JP2003116598A - 遺伝子の検出方法 - Google Patents
遺伝子の検出方法Info
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- JP2003116598A JP2003116598A JP2001310895A JP2001310895A JP2003116598A JP 2003116598 A JP2003116598 A JP 2003116598A JP 2001310895 A JP2001310895 A JP 2001310895A JP 2001310895 A JP2001310895 A JP 2001310895A JP 2003116598 A JP2003116598 A JP 2003116598A
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- hcp
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ＰＡＬＳＡＲ法で使用するＨＣＰをインベーダ
ー法におけるシグナル・プローブのフラップ部分とする
ことにより、ＦＲＥＴプローブを必要とせず、低コスト
でＳＮＰを検出することができる遺伝子の検出方法を提
供する。 【解決手段】お互いに相補的な部分がｎ（ｎ≧３）カ所
の数から構成される一対のプローブ（ＨＣＰ）の複数対
を用いて、２本鎖の自己集合体を形成させるＰＡＬＳＡ
Ｒ法を用い、使用する一対のプローブの片側の３'末端
に、ＳＮＰがあるターゲット遺伝子と相補的になるよう
にデザインしたシグナル・プローブをあらかじめ結合さ
せておき、インベーダー・プローブと一緒にターゲット
遺伝子とハイブリダイゼーションした後、フラップ・エ
ンドヌクレアーゼによりターゲット遺伝子とハイブリダ
イゼーションしたプローブを切断し、完全なＨＣＰを形
成させ、自己集合体を形成させることにより遺伝子を検
出するようにした。
ー法におけるシグナル・プローブのフラップ部分とする
ことにより、ＦＲＥＴプローブを必要とせず、低コスト
でＳＮＰを検出することができる遺伝子の検出方法を提
供する。 【解決手段】お互いに相補的な部分がｎ（ｎ≧３）カ所
の数から構成される一対のプローブ（ＨＣＰ）の複数対
を用いて、２本鎖の自己集合体を形成させるＰＡＬＳＡ
Ｒ法を用い、使用する一対のプローブの片側の３'末端
に、ＳＮＰがあるターゲット遺伝子と相補的になるよう
にデザインしたシグナル・プローブをあらかじめ結合さ
せておき、インベーダー・プローブと一緒にターゲット
遺伝子とハイブリダイゼーションした後、フラップ・エ
ンドヌクレアーゼによりターゲット遺伝子とハイブリダ
イゼーションしたプローブを切断し、完全なＨＣＰを形
成させ、自己集合体を形成させることにより遺伝子を検
出するようにした。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、お互いに相補的な
部分がｎ（ｎ≧３）カ所の数から構成される一対のプロ
ーブ（以下、HoneyComb Probe：ＨＣＰと称することが
ある。）の複数対を用いて、互い違いに交差するように
ハイブリダイゼーションさせることにより、２本鎖の自
己集合体を形成させるプローブ自己集合体の作製方法
（ＵＳＰ６，２６１，８４６、特開２０００−２０１６
８７号及びＥＰ１，００２，８７７Ａ、以下、Probe al
ternation link self-assembly reaction；ＰＡＬＳＡ
Ｒ法と称することがある。）を利用して、遺伝子を検出
する方法に関する。
部分がｎ（ｎ≧３）カ所の数から構成される一対のプロ
ーブ（以下、HoneyComb Probe：ＨＣＰと称することが
ある。）の複数対を用いて、互い違いに交差するように
ハイブリダイゼーションさせることにより、２本鎖の自
己集合体を形成させるプローブ自己集合体の作製方法
（ＵＳＰ６，２６１，８４６、特開２０００−２０１６
８７号及びＥＰ１，００２，８７７Ａ、以下、Probe al
ternation link self-assembly reaction；ＰＡＬＳＡ
Ｒ法と称することがある。）を利用して、遺伝子を検出
する方法に関する。
【０００２】
【関連技術】近年、ＤＮＡの３重鎖を認識して特異的に
切断する酵素を利用して、ＳＮＰを検出するインベーダ
ー法（Invader Assay：Lyamichev V et al.Polymorphis
m identification and quantitative detection of gen
omic DNA by invasive cleavage of oligonucleotide p
robes.Nat Biotechnol 17,292,1999）という技術があ
る。
切断する酵素を利用して、ＳＮＰを検出するインベーダ
ー法（Invader Assay：Lyamichev V et al.Polymorphis
m identification and quantitative detection of gen
omic DNA by invasive cleavage of oligonucleotide p
robes.Nat Biotechnol 17,292,1999）という技術があ
る。
【０００３】当該技術では、２種類の非蛍光標識プロー
ブと１種類の蛍光標識プローブを用いる。２種類の非蛍
光標識プローブのうちの一つは、シグナル・プローブ
（Signal probe）と呼ばれ、ターゲット遺伝子とは無関
係な塩基配列（フラップ）を５'側に有し、３'側はター
ゲット遺伝子に対して相補的な塩基配列であり、相補的
な塩基配列の５'末端はＳＮＰ部位となっている。もう
一つのプローブはインベーダー・プローブ（Invader pr
obe）と呼ばれ、ターゲット遺伝子のＳＮＰ部位から３'
側に相補的にハイブリダイゼーションするようにデザイ
ンされている。
ブと１種類の蛍光標識プローブを用いる。２種類の非蛍
光標識プローブのうちの一つは、シグナル・プローブ
（Signal probe）と呼ばれ、ターゲット遺伝子とは無関
係な塩基配列（フラップ）を５'側に有し、３'側はター
ゲット遺伝子に対して相補的な塩基配列であり、相補的
な塩基配列の５'末端はＳＮＰ部位となっている。もう
一つのプローブはインベーダー・プローブ（Invader pr
obe）と呼ばれ、ターゲット遺伝子のＳＮＰ部位から３'
側に相補的にハイブリダイゼーションするようにデザイ
ンされている。
【０００４】したがって、ターゲット遺伝子と二つのプ
ローブをハイブリダイゼーションさせるとＳＮＰ部位に
インベーダー・プローブが侵入（invasion）して３つの
プローブが重なりあうため、その３重鎖の部位をフラッ
プ・エンドヌクレアーゼ〔Flap endonuclease、或いは
クリアベース（Cleavase）とも呼ばれる：Structure-sp
ecific endonucleolytic cleavage of nucleic acids b
y eubacterial DNA polymerases.Science 260,778,199
3〕が認識してフラップを切断する。
ローブをハイブリダイゼーションさせるとＳＮＰ部位に
インベーダー・プローブが侵入（invasion）して３つの
プローブが重なりあうため、その３重鎖の部位をフラッ
プ・エンドヌクレアーゼ〔Flap endonuclease、或いは
クリアベース（Cleavase）とも呼ばれる：Structure-sp
ecific endonucleolytic cleavage of nucleic acids b
y eubacterial DNA polymerases.Science 260,778,199
3〕が認識してフラップを切断する。
【０００５】遊離したフラップは、５'側が自分自身で
ハイブリダイゼーションできる相補的な塩基配列と５'
末端に蛍光色素が標識されその上流にクエンチャー（Qu
encher:発光抑制体）が結合しているＦＲＥＴ（fluores
cence resonance energy transfer）プローブとハイブ
リダイゼーションする。このときフラップのＳＮＰ部位
がＦＲＥＴ自身のハイブリダイゼーション部位に侵入
し、クリアベース（Cleavase）は再びこの構造を認識し
て蛍光色素部分を切断するため蛍光色素はクエンチャー
と離れ蛍光を発するようになり、ＳＮＰを検出すること
ができるというものである。
ハイブリダイゼーションできる相補的な塩基配列と５'
末端に蛍光色素が標識されその上流にクエンチャー（Qu
encher:発光抑制体）が結合しているＦＲＥＴ（fluores
cence resonance energy transfer）プローブとハイブ
リダイゼーションする。このときフラップのＳＮＰ部位
がＦＲＥＴ自身のハイブリダイゼーション部位に侵入
し、クリアベース（Cleavase）は再びこの構造を認識し
て蛍光色素部分を切断するため蛍光色素はクエンチャー
と離れ蛍光を発するようになり、ＳＮＰを検出すること
ができるというものである。
【０００６】しかしながら、上記の方法では遊離したフ
ラップを検出するために、５'側が自分自身でハイブリ
ダイゼーションできる相補的な塩基配列と、その５'末
端に蛍光色素が標識されその上流にクエンチャーが結合
しているＦＲＥＴプローブとが必要なことから、プロー
ブ作製のためのコストが非常に高いことが欠点である。
ラップを検出するために、５'側が自分自身でハイブリ
ダイゼーションできる相補的な塩基配列と、その５'末
端に蛍光色素が標識されその上流にクエンチャーが結合
しているＦＲＥＴプローブとが必要なことから、プロー
ブ作製のためのコストが非常に高いことが欠点である。
【０００７】他方、本発明者は、酵素や枝分かれしたＤ
ＮＡを用いずに、効率よくプローブの増幅を行うことが
できるようにした画期的なプローブ自己集合体の作製方
法、すなわちＰＡＬＳＡＲ法を発明し、既に提案してい
る。（ＵＳＰ６，２６１，８４６、特開２０００−２０
１６８７号及びＥＰ１，００２，８７７Ａ参照。）
ＮＡを用いずに、効率よくプローブの増幅を行うことが
できるようにした画期的なプローブ自己集合体の作製方
法、すなわちＰＡＬＳＡＲ法を発明し、既に提案してい
る。（ＵＳＰ６，２６１，８４６、特開２０００−２０
１６８７号及びＥＰ１，００２，８７７Ａ参照。）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】上記した従来技術の現
状に鑑み、本発明者は上記したＰＡＬＳＡＲ法を用いて
新規な遺伝子の検出方法を創出すべく、鋭意研究を重ね
た処、図４に示すようにＰＡＬＳＡＲ法で使用する一対
のプローブは、図５に示すようにハイブリダイゼーショ
ン反応の温度に依存して矢印の如く自己集合体が形成さ
れるが、他方、図６に示したように一対のプローブの一
方にターゲット遺伝子と相補的になるようにデザインし
たシグナル・プローブをあらかじめ結合させておくと、
図７に示したようにハイブリダイゼーション反応のどの
温度においても自己集合体は形成されないことが分かっ
た。
状に鑑み、本発明者は上記したＰＡＬＳＡＲ法を用いて
新規な遺伝子の検出方法を創出すべく、鋭意研究を重ね
た処、図４に示すようにＰＡＬＳＡＲ法で使用する一対
のプローブは、図５に示すようにハイブリダイゼーショ
ン反応の温度に依存して矢印の如く自己集合体が形成さ
れるが、他方、図６に示したように一対のプローブの一
方にターゲット遺伝子と相補的になるようにデザインし
たシグナル・プローブをあらかじめ結合させておくと、
図７に示したようにハイブリダイゼーション反応のどの
温度においても自己集合体は形成されないことが分かっ
た。
【０００９】このことから、ＰＡＬＳＡＲ法で使用する
一対のプローブ（ＨＣＰ）の性質と上記インベーダー法
で使用しているフラップ・エンドヌクレアーゼを組合せ
ることにより、ＳＮＰ（一塩基多形）を容易に検出する
ことができることを見出し本提案に及ぶものである。
一対のプローブ（ＨＣＰ）の性質と上記インベーダー法
で使用しているフラップ・エンドヌクレアーゼを組合せ
ることにより、ＳＮＰ（一塩基多形）を容易に検出する
ことができることを見出し本提案に及ぶものである。
【００１０】本発明は、ＰＡＬＳＡＲ法で使用するＨＣ
Ｐを上記インベーダー法におけるシグナル・プローブの
フラップ部分とすることにより、ＦＲＥＴプローブを必
要とせず、もう一方のＨＣＰを加えるだけで自己集合体
が形成されるので、低コストでＳＮＰ（一塩基多形）を
検出することができる遺伝子の検出方法を提供すること
を目的とする。
Ｐを上記インベーダー法におけるシグナル・プローブの
フラップ部分とすることにより、ＦＲＥＴプローブを必
要とせず、もう一方のＨＣＰを加えるだけで自己集合体
が形成されるので、低コストでＳＮＰ（一塩基多形）を
検出することができる遺伝子の検出方法を提供すること
を目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明の遺伝子の検出方法は、お互いに相補的な部
分がｎ（ｎ≧３）カ所の数から構成される一対のプロー
ブ（ＨＣＰ）の複数対を用いて、互い違いに交差するよ
うにハイブリダイゼーションさせることにより、２本鎖
の自己集合体を形成させるプローブ自己集合体の作製方
法を用い、使用する一対のプローブの片側の３'末端
に、ＳＮＰ（一塩基多形）があるターゲット遺伝子と相
補的になるようにデザインしたシグナル・プローブをあ
らかじめ結合させておき、インベーダー・プローブと一
緒にターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションした
後、インベーダー法で使用するフラップ・エンドヌクレ
アーゼによりターゲット遺伝子とハイブリダイゼーショ
ンしたプローブを切断し、上記プローブ自己集合体の作
製方法で使用する完全なプローブを形成させ、２本鎖の
自己集合体を形成させることにより遺伝子を検出するこ
とを特徴とする。
に、本発明の遺伝子の検出方法は、お互いに相補的な部
分がｎ（ｎ≧３）カ所の数から構成される一対のプロー
ブ（ＨＣＰ）の複数対を用いて、互い違いに交差するよ
うにハイブリダイゼーションさせることにより、２本鎖
の自己集合体を形成させるプローブ自己集合体の作製方
法を用い、使用する一対のプローブの片側の３'末端
に、ＳＮＰ（一塩基多形）があるターゲット遺伝子と相
補的になるようにデザインしたシグナル・プローブをあ
らかじめ結合させておき、インベーダー・プローブと一
緒にターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションした
後、インベーダー法で使用するフラップ・エンドヌクレ
アーゼによりターゲット遺伝子とハイブリダイゼーショ
ンしたプローブを切断し、上記プローブ自己集合体の作
製方法で使用する完全なプローブを形成させ、２本鎖の
自己集合体を形成させることにより遺伝子を検出するこ
とを特徴とする。
【００１２】上記ターゲット遺伝子に一本鎖のＤＮＡま
たはＲＮＡを用いることができる。
たはＲＮＡを用いることができる。
【００１３】上記ターゲット遺伝子に二本鎖のＤＮＡま
たはＲＮＡを用いることができる。
たはＲＮＡを用いることができる。
【００１４】上記あらかじめ結合されるシグナル・プロ
ーブの一部分がＳＮＰ（一塩基多形）と相補的になるよ
うにデザインされることが好ましい。
ーブの一部分がＳＮＰ（一塩基多形）と相補的になるよ
うにデザインされることが好ましい。
【００１５】上記ハイブリダイゼーションの反応温度を
制御する機器を使用することが好ましい。
制御する機器を使用することが好ましい。
【００１６】
【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態を添付
図面に基づいて説明するが、これらの実施の形態は例示
的に示されるもので、本発明の技術の技術思想から逸脱
しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。
図面に基づいて説明するが、これらの実施の形態は例示
的に示されるもので、本発明の技術の技術思想から逸脱
しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。
【００１７】なお、図面において、先端矢印は３'末端
を示し、基端黒丸印は５'末端を示すものである。
を示し、基端黒丸印は５'末端を示すものである。
【００１８】図１〜図３は、本発明の遺伝子の検出方法
の実施の形態を原理的に示す模式図である。図１（ａ）
に示したように、ＳＮＰ（一塩基多形）を含む部位
（Ｉ’領域）を含むターゲット遺伝子と相補的な１領域
（Ｉ領域、シグナル・プローブ）が３'末端に追加され
ているＨＣＰと、ＳＮＰ（一塩基多形）の近傍にハイブ
リダイゼーションするインベーダー・プローブを用い
て、１領域が追加されたＨＣＰとインベーダー・プロー
ブを図１（ｂ）のようにターゲット遺伝子に対してハイ
ブリダイゼーションさせる。
の実施の形態を原理的に示す模式図である。図１（ａ）
に示したように、ＳＮＰ（一塩基多形）を含む部位
（Ｉ’領域）を含むターゲット遺伝子と相補的な１領域
（Ｉ領域、シグナル・プローブ）が３'末端に追加され
ているＨＣＰと、ＳＮＰ（一塩基多形）の近傍にハイブ
リダイゼーションするインベーダー・プローブを用い
て、１領域が追加されたＨＣＰとインベーダー・プロー
ブを図１（ｂ）のようにターゲット遺伝子に対してハイ
ブリダイゼーションさせる。
【００１９】この場合は、ＨＣＰの部分（Ｘ領域、Ｙ領
域及びＺ領域よりなる）がインベーダー法で言うところ
のフラップに相当する。
域及びＺ領域よりなる）がインベーダー法で言うところ
のフラップに相当する。
【００２０】次に、図２（ｃ）に示したように、このＳ
ＮＰの部位の３重鎖を認識して切断するフラップ・エン
ドヌクレアーゼを加えることにより、自己集合体の形成
が可能なＨＣＰ（Ｘ領域、Ｙ領域及びＺ領域よりなる）
が遊離〔図３（ｄ）〕する。
ＮＰの部位の３重鎖を認識して切断するフラップ・エン
ドヌクレアーゼを加えることにより、自己集合体の形成
が可能なＨＣＰ（Ｘ領域、Ｙ領域及びＺ領域よりなる）
が遊離〔図３（ｄ）〕する。
【００２１】遊離したＨＣＰは、新たに加えられたＨＣ
Ｐ（Ｘ'領域，Ｙ'領域及びＺ'領域よりなる）と反応
し、ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い、図３（ｅ）のように
自己集合体を形成することができるので、自己集合体の
存在を確認することにより、簡単に遺伝子を検出するこ
とができる。
Ｐ（Ｘ'領域，Ｙ'領域及びＺ'領域よりなる）と反応
し、ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い、図３（ｅ）のように
自己集合体を形成することができるので、自己集合体の
存在を確認することにより、簡単に遺伝子を検出するこ
とができる。
【００２２】このようにして形成された自己集合体は、
一般的なアガロースゲル電気泳動法等により簡単に確認
することができる。
一般的なアガロースゲル電気泳動法等により簡単に確認
することができる。
【００２３】
【発明の効果】以上述べたごとく、本発明の遺伝子の検
出方法によれば、ＰＡＬＳＡＲ法で使用するＨＣＰを上
記フラップ部分とすることにより、ＦＲＥＴプローブを
必要とせず、もう一方のＨＣＰを加えるだけで自己集合
体が形成されるので、低コストでＳＮＰ（一塩基多形）
を検出することができるという著大なる効果を奏する。
出方法によれば、ＰＡＬＳＡＲ法で使用するＨＣＰを上
記フラップ部分とすることにより、ＦＲＥＴプローブを
必要とせず、もう一方のＨＣＰを加えるだけで自己集合
体が形成されるので、低コストでＳＮＰ（一塩基多形）
を検出することができるという著大なる効果を奏する。
【図１】 １領域が追加されているＰＡＬＳＡＲ法で使
用する一対のプローブ（ＨＣＰ）を利用したインベーダ
ー法によるＳＮＰの検出の一例を示す模式図であり、
（ａ）はターゲット遺伝子、１領域を追加されているＨ
ＣＰ及びインベーダー・プローブを、（ｂ）はターゲッ
ト遺伝子への１領域が追加されているＨＣＰとインベー
ダー・プローブのハイブリダイゼーションをそれぞれ示
す。
用する一対のプローブ（ＨＣＰ）を利用したインベーダ
ー法によるＳＮＰの検出の一例を示す模式図であり、
（ａ）はターゲット遺伝子、１領域を追加されているＨ
ＣＰ及びインベーダー・プローブを、（ｂ）はターゲッ
ト遺伝子への１領域が追加されているＨＣＰとインベー
ダー・プローブのハイブリダイゼーションをそれぞれ示
す。
【図２】 １領域が追加されているＰＡＬＳＡＲ法で使
用する一対のプローブ（ＨＣＰ）を利用したインベーダ
ー法によるＳＮＰの検出の一例を示す模式図であり、
（ｂ）はターゲット遺伝子への１領域が追加されている
ＨＣＰとインベーダー・プローブのハイブリダイゼーシ
ョンを、（ｃ）はフラップ・エンドヌクレアーゼの添加
によるＨＣＰの遊離をそれぞれ示す。
用する一対のプローブ（ＨＣＰ）を利用したインベーダ
ー法によるＳＮＰの検出の一例を示す模式図であり、
（ｂ）はターゲット遺伝子への１領域が追加されている
ＨＣＰとインベーダー・プローブのハイブリダイゼーシ
ョンを、（ｃ）はフラップ・エンドヌクレアーゼの添加
によるＨＣＰの遊離をそれぞれ示す。
【図３】 １領域が追加されているＰＡＬＳＡＲ法で使
用する一対のプローブ（ＨＣＰ）を利用したインベーダ
ー法によるＳＮＰの検出の一例を示す模式図であり、
（ｄ）は遊離したＨＣＰを、（ｅ）は遊離したＨＣＰと
新たに添加されたＨＣＰによる自己集合体の形成をそれ
ぞれ示す。
用する一対のプローブ（ＨＣＰ）を利用したインベーダ
ー法によるＳＮＰの検出の一例を示す模式図であり、
（ｄ）は遊離したＨＣＰを、（ｅ）は遊離したＨＣＰと
新たに添加されたＨＣＰによる自己集合体の形成をそれ
ぞれ示す。
【図４】 ＰＡＬＳＡＲ法で使用する一対のプローブ
（ＨＣＰ）の一例を示す模式的説明図である。
（ＨＣＰ）の一例を示す模式的説明図である。
【図５】 ＰＡＬＳＡＲ法で使用する一対のプローブ
（ＨＣＰ）が、ハイブリダイゼーション反応の温度に依
存して矢印の如く自己集合体を形成することを示すアガ
ロースゲル電気泳動法写真である。
（ＨＣＰ）が、ハイブリダイゼーション反応の温度に依
存して矢印の如く自己集合体を形成することを示すアガ
ロースゲル電気泳動法写真である。
【図６】 ＰＡＬＳＡＲ法で使用する一対のプローブ
（ＨＣＰ）の一方にターゲット遺伝子と相補的になるよ
うにデザインしたシグナル・プローブを予め結合させた
場合の一例を示す模式的説明図である。
（ＨＣＰ）の一方にターゲット遺伝子と相補的になるよ
うにデザインしたシグナル・プローブを予め結合させた
場合の一例を示す模式的説明図である。
【図７】 ＰＡＬＳＡＲ法で使用する一対のプローブ
（ＨＣＰ）の一方にターゲット遺伝子と相補的になるよ
うにデザインしたプローブを予め結合させた場合には、
ハイブリダイゼーション反応のどの温度においても自己
集合体は形成されないことを示すアガロースゲル電気泳
動法写真である。
（ＨＣＰ）の一方にターゲット遺伝子と相補的になるよ
うにデザインしたプローブを予め結合させた場合には、
ハイブリダイゼーション反応のどの温度においても自己
集合体は形成されないことを示すアガロースゲル電気泳
動法写真である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１２月２４日（２００２．１２．
２４）
２４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２１】遊離したＨＣＰは、新たに加えられたＨＣ
Ｐ（Ｘ'領域，Ｙ'領域及びＺ'領域よりなる）と反応
し、ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い、図３（ｅ）のように
自己集合体を形成することができるので、自己集合体の
存在を確認することにより、簡単に遺伝子を検出するこ
とができる。このようにして形成された自己集合体は、
一般的なアガロースゲル電気泳動法等により簡単に確認
することができる。
Ｐ（Ｘ'領域，Ｙ'領域及びＺ'領域よりなる）と反応
し、ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い、図３（ｅ）のように
自己集合体を形成することができるので、自己集合体の
存在を確認することにより、簡単に遺伝子を検出するこ
とができる。このようにして形成された自己集合体は、
一般的なアガロースゲル電気泳動法等により簡単に確認
することができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】
【発明の効果】以上述べたごとく、本発明の遺伝子の検
出方法によれば、ＰＡＬＳＡＲ法で使用するＨＣＰを上
記フラップ部分とすることにより、ＦＲＥＴプローブを
必要とせず、もう一方のＨＣＰを加えるだけで自己集合
体が形成されるので、低コストでＳＮＰ（一塩基多形）
を検出することができるという著大なる効果を奏する。
出方法によれば、ＰＡＬＳＡＲ法で使用するＨＣＰを上
記フラップ部分とすることにより、ＦＲＥＴプローブを
必要とせず、もう一方のＨＣＰを加えるだけで自己集合
体が形成されるので、低コストでＳＮＰ（一塩基多形）
を検出することができるという著大なる効果を奏する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Sanko Junyaku Co., Ltd.
<120> Gene Detecting Method
<130> 76207-P
<140> JP2001-310895
<141> 2001-10-09
<160> 3
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic
<400> 1
gaataagtca tagctcataa aggactggtc gctcgacatc gtcctaggga gattcg
56
<210> 2
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic
<400> 2
tatgagctat gacttattcg tcgagcgacc agtccttcga atctccctag gacgat
56
<210> 3
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic
<400> 3
gaataagtca tagctcataa aggactggtc gctcgacatc gtcctaggga gattcgaccg 60
actgaattgg cctgta
76
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 波木井 千雅子
千葉県柏市あけぼの４−３−27 ハイム・
デンマー502
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA09 CA11 HA14
4B063 QA01 QQ42 QQ52 QR14 QR32
QR35 QR55 QS34
Claims (5)
- 【請求項１】 お互いに相補的な部分がｎ（ｎ≧３）カ
所の数から構成される一対のプローブの複数対を用い
て、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーション
させることにより、２本鎖の自己集合体を形成させるプ
ローブ自己集合体の作製方法を用い、使用する一対のプ
ローブの片側の３'末端に、ＳＮＰ（一塩基多形）があ
るターゲット遺伝子と相補的になるようにデザインした
シグナル・プローブをあらかじめ結合させておき、イン
ベーダー・プローブと一緒にターゲット遺伝子とハイブ
リダイゼーションした後、インベーダー法で使用するフ
ラップ・エンドヌクレアーゼによりターゲット遺伝子と
ハイブリダイゼーションしたプローブを切断し、前記プ
ローブ自己集合体の作製方法で使用する完全なプローブ
を形成させ、２本鎖の自己集合体を形成させることによ
り遺伝子を検出することを特徴とする遺伝子の検出方
法。 - 【請求項２】 前記ターゲット遺伝子に一本鎖のＤＮＡ
またはＲＮＡを用いることを特徴とする請求項１記載の
方法。 - 【請求項３】 前記ターゲット遺伝子に二本鎖のＤＮＡ
またはＲＮＡを用いることを特徴とする請求項１記載の
方法。 - 【請求項４】 前記あらかじめ結合されるシグナル・プ
ローブの一部分がＳＮＰ（一塩基多形）と相補的になる
ようにデザインされることを特徴とする請求項１〜請求
項３のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項５】 前記ハイブリダイゼーションの反応温度
を制御する機器を使用することを特徴とする請求項１〜
請求項４のいずれか１項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001310895A JP2003116598A (ja) | 2001-10-09 | 2001-10-09 | 遺伝子の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001310895A JP2003116598A (ja) | 2001-10-09 | 2001-10-09 | 遺伝子の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003116598A true JP2003116598A (ja) | 2003-04-22 |
Family
ID=19129811
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001310895A Pending JP2003116598A (ja) | 2001-10-09 | 2001-10-09 | 遺伝子の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003116598A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009054320A1 (ja) * | 2007-10-24 | 2009-04-30 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | 核酸プローブ及びプローブポリマーの形成方法 |
| EP3851527A4 (en) * | 2018-09-11 | 2022-08-03 | Sekisui Medical Co., Ltd. | METHOD FOR DETECTION AND METHOD FOR QUANTIFICATION OF OLIGONUCLEOTIDES |
| US11993806B2 (en) | 2018-09-11 | 2024-05-28 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Method of detecting or method of quantifying oligonucleotides |
-
2001
- 2001-10-09 JP JP2001310895A patent/JP2003116598A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009054320A1 (ja) * | 2007-10-24 | 2009-04-30 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | 核酸プローブ及びプローブポリマーの形成方法 |
| JPWO2009054320A1 (ja) * | 2007-10-24 | 2011-03-03 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | 核酸プローブ及びプローブポリマーの形成方法 |
| EP3851527A4 (en) * | 2018-09-11 | 2022-08-03 | Sekisui Medical Co., Ltd. | METHOD FOR DETECTION AND METHOD FOR QUANTIFICATION OF OLIGONUCLEOTIDES |
| US11993806B2 (en) | 2018-09-11 | 2024-05-28 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Method of detecting or method of quantifying oligonucleotides |
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