KR20210057074A - 올리고뉴클레오티드의 검출, 또는 정량 방법 - Google Patents

올리고뉴클레오티드의 검출, 또는 정량 방법 Download PDF

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아카네 오모리
고이치 시부사와
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세키스이 메디칼 가부시키가이샤
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Abstract

종래의 시그널 증폭법(펄서법) 측정법과 비교하여, 보다 특이성 및 정량성이 우수한 올리고뉴클레오티드의 검출 및 정량 방법을 제공한다. 본 발명은, 검출 대상인 표적 올리고뉴클레오티드를 상보적인 핵산 프로브(3'-표적 서열의 상보적 서열-5')와 하이브리다이즈시키거나, 혹은 검출 대상인 표적 올리고뉴클레오티드에 임의의 염기(폴리A 등)를 부가하고 이것과 상보적인 핵산 프로브(3'-표적 서열의 상보적 서열+임의의 염기의 상보 서열-5')와 하이브리다이즈시키고, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 사용해서 불완전한 하이브리다이제이션 생성물을 분해 및 제거하고, 잔존하는 완전한 하이브리다이제이션 생성물에 포함되는 핵산 프로브를 펄서법에 의해 측정함으로써, 상기의 과제를 해결했다.

Description

올리고뉴클레오티드의 검출, 또는 정량 방법
본 발명은, 고감도이고 또한 특이성 및 정량성이 우수한 올리고뉴클레오티드의 검출 또는 정량 방법에 관한 것이다.
핵산 의약은 서열 특이적인 유전자 침묵을 야기하는 점에서, 유전자 질환이나 난치성 질환을 비롯한, 지금까지 치료가 곤란했던 여러가지 질환에 대한 신규 치료약으로서 근년 큰 주목을 모으고 있다(비특허문헌 1, Ando 2012).
의약품 개발의 탐색 단계에 있어서의 약물 동태·약역학(PK/PD) 스크리닝 시험, 비임상 단계에 있어서의 안전성 시험, 약리 시험 및 약물 동태 시험, 임상 단계에 있어서, 약물이 투여된 동물 혹은 인간 생체 시료 중의 약물 농도가 측정된다. 또한, 신의약품으로서 승인을 받을 때, 후생 노동성령에서 정해진 가이드 라인에 따라, 생체 시료 중의 약물 농도에 관한 데이터를 취득하여 안전성 및 약물 동태에 관한 자료를 제출할 필요가 있다.
안도(Ando) 등은, 핵산 의약을 포지트론 방출 핵종으로 표지함으로써, 생체 내에서의 거동을 비침습적이고 또한 실시간으로 3차원 해석하는 것을 보고하고 있다(비특허문헌 1, Ando 2012). 또한, 힐리(Healey) 등은 스템-루프(stem-loop) RT-PCR법(비특허문헌 3, Chen 2005)을 사용하여, 0.01pg/㎕의 정량 하한을 달성한 것을 보고하고 있다(비특허문헌 2, Healey 2014).
그러나, 근년 인공 핵산 및 딜리버리 재료의 개발에 의해, 저용량으로의 치료가 가능해져 왔다. 그 결과, 생체 시료 중의 약물 농도가 이전보다 낮은 값이 되어, 이들 저농도의 약물을 검출하기 위해서 보다 고감도의 측정계가 필요해지게 되어 왔다. 또한, 후생 노동성령에서 정해진 가이드 라인에 따르기 위해서는, 측정계는 조작자에게 의존하지 않는 높은 정량성을 가질 필요가 있는 점에서, 반정량법인 PCR법에서의 측정으로는 부적합했다.
또한, 종래의 측정계는 핵산 의약에 사용되는 올리고뉴클레오티드가 대사되고, 5' 또는 3' 말단으로부터 분해된 경우, 측정 대상인 무손상 올리고뉴클레오티드와 구별할 수 없어 정확한 약물 농도를 측정할 수 없다는 문제가 있었다.
측정 대상인 무손상 올리고뉴클레오티드와 그의 대사물을 구별하고, 생물 활성을 갖는 핵산 의약을 특이적으로 측정하기 위해서, 유(Yu) 등은 하이브리다이제이션·라이게이션 ELISA법을 개발했다(비특허문헌 4, Yu 2002). 당해 방법에 있어서는, 측정 대상인 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열을 포함하는 「주형」 올리고뉴클레오티드와 「라이게이션·프로브」를 사용한다. 당해 「주형」 올리고뉴클레오티드는, 상기 상보적인 서열의 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 9mer의 추가 뉴클레오티드를 갖고, 3' 말단에 비오틴을 갖는다. 상기 「라이게이션·프로브」는, 당해 9mer의 추가 뉴클레오티드에 상보적인 서열을 갖는 9mer의 올리고뉴클레오티드이며, 5' 말단에 인산을 갖고, 3' 말단에 디곡시게닌을 갖는다. 따라서, 측정 대상인 올리고뉴클레오티드가 무손상인 경우에는, 주형 올리고뉴클레오티드 상에서, 무손상 올리고뉴클레오티드와 라이게이션·프로브가 간극없이 하이브리다이즈하게 된다. 이 하이브리다이제이션의 생성물을 리가아제로 처리함으로써, 무손상 올리고뉴클레오티드와 라이게이션·프로브가 연결된다. 반면에, 측정 대상인 올리고뉴클레오티드가 대사되어 3' 말단측의 뉴클레오티드가 결손되어 있는 경우에는, 이 연결은 일어나지 않는다. 상기한 라이게이션 생성물을 비오틴을 이용해서 고상에 결합하고, 미반응의 라이게이션·프로브를 세정해서 제거하고, 고정된 당해 라이게이션 생성물의 3' 말단의 디곡시게닌을 ELISA법에 의해 검출한다(비특허문헌 4, Yu 2002의 도 1 참조).
웨이(Wei) 등은, 하이브리다이제이션·라이게이션 ELISA법의 특이성을 향상시키기 위해서, 리가아제 처리 후에 S1 뉴클레아제 처리를 행하는 것을 개시하고 있다(비특허문헌 5, Wei 2006).
그러나, 하이브리다이제이션·라이게이션 ELISA법은 측정 대상인 올리고뉴클레오티드의 서열을 고려하여 최적의 라이게이션·프로브의 서열을 설계할 필요가 있으므로, 번잡하고 또한 멀티플렉스화에는 부적합했다.
의약품 개발에 있어서의 상기의 높은 요구를 만족하고, 또한 범용성이 높은 올리고뉴클레오티드의 검출 또는 정량 방법을 개발하기 위해서, 본 발명자들은 완전히 새로운 발상에 의해, 고감도이면서 또한 특이성 및 정량성이 우수한 올리고뉴클레오티드의 검출 또는 정량 방법을 개발하여, 본 발명을 완성했다.
국제공개 WO2013/172305호 팸플릿
Ando H, Yonenaga N, Asai T, Hatanaka K, Koide H, Tsuzuku T, Harada N, Tsukada H, Oku N. [In vivo imaging of liposomal small interfering RNA(siRNA) trafficking by positron emission tomography]. Yakugaku Zasshi. 2012;132(12):1373-81. Review. Healey GD, Lockridge JA, Zinnen S, Hopkin JM, Richards I, Walker W. Development of pre-clinical models for evaluating the therapeutic potential of candidate siRNA targeting STAT6. PLoS One. 2014 Feb 27;9(2):e90338. Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT, Barbisin M, Xu NL, Mahuvakar VR, Andersen MR, Lao KQ, Livak KJ, Guegler KJ. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2005 Nov 27;33(20):e179. Yu RZ, Baker B, Chappell A, Geary RS, Cheung E, Levin AA. Development of an ultrasensitive noncompetitive hybridization-ligation enzyme-linked i㎜unosorbent assay for the determination of phosphorothioate oligodeoxynucleotide in plasma. Anal Biochem. 2002 May 1;304(1):19-25. Wei X, Dai G, Marcucci G, Liu Z, Hoyt D, Blum W, Chan KK. A specific picomolar hybridization-based ELISA assay for the determination of phosphorothioate oligonucleotides in plasma and cellular matrices. Pharm Res. 2006 Jun;23(6):1251-64.
본 발명자는 종래의 시그널 증폭법(펄서법 등)에서는, 측정 대상이 되는 표적 올리고뉴클레오티드의 서열의 일부가 결실된 올리고뉴클레오티드, 특히 5'측 또는 3'측이 결실된 올리고뉴클레오티드(대사산물 등)와 무손상 표적 올리고뉴클레오티드(미변화체)의 구별이 되지 않고, 대사산물과 미변화체의 양쪽을 측정해버린다고 하는 문제점을 찾았다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 종래의 측정법과 비교하여, 보다 고감도이면서 또한 특이성 및 정량성이 우수한 올리고뉴클레오티드의 측정법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기한 미변화체와 대사산물의 구별을 하고, 미변화체만을 검출 가능한 특이성 및 정량성이 우수한 올리고뉴클레오티드의 측정법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 측정 대상인 표적 올리고뉴클레오티드를 상보적인 핵산 프로브(3'-표적 서열의 상보적 서열-5')와 하이브리다이즈시키거나, 혹은 측정 대상인 표적 올리고뉴클레오티드에 폴리A 등의 임의의 염기(제1 폴리뉴클레오티드)를 부가하고 이것과 상보적인 핵산 프로브(3'-표적 올리고뉴클레오티드의 상보적 서열+제1 폴리뉴클레오티드의 상보적 서열-5')와 하이브리다이즈시키고, S1 뉴클레아제 등의 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 사용해서 불완전한 하이브리다이제이션 생성물을 분해 및 제거하고, 잔존하는 완전한 하이브리다이제이션 생성물에 포함되는 핵산 프로브를 측정함으로써, 상기의 과제를 해결했다.
즉, 5'측 또는 3'측이 결실된 표적 올리고뉴클레오티드의 대사물이나 표적 올리고뉴클레오티드의 변이체는 핵산 프로브와 불완전한 하이브리다이제이션 생성물을 형성하기 때문에, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제에 의해 분해된다. 단일 가닥 뉴클레아제에 의한 분해 산물은 제거하는 쪽이 바람직하고, 예를 들어 핵산 프로브의 3' 말단을 고상에 고정해서 세정함으로써 제거할 수 있다. 잔존하는 완전한 하이브리다이제이션 생성물에 포함되는 핵산 프로브는 WO2013/172305의 기술을 개량한 본 명세서에 개시하는 방법(소위 펄서법)을 사용하여, 핵산 프로브, 또는 핵산 프로브의 부가 염기의 부분을 검출함으로써 측정 대상인 표적 올리고뉴클레오티드를 정량할 수 있다.
혹은 잔존하는 완전한 하이브리다이제이션 생성물에 포함되는 핵산 프로브는, 핵산 프로브의 5' 말단에 부가한 표지 물질 등의 화학적 부분을 검출함으로써 측정 대상인 표적 올리고뉴클레오티드를 정량할 수 있다.
또한, 핵산 프로브의 5' 말단에 부가한 표지 물질 등의 화학적 부분을 검출하기 위해서는, 유 등 및 웨이 등과 마찬가지로, 당업자에게 주지된 ELISA법을 사용할 수 있다.
이와 같이 해서 회수된 잔존하는 완전한 하이브리다이제이션 생성물에 포함되는 핵산 프로브는, 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드의 양에 대응한다. 따라서, 본 발명자들은, 시료 중의 특정한 서열을 갖는 표적 올리고뉴클레오티드의 양에 대응한 핵산 프로브를 회수하는 방법도 제공한다.
이상으로부터, 본 발명은 이하의 구성을 갖는다.
<1>
이하의 공정을 포함하는, 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법:
(i) 상기 시료에, 상기 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브를 접촉시키는 공정,
여기서, 상기 포착 프로브는
(A) 핵산 프로브와,
(B) 상기 핵산 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 고상 또는 어댑터 혹은 링커
를 포함하고,
상기 핵산 프로브는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 또는 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함한다
(ii) 상기 포착 프로브와의 접촉 공정을 행한 상기 시료에, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 접촉시키는 공정,
(iii) 상기 단일 가닥 특이적 뉴클레아제와의 접촉 공정을 행한 후, 상기 시료 중의 상기 포착 프로브를 단일 가닥으로 하는 공정,
(iv) 상기 포착 프로브를 단일 가닥으로 하는 공정을 행한 상기 시료에, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브를 접촉시켜서, 상기 포착 프로브와, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드가 자기 응집해서 이루어지는 상기 올리고뉴클레오티드 폴리머의 복합체를 형성시키는 공정,
(v) 상기 복합체를 검출하는 공정.
<2>
제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브 중 적어도 한쪽의 올리고뉴클레오티드가, 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 또는 부분 서열을 포함하는, <1>에 기재된 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
<3>
상기 (iv)의 복합체 형성 공정이,
표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 또는 부분 서열, 그리고 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드 중 적어도 한쪽의 전체 서열 또는 부분 서열에 대하여 상보적인 서열의 양쪽을 포함하는 어시스트 프로브와 접촉시키는 공정을 포함하는, <1>에 기재된 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
<4>
이하의 공정을 포함하는, 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법:
(i) 상기 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 공정,
(ii) 표적 올리고뉴클레오티드에, 상기 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브를 접촉시키는 공정,
여기서, 상기 포착 프로브는
(A) 핵산 프로브와,
(B) 상기 핵산 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 고상 또는 어댑터 혹은 링커를 포함하고,
상기 핵산 프로브는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함한다
(iii) 상기 제1 폴리뉴클레오티드의 부가 및 상기 포착 프로브와의 접촉 공정을 행한 상기 시료에, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 접촉시키는 공정,
(iv) 상기 단일 가닥 특이적 뉴클레아제와의 접촉 공정을 행한 후, 상기 시료 중의 상기 포착 프로브를 단일 가닥으로 하는 공정,
(v) 상기 포착 프로브를 단일 가닥으로 하는 공정을 행한 상기 시료에, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브를 접촉시켜서, 상기 포착 프로브와, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드가 자기 응집해서 이루어지는 올리고뉴클레오티드 폴리머의 복합체를 형성하는 공정,
(vi) 상기 복합체를 검출하는 공정.
<5>
(i) 상기 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 공정이, 포착 프로브와의 접촉 공정을 행하기 전의 상기 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 공정인, <4>에 기재된 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
<6>
(i) 상기 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 공정이,
포착 프로브와의 접촉 공정을 행한 후의 상기 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 공정인, <4>에 기재된 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
<7>
제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브 중 적어도 한쪽의 올리고뉴클레오티드가, 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열을 포함하는, <4> 내지 <7> 중 어느 것에 기재된 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
<8>
상기 (v)의 복합체 형성 공정이 어시스트 프로브를 접촉시키는 공정을 포함하고,
상기 어시스트 프로브가, 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열, 그리고 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드 중 한쪽의 전체 서열 또는 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함하는, <4> 내지 <7> 중 어느 것에 기재된 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
<9>
상기 제1 폴리뉴클레오티드가, 폴리A 서열, 폴리T 서열, 폴리U 서열, 폴리(T/U) 서열, 폴리G 서열, 또는 폴리C 서열인 <4> 내지 <8> 중 어느 것에 기재된 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
<10>
상기 제1 폴리뉴클레오티드가 폴리A 서열인 <9>에 기재된 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
<11>
제1 올리고뉴클레오티드가, 5' 말단측으로부터 순서대로 적어도 핵산 영역 X, 핵산 영역 Y 및 핵산 영역 Z를 포함하는 올리고뉴클레오티드이며, 제2 올리고뉴클레오티드가, 5' 말단측으로부터 순서대로 적어도 상기 핵산 영역 X에 상보적인 핵산 영역 X', 상기 핵산 영역 Y에 상보적인 핵산 영역 Y' 및 상기 핵산 영역 Z에 상보적인 핵산 영역 Z'를 포함하는 올리고뉴클레오티드인 <1> 내지 <10> 중 어느 것에 기재된 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
<12>
상기 핵산 영역 Z가 폴리A 서열을 포함하고, 또한 상기 핵산 영역 Z'가 폴리T 서열을 포함하는, <11>에 기재된 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
<13>
상기 단일 가닥 특이적 뉴클레아제가 엔도뉴클레아제인, <1> 내지 <12> 중 어느 것에 기재된 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
<14>
이하를 포함하는, 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 키트.
(1) 단일 가닥 특이적 뉴클레아제
(2) 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브
(3) 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브
<15>
추가로, 표적 올리고뉴클레오티드에 부가하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는, <14>에 기재된 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 키트.
<16>
추가로, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드로서의 폴리A를 부가하는 폴리아데닐화 효소를 포함하는, <14>에 기재된 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 키트.
<17>
상기 (2)의 포착 프로브는
(A) 핵산 프로브와,
(B) 상기 핵산 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 고상 또는 어댑터 혹은 링커를 포함하고,
상기 핵산 프로브는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함하고,
(3)의 상기 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브는, 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드의 적어도 한쪽이 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 또는 부분 서열을 포함하는,
<15> 또는 <16>에 기재된 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 키트.
<18>
상기 (2)의 포착 프로브는
(A) 핵산 프로브와,
(B) 상기 핵산 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 고상 또는 어댑터 혹은 링커를 포함하고,
상기 핵산 프로브는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 서열을 포함하고,
(3)의 상기 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브는, 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드의 적어도 한쪽이 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 또는 부분 서열을 포함하는, <14>에 기재된 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 키트.
<19>
(1) 단일 가닥 특이적 뉴클레아제가 엔도뉴클레아제인 <14> 내지 <18> 중 어느 것에 기재된 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 키트.
<20>
추가로 어시스트 프로브를 포함하고, 상기 어시스트 프로브가, 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열, 그리고 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드 중 한쪽의 전체 서열 또는 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함하는, <14> 내지 <16> 중 어느 것에 기재된 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 키트.
<21>
이하의 공정을 포함하는, 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드의 양에 대응한 포착 프로브를 회수하는 방법:
(i) 상기 시료에, 상기 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브를 접촉시키는 공정,
여기서, 상기 포착 프로브는
(A) 핵산 프로브와,
(B) 상기 핵산 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 고상 또는 어댑터 혹은 링커를 포함하고,
상기 핵산 프로브는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 또는 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함한다
(ii) 상기 포착 프로브와의 접촉 공정을 행한 상기 시료에, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 접촉시키는 공정,
(iii) 상기 단일 가닥 특이적 뉴클레아제와의 접촉 공정을 행한 후, 상기 시료에 포함되는, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제로 절단되어 있지 않은 포착 프로브를 회수하는 공정.
<22>
시료에, 상기 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 접촉시키는 상기 (ii)의 공정 전에, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 공정을 포함하고,
상기 핵산 프로브가, 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함하는 <21>에 기재된 포착 프로브를 회수하는 방법.
<23>
시료에, 상기 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브를 접촉시키는 상기 (i)의 공정 전에, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 공정을 포함하고,
상기 핵산 프로브가, 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함하는 <21>에 기재된 포착 프로브를 회수하는 방법.
<24>
이하의 공정을 포함하는, 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드를 정량하는 방법:
(i) 상기 시료에, 상기 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브를 접촉시키는 공정,
여기서, 상기 포착 프로브는
(A) 핵산 프로브와,
(B) 상기 핵산 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 고상 또는 어댑터 혹은 링커를 포함하고,
상기 핵산 프로브는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 서열을 포함하고,
(ii) 상기 포착 프로브와의 접촉 공정을 행한 상기 시료에, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 접촉시키는 공정,
(iii) 상기 단일 가닥 특이적 뉴클레아제와의 접촉 공정을 행한 후, 상기 시료에 포함되는, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제로 절단되어 있지 않은 포착 프로브를 회수하는 공정,
(iv) 회수된 포착 프로브를 검출하고, 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드를 정량하는 공정.
<25>
시료에, 상기 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 접촉시키는 상기 (ii)의 공정 전에, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 공정을 포함하고, 상기 핵산 프로브가, 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함하는 <24>에 기재된 표적 올리고뉴클레오티드를 정량하는 방법.
<26>
시료에, 상기 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브를 접촉시키는 상기 (i)의 공정 전에, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 공정을 포함하고, 상기 핵산 프로브가, 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함하는 <24>에 기재된 표적 올리고뉴클레오티드를 정량하는 방법.
또한, 본 발명은 상기 구성 중, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 시료와 접촉시키기 전에, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드로서 폴리A를 부가하는 공정을 갖는 실시 양태에 대해서, 보다 구체적으로 이하에 나타낸다(실시 양태 1 내지 실시 양태 15).
[실시 양태 1]
이하의 공정을 이하에 기재한 순서로 포함하는, 시료 중의 특정한 서열을 갖는 표적 올리고뉴클레오티드의 양에 비례한 핵산 프로브를 회수하는 방법:
(i) 당해 표적 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 또는 포함하는 것이 의심되는 시료에 폴리A 폴리메라아제(폴리뉴클레오티드아데닐릴 트랜스페라아제) 및 아데노신삼인산(ATP)을 폴리A 폴리메라아제의 활성 조건 하에서 접촉시킴으로써, 상기 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드를 폴리아데닐화하는 공정;
(ii) 임의에 따라, 상기 시료를 열처리함으로써 폴리A 폴리메라아제를 열 실활시키는 공정;
(iii) 상기 시료에, 당해 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브를 접촉시키는 공정, 여기서 당해 포착 프로브는, 당해 표적 올리고뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 핵산 프로브와, 당해 핵산 프로브의 3' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 고상 또는 고상에 고정 가능한 어댑터 혹은 링커를 포함하고, 당해 핵산 프로브는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 길이에 대하여 또는 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 3' 말단을 포함하는 연속하는 적어도 15mer의 부분에 대하여 완전히 상보적인 서열과, 당해 상보적인 서열의 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 연속하는 적어도 15mer의 폴리(T/U) 서열과, 임의에 따라 당해 폴리(T/U) 서열의 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 화학적 부분을 포함하고, 당해 접촉은, 폴리아데닐화된 당해 표적 올리고뉴클레오티드와 당해 핵산 프로브의 완전히 상보적인 서열의 대응하는 염기 모두가 왓슨·크릭 염기쌍을 형성할 수 있는 조건 하에서 행해진다;
(iv) 상기 포착 프로브와의 접촉 공정을 행한 상기 시료에, 단일 가닥 특이적 엔도뉴클레아제를 접촉시키는 공정;
(v) 상기 단일 가닥 특이적 엔도뉴클레아제와의 접촉 공정을 행한 상기 시료에 포함되는 상기 고상을 세정하는 공정, 여기서 상기 어댑터 혹은 링커는 당해 세정 공정 전에 고상에 고정되어 있다;
(vi) 상기 세정 후의 고상에 결합한 핵산 프로브를, 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드의 양에 비례한 핵산 프로브로서 회수하는 공정.
[실시 양태 2]
이하의 공정을 이하에 기재한 순서로 포함하는, 핵산 프로브에 포함되는 화학적 부분을 검출함으로써, 시료 중의 특정한 서열을 갖는 표적 올리고뉴클레오티드를 정량하는 방법:
(vii) 당해 표적 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 또는 포함하는 것이 의심되는 시료에 폴리A 폴리메라아제(폴리뉴클레오티드아데닐릴 트랜스페라아제) 및 아데노신삼인산(ATP)을 폴리A 폴리메라아제의 활성 조건 하에서 접촉시킴으로써, 상기 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드를 폴리아데닐화하는 공정;
(viii) 임의에 따라, 상기 시료를 열처리함으로써 폴리A 폴리메라아제를 열 실활시키는 공정;
(ix) 상기 시료에, 당해 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브를 접촉시키는 공정, 여기서 당해 포착 프로브는, 당해 표적 올리고뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 핵산 프로브와, 당해 핵산 프로브의 3' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 고상 또는 고상에 고정 가능한 어댑터 혹은 링커를 포함하고, 당해 핵산 프로브는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 길이에 대하여 또는 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 3' 말단을 포함하는 연속하는 적어도 15mer의 부분에 대하여 완전히 상보적인 서열과, 당해 상보적인 서열의 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 연속하는 적어도 15mer의 폴리(T/U) 서열과, 당해 폴리(T/U) 서열의 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 화학적 부분(표지 물질)을 포함하고, 당해 접촉은, 폴리아데닐화된 당해 표적 올리고뉴클레오티드와 당해 핵산 프로브의 완전히 상보적인 서열의 대응하는 염기 모두가 왓슨·크릭 염기쌍을 형성할 수 있는 조건 하에서 행해진다;
(x) 상기 포착 프로브와의 접촉 공정을 행한 상기 시료에, 단일 가닥 특이적 엔도뉴클레아제를 접촉시키는 공정;
(xi) 상기 단일 가닥 특이적 엔도뉴클레아제와의 접촉 공정을 행한 상기 시료에 포함되는 상기 고상을 세정하는 공정, 여기서 상기 어댑터 혹은 링커는 당해 세정 공정 전에 고상에 고정되어 있다;
(xii) 상기 핵산 프로브를 개재해서 상기 고상에 연결되어 있는 상기 화학적 부분을, 당해 화학적 부분이 발하는 광을 검출함으로써, 또는 당해 화학적 부분에 대하여 특이적으로 결합하는 표지 항체를 사용해서 검출함으로써, 상기 단일 가닥 특이적 엔도뉴클레아제로 절단되어 있지 않은 포착 프로브를 정량하는 공정;
(xiii) 상기 정량된 포착 프로브의 양을, 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드의 양과 상관시키는 공정.
[실시 양태 3]
이하의 공정을 이하에 기재한 순서로 포함하는, 핵산 프로브에 포함되는 폴리(T/U) 서열을 검출함으로써, 시료 중의 특정한 서열을 갖는 표적 올리고뉴클레오티드를 정량하는 방법:
(xiv) 당해 표적 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 또는 포함하는 것이 의심되는 시료에 폴리A 폴리메라아제(폴리뉴클레오티드아데닐릴 트랜스페라아제) 및 아데노신삼인산(ATP)을 폴리A 폴리메라아제의 활성 조건 하에서 접촉시킴으로써, 상기 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드를 폴리아데닐화하는 공정;
(xv) 임의에 따라, 상기 시료를 열처리함으로써 폴리A 폴리메라아제를 열 실활시키는 공정;
(xvi) 상기 시료에, 당해 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브를 접촉시키는 공정, 여기서 당해 포착 프로브는, 당해 표적 올리고뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 핵산 프로브와, 당해 핵산 프로브의 3' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 표면에 제1 형광 물질을 갖는 미립자를 포함하고, 당해 핵산 프로브는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 길이에 대하여 또는 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 3' 말단을 포함하는 연속하는 적어도 15mer의 부분에 대하여 완전히 상보적인 서열과, 당해 상보적인 서열의 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 연속하는 적어도 15mer의 폴리(T/U) 서열과, 임의에 따라 당해 폴리(T/U) 서열의 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 화학적 부분을 포함하고, 당해 접촉은, 폴리아데닐화된 당해 표적 올리고뉴클레오티드와 당해 핵산 프로브의 완전히 상보적인 서열의 대응하는 염기 모두가 왓슨·크릭 염기쌍을 형성할 수 있는 조건 하에서 행해진다;
(xvii) 상기 포착 프로브와의 접촉 공정을 행한 상기 시료에, 단일 가닥 특이적 엔도뉴클레아제를 접촉시키는 공정;
(xviii) 상기 단일 가닥 특이적 엔도뉴클레아제와의 접촉 공정을 행한 상기 시료를, 상기 핵산 프로브가 열변성하는 온도에서 열처리하는 공정;
(xix) 상기 열변성 공정을 행한 상기 시료에, 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브를 접촉시키는 공정, 여기서 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드의 적어도 한쪽은 표지 물질에 의해 표지되어 있다;
(xx) 상기 포착 프로브 및 자기 응집한 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드의 3 성분 복합체를 원심 분리법에 의해 침전시키거나 또는 흡인 여과법에 의해 분리하는 공정;
(xxi) 임의에 따라, 상기 침전을 세정 완충액에 재현탁하고, 다시 원심 분리법에 의해 침전시키거나 또는 흡인 여과법에 의해 분리하는 공정;
(xxii) 상기 (xx) 또는 (xxi) 공정의 침전에 제2 형광 물질과 상기 표지 물질에 특이적으로 결합하는 물질의 포합체를 완충액 중에서 접촉시켜서, 형광 물질 반응액을 얻는 공정;
(xxiii) 상기 포착 프로브 및 자기 응집한 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 및 상기 포합체의 4 성분 복합체를 원심 분리법에 의해 침전시키거나 또는 흡인 여과법에 의해 분리하는 공정;
(xxiv) 임의에 따라, 상기 침전을 세정 완충액에 재현탁하고, 다시 원심 분리법에 의해 침전시키거나 또는 흡인 여과법에 의해 분리하는 공정;
(xxv) 상기 (xxiii) 또는 (xxiv) 공정의 침전을 세정 완충액에 재현탁하고, 플로 사이토메트리법을 사용하여, 제1 형광 물질이 발하는 제1 형광과 제2 형광 물질이 발하는 제2 형광을 검출하는 공정.
[실시 양태 4]
실시 양태 3에 기재된 공정 (xxv) 후에,
(xxvi) 제1 형광과 제2 형광이 동시에 검출되는 경우에 있어서의 제2 형광의 강도를, 당해 올리고뉴클레오티드를 기지의 농도로 포함하는 대조 시료에 있어서 제1 형광과 제2 형광이 동시에 검출되는 경우에 있어서의 제2 형광의 강도와 비교함으로써, 상기 시료 중의 당해 올리고뉴클레오티드의 농도를 결정하는 공정을 포함하는, 실시 양태 3에 기재된 방법.
[실시 양태 5]
제1 올리고뉴클레오티드가, 5' 말단측으로부터 순서대로 적어도 핵산 영역 X, 핵산 영역 Y 및 핵산 영역 Z를 포함하는 올리고뉴클레오티드이며, 제2 올리고뉴클레오티드가, 5' 말단측으로부터 순서대로 적어도 상기 핵산 영역 X에 상보적인 핵산 영역 X', 상기 핵산 영역 Y에 상보적인 핵산 영역 Y' 및 상기 핵산 영역 Z에 상보적인 핵산 영역 Z'를 포함하는 올리고뉴클레오티드인 실시 양태 3 또는 4에 기재된 방법.
[실시 양태 6]
상기 핵산 영역 Z가 폴리T 서열을 포함하고, 또한 상기 핵산 영역 Z'가 폴리A 서열을 포함하는, 실시 양태 5에 기재된 방법.
[실시 양태 7]
제1 올리고뉴클레오티드가 서열번호 9로 표현되는 올리고뉴클레오티드인 실시 양태 3 내지 6 중 어느 것에 기재된 방법.
[실시 양태 8]
제2 올리고뉴클레오티드가 서열번호 10으로 표현되는 올리고뉴클레오티드인 실시 양태 3 내지 7 중 어느 것에 기재된 방법.
[실시 양태 9]
상기 고상이 미립자인, 실시 양태 1 또는 2에 기재된 방법.
[실시 양태 10]
상기 미립자는, 직경이 1 내지 10㎛인 자성 또는 비자성 폴리스티렌제 비즈인, 실시 양태 3 내지 9 중 어느 것에 기재된 방법.
[실시 양태 11]
상기 핵산 프로브가, 상기 폴리아데닐화된 당해 표적 올리고뉴클레오티드와 특이적으로 결합한 경우에, 완전히 적합한 이중 가닥 핵산의 구조, 또는 완전히 적합한 이중 가닥 핵산의 부분과 한쪽 또는 양쪽의 가닥에 있어서의 5' 돌출 말단의 부분을 포함하는 구조, 또는 완전히 적합한 이중 가닥 핵산의 부분과 상기 폴리아데닐화된 당해 표적 올리고뉴클레오티드의 가닥에 있어서의 3' 돌출 말단의 부분을 포함하는 구조, 또는 완전히 적합한 이중 가닥 핵산의 부분과 상기 폴리아데닐화된 당해 표적 올리고뉴클레오티드의 가닥에 있어서의 5' 돌출 말단 및 3' 돌출 말단의 부분을 포함하는 구조를 형성하는 서열을 갖는, 실시 양태 1 내지 10 중 어느 것에 기재된 방법.
[실시 양태 12]
시료는 인간, 설치류 동물(래트, 마우스, 모르모트) 또는 비설치류 동물(원숭이, 개, 돼지)의 체액(전혈, 혈청, 혈장, 림프액, 소변, 타액, 누액, 땀, 위액, 췌액, 담즙, 흉수, 관절강액, 뇌척수액, 수액, 골수액) 또는 조직(간장, 신장, 폐, 심장)인, 실시 양태 1 내지 11 중 어느 것에 기재된 방법.
[실시 양태 13]
상기 고상에 고정 가능한 어댑터 또는 링커가 비오틴인, 실시 양태 1 또는 2에 기재된 방법.
[실시 양태 14]
상기 화학적 부분이 디곡시게닌인, 실시 양태 1 내지 13 중 어느 것에 기재된 방법.
[실시 양태 15]
상기 단일 가닥 특이적 엔도뉴클레아제가 S1 뉴클레아제인, 실시 양태 1 내지 14 중 어느 것에 기재된 방법.
본 발명에 의해, 고감도이면서 또한 특이성 및 정량성이 우수한 올리고뉴클레오티드의 검출 또는 정량을 행할 수 있다.
또한, 시그널 증폭법(펄서법 등)에 의해 측정 대상인 표적 올리고뉴클레오티드의 5'측 또는 3'측이 결실된 올리고뉴클레오티드 대사산물과 미변화체의 구별을 하고, 미변화체만을 검출 가능한 특이성 및 정량성이 우수한 올리고뉴클레오티드의 검출 방법 또는 정량 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 방법에 의한 표적 올리고뉴클레오티드의 정량 결과를 나타낸다(실시예 1).
도 2는 본 발명의 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법에 있어서의 각 공정을 나타내는 개략 설명도이다(실시예 1, 폴리A의 부가 있음)((A)는 표적 올리고뉴클레오티드인 경우, (B)는 5' 말단이 결실된 표적 올리고뉴클레오티드인 경우).
도 3은 본 발명의 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법에 있어서의 각 공정을 나타내는 개략 설명도이다(실시예 2, 폴리뉴클레오티드의 부가 없음, 어시스트 프로브 사용).
도 4는 본 발명의 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법에 있어서의 각 공정을 나타내는 개략 설명도이다(폴리뉴클레오티드의 부가 없음).
(표적 올리고뉴클레오티드)
본 명세서에 있어서, 「표적 올리고뉴클레오티드」라고 하는 용어는 핵산 프로브와 특이적인 하이브리드를 형성할 수 있는 것이면, DNA 또는 RNA 중 어느 것이어도 되고, 단일 가닥 또는 이중 가닥 중 어느 것이어도 되고, 화학 수식되어 있어도 된다. 화학 수식으로서는, 포스포로티오에이트 수식(S화), 2'-F 수식, 2'-O-메틸(2'-OMe) 수식, 2'-O-메톡시에틸(2'-MOE) 수식, 모르폴리노 수식, LNA 수식, BNACOC 수식, BNANC 수식, ENA 수식, cEt BNA 수식 등을 들 수 있다.
상기 표적 올리고뉴클레오티드가 이중 가닥인 경우에는, 단일 가닥으로 해서 본 발명에 사용된다.
(포착 프로브)
본 발명에 있어서 「포착 프로브」란, 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 프로브이며, (A) 핵산 프로브와, (B) 상기 핵산 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 고상 또는 어댑터 혹은 링커를 포함한다.
(핵산 프로브)
본 발명에 사용하는 「핵산 프로브」의 제1 양태는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 또는 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함한다. 구체적으로는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 길이에 대하여 또는 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단을 포함하는 부분에 대하여 상보적인 서열을 포함하고, 이하의 (a-1)과 (a-2)의 경우를 들 수 있다.
(a-1) 고상 또는 어댑터 혹은 링커가 3' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 경우에는, 핵산 프로브는, 당해 3' 말단의 뉴클레오티드를 포함하는 부분에 있어서, 상기 표적 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 서열을 포함한다.
(a-2) 상기 고상 또는 어댑터 혹은 링커가 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 경우에는, 핵산 프로브는, 당해 5' 말단의 뉴클레오티드를 포함하는 부분에 있어서, 상기 표적 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 서열을 포함한다.
상기 핵산 프로브에 있어서, 표적 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단을 포함하는 부분에 대하여 상보적인 서열은, 표적 올리고뉴클레오티드의 적어도 4mer의 부분에 대하여 상보적인 서열을 포함하는 것이 바람직하고, 적어도 10mer의 부분에 대하여 상보적인 서열을 포함하는 것이 더욱 바람직하고, 적어도 15mer의 부분에 대하여 상보적인 서열을 포함하는 것이 가장 바람직하다.
또한, 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 길이에 대하여 상보적인 서열은, 전체 길이에 대하여 하이브리다이즈할 수 있는 정도의 동일성이 있으면 되고, 동 전체 길이에 대하여 완전히 상보적인 서열인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 핵산 프로브의 다른 양태에 대해서 설명한다.
표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드가 부가되는 경우에는, 상기 핵산 프로브는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함한다.
구체적으로는, 이하의 (b-1) 또는 (b-2)의 경우를 들 수 있다.
(b-1) 상기 고상 또는 어댑터 혹은 링커가 3' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 경우에는, 당해 3' 말단의 뉴클레오티드를 포함하는 부분에 있어서, 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함한다.
(b-2) 상기 고상 또는 어댑터 혹은 링커가 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 경우에는, 당해 5' 말단의 뉴클레오티드를 포함하는 부분에 있어서, 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함한다.
상기 표적 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 부가되어 있는 제1 폴리뉴클레오티드의 염기는, 비특이적 반응을 억제하기 위해서 측정 대상인 시료에 포함되지 않는 염기 서열인 것이 바람직하다.
표적 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 제1 폴리뉴클레오티드로서 폴리염기(A, T/U, G, 또는 C)가 부가되어 있는 경우, 핵산 프로브는, 표적 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열의 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 폴리염기(T/U, A, C, 또는 G)를 포함한다.
표적 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 폴리A가 부가되어 있는 경우에는, 핵산 프로브는, 표적 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열의 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 폴리T/U를 포함한다.
상기 핵산 프로브는, 상기 폴리아데닐화된(폴리A가 부가된 것과 동일한 의미이다) 당해 표적 올리고뉴클레오티드와 특이적으로 결합한 경우에는, 완전히 적합한 이중 가닥 핵산의 구조, 또는 완전히 적합한 이중 가닥 핵산의 부분과 한쪽 또는 양쪽의 가닥에 있어서의 5' 돌출 말단의 부분을 포함하는 구조, 또는 완전히 적합한 이중 가닥 핵산의 부분과 상기 폴리아데닐화된 당해 표적 올리고뉴클레오티드의 가닥에 있어서의 3' 돌출 말단의 부분을 포함하는 구조, 또는 완전히 적합한 이중 가닥 핵산의 부분과 상기 폴리아데닐화된 당해 표적 올리고뉴클레오티드의 가닥에 있어서의 5' 돌출 말단 및 3' 돌출 말단의 부분을 포함하는 구조를 형성하는 서열을 갖는 것이 바람직하다.
상기 상보적인 서열의 길이(염기수)는 적어도 4mer의 염기가 바람직하고, 적어도 10mer의 염기가 더욱 바람직하고, 적어도 15mer의 염기가 더욱 보다 바람직하다. 적어도 4mer란, 4mer 이상, 10mer 이상, 15mer 이상, 20mer 이상, 25mer 이상, 30mer 이상, 35mer 이상, 40mer 이상, 45mer 이상, 또는 50mer 이상, 바람직하게는 15mer, 16mer, 17mer, 18mer, 19mer, 20mer, 21mer, 22mer, 23mer, 24mer, 25mer, 26mer, 27mer, 28mer, 29mer, 또는 30mer를 의미한다. 또한, 상보적인 서열의 길이의 상한은 100mer 이하가 바람직하다.
본 발명에 사용하는 「핵산 프로브」는 바람직하게는 적어도 연속하는 4mer의 부분, 적어도 연속하는 10mer의 부분, 적어도 연속하는 15mer의 부분, 적어도 연속하는 16mer의 부분, 적어도 연속하는 17mer의 부분, 적어도 연속하는 18mer의 부분, 적어도 연속하는 19mer의 부분, 적어도 연속하는 20mer의 부분, 적어도 연속하는 21mer의 부분, 적어도 연속하는 22mer의 부분, 적어도 연속하는 23mer의 부분, 적어도 연속하는 24mer의 부분, 적어도 연속하는 25mer의 부분, 적어도 연속하는 26mer의 부분, 적어도 연속하는 27mer의 부분, 적어도 연속하는 28mer의 부분, 적어도 연속하는 29mer의 부분, 적어도 연속하는 30mer의 부분, 적어도 연속하는 31mer의 부분, 적어도 연속하는 32mer의 부분, 적어도 연속하는 33mer의 부분, 적어도 연속하는 34mer의 부분, 적어도 연속하는 35mer의 부분, 적어도 연속하는 36mer의 부분, 적어도 연속하는 37mer의 부분, 적어도 연속하는 38mer의 부분, 적어도 연속하는 39mer의 부분, 적어도 연속하는 40mer의 부분, 적어도 연속하는 41mer의 부분, 적어도 연속하는 42mer의 부분, 적어도 연속하는 43mer의 부분, 적어도 연속하는 44mer의 부분, 적어도 연속하는 45mer의 부분, 적어도 연속하는 46mer의 부분, 적어도 연속하는 47mer의 부분, 적어도 연속하는 48mer의 부분, 적어도 연속하는 49mer의 부분, 혹은 적어도 연속하는 50mer의 부분이 표적 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 서열을 포함하고, 바람직하게는 적어도 연속하는 15mer의 부분, 적어도 연속하는 16mer의 부분, 적어도 연속하는 17mer의 부분, 적어도 연속하는 18mer의 부분, 적어도 연속하는 19mer의 부분, 적어도 연속하는 20mer의 부분, 적어도 연속하는 21mer의 부분, 적어도 연속하는 22mer의 부분, 적어도 연속하는 23mer의 부분, 적어도 연속하는 24mer의 부분, 적어도 연속하는 25mer의 부분, 적어도 연속하는 26mer의 부분, 적어도 연속하는 27mer의 부분, 적어도 연속하는 28mer의 부분, 적어도 연속하는 29mer의 부분, 혹은 적어도 연속하는 30mer의 부분이 표적 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 서열을 포함하고, 보다 바람직하게는 적어도 연속하는 18mer의 부분, 적어도 연속하는 19mer의 부분, 적어도 연속하는 20mer의 부분, 적어도 연속하는 21mer의 부분, 혹은 적어도 연속하는 22mer의 부분이 표적 오리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 서열을 포함한다.
(고상)
본 명세서에 있어서 「고상」이라고 하는 용어는, 불용성의 미립자, 마이크로비즈, 형광 미립자, 자기 입자, 마이크로타이터 플레이트, 마이크로 어레이, 슬라이드 유리, 전기 전도성 기판 등의 기판 등을 들 수 있고, 바람직하게는 형광 미립자이며, 더욱 바람직하게는 형광 비즈이며, 특히 바람직하게는 표면에 형광 물질을 갖는 비즈이다. 본 발명에 사용하는 「표면에 형광 물질을 갖는 비즈」로서는, 형광 물질을 갖는 비즈이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 Luminex사의 MicroPlexTM Microspheres를 적합하게 사용할 수 있다. 1종류의 비즈를 사용하는 것도, 다종류의 비즈를 사용하는 것도 가능하다. 컬러 코드화된 복수 종류의 비즈를 사용하면, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 정량 방법도 용이하게 멀티플렉스화할 수 있다.
상기 고상과 상기 핵산 프로브는 직접 결합하고 있어도 되고, 어댑터 또는 링커를 개재해서 결합해도 되고, 바람직하게는 어댑터 또는 링커를 개재해서 결합하고 있는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 핵산 프로브는 표지 물질을 결합시켜도 된다.
본 발명에 있어서 「핵산 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 고상」의 「인접」이란, 상기 뉴클레오티드에 직접 결합하고 있거나, 혹은 어댑터나 링커 등을 개재해서 결합하고 있는 것을 의미하고, 결합의 의미에 대해서는 후술한다.
(어댑터 또는 링커)
본 발명에 사용하는 「어댑터 또는 링커」로서는, 예를 들어 비오틴, 스페이서 9, 스페이서 12, 스페이서 18, 스페이서 C3 등의 스페이서 등의 아미노기 혹은 카르복실기를 갖는 화합물 등을 들 수 있고, 바람직하게는 5'-아미노-변형제 C12(12-(4-모노메톡시트리틸아미노)도데실-1-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트), 비오틴 등이다.
예를 들어 비즈 표면에 카르복실기를 갖고, 아미노기의 화합물을 부가한 핵산 프로브가, 아미노기를 개재해서 비즈 표면의 카르복실기와 결합하는 양태는 아미노기를 갖는 화합물이 링커의 예가 된다.
(표지 물질)
본 발명에 있어서의 표지 물질은 방사성 동위 원소, 비오틴, 디곡시게닌, 형광 물질, 발광 물질 또는 색소 등을 적합한 예로서 들 수 있다.
구체적으로는, 125I나 32P 등의 방사성 동위 원소, 디곡시게닌이나 아크리디늄·에스테르 등의 발광·발색 물질, 디옥세탄 등의 발광 물질이나 4-메틸움벨리페릴인산 등의 형광 물질을 이용하기 위한 알칼리 포스파타아제, 아비딘에 결합한 형광·발광·발색 물질 등을 이용하기 위한 비오틴 등, 형광 공명 에너지 전이(FRET)를 이용하기 위한 도너 형광 색소와 억셉터 형광 색소를 부가시켜 두어, 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 것도 가능하다.
(핵산 프로브의 고상에 대한 결합)
핵산 프로브의 고상에 대한 결합은 화학 결합에 의한 방법, 생물학적 상호 작용에 의한 방법, 물리 흡착에 의한 방법 등을 들 수 있다. 화학 결합에 의한 방법에서는, 예를 들어 카르복실기로 코팅된 담체를 사용하는 경우, 올리고뉴클레오티드에 표지한 아미노기와의 사이에서 커플링 반응을 시킬 수 있다. 생물학적 상호 작용에 의한 방법에서는, 예를 들어 담체에 코팅한 스트렙트아비딘과, 핵산 프로브에 수식한 비오틴 사이의 결합력을 이용할 수 있다. 또한, 물리 흡착에 의한 방법에서는, 예를 들어 음의 전하를 갖는 고상을 사용한 경우, 올리고뉴클레오티드에 아미노기 등 양의 전하를 갖는 물질을 표지함으로써, 정전기적으로 담체에 흡착시킬 수 있다.
(제1 폴리뉴클레오티드 부가 반응)
본 발명의 제1 폴리뉴클레오티드 부가 반응은 표적 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단에 폴리뉴클레오티드를 부가하는 반응이며, 미리 핵산 합성으로 제작한 폴리뉴클레오티드를 리가아제 등의 효소로 표적 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단에 결합하는 방법, 또는 폴리A 폴리메라아제 등의 효소에 의해 뉴클레오티드(염기)를 부가하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 리가아제 등의 효소로서는, 예를 들어 RNA 리가아제, T4RNA 리가아제, DNA 리가아제 등을 들 수 있다. 또한, 5' 말단에 폴리염기를 부가하는 경우에는, 5' 말단을 미리 인산화함으로써 리가아제를 작용시킬 수 있다.
상기 제1 폴리뉴클레오티드의 서열의 길이의 하한으로서는 4mer 이상이 바람직하고, 10mer 이상이 더욱 바람직하고, 15mer 이상이 한층 더 바람직하다. 또한 길이의 상한으로서는 100mer 이하가 바람직하다. 또한, 길이의 바람직한 범위로서는 15mer 이상 100mer 이하이다.
또한, 제1 폴리뉴클레오티드의 서열은 측정 대상인 시료에 포함되지 않는 서열이 바람직하고, 이러한 서열은 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 시, 비특이 반응을 억제하는 것이 가능하다.
상기 제1 폴리뉴클레오티드의 부가 반응이 폴리A의 부가 반응인 경우에는, 표적 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단에 폴리A를 부가하는 반응이며, 미리 핵산 합성으로 제작한 폴리A를 리가아제로 표적 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단에 결합하는 방법, 또는 표적 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 폴리A 폴리메라아제(폴리뉴클레오티드아데닐릴 트랜스페라아제)로 아데닐 잔기를 부가하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 폴리A 폴리메라아제로서는, 단일 가닥 RNA의 3' 말단에 아데닌 잔기를 도입하는 효소 활성을 갖는 단백질을 의미한다. 보다 구체적으로는, 대장균 유래의 폴리A 폴리메라아제가 적합하게 사용된다.
폴리A 폴리메라아제 및 아데노신삼인산(ATP)을 폴리A 폴리메라아제의 활성 조건 하에서 접촉시킴으로써, 표적 올리고뉴클레오티드를 폴리아데닐화할 수 있고, 본 명세서 중, 표적 올리고뉴클레오티드의 폴리A 부가와 폴리아데닐화는 동일한 의미로 사용된다.
상기 폴리A의 길이의 하한으로서는 4mer 이상이 바람직하고, 10mer 이상이 더욱 바람직하고, 15mer 이상이 한층 더 바람직하다. 또한, 길이의 상한으로서는 100mer 이하이다. 또한, 길이의 바람직한 범위로서는 15mer 이상 100mer 이하이다.
상기 폴리염기 부가 반응이 폴리T 부가 반응인 경우에는, 표적 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단에 폴리T를 부가하는 반응이며, 미리 핵산 합성으로 제작한 폴리T를 리가아제 등으로 표적 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단에 결합하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 리가아제 등으로서는, 예를 들어 RNA 리가아제, DNA 리가아제 등을 들 수 있다.
상기 폴리T의 길이의 하한으로서는 4mer 이상이 바람직하고, 10mer 이상이 더욱 바람직하고, 15mer 이상이 한층 더 바람직하다. 또한, 길이의 상한으로서는 100mer 이하가 바람직하다. 또한, 길이의 바람직한 범위로서는 15mer 이상 100mer 이하이다.
또한, 폴리T의 서열은 측정 대상인 시료에 포함되지 않는 서열이므로, 이러한 서열은 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 시, 비특이 반응을 억제한다.
폴리C의 부가, 폴리G의 부가도 마찬가지로 행해진다.
상기 RNA 리가아제, DNA 리가아제, 폴리A 폴리메라아제는 부가 반응 후에, 열 등으로 실활시키는 것이 바람직하다.
상기 제1 폴리뉴클레오티드 부가 반응은 상기 단일 가닥 특이적 뉴클레아제와의 접촉 공정 전에 행하면 되고, 상기 시료에, 상기 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브를 접촉시키기 전, 또는 포착 프로브를 접촉시킨 후에 행할 수 있다.
상기 시료에 상기 포착 프로브를 접촉시키기 전에, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 경우에는, 시료에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가해서 표적 올리고뉴클레오티드와 제1 폴리뉴클레오티드의 부가물(이하, 단순히 표적 올리고뉴클레오티드-제1 폴리뉴클레오티드라고 기재하는 경우가 있다)을 형성하고, 그 후 당해 부가물과 포착 프로브의 하이브리다이제이션에 의해 표적 올리고뉴클레오티드-제1 폴리뉴클레오티드와 포착 프로브의 이중 가닥을 형성한다.
상기 시료에 상기 포착 프로브를 접촉시킨 후에, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 경우에는, 시료와 포착 프로브의 접촉에 의해 표적 올리고뉴클레오티드와 포착 프로브의 하이브리다이제이션 후에, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가함으로써, 표적 올리고뉴클레오티드-제1 폴리뉴클레오티드와 포착 프로브의 이중 가닥을 형성한다.
(단일 가닥 특이적 뉴클레아제)
본 발명에 사용하는 단일 가닥 특이적 뉴클레아제란, 단일 가닥 특이적 엔도뉴클레아제 또는 단일 가닥 특이적 엑소뉴클레아제를 말한다.
「단일 가닥 특이적 엔도뉴클레아제」로서는, 단일 가닥인 핵산 서열의 내부에서 핵산을 절단하는 효소이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 S1 뉴클레아제, 녹두 뉴클레아제 등을 들 수 있고, S1 뉴클레아제가 바람직하다. 또한, 표적 올리고뉴클레오티드 및 핵산 프로브가 RNA인 경우, 본 발명에 사용하는 「단일 가닥 특이적 엔도뉴클레아제」로서, 단일 가닥 RNA(ssRNA)를 특이적으로 분해하는 RNase ONE(등록상표) Ribonuclease(Promega, 카탈로그 번호: M4261) 등을 들 수 있다.
「단일 가닥 특이적 엑소뉴클레아제」로서는, 단일 가닥인 DNA 또는 RNA를 5' 말단 또는 3' 말단으로부터 절단하는 효소이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 엑소뉴클레아제 I 등을 들 수 있다.
(포착 프로브를 단일 가닥으로 하는 공정)
본 명세서에 있어서 「포착 프로브를 단일 가닥으로 하는 공정」은, 하이브리다이즈하고 있는 표적 올리고뉴클레오티드와 포착 프로브의 이중 가닥 또는 표적 올리고뉴클레오티드와 제1 폴리뉴클레오티드의 부가물과 포착 프로브의 이중 가닥을 단일 가닥의 포착 프로브로 하는 것이다.
상기 단일 가닥의 포착 프로브로 하는 방법은 이중 가닥을 단일 가닥으로 하는 방법이면 되고, 예를 들어 열처리, 알칼리 처리, 카오트로프 처리 등을 들 수 있고, 바람직하게는 열처리에 의해 행해진다. 열처리로서는, 예를 들어 95℃에서 3분간, 50℃에서 3분간 처리하는 방법 등이다.
(접촉)
본 명세서에 있어서 「접촉시킨다」 혹은 「접촉 공정」이라고 하는 용어는, 어떤 물질과 다른 물질 사이에서 공유 결합, 이온 결합, 금속 결합, 비공유 결합 등의 화학 결합을 형성할 수 있도록, 이들 물질을 서로 근방에 두는 것을 의미한다. 본 발명의 일 양태에 있어서는, 어떤 물질과 다른 물질을 「접촉시킨다」란, 어느 물질을 포함하는 용액과 다른 물질을 포함하는 용액을 혼합하는 것을 의미한다. 예를 들어, 시료에 리가아제를 접촉시키는 공정은 4 내지 80℃에서 0.1 내지 30시간 보온하는 것, 바람직하게는 15 내지 30℃에서 1 내지 24시간 보온하는 것으로 행해진다. 시료에 폴리A 폴리메라아제 및 ATP를 접촉시키는 공정은 30 내지 42℃에서 5 내지 60분간 보온하는 것, 바람직하게는 37℃에서 15분간 보온하는 것으로 행해진다. 시료와 포착 프로브의 접촉 공정은 30 내지 70℃에서 0.2 내지 30시간 보온하는 것, 35 내지 65℃에서 8 내지 24시간 보온하는 것, 바람직하게는 50℃에서 13.5시간 보온하는 것으로 행해진다. 시료와 단일 가닥 특이적 엔도뉴클레아제의 접촉 공정은 30 내지 42℃에서 0.2 내지 3시간 보온하는 것, 33 내지 40℃에서 0.3 내지 2시간 보온하는 것, 바람직하게는 37℃에서 0.5시간 보온하는 것으로 행해진다. 시료와 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드의 접촉 공정은 28 내지 70℃에서 0.2 내지 3시간 보온하는 것, 30 내지 45℃에서 0.5 내지 2시간 보온하는 것, 바람직하게는 30℃에서 1시간 보온하는 것으로 행해진다.
또한, 표적 올리고뉴클레오티드와 포착 프로브의 접촉은, 표적 올리고뉴클레오티드와 핵산 프로브의 상보적인 서열의 대응하는 염기가 하이브리다이제이션할 수 있는 조건 하에서 행해지는 것을 의미한다. 마찬가지로, 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브와 단일 가닥 공정을 거친 포착 프로브의 접촉, 혹은 당해 포착 프로브와 어시스트 프로브의 접촉, 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브끼리의 접촉도 대응하는 염기가 하이브리다이제이션할 수 있는 조건 하에서 행해지는 것을 의미한다.
(자기 응집)
본 명세서에 있어서 「자기 응집」이라고 하는 용어는, 복수의 제1 올리고뉴클레오티드가 제2 올리고뉴클레오티드와의 하이브리다이제이션에 의해 복합체를 형성한 상태, 및 복수의 제2 올리고뉴클레오티드가 제1 올리고뉴클레오티드와의 하이브리다이제이션에 의해 복합체를 형성한 상태를 의미한다.
(자기 응집한 한 쌍의 프로브)
본 발명의 방법에 사용하는 「자기 응집 가능」한 한 쌍의 프로브는, 제1 올리고뉴클레오티드와 제2 올리고뉴클레오티드가 서로 하이브리다이즈 가능한 상보적 염기 서열 영역을 갖고, 자기 응집 반응에 의한 프로브 폴리머의 형성이 가능한 올리고뉴클레오티드를 말한다. 바람직하게는, 상기 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드 중 적어도 한쪽은 표지 물질에 의해 표지되어 있다. 여기서 「하이브리다이즈 가능」이란, 일 양태에 있어서는, 당해 상보적 염기 서열 영역에 있어서 완전히 상보적인 것을 의미하고, 다른 일 양태에 있어서는, 1개 또는 2개의 미스매치를 제외하고, 당해 상보적 염기 서열 영역에 있어서 상보적인 것을 의미한다.
자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브에는 미리 검출을 위한 표지 물질로 표지해 두는 것도 가능하다. 그러한 표지 물질로서, 방사성 동위 원소, 비오틴, 디곡시게닌, 형광 물질, 발광 물질 또는 색소 등을 적합한 예로서 들 수 있다. 구체적으로는, 125I나 32P 등의 방사성 동위 원소, 디곡시게닌이나 아크리디늄·에스테르 등의 발광·발색 물질, 디옥세탄 등의 발광 물질이나 4-메틸움벨리페릴인산 등의 형광 물질을 이용하기 위한 알칼리 포스파타아제, 아비딘에 결합한 형광·발광·발색 물질 등을 이용하기 위한 비오틴 등, 형광 공명 에너지 전이(FRET)를 이용하기 위한 도너 형광 색소와 억셉터 형광 색소를 부가시켜 두어, 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 것도 가능하다.
바람직하게는 당해 표지 물질은 비오틴이며, 당해 올리고뉴클레오티드의 표지는 바람직하게는 5' 말단 또는 3' 말단을 비오틴화함으로써 행해진다. 당해 표지 물질이 비오틴인 경우, 표지 물질에 특이적으로 결합하는 물질은 스트렙트아비딘 또는 아비딘이다.
「자기 응집 가능」한 한 쌍의 프로브를 보다 구체적으로 설명하면, 제1 올리고뉴클레오티드가, 5' 말단측으로부터 순서대로 적어도 핵산 영역 X, 핵산 영역 Y 및 핵산 영역 Z를 포함하는 올리고뉴클레오티드이며, 제2 올리고뉴클레오티드가, 5' 말단측으로부터 순서대로 적어도 상기 핵산 영역 X에 상보적인 핵산 영역 X', 상기 핵산 영역 Y에 상보적인 핵산 영역 Y' 및 상기 핵산 영역 Z에 상보적인 핵산 영역 Z'를 포함하는 올리고뉴클레오티드라고 하는 것이다.
여기서, 제1 폴리뉴클레오티드가 폴리A인 경우, 상기 핵산 영역 Z가 폴리A 서열을 포함하고, 또한 상기 핵산 영역 Z'가 폴리T 서열을 포함하는 양태가 예시된다.
본 발명에 있어서의 포착 프로브를 단일 가닥으로 하는 공정을 행한 시료에, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브를 접촉시켜서, 상기 포착 프로브와, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 폴리머의 복합체를 형성시키는 공정은, 어시스트 프로브를 개재하지 않고 복합체를 형성하는 경우와, 어시스트 프로브를 개재해서 복합체를 형성하는 경우가 있다.
상기 어시스트 프로브란, 상기 단일 가닥 공정에 의해 단일 가닥이 된 포착 프로브와 상기 올리고뉴클레오티드 폴리머의 복합체를 형성하기 위해서 어시스트하는 역할을 갖는 프로브이다. 어시스트 프로브의 제1 양태는 상기 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드 중 적어도 한쪽의 전체 서열 또는 부분 서열에 대하여 상보적인 서열 및 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열을 포함하는 프로브이다.
예를 들어, 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브의 한쪽이 XYZ인 경우, (표적 올리고뉴클레오티드)-X'Y'X', (표적 올리고뉴클레오티드)-Z'Y'Z', (표적 올리고뉴클레오티드)-X'Y'Z' 등을 들 수 있다.
상기 어시스트 프로브는 표지 물질로 표지되어 있어도 되고, 표지되어 있지 않아도 된다.
또한, 다른 양태로서, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드가 부가되는 경우에는, 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드 중 적어도 한쪽의 전체 서열 또는 부분 서열에 대하여 상보적인 서열 및 제1 폴리뉴클레오티드 전체 서열 또는 부분 서열을 포함하는 프로브이다.
예를 들어, 제1 폴리뉴클레오티드가 부가되는 경우에, 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브의 한쪽 서열이 XYZ인 경우, (부가 염기)-X'Y'X', (부가 염기)-Z'Y'Z', 표적 올리고뉴클레오티드(부가된 것은, 부가 염기)-X'Y'Z' 등을 들 수 있다.
표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드의 부가가 있는 경우와 없는 경우, 어시스트 프로브가 있는 경우와 없는 경우의 각각의 조합에 대해서 이하의 경우로 나누어서 설명한다.
상기 어시스트 프로브를 개재하지 않고 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브와 단일 가닥 포착 프로브의 복합체를 형성하는 경우에 대해서 설명한다.
제1 양태는, 상기 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드 중 적어도 한쪽이 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열을 포함하면 된다.
다른 양태는, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드가 부가되어 있는 경우에 사용되는 양태이며, 상기 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드 중 적어도 한쪽이 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열을 포함하면 된다.
상기 어시스트 프로브를 개재해서 복합체를 형성하는 경우에는, 상기 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 자기 응집 반응에 의한 프로브 폴리머의 형성이 가능한 올리고뉴클레오티드이면 된다. 이 경우, 어시스트 프로브는 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 또는 부분 서열, 그리고 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드 중 적어도 한쪽의 전체 서열 또는 부분 서열에 대하여 상보적인 서열의 양쪽을 포함하면 된다.
또한, 다른 양태는, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드가 부가되어 있는 경우에 사용되는 양태이며, 이 경우, 어시스트 프로브는, 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열, 그리고 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드 중 적어도 한쪽의 전체 서열 또는 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함하는 것이면 된다.
제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 적어도 한쪽이 표지 물질에 의해 표지되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 방법의 제1 양태로서, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드로서 폴리A를 부가해서 검출하는 방법에 대해서 도 2의 (A)에 기초하여 이하 설명한다.
먼저, 표적 올리고뉴클레오티드가 포함될 수 있는 시료와 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브를 준비한다.
본 발명의 포착 프로브는
(A) 핵산 프로브와,
(B) 상기 핵산 프로브의 3' 말단의 뉴클레오티드 부분에 고정화된 비즈를 포함한다.
상기 핵산 프로브는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 및 제1 폴리뉴클레오티드의 부분(이 경우 폴리A)에 대하여 상보적인 서열(폴리T)을 포함한다.
이어서, 상기 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 폴리A 폴리메라아제를 작용시켜서 폴리A를 부가한다(도 2의 (A)의 (a)). 계속해서, 폴리A를 부가한 표적 올리고뉴클레오티드에 상기 포착 프로브를 접촉시킨다. 이에 의해, 폴리A가 부가된 표적 올리고뉴클레오티드와, 포착 프로브 중의 핵산 프로브의 하이브리다이제이션이 행해져서 이중 가닥이 형성된다(도 2의 (A)의 (b)).
이어서, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제인 엔도뉴클레아제를 접촉시킨다. 이에 의해 단일 가닥 부분이 분해된다(도 2의 (A)의 (c)). 파선의 화살표는 엔도뉴클레아제가 작용하는 개소를 나타낸다.
여기서, 시료 중에 표적 올리고뉴클레오티드의 유사 물질(5'측 또는 3'측이 결실된 표적 올리고뉴클레오티드의 대사물이나 표적 올리고뉴클레오티드의 변이체)이 존재한 경우에는, 본 발명의 핵산 프로브와 불완전한 하이브리다이제이션 생성물을 형성한다. 5'측이 결실된 표적 올리고뉴클레오티드의 작용에 대해서 도 2의 (B)에 기초하여 설명한다. 표적 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 흰색 마름모꼴은 결실 개소를 나타낸다. 당해 올리고뉴클레오티드에 폴리A를 부가하고(도 2의 (B)의 (a)), 핵산 프로브와 하이브리다이제이션을 행하고(도 2의 (B)의 (b)), 엔도뉴클레아제 처리를 행한다(도 2의 (B)의 (c)). 당해 엔도뉴클레아제는 파선 화살표 부위에 작용하여, 당해 개소에서 분해되게 된다.
상기 시료 중에서 분해되지 않고 잔존하는 포착 프로브와 표적 올리고뉴클레오티드에 의해 형성된 완전한 이중 가닥의 하이브리다이제이션 생성물을 단일 가닥으로 한다(도 2의 (A)의 (d)). 단일 가닥으로의 변성은 열처리 등에 의해 행한다. 상기 엔도뉴클레아제에 의한 분해 산물은, 비즈에 고정화되어 있지 않은 점에서 세정해서 비즈를 회수함으로써 제거할 수 있다.
잔존하는 완전한 하이브리다이제이션 생성물에 포함되는 핵산 프로브는 이하의 펄서법에 의해 정량할 수 있다.
상기 포착 프로브를 단일 가닥으로 하는 공정을 행한 상기 시료에, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브를 접촉시켜서, 상기 포착 프로브와, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드가 자기 응집해서 이루어지는 올리고뉴클레오티드 폴리머의 복합체를 형성한다(소위 펄서 반응).
여기서, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브는, 제1 올리고뉴클레오티드가, 5' 말단측으로부터 순서대로 핵산 영역 X, 핵산 영역 Y 및 핵산 영역 Z를 포함하는 올리고뉴클레오티드이며, 제2 올리고뉴클레오티드가, 5' 말단측으로부터 순서대로 상기 핵산 영역 X에 상보적인 핵산 영역 X', 상기 핵산 영역 Y에 상보적인 핵산 영역 Y' 및 상기 핵산 영역 Z에 상보적인 핵산 영역 Z'를 포함하고 있다(이하, 당해 핵산 영역을 단순히 X, Y, Z, X', Y', Z'라고 하는 경우가 있다). 본 형태에서는, 제1 폴리뉴클레오티드가 폴리A이기 때문에, Z가 폴리A 서열을 포함하고, 또한 Z'가 폴리T 서열을 포함하고 있다. 또한, 제1과 제2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에는 표지 물질이 부여되어 있다.
단일 가닥인 포착 프로브의 Z'(폴리T)에 제1 올리고뉴클레오티드의 Z(폴리A)가 하이브리다이즈하고, 제1 올리고뉴클레오티드의 X, Y에 제2 올리고뉴클레오티드의 X', Y'가 각각 하이브리다이즈한다. 그리고 차례차례 X와 X', Y와 Y', Z(폴리A)와 Z'(폴리T)가 하이브리다이즈를 반복함으로써, 자기 응집 프로브의 올리고뉴클레오티드 폴리머가 형성된다(도 2의 (A)의 (e)).
상기 포착 프로브 및 자기 응집한 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드의 복합체를 원심 분리법에 의해 침전시키거나 해서 분리하고, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 표지 물질 등을 검출함으로써 표적 올리고뉴클레오티드의 농도 등을 측정할 수 있다.
또한, 열처리에 의한 단일 가닥 공정 및 그 후의 펄서 반응을 행하기 전의 포착 프로브와 표적 올리고뉴클레오티드에 의해 형성된 완전한 이중 가닥의 하이브리다이제이션 생성물을 검출함으로써, 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 것도 가능하다. 예를 들어 5' 말단이 미리 표지 물질로 부여된 포착 프로브의 표지 물질을 검출함으로써, 표적 올리고뉴클레오티드를 검출할 수 있다.
또한, 3' 말단이 미리 표지 물질로 부여된 제1 폴리뉴클레오티드의 표지 물질을 검출함으로써, 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 것도 가능하다.
본 발명의 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 방법의 제2 양태로서, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하지 않고, 또한 자기 응집 반응에서는 어시스트 프로브를 개재해서 행하는 검출 방법에 대해서 도 3에 기초하여 이하 설명한다.
먼저, 표적 올리고뉴클레오티드가 포함될 수 있는 시료와 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브를 준비한다. 본 실시 양태에서는 제1 폴리뉴클레오티드의 부가를 행하지 않는 것부터, 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 프로브는
(A) 핵산 프로브와,
(B) 상기 핵산 프로브의 3' 말단의 뉴클레오티드 부분에 고정화된 비즈를 포함한다.
상기 핵산 프로브는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함한다.
제1 실시 양태의 공정과의 차이는, (도 2의 (A)의 (a))의 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 공정이 없는 것, 및 포착 프로브를 단일 가닥으로 하는 공정을 행한 시료에 어시스트 프로브를 하이브리다이즈하는 공정(도 3의 (d))이 추가되어 있는 것 이외에는 동일하다.
어시스트 프로브는 표적 올리고뉴클레오티드의 부분 서열, 그리고 제2 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열 Z, Y, Z를 포함하고, 3' 말단이 표지 물질로 표지되어 있다.
또한, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브는, 제1 올리고뉴클레오티드가 5' 말단측으로부터 순서대로 X, Y 및 Z를 포함하는 올리고뉴클레오티드이며, 제2 올리고뉴클레오티드가 5' 말단측으로부터 X', Y' 및 Z'를 포함하고 있다.
포착 프로브를 단일 가닥으로 하는 공정을 행한 시료에 어시스트 프로브를 접촉시키면, 포착 프로브에 포함되는 표적 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열과 어시스트 프로브의 표적 올리고뉴클레오티드의 서열 사이에서 하이브리다이제이션이 일어난다(도 3의 (d)). 다음에 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브를 접촉시키면, 어시스트 프로브의 Y, Z와 제2 올리고뉴클레오티드의 Y', Z'가 하이브리다이즈하고, 그리고 차례차례 X와 X', Y와 Y', Z와 Z'가 하이브리다이즈를 반복함으로써, 자기 응집 프로브의 올리고뉴클레오티드 폴리머가 형성된다(도 3의 (e)). 포착 프로브, 어시스트 프로브, 및 자기 응집한 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드의 복합체를 분리하고, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드의 표지 물질 등을 검출함으로써, 표적 올리고뉴클레오티드의 농도 등을 측정할 수 있다. 또한, 펄서 반응을 행하기 전의 비즈를 수반하는 완전한 이중 가닥의 하이브리다이제이션 생성물을 검출함으로써 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 것도 가능하다. 예를 들어, 3' 말단이 미리 표지 물질로 부여된 어시스트 프로브의 표지 물질을 검출함으로써, 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 것도 가능하다.
본 발명의 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 방법의 제3 양태로서, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하지 않고, 또한 어시스트 프로브를 개재하지 않고 자기 응집 반응을 행하여 검출하는 방법에 대해서 도 4에 기초하여 이하 설명한다.
제2 실시 양태와의 차이는, 포착 프로브와 어시스트 프로브를 접촉하는 공정(도 3의 (d))이 없는 것이다. 또한, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브는, 제1 올리고뉴클레오티드가 5' 말단측으로부터 순서대로 X, Y 및 Z를 포함하는 올리고뉴클레오티드이며, 제2 올리고뉴클레오티드가 5' 말단측으로부터 X', Y' 및 Z'를 포함하고 있다. 여기서, Z는 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열이며, 표적 올리고뉴클레오티드의 유사 물질의 완전 상보 서열과는 하이브리다이즈하지 않는 서열이고, Z'는 Z와 상보적인 서열이다.
단일 가닥이 된 포착 프로브의 핵산 프로브인 표적 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열 부분은, 제1 올리고뉴클레오티드의 Z 영역인 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열과 하이브리다이즈한다. 그리고, 차례차례 X와 X', Y와 Y', Z(표적 올리고뉴클레오티드)와 Z'(표적 올리고뉴클레오티드의 상보 가닥)가 하이브리다이즈를 반복함으로써, 자기 응집 프로브의 올리고뉴클레오티드 폴리머가 형성된다(도 4의 (d)). 포착 프로브 및 자기 응집한 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드의 복합체를 분리하고, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드의 표지 물질 등을 검출함으로써 표적 올리고뉴클레오티드의 농도 등을 측정할 수 있다.
표적 올리고뉴클레오티드에 상보적인 단일 가닥의 포착 프로브를 정량하기 위한 자기 응집을 이용한 방법은, 소위 펄서법으로서 알려져 있는 공지된 방법이다. 펄서법의 구체예는 국제공개 2013/172305호의 도 4 내지 도 14 등에 도시되어 있고, 이량체 형성용 프로브 등을 사용해서 당업자 상식에 기초하여 적절히 변형해서 본 발명의 자기 응집 반응에 응용하는 것이 가능하다.
본 발명의 포착 프로브, 그리고 자기 응집한 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 폴리머(시그널 프로브 폴리머)는 바람직하게는 분리하는 쪽이 좋고, 복합체의 분리 방법은 특별히 한정되지 않고, 바람직하게는 원심 분리법, 흡인 여과법을 들 수 있다.
포착 프로브 및 그의 복합체를 「원심 분리법」에 의해 침전시키는 공정은, 통상, 20 내지 30℃에서 0.2 내지 5분간, 500 내지 3000×g의 원심, 23 내지 28℃에서 0.5 내지 2분간, 800 내지 1500×g의 원심, 바람직하게는 25℃에서 1분간, 1000×g의 원심으로 행한다. 보다 구체적으로는, 비즈의 제조 회사의 사용 설명서를 따르면 된다.
포착 프로브 및 그의 복합체를 「흡인 여과법」에 의해 분리시키는 공정은, 문헌[Biochem Biophys Res Commun. 2015 Nov 27;467(4):1012-8.]에 기재된 방법으로 실시할 수 있다. 구체적으로는, 포착 프로브 및 그의 복합체를 포함하는 용액을 필터 플레이트로 옮기고, 통상 20 내지 30℃에서 음압 범위 1 내지 10in.Hg의 흡인, 23 내지 28℃에서 1 내지 10in.Hg의 흡인, 바람직하게는 25℃에서 1 내지 5in.Hg의 흡인으로 행한다. 흡인 시간은, 필터 상에서 눈으로 봐서 액체가 제거되어 있으면 되고, 예를 들어 1초 내지 5분간, 바람직하게는 5초간 내지 1분간을 들 수 있다. 필터 플레이트의 포어 크기는 포착 프로브의 직경보다 작은 것이 적합하게 사용되고, 예를 들어 1.2㎛ 또는 1.0㎛가 바람직하다. 구체적인 부재의 예로서, 필터 플레이트: MultiScreen(등록상표) HTS-BV plate(Merck Millipore, 제품 번호: MSBVN1250), 매니폴드: MultiScreen(등록상표) HTS Vacuum Manifold(Merck Millipore), 흡인 펌프: Chemical duty pump(Merck Millipore, 카탈로그 번호: WP6110060)를 들 수 있다.
(시료)
본 발명의 방법에 사용하는 「시료」는 인간, 원숭이, 개, 돼지, 래트, 모르모트, 또는 마우스의 전혈, 혈청, 혈장, 림프액, 소변, 타액, 누액, 땀, 위액, 췌액, 담즙, 흉수, 관절강액, 뇌척수액, 수액, 골수액 등의 체액 혹은 간장, 신장, 폐, 심장 등의 조직 등이다. 바람직하게는, 시료는 인간의 전혈, 혈청, 혈장, 또는 소변이다. 더욱 바람직하게는, 시료는 표적 올리고뉴클레오티드를 포함하는 의약이 투여된 인간의 전혈, 혈청, 혈장, 또는 소변이다.
본 발명의 방법에 사용하는 「세정 완충액」은 바람직하게는 0.01 내지 0.05%의 계면 활성제를 포함하고, 더욱 바람직하게는 0.02%의 Tween20 등의 비이온성 계면 활성제를 포함한다. 바람직하게는, 비이온성 계면 활성제는 Tween20이다. 더욱 바람직하게는, 「세정 완충액」은 1×PBS((10×PBS(닛폰 진, 제품 번호: 314-90185를 10배 희석) 137mM 염화나트륨, 8.1mM 인산수소이나트륨, 2.68mM 염화칼륨, 1.47mM 인산이수소칼륨, pH7.4±0.2)) 및 0.02% Tween20을 포함한다. 보다 더욱 바람직하게는, 「세정 완충액」은 1×PBS, 0.02% Tween20 및 1.5ppm ProClin300을 포함한다. 「세정 완충액」은 0.01 내지 1%, 0.02 내지 0.5%, 0.05 내지 0.2%, 혹은 0.1%의 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 폴리머를 검출하는 방법은, 예를 들어 탁도법, 아가로오스 전기 영동법, 흡광도법, 형광 측정법, 플로 사이토메트리법을 들 수 있고, 바람직하게는 플로 사이토메트리법을 들 수 있다.
플로 사이토메트리법으로서는, 예를 들어 「플로 사이토메트리법을 사용하여, 제1 형광 물질이 발하는 제1 형광과 제2 형광 물질이 발하는 제2 형광을 검출하는 공정」에서 행해지고, 「플로 사이토메트리법을 사용하여, 제1 형광 물질이 발하는 제1 형광과 제2 형광 물질이 발하는 제2 형광을 검출하는 공정」은, 제1 형광 물질이 발하는 제1 형광과 제2 형광 물질이 발하는 제2 형광을 동시에 또는 동일 기회에 검출하는 것이 바람직하다. 여기서 「동시 또는 동일 기회에 검출한다」란, 1개의 복합체(3성분 복합체 또는 4성분 복합체)에 포함되는 제1 형광 물질과 제2 형광 물질이 플로 사이토미터의 유로 내에서 동시에 또는 순차적으로 여기되고, 발해진 제1 형광과 제2 형광이 당해 1개의 복합체로부터 발해진 형광으로서 검출되는 것을 의미한다.
보다 구체적으로는, 제1 형광 물질로서는, 포착 프로브의 고상이 포함하는 형광 물질 등을 들 수 있고, 제2 형광 물질로서는, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드에 부여된 표지 물질에 특이적으로 결합하는 물질에 미리 결합된 형광 물질을 들 수 있다. 이들 제1 및 제2 형광 물질이 포함되는 반응액을 플로 사이토메트리법을 사용하여, 제1 형광 물질이 발하는 제1 형광과 제2 형광 물질이 발하는 제2 형광을 검출할 수 있다.
본 발명에 있어서 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 키트는, 적어도 이하의 구성을 포함하는 키트를 말한다.
(1) 단일 가닥 특이적 뉴클레아제
(2) 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브
(3) 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브
또한, 필요에 따라, 제1 폴리뉴클레오티드, 리가아제, 폴리A 폴리메라아제, 어시스트 프로브 등이 포함되어 있다. 각 구성에 대해서는, 상술한 바와 같다.
실시예
〔실시예 1〕
1. 재료 및 방법
(가) 표적 올리고뉴클레오티드
측정 대상인 표적 올리고뉴클레오티드로서는, 웨이 등이 사용한 GTI-2040을 사용했다(Wei 2006 참조). GTI-2040의 서열은 5'-GGCTAAATCGCTCCACCAAG-3'(서열번호 1)이다. 표적 올리고뉴클레오티드의 대사물의 모델(본 명세서에 있어서, 「유사 물질」이라고 칭하는 경우가 있다.)로서, 웨이 등이 사용한 3'N-1, 3'N-2, 5'N-1, 미스매치된 GTI-2040 및 스크램블된 GTI-2040을 사용했다. 3'N-1 및 3'N-2(서열번호 2 및 서열번호 3)은 3' 말단이 1 내지 2염기 결손된 올리고뉴클레오티드이며, 5'N-1(서열번호 4)은 5' 말단이 1염기 결손된 올리고뉴클레오티드이며, 미스매치된 GTI-2040(5'-GGCTAAACTCGTCCACCAAG-3')(서열번호 5)은 내부에 4개의 미스매치를 갖는 올리고뉴클레오티드이며, 스크램블된 GTI-2040(5'-ACGCACTCAGCTAGTGACAC-3')(서열번호 6)은 GTI-2040과 동일한 GC 함량 그대로이며 염기의 순번을 교체한 올리고뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드는 모두 일본 유전자 연구소사에 합성을 의뢰했다(HPLC 정제 그레이드). 상기의 표적 올리고뉴클레오티드 및 표적 올리고뉴클레오티드의 대사물의 모델은 웨이 등과 마찬가지로, 완전 S화(포스포로티오에이트)되어 있다.
(나) 핵산 프로브, 포착 프로브
Luminex사의 MicroPlexTM Microspheres(영역 번호: 43, 제품 번호: LC10043-01)에, GTI-2040에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브(핵산 프로브)를 3' 말단의 NH2 수식을 개재해서 결합시키고, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(Thermo Fisher Scientific, 제품 번호: EK0032)를 사용해서 5' 말단을 인산화하고, 여기에 20mer의 폴리(T) 올리고뉴클레오티드를 T4 DNA 리가아제(Thermo Fisher Scientific, 제품 번호: 15224-025)를 사용해서 라이게이션함으로써 제조했다. 결합 방법은 Luminex사의 매뉴얼집(xMAP(등록상표) Cookbook, 3rd Edition)에 따랐다. 키나아제 처리 및 리가아제 처리는 첨부의 사용설명서에 따랐다. GTI-2040에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브(핵산 프로브)의 서열은 5'-CTTGGTGGAGCGATTTAGCC-3'(서열번호 7)이며, 폴리(T) 올리고뉴클레오티드의 서열은 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'(서열번호 8)이다.
본 발명의 방법에 사용하는 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브의 서열은 5' 말단이 비오틴으로 표지되어 있고,
5'-(비오틴)-CAACAATCAGGACGATACCGATGAAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'
(염기 부분은 서열번호 9. Ccb4530-1-XY-20T-B라 칭한다) 및
5'-(비오틴)-GTCCTGATTGTTGCTTCATCGGTATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'
(염기 부분은 서열번호 10. Ccb4530-2-XY-20A-B라 칭한다)이다.
(다) 본 발명의 방법에 의한 표적 올리고뉴클레오티드의 정량
(1) 완충액, 희석액 및 반응액의 제조
「PAP 믹스」: 시판 키트(A-PlusTM Poly(A) Polymerase Tailing Kit, CELLSCRIPT사, 제품 번호: C-PAP5104H)의 첨부 시약을 사용하여, 10× 반응 완충액(키트 첨부; 0.5M 트리스-HCl(pH8.0), 2.5M NaCl, 및 100mM MgCl2)을 2㎕, 10mM ATP(키트 첨부)을 2㎕, 폴리(A) 폴리메라아제(키트 첨부)를 0.5㎕, 뉴클레아제 무함유 물을 5.5㎕를 혼합하여, 합계 10㎕의 PAP 믹스를 제조했다. 샘플수에 따라서 필요한 양의 PAP 믹스를 제조했다.
「올리고뉴클레오티드 용액」: 측정 대상인 표적 올리고뉴클레오티드 및 그의 대사물의 모델을 이하의 농도로 TE(10mM 트리스-HCl(pH8.0), 1mM EDTA(pH8.0))에 용해하여, 올리고뉴클레오티드 용액을 제조하였다: GTI-2040에 대해서는 1,000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25pM; 그 밖에 대해서는 125pM. 올리고뉴클레오티드를 포함하지 않는 블랭크 샘플도 준비했다.
「1st 하이브리다이제이션 반응액」: 포착 프로브를 0.33㎕(1500개/㎕), 5M 염화테트라메틸암모늄(Tetramethyla㎜onium chloride, TMAC)을 7.7㎕, 10× 보충액을 5.6㎕, 뉴클레아제 무함유 물을 1.37㎕ 혼합하여, 합계 15㎕의 1st 하이브리다이제이션 반응액을 제조했다. 10× 보충액의 조성은 500mM 트리스-HCl(pH8.0), 40mM EDTA(pH8.0), 8% N-라우로일사르코신나트륨이다. 샘플수에 따라서 필요한 양의 1st 하이브리다이제이션 반응액을 제조했다.
「10× S1 뉴클레아제 완충액」: 8mL의 3M 아세트산나트륨 용액(pH5.2, 후지필름 와코준야쿠, 제품 번호: 316-90081), 13.0906g의 염화나트륨(간또 가가꾸, 제품 번호: 37144-00), 8mL의 0.1M 아세트산아연 용액(후지필름 와코준야쿠, 제품 번호: 267-01575)을 잘 혼합했다. pH4.5로 조정하고, 뉴클레아제 무함유 물로 총량을 80mL로 희석하였다. 0.22㎛ 필터로 멸균하고, 사용까지 냉동(-20℃) 보존했다.
「S1 뉴클레아제 완충액-T」: 40mL의 10× S1 뉴클레아제 완충액, 2mL의 10% Tween20 용액(Merck Millipore, 제품 번호: 655206)을 잘 혼합했다. pH4.5로 조정하고, 뉴클레아제 무함유 물로 총량을 400mL로 희석하였다. 0.22㎛ 필터로 멸균하고, 실온에서 보존했다.
「S1 뉴클레아제 마스터 믹스」: 7.5㎕의 10× S1 뉴클레아제 완충액(pH4.5), 0.056㎕의 S1 뉴클레아제(180U/㎕, 타카라 바이오, 제품 번호: 2410A) 및 67.44㎕의 뉴클레아제 무함유 물을 혼합하여, 합계 75㎕의 S1 뉴클레아제 마스터 믹스를 제조했다. 샘플수에 따라서 필요한 양의 S1 뉴클레아제 마스터 믹스를 제조했다.
「자기 응집 개시 믹스」: 5M TMAC을 15㎕, 10× 보충액을 8㎕, 20pmol/㎕의 Ccb4530-2-XY-20A-B를 0.05㎕, 뉴클레아제 무함유 물을 26.95㎕ 첨가하고, 혼합해서 자기 응집 개시 믹스를 제조했다(합계 50㎕). 샘플수에 따라서 필요한 양의 자기 응집 개시 믹스를 제조했다.
「자기 응집 믹스」: 5M TMAC을 4.5㎕, 10× 보충액을 2.4㎕, 20pmol/㎕의 Ccb4530-1-XY-20T-B를 1.75㎕, 20pmol/㎕의 Ccb4530-2-XY-20A-B를 1.4㎕, 뉴클레아제 무함유 물을 5.0㎕ 첨가하고, 혼합해서 자기 응집 믹스를 제조했다(합계 15㎕). 샘플 수에 따라서 필요한 양의 자기 응집 믹스를 제조했다.
「1×PBS-TP」: 최종 농도가 1×PBS(10×PBS(닛폰 진, 제품 번호: 314-90185)를 10배 희석), 0.02% Tween20, 1.5ppm ProClin300(Merck, 제품 번호: 48912-U)이 되도록, 1×PBS-TP를 제조했다.
「SAPE 용액」: PhycoLink(등록상표) 스트렙트아비딘-R-피코에리트린(ProZyme사, 제품 번호: PJ31S)을 1×PBS-TP로 희석하여, 5㎍/mL의 SAPE 용액을 제조했다.
(2) 폴리(A) 부가 반응
PCR 플레이트에 PAP 믹스를 10㎕, 및 올리고뉴클레오티드 용액을 10㎕ 첨가하고, 혼합했다(합계 20㎕). 서멀 사이클러를 사용하여 반응액을 37℃에서 15분간 보온한 후, 65℃에서 10분간 열처리하고, 다음 처리까지 4℃에서 유지했다.
(3) 포착 프로브에 대한 폴리(A) 부가 올리고뉴클레오티드의 포착(하이브리다이제이션)
폴리(A) 부가 반응 후의 올리고뉴클레오티드 용액에, 15㎕의 1st 하이브리다이제이션 반응액을 첨가하고, 혼합했다(합계 35㎕). 당해 혼합액을 50℃에서 13.5시간 보온한 후, 다음 처리까지 4℃에서 유지했다.
(4) 세정 공정
보온 후에, 40㎕의 뉴클레아제 무함유 물을 첨가하고, 25℃에서 1분간, 1000×g로 원심 분리하여 비즈를 침전시키고, 상청을 경사 분리로 제거했다. 75㎕의 S1 뉴클레아제 완충액-T를 첨가하고, 25℃에서 1분간, 1000×g로 원심 분리하여 비즈를 침전시키고, 상청을 경사 분리로 제거했다.
(5) S1 뉴클레아제 처리
상기의 세정 공정 후의 비즈에, 75㎕의 S1 뉴클레아제 마스터 믹스를 첨가하고, 혼합해서 비즈를 재현탁했다. 당해 비즈를 37℃에서 30분간 보온했다.
(6) 세정 공정
보온 후에, 25℃에서 1분간, 1000×g로 원심 분리하여 비즈를 침전시키고, 상청을 경사 분리로 제거했다. 75㎕의 0.05% Tween20을 첨가하고, 25℃에서 1분간, 1000×g로 원심 분리하여 비즈를 침전시키고, 상청을 경사 분리로 제거했다.
(7) 자기 응집 반응
상기 세정 공정 후의 비즈에, 50㎕의 자기 응집 개시 믹스를 첨가하고, 혼합해서 비즈를 재현탁했다. 당해 비즈를 50℃에서 3분간 보온(단일 가닥 공정)한 후, 30℃에서 30분간 보온하고, 보온 후에, 당해 혼합액에 자기 응집 믹스를 15㎕ 첨가하고, 혼합해서(합계 65㎕), 30℃에서 1시간 보온했다(자기 응집 반응).
(8) 세정 공정
보온 후에, 25℃에서 1분간, 1000×g로 원심 분리하여 비즈를 침전시키고, 상청을 경사 분리로 제거했다. 실온의 1×PBS-TP를 각 웰에 75㎕ 첨가하고, 다시 25℃에서 1분간, 1000×g로 원심 분리하여 비즈를 침전시키고, 상청을 경사 분리로 제거했다.
(9) SAPE 처리
PCR 플레이트의 각 웰에 SAPE 용액을 50㎕씩 첨가하고, 혼합했다. 차광 하에 PCR 플레이트를 25℃에서 10분간 정치하고, SAPE를 비오틴과 반응시켰다.
(10) 과잉 SAPE의 세정
SAPE 반응액을 포함하는 PCR 플레이트를 25℃에서 1분간, 1000×g로 원심 분리하여 비즈를 침전시키고, 상청을 경사 분리로 제거했다. 비즈의 펠릿에 1×PBS-TP를 75㎕ 첨가하고, 다시 25℃에서 1분간, 1000×g로 원심 분리하여 비즈를 침전시키고, 상청을 경사 분리로 제거했다. 이 재현탁, 원심 및 상청 제거의 조작을 다시 1회 반복했다. 비즈의 펠릿에 1×PBS-TP를 75㎕ 첨가하고, 혼합해서 비즈를 재현탁했다.
(11) 형광 검출
재현탁한 비즈를 포함하는 PCR 플레이트를 플로 사이토메트리(Luminex사 제조, Luminex시스템)에 세팅하고, 당해 플로 사이토메트리를 사용해서 비즈 및 SAPE 포합체로부터의 형광을 검출했다.
2. 시험 결과
(가) 본 발명의 방법에 의한 표적 올리고뉴클레오티드의 정량 결과
본 발명의 방법에 의한 표적 올리고뉴클레오티드의 정량 결과를 도 1에 도시한다. 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드의 농도에 의존한 형광 시그널이 얻어졌다. 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드의 농도와 형광 시그널의 상관 계수(r)는 0.9995이고, 높은 상관성이 인정되었다.
(나) 본 발명의 방법에 의한 표적 올리고뉴클레오티드의 정량의 특이성 평가
본 발명의 방법을 사용해서 표적 올리고뉴클레오티드의 대사물의 모델을 정량한 경우의 교차 반응성을 표 1에 나타낸다. 3' 말단 또는 5' 말단을 결손하는 대사물의 모델에 대해서, 교차 반응성을 약 14 내지 26%로 억제할 수 있었다. 또한, 내부에 4개의 미스매치를 갖는 유사 물질 및 동일한 GC 함량 그대로이며 염기의 순번을 교체한 유사 물질에 대해서도, 교차 반응성을 10% 미만으로 억제할 수 있었다.
Figure pct00001
〔실시예 2〕
실시예 1에 있어서는 폴리A를 부가한 표적 올리고뉴클레오티드를 포착 프로브에 의해 포착했지만, 본 실시예에서는 폴리A를 부가하지 않고, 표적 올리고뉴클레오티드의 전부에 대하여 상보적인 서열을 포함하는 포착 프로브에 의해 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하여, 당해 표적 올리고뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 것을 확인했다. 또한, 자기 응집 반응은 어시스트 프로브를 개재해서 행하였다.
1. 재료 및 방법
(1) 포착 프로브의 제조
Luminex사의 MicroPlexTM Microspheres(영역 번호: 43, 제품 번호: LC10043-01)에, GTI-2040에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브(핵산 프로브)를 3' 말단의 NH2 수식을 개재해서 결합시킴으로써 제조했다(포착 프로브라고 한다). GTI-2040에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브의 서열은 5'-CTTGGTGGAGCGATTTAGCC-3'(서열번호 7)이다.
(2) 포착 프로브에 대한 표적 올리고뉴클레오티드의 포착(하이브리다이제이션)
측정 대상 물질 10㎕에, 1st 하이브리다이제이션 반응액을 20㎕ 첨가하여 계 30㎕로 하고, 50℃에서 13.5시간 반응시켰다.
(2-1) 1st 하이브리다이제이션 반응액의 조성
상기 (1)에서 제조한 포착 프로브 0.25㎕(500개), 5M TMAC 6.6㎕, 10× 보충액[500mM 트리스-HCl(pH8.0), 40mM EDTA(pH8.0), 8% N-라우로일사르코신나트륨] 4.8㎕, 뉴클레아제 무함유 물 8.35㎕
(2-2) 측정 대상 물질, 유사 물질
측정 대상 물질(표적 올리고뉴클레오티드), 유사 물질로서 실시예 1과 동일한 물질(3'N-1, 3'N-2, 미스매치된 GTI-2040, 스크램블된 GTI-2040) 및 3'N-3(GTI-2040의 3' 말단이 3염기 결실된 올리고뉴클레오티드)을 사용하고, TE(10mM 트리스-HCl(pH8.0), 1mM EDTA(pH8.0))를 사용해서 이하의 농도로 제조해서 사용했다. GTI-2040에 대해서는 1,000, 125, 50pM, 그 밖에 대해서는 125pM으로 제조했다. 올리고뉴클레오티드를 포함하지 않는 블랭크 샘플도 준비했다.
(3) 절단 공정(S1 뉴클레아제 처리)
포착 공정 후의 반응액 30㎕를 뉴클레아제 무함유 물로 1회 세정한 후, S1 뉴클레아제 완충액-T로 1회 세정했다. 그 후, 세정 후의 비즈에 S1 뉴클레아제 반응액을 75㎕ 첨가하여 계 75㎕로 하고, 37℃에서 30분간 반응시켰다.
(3-1) S1 뉴클레아제 완충액-T의 조성
30mM 아세트산나트륨, 280mM 염화나트륨, 1mM 아세트산아연, 0.05% Tween20, pH4.5
(3-2) S1 뉴클레아제 반응액의 조성
10× S1 뉴클레아제 완충액[300mM 아세트산나트륨, 2800mM 염화나트륨, 10mM 아세트산아연, pH4.5] 7.5㎕, S1 뉴클레아제(180U/㎕, 타카라 바이오, 제품 번호: 2410A) 0.056㎕, 뉴클레아제 무함유 물 67.4㎕
(4) 검출용 복합체 형성 보조 공정(어시스트 프로브 하이브리다이제이션)
절단 공정 후의 반응액 75㎕를 0.05% Tween20으로 1회 세정한 후, 세정 후의 비즈에 AP 하이브리다이제이션 반응액을 50㎕ 첨가하여 계 50㎕로 하고, 95℃에서 3분간 가온 후(단일 가닥 공정), 50℃에서 30분간 반응시켰다.
(4-1) AP 하이브리다이제이션 반응액의 조성
5M TMAC 15㎕, 10× 보충액[500mM 트리스-HCl(pH8.0), 40mM EDTA(pH8.0), 8% N-라우로일사르코신나트륨] 8㎕, 20pmol/㎕ Ccb4530-2-ZYZ-8-B 0.05㎕, 뉴클레아제 무함유 물 26.95㎕
본 발명의 방법에 사용하는 어시스트 프로브의 서열은
5'-(비오틴)-CCACCAAGCACTCCTTATATCCTTCATCGGTATCCACTCCTTATATC-3'
(염기 부분은 서열번호 11. Ccb4530-2-ZYZ-8-B라 칭한다.)이다.
(5) 검출용 복합체 형성 공정(자기 응집 반응/펄서 반응)
검출용 복합체 형성 보조 공정 후의 반응액 50㎕에, 펄서 반응액을 15㎕ 첨가하여 계 65㎕로 하고, 30℃에서 1시간 반응시켰다.
본 발명의 방법에 사용하는 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브 서열은 5' 말단이 비오틴으로 표지되어 있고,
5'-(비오틴)-CAACAATCAGGACGATACCGATGAAGGATATAAGGAGTG-3'(염기 부분은 서열번호 12. Ccb4530-1B라 칭한다) 및
5'-(비오틴)-GTCCTGATTGTTGCTTCATCGGTATCCACTCCTTATATC-3'(염기 부분은 서열번호 13. Ccb4530-2B라 칭한다)이다.
(5-1) 펄서 반응액
5M TMAC 4.5㎕, 10× 보충액[500mM 트리스-HCl(pH8.0), 40mM EDTA(pH8.0), 8% N-라우로일사르코신나트륨] 2.4㎕, 20pmol/㎕ Ccb4530-1B 1.75㎕, 20pmol/㎕ Ccb4530-2B 1.4㎕, 뉴클레아제 무함유 물 5.0㎕
(6) 검출 공정(형광 검출)
검출용 복합체 형성 공정 후의 반응액을 1×PBS-TP[1×PBS[137mM 염화나트륨, 8.1mM 인산이나트륨, 2.68mM 염화칼륨, 1.47mM 인산이수소칼륨], 0.02% Tween20, 1.5ppm ProClin300]로 1회 세정한 후, 검출 시약[SAPE(Prozyme사제) 5㎍/mL]을 50㎕ 첨가하고, 25℃의 차광 하에서 10분간 정치한 후, 1×PBS-TP로 2회 세정했다. 그 후 1×PBS-TP를 75㎕ 첨가하고, Luminex System(Luminex사제)으로 비즈 및 SAPE 포합체로부터의 형광을 측정하고, 측정 대상 물질의 시그널을 검출했다.
2. 시험 결과
본 실시예 2의 방법을 사용해서 표적 올리고뉴클레오티드 및 그의 대사물(유사 물질)의 모델을 정량한 경우의 교차 반응성을 표 2에 나타낸다. 3' 말단을 결손하는 대사물의 모델에 대해서, 교차 반응성을 26% 미만으로 억제할 수 있었다. 또한, 내부에 4개의 미스매치를 갖는 유사 물질 및 표적 올리고뉴클레오티드와 동일한 GC 함량 그대로이며 염기의 순번을 교체한 유사 물질에 대해서도, 교차 반응성을 30 내지 40% 정도로 억제할 수 있었다.
Figure pct00002
〔실시예 3〕(임의 염기 부가)
실시예 1에 있어서는 표적 올리고뉴클레오티드에 폴리A를 부가하고 이것을 포착 프로브에 의해 포착했지만, 본 실시예에서는 폴리A 대신에 임의의 염기를 부가하고, 표적 올리고뉴클레오티드를 검출할 수 있는 것을 확인했다.
1. 재료 및 방법
(1) 포착 프로브의 제조
Luminex사의 MicroPlexTM Microspheres(영역 번호: 43, 제품 번호: LC10043-01)에, GTI-2040에 상보적인 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브(핵산 프로브)를 3' 말단의 NH2 수식을 개재해서 결합시킴으로써 제조했다. 결합 방법은 Luminex사의 매뉴얼집(xMAP(등록상표) Cookbook, 3rd Edition)에 따랐다. GTI-2040에 상보적인 영역을 포함하는 핵산 프로브의 서열은 5'-TCGCTATTCCTTGGTGGAGCGATTTAGCC-NH2-3'(서열번호 14)이다.
(2) 측정 대상 물질
측정 대상 물질(표적 올리고뉴클레오티드)로서 실시예 1과 동일한 물질을 0, 1,000pM으로 사용했다.
(3) 포착 공정
측정 대상 물질 10㎕에, 하이브리다이제이션 반응액[5M TMAC 6㎕, 10× 보충액[500mM 트리스-HCl(pH8.0), 40mM EDTA(pH8.0), 8% N-라우로일사르코신나트륨] 3.2㎕, 1pmol/㎕ P-AP2-B 0.2㎕, 포착 프로브 0.5㎕(1000개), 뉴클레아제 무함유 물 0.1㎕]을 10㎕ 첨가하여 계 20㎕로 하고, 50℃에서 1시간 반응시켰다.
(3-1) P-AP2-B의 서열(임의의 염기)
5'-인산화-GAATAGCGA-비오틴-3'
(4) 라이게이션 공정
포착 공정 후의 반응액 20㎕를 뉴클레아제 무함유 물로 1회 세정했다. 그 후, 세정 후의 비즈에 라이게이션 반응액을 50㎕ 첨가하여 계 50㎕로 하고, 50℃에서 1시간 반응시켰다.
(4-1) 라이게이션 반응액의 조성
10× 9°N DNA 리가아제 반응 완충액[100mM 트리스-HCl, 6000μM ATP, 25mM 염화마그네슘, 25mM 디티오트레이톨, 1% 트리톤 X-100, pH7.5] 5㎕, 9°N DNA 리가아제(*)(40U/㎕, New England Biolabs, 제품 번호: M0238S) 0.25㎕, 뉴클레아제 무함유 물 44.75㎕
(*) 9°N DNA 리가아제는 DNA의 닉을 수복하는 효소이며, 표적 올리고뉴클레오티드의 3' 히드록시 말단과 P-AP-B의 5' 인산 말단의 포스포디에스테르 결합을 촉매한다.
(5) 절단 공정(S1 뉴클레아제 처리)
라이게이션 공정 후의 반응액 50㎕를 S1 뉴클레아제 완충액-T로 2회 세정했다. 그 후, S1 뉴클레아제 반응액을 첨가하여 계 50㎕로 하고, 37℃에서 30분간 반응시켰다.
(5-1) S1 뉴클레아제 완충액-T의 조성
30mM 아세트산나트륨, 280mM 염화나트륨, 1mM 아세트산아연, 0.05% Tween20, pH4.5
(5-2) S1 뉴클레아제 반응액의 조성
10× S1 뉴클레아제 완충액[300mM 아세트산나트륨, 2800mM 염화나트륨, 10mM 아세트산아연, pH4.5] 5㎕, S1 뉴클레아제(180U/㎕, 타카라 바이오, 제품 번호: 2410A) 0.056㎕, 뉴클레아제 무함유 물 44.94㎕
(6) 검출 공정(형광 검출)
절단 공정 후의 반응액을 1×PBS-TP[1×PBS[137mM 염화나트륨, 8.1mM 인산이나트륨, 2.68mM 염화칼륨, 1.47mM 인산이수소칼륨], 0.02% Tween20, 1.5ppm ProClin300]로 1회 세정한 후, 검출 시약[SAPE(Prozyme사제) 5㎍/mL]을 50㎕ 첨가하고, 25℃의 차광 하에서 10분간 정치한 후, 1×PBS-TP로 2회 세정했다. 그 후 1×PBS-TP를 75㎕ 첨가하고, Luminex System(Luminex사제)으로 비즈 및 SAPE 포합체로부터의 형광을 측정하고, 측정 대상 물질의 시그널을 검출했다. 또한, 본 실시예에서는 열변성 처리(단일 가닥 공정) 및 펄서 반응에 의한 시그널 증폭을 행하지 않고, 표적 올리고뉴클레오티드-부가 염기의 부가물과 포착 프로브의 하이브리다이제이션 반응물을 직접 검출했다.
2. 시험 결과
표적 올리고뉴클레오티드의 모델의 시그널(MFI, Median Fluorescent Intensity; 중앙 형광 강도)을 표 3에 나타낸다. 또한, 수치는 블랭크값(표적 올리고뉴클레오티드 미첨가(0pM)의 시그널)을 뺀 값을 나타냈다. 표적 올리고뉴클레오티드 미첨가(0pM)와 비교해서 표적 올리고뉴클레오티드 첨가(1,000pM)에 있어서 시그널의 상승을 확인할 수 있어, 표적 올리고뉴클레오티드에 대해 임의의 염기가 부가된 표적 올리고뉴클레오티드를 검출할 수 있었다.
Figure pct00003
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 검출 또는 정량 방법을 사용함으로써, 의약품 개발의 탐색 단계에 있어서의 약물 동태·약역학(PK/PD) 스크리닝 시험, 비임상 단계에 있어서의 안전성 시험, 약리 시험 및 약물 동태 시험, 임상 단계에 있어서 약물이 투여된 동물 혹은 인간 생체 시료 중의 약물 농도를 측정할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> SEKISUI MEDICAL Co., Ltd. <120> PAP_S1_protection <130> P1893 <150> JP 2018-169340 <151> 2018-9-11 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GTI-2040 <400> 1 ggctaaatcg ctccaccaag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'N-1 <400> 2 ggctaaatcg ctccaccaa 19 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'N-2 <400> 3 ggctaaatcg ctccacca 18 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'N-1 <400> 4 gctaaatcgc tccaccaag 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mismatched GTI-2040 <400> 5 ggctaaactc gtccaccaag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scrambled GTI-2040 <400> 6 acgcactcag ctagtgacac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Complementary to GTI-2040 <400> 7 cttggtggag cgatttagcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> poly(T)20 <400> 8 tttttttttt tttttttttt 20 <210> 9 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccb4530-1-XY-20T-B <400> 9 caacaatcag gacgataccg atgaagtttt tttttttttt tttttt 46 <210> 10 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccb4530-2-XY-20A-B <400> 10 gtcctgattg ttgcttcatc ggtatcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 46 <210> 11 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccb4530-2-ZYZ-8-B <400> 11 ccaccaagca ctccttatat ccttcatcgg tatccactcc ttatatc 47 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccb4530-1B <400> 12 caacaatcag gacgataccg atgaaggata taaggagtg 39 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccb4530-2B <400> 13 gtcctgattg ttgcttcatc ggtatccact ccttatatc 39 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Complementary to GTI-2040 <400> 14 tcgctattcc ttggtggagc gatttagcc 29

Claims (26)

  1. 이하의 공정을 포함하는, 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법:
    (i) 상기 시료에, 상기 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브를 접촉시키는 공정,
    여기서, 상기 포착 프로브는
    (A) 핵산 프로브와,
    (B) 상기 핵산 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 고상 또는 어댑터 혹은 링커
    를 포함하고,
    상기 핵산 프로브는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 또는 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함한다
    (ii) 상기 포착 프로브와의 접촉 공정을 행한 상기 시료에, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 접촉시키는 공정,
    (iii) 상기 단일 가닥 특이적 뉴클레아제와의 접촉 공정을 행한 후, 상기 시료 중의 상기 포착 프로브를 단일 가닥으로 하는 공정,
    (iv) 상기 포착 프로브를 단일 가닥으로 하는 공정을 행한 상기 시료에, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브를 접촉시켜서, 상기 포착 프로브와, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드가 자기 응집해서 이루어지는 올리고뉴클레오티드 폴리머의 복합체를 형성시키는 공정,
    (v) 상기 복합체를 검출하는 공정.
  2. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브 중 적어도 한쪽의 올리고뉴클레오티드가, 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 또는 부분 서열을 포함하는, 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (iv)의 복합체 형성 공정이,
    표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 또는 부분 서열, 그리고 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드 중 적어도 한쪽의 전체 서열 또는 부분 서열에 대하여 상보적인 서열의 양쪽을 포함하는 어시스트 프로브와 접촉시키는 공정을 포함하는, 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
  4. 이하의 공정을 포함하는, 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법:
    (i) 상기 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 공정,
    (ii) 표적 올리고뉴클레오티드에, 상기 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브를 접촉시키는 공정,
    여기서, 상기 포착 프로브는
    (A) 핵산 프로브와,
    (B) 상기 핵산 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 고상 또는 어댑터 혹은 링커를 포함하고,
    상기 핵산 프로브는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함한다
    (iii) 상기 제1 폴리뉴클레오티드의 부가 및 상기 포착 프로브와의 접촉 공정을 행한 상기 시료에, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 접촉시키는 공정,
    (iv) 상기 단일 가닥 특이적 뉴클레아제와의 접촉 공정을 행한 후, 상기 시료 중의 상기 포착 프로브를 단일 가닥으로 하는 공정,
    (v) 상기 포착 프로브를 단일 가닥으로 하는 공정을 행한 상기 시료에, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브를 접촉시켜서, 상기 포착 프로브와, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드가 자기 응집해서 이루어지는 올리고뉴클레오티드 폴리머의 복합체를 형성하는 공정,
    (vi) 상기 복합체를 검출하는 공정.
  5. 제4항에 있어서, (i) 상기 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 공정이, 포착 프로브와의 접촉 공정을 행하기 전의 상기 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 공정인, 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, (i) 상기 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 공정이,
    포착 프로브와의 접촉 공정을 행한 후의 상기 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 공정인, 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브 중 적어도 한쪽의 올리고뉴클레오티드가, 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열을 포함하는, 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
  8. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (v)의 복합체 형성 공정이 어시스트 프로브를 접촉시키는 공정을 포함하고,
    상기 어시스트 프로브가, 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열, 그리고 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드 중 한쪽의 전체 서열 혹은 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함하는, 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드가 폴리A 서열, 폴리T 서열, 폴리U 서열, 폴리(T/U) 서열, 폴리G 서열, 또는 폴리C 서열인, 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드가 폴리A 서열인, 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 올리고뉴클레오티드가, 5' 말단측으로부터 순서대로 적어도 핵산 영역 X, 핵산 영역 Y 및 핵산 영역 Z를 포함하는 올리고뉴클레오티드이며, 제2 올리고뉴클레오티드가, 5' 말단측으로부터 순서대로 적어도 상기 핵산 영역 X에 상보적인 핵산 영역 X', 상기 핵산 영역 Y에 상보적인 핵산 영역 Y' 및 상기 핵산 영역 Z에 상보적인 핵산 영역 Z'를 포함하는 올리고뉴클레오티드인, 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 핵산 영역 Z가 폴리A 서열을 포함하고, 또한 상기 핵산 영역 Z'가 폴리T 서열을 포함하는, 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가닥 특이적 뉴클레아제가 엔도뉴클레아제인, 표적 올리고뉴클레오티드를 검출하는 방법.
  14. 이하를 포함하는, 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 키트.
    (1) 단일 가닥 특이적 뉴클레아제
    (2) 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브
    (3) 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브
  15. 제14항에 있어서, 추가로, 표적 올리고뉴클레오티드에 부가하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 키트.
  16. 제14항에 있어서, 추가로, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드로서의 폴리A를 부가하는 폴리아데닐화 효소를 포함하는, 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 키트.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 (2)의 포착 프로브는
    (A) 핵산 프로브와,
    (B) 상기 핵산 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 고상 또는 어댑터 혹은 링커를 포함하고,
    상기 핵산 프로브는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함하고,
    (3)의 상기 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브는, 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드의 적어도 한쪽이 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 또는 부분 서열을 포함하는, 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 키트.
  18. 제14항에 있어서, (2)의 상기 포착 프로브는
    (A) 핵산 프로브와,
    (B) 상기 핵산 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 고상 또는 어댑터 혹은 링커를 포함하고,
    상기 핵산 프로브는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 서열을 포함하고,
    (3)의 상기 자기 응집 가능한 한 쌍의 프로브는, 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드의 적어도 한쪽이 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 또는 부분 서열을 포함하는, 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 키트.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, (1) 단일 가닥 특이적 뉴클레아제가 엔도뉴클레아제인, 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 키트.
  20. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 어시스트 프로브를 포함하고, 상기 어시스트 프로브가, 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열, 그리고 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드 중 한쪽의 전체 서열 또는 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함하는, 표적 올리고뉴클레오티드의 검출 키트.
  21. 이하의 공정을 포함하는, 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드의 양에 대응한 포착 프로브를 회수하는 방법:
    (i) 상기 시료에, 상기 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브를 접촉시키는 공정,
    여기서, 상기 포착 프로브는
    (A) 핵산 프로브와,
    (B) 상기 핵산 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 고상 또는 어댑터 혹은 링커를 포함하고,
    상기 핵산 프로브는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 또는 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함한다
    (ii) 상기 포착 프로브와의 접촉 공정을 행한 상기 시료에, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 접촉시키는 공정;
    (iii) 상기 단일 가닥 특이적 뉴클레아제와의 접촉 공정을 행한 후, 상기 시료에 포함되는, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제로 절단되어 있지 않은 포착 프로브를 회수하는 공정.
  22. 제21항에 있어서, 시료에, 상기 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 접촉시키는 상기 (ii)의 공정 전에, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 공정을 포함하고,
    상기 핵산 프로브가, 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함하는, 포착 프로브를 회수하는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 시료에, 상기 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브를 접촉시키는 상기 (i)의 공정 전에, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 공정을 포함하고,
    상기 핵산 프로브가, 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함하는, 포착 프로브를 회수하는 방법.
  24. 이하의 공정을 포함하는, 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드를 정량하는 방법:
    (i) 상기 시료에, 상기 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브를 접촉시키는 공정,
    여기서, 상기 포착 프로브는
    (A) 핵산 프로브와,
    (B) 상기 핵산 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단의 뉴클레오티드에 인접하는 고상 또는 어댑터 혹은 링커를 포함하고,
    상기 핵산 프로브는, 상기 표적 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 서열을 포함하고,
    (ii) 상기 포착 프로브와의 접촉 공정을 행한 상기 시료에, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 접촉시키는 공정,
    (iii) 상기 단일 가닥 특이적 뉴클레아제와의 접촉 공정을 행한 후, 상기 시료에 포함되는, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제로 절단되어 있지 않은 포착 프로브를 회수하는 공정,
    (iv) 회수된 포착 프로브를 검출하고, 시료 중의 표적 올리고뉴클레오티드를 정량하는 공정.
  25. 제24항에 있어서, 시료에, 상기 단일 가닥 특이적 뉴클레아제를 접촉시키는 상기 (ii)의 공정 전에, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 공정을 포함하고, 상기 핵산 프로브가, 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함하는, 표적 올리고뉴클레오티드를 정량하는 방법.
  26. 제24항에 있어서, 시료에, 상기 표적 올리고뉴클레오티드를 포착하기 위한 포착 프로브를 접촉시키는 상기 (i)의 공정 전에, 표적 올리고뉴클레오티드에 제1 폴리뉴클레오티드를 부가하는 공정을 포함하고, 상기 핵산 프로브가, 표적 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열 및/또는 제1 폴리뉴클레오티드의 전체 서열 혹은 부분 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함하는, 표적 올리고뉴클레오티드를 정량하는 방법.
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