JP2020530779A5 - - Google Patents
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Description
別の好適な実施形態において、Cas12bタンパク質は、AacCas12bからなる群から選択される。
本発明の範囲内で、本発明の上述の技術的特徴及び以下に(例えば、実施例において)詳細に説明する技術的特徴を互いに組み合わせて、新たなまたは好ましい技術的解決策を形成できることを理解されたい。長さによる制限のため、ここではこれ以上繰り返さない。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
標的核酸分子の検出方法であって、ガイドRNA、Casタンパク質、核酸プローブ、及び緩衝溶液を、検出される前記標的核酸分子を含む系に添加し、次いで、前記核酸プローブを検出することを含む、前記方法。
(項目2)
前記Casタンパク質が、Cas12aであるか、またはCas12aのものと類似のコラテラル一本鎖DNA切断活性を有するCasタンパク質であり、
前記Cas12aが、好ましくはFnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a、またはLb4Cas12aのうちの1つであり、前記Cas12aが、好ましくはLbCas12aである、
項目1に記載の標的核酸分子の検出方法。
(項目3)
前記ガイドRNAが、前記Casタンパク質を標的DNAに特異的に結合するように誘導するRNAを指す、項目1に記載の標的核酸分子の検出方法。
(項目4)
前記核酸プローブが一本鎖DNAであり、前記一本鎖DNAが好ましくは蛍光標識された一本鎖DNAであり、前記一本鎖DNAが好ましくは5’末端を蛍光基HEXで標識され、3’末端を消光基BHQ1で標識された蛍光プローブであり、好ましくは
前記核酸プローブの検出方法が好ましくは蛍光検出方法であり、前記蛍光検出方法が、好ましくはマイクロプレートリーダーまたは蛍光分光光度計を用いた検出方法である、
項目1に記載の標的核酸分子の検出方法。
(項目5)
検出される前記標的核酸分子の前記反応系において検出される前記標的核酸分子が、増幅により得られる、項目1〜4のいずれか1項に記載の標的核酸分子の検出方法。
(項目6)
病原微生物、遺伝子変異、または特定の標的DNAを検出することができる、項目5に記載の標的核酸分子の検出方法。
(項目7)
前記Casタンパク質が、Cas12b(すなわち、C2c1)を含む、項目1に記載の方法。
(項目8)
標的核酸分子の検出方法におけるCasタンパク質の使用。
(項目9)
標的DNA、ガイドRNA、及びCasタンパク質が三元複合体を形成する場合、前記複合体が系内の他の一本鎖DNA分子を切断し、好ましくは、前記ガイドRNAが前記標的DNAに特異的に結合するように前記Casタンパク質を誘導するRNAを指す、項目8に記載の使用。
(項目10)
ガイドRNA、Casタンパク質、及び核酸プローブを含む、標的核酸分子を検出するためのキット。
(項目11)
標的核酸分子を検出するための検出系であって、
(a)Cas12aであるか、または前記Cas12aのものと類似のコラテラル一本鎖DNA切断活性を有するCasタンパク質である、Casタンパク質と、
(b)前記標的核酸分子に特異的に結合するように前記Casタンパク質を誘導するガイドRNAと、
(c)一本鎖DNAである核酸プローブと、を含み、
前記標的核酸分子が、標的DNAである、前記検出系。
(項目12)
Cas12aのものと類似のコラテラル一本鎖DNA切断活性を有する前記Casタンパク質が、Cas12b(すなわち、C2c1)からなる群から選択される、項目11に記載の検出系。
(項目13)
前記核酸プローブが、検出可能な標識を有する一本鎖DNAを含む、項目11に記載の検出系。
(項目14)
標的核酸分子を検出するためのキットであって、
i)第1の容器、及び前記第1の容器内のCasタンパク質であって、前記Casタンパク質がCas12a、または前記Cas12aのものと類似のコラテラル一本鎖DNA切断活性を有するCasタンパク質である、前記第1の容器内のCasタンパク質と、
ii)任意の第2の容器、及び前記第2の容器内のガイドRNAであって、前記ガイドRNAが前記標的核酸分子に特異的に結合するように前記Casタンパク質を誘導する、前記第2の容器内のガイドRNAと、
iii)第3の容器、及び前記第3の容器内の核酸プローブと、
iv)任意の第4の容器、及び前記第4の容器内の緩衝溶液と、を含み、
前記標的核酸分子が、標的DNAである、前記キット。
(項目15)
試料中に標的核酸分子が存在するかどうかを検出するための方法であって、以下の工程:
(a)項目11に記載の標的核酸分子を検出するための検出系を提供する工程であって、前記検出系が、検出される試料をさらに含む、前記提供する工程と、
(b)前記検出系の前記核酸プローブがCasタンパク質によって切断されているかどうかを検出する工程であって、前記切断が、コラテラル一本鎖DNAのトランス切断である、前記検出する工程と、を含み、
前記核酸プローブが前記Casタンパク質によって切断される場合、それは前記試料中の前記標的核酸分子の存在を示し、前記核酸プローブが前記Casタンパク質によって切断されない場合、それは前記試料中に前記標的核酸分子が存在しないことを示す、
前期検出するための方法。
(項目16)
前記核酸を増幅するための方法が、PCR増幅、LAMP増幅、RPA増幅、リガーゼ連鎖反応、分岐DNA増幅、NASBA、SDA、転写介在増幅、ローリングサークル増幅、HDA、SPIA、NEAR、TMA、及びSMAP2からなる群から選択される、項目15に記載の方法。
(項目17)
標的部位の上流及び下流(−20nt〜+20ntの範囲、好ましくは−15nt〜+15ntの範囲、より好ましくは−10nt〜+10ntの範囲)がPAM配列を欠く場合、PAM導入プライマーを用いて核酸増幅を実施する、項目15に記載の方法。
(項目18)
前記PAM導入プライマーが、5’−3’中に式I
P1−P2−P3(I)
の構造を有し、
式中、
P1は、5’末端に位置し、前記標的核酸分子の配列に相補的または非相補的である5’セグメント配列であり、
P2は、PAM配列であり、
P3は、3’末端に位置し、前記標的核酸分子の配列に相補的である3’セグメント配列である、
項目17に記載の方法。
(項目19)
前記標的部位の上流及び下流(−20nt〜+20ntの範囲、好ましくは−15nt〜+15ntの範囲、より好ましくは−10nt〜+10ntの範囲)が前記PAM配列を含む場合、前記PAM配列を含むかまたは含まないプライマーを使用することができ、前記増幅産物が前記PAM配列を含む、項目15に記載の方法。
(項目20)
コラテラル一本鎖DNA切断に基づいて標的核酸分子を検出するための、検出試薬の調製またはキットにおけるCasタンパク質の使用であって、前記Casタンパク質が、Cas12aであるか、または前記Cas12aのものと類似のコラテラル一本鎖DNA切断活性を有するCasタンパク質である、前記使用。
(項目21)
前記Cas12aのものと類似のコラテラル一本鎖DNA切断活性を有する前記Casタンパク質が、Cas12b(またはC2c1)からなる群から選択される、項目20に記載の使用。
本発明の範囲内で、本発明の上述の技術的特徴及び以下に(例えば、実施例において)詳細に説明する技術的特徴を互いに組み合わせて、新たなまたは好ましい技術的解決策を形成できることを理解されたい。長さによる制限のため、ここではこれ以上繰り返さない。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
標的核酸分子の検出方法であって、ガイドRNA、Casタンパク質、核酸プローブ、及び緩衝溶液を、検出される前記標的核酸分子を含む系に添加し、次いで、前記核酸プローブを検出することを含む、前記方法。
(項目2)
前記Casタンパク質が、Cas12aであるか、またはCas12aのものと類似のコラテラル一本鎖DNA切断活性を有するCasタンパク質であり、
前記Cas12aが、好ましくはFnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a、またはLb4Cas12aのうちの1つであり、前記Cas12aが、好ましくはLbCas12aである、
項目1に記載の標的核酸分子の検出方法。
(項目3)
前記ガイドRNAが、前記Casタンパク質を標的DNAに特異的に結合するように誘導するRNAを指す、項目1に記載の標的核酸分子の検出方法。
(項目4)
前記核酸プローブが一本鎖DNAであり、前記一本鎖DNAが好ましくは蛍光標識された一本鎖DNAであり、前記一本鎖DNAが好ましくは5’末端を蛍光基HEXで標識され、3’末端を消光基BHQ1で標識された蛍光プローブであり、好ましくは
前記核酸プローブの検出方法が好ましくは蛍光検出方法であり、前記蛍光検出方法が、好ましくはマイクロプレートリーダーまたは蛍光分光光度計を用いた検出方法である、
項目1に記載の標的核酸分子の検出方法。
(項目5)
検出される前記標的核酸分子の前記反応系において検出される前記標的核酸分子が、増幅により得られる、項目1〜4のいずれか1項に記載の標的核酸分子の検出方法。
(項目6)
病原微生物、遺伝子変異、または特定の標的DNAを検出することができる、項目5に記載の標的核酸分子の検出方法。
(項目7)
前記Casタンパク質が、Cas12b(すなわち、C2c1)を含む、項目1に記載の方法。
(項目8)
標的核酸分子の検出方法におけるCasタンパク質の使用。
(項目9)
標的DNA、ガイドRNA、及びCasタンパク質が三元複合体を形成する場合、前記複合体が系内の他の一本鎖DNA分子を切断し、好ましくは、前記ガイドRNAが前記標的DNAに特異的に結合するように前記Casタンパク質を誘導するRNAを指す、項目8に記載の使用。
(項目10)
ガイドRNA、Casタンパク質、及び核酸プローブを含む、標的核酸分子を検出するためのキット。
(項目11)
標的核酸分子を検出するための検出系であって、
(a)Cas12aであるか、または前記Cas12aのものと類似のコラテラル一本鎖DNA切断活性を有するCasタンパク質である、Casタンパク質と、
(b)前記標的核酸分子に特異的に結合するように前記Casタンパク質を誘導するガイドRNAと、
(c)一本鎖DNAである核酸プローブと、を含み、
前記標的核酸分子が、標的DNAである、前記検出系。
(項目12)
Cas12aのものと類似のコラテラル一本鎖DNA切断活性を有する前記Casタンパク質が、Cas12b(すなわち、C2c1)からなる群から選択される、項目11に記載の検出系。
(項目13)
前記核酸プローブが、検出可能な標識を有する一本鎖DNAを含む、項目11に記載の検出系。
(項目14)
標的核酸分子を検出するためのキットであって、
i)第1の容器、及び前記第1の容器内のCasタンパク質であって、前記Casタンパク質がCas12a、または前記Cas12aのものと類似のコラテラル一本鎖DNA切断活性を有するCasタンパク質である、前記第1の容器内のCasタンパク質と、
ii)任意の第2の容器、及び前記第2の容器内のガイドRNAであって、前記ガイドRNAが前記標的核酸分子に特異的に結合するように前記Casタンパク質を誘導する、前記第2の容器内のガイドRNAと、
iii)第3の容器、及び前記第3の容器内の核酸プローブと、
iv)任意の第4の容器、及び前記第4の容器内の緩衝溶液と、を含み、
前記標的核酸分子が、標的DNAである、前記キット。
(項目15)
試料中に標的核酸分子が存在するかどうかを検出するための方法であって、以下の工程:
(a)項目11に記載の標的核酸分子を検出するための検出系を提供する工程であって、前記検出系が、検出される試料をさらに含む、前記提供する工程と、
(b)前記検出系の前記核酸プローブがCasタンパク質によって切断されているかどうかを検出する工程であって、前記切断が、コラテラル一本鎖DNAのトランス切断である、前記検出する工程と、を含み、
前記核酸プローブが前記Casタンパク質によって切断される場合、それは前記試料中の前記標的核酸分子の存在を示し、前記核酸プローブが前記Casタンパク質によって切断されない場合、それは前記試料中に前記標的核酸分子が存在しないことを示す、
前期検出するための方法。
(項目16)
前記核酸を増幅するための方法が、PCR増幅、LAMP増幅、RPA増幅、リガーゼ連鎖反応、分岐DNA増幅、NASBA、SDA、転写介在増幅、ローリングサークル増幅、HDA、SPIA、NEAR、TMA、及びSMAP2からなる群から選択される、項目15に記載の方法。
(項目17)
標的部位の上流及び下流(−20nt〜+20ntの範囲、好ましくは−15nt〜+15ntの範囲、より好ましくは−10nt〜+10ntの範囲)がPAM配列を欠く場合、PAM導入プライマーを用いて核酸増幅を実施する、項目15に記載の方法。
(項目18)
前記PAM導入プライマーが、5’−3’中に式I
P1−P2−P3(I)
の構造を有し、
式中、
P1は、5’末端に位置し、前記標的核酸分子の配列に相補的または非相補的である5’セグメント配列であり、
P2は、PAM配列であり、
P3は、3’末端に位置し、前記標的核酸分子の配列に相補的である3’セグメント配列である、
項目17に記載の方法。
(項目19)
前記標的部位の上流及び下流(−20nt〜+20ntの範囲、好ましくは−15nt〜+15ntの範囲、より好ましくは−10nt〜+10ntの範囲)が前記PAM配列を含む場合、前記PAM配列を含むかまたは含まないプライマーを使用することができ、前記増幅産物が前記PAM配列を含む、項目15に記載の方法。
(項目20)
コラテラル一本鎖DNA切断に基づいて標的核酸分子を検出するための、検出試薬の調製またはキットにおけるCasタンパク質の使用であって、前記Casタンパク質が、Cas12aであるか、または前記Cas12aのものと類似のコラテラル一本鎖DNA切断活性を有するCasタンパク質である、前記使用。
(項目21)
前記Cas12aのものと類似のコラテラル一本鎖DNA切断活性を有する前記Casタンパク質が、Cas12b(またはC2c1)からなる群から選択される、項目20に記載の使用。
Claims (52)
- 標的核酸分子の検出方法であって、ガイドRNA、Casタンパク質、核酸プローブ、及び緩衝溶液を、前記標的核酸分子を含む系に添加する工程と、次いで、前記核酸プローブの切断を検出する工程とを含む、方法。
- 前記Casタンパク質が、コラテラル一本鎖DNA切断活性を有し、前記核酸プローブが、一本鎖DNAを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ガイドRNAが、前記Casタンパク質を前記標的核酸分子に特異的に結合するように誘導する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記核酸プローブが、検出可能な標識を有する一本鎖DNAを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸分子が増幅される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Casタンパク質が、Cas12タンパク質である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Cas12タンパク質が、FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a、Lb4Cas12aおよびCas12b(すなわち、C2c1)からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記核酸プローブを検出することが、蛍光検出方法を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸プローブが、蛍光標識を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸プローブが、5’末端に蛍光基HEXを、3’末端に消光基BHQ1を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸分子を増幅する工程をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸分子を増幅する工程が、PCR増幅、LAMP増幅、RPA増幅、リガーゼ連鎖反応、分岐DNA増幅、NASBA、SDA、転写介在増幅、ローリングサークル増幅、HDA、SPIA、NEAR、TMA、またはSMAP2を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記標的核酸分子が、プライマーを用いて増幅され、少なくとも1つのプライマーは、PAM配列を含む、請求項11または12に記載の方法。
- 前記標的核酸分子が、病原体にのみ見いだされる配列を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸分子が、ヒトまたは他の種における一塩基多型(SNP)部位を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸分子が、遺伝子変異を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ガイドRNAが、長さが15nt、16ntまたは17ntのcrRNAを含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 検出系であって、
(a)Casタンパク質と、
(b)標的核酸分子と、
(c)前記標的核酸分子に特異的に結合するように前記Casタンパク質を誘導するガイドRNAと、
(d)一本鎖DNAを含む核酸プローブと
を含む、検出系。 - 前記Casタンパク質が、コラテラル一本鎖DNA切断活性を有する、請求項18に記載の検出系。
- 前記核酸プローブが、検出可能な標識を含む、請求項18または19に記載の検出系。
- 前記Casタンパク質が、Cas12タンパク質である、請求項18〜20のいずれか一項に記載の検出系。
- 前記Cas12タンパク質が、FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a、Lb4Cas12aおよびCas12b(すなわち、C2c1)からなる群から選択される、請求項21に記載の検出系。
- 前記Cas12タンパク質が、LbCas12aである、請求項21に記載の検出系。
- 前記核酸プローブが、蛍光標識を含む、請求項18〜23のいずれか一項に記載の検出系。
- 前記核酸プローブが、5’末端に蛍光基HEXを、3’末端に消光基BHQ1を含む、請求項18〜23のいずれか一項に記載の検出系。
- 前記標的核酸分子が、標的DNAである、請求項18〜25のいずれか一項に記載の検出系。
- 前記標的核酸分子が増幅される、請求項26に記載の検出系。
- 前記標的核酸分子が、PCR増幅、LAMP増幅、RPA増幅、リガーゼ連鎖反応、分岐DNA増幅、NASBA、SDA、転写介在増幅、ローリングサークル増幅、HDA、SPIA、NEAR、TMA、およびSMAP2からなる群から選択される方法によって増幅される、請求項27に記載の検出系。
- 前記標的核酸分子が、プライマーを用いて増幅され、少なくとも1つのプライマーは、PAM配列を含む、請求項27または28に記載の検出系。
- 前記標的核酸分子が、前記ガイドRNAの結合部位の上流または下流のPAM配列を含む、請求項18〜29のいずれか一項に記載の検出系。
- 前記PAM配列が、前記ガイドRNAの前記標的部位の−20nt〜+20nt上流または下流である、請求項30に記載の検出系。
- 前記標的核酸分子が、病原体にのみ見いだされる配列を含む、請求項18〜31のいずれか一項に記載の検出系。
- 前記標的核酸分子が、ヒトまたは他の種における一塩基多型(SNP)部位を含む、請求項18〜31のいずれか一項に記載の検出系。
- 前記標的核酸分子が、遺伝子変異を含む、請求項18〜31のいずれか一項に記載の検出系。
- 前記ガイドRNAが、長さが15nt、16ntまたは17ntのcrRNAを含む、請求項18〜34のいずれか一項に記載の検出系。
- 緩衝液をさらに含む、請求項18〜35のいずれか一項に記載の検出系。
- キットであって、
i)Casタンパク質を含む第1の容器であって、前記Casタンパク質がコラテラル一本鎖DNA切断活性を有する、前記第1の容器と、
ii)ガイドRNAを含む任意の第2の容器であって、前記ガイドRNAが前記標的核酸分子に特異的に結合するように前記Casタンパク質を誘導する、前記第2の容器と、
iii)核酸プローブを含む第3の容器と、
iv)緩衝液を含む任意の第4の容器と、
を含む、キット。 - 前記Casタンパク質が、Cas12タンパク質である、請求項37に記載のキット。
- 前記Cas12タンパク質が、FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a、Lb4Cas12aおよびCas12b(すなわち、C2c1)からなる群から選択される、請求項38に記載のキット。
- 前記Cas12タンパク質が、LbCas12aである、請求項38に記載のキット。
- 前記核酸プローブが、蛍光標識を含む、請求項38〜40のいずれか一項に記載のキット。
- 前記核酸プローブが、5’末端に蛍光基HEXを、3’末端に消光基BHQ1を含む、請求項38〜40のいずれか一項に記載のキット。
- 前記標的核酸分子が、標的DNAである、請求項38〜42のいずれか一項に記載のキット。
- 前記核酸プローブが、一本鎖DNAを含む、請求項38〜42のいずれか一項に記載のキット。
- 前記ガイドRNAが、長さが15nt、16ntまたは17ntのcrRNAを含む、請求項38〜44のいずれか一項に記載のキット。
- 標的核酸分子を検出するための検出試薬またはキットの調製におけるCasタンパク質の使用であって、前記Casタンパク質が、Cas12a、またはCas12aのものと類似のコラテラル一本鎖DNA切断活性を有するCasタンパク質である、使用。
- 前記Casタンパク質が、Cas12タンパク質である、請求項46に記載の使用。
- 前記Cas12タンパク質が、FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a、Lb4Cas12aおよびCas12b(すなわち、C2c1)からなる群から選択される、請求項47に記載の使用。
- 前記Cas12タンパク質が、LbCas12aである、請求項48に記載の使用。
- 前記標的核酸分子が、病原体にのみ見いだされる配列を含む、請求項46〜49のいずれか一項に記載の使用。
- 前記標的核酸分子が、ヒトまたは他の種における一塩基多型(SNP)部位を含む、請求項46〜49のいずれか一項に記載の使用。
- 前記標的核酸分子が、遺伝子変異を含む、請求項46〜49のいずれか一項に記載の使用。
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