CN112029838B - 一种用于DNA均相检测的CRISPR/Cas9分型PCR方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于DNA均相检测的CRISPR/Cas9分型PCR方法及其应用，该方法包括如下步骤：将全部反应组分加入一个PCR管中混合，混合物放置于荧光定量PCR仪上运行PCR程序，即可即时获得检测结果，期间无需再打开试管添加其他试剂或增设其他操作，检测结束后PCR反应管不开盖直接丢弃。本发明方法仅在当前PCR反应中增加了几个新组分，包括Cas9核酸酶和两个sgRNA和插入寡核苷酸，通过添加这些新的组分，消除了繁琐的引物设计。以单个通用引物代替传统引物，用于扩增所有靶DNA；本发明方法简便，检测快速，可以高特异性、高灵敏度地均相检测目标DNA，克服了PCR的局限性。

Description

一种用于DNA均相检测的CRISPR/Cas9分型PCR方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体一种用于DNA均相检测的CRISPR/Cas9分型PCR方法及其应用。
背景技术
众所周知，聚合酶链反应(PCR)由于对目标DNA的指数扩增而具有高灵敏度。因此，PCR已成为与生命科学有关的各个领域中必不可少的DNA检测工具。例如，逆转录PCR(RT-PCR)被广泛用于检测SARS-CoV-2，并在当前COVID-19大流行的诊断中起关键作用。然而，已经发现PCR具有一定的缺陷，这促进了该技术的持续发展。到目前为止，已经开发出三种类型的PCR技术，包括传统PCR(tPCR)、定量PCR(qPCR)和数字PCR。尽管已经开发了这些不同类型的PCR技术，但PCR技术的基本机制仍然保持不变，那就是必须设计一对特异性引物来扩增靶DNA。因此，引物设计对PCR的特异性至关重要。但是，在某些情况下，很难找到针对目标DNA的最佳引物，尤其是针对一些高度同源的DNA(例如一种病毒家族的不同基因型)的引物。引物设计对于多重PCR 可能会变得更加困难，在多重PCR中，要求引物既具有高特异性又具有相同的退火温度。引物在退火温度(通常为58℃)下发生不可避免的错配，通常会导致非特异性扩增和假阳性结果，这种情况总是困扰着基于PCR的诊断。因此，操作人员一直期望如何简化甚至消除繁琐的引物设计。
规则间隔的短回文重复序列簇(CRISPR)是细菌对噬菌体的免疫工具，该机制随后很快发展成为一种新型的基因编辑工具。在各种CRISPR cas蛋白中， II型CRISPR系统的Cas9由于其简单性，被广泛地表征和探索作为最广泛使用的基因编辑工具。单独的Cas9蛋白可以通过与CRISPR相关RNA(crRNA)和反式激活的crRNA(tracrRNA)结合而用作序列特异性DNA内切核酸酶。通过将tracrRNA和crRNA整合到单个引导RNA(sgRNA)中进一步简化了其操作。由于Cas9-sgRNA可高序列特异性地与天然双链DNA(dsDNA)相互作用，因此除了DNA编辑，Cas9已逐渐应用于DNA检测。例如，CRISPR/Cas9系统最早用于检测并分型Zika病毒。近年来，通过使用典型的Cas9对dsDNA的裂解活性、Cas9切口酶活性(nikase Cas9，n Cas9)和失活Cas9(dCas9)，迅速开发了越来越多的Cas相关DNA检测方法，例如CUT-LAMP、FLASH、Cas9nAR (基于Cas9切口酶的扩增反应)、CRISDA(CRISPR-Cas9触发的切口内切核酸酶介导的链置换扩增)、CRISPR-Chip和“成对的dCas9蛋白与荧光素酶的两半连接”等。这些研究表明CRISPR/Cas9在DNA检测中具有巨大潜力。但是，这些方法不容易直接移植到目前使用最广泛的DNA检测平台PCR上，以实现简单、自动和高通量的检测。
本质上，Cas9-sgRNA及其靶标dsDNA的序列特异性相互作用是在自然低温下的蛋白质辅助RNA-DNA杂交，这不同于在人工高温下的核酸杂交。后者构成了当前核酸检测的基础，例如各种PCR、Southern和Northern印迹以及微阵列或芯片。在这些当前的核酸检测中，核酸样品必须经历高温变性，从而产生非常复杂的单链DNA或RNA环境，引物或探针必须在其中找到其靶标。如果未提供受控的温度，则可能发生各种可能的退火，包括有限的与真实靶标的特异性退火，以及由于碱基错配而引起的非特定退火。因此，控制杂交温度非常重要。即便如此，错配还是不可避免的，从而导致PCR扩增、Southern和Northern印迹中普遍存在非特异性条带，以及微阵列杂交中出现非特异性斑点(spot)。因此，在非变性状态下的杂交可以避免这种严重挑战当前核酸检测的令人生畏的非特异性杂交。显然，Cas9辅助的sgRNA-DNA在低温(37℃)的自然dsDNA环境中的杂交，为解决该问题提供了一个很好的机会，尤其是解决在高退火温度(通常为58℃)下引物非特异性杂交导致的非特异性PCR扩增问题。
因此，近年来，申请人致力于开发结合了CRISPR/Cas9和PCR优势的新型 DNA检测方法。CRISPR/Cas9具有高特异性，PCR具有高灵敏度。申请人旨在克服PCR的关键限制，即在PCR中，特异性由引物决定。申请人着力开发依赖于CRISPR/Cas9的PCR新方法，在这些新方法中，检测的特异性不再由引物决定，而是由CRISPR/Cas9决定。通过使用Cas9-sgRNA的典型的dsDNA裂解活性，申请人目前已经开发了三种类型的CRISPR分型PCR(ctPCR)。在第一种ctPCR(ctPCR1.0)(中国专利申请号：201711146674.2；Sci Rep.2018；8:14126) 中，设计了一对靶向靶DNA的sgRNA；首先用一对Cas9-sgRNA切割目标DNA，然后将释放的靶DNA片段与通用接头连接，然后用通用引物或一对通用-特异性引物(us-primer)扩增。在第二种ctPCR(ctPCR2.0)(中国专利申请号： 201711157285.X；Anal Biochem.2018；561-562:37-46)中，首先用一对Cas9-sgRNA切割靶DNA，然后将其连接成分子内环状DNA或分子间串联线性DNA，最后用一对反向引物进行扩增，从而检测到目标DNA。显然，ctPCR1.0 和2.0仍然是多步骤且需要连接酶的非均相检测。在第三种ctPCR(ctPCR3.0) (中国专利申请号：201810271385.3；Anal Bioanal Chem.2018；410:2889-2900) 中，通过两个qPCR反应检测到靶DNA，一个反应包含一对Cas9-sgRNA，另一个不包含；通过比较两个qPCR反应的Ct值来检测目标DNA，尽管这是一种均相检测，但必须通过执行两个qPCR反应并比较两个PCR反应的Ct来获得最终检测结果。这些ctPCR各有其优点和特殊应用价值，但未实现单管均相检测。
发明内容
发明目的：为了克服当前ctPCR方法仍然存在的缺点，本发明开发了一种用于DNA均相检测的CRISPR/Cas9分型PCR方法(简称ctPCR4.0)，即一种全新的ctPCR(ctPCR4.0)。在这种方法中，仅需要Cas9-sgRNA和PCR所必需的功能组分。该方法除去了任何其他酶(例如DNA连接酶)和DNA接头(DNA adaptor或linker)。这种新方法的最大优势在于它是一种一锅法(one pot)均相检测(homogenous detection)。可以在均相检测反应中检测目标DNA，该反应包含所有必需的检测组分，包括DNA样品、一对Cas9-sgRNA、两个插入寡核苷酸、单个通用引物和其他常规PCR组分。整个检测过程可以在PCR仪器上完成，而无需再打开试管。本发明通过检测含有10种高危人类乳头瘤病毒(high-risk HPV，hrHPV)L1基因的质粒、人类宫颈癌细胞和临床宫颈样本的基因组DNA (gDNA)，论证该方法是否具有可行性、可靠性，并探讨其特异性和灵敏性。本发明的方法在现有ctPCR技术的基础上，进一步简化检测流程和试剂，实现单管一步法均相检测。
本发明还提供用于DNA均相检测的CRISPR/Cas9分型PCR方法的应用。
技术方案：本发明所述一种用于DNA均相检测的CRISPR/Cas9分型PCR 方法，包括如下步骤：将全部反应组分加入一个PCR管中混合，混合物放置于荧光定量PCR仪上运行PCR程序，即可即时获得检测结果，期间无需再打开试管添加其他试剂或增设其他操作，检测结束后PCR反应管不开盖直接丢弃。本方法是一种“样品进结果出”的一步法检测。
其中，所述全部反应组分包括DNA样品、Cas9蛋白、靶向靶DNA的一对 sgRNA(sgRNAa和sgRNAb)、与sgRNA配套的一对插入寡核苷酸、一个通用引物，以及其他常规PCR反应组分。
其中，所述DNA样品为任何双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)样品，如本发明中实例中使用的含有10种高危人类乳头瘤病毒L1基因的质粒、人类宫颈癌细胞和临床宫颈样本的基因组DNA(gDNA)等。
其中，所述Cas9蛋白为来自任何细菌的Cas9蛋白，如来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9蛋白(SpCas9)、来自金黄 葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)的Cas9蛋白(SaCas9)；Cas9蛋白也包括经过人工基因突变改造的Cas9蛋白，如高保真Cas9蛋白SpCas9-HF1(Nature 2016；529: 490-495)、特异性增强的SpCas9蛋白eSpCas9(Science 2016；351:84-88)。用于DNA检测的Cas9蛋白常常为经过基因工程生产纯化的Cas9蛋白，如本发明实验实例中使用的购自New England Biolabs公司(简称NEB)的Cas9蛋白(货号M0646T)。
其中，所述靶向靶DNA的一对sgRNA为一对能够通过与Cas9蛋白形成复合物的引导RNA(single guide RNA，sgRNA)，所形成的复合物称为Cas9-sgRNA 复合物(简称Cas9-sgRNA，如Cas9-sgRNAa和Cas9-sgRNAb)，其中sgRNA在 Cas9蛋白辅助下可在DNA样品中寻找其靶DNA并与之通过碱基互补发生结合 (结合靶点为20bp)；这种结合诱发Cas9蛋白在DNA靶点上发生对DNA双链的切割(图1)，从而释放出具有游离3′端的两段单链DNA(图1)。
其中，所述与sgRNA配套的一对插入寡核苷酸为一对3′端可与Cas9-sgRNA 切割靶DNA释放的具有游离3′端的两段单链DNA发生退火的寡核苷酸，其3′端退火序列与配套的sgRNA的靶DNA退火序列互补(图1)。
作为优选，所述通用引物为5′-GCGGTGACCCGGGAGATCTGAATTCT-3′。
其中，所述常规PCR反应组分包括PCR反应缓冲液、Taq酶、dNTP及荧光报告试剂。
作为优选，所述荧光报告试剂如Sybrgreen。
作为优选，其他常规PCR反应组分可使用商品化的荧光定量PCR试剂，如
Figure BDA0002598172830000042
qPCR SYBR Green Master Mix(YEASEN)。
其中，所述通用PCR程序为37℃30分钟，72℃10分钟，95℃10分钟， 40个循环：95℃15s，58℃30s和72℃45s；72℃5分钟。
其中，所述靶向靶DNA的一对sgRNA为sgRNAa和sgRNAb，当靶DNA 为10种高风险人乳头瘤病毒(hrHPV)的L1区时，sgRNAa和sgRNAb选自如下表1任意一对序列(如sgRNA16a和sgRNA16b为一组)，按顺序为SEQ ID NO.1-20。
表1用于检测10种高危型HPV的sgRNA序列
Figure BDA0002598172830000041
Figure BDA0002598172830000051
*是指与Cas9结合切割靶DNA产生的DNA片段的大小(bp)。
作为优选，所用的sgRNA对用于制备高危型人乳头瘤病毒(hrHPV)的 ctPCR4.0快速筛查的试剂中应用。
其中，在均相检测反应中，靶DNA首先被加入检测反应的Cas9分别与一对sgRNA结合形成的一对Cas9-sgRNA复合物(Cas9-sgRNAa和Cas9-sgRNAb) 切割，释放出具有自由3'端的两条单链，从而使一对插入寡核苷酸能够与之退火；退火的寡核苷酸提供了从游离3'端进行DNA聚合的模板，通过DNA聚合酶延伸在两条单链的末端产生通用引物退火位点；然后使用通用引物进行靶 DNA的PCR扩增。
本发明所述的用于DNA均相检测的CRISPR/Cas9分型PCR方法在制备检测各种DNA分子的检测试剂中的应用。本发明所述的用于DNA均相检测的 CRISPR/Cas9分型PCR方法——ctPCR4.0在DNA检测中的应用。
本发明所述的用于DNA均相检测的CRISPR/Cas9分型PCR的试剂盒在制备检测人乳头瘤病毒DNA分子的检测试剂中的应用。进一步地，ctPCR4.0在检测高危型HPV中的应用。
本发明所述用于DNA均相检测的CRISPR/Cas9分型PCR的试剂盒，包括 Cas9蛋白、靶向靶DNA的一对sgRNA(sgRNAa和sgRNAb)、与sgRNA配套的一对插入寡核苷酸、一个通用引物，以及常规PCR反应组分。
其中，所述靶向靶DNA的一对sgRNA包括sgRNAa和sgRNAb为一对能够通过与Cas9蛋白分别形成复合物Cas9-sgRNA的引导RNA；所述与sgRNA 配套的一对插入寡核苷酸为一对3′端可与Cas9-sgRNA切割靶DNA释放的具有游离3′端的两段单链DNA发生退火的寡核苷酸，其3′端退火序列与配套的 sgRNA的靶DNA退火序列互补；所述通用引物为 5′-GCGGTGACCCGGGAGATCTGAATTCT-3′；所述常规PCR反应组分包括PCR 反应缓冲液、Taq酶、dNTP及荧光报告试剂。
本发明所述的用于DNA均相检测的CRISPR/Cas9分型PCR的试剂盒在制备检测各种DNA分子的检测试剂中的应用。
本发明所述的用于DNA均相检测的CRISPR/Cas9分型PCR的试剂盒在制备检测人乳头瘤病毒DNA分子的检测试剂中的应用。
本发明提出一种用于DNA均相检测的CRISPR/Cas9分型PCR新方法—— ctPCR4.0。ctPCR4.0结合了CRISPR/Cas9和PCR的优势，可均相检测靶DNA。其中，所述CRISPR/Cas9的优势指CRISPR/Cas9识别并切割双链DNA(dsDNA) 的序列特异性；所述PCR的优势指PCR通过指数扩增检测靶DNA分子的高灵敏性；所述ctPCR4.0方法的检测特异性取决于Cas9-sgRNA，而其检测的高灵敏性取决于PCR。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、通过整合CRISPR/Cas9和PCR的优势，本发明开发了CRISPR分型PCR 的新方法ctPCR4.0，是一种快速简便、可以高特异性、高灵敏度地均相检测目标DNA的方法。该方法的高特异性取决于sgRNA而不是PCR引物，并且该方法的高灵敏度取决于PCR。这种方法可以一锅法均相检测目标DNA。与当前的 PCR相比，该方法仅在当前PCR反应中增加了几个新组分，包括Cas9核酸酶和两个sgRNA和插入寡核苷酸。通过添加这些新的组分，消除了繁琐的引物设计。以单个通用引物代替传统引物，用于扩增所有靶DNA。本发明中使用的通用引物(oJW102)是高度的人工序列，通过搜索NCBI核酸数据库(核苷酸集合(nt)， Refseq mRNA和NCBI转录参考序列)设计而成，在已知的自然序列中没有该引物的靶DNA。在本发明中进行的检测证明了其高特异性。本发明对当前PCR程序的唯一改变仅仅是在PCR程序之前增加了两个恒温孵育环节(37℃30分钟和72℃10分钟)。前者使Cas9-sgRNA和插入寡核苷酸与dsDNA相互作用，后者使释放的游离3'末端聚合延伸。
除此方法中使用的CRISPR/Cas9外，目前核酸检测领域还正在深入探索具有侧向切割活性的其他CRISPR/Cas蛋白进行核酸检测。例如，基于具有侧向切割活性的Cas13a，开发了SHERLOCK(Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)技术。在目标RNA激活后，Cas13a-gRNA可对单链RNA (ssRNA)出现非特异性切割活性。基于Cas12a和Cas14被目标DNA激活后的单链DNA(ssDNA)侧向切割活性，发展了DETECTR((DNAEndonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter)和HOLMES(a one-HOur Low-costMultipurpose highly Efficient System)技术。基于Cas12b对ssDNA的侧向切割活性，开发 HOLMESv2(HOLMES2.0)和CDetection。据报道这些方法具有attomolar级灵敏度，但其超高灵敏度仍依赖于预扩增，例如PCR、重组酶聚合酶扩增(RPA)、 Loop介导的等温扩增(LAMP)。Cas13a发挥作用之前，SHERLOCK还需要最终的体外转录。本发明的CtPCR4.0与这些基于CRISPR的方法有重要区别。在 ctPCR4.0中，首先用Cas9-sgRNA切割DNA，然后扩增。相反，在这些基于CRISPR 的方法中，DNA首先被扩增，然后被Cas9以外的Cas蛋白切割。这些预扩增可能会增加检测中的假阴性或阳性，因为使用各种DNA聚合酶进行的预扩增可能会将突变引入DNA，导致出现新的靶点，造成假阳性。此外，所有这些基于 CRISPR的方法在检测中都必须在扩增后打开试管以添加Cas蛋白、gRNA和荧光报告基因以实现检测，该环节增加了扩增子对检测环境的潜在污染。扩增子污染在核酸检测领域是个非常严重的问题。
2、本发明提供了用于DNA均相检测的CRISPR/Cas9分型PCR方法在制备检测各种DNA分子的检测试剂中的应用，本发明提供了DNA均相检测的 CRISPR/Cas9分型PCR方法在检测人乳头瘤病毒DNA分子中的应用的实例，提供一种可用于临床筛查HPV的新方法。HPV属于伪病毒科的乳头瘤病毒属，它是一种具有上皮亲和特性的小分子、无膜包被的环形双链DNA病毒，广泛分布于动物和人类中。已确认HPV占全世界所有癌症病因的5％。几乎所有宫颈癌都与hrHPV持续感染有关，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、 56、58、59、68和82，其中HPV16和HPV18是全世界两种最常见的hrHPV基因型，导致约70％的宫颈癌。2018年，全球约570,000名妇女患了宫颈癌，可以通过HPV疫苗接种或预防来预防筛查，每年约有30万妇女死于宫颈癌。因此，包括中国在内的许多国家建议将HPV检测作为宫颈癌筛查的首选方法。因此，准确检测hrHPV对于改善HPV阳性病变的处理以及预防、及早发现和治疗与 HPV相关的癌症具有重要意义。到目前为止，各种基于PCR的方法仍是hrHPV 筛选和分型的主要技术。因此，本发明使用具有高度可变基因型(超过100个基因型)的HPV作为靶标来验证ctPCR4.0。通过检测人类宫颈癌细胞和临床宫颈样本的质粒和gDNA中最常见的10种hrHPV，该研究证实了ctPCR4.0的可行性、可靠性、特异性和灵敏性。本发明设计和验证的sgRNA(序列表1)可用于制备10种hrHPV的ctPCR4.0快速筛查的试剂。
3、本发明提供一种原料来源广，制备简单，使用方便的用于DNA均相检测的CRISPR/Cas9分型PCR的试剂盒，可以实现单管一步法均相检测，有效解决了现有PCR是多步骤且需要连接酶或者必须通过执行两个qPCR反应并比较两个PCR反应的Ct来获得最终检测结果，操作比较麻烦且费时费材等问题。
附图说明
图1为ctPCR4.0检测原理示意图；IO，插入oligo，IOUPS，插入上游oligo； IODNS，插入下游寡头；oJW102，通用引物；
图2为针对10种高危型HPV L1片段设计的sgRNAs的位置示意图及其用于扩增HPVL1片段的简并引物MY09和MY11的位置示意图；
图3为所制备的10中高危型HPV质粒DNA及其sgRNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果图；(A)10种HPV L1质粒的电泳检测，1～10：pHPV16、pHPV18、pHPV33、pHPV35、pHPV45、pHPV51、pHPV52、pHPV56、pHPV58、pHPV59， M,DNA Marker 2000；(B)20个sgRNA的电泳检测，1～20：sgRNA16a、 sgRNA16b、sgRNA18a、sgRNA18b、sgRNA33a、sgRNA33b、sgRNA35a、 sgRNA35b、sgRNA45a、sgRNA45b、sgRNA51a、sgRNA51b、sgRNA52a、 sgRNA52b、sgRNA56a、sgRNA56b、sgRNA58a、sgRNA58b、sgRNA59a、 sgRNA59b，M 100bp DNA Ladder；
图4为用Cas9-sgRNA切割HPV L1 DNA结果图；用Cas9-sgRNA切割三个 HPV质粒pHPV18、pHPV33和pHPV58；(A)用Cas9-sgRNA切割pHPV33和 pHPV58，M，10000bp DNA标记；(B)用Cas9-sgRNA切割pHPV18，M，100 bp DNA阶梯；为了比较，pHPV18也被Aat II(Takara)切割以线性化该质粒；应当指出，通过一对Cas9-sgRNA的双重切割而从质粒中释放的L1片段太小，无法在凝胶中看到，但切割产生的线性大片段可清除地看到；
图5为用CtPCR4.0检测克隆HPV L1的质粒结果图；用ctPCR4.0检测克隆有10种HPVL1基因的质粒(pHPV16、pHPV18、pHPV33、pHPV35、pHPV45、 pHPV51、pHPV52、pHPV56、pHPV58、pHPV59)，每个hrHPV都被其相应的 sgRNA(sgRNAa和sgRNAb)检测到(test，T)，没有Cas9-sgRNAs的反应用作阴性对照(N)，没有Cas9-sgRNA和pHPV的反应被用作空白对照(B)，通过琼脂糖电泳检测qPCR产物，M：100bp DNA阶梯，qPCR的解链曲线如图6 所示；
图6为ctPCR4.0检测10种HPV L1质粒DNA的熔解曲线；(A)用 Cas9-sgRNA16检测HPV16 L1 DNA，(B)用Cas9-sgRNA18检测HPV18 L1 DNA，(C)用Cas9-sgRNA33检测HPV33 L1DNA，(D)用Cas9-sgRNA35检测HPV35 L1 DNA，(E)用Cas9-sgRNA45检测HPV45 L1 DNA。(F)用Cas9-sgRNA51 检测HPV51 L1 DNA，(G)用Cas9-sgRNA52检测HPV52 L1 DNA，(H)用 Cas9-sgRNA56检测HPV56 L1 DNA，(I)用Cas9-sgRNA58检测HPV58 L1 DNA， (J)用Cas9-sgRNA59检测HPV59 L1 DNA；
图7为用ctPCR4.0检测宫颈癌细胞的gDNA；(A)纯化的SiHa、HeLa和 C-33AgDNA的凝胶电泳检测，1：SiHa gDNA，2：HeLa gDNA，3：C-33AgDNA， M：DNA标记DL10000；(B)使用引物MY09和MY11通过PCR检测宫颈癌细胞的gDNA，1：SiHa gDNA，2：HeLa gDNA，3：C-33A gDNA，4：空白， M：DNA标记DL2000；(C)CtPCR4.0检测三个宫颈癌细胞中的HPV18；(D) CtPCR4.0检测三个宫颈癌细胞中HPV16；
图8为ctPCR4.0检测的特异性和灵敏性实验结果图；(A)ctPCR4.0检测的特异性，使用分别靶向HPV16、18和45的sgRNA，通过ctPCR4.0检测10种 hrHPV质粒；(B)ctPCR4.0检测的灵敏度；使用不同量的HeLa和SiHa gDNA 分别检测HPV18和HPV16，M，100bp梯形图；
图9为使用琼脂糖凝胶电泳检测分离纯化的30份临床子宫颈样品的gDNA 实验结果图；30个临床样品的gDNA电泳结果，从30个临床样品中提取gDNA，并取50ng gDNA用于琼脂糖凝胶电泳，1～30，样品编号；M，100bp DNA ladder；
图10为用ctPCR4.0检测临床子宫颈样品；使用靶向10种hrHPV的sgRNA，通过ctPCR4.0分别检测30个临床子宫颈样品的纯化gDNA，M：100bp DNA阶梯，Reaction：ctPCR4.0反应，sgRNA type：sgRNA种类，每个gDNA样品分别用靶向10种高危型HPV的是个RNA进行ctPCR4.0检测，ctPCR4.0扩增产物用琼脂糖凝胶电泳观测；
图11为用简并引物MY09和MY11分别PCR扩增30份临床子宫颈样品的 gDNA的实验结果图，PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳观测；
图12为MY09和MY11扩增产物(图11)克隆测序的结果图，S1～S30：样品(sample)1～30；
图13为MY09和MY11扩增产物(图11)的克隆测序结果分析及其与 ctPCR4.0检测结果的比较结果图；(A)使用NCBI blast鉴定测序结果(图12) 并构建HPV基因型系统发育树。(B)ctPCR4.0检测结果和Sanger测序法检测结果的比较。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
ctPCR4.0检测不同样品中的高危型HPV DNA
1.实验材料和方法
1.1、sgRNA的设计
使用在线sgRNA设计软件Chop-Chop(http://chopchop.cbu.uib.no/)设计了sgRNA，设计中使用hg19作为参考基因组。表1中显示了所设计的靶向10种高危型HPV(hrHPV)的sgRNA。为每个DNA靶标分别设计了两个sgRNA，即sgRNAa 和sgRNAb。根据设计的sgRNA，通过三轮融合PCR方案合成了用于扩增sgRNA 模板的引物(表2)。PCR扩增的sgRNA转录模板具有T7启动子序列。然后使用 sgRNA模板通过体外转录法制备sgRNA。
1.2、sgRNA体外转录模板的制备
PCR1：首先根据sgRNA的骨架部分设计一对引物(表2中所示的F1和R)进行融合PCR扩增。30μL PCR反应包含2μL F1(表2)、2μL R(表2)和15μL 2 ×primestar(Takara)。PCR程序为：95℃2分钟；7个循环：95℃ 15秒，72℃ 1分钟。然后将PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上100V电泳40分钟，通过AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AxyPrep)回收，并溶于25μL洗脱液中。通过Nanodrop 2000 分光光度计测量DNA浓度和纯度。PCR产物命名为片段1，并保存在-20℃下备用。
PCR2：以片段1为模板，以F2和Sg-R为引物进行PCR。50μL PCR反应包含2 μL片段1、1μL F2(表2)、1μL Sg-R(表2)、25μL 2×primestar(Takara)， 21μL H2O。PCR程序为：95℃2分钟；30个循环：95℃ 15秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟；72℃ 2分钟。使用PCR清洁试剂盒(Axygen)直接回收PCR产物，并将其溶于25μL洗脱液中。通过Nanodrop 2000分光光度计测量PCR产物的DNA浓度和纯度。PCR产物命名为片段2，并保存在-20℃下备用。
PCR3：以片段2为模板，以F3(表2)和Sg-R(表2)为引物进行PCR。50μL PCR反应包含2μL片段2、1μL F3(表1)、1μL Sg-R(表1)、25μL 2×primestar (Takara)、21μL H2O。PCR程序为：95℃2分钟；30个循环：95℃ 15秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟；72℃ 2分钟。使用AxyPrepPCR清洁试剂盒(AxyPrep)直接回收PCR产物，将其溶于25μL洗脱液中。通过Nanodrop 2000分光光度计测量 PCR产物的DNA浓度和纯度。将该PCR产物命名为T7-sgRNA转录模板，并保存在-20℃下备用。
1.3、通过体外转录制备sgRNA
根据制造商的说明，使用T7 RNA聚合酶(NEB，M0251S)进行体外转录。体外转录反应(20μL)包含0.2～1μg T7-sgRNA转录模板、2μL T7 RNA聚合酶、2μL T7 RNA聚合酶缓冲液、1μL rNTP(NEB，N0466S)，以H2O补充至20μL。将反应在37℃下孵育过夜。
1.4、sgRNA的提取和纯化
使用Trizol试剂(Invitrogen，15596018)提取RNA。首先，将1mL Trizol添加到过夜反应的体外转录反应中，并吹打几次。将裂解物转移至1.5mL离心管中，并使其在室温下静置5分钟。加入氯仿，氯仿的量为0.2ml氯仿/mL Trizol。将试管加盖，剧烈摇动15秒，在室温下静置5分钟，然后在4℃以12000g离心15分钟。将上层液相转移至干净的离心管中，并加入异丙醇(0.5mL/mL Trizol)。通过颠倒几次将混合物温和地混合，使其在室温下静置10分钟，并在4℃以12,000g离心10分钟。弃去上清液。向沉淀物中加入75％的乙醇(1mL/mLTrizol)，充分混合，并在4℃下以7500g离心5分钟。除去上清液，并将沉淀在室温下孵育5至10分钟，使其自然干燥(不要完全干燥)。向沉淀添加30μL DEPC处理过的H2O 以溶解RNA。使用紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度。取1μg sgRNA进行 1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
表1 sgRNAs(其中显示了每对sgRNA可产生的靶DNA片段大小)
Figure BDA0002598172830000111
Figure BDA0002598172830000121
表2.用于通过PCR扩增制备sgRNA转录模板的寡核苷酸
Figure BDA0002598172830000122
Figure BDA0002598172830000131
表3.ctPCR4.0的插入寡核苷酸和通用引物
Figure BDA0002598172830000132
Figure BDA0002598172830000141
1.5、DNA提取
10个HPV L1克隆(pHPV16、pHPV18、pHPV33、pHPV35、pHPV45、pHPV51、pHPV52、pHPV56、pHPV58、pHPV59)由发明人的实验室构建制备保存 (Analytical Biochemistry2018，561-562：37-46)。以这些质粒分别转化大肠杆菌DH5α(Tiangen，CB101)，使用质粒迷你试剂盒(CWBIO，CW0502S)从 DH5α中纯化质粒DNA。使用血液/细胞/编织的gDNA提取试剂盒(TIANGEN， DP503)从三个人类宫颈癌细胞(SiHa，HeLa和C-33A)和临床宫颈样品中纯化基因组DNA(gDNA)。用Nanodrop 2000分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分析纯化的DNA的质量。
1.6、用Cas9-sgRNA切割HPV质粒
按照Cas9蛋白(NEB；M0646T)的生产说明，将提取的质粒用Cas9-sgRNA 复合物切割。在30μL Cas9-sgRNA组装反应中含有1×Cas9缓冲液、30nM sgRNAa、30nM sgRNAb和30nMCas9核酸酶。将反应在37℃下保持10分钟。然后将200ng质粒加入反应中。将反应在37℃下保持15分钟。通过1％琼脂糖凝胶电泳检测产物。
1.7、ctPCR检测DNA样品
50μL普通PCR反应包含
Figure BDA0002598172830000142
HS(Takara，R040A)、30nM sgRNAa、 30nMsgRNAb、30nM Cas9核酸酶、50nM每种插入寡核苷酸(表3)、100nM 通用引物(oJW102；表3)、从各种宫颈癌细胞中提取的100ng gDNA。50μL qPCR 反应包含
Figure BDA0002598172830000143
qPCR SYBR GreenMaster Mix(YEASEN)、30nM sgRNAa、 30nM sgRNAb、30nM Cas9核酸酶、50nM每种插入寡核苷酸(表3)、100nM 通用引物(oJW102；表3)、200ng待测质粒DNA(pHPV16、pHPV18、pHPV33、pHPV35、pHPV45、pHPV51、pHPV52、pHPV56、pHPV58、pHPV59)。反应在PCR仪(ABI StepOneplus)上进行，程序为37℃30分钟，72℃10分钟，95℃ 10分钟，40个循环：95℃15秒，58℃30秒和72℃45秒；72℃5分钟。在 ctPCR4.0检测中，使用了200ng质粒DNA、100ng宫颈癌细胞的gDNA和25ng临床宫颈样品的gDNA。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
1.8、克隆测序
用引物MY09和MY11(表4)扩增30个临床宫颈样品的gDNA。50μL PCR反应中包含10ng gDNA、100nM MY09、100nM MY11和
Figure BDA0002598172830000151
HS。反应系统在PCR仪(ABI 9600)上运行以下程序：95℃3分钟；35个循环：95℃15 秒，58℃30秒和72℃45秒；72℃5分钟。用琼脂糖凝胶电泳检测产物。通过 Sanger测序(Sangon Biotech，上海)对PCR产物进行Sanger测序。
表4.PCR扩增HPV L1区的简并引物MY09和MY11
Name sequence(5′-3′)
MY09 CGTCCMARRGGAWACTGATC
MY11 GCMCAGGGWCATAAYAATGG
2.实验结果
2.1、ctPCR4.0检测原理说明
本发明设计了新的CRISPR分型PCR及其试剂盒，即ctPCR4.0(图1)，可用于一锅法(one pot)检测均相检测目标DNA。在开始ctPCR4.0检测时，将DNA 样品、Cas9蛋白、两个sgRNA(sgRNAa和sgRNAb)、两个插入寡核苷酸(IOUPS和IODNS)、单个通用引物和其他PCR组分混合在一起，形成均相ctPCR4.0反应。将反应物在放置在PCR仪中，运行如下通用程序：37℃30分钟，72℃10分钟和常规PCR程序(95℃10分钟；30个循环：95℃15秒，58℃30秒，72℃45秒； 72℃5分钟。在此过程中，靶DNA首先被一对Cas9-sgRNA复合物切割，从而释放出两条带有自由3'末端的单链，从而使一对插入寡核苷酸与之退火；退火的寡核苷酸提供了从游离3'端进行DNA聚合的模板；可通过DNA聚合反应，在两条单链的末端产生通用引物退火位点。然后使用通用引物通过PCR扩增靶DNA。为了检测HPV，本发明针对10种hrHPV的每种hrHPV设计了一对sgRNA(图2和表1)。
2.2、用Cas9-sgRNA切割HPV质粒
用Nanodrop 2000分光光度计测定提取的10种hrHPV质粒和所制备的sgRNA 的纯度和浓度。通过1％琼脂糖凝胶电泳检测其质量。结果显示10个质粒样品和 20个sgRNA是高质量的(图3)。为了评估制备的质粒和sgRNA，用与sgRNA18a 和sgRNA18b、sgRNA33a和sgRNA33b以及sgRNA58a和sgRNA58b相结合的Cas9，分别切割三个不同的质粒：pHPV18、pHPV33和pHPV58。通过电泳检测产物。结果表明，所有HPV质粒几乎都被相应的Cas9-sgRNA完全切割(图4A和图4B)，表明Cas9-sgRNA的切割效率很高。
2.3、ctPCR4.0检测10种hrHPV质粒：
为了确定ctPCR4.0的可行性和特异性，首先用ctPCR4.0测试了克隆有10种 hrHPV的L1基因的质粒(HPV16、18、33、35、45、51、52、56、58和59)。结果(图5)表明，当ctPCR4.0反应中包含Cas9与相应的sgRNA和插入寡核苷酸时，该HPV质粒上的目标片段被扩增(图5中用T标示的曲线)。如果不添加Cas9、相应的sgRNA和插入寡核苷酸，则无法扩增任何DNA(图5中用N标示的曲线)。 PCR空白对照(图5中用B标示的曲线)也无法扩增DNA。所有测试反应(test， T)(图5中的T曲线)的Ct值均小于30；但是，所有阴性对照(图5中的N曲线) 和空白对照(图5中的B曲线)的Ct值均超过30。所有ctPRC4.0反应的熔解曲线均为单峰(图6)，表明特异性扩增。所有ctPRC4.0反应产物的电泳检测结果也表明，只有所有测试反应(T)都扩增了具有预期大小的条带(图5中的电泳图的T 泳道)。
2.4、ctPCR4.0检测宫颈癌细胞中的HPV DNA
为了研究ctPCR4.0是否可用于检测gDNA中的HPV DNA，从人宫颈癌细胞 (SiHa，HeLa和C-33A)中提取了gDNA(图7A)。使用一对简并引物MY09和 MY11通过PCR扩增gDNA，该引物被广泛用于扩增所有HPV的L1基因片段。结果表明，可以从SiHa和HeLa细胞的gDNA中扩增L1基因片段，但从来自C-33A细胞的gDNA不能扩增出L1基因片段(图7B)，表明SiHa和HeLa是HPV阳性细胞，而C-33A是HPV阴性细胞。然后使用ctPCR4.0检测这三个细胞的gDNA。结果表明，预期的300bp片段只能通过ctPCR4.0反应从HeLa gDNA中扩增，该反应包含所有ctPCR4.0所需的组分，包括sgRNA18(sgRNA18a和sgRNA18b)(图7C)。类似地，仅通过包含所有ctPCR4.0所需组分的ctPCR4.0反应(包括sgRNA16 (sgRNA16a和sgRNA16b))从SiHa gDNA中扩增出预期的150bp片段(图7D)。作为对照的所有其他ctPCR4.0反应均未扩增靶片段(图7C和图7D)。这些结果与上述MY09/MY11 PCR检测以及先前报道SiHa和HeLa细胞分别是HPV16和 HPV18阳性细胞，C-33A细胞是HPV阴性细胞的报道相吻合。结果表明，ctPCR4.0 可以准确检测和分型人细胞gDNA中的HPV DNA。
2.5、ctPCR4.0检测的特异性和灵敏性
为了进一步探索ctPCR4.0检测的特异性，分别使用对HPV16、18和45个亚型的L1基因具有特异性的sgRNA，通过ctPCR4.0检测了10种hrHPV质粒。结果表明，目标质粒只能通过其相应的sgRNA才能扩增(图8A)，表明sgRNA的特异性及ctPCR4.0检测的特异性。为了探索ctPCR4.0检测的灵敏性，使用ctPCR4.0分别检测了不同量的HeLa和SiHa gDNA。结果表明，即使gDNA低至1ng(SiHa gDNA)和5ng(HeLa gDNA)，ctPCR4.0仍然可以检测到其中的HPVDNA(图8B)。
2.6、ctPCR4.0检测临床宫颈样本中的HPV DNA
最后，为了探索ctPCR4.0是否可以检测临床子宫颈样品，从30个临床子宫颈粘液脱落细胞中提取了gDNA(图9)，并用ctPCR4.0进行了检测。使用特异于10 种hrHPV的sgRNA，分别用ctPCR4.0检测每个样品。结果显示，有19个样品被 10种hrHPV之一感染(图10)。所有扩增产物均与预期长度一致(图2)。为了进一步验证这些检测的特异性，将所有这些临床样品的gDNA用MY09和MY11 扩增。结果表明，可以从所有样品中扩增出预期的500bp L1片段，表明所有样品均被HPV感染(图11)。然后通过Sanger测序对PCR产物进行测序(图12)。然后使用这些序列构建系统发育树(图13A)。这些序列由NCBI blast鉴定(图 13A)。与这些测序结果相比，ctPCR4.0可以准确检测出这些临床样品中的HPV 感染并进行分型(图13B)。这些数据表明ctPCR4.0可用于检测临床样品。
序列表
<110> 东南大学
<120> 一种用于DNA均相检测的CRISPR/Cas9分型PCR方法及其应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtcataacg tctgcagtta 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcacactaga agatacttat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgctgcaccg gctgaaaata 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcatcatatt gcccaggtac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgagaggta acaaacctat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaggaaaagg aagacccctt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accgccttct ggtaccttag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acacagacat atttgtacta 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
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<400> 9
accacctact accagtttgg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
taatgttaaa ttagtactgc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agttacttgg agtaaatgtt 20
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<212> DNA
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<400> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggaatacctt cgtcatggcg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agtcatgtta gtgctacgag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tattgggtta tccccgccag 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
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<400> 16
catattcctc cacatgtcta 20
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 17
gctacgagtg gtatcaacca 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
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<400> 18
aatgacatat atacatacta 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctggtaggtg tgtatacatt 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggcctgtaga tcttaaggaa 20

Claims (7)

1.一种非诊断目的的用于DNA均相检测的CRISPR/Cas9分型PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：将全部反应组分加入一个PCR管中混合，混合物放置于荧光定量PCR仪上运行PCR程序，即可即时获得检测结果，所述全部反应组分包括DNA样品、Cas9蛋白、靶向靶DNA 的一对sgRNA、与sgRNA配套的一对插入寡核苷酸、一个通用引物，以及常规PCR反应组分；
所述Cas9蛋白为切割非靶向链的蛋白；
所述靶向靶DNA 的一对sgRNA为sgRNAa和sgRNAb，为一对通过与Cas9蛋白分别形成复合物Cas9-sgRNAa和Cas9-sgRNAb的引导RNA，其中引导RNA在Cas9蛋白辅助下可在DNA样品中寻找其靶DNA并与之通过碱基互补发生结合，所述sgRNAa和sgRNAb分别靶向不同的DNA单链；
所述与sgRNA配套的一对插入寡核苷酸，其3′端的退火序列与Cas9-sgRNA切割靶DNA释放的具有游离3′ 端的两段单链DNA分别退火，其5’端的序列作为DNA聚合的模板合成的DNA单链具有通用引物退火位点，其3' 末端的核苷酸有氨基修饰；
所述均相检测反应中，DNA样品中的靶DNA首先被一对Cas9-sgRNA复合物Cas9-sgRNAa和Cas9-sgRNAb切割，释放出具有自由3' 端的两条单链，从而使一对插入寡核苷酸能够分别与具有自由3' 端的两条单链退火；退火的插入寡核苷酸提供了从游离3' 端进行DNA聚合的模板，通过DNA聚合酶延伸在具有自由3' 端的两条单链的末端产生通用引物退火位点；然后使用通用引物进行靶DNA的PCR扩增，所述PCR程序为，在常规PCR程序之前增加了两个恒温孵育环节，37℃ 30分钟和72℃ 10分钟。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述通用引物为5′-GCGGTGACCCGGGAGATCTGAATTCT-3′。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述常规PCR反应组分包括PCR反应缓冲液、Taq酶、dNTP及荧光报告试剂。
4.根据权利要求1方法，其特征在于，所述PCR程序为37℃ 30分钟，72℃ 10分钟，95℃10分钟，40个循环：95℃ 15 s，58℃ 30 s和72℃ 45 s；72℃ 5分钟。
5.一种权利要求1所述方法在检测各种DNA分子中的应用，所述应用是非诊断目的。
6.一种权利要求1所述方法在检测人乳头瘤病毒DNA中的应用，所述应用是非诊断目的。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述用于DNA均相检测的CRISPR/Cas9分型PCR方法在制备用于人乳头瘤病毒DNA检测试剂时，所用的sgRNA对（sgRNAa和sgRNAb）选自如下任意一对序列：
Figure 682919DEST_PATH_IMAGE001
。
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