JP2018531596A - Rnaガイド型核酸結合タンパク質を使用する分子間近接性検出用の方法および試薬 - Google Patents
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Abstract
Description
本開示の一態様は、RNAガイド型核酸結合タンパク質を含む近接性検出用プローブ複合体を提供する。RNAガイド型核酸結合タンパク質は、CRISPR/Casタンパク質とガイドRNA(gRNA)を含むCRISPR/Cas系であってよい。本明細書で開示する近接性検出用プローブ複合体は、標的核酸へのプローブの結合を誘導するCRISPR/Cas系を含む少なくとも1つのプローブ、および増幅近接性検出アッセイによって結合プローブの検出を容易にする近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む。一般に、近接性検出用オリゴヌクレオチドはCRISPR/Cas系と直接的または間接的に結合する。幾つかの実施形態では、近接性検出用オリゴヌクレオチドを、プローブのCRISPR/Casタンパク質(図1参照)またはガイドRNA(図4参照)と直接結合させることが可能である。他の実施形態では、近接性検出用オリゴヌクレオチドを、CRISPR/Casタンパク質を対象とする抗体と結合させることが可能である(図3参照、ゲノム部位1におけるプローブ)。さらなる実施形態では、近接性検出用オリゴヌクレオチドを抗種族間二次抗体と結合させることが可能であり、近接性検出用プローブ複合体はCRISPR/Casタンパク質を対象とする一次抗体をさらに含む(図5および6参照)。以下で詳述するように、近接性検出用プローブ複合体は追加的プローブをさらに含むことができる。
近接性検出用プローブ複合体は、RNAガイド型核酸結合タンパク質を含む結合部分と少なくとも1つの近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む少なくとも1つのプローブを含む。RNAガイド型核酸結合タンパク質は、CRISPR/Casタンパク質とガイドRNAを含むCRISPR/Cas系であってよい。
本明細書で開示する近接性検出用プローブ複合体は、CRISPR/Cas系を含む少なくとも1つのプローブを含む。CRISPR/Cas系は、非天然で遺伝子操作型の系CRISPR/Cas系であってよい。CRISPR/Cas系は、CRISPR/Casタンパク質とガイドRNAを含む。
CRISPR/Casタンパク質。近接性検出用プローブ複合体のCRISPR/Casタンパク質は、様々な細菌および古細菌において存在する、タイプI(すなわちIA、IB、IC、ID、IE、またはIF)、タイプII(すなわちIIA、IIB、またはIIC)、タイプIII(すなわちIIIAまたはIIIB)、またはタイプVのCRISPR系に由来し得る。CRISPR/Cas系は、ストレプトコッカス種(Streptococcus sp.)(例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス)、カンピロバクター種(Campylobacter sp.)[例えば、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)]、フランシセラ種(Francisella sp.)[例えば、フランシセラ・ノビシダ(Francisella novicida)]、アカリオクロリス種(Acaryochloris sp.)、アセトハロビウム種(Acetohalobium sp.)、アシダミノコッカス種(Acidaminococcus sp.)、アシディチオバチルス種(Acidithiobacillus sp.)、アリシクロバチルス種(Alicyclobacillus sp.)、アロクロマチウム種(Allochromatium sp.)、アモニフェクス種(Ammonifex sp.)、アナバエナ種(Anabaena sp.)、アルスロスピラ種(Arthrospira sp.)、バチルス種(Bacillus sp.)、バークホルデリア種(Burkholderiales sp.)、カルジセルロシルプトー種(Caldicelulosiruptor sp.)、カンジダタス種(Candidatus sp.)、クロストリジウム種(Clostridium sp.)、クロコスファエラ種(Crocosphaera sp.)、シアノゼセ種(Cyanothece sp.)、エクシグオバクテリウム種(Exiguobacterium sp.)、フィネゴルディア種(Finegoldia sp.)、クテドノバクター種(Ktedonobacter sp.)、ラクトバチルス種(Lactobacillus sp.)、リングビア種(Lyngbya sp.)、マリノバクター種(Marinobacter sp.)、メタノハロビウム種(Methanohalobium sp.)、マイクロスシーラ種(Microscilla sp.)、マイクロコレウス種(Microcoleus sp.)、マイクロシスティス種(Microcystis sp.)、ナトラナエロビウス種(Natranaerobius sp.)、ネイセリア種(Neisseria sp.)、ニトロソコッカス種(Nitrosococcus sp.)、ノカルジオプシス種(Nocardiopsis sp.)、ノジュラリア種(Nodularia sp.)、ノストック種(Nostoc sp.)、オスキラトリア種(Oscillatoria sp.)、ポラロモナス種(Polaromonas sp.)、ペロトマクラム種(Pelotomaculum sp.)、シュードアルテロモナス種(Pseudoalteromonas sp.)、ペトロトガ種(Petrotoga sp.)、プレボテラ種(Prevotella sp.)、スタフィロコッカス種(Staphylococcus sp.)、ストレプトマイセス種(Streptomyces sp.)、ストレプトスポランジウム種(Streptosporangium sp.)、シネココッカス種(Synechococcus sp.)、またはサーモシプホ種(Thermosipho sp.)に由来し得る。
適切なCRISPR/Casタンパク質の非制限的な例には、Casタンパク質、Cpfタンパク質、Cmrタンパク質、Csaタンパク質、Csbタンパク質、Cscタンパク質、Cseタンパク質、Csfタンパク質、Csmタンパク質、Csnタンパク質、Csxタンパク質、Csyタンパク質、Cszタンパク質、およびこれらの誘導体または変異体が含まれる。具体的実施形態では、CRISPR/Casタンパク質は、タイプIIのCas9タンパク質、タイプVのCpf1タンパク質、またはこれらの誘導体であってよい。幾つかの実施形態では、CRISPR/Casタンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネスCas9(SpCas9)またはストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)Cas9(StCas9)であってよい。他の実施形態では、CRISPR/Casタンパク質はカンピロバクター・ジェジュニCas9(CjCas9)であってよい。代替実施形態では、CRISPR/Casタンパク質はフランシセラ・ノビシダCas9(FnCas9)であってよい。さらに他の実施形態では、CRISPR/Casタンパク質はフランシセラ・ノビシダCpf1(FnCpf1)であってよい。
近接性検出用プローブ複合体のCRISPR/Cas含有プローブは、近接性検出用オリゴヌクレオチドも含む。近接性検出用オリゴヌクレオチドは、プローブのCRISPR/Cas系と直接的または間接的に結合させることが可能である。
幾つかの実施形態では、近接性検出用プローブ複合体の第1のプローブは、CRISPR/Cas系、および共有または非共有結合によりCRISPR/Cas系のCRISPR/Casタンパク質またはガイドRNAと結合した第1のオリゴヌクレオチドを含む。代替実施形態では、近接性検出用プローブ複合体の第1のプローブは、CRISPR/Cas系、およびCRISPR/Casタンパク質を対象とする抗体と結合した第1のオリゴヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態では、近接性検出用プローブ複合体の第1のプローブは、CRISPR/Cas系、および抗種族間二次抗体と結合した少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含み、複合体はCRISPR/Casタンパク質を対象とする一次抗体をさらに含む。幾つかの実施形態では、CRISPR/Cas系のCRISPR/Casタンパク質はCas9タンパク質である。様々な実施形態では、Cas9タンパク質はヌクレアーゼ活性を有し、ニッカーゼ活性を有し、または修飾されて全ヌクレアーゼ活性を欠いている。幾つかの実施形態では、Cas9タンパク質は修飾されて全ヌクレアーゼ活性を欠いている。他の実施形態では、Cas9タンパク質は少なくとも1つの核局在化シグナルを含む。
一般に近接性検出用プローブ複合体は、1つまたは複数の追加的プローブをさらに含む。第2の(または追加的)プローブは、異なるガイドRNAを含むCRISPR/Cas系であり得る結合部分、およびその配列および/または構造が第1の近接性検出用オリゴヌクレオチドのそれと異なる第2の(または追加的)追加的近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む。例えば、第1または第2の近接性検出用プローブオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの3’末端に1つまたは複数のブロッキングヌクレオチドを含む可能性がある。あるいは、第1または第2の近接性検出用プローブオリゴヌクレオチドは、異なる配列および/または異なるヘアピン構造を含む可能性がある。幾つかの場合、第1および第2の近接性検出用オリゴヌクレオチドは(+)および(−)オリゴヌクレオチドと呼ぶことができる。
本開示の別の態様は、細胞中の内在核酸をin situで検出し視覚化するための方法を包含する。この方法は、RNAガイド型核酸結合タンパク質を含む少なくとも1つのプローブを含む近接性検出用プローブ複合体と細胞を接触させることであって、RNAガイド型核酸結合タンパク質がRNAにより結合用内在核酸にガイドされ、それによって結合型近接性検出用プローブ複合体が形成されること、およびin situ近接性依存増幅反応により結合型近接性検出用プローブ複合体を視覚化して内在核酸を検出することを含む。
本発明の方法は、CRISPR/Cas系を含む少なくとも1つのプローブを含む近接性検出用プローブ複合体と細胞を接触させることを含む。近接性検出用プローブ複合体は前のセクション(I)中に記載する。
本発明の方法は、in situ近接性依存増幅反応により結合型近接性検出用プローブ複合体を視覚化して内在核酸を検出することをさらに含む。in situ近接性依存増幅反応は、近接ライゲーションアッセイ(PLA)、近接性依存初期ハイブリダイゼーション連鎖反応(proxHCR)、または不溶性産物もしくは近接性検出用プローブ複合体と連結した産物を生成する別の増幅方法であってよい。
幾つかの実施形態では、本明細書で開示する方法によって検出される内在核酸は核染色体DNAであり得る。例えば、核DNAにおいて特異的染色体またはゲノム遺伝子座を検出することができる。特異的染色体またはゲノム遺伝子座は、遺伝子のコード領域、遺伝子のイントロン、遺伝子の制御領域、CpG島細胞、遺伝子間のスペーサー領域、非コード領域、セントロメア領域、テロメア領域、トリヌクレオチドリピートを含む領域内などに存在し得る。遺伝子は、タンパク質コード遺伝子またはRNAコード遺伝子であり得る。幾つかの実施形態では、染色体またはゲノム遺伝子座は、疾患または障害と関連した遺伝子の、改変または修飾、例えば欠失、挿入、置換(例えばSNP)、トランスバージョンなどであり得る。一般に、近接性検出用プローブ複合体は、同一染色体においてシスで最大約2kb離れ得る染色体またはゲノム遺伝子座中の2つの異なる部位を標的化する。
様々な細胞を、本明細書で開示する方法中で使用することができる。一般に、細胞は真核生物細胞である。様々な態様では、細胞はヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、または真核生物単細胞であり得る。例示的態様では、細胞は哺乳動物細胞である。細胞は初代細胞または細胞株細胞であり得る。細胞は成体細胞、胚細胞、または幹細胞であり得る。細胞は正常細胞、疾患細胞、またはがん細胞であり得る。
本開示のさらなる態様は細胞中の内在核酸を検出するためのキットを内含し、この場合キットは、セクション(I)(a)中で前に定義したCRISPR/Cas系を含む少なくとも1つのプローブを含む。
他に定義しない限り、本明細書中で使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参照文献は、本発明中で使用する多くの用語の一般的定義を当業者に示す。Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994);TheCambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988);The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991);およびHale and Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。本明細書中で使用する以下の用語は、他に指定しない限り、それらが帰する意味を有する。
セントロメアサテライトDNAはタンデムリピート型、非コード配列の巨大アレイを含み、セントロメアクロマチンはヒストンH3がCENP−Aで置換されている点において特有である(図7参照)。本明細書中で開示する方法を使用してセントロメアを検出できるかどうか決定するため、マイナーサテライト反復配列またはメジャーサテライト反復配列を標的化するCas9系を含むプローブを構築し、近接ライゲーションアッセイ(PLA)[例えば、DUOLINK(登録商標)アッセイ]およびCENP−Aに対する抗体と組み合わせて使用した。
TR1およびTR2は、染色体の末端でテロメア反復配列と結合したタンパク質である(図9A、B参照)。TRF2およびTRF1はテロメア反復配列5’−TTAGGG−3’と結合する。以下の変更点において、実施例1中で前に記載したのと類似した手順を使用して、U2OS細胞においてテロメアを検出した。(a)テロメア反復配列を標的化するcrRNA(5’−UAGGGUUAGGGUUAGGGUUAUGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG−3’、配列番号13)でRNP複合体を構築したこと、および(b)(4℃で終夜)抗Cas9抗体(マウス、Diagenode、1:3000希釈)および抗TRF2抗体(ウサギ、Cell Signalling、1:1000希釈)抗体を用いてPLAアッセイを実施したこと。
U2OS細胞を室温で10分間1%パラホルムアルデヒドを用いて固定し、室温で5分間10分の1体積の1.25Mグリシンを用いてクエンチし、PBSを用いて洗浄した。細胞は浸透処理バッファー(0.75%TritonX100、0.75%Tween20)中で1時間浸透処理し、室温で1時間PLA用ブロッキングバッファーを用いてブロッキングした。組換えdCas9(1pmol)と、マイナーサテライト反復配列、メジャーサテライト反復配列のいずれかを標的化する合成DIG−tracrRNA(2pmol)およびcrRNA(2pmol)、または(如何なる公知のヒト配列も標的化しない)陰性対照1配列を組み合わせることにより、リボヌクレオタンパク質(RNP)複合体としてCRISPRを形成した。DIG−tracrRNAおよびcrRNA配列は表1中に示す。ブロッキング後、PBSを用いて細胞を洗浄した。細胞をPBS(30μL)で覆い、スライドはハイブリダイゼーション用カバー[HYBRISLIP(商標)、GraceBioLabs]で密封し、5分間80℃でスライド(および細胞)をインキュベートすることによって染色体DNAを変性させた。PBSを吸引し、(Cas9バッファー:20mMのHEPES pH7.5、150mMのKCl、1%スクロースで1:10に希釈した)RNPを加え、スライドはハイブリダイゼーション用カバーで密封し、スライドハイブリダイザー[THERMOBRITE(登録商標);Leica Biosystems]において37℃で終夜(16時間)インキュベートした。実施例1においてほぼ前に記載したようにPLA[DUOLINK(登録商標)]アッセイを始める前に、PLA用洗浄バッファーAで(カバージャーにおいてそれぞれ2×5分間)細胞を洗浄した。
精製組換えdCas9(すなわち、D10A/H840A二重突然変異体)は、(標的特異的ゲノム遺伝子座と並んだ)crRNAまたはcrRNAプールおよびtracrRNAと複合体形成してdCas9−ガイドRNA複合体を形成し、これらを使用してゲノム遺伝子座を認識することができる。例えば、1つまたは複数のガイドRNAをAAVS1、EMX1、またはKras中標的部位周辺2kb領域内(すなわち、1kb上流と1kb下流)に設計することができる。ヒトガイドRNA標的(および非標的)を以下に示す。
1.AAVS1−gRNA(標的部位:GGGCCACTAGGGACAGGATTGG;配列番号14)
2.EMX1−gRNA(標的部位:AGTCCGAGCAGAAGAAGAA;配列番号15)
3.Kras−gRNA(標的部位:TAGTTGGAGCTGGTGGCGT;配列番号16)
4.非標的1(標的部位:CGCGATAGCGCGAATATATT;配列番号17)
Claims (27)
- (i)CRISPR/Casタンパク質とガイドRNAを含む遺伝子操作型、非天然のクラスター化規則的配置短回文リピート(CRISPR)関連(Cas)(CRISPR/Cas)系、および(ii)CRISPR/Cas系と直接的または間接的に結合したオリゴヌクレオチドを含む少なくとも1つのプローブを含む複合体。
- CRISPR/Casタンパク質がCas9タンパク質である、請求項1に記載の複合体。
- Cas9タンパク質が2つの機能的ヌクレアーゼドメイン、1つの機能的ヌクレアーゼドメインを含むか、または機能的ヌクレアーゼドメインを含まない、請求項2に記載の複合体。
- (i)CRISPR/Cas系および(ii)共有または非共有結合によりCRISPR/Casタンパク質と結合した第1のオリゴヌクレオチドを含む第1のプローブを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の複合体。
- (i)CRISPR/Cas系および(ii)共有または非共有結合によりガイドRNAと結合した第1のオリゴヌクレオチドを含む第1のプローブを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の複合体。
- (a)第2のCRISPR/Cas系および共有または非共有結合により第2のCRISPR/Cas系のCRISPR/Casタンパク質と結合した第2のオリゴヌクレオチド、(b)第2のCRISPR/Cas系および共有または非共有結合により第2のCRISPR/Cas系のガイドRNAと結合した第2のオリゴヌクレオチド、または(c)核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体および核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体と結合した第2のオリゴヌクレオチドを含む第2のプローブをさらに含む、請求項4または5に記載の複合体。
- (i)CRISPR/Cas系および(ii)CRISPR/Casタンパク質を対象とする一次抗体と結合した第1のオリゴヌクレオチドを含む第1のプローブを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の複合体。
- 核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体、および核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体と結合した第2のオリゴヌクレオチドを含む第2のプローブをさらに含む、請求項7に記載の複合体。
- (i)CRISPR/Cas系、(ii)抗種族間二次抗体と結合した第1および第2のオリゴヌクレオチド、および(iii)CRISPR/Casタンパク質を対象とする一次抗体を含むプローブを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の複合体。
- 少なくとも1つの追加的CRISPR/Cas系をさらに含む、請求項9に記載の複合体。
- オリゴヌクレオチドが一本鎖であるか、および/またはステム、ループ、および/またはヘアピン二次構造を含み、オリゴヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの組合せを含み、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドが標準ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、または2’−O−メチル修飾ヌクレオチドである、請求項1から10のいずれか一項に記載の複合体。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載の複合体を含むキット。
- 細胞中の内在核酸を検出するための方法であって、RNAガイド型核酸結合タンパク質を含む少なくとも1つのプローブを含む近接性検出用プローブ複合体と細胞を接触させることであって、RNAガイド型核酸結合タンパク質がRNAにより結合用内在核酸にガイドされ、それによって結合型近接性検出用プローブ複合体が形成されること、およびin situ近接性依存増幅反応により結合型近接性検出用プローブ複合体を視覚化して内在核酸を検出することを含む方法。
- 近接性検出用プローブ複合体が、(i)CRISPR/Casタンパク質および内在核酸中の第1の部位に標的化されるガイドRNAを含むCRISPR/Cas系、および(ii)CRISPR/Cas系と直接的または間接的に結合した第1の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第1のプローブを含む、請求項13に記載の方法。
- CRISPR/Casタンパク質がCas9タンパク質である、請求項14に記載の方法。
- Cas9タンパク質が2つの機能的ヌクレアーゼドメイン、1つの機能的ヌクレアーゼドメインを含むか、または機能的ヌクレアーゼドメインを含まない、請求項15に記載の方法。
- 第1の近接性検出用オリゴヌクレオチドが共有または非共有結合によりCRISPR/Casタンパク質と結合しているか、または第1の近接性検出用オリゴヌクレオチドが共有または非共有結合によりガイドRNAと結合している、請求項14から16のいずれか一項に記載の方法。
- 近接性検出用プローブ複合体が、(a)内在核酸中の第2の部位を標的化する第2のガイドRNAを含む第2のCRISPR/Cas系および共有または非共有結合により第2のCRISPR/Cas系のCRISPR/Casタンパク質と結合した第2の近接性検出用オリゴヌクレオチド、(b)内在核酸中の第2の部位を標的化する第2のガイドRNAを含む第2のCRISPR/Cas系および共有または非共有結合により第2のCRISPR/Cas系の第2のガイドRNAと結合した第2の近接性検出用オリゴヌクレオチド、または(c)核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体および核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体に結合した第2の近接性検出用オリゴヌクレオチドを含む第2のプローブをさらに含む、請求項14から17のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の近接性検出用オリゴヌクレオチドがCRISPR/Casタンパク質を対象とする一次抗体と結合した、請求項14から16のいずれか一項に記載の方法。
- 近接性検出用プローブ複合体が、内在核酸中の核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体を含む第2のプローブ、および核酸関連タンパク質または核酸修飾を対象とする抗体と結合した第2の近接性検出用オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 第1と第2の近接性検出用オリゴヌクレオチドが抗種族間二次抗体と結合しており、近接性検出用プローブ複合体がCRISPR/Casタンパク質を対象とする一次抗体をさらに含む、請求項14から16のいずれか一項に記載の方法。
- 内在核酸中の第2または追加的部位を対象とする第2または追加的ガイドRNAを含む第2または追加的CRISPR/Cas系と細胞を接触させる、請求項21に記載の方法。
- 近接性検出用オリゴヌクレオチドが一本鎖であるか、および/またはステム、ループ、および/またはヘアピン二次構造を含み、近接性検出用オリゴヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの組合せを含み、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドが標準ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、または2’−O−メチル修飾ヌクレオチドである、請求項14から22のいずれか一項に記載の方法。
- 内在核酸が核染色体DNA、メッセンジャーRNA、または非コードRNAである、請求項13から23のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が初代細胞、細胞株細胞であるか、または対象から得た組織もしくは体液試料内に存在する、請求項13から24のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が生存状態、固定状態、または凍結状態である、請求項13から25のいずれか一項に記載の方法。
- in situ近接性依存増幅反応が近接ライゲーションアッセイ(PLA)または近接性依存初期ハイブリダイゼーション連鎖反応(proxHCR)を含む、請求項13から26のいずれか一項に記載の方法。
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