が第１ダイマープローブ４０ａの５’側領域（領域Ｄ）と相補的である。ダイマー形成用プローブ４１ｇの中央領域Ｅは、ダイマー形成用プローブ４１ｈの中央領域Ｅ’と相補的である。
　図７（ｃ）において、第３ダイマープローブ４０ｅは、２種の一本鎖核酸プローブ（ダイマー形成用プローブ４１ｊ，４１ｋ）をハイブリダイズさせることにより形成される。ダイマー形成用プローブ４１ｊは、５’側領域（領域Ａ’）、中央領域（領域Ｊ）及び３’側領域（領域Ｈ’）の３領域を含み、５’側領域（領域Ａ’）が第１ダイマープローブ４０ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり、３’側領域（領域Ｈ’）が第２ダイマープローブ４０ｄの３’側領域（領域Ｈ）と相補的である。ダイマー形成用プローブ４１ｋは、５’側領域（領域Ｇ’）、中央領域（領域Ｊ’）及び３’側領域（領域Ｆ’）の３領域を含み、５’側領域（領域Ｇ’）が第２ダイマープローブ４０ｄの５’側領域（領域Ｇ）と相補的であり、３’側領域（領域Ｆ’）が第１ダイマープローブ４０ａの３’側領域（領域Ｆ）と相補的である。なお、図中、領域J’は領域Ｊに相補的な領域である。
　即ち、図７において、第１ダイマープローブの１つの５’側領域及び１つの３’側領域は、第２ダイマープローブの１つの５’側領域及び１つの３’側領域と相補的であり、第１ダイマープローブの他の５’側領域及び他の３’側領域は、第３ダイマープローブの１つの５’側領域及び１つの３’側領域と相補的であり、第２ダイマープローブの他の５’側領域及び他の３’側領域は、第３ダイマープローブの他の５’側領域及び他の３’側領域と相補的であるように構成されている。
　図７に示した如く、各ダイマープローブの各３’側領域をそれぞれ他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的とし、且つ各ダイマープローブの各５’側領域をそれぞれ他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的となるように構成した複数種のダイマープローブを用いて、これら複数種のダイマープローブをハイブリダイズさせることにより、ダイマープローブの集合体であるシグナルプローブポリマーが形成される。
　なお、本発明において、相補的な関係を有するダイマープローブの組み合わせに特に制限はないが、図７に示した如く、各ダイマープローブ中の１つの３’側領域及び１つの５’側領域が、他の１つのダイマープローブ中の１つの３’側領域及び１つの５’側領域とそれぞれ相補的となるように構成することが好ましい。
　ダイマー形成用プローブの各相補的な領域の長さは、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好ましくは少なくとも８塩基、さらに好ましくは１０塩基～１００塩基、さらに好ましくは１２～３０塩基である。また、それぞれのプローブにおける相補的な領域の長さは同じであることが望ましい。
　本発明において、ダイマープローブの代わりに、ダイマープローブ形成前のダイマー形成用プローブを用いてもよいが、ダイマープローブを用いることが好ましい。なお、シグナル増幅用プローブの第IIの例のいずれかの３’領域（例えば、領域Ｃ、Ｆ、Ｈ）にポリＴ配列を含み、これに相補的な領域（例えば、領域Ｃ’、Ｆ’、Ｈ’）にポリＡ配列を含む。
　本発明に用いられるシグナル増幅用プローブの第IIIの例として、一対のダイマー形成用プローブもしくは該一対のダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを１組以上と、１種以上の架橋プローブと、を含む複数種のシグナル増幅用プローブが挙げられる。前記各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、前記各一対のダイマー形成用プローブの中央領域は互いに相補的であり、前記各一対のダイマー形成用プローブのそれぞれの３’側領域及び５’側領域は全て互いに非相補的であり、前記各架橋プローブは５’側領域及び３’側領域の２領域を含み、前記各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、前記各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、該架橋プローブが、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能なように構成されており、自ら自己集合して集合体（プローブポリマー）を形成することができるものであり、例えば、特許文献６記載の核酸プローブが用いられる。
　図８は、１組の一対のダイマー形成用プローブ、及び１組の一対の架橋プローブを用いた場合の第１の例を示した。
　図８において、（ａ）は１組の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ６１ａ，第２ダイマー形成用プローブ６１ｂ）、並びに該一対のダイマー形成用プローブ６１ａ，６１ｂから形成されるダイマープローブ６０ａである。
　図８（ａ）に示した如く、一対のダイマー形成用プローブは、２種の一本鎖核酸プローブ（第１ダイマー形成用プローブ６１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ６１ｂ）からなり、各ダイマー形成用プローブ６１ａ，６１ｂは、中央領域、該中央領域より５’側に位置する５’側領域、及び該中央領域より３’側に位置する３’側領域の少なくとも３領域を含む。図８中、第１ダイマー形成用プローブ６１ａの５’側領域を領域Ａ、中央領域を領域Ｂ、３’側領域を領域Ｃで示し、第２ダイマー形成用プローブ６１ｂの５’側領域を領域Ｄ、中央領域を領域Ｂ’、３’側領域を領域Ｆで示した。第１ダイマー形成用プローブ６１ａと第２ダイマー形成用プローブ６１ｂの中央領域（領域Ｂ及びＢ’）は互いに相補的であり、第１ダイマー形成用プローブ６１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ６１ｂのそれぞれの５’側領域（領域Ａ及びＤ）及び３’側領域（領域Ｃ及びＦ）の４領域は全て互いに非相補的であり、両者をハイブリダイズさせることにより、１組のダイマープローブ６０ａが形成される。
　本発明において、予め一対のダイマー形成用プローブをハイブリダイズさせて形成させたダイマープローブを用いてもよく、ダイマー形成用プローブをそのまま用いてもよいが、ダイマープローブを用いることが好ましい。
　複数組の一対のダイマー形成用プローブを用いる場合、前述した１組の場合と同様に各組の一対のダイマー形成用プローブを構成する。複数組の一対のダイマー形成用プローブにより同数組のダイマープローブが形成される。
　図１４（ａ），（ｂ）は、２組の一対のダイマー形成用プローブの一例及び該一対のダイマー形成用プローブから形成される２組のダイマープローブを示す概略説明図である。図１４において、（ａ）は１組目の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ７１ａ，第２ダイマー形成用プローブ７１ｂ）、並びに該一対のダイマー形成用プローブ７１ａ，７１ｂから形成されるダイマープローブ７０ａであり、（ｂ）は２組目の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ７１ｃ，第２ダイマー形成用プローブ７１ｄ）、並びに該一対のダイマー形成用プローブ７１ｃ，７１ｄから形成されるダイマープローブ７０ｂである。
　図１４中、１組目の第１ダイマー形成用プローブ７１ａの５’側領域を領域Ａ、中央領域を領域Ｂ、３’側領域を領域Ｃで示し、１組目の第２ダイマー形成用プローブ７１ｂの５’側領域を領域Ｄ、中央領域を領域Ｂ’、３’側領域を領域Ｆで示し、２組目の第１ダイマー形成用プローブ７１ｃの５’側領域を領域Ｇ、中央領域を領域Ｅ、３’側領域を領域Ｈで示し、２組目の第２ダイマー形成用プローブ７１ｄの５’側領域を領域Ｉ、中央領域を領域Ｅ’、３’側領域を領域Ｊで示した。各組の第１及び第２ダイマー形成用プローブの中央領域（領域Ｂ及びＢ’、領域Ｅ及びＥ’）はそれぞれ互いに相補的であり、各一対の第１及び第２ダイマー形成用プローブの５’側領域及び３’側領域の４領域（領域Ａ、Ｃ、Ｄ及びＦ、領域Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪ）は全て互いに非相補的であり、各組の一対のダイマー形成用プローブ７１ａ，７１ｂ，７１ｃ，７１ｄをハイブリダイズさせることにより、２組のダイマープローブ７０ａ，７０ｂが形成される。本発明において、用いるダイマー形成用プローブの３’側領域及び５’側領域が全て互いに非相補的であることが好ましい。
　本発明において、架橋プローブはダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを架橋することができる１種以上の一本鎖核酸プローブであり、少なくとも２領域を含む。該２領域の内、５’側に位置する領域を５’側領域と称し、３’側に位置する領域を３’側領域と称する。本発明において、各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的である。該構成とすることにより、架橋プローブは、ダイマー形成用プローブから形成される１種以上の複数のダイマープローブを架橋するように、ダイマー形成用プローブに結合し、プローブの集合体（プローブポリマー）を形成することができる。
　１組の一対のダイマー形成用プローブを用いる場合、１組の一対の架橋プローブを用いることが好ましい。１組の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ及び第２ダイマー形成用プローブ）及び１組の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ及び第２架橋プローブ）は、一対のダイマー形成用プローブの各５’側領域が、一対の架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、且つ一対の架橋プローブの各５’側領域が、一対のダイマー形成用プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、一対のダイマー形成用プローブの各３’側領域が、一対の架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、且つ一対の架橋プローブの各３’側領域が、一対のダイマー形成用プローブのいずれかの３’側領域と相補的であるように構成される。
　図８（ｂ）は、図８（ａ）記載の一対のダイマー形成用プローブ６１ａ，６１ｂと共に用いられる１組の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ６２ａ及び第２架橋プローブ６２ｂ）の一例を示す概略説明図である。
　図８（ａ）記載の１組の一対のダイマー形成用プローブ６１ａ，６１ｂと共に用いられる架橋プローブとしては、例えば、図８（ｂ）に示した如く、第１架橋プローブ６２ａの５’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ６１ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり、第１架橋プローブ６２ａの３’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ６１ａの３’側領域（領域Ｃ）と相補的であり、第２架橋プローブ６２ｂの５’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ６１ｂの５’側領域（領域Ｄ）と相補的であり、第２架橋プローブ６２ｂの３’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ６１ｂの３’側領域（領域Ｆ）と相補的である、一対の架橋プローブが好適である。図８（ａ）記載のダイマー形成用プローブ６１ａ－６１ｂ及び図８（ｂ）記載の架橋プローブ６２ａ－６２ｂをハイブリダイズさせることにより、シグナルプローブポリマー６８を形成することができる（図９）。
　図８では、第１ダイマー形成用プローブ６１ａの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第１架橋プローブ６２ａの５’側領域及び３’側領域と相補的とし、第２ダイマー形成用プローブ６１ｂの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第２架橋プローブ６２ｂの５’側領域及び３’側領域と相補的とした例を示したが、本発明において、１つのダイマー形成用プローブの５’側領域が１つの架橋プローブの５’側領域と相補的であり且つ１つのダイマー形成用プローブの３’側領域が１つの架橋プローブの３’側領域と相補的であればよいものである。
　図１０は、図８記載の一対のダイマー形成用プローブ６１ａ，６１ｂと共に用いられる１組の一対の架橋プローブの他の例（第１架橋プローブ６２ｃ及び第２架橋プローブ６２ｄ）（第２の例）を示す概略説明図である。
　図１０に示した如く、一対の架橋プローブの他の例として、第１架橋プローブ６２ｃの５’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ６１ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり、第１架橋プローブ６２ｃの３’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ６１ｂの３’側領域（領域Ｆ）と相補的であり、第２架橋プローブ６２ｄの５’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ６１ｂの５’側領域（領域Ｄ）と相補的であり、第２架橋プローブ６２ｄの３’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ６１ａの３’側領域（領域Ｃ）と相補的である、一対の架橋プローブが挙げられる。図８（ａ）記載のダイマー形成用プローブ６１ａ－６１ｂ及び図１０記載の架橋プローブ６２ｃ－６２ｄをハイブリダイズさせることにより、シグナルプローブポリマー６８を形成することができる（図１１）。
　複数組の一対のダイマー形成用プローブを用いる場合、同数組の一対の架橋プローブを用いることが好ましい。具体的には、ｎ組（ｎは２以上の整数）の一対のダイマー形成用プローブ（即ち、２ｎ個のダイマー形成用プローブ）及びｎ組の一対の架橋プローブ（即ち、２ｎ個の架橋プローブ）を用い、各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、且つ各架橋プローブの５’側領域は、ダイマー形成用プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、且つ各架橋プローブの３’側領域は、前記ダイマー形成用プローブのいずれかの３’側領域と相補的であるでるように構成することが好適である。
　図１４（ｃ）（ｄ）は、図１４（ａ）（ｂ）記載の２組の一対のダイマー形成用プローブ７１ａ－７１ｄと共に用いられる２組の一対の架橋プローブ７２ａ－７２ｄの一例を示す概略説明図である。図１４において、（ｃ）は１組目の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ７２ａ，第２架橋プローブ７２ｂ）であり、（ｄ）は２組目の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ７２ｃ，第２架橋プローブ７２ｄ）である。
　図１４に示した如く、２組の一対のダイマー形成用プローブ７１ａ－７１ｄと共に用いられる架橋プローブとしては、２組の一対の架橋プローブ（即ち、４種の架橋プローブ）を用い、各ダイマー形成用プローブの５’側領域が架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各架橋プローブの５’側領域がダイマー形成用プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各ダイマー形成用プローブの３’側領域が架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、各架橋プローブの３’側領域がダイマー形成用プローブのいずれかの３’側領域と相補的であるように構成することが好適である。
　具体的には、図１４に示した如く、１組目の第１架橋プローブ７２ａの５’側領域は、１組目の第１ダイマー形成用プローブ７１ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり、１組目の第２架橋プローブ７２ｂの５’側領域は、１組目の第２ダイマー形成用プローブ７１ｂの５’側領域（領域Ｄ）と相補的であり、２組目の第１架橋プローブ７２ｃの５’側領域は、２組目の第１ダイマー形成用プローブ７１ｃの５’側領域（領域Ｇ）と相補的であり、２組目の第２架橋プローブ７２ｄの５’側領域は、２組目の第２ダイマー形成用プローブ７１ｄの５’側領域（領域Ｉ）と相補的であり、１組目の第１架橋プローブ７２ａの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ７１ａ－７１ｄのいずれか１つの３’側領域と相補的であり（図１４では、領域Ｈと相補的である場合を示した）、１組目の第２架橋プローブ７２ｂの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ７１ａ－７１ｄ中、１組目の第１架橋プローブ７２ａで選択したものを除くいずれか１つの３’側領域と相補的であり（図１４では、領域Ｊと相補的である場合を示した）、２組目の第１架橋プローブ７２ｃの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ７１ａ－７１ｄ中、１組目の第１及び第２架橋プローブ７２ａ－７２ｂで選択したものを除くいずれか１つの３’側領域と相補的であり（図１４では、領域Ｃと相補的である場合を示した）、２組目の第２架橋プローブ７２ｄの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ７１ａ－７１ｄ中、１組目の第１及び第２架橋プローブ７２ａ－７２ｂ及び２組目の第１架橋プローブ７２ｃで選択したものを除く１つの３’側領域と相補的である（図１４では、領域Ｆと相補的である場合を示した）、２組の一対の架橋プローブが好適である。図１４記載のダイマー形成用プローブ７１ａ－７１ｄ及び架橋プローブ７２ａ－７２ｄをハイブリダイズさせることにより、シグナルプローブポリマー６８を形成することができる。
　なお、図１４では、１組目の第１架橋プローブ７２ａの３’側領域は、２組目の第１ダイマー形成用プローブ７１ｃの３’側領域と相補的であり、１組目の第２架橋プローブ７２ｂの３’側領域は、２組目の第２ダイマー形成用プローブ７１ｄの３’側領域と相補的であり、２組目の第１架橋プローブ７２ｃの３’側領域は、１組目の第１ダイマー形成用プローブ７１ａの３’側領域と相補的であり、２組目の第２架橋プローブ７２ｄの３’側領域は、１組目の第２ダイマー形成用プローブ７１ｂの３’側領域と相補的である場合を示したが、各架橋プローブの３’側領域と相補的となるダイマー形成用プローブの３側領域の組み合わせに制限はないものである。
　ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブの各相補的な領域の長さは、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好ましくは少なくとも８塩基、さらに好ましくは１０塩基～１００塩基、さらに好ましくは１２～３０塩基である。また、それぞれのプローブにおける相補的な領域の長さは同じであることが望ましい。なお、シグナル増幅用プローブの第IIIの例において、いずれかの３’側領域（例えば、領域Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｊ）にポリＴ配列を含み、これに相補的な領域（例えば、領域Ｃ’、Ｆ’、Ｈ’、Ｊ’）にポリＡ配列を含む。
　本発明において、非相補的な塩基配列とは、互いにハイブリダイズしない塩基配列であればいかなるものでもよく、同一な塩基配列も非相補的な塩基配列に含まれるものである。
　図１２は、本発明に用いられる１組の一対のダイマー形成用プローブ及び１種の一対の架橋プローブの第３の例を示す概略説明図である。図１２（ａ）において、符号６０ｂはダイマープローブであり、３’側領域並びに５’側領域をそれぞれ同一の塩基配列とした２種のダイマー形成用プローブ６１ｃ，６１ｄを用いてダイマーを形成した例を示した。即ち、図８のダイマープローブ６０ａにおいて、領域Ａと領域Ｄを同一の塩基配列とし、領域Ｃと領域Ｆを同一の塩基配列としたものである。該構成とすることにより、図１２（ｂ）に示した如く、ダイマープローブ６０ｂと共に用いられる一対の架橋プローブは同一となり、１種の架橋プローブ６２ｃが用いられる。図１２記載のダイマー形成用プローブ６１ｃ－６１ｄ及び架橋プローブ６２ｃをハイブリダイズさせることにより、シグナルプローブポリマー６８を形成することができる（図１３）。
　本発明に用いられるシグナル増幅用プローブの第IVの例として、自己集合可能な１種の核酸プローブが挙げられる。前記核酸プローブは、３以上の核酸領域を含む核酸プローブであって、該核酸プローブの各核酸領域が第１領域及び該第１領域に相補的な第２領域を隣接して含むように構成することにより、１種の核酸プローブのみによって該核酸プローブのポリマーを形成することができるものであり、例えば、特許文献７記載の核酸プローブが用いられる。本願明細書において、核酸プローブの核酸領域とは、前記第１領域及び第２領域からなる領域を意味する。また、各核酸領域中の第１領域及び第２領域をそれぞれ相補領域と称する。
　図１５は、本発明で用いられる自己集合可能な１種の核酸プローブの一例を示す概略説明図である。図１６は、図１５の核酸プローブの結合態様を示す概略説明図である。図１７は、図１５の核酸プローブにより形成された自己集合体（プローブポリマー）を示す概略説明図である。
　図１５は、本発明に用いられるシグナル増幅用プローブの第IVの例の一例を示す概略説明図であり、３箇所の核酸領域を含む例を示した。図１５に示した如く、自己集合可能な１種の核酸プローブ８０は、５’端部から順に核酸領域８０ａ，核酸領域８０ｂ及び核酸領域８０ｃを有し、各核酸領域８０ａ，８０ｂ及び８０ｃは互いに相補的な２領域を隣接して含む。即ち、前記核酸領域８０ａは相補領域Ｘ及び該相補領域Ｘに相補的な塩基配列を有する相補領域Ｘ’を隣接して含み、前記核酸領域８０ｂは相補領域Ｙ及び該相補領域Ｙに相補的な塩基配列を有する相補領域Ｙ’を隣接して含み、前記核酸領域８０ｃは相補領域Ｚ及び該相補領域Ｚに相補的な塩基配列を有する相補領域Ｚ’を隣接して含むものである。
　前記核酸プローブ８０において、相補領域Ｘと相補領域Ｘ’、相補領域Ｙと相補領域Ｙ’、相補領域Ｚと相補領域Ｚ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的核酸領域であり、図１６に示した如く、相補領域Ｘと相補領域Ｘ’が結合し［図１６（ａ）］、相補領域Ｙと相補領域Ｙ’が結合し［図１６（ｂ）］、相補領域Ｚと相補領域Ｚ’が結合する［図１６（ｃ）］。なお、図１６では、好適な例として、３個の核酸領域（８０ａ，８０ｂ及び８０ｃ）を有する核酸プローブを示したが、核酸領域の数は３個以上であれば特に限定されないものである。
　該核酸プローブ８０をハイブリダイゼーション反応させることにより、図１７に示した如く、核酸プローブ８０が自己集合し、核酸プローブ８０の自己集合体であるプローブポリマー９０を形成させることができる。なお、シグナル増幅用プローブの第IVの例の３’領域（例えば、領域Ｚ’）にポリＴ配列を含み、これに相補的な領域（例えば、領域Ｚ）にポリＡ配列を含む。
　前記核酸プローブ８０において、各相補領域の長さは、塩基数にして２塩基以上が好ましく、３塩基～５０塩基がより好ましく、さらに好ましくは４～１５塩基である。また、核酸プローブ中の各相補領域の長さは同じであることが望ましい。
　本発明において、それぞれのシグナル増幅用プローブのポリＴ配列の長さは、１１～２６塩基であることが好適である。なお、図１では、核酸領域Ｚが全てポリＴ配列である例を示したが、ポリＴ配列及び他の配列を含む核酸領域Ｚを有する第１のシグナル増幅用プローブ１８ａを用いてもよい。
　それぞれのシグナル増幅用プローブのポリＴ配列を含む核酸領域を除く各核酸領域の塩基配列は、プローブポリマーが形成されるように所定の領域が相補的な塩基配列となるように構成されればよく特に制限はないが、各領域の両末端の塩基がグアニン又はシトシンであることが好ましい。各領域の両末端の塩基をグアニン又はシトシンとすることにより、反応時間を短縮させることができ、さらにより低い反応温度で安定したプローブポリマーを形成させることができ、作業性及び検出感度を向上させることができる。
　上記シグナル増幅用プローブは、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、国際公開第９２／２０７０２号公報等参照）やLocked Nucleic Acid（ＬＮＡ、Koshkin AA et al. Tetrahedron1998.54, 3607-3630.、Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc. 1998.120, 13252-13253.、Wahlestedt C et al. PNAS.2000.97,5633-5638.等参照）が挙げられる。また、一対のシグナル増幅用プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、たとえばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体（たとえばＰＮＡやＬＮＡ等）から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえばＤＮＡのみから構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、ＤＮＡとＲＮＡから構成されるオリゴヌクレオチド・プローブ（キメラプローブ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。
　これらプローブは公知の方法により合成することができる。たとえばＤＮＡプローブの場合、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイド法により合成することができる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ－ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであってもよい。
　本発明において、それぞれのシグナル増幅用プローブの一方又は両方が標識物質２０で標識されたものを用いることが好ましい。前記標識物質２０としては、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質又は色素等が好適な例として挙げられる。
　次に、本発明のＲＮＡの検出方法の第２の態様として、標的ＲＮＡがポリＡテールを持たないＲＮＡ、例えば、マイクロＲＮＡの場合を以下に説明する。
　本発明のＲＮＡの検出方法の第２の態様は、標的ＲＮＡがマイクロＲＮＡであり、（Ｄ）マイクロＲＮＡの３’末端にポリＡを付加するポリＡ付加工程と、（Ａ）前記マイクロＲＮＡ、及び前記マイクロＲＮＡを捕捉するための捕捉物質を反応させ、前記マイクロＲＮＡを捕捉する捕捉工程と、（Ｂ）前記捕捉されたマイクロＲＮＡ、及び１種又は複数種のシグナル増幅用プローブを反応させ、前記マイクロＲＮＡと、前記捕捉物質と、前記シグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーと、を含む検出用複合体を形成する検出用複合体形成工程と、（Ｃ）前記検出用複合体に結合した前記プローブポリマーを検出することにより、前記マイクロＲＮＡを検出する検出工程と、を含むマイクロＲＮＡの検出方法であって、前記複数種のシグナル増幅用プローブは、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な複数種のシグナル増幅用プローブであって、該複数種のシグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブが、ポリＴ配列を有し、前記１種のシグナル増幅用プローブは、ポリＴ配列を有し且つ３以上の核酸領域を含む１種のシグナル増幅用プローブであって、該１種のシグナル増幅用プローブの各核酸領域が第１領域及び該第１領域に相補的な第２領域を隣接して含むことを特徴とする。
　図１８は、本発明のＲＮＡの検出方法の第２の態様の例を示す概略説明図であり、（ａ）はマイクロＲＮＡ、（ｂ）はポリＡ付加工程後のポリＡ付加されたマイクロＲＮＡ、（ｃ）は捕捉工程後の捕捉物質により捕捉されたマイクロＲＮＡ、（ｄ）は検出用複合体形成工程後の検出用複合体をそれぞれ示す。
　図１８において符号１０ｂはマイクロＲＮＡである。本発明は、短い標的核酸の検出に好適に用いられるものであり、１７～６３塩基のマイクロＲＮＡの検出に好適に用いられ、１７～２４塩基程度のマイクロＲＮＡの検出に特に好適に用いられる。また、同時に多種の核酸分子を検出することも出来る。
　図１８（ｂ）に示した如く、マイクロＲＮＡ１０ｂの３’末端にポリＡを付加するポリＡ付加工程を行い、ポリＡ付加されたマイクロＲＮＡ１２とする［工程（Ｄ）］。次に、図１８（ｃ）に示した如く、前記ポリＡ付加されたマイクロＲＮＡ１２と、標的マイクロＲＮＡ１０ｂを捕捉するための捕捉物質１４を反応させ、ポリＡ付加されたマイクロＲＮＡ１２を捕捉する捕捉工程を行う［工程（Ａ）］。なお、図１８では、工程（Ｄ）後に工程（Ａ）を行う場合を示したが、工程（Ａ）後に工程（Ｄ）を行う、即ち、マイクロＲＮＡ１０ｂと、捕捉物質１４を反応させ、マイクロＲＮＡ１０ｂを捕捉する捕捉工程を行った後［工程（Ａ）］、マイクロＲＮＡ１０ｂの３’末端にポリＡを付加するポリＡ付加工程を行い［工程（Ｄ）］、ポリＡ付加されたマイクロＲＮＡ１２を捕捉物質１４により捕捉してもよい。
　本発明のＲＮＡの検出方法の第２の態様において、工程（Ａ）～（Ｃ）は前述した第１の態様と同様に行うことができる。
　本発明において、複数の捕捉物質１４を併用することにより、複数種の標的核酸を同時に検出することが可能である。複数種の標的核酸の同時検出において、それぞれのシグナル増幅用プローブは同一のものが使用可能であり、担体１６及び捕捉物質１４のみを複数種準備すればよく、作業性に優れ、低コストである。
　以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。
（実施例１）合成ＲＮＡを用いた１２種類のマイクロＲＮＡ検出
　標的マイクロＲＮＡとして６種類の合成オリゴＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－１００，１５５，１５ｂ，１６，２１及び２３ａ／ｂ）を使用した。該６種類の合成ＲＮＡを等量ずつ混ぜ、それぞれの量が０，０．３１６ａｍｏｌ，１ａｍｏｌ，３．１６ａｍｏｌ，１０ａｍｏｌ又は３１．６ａｍｏｌとなるように調整し実験に使用した。
　ｈｓａ－ｍｉＲ－１００の塩基配列
5'-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3'（配列番号１）
　ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５の塩基配列
5'-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG-3'（配列番号２）
　ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ｂの塩基配列
5'-UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA-3'（配列番号３）
　ｈｓａ－ｍｉＲ－１６の塩基配列
5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3'（配列番号４）
　ｈｓａ－ｍｉＲ－２１の塩基配列
5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'（配列番号５）
　ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ／ｂの塩基配列
5'-AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC-3'（配列番号６）
　捕捉物質として１２種のキャプチャープローブ（ＣＰ－ｈｓａ－ｌｅｔ７ｄ，ＣＰ－ｈｓａ－ｍｉＲ－１００，１０７，１５５，１５ｂ，１６，１８１ａ，１８１ｃ，２１，２２１，２３ａ／ｂ，又は９２ａ）がそれぞれ結合した１２種の球状ビーズ［蛍光微小粒子（Luminex bead、Luminex社製）］を用いた。
　ＣＰ－ｈｓａ－ｌｅｔ７ｄの塩基配列
5'-AACTATGCAACCTACTACCTCT-3'（配列番号７）
　ＣＰ－ｈｓａ－ｍｉＲ－１００の塩基配列
5'-CACAAGTTCGGATCTACGGGTT-3'（配列番号８）
　ＣＰ－ｈｓａ－ｍｉＲ－１０７の塩基配列
5'-TGATAGCCCTGTACAATGCTGCT-3'（配列番号９）
　ＣＰ－ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５の塩基配列
5'-CCCCTATCACGATTAGCATTAA-3'（配列番号１０）
　ＣＰ－ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ｂの塩基配列
5'-TGTAAACCATGATGTGCTGCTA-3'（配列番号１１）
　ＣＰ－ｈｓａ－ｍｉＲ－１６の塩基配列
5'-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3'（配列番号１２）
　ＣＰ－ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａの塩基配列
5'-ACTCACCGACAGCGTTGAATGTT-3'（配列番号１３）
　ＣＰ－ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｃの塩基配列
5'-ACTCACCGACAGGTTGAATGTT-3'（配列番号１４）
　ＣＰ－ｈｓａ－ｍｉＲ－２１の塩基配列
5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'（配列番号１５）
　ＣＰ－ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１の塩基配列
5'-GAAACCCAGCAGACAATGTAGCT-3'（配列番号１６）
　ＣＰ－ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ／ｂの塩基配列
5'-GGAAATCCCTGGCAATGTGAT-3'（配列番号１７）
　ＣＰ－ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａの塩基配列
5'-ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA-3'（配列番号１８）
　シグナル増幅用プローブとして、５’末端がビオチンで標識されている２種類の核酸プローブ（ＨＣＰ－１及びＨＣＰ－２）を用いた。
　ＨＣＰ－１の塩基配列（5’-X-Y-Z-3’）
5'-CAACAATCAGGAC GATACCGATGAAG TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号１９）
　ＨＣＰ－２の塩基配列（5’-X’-Y’-Z’-3’）
5'-GTCCTGATTGTTG CTTCATCGGTATC AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'（配列番号２０）
　標的マイクロＲＮＡを５μＬ、10xPAP Buffer（NEB社製）を１μＬ、10mM ATP（NEB社製）を１μＬ、PolyA polymerase（NEB社製）を０．２μＬ、D.W.を２．８μＬ加え、計１０μＬとし、３７℃で１５分間反応させた（ポリＡ付加工程）。
　前記ポリＡ付加工程後の反応液１０μＬに、第１ハイブリダイゼーション反応液［１２種の球状ビーズ（各１０００個）　各０．１μＬ（計１．２μＬ）、５Ｍ　ＴＭＡＣ（tetra-methyl ammonium chloride）７．５μＬ、10xSupplement［500mM Tris-HCl（pH8.0）, 40mM EDTA（pH8.0）, 1% sarkosyl］３．７５μＬ、D.W.　２．５５μＬ］を１５μＬ加え、計２５μＬとし、５０℃で６０分間反応させた（捕捉工程）。
　前記捕捉工程後の反応液２５μＬに、ＰＡＬＳＡＲ反応液［５Ｍ　ＴＭＡＣ　７．５μＬ、10xSupplement　２．５μＬ、２０ｐｍｏｌ／μＬ　ＨＣＰ－１　２．５μＬ、２０ｐｍｏｌ／μＬ　ＨＣＰ－２　２．０μＬ、D.W.　１０．５μＬ］を２５μＬ加え、計５０μＬとし、４４℃で６０分間反応させた（検出用複合体形成工程）。
　前記検出用複合体形成工程後の反応液をWash Buffer［1xPBS with 0.02% tween20 and 1.5ppm Proclin300］で１回洗浄した後、検出試薬［ＳＡ－ＰＥ（Prozyme社製）５ｎｇ／μＬ］を５０μＬ加え、室温で１０分間置いた後、Wash Bufferで１回洗浄した。その後Wash Bufferを１００μＬ加え、フローサイトメトリー（Luminex社製、Luminex System）でビオチン及び蛍光微小粒子の蛍光を測定し、１２種類のマイクロＲＮＡのシグナルを検出した（検出工程）。結果を表１及び図１９に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（比較例１）
　市販miRNA検出キットを用い、実施例１と同一の標的マイクロＲＮＡを用いて、マイクロＲＮＡの検出を行った。
　ラベリング試薬としてVantage microRNA Labeling Kit（Marligen社製）、検出試薬としてVantage miRNA Multiplex Detection Kit Pancreatic Cancer Panel1（Marligen社製）を用い、実施例１と同じ６種類の標的マイクロＲＮＡを用いて、マイクロＲＮＡの検出を行った。試薬組成、反応方法は、Kit付属のプロトコールに基づいた。結果を表２及び図２０に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（実施例２）合成ＲＮＡ及び細胞由来のTotal RNAを用いたmiRNAの検出
　標的マイクロＲＮＡとして実施例１で用いた合成オリゴＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－２１）を使用した。該合成オリゴＲＮＡが０，０．１ａｍｏｌ，０．３１６ａｍｏｌ，１ａｍｏｌ，３．１６ａｍｏｌ，１０ａｍｏｌ，３１．６ａｍｏｌ，１００ａｍｏｌ又は３１６ａｍｏｌとなるように調整し実験に使用した（実施例２－１）。
　また、標的マイクロＲＮＡとして、細胞由来の１０種のTotal RNA（ＮＣＩ－Ｈ６５０，ＭＣＦ－７，ＣＦＰＡＣ－１，ＬＣ－１Ｆ，Ａ５４９，Ｈｅｐ－２，ＰＣ－１４，ＨｅＬａ，ＭＤＡ－ＭＢ－４３５ｓ，又はＢＴ５４９）をそれぞれ１０ｎｇ使用した（実施例２－２～２－１１）。
　捕捉物質として実施例１で用いたキャプチャープローブ（ＣＰ－ｈａｓ－ｍｉＲ－２１）が結合した球状ビーズを用いた。
　前述した標的マイクロＲＮＡを用いて実施例１と同様の方法によりポリＡ付加工程を行った。
　前記ポリＡ付加工程後の反応液１０μＬに、第１ハイブリダイゼーション反応液［球状ビーズ（１０００個）　０．４μＬ、５Ｍ　ＴＭＡＣ　７．５μＬ、10xSupplement［500mM Tris-HCl（pH8.0）,40mM EDTA（pH8.0）, 1% sarkosyl］３．７５μＬ、D.W. ３．３５μＬ］を１５μＬ加え、計２５μＬとし、５０℃で６０分間反応させた（捕捉工程）。
　前記捕捉工程後の反応液２５μＬを用いて実施例１と同様の方法により検出用複合体形成工程を行った。
　前記検出用複合体形成工程後の反応液をWash Buffer［1xPBS with 0.02% tween20, 0.1% BSA and 0.05% NaN3］で１回洗浄した後、検出試薬［ＳＡ－ＰＥ（Invitrogen社製）１０ｎｇ／μＬ］を５０μＬ加え、室温で１０分間置いた後、Wash Bufferで１回洗浄した。その後Wash Bufferを１００μＬ加え、フローサイトメトリー（Luminex社製、Luminex System）でビオチン及び蛍光微小粒子の蛍光を測定し、マイクロＲＮＡのシグナルを検出した（検出工程）。実施例２－１の結果を図２１に示した。また、図２１のグラフから算出した実施例２－２～実施例２－１１の定量値の結果を表３に示した。さらに、実施例２と比較例２の結果の相関図を図２３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（比較例２）
　TaqManProbeを用い、実施例２と同一の標的マイクロＲＮＡを用いて、リアルタイムＰＣＲ法により、マイクロＲＮＡ（has-miR-21およびhas-miR-16）の検出を行った。
　TaqMan MicroRNA Primer（ABI社製、miR-21, 16用）及びTaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（ABI社製）を用いて、付属プロトコールに従い逆転写反応を行った。その後、TaqMan MicroRNA Assays（ABI社製、miR-21, 16用）及びUniversal PCR Master Mix, No AmpErase UNG（ABI社製）と逆転写反応液を用いて、付属プロトコールに従いリアルタイムPCR反応を行った。その結果を図２２及び表３に示した。また、実施例２と比較例２の結果の相関図を図２３に示した。
　実施例１及び２の結果に示される如く、本願発明はマイクロＲＮＡを数amolレベルまで検出可能であり、高感度且つ簡易にマイクロＲＮＡを検出することができた。さらに、実施例２及び比較例２の結果に示される如く、本願発明はリアルタイムＰＣＲ法と高い相関を示すことが証明された。
（実施例３）培養細胞由来ＴｏｔａｌＲＮＡを用いた２種類のメッセンジャーＲＮＡ検出
　標的メッセンジャーＲＮＡであるＢｅｔａ－Ａｃｔｉｎ（ＢＡ）とＧＡＰＤＨ（Ｇ３Ｐ）を含む細胞由来のＴｏｔａｌＲＮＡ（細胞株ＲＥＲＦ－ＬＣ－ＡＩ）を使用した。ＴｏｔａｌＲＮＡのそれぞれの量が０，０．１μｇ，０．５μｇ，１μｇ又は２．５μｇとなるように調整し実験に使用した。
　捕捉物質として２種のキャプチャープローブ（ＣＰ－ＢＡ－１又はＣＰ－Ｇ３Ｐ－１）がそれぞれ結合した２種の球状ビーズ［蛍光微小粒子（Ｌｕｍｉｎｅｘ ｂｅａｄ、Ｌｕｍｉｎｅｘ社製）］を用いた。
　ＣＰ－ＢＡ－１の塩基配列
5'-AAGGTGTGCACTTTTATTCAACTGGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGCCCTGGCTGCCTC -3'（配列番号２１）
　ＣＰ－Ｇ３Ｐ－１の塩基配列
5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATTGATGGTACATGACAAGGTGCGGCTCCCTAGGCCCCTCC -3'（配列番号２２）
　シグナル増幅用プローブとして、実施例１で用いた５’末端がビオチンで標識されている２種類の核酸プローブ（ＨＣＰ－１及びＨＣＰ－２）を用いた。
　ＴｏｔａｌＲＮＡを１０μＬに、第１ハイブリダイゼーション反応液［２種の球状ビーズ各２０００個　各０．２μＬ（計０．４μＬ）、５Ｍ　ＴＭＡＣ（ｔｅｔｒａ-ｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）７．５μＬ、10ｘＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ［500ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ8.0）, 40ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ8.0）, 1% ｓａｒｋｏｓｙｌ］２．５μＬ、D.W.　４．６μＬ］を１５μＬ加え、計２５μＬとし、５５℃で６０分間反応させた（捕捉工程）。
　前記捕捉工程後の反応液２５μＬに、ＰＡＬＳＡＲ反応液［５Ｍ　ＴＭＡＣ　７．５μＬ、10xSupplement　２．５μＬ、２０ｐｍｏｌ／μＬ　ＨＣＰ－１　２．５μＬ、２０ｐｍｏｌ／μＬ　ＨＣＰ－２　２．０μＬ、Ｄ.Ｗ.　１０．５μＬ］を２５μＬ加え、計５０μＬとし、４４℃で６０分間反応させた（検出用複合体形成工程）。
　前記検出用複合体形成工程後の反応液をＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ［１ｘＰＢＳ ｗｉｔｈ ０．０２％ ｔｗｅｅｎ２０ ａｎｄ ０．５％ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｚｉｄｅ］で１回洗浄した後、検出試薬［ＳＡ－ＰＥ（Ｐｒｏｚｙｍｅ社製）５ｎｇ／μＬ］を５０μＬ加え、室温で１０分間置いた後、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した。その後Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ加え、フローサイトメトリー（Ｌｕｍｉｎｅｘ社製、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｓｙｓｔｅｍ）でビオチン及び蛍光微小粒子の蛍光を測定し、２種類のメッセンジャーＲＮＡのシグナルを検出した（検出工程）。結果を図２４に示した。
　（実施例４）5種類の培養細胞由来ＴｏｔａｌＲＮＡを用いた２種類のメッセンジャーＲＮＡ比率の検討
　標的メッセンジャーＲＮＡであるＢｅｔａ－ＡｃｔｉｎとＧＡＰＤＨを含む細胞由来のＴｏｔａｌＲＮＡ（細胞株ＲＥＲＦ－ＬＣ－ＡＩ,Ａ５４９,Ｈｅｌａ,ＰＣ－１４,Ｈｅｐ－２）を使用した。ＴｏｔａｌＲＮＡのそれぞれの量が１μｇ又は５μｇとなるように調整し実験に使用した。
　捕捉物質として実施例３と同じ２種のキャプチャープローブ（ＣＰ－ＢＡ－１又はＣＰ－Ｇ３Ｐ－１）がそれぞれ結合した２種の球状ビーズ［蛍光微小粒子（Luminex bead、Luminex社製）］を用いた。
　シグナル増幅用プローブとして、実施例１と同じ５’末端がビオチンで標識されている２種類の核酸プローブ（ＨＣＰ－１及びＨＣＰ－２）を用いた
　ＴｏｔａｌＲＮＡを１０μＬに、第１ハイブリダイゼーション反応液［２種の球状ビーズ各２０００個　各０．２μＬ（計０．４μＬ）、５Ｍ　ＴＭＡＣ（ｔｅｔｒａ-ｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）７．５μＬ、10ｘＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ［500ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ8.0）, 40ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ8.0）, 1% ｓａｒｋｏｓｙｌ］２．５μＬ、D.W.　４．６μＬ］を１５μＬ加え、計２５μＬとし、５５℃で６０分間反応させた（捕捉工程）。
　前記捕捉工程後の反応液２５μＬに、ＰＡＬＳＡＲ反応液［５Ｍ　ＴＭＡＣ　７．５μＬ、１０ｘＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　２．５μＬ、２０ｐｍｏｌ／μＬ　ＨＣＰ－１　２．５μＬ、２０ｐｍｏｌ／μＬ　ＨＣＰ－２　２．０μＬ、Ｄ.Ｗ.　１０．５μＬ］を２５μＬ加え、計５０μＬとし、４４℃で６０分間反応させた（検出用複合体形成工程）。
　前記検出用複合体形成工程後の反応液をＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ［１ｘＰＢＳ ｗｉｔｈ ０．１％ ＢＳＡ, ０．０２％ ｔｗｅｅｎ20 ａｎｄ 0.5% Ｓｏｄｉｕｍ Ａｚｉｄｅ］で１回洗浄した後、検出試薬［ＳＡ－ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０ｎｇ／μＬ］を５０μＬ加え、室温で１０分間置いた後、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した。その後Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ加え、フローサイトメトリー（Ｌｕｍｉｎｅｘ社製、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｓｙｓｔｅｍ）でビオチン及び蛍光微小粒子の蛍光を測定し、２種類のメッセンジャーＲＮＡのシグナルを検出した（検出工程）。結果を図２５に示した。
（実施例５）培養細胞由来ＴｏｔａｌＲＮＡを用いたメッセンジャーＲＮＡの検出感度
　標的メッセンジャーＲＮＡであるＧＡＰＤＨを含む細胞由来のＴｏｔａｌＲＮＡ（細胞株ＣＣＲＦ－ＣＥＭ）を使用した。１０７細胞分より抽出したＴｏｔａｌＲＮＡを希釈し、それぞれの量が１０３、１０４、１０５、１０６細胞分となるように調整し実験に使用した。
　捕捉物質としてキャプチャープローブ（ＣＰ－Ｇ３Ｐ－２）が結合した球状ビーズ［蛍光微小粒子（Luminex bead、Luminex社製）］を用いた。
　ＣＰ－Ｇ３Ｐ－２の塩基配列
5'- TGGTGGTGCAGGAGGCATTGCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTCATACTTCTCATGGTTCAC -3'（配列番号２３）
　また、ＲＮＡの捕捉安定化のため以下の2種類のプローブを用いた。
　ＢＬ－１
5'- ACCCATGACGAACATGGGGGCATCAGCAGAGGGGGCAGAGATGATGACCCTTTTGGCTCC -3'（配列番号２４）
　ＢＬ－２
5'- TGAGTCCTTCCACGATACCAAAGTTGTCATGGATGACCTTGGCCAGGGGTGCTAAGCAGT -3'（配列番号２５）
　シグナル増幅用プローブとして、実施例１で使用した５’末端がビオチンで標識されている２種類の核酸プローブ（ＨＣＰ－１及びＨＣＰ－２）を用いた。
　ＴｏｔａｌＲＮＡを１０μＬに、第１ハイブリダイゼーション反応液［球状ビーズ（各１０００個）　０．１μＬ、５Ｍ　ＴＭＡＣ（ｔｅｔｒａ-ｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）７．５μＬ、１０ｘＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ［５００ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）, ４０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）, １％ ｓａｒｋｏｓｙｌ］２．５μＬ、Ｄ.Ｗ.　にて全量１５μＬとなるよう補正］を１５μＬ加え、計２５μＬとし、５５℃で４時間反応させた（捕捉工程）。
　前記捕捉工程後の反応液２５μＬに、ＰＡＬＳＡＲ反応液［５Ｍ　ＴＭＡＣ　７．５μＬ、１０ｘＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　２．５μＬ、２０ｐｍｏｌ／μＬ　ＨＣＰ－１　２．５μＬ、２０ｐｍｏｌ／μＬ　ＨＣＰ－２　１．７５μＬ、D.W.　１０．７５μＬ］を２５μＬ加え、計５０μＬとし、４４℃で６０分間反応させた（検出用複合体形成工程）。
　前記検出用複合体形成工程後の反応液をＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ［１ｘＰＢＳ ｗｉｔｈ ０．０２％ ｔｗｅｅｎ２０ ａｎｄ １．５ｐｐｍ ＰｒｏＣｌｉｎ ３００］で１回洗浄した後、検出試薬［ＳＡ－ＰＥ（Ｐｒｏｚｙｍｅ社製）５ｎｇ／μＬ］を５０μＬ加え、室温で１０分間置いた後、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した。その後Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ加え、フローサイトメトリー（Ｌｕｍｉｎｅｘ社製、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｓｙｓｔｅｍ）でビオチン及び蛍光微小粒子の蛍光を測定し、メッセンジャーＲＮＡのシグナルを検出した（検出工程）。結果を図２６に示した。
　実施例３及び４の結果に示される如く、本願発明はメッセンジャーＲＮＡを逆転写反応やＰＣＲを行うことなく、ＲＮＡをそのままの非標識の状態で検出することに成功した。また、用いるターゲット量に関わらず各細胞ごとに一定の比率で存在するハウスキーピング遺伝子を検出することができた。さらに、実施例５の結果に示される如く、１０３個の細胞からＧＡＰＤＨのメッセンジャーＲＮＡを直線性を持って高感度に検出できることが証明された。
　１０ａ：メッセンジャーＲＮＡ、１０ｂ：マイクロＲＮＡ、１２：ポリＡ付加されたマイクロＲＮＡ、１４：捕捉物質、１６：担体、１８ａ：第１のシグナル増幅用プローブ、１８ｂ：第２のシグナル増幅用プローブ、２０：標識物質、２２，５０，６８，９０：プローブポリマー、３０：検出用複合体、４０ａ：第１ダイマープローブ、４０ｂ、４０ｃ、４０ｄ：第２ダイマープローブ、４０ｅ：第３ダイマープローブ、４１ａ～４１ｈ、４１ｊ、４１ｋ：ダイマー形成用プローブ、６０ａ，６０ｂ：ダイマープローブ、６１ａ～６１ｄ：ダイマー形成用プローブ、６２ａ～６２ｄ：架橋プローブ、７０ａ，７０ｂ：ダイマープローブ、７１ａ～７１ｄ：ダイマー形成用プローブ、７２ａ～７２ｄ：架橋プローブ、８０：核酸プローブ、８０ａ，８０ｂ，８０ｃ：核酸領域。

Claims (9)

  1. 　（Ａ）ＲＮＡを、該ＲＮＡを捕捉するための捕捉物質により捕捉する捕捉工程と、
    　（Ｂ）前記捕捉されたＲＮＡ、第１のシグナル増幅用プローブ及び第２のシグナル増幅用プローブを反応させ、前記ＲＮＡと、前記捕捉物質と、前記第１のシグナル増幅用プローブ及び前記第２のシグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーと、を含む検出用複合体を形成する工程と、
    　（Ｃ）前記検出用複合体に結合した前記プローブポリマーを検出することにより、前記ＲＮＡを検出する工程と、
    を含む、標的ＲＮＡを検出する方法であって、
    　前記第１のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ、及びポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、
    　前記第２のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブであることを特徴とするＲＮＡの検出方法。
  2. 　前記第１のシグナル増幅用プローブのポリＴ配列の長さが１１～２６塩基であることを特徴とする請求項１記載のＲＮＡの検出方法。
  3. 　前記第１のシグナル増幅用プローブの前記核酸領域Ｘの長さが１１～２０塩基であり、前記核酸領域Ｙの長さが１１～２０塩基であり、前記核酸領域Ｚの長さが１１～２６塩基であることを特徴とする請求項１又は２記載のＲＮＡの検出方法。
  4. 　前記第１のシグナル増幅用プローブ及び／又は前記第２のシグナル増幅用プローブが標識物質で標識されてなることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項記載のＲＮＡの検出方法。
  5. 　前記捕捉物質が、前記ＲＮＡに相補的な塩基配列を含み、且つ担体に固定されているか又は担体に固定可能な部分が導入されていることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項記載のＲＮＡの検出方法。
  6. 　前記標的ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡであることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項記載のＲＮＡの検出方法。
  7. 　前記標的ＲＮＡがマイクロＲＮＡであり、（Ｄ）該マイクロＲＮＡの３’末端にポリＡを付加するポリＡ付加工程を含むことを特徴とする請求項１～５のいずれか１項記載のＲＮＡの検出方法。
  8. 　標的ＲＮＡを捕捉するための捕捉物質、第１のシグナル増幅用プローブ及び第２のシグナル増幅用プローブを含むＲＮＡの検出用キットであって、
    　前記第１のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ、及びポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、
    　前記第２のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブであることを特徴とするＲＮＡの検出用キット。
  9. 　第１のシグナル増幅用プローブ及び第２のシグナル増幅用プローブからなる一対のシグナル増幅用プローブであって、
    　前記第１のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ、及びポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、
    　前記第２のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブであり、
    　請求項１～７のいずれか１項記載の方法に用いられることを特徴とする一対のシグナル増幅用プローブ。
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