JP2001516594A

JP2001516594A - 電気泳動用のｄｎａブラケティング遺伝子座適合標準

Info

Publication number: JP2001516594A
Application number: JP2000511909A
Authority: JP
Inventors: シー．ダウ、ピーター; リウ、デバング
Original assignee: オリゴトレール、エルエルシー．
Priority date: 1997-09-18
Filing date: 1998-09-17
Publication date: 2001-10-02
Also published as: WO1999014371A1; BR9812470A; EP1015636A1; CA2302432A1; US6013444A; AU9393298A; CN1270638A

Abstract

(57)【要約】【課題】ＴＣＲ・ＡおよびＴＣＲ・Ｂ遺伝子多型ＣＤＲ３領域の測定を含む様々な用途に使用可能な、既知の長さと配列のブラケティング、遺伝子座適合、あるいは特異ＤＮＡの標準を製造するための方法を提供することである。【解決の手段】遺伝子座の断片長さ多型の適合性のある配列あるいは特異ＤＮＡマーカは、電気泳動分離の際にその座のいくつかの対立遺伝子、あるいは全て既知の対立遺伝子の長さを重複することのない、密接なブラケティングを目標として作られる。ターゲットの遺伝子座の対立遺伝子に関係した近似の配列と断片長さのために、その座からのサンプル対立遺伝子と同じレーンで共電気泳動をおこなわれたブラケティング座適合性マーカはサンプル断片の長さ決定のための正確な換算標準を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は電気泳動システムを使用して未知のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の長
さの測定に関し、特に、測定対象のＤＮＡ座から由来の配列に密接に関連づけた
ＤＮＡ標準のブラケティング・ペアの製造および利用に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】

米国特許ＵＳＰ５，３６４，７５９、発明者キャスキイ（Ｃａｓｋｅｙ）、は
特に短い縦列反復多型現象に関係する生物工学で使われる技術用語の定義を提供
している。米国特許ＵＳＰ５，３６４，７５９の全内容は引例として提示する。
以下の定義は本発明を明確かつ混乱なく理解するための助けとなるように示すも
のである。

【０００３】対立遺伝子：ＤＮＡの一切片に関連した遺伝的な変異、つまり、同じ多型領域
の遺伝子座を有するＤＮＡ配列の二つ以上の別な形態の一つである。

【０００４】対立遺伝子ラダー：多型領域から増幅した対立遺伝子から成る標準サイズのマ
ーカ。

【０００５】生化学的命名：標準的な生化学命名法をここでは使用する。つまり、ヌクレオ
チド塩基はアデニンＡ、チミンＴ、グアニンＧ、シトシンＣとする。対応するヌ
クレオチドは、例えばデオキシグアノシン−５’三燐酸（ｄＧＴＰ）などである
。

【０００６】偏差：多型ＤＮＡ断片の分かっている長さ（予測値）と、種々のＤＮＡ標準マ
ーカの共電気泳動により換算したゲル電気泳動で測定した長さとの差。

【０００７】区別して標識したもの：これは各延長生成物は全ての他の生成物とは区別でき
ることを示す。つまり、異なった標識を有し、また／あるいは異なったサイズで
あり、また／あるいは、特に標識したオリゴヌクレオチドに結合することによる
。当業者は様々な標識があることを理解できるであろう。様々な要因が標識の選
択に影響する。すなわち、あるＤＮＡへのプライマ結合やハイブリッド形成の率
についての標識の効果や、標識の感度や、標識をつけたプライマやプローブや延
長生成物の作り易さや、自動化する能力や、市販の器具、設備等である。

【０００８】延長生成物：オリゴヌクレオチド・プライマの３’末端から合成されるヌクレ
オチド配列、およびオリゴヌクレオチド・プライマが結合するストランドに相補
的なヌクレオチド配列を示す。

【０００９】側面配列：増幅対象の遺伝子座の多型領域の部分の片側にあるヌクレオチド配
列を示す。「固有側面配列」はゲノム内のある位置にだけ見られる側面配列であ
る。

【００１０】座（あるいは遺伝子座）：染色体のある位置。座の対立遺伝子は相同染色体の
同じ場所に位置している。

【００１１】座適合マーカ：多型遺伝子座のＤＮＡ断片長さのゲル電気泳動測定で使用する
ために作られたＤＮＡ標準マーカで、多型遺伝子座からその真の対立遺伝子ある
いは無効の対立遺伝子から側面配列の長さの変異を通じて誘導される。座適合マ
ーカは本発明の一部を構成している。

【００１２】座特異ＳＴＲマーカ：全ての判明した真の対立遺伝子より短い、あるいは、全
ての判明した真の対立遺伝子より長い、新規な対立遺伝子を生成するため縦列反
復ユニットを減らしたり、加えたりすることによる多型遺伝子座のＤＮＡ断片長
さのゲル電気泳動測定で使用するために作られたＤＮＡ標準マーカ。

【００１３】座特異プライマ：規定された座、あるいはその相補的ストランドの固有側面配
列の一部と特異にハイブリッド形成し、かつ増幅法で使用する条件下で他のＤＮ
Ａ配列と効率よくハイブリッド形成することのないプライマ。

【００１４】多重ポリメラーゼ鎖反応（ｍＰＣＲ）：２つ以上の異なった配列で同時に起き
るポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）についての処置を含むＰＣＲの一バリエーショ
ンである。ｍＰＣＲでは、２つの単一ストランドになった相補的ストランドの形
成後、標識を付けたペアになった複数のオリゴヌクレオチド・プライマが加えら
れる。このペアの各々は異なった配列に特異である。各ペアの一方のプライマは
センス・ストランドの配列の一部に実質的に相補的であり、各ペアの他のプライ
マは相補的なアンチセンス・ストランドの同じ配列の異なった部分に実質的に相
補的である。複数のプライマ・ペアはその相補的配列にアニールされ、また各ペ
アの各プライマから同時に延長される。この延長生成物は各ペアの他方のプライ
マに対する鋳型として働く。

【００１５】多型現象：増幅対象の遺伝子座の一部に見られる遺伝子変異を示す。

【００１６】ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）：変性、プライマでのアニール、およびＤＮＡ
ポリメラーゼというサイクルがターゲットＤＮＡ配列のコピー回数を＞１０６回
まで増幅するために使用される技術。ＰＣＲプロセスは米国特許ＵＳＰ４，６８
３，１９５およびＵＳＰ４，６８３，２０２に詳細に記載されており、これらは
本願に引例として示す。

【００１７】プライマ：複数のプライマの３’末端が極めて近接しているような座の、対向
するストランドをハイブリッド形成する２つの単一ストランドになったオリゴヌ
クレオチドあるいはＤＮＡ断片。

【００１８】プライマ・ペア：増幅対象のＤＮＡ配列の５’末端とハイブリッド形成する５
’前進プライマと、増幅対象のＤＮＡ配列の３’末端の補体とハイブリッド形成
する３’復帰プライマとを有する一組のプライマ。

【００１９】プライマ部位：プライマがハイブリッド形成するターゲットＤＮＡの範囲。

【００２０】泳動時間：ゲルあるいは他のマトリックスの一定長さを介して電界内で移動し
検出器に到達するためＤＮＡ断片に必要な時間。

【００２１】変異対立遺伝子：多型現象の反復ユニットあるいはコア反復ユニットと結合し
、および反復ユニットの変異体数による全ての対立遺伝子あるいはその遺伝子座
の通常の対立遺伝子より短い、あるいは長い、遺伝子座の製造したＳＴＲ対立遺
伝子。

【００２２】電気泳動のサイズ決定の旧来からの方法は、未知のサンプルＤＮＡ断片を長さ
が判明している全く別の配列のＤＮＡ断片と比較するものである。サイズ決めの
標準は、一般的に、プラスミドあるいはバクテリオファージＤＮＡの制限消化に
より、あるいは良く特徴をつかんだ鋳型のＰＣＲ増幅により作られる。効果的に
用いられているが、これらの方法は異なったＤＮＡ配列が独特なＤＮＡコンホメ
ーション力学が生じ、これが同一長さの断片の異なった移動度となる。従って、
標準および同一長さのサンプルＤＮＡ断片はゲル電気泳動では異なったサイズと
して出現する。

【００２３】変性ＤＮＡの電気泳動の移動度は主に、断片の長さと相関関係がある。しかし
、様々な要因が移動度に影響を与える。つまり、電気泳動の媒体の種類（溶液対
ゲル）、濃度、遅延分子の重合と架橋、バッファ、電界強度、温度などである。
同じ見かけの移動条件下での移動レーンによる、また移動のたびの変動と同じよ
うに、異なった運転条件下でのＤＮＡの変化しうる移動度のために、判明した長
さの標準ＤＮＡ断片は、不明の長さのサンプルＤＮＡの基準計測を提供するため
に各移動の部分として共電気泳動に掛けられる。

【００２４】ある目的では、共電気泳動で得た標準断片による電気泳動後の染色サンプル・
バンドの簡単な視覚的比較が未知のサンプルを識別するために適している。自動
ＤＮＡシーケンサの出現は、１つのヌクレオチド（１ｎｔ）の程度までＤＮＡ断
片の違いを解析することを可能としており、こうした装置は換算曲線を作り出し
、サンプル断片の長さを自動的に読み取るために外部および内部ＤＮＡストラン
ドの両者を同時に用いることが可能である。

【００２５】局所的サザン換算式、あるいは関連式が電気泳動移動度を断片長さに変換する
ために一般的につかわれている。（エルダーとサザンによる「一次元制限断片ゲ
ルのコンピュータ解析」、ビショップ、Ｍ．Ｊ．、ロウリングス、Ｃ．Ｊ．編
纂、「核酸とタンパク質配列の分析」、米国オックスフォード、ＩＲＬ出版、１
９８７を参照）（”Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｉｄｅｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆ
ｏｎｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔ
ｇｅｌｓ”、Ｂｉｓｈｏｐ，Ｍ．Ｊ．，Ｒａｗｌｉｎｇｓ、Ｃ．Ｊ．Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄａｎｄＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａ
ｌｙｓｉｓ）。それは換算曲線の局所部分を使用し、未知のサンプルをブラケッ
トする最も隣接する標準マーカにより決められるようにして、全体の曲線から分
かるものより数段正確な測定を得る。エルダーとサザンもＤＮＡ関連配列が非対
応配列のＤＮＡよりはるかに正確な換算を提供したことを報告している。

【００２６】米国特許ＵＳＰ５，５９９，６６６、発明者シュッム（Ｓｃｈｕｍｍ）等、で
は一般に対立遺伝子ラダー、そして特に短い縦列反復（ＳＴＲ）座に対する対立
遺伝子ラダーについて説明しており、その発明の全内容は引例として示す。上記
発明で説明されているように、対立遺伝子ラダーでの早期の仕事は個々のもの（
つまり、個別のゲノムＤＮＡサンプル）から増幅した対立遺伝子を混合し、電気
泳動にかけ分離することであった。分離した対立遺伝子は蛍光プライマを封入す
ることにより標識をつけ、蛍光検出器により識別した。この発明では、特定の座
でのＤＮＡからのＳＴＲ配列は、その座について２つ以上の既知の対立遺伝子と
同じ長さのヌクレオチド断片を含むＳＴＲ対立遺伝子ラダーを使用して識別して
いる。さらに、その発明では、対立遺伝子ラダー成分は配列解析により特徴づけ
られている。対立遺伝子ラダーを構成する断片は、サンプル物質から識別する増
幅した対立遺伝子とサイズおよび配列が同じであり、それ故に、電気泳動分離に
使用したゲル・システムに関わりなく解析対象の断片と同じサイズと配列に応じ
た電気泳動移動度を有する。

【００２７】Ｔ細胞レセプタ（ＴＣＲ）は免疫系による微生物の認識において重要な役割を
演じる。そのための能力の分子ベースは、そのアルファ（Ａ）およびベータ（Ｂ
）鎖の多型ＣＤＲ３領域により形成されたループ内にあり、主たる組織適合分子
により形成された溝に結合した抗原断片に直接接する。ＴＣＲ遺伝子は微生物免
疫ばかりでなく、腫瘍免疫、自己免疫、同種免疫、免疫不全においても中心的役
割を果たす。従って、これらの免疫状態に関わるＴＣＲ遺伝子の識別は生命現象
上重要である。

【００２８】ＴＣＲ・ＣＤＲ３領域は配列と長さの両方が超可変であり、ＴＣＲ遺伝子の５
’可変部分Ｖと３’不変部分Ｃの間にあり、Ｂ鎖と結合部分Ｊ内のＮヌクレオチ
ドおよびＡ鎖内のＮヌクレオチドと同様に、分岐部分Ｄと結合部分Ｊからのヌク
レオチドにより形成される。５０以上の既知Ａ鎖と４５の既知Ｂ鎖ＴＣＲＶ部分
遺伝子がある。それらはＶ遺伝子部分内の相同配列に基づき、３２のＡ鎖ファミ
リ（モス著、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１１５３−１１５９，１９９
２年を参照）および２５のＢ鎖ファミリあるいはサブファミリ（ローエン著、サ
イエンス ”Ｓｃｉｅｎｃｅ”２７２：１７５５−１７６２、１９９６年を参照
）にグループ分けされる。

【００２９】多クローンのＴリンパ球集団からの遺伝子ファミリが、ＣＤＲ３領域に渡って
ＴＣＲ遺伝子を増幅するためにＶ部分およびＣ部分でハイブリッドする側面プラ
イマを使用するＰＣＲで増幅される際に、０から６０ｎｔ長さのＣＤＲ３の多型
系列を産出することが分かる（リュウ著、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．、１８７
：１３９−１５０，１９９５年を参照）。変性条件下でポリアクリルアミド配列
化ゲルでの電気泳動で、異なった遺伝子断片がＣＤＲ３長さにおける単一のアミ
ノ酸の差に対応した３ｎｔの倍数により異なるピークとして解析される。従って
、分離し、クローン化したＴＣＲ・ＡとＢ鎖遺伝子断片を起源集団に正確に関連
づけるためには、電気泳動測定の誤差は１．５ｎｔ未満（＜１．５ｎｔ）でなけ
ればならない。この目的は現在使用されている異種由来のＤＮＡ標準によっては
、一般的に得ることはできない。

【００３０】ＤＮＡ断片長さの精密な電気泳動識別は、ＳＴＲ配列を含む多型遺伝子座の測
定に必要である。ＳＴＲ座は、反復モティーフの多数の複製の変異から得られる
安定した遺伝性の多型マーカの豊富な源を提供する長さが２−７塩基ペア（ｂｐ
）の縦列反復配列成分を含む。２００，０００個の個別の遺伝子座を作る人間の
ゲノムでは、１５０００塩基の頻度で三量体および四量体ＳＴＲが発生する（ベ
ックマンとウェーバ著、ゲノム学、１２：６２７−６３１，１９９２年参照）。
ＳＴＲは人間の識別、実夫確定テスト、リンケージ分析などに有用であることを
証明しており、また、使いやすさと再現性という点からこれらの用途に望ましい
。例えば、シェフィールド著、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．４：１８３７−１８４
４，１９９１年では、ゲノム全域の人間のリンケージ地図を構成する２０００を
超える座の使用について説明されている。大きな反復ユニットを有する小衛星座
と２ｂｐ反復ユニットを有するＳＴＲ座は、他のＳＴＲ座との類似を示すが、技
術的な理由から分析するにはかなり困難である。ある種のＳＴＲ座、特に、テト
ラヌクレオチド反復を含むものは、サイズが１ないし２ｎｔ異なる不完全体の対
立遺伝子を示す（プエル著、サイエンス、２７２：１７５５−１７６２，１９９
３年を参照）。対立遺伝子の指定は最も近くのヌクレオチド（ｎｔ）を巡るもの
なので、ＳＴＲ対立遺伝子検出について０．５ｎｔ未満の誤差が望ましい。

【００３１】ＳＴＲ多型はＰＣＲによってゲノムＤＮＡから増幅される。このＰＣＲは、多
型ＣＤＲ３領域を増幅するためＴＣＲ遺伝子の側面Ｖ部分およびＣ部分特異プラ
イマを使用することに類似した方法で、５’および３’側面配列とハイブリッド
する特異プライマ配列を使用する。異なったＳＴＲ座にたいするプライマ・ペア
、通常、４から８が複合ＰＣＲ内で互いに結合させられる。

【００３２】ＳＴＲ座の対立遺伝子の形は、電気泳動の際に断片長さにより判定したように
、増幅した範囲に含まれた反復配列の複製の数により区別され、また反復ユニッ
トの数に応じで番号がつけられる。対立遺伝子のＰＣＲ断片の識別は、内部レー
ン、あるいは内部と外部の両方において換算標準として非対応のＤＮＡ断片マー
カを用いた粘着性ゲル上で電気泳動により行われている（内部標準はサンプルと
してサンプル・レーンで一標準を移動させることにより行われ、外部標準はサン
プル・レーンに隣接したレーンで一標準を移動させることにより行われる）。毛
細管電気泳動の標準を未知のサンプルの前後のどちらかで異なった移動の際に、
同じゲル上を移動させる。非座特異ＤＮＡから成る信頼性のたかい標準は、１ユ
ニットごとに長さが変化する２０から５０ユニットのコンカテマであり、最近開
発されたものである（ヴァニール”Ｖａｎｉｅｒ”著、ゲノム”Ｇｅｎｏｍｉｃ
ｓ”４１：１−９，１９９７年を参照）。これらホモポリマは電気泳動移動度か
ら得た配列では、それらの間には最小の差しかない。

【００３３】外部レーン・マーカの、最も信頼性のあるラダーはそれら自体の対立遺伝子か
ら合成したものであり（スプレッチャ”Ｓｐｒｅｃｈｅｒ”著、バイオテクニッ
ク”ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”２０：２６６−２７７，１９９６年参照）、
それを用いて測定対象のＤＮＡサンプル対立遺伝子断片の配列を分ける。しかし
、対立遺伝子ラダーは、未知のＤＮＡ断片とゲルでの位置が同じように移動する
ので検出を妨害することになり、内レーン標準として利用することが困難である
。この問題にもかかわらず、モセッティ”Ｍｏｓｃｅｔｔｉ”著、電気泳動”Ｅ
ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ”１６：１８７５−１８８０，１９９５年では未
知のサンプルの検出方法と同じ蛍光体によって標識した対立遺伝子を重複させる
ことによるサンプルのピーク信号の増強を用いた。スミス ”Ｓｍｉｔｈ”著、
バイオテクニック１８：１２２−１２８，１９９５年では、単一のＳＴＲ座内で
３種の異なった蛍光体を使用して、レーン内の対立遺伝子ラダーが非対応ＤＮＡ
標準より優れていたことを示す。エネルギ転移蛍光体が、対立遺伝子および非座
特異標準と未知のサンプルと共に使用するため開発された。それらは通常のレー
ザにより励起されるが、重複しない検出可能な放射を作る（ワン ”Ｗａｎｇ”
著、分析化学 ”Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．”、６７：１１９７−１２０３，１９
９５年、またワン ”Ｗａｎｇ”著、電気泳動 ”Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓ
ｉｓ”、１７：１４８５−１４９０，１９９６年を参照）。

【００３４】

【発明が解決しようとする課題】

本発明の目的は、特にＴＣＲ・ＡおよびＴＣＲ・Ｂ遺伝子多型ＣＤＲ３領域の
測定を含む様々な用途に使用可能な、既知の長さと配列のブラケティング、遺伝
子座適合、あるいは特異ＤＮＡ標準を製造するための方法を提供することである
。

【００３５】本発明の別な目的は、内的にあるいは外的に、ブラケティング、座適合、ある
いは特異ＤＮＡ標準として、多型ＤＮＡサンプルを用いた共電気泳動をかけられ
る測定対象の座から導かれるＤＮＡ標準を生成する方法を提供することである。

【００３６】本発明のさらに別な目的は、ＤＮＡ断片の長さを決定するため座特異ＳＴＲマ
ーカを作り、使用する方法を提供することである。

【００３７】

【課題を解決するための手段】

本発明によれば、遺伝子座の断片長さ多型の適合性のある配列あるいは特異Ｄ
ＮＡマーカは、電気泳動分離の際に座のいくつかの対立遺伝子、あるいは全て既
知の対立遺伝子の長さを重複することのない、密接なブラケティングを目標とし
て作られる。ターゲットの遺伝子座の対立遺伝子に関係した近似の配列と断片長
さのために、その座からのサンプル対立遺伝子と同じレーンで共電気泳動をおこ
なわれたブラケティング座適合マーカはサンプル断片の長さ決定のための正確な
換算標準を提供する。側面配列の充分な長さのブラケティング座特異標準に対し
てＰＣＲ鋳型断片ペアを提供することが本発明の別な目標である。これらの鋳型
ペアは、その座に使用されたＰＣＲプライマによりゲノム・サンプルＤＮＡと共
に増幅させることができる。共増幅はその座に対するブラケティング内部標準に
加え、ＰＣＲ反応に対する積極的な制御を作り出す。また、共増幅はブラケティ
ング・マーカとＴａｑＤＮＡポリメラーゼを３’末端に付加したエキストラ・
ヌクレオチドを有するサンプルＤＮＡに対して機会均等を提供する。

【００３８】さらに、本発明の別な特徴では、多型遺伝子座の座特異ＳＴＲマーカは、全て
の既知の真の対立遺伝子より長いか、短い新規な対立遺伝子を作るために縦列反
復ユニットを加減することにより作られる。これら座特異ＳＴＲマーカは電気泳
動に使われ、多型遺伝子座に対するＤＮＡ断片の長さを決定することができる。

【００３９】

【発明の実施の形態】

本発明のシステムは極めて微量（例えば、１ｎｇ）の人間のＤＮＡを判定する
ため使用できる、迅速で非同位体の方法を提供する。望ましいプロセスは変性媒
体の電気泳動による分離の際、蛍光標識し、増幅し、座適合の、長さ多型ＤＮＡ
生成物を使用するものである。入手可能なゲルあるいはビスコース・マトリック
スあるいは他のサイズ分離法を使用する変性あるいは非変性ＤＮＡ電気泳動と共
に、放射能や種々の染色剤を使用して、これらＤＮＡ断片を検出することも可能
である。

【００４０】遺伝子座の断片長多型に対する配列適合ＤＮＡマーカは、電気泳動分離の際に
その座のいくつか、あるいは全ての既知の対立遺伝子の長さと重複せず、密接な
ブラケティングを目標として作られる。ターゲットの遺伝子座の対立遺伝子への
近い配列と断片の長さの関係のため、その座からのサンプル対立遺伝子と同じレ
ーンで共電気泳動したブラケティング座適合マーカは、サンプル断片長さの決定
用に正確な換算標準を提供する。

【００４１】座適合密接ブラケティング・マーカの製作は、ＤＮＡサンプルの入手、クロー
ニング、および配列決め、増幅、分離および検査等のいくつかの導入ステップを
含む。これらのステップにより、座適合ブラケティング・マーカが製作できる。
この導入ステップの各々は下記に説明する。

【００４２】ＤＮＡサンプルの入手：数人の個人をＤＮＡ分離用に選ぶ。ＤＮＡは標準的な
方法（ピュアジェーン、ジェンタシステム ”Ｐｕｒｅｇｅｎｅ、Ｇｅｎｔａ
Ｓｙｓｔｅｍｓ”製、ミシガン州ミネアポリス在）を用いて血液、組織、あるい
は組織培養細胞から直接抽出する。ＤＮＡ濃度は分光測光法により決定する。Ｋ
５６２コントロールＤＮＡはプロメガ製（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マ
ディソン在）である。

【００４３】ＲＮＡは、本発明者の研究所（ＲＮＡｚｏｌＢ、Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ、テキ
サス州フレンドウッド在）で育成した全血液あるいは人間のリンパ球クローンの
１０ｍｌの密度沈降法（ＬＳＭ、オーガノン・テクニカ ”ＯｒｇａｎｏｎＴ
ｅｋｎｉｋａ”製、ノースカロライナ州ダーラム在）によって得た２−３×１０
６の末梢血液の単核細胞（ＰＢＭＣ）から抽出する。ＲＮＡ密度はＤＮＡと同じ
機器で測定できる。第一ストランドｃＤＮＡ（３３μｌ）は第一ストランドｃＤ
ＮＡキット（ファーマシア ”Ｐｈａｒｍａｃｉａ”、ニュージャージ州ピスキ
ャタウェイ在）を使用して１．０μｇの全ＲＮＡから合成した。

【００４４】クローニングと配列決め：Ｔ細胞クローンは養育細胞としてＰＨＡ、ＩＬ−２
、および１０５自己由来照射（５０００ｒａｄｓ）ＰＢＭＣの存在で、限定した
希釈条件（０．７細胞／ウェル）下で、マイクロタイタ・ウェル内での一次培養
によりＰＢＭＣから得る。ブラント末端のあるＴＣＲＰＣＲ生成物の分子クロ
ーニングはＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＡｍｐＳＫ（＋）クローニング・キット（
ストラッタジェーン ”Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ”製、カリフォルニア州ラジョラ
在）で行った。クローンのＴＣＲ断片のサイクル配列決めがｆｍｏｌ（商標）Ｄ
ＮＡサイクル配列決めシステム（プロメガ ”Ｐｒｏｍｅｇａ”製）とＡ．Ｌ．
Ｆ．自動ＤＮＡシーケンサ（ファーマシア ”Ｐｈａｒｍａｃｉａ”製）で行わ
れた。

【００４５】増幅：ＤＮＡサンプルはプライマと各座に対して特異な熱循環条件を使用して
ＰＣＲ増幅にかけられる。以下の表１は遺伝子座特異プライマ・ペアの配列を示
す。

【００４６】

【表１】

【００４７】表１内の肩番号の説明。１プライマの５’末端はＣｙ５で標識をつけられる。２プライマの５’末端はＣｙ５あるいはフルオレセインで標識をつけられる。３プライマの５’末端はフルオレセインで標識をつけられる。４下線をつけたヌクレオチドはゲノム配列に相補的である。ａ配列参照：ＣＳＦ−１レセプタに対する人ｃ−ｆｍｓプロト潰瘍遺伝子。遺
伝子バンクのアクセスはＸ１４７２０ＮＩＤ。ｂ配列参照：人間の凝固因子ＸＩＩＩサブユニット遺伝子、５’側面。遺伝子
バンクのアクセスはＭ２１９８６Ｊ０３８３４ＮＩＤｇ１８２２９３。ｃ配列参照：人ｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓプロト潰瘍遺伝子。遺伝子バンクのアクセ
スはＸ０６２９２Ｍ１４２０９Ｍ１４５８９ＮＩＤ。

【００４８】表１内の参考の詳細は下記のとおりである。Ｌｉｕｅｔａｌ（リュウ等）：本明細書中に提示したデータ。Ｇｅｎｅｖｅｅ、Ｃ（ジェネビイ、Ｃ）：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．２２：１
２６１−１２６９（１９９２）。Ｃｈｏｉ，Ｙ．（チョイ、Ｙ）：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８
６：８９４１−８９４５（１９８９）。Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍ．（ロビンソン、Ｍ）：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６（
１２）：４３９２−４３９７（１９９１）。Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｈ．（ハモンド，Ｈ）：Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、５５：
１７５−１８９（１９９４）。Ｐｕｅｒｓ，Ｃ．（プエル，Ｃ）：Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２３：２６０−２６４（
１９９４）。

【００４９】以下の例は各座に関連の特異処置の詳細を示す。座特異プライマは、ハイブリ
ッド形成で使用された条件下で、増幅対象の座の対立遺伝子とハイブリッドを形
成し、他の座の対立遺伝子とのハイブリッドから解放されたいくつかのヌクレオ
チドを有する。オリゴヌクレオチド・プライマはオペロン・テクノロジ製（Ｏｐ
ｅｒｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州アラメダ在）である。
米国特許ＵＳＰ．５，１９２，６５９、発明者サイモン（Ｓｉｍｏｎ）、は遺伝
子座特異プライマについて詳しく記述しており、この特許は本明細書に引例とし
て示す。

【００５０】本発明の一実施例では、ＴＣＲ・ＡおよびＢ遺伝子ＣＤＲ３多型をＤＮＡ断片
長さ判定用に選んだ。５’側面可変（ＶＡ）あるいは（ＶＢ）部分のファミリ特
異領域とハイブリッド形成するＰＣＲプライマが前進プライマとして働き、３’
側面コンスタント（ＣＡ）あるいは（ＣＢ）部分とハイブリッド形成するプライ
マが復帰プライマとして働く（著者リュウ、 ”Ｌｉｕｅｔａｌ．”，Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．１８７：１３９−１５０，１９９５を参照）。各ＰＣ
Ｒ反応は１．０μｌの前進、復帰プライマ（各々３μＭ）と、０．１５μｌのＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼと、０．１５μｌ、１０μＭｄＮＴＰｓ、１．０μｌ
のｃＤＮＡと、最終容量を１０．０μｌとするための水から構成した。３０サイ
クルのＰＣＲが９４℃で４５秒間の変性、５５℃で４５秒間のアニーリング、７
２℃で４５秒間の延長、そして、最後のサイクルの後に７２℃で１０分間の延長
が行われた。

【００５１】別の実施例では、フルオレセイン標識をした対立遺伝子ラダーと３つの個々の
座からのプライマを含む３つのＳＴＲキットをプロメガ；Ｐｒｏｍｅｇａ（遺伝
子プリント蛍光ＳＴＲシステム、ウィスコンシン州マディソン）から購入した。
すなわち、ＣＳＦ１ＰＯ、ＦＥＳＦＰＳ、Ｆ１３ＡＯ１。ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼおよび１０Ｘバッファはボエリンガ・マンハイム製（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナ州インディアナポリス在）である。１９９６
年２月の技術マニュアルのプロメガ・プロトコル８を使用するＰＣＲ増幅に、パ
ーキン・エルマ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）４８０ＤＮＡサーモサイクラを使
った。遺伝子座特異側面配列５’と３’にハイブリッドし、縦列反復領域（表１
）を形成するＳＴＲ遺伝子座特異プライマ（プロメガ製）でＳＴＲサンプルＤＮ
Ａを増幅した。５０から５００ｂｐの間隔のＤＮＡ標準ラダーはファーマシア製
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。

【００５２】ＤＮＡ断片の分離と検出：増幅生成物は電気泳動、例えば、変性ポリアクリル
アミド・ゲル電気泳動により分離する。電気泳動は自動ＤＮＡシーケンサＡ．Ｌ
．Ｆ．およびＡ．Ｌ．Ｆ．エクスプレス（ファーマシア製）上で０．５ｍｍ厚の
６％変性ポリアクリルアミド事前混合ゲルとＴＢＥバッファ（ゲルミックス６と
ゲルミックス・ランニング・メイト；Ｇｅｌ−Ｍｉｘ６＆Ｇｅｌ−Ｍｉｘ
ＲｕｎｎｉｎｇＭａｔｅ、ＧＩＢＣＯＢＲＬ、メリーランド州ガイザーズバー
グ在）内で行われる。製造元の推薦に基づき、Ａ．Ｌ．Ｆ．／Ａ．Ｌ．Ｆ．エク
スプレスの操作条件は電圧１５００Ｖ／１５００Ｖ、電流３８ｍＡ／６０ｍＡ、
出力３ｍＷ／３ｍＷ、温度４２℃／５５℃である。

【００５３】分析対象の全てのＤＮＡの一本のストランドに標識をつけるため、各ＰＣＲプ
ライマ・ペアの片方を適切な蛍光体（Ａ．Ｌ．Ｆ．用フルオレセイン、Ａ．Ｌ．
Ｆ．エクスプレス用Ｃｙ５）で標識する。データは以下の設定を用いてフラグメ
ント・マネージャ ”ＦｒａｇｍｅｎｔＭａｎａｇｅｒ”（登録商標）１．２
ソフトウェア（ファーマシア製）で分析する。すなわち、ピーク幅１０、ピーク
高さ０．５、クラスター感度０である。このソフトウェアはゲル内のサンプルの
電気泳動移動度に基づき、同じレーン（内部マーカ）および／あるいは別のレー
ン（外部マーカ）における既知のサイズ・マーカとの比較により自動的に断片長
さを決める。各ゲル・レーンに乗せるＰＣＲ生成物の量は、各断片が隣接するピ
ークから区別できる単独ピークを作るように調節する。

【００５４】遺伝子座適合ブラケティング・マーカの作製：座適合ブラケティング・マーカ
の作製は、増幅のためターゲットにした遺伝子座の多型領域の固有側面配列に特
異なＰＣＲプライマの使用を伴う。望ましい実施例では、このプライマは誘導物
質の存在で特異配列から延長生成物の合成を開始するに充分な長さの単一ストラ
ンドのオリゴ・デオキシリボ・ヌクレオチドである。そのオリゴヌクレオチド・
プライマの感度と特異性は、鋳型ＤＮＡの与えられたサンプルでプライマ長さと
配列の固有性により決められる。本発明では、オリゴヌクレオチド・プライマは
通常１５ｍｅｒより大きく、望ましい実施例では約２０−３０ｍｅｒ以上の長さ
である。

【００５５】プライマの各ペアを異なった遺伝子座の部分を検出するために選択する。ここ
での各ペアの各プライマは、増幅対象の各特異遺伝配列の側面配列内の異なった
ストランドと実質的に相補的となるように選択する。こうして、各ペアの一方の
プライマはセンス・ストランドの配列の一部とハイブリッドするに充分相補的で
あり、各ペアの他方のプライマはアンチセンス・ストランドの同じ配列の別な部
分とハイブリッドするに充分相補的である。プライマ配列は鋳型の正確な配列を
反映する必要はないが、３’末端が正確な配列を反映するほどアニーリング段階
での結合がよくなる。

【００５６】一実施例では、プライマは側面配列位置５’と３’を古典的位置へ向けられ、
ＰＣＲ反応の他の古典的な側面配列プライマと結合した時に、古典的生成物より
短い、または長い増幅生成物を作る。新しい増幅生成物は電気泳動フィールドで
古典的生成物より速く、あるいは遅く移動することになり、古典的生成物の位置
に対するブラケティング・マーカとして働く。

【００５７】別の実施例では、与えられた多型領域を増幅するため使用した古典的プライマ
・ペアと部分的に一致し、その長短のみ異なる位置で新たに設計したプライマが
結合できる。短いプライマは、短い増幅生成物を作るようにターゲットの多型座
から最も離れた末端で短くされる。長いプライマは、長くした増幅生成物を作る
ようにターゲットの座から最遠い末端で長くされる。対向する固有側面配列から
の古典的な座特異プライマとペアとなったなら、短、長それぞれのＤＮＡ断片を
増幅することになり、それらは電気泳動による断片長さの分析の際に従来の方法
で増幅した生成物とブラケティングすることになる。

【００５８】望ましい実施例では、この修正した座特異プライマを使用し、多型領域からの
所望長さの選択対立遺伝子を増幅することにより標準電気泳動マーカを作る。短
くされたプライマは、遺伝子座の多型領域の対立遺伝子あるいは普通の対立遺伝
子より大きな電気泳動移動度を有する短いブラケティング・マーカを作るために
、その多型領域から最も短い対立遺伝子あるいは、短い希な対立遺伝子を短くす
るため使用される。長くされたプライマは、遺伝子座の多型領域の対立遺伝子あ
るいは通常の対立遺伝子より小さな電気泳動移動度を有する長いブラケティング
・マーカを作るために、その多型領域から最も長い対立遺伝子あるいは、長い希
な対立遺伝子を増幅するため使用される。

【００５９】別の実施例では、自然に存在する対立遺伝子あるいは通常の対立遺伝子より短
い、あるいは長い変異対立遺伝子を作るために、多型領域の固有側面配列より多
型領域そのものを変えるように数組のプライマ・ペアを設計する。本願では、多
型領域を増幅するため古典的に使用された同じ側面配列特異プライマを使って変
異対立遺伝子を増幅し、多型遺伝子座の対立遺伝子あるいは通常の対立遺伝子よ
りも小さな電気泳動移動度あるいは大きな移動度を有する密接にブラケティング
する増幅生成物のペアを、それぞれ作る。従って、ブラケティングする変異対立
遺伝子は、分析下のサンプル対立遺伝子と同じＰＣＲ反応で増幅可能である。

【００６０】図１は本発明の一実施例の概略を示しており、５’末端での開始で識別された
センス・ストランドおよび３’末端での終了で識別されたアンチセンス・ストラ
ンドを従来より有する分析対象の遺伝子座からのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）断
片である。その多型領域Ｐは側面配列とハイブリッド形成する前進プライマ１と
復帰プライマ２によりＰＣＲで増幅される。プライマ３と４はプライマ２からの
位置５’と３’で復帰プライマと同じセンス・ストランドと、それぞれハイブリ
ッド形成するように作られる。プライマ３と４はプライマ１からの同等位置５’
と３’でプライマ１と同じアンチセンス・ストランドとハイブリッド形成するよ
うに、同じように作られる。

【００６１】望ましい実施例では、復帰プライマ２、３、４の各々はマーカ、例えば蛍光体
、放射線マーカ、または検出識別可能な他の適切なもので標識される。あるいは
、前進プライマ１は標識可能で、プライマ２、３、４は標識不可能であり、また
は全てのプライマが標識可能である。図１に示した実施例では、プライマ２、３
、４を使用して長さを変えた延長生成物を作る。ＰＣＲを行う際に、プライマ１
で開始しプライマ２、３、４で終結する断片が作られる。これらの断片は電気泳
動を使用して分離可能であり、復帰プライマ３と４でそれぞれ作られた長短延長
生成物が復帰プライマ２で作られた延長生成物とブラケティングする。ブラケテ
ィング延長生成物が、その５’と３’末端でプライマ１とプライマ２を有する古
典的断片で分けられた領域内で同じ配列を有する範囲では、電気泳動媒体（例え
ば、ゲル）内で同様の移動度を有することになる。さらに、プライマ３と４で既
知の鋳型から増幅したブラケティング延長生成物の長さが、その配列から正確に
分かるので、プライマ１と２で増幅された未知のサンプルの対立遺伝子領域の長
さは、長さ換算マーカとしてブラケティング延長生成物を使用して容易に決定で
きる。さらに、プライマ３と４は増幅した多型領域と重複しないように選択する
ので、そのブラケティング延長生成物は容易に識別できる。

【００６２】図２は図１に示した方法のバリエーションである。特に、遺伝子座の多型領域
はアンチセンス・ストランドの前進プライマ５とセンス・ストランドの復帰プラ
イマ６’、６”、あるいは６”’で結合している。復帰プライマは蛍光体あるい
は放射分析標識で標識されるのが望ましく、ヌクレオチド配列６から選択する。
しかし、プライマ５は本発明の方法で標識可能であることが分かる。最も長いプ
ライマ６’は配列６のヌクレオチドの全部、あるいはほとんどを構成する。プラ
イマ６”は遺伝子座に対する古典的な既知のプライマが望ましく、６’にあるヌ
クレオチドの別な既知数を除いてプライマ６’と等しい。プライマ６”’は最も
短いプライマである。プライマ６”’はプライマ６”の５’末端に見られるもの
と同じヌクレオチドを有するが、３’末端の二、三のヌクレオチドを欠いている
。

【００６３】ＰＣＲの際に、標識した断片を作り、各々は５’末端でプライマ５と、３’末
端で標識したプライマ６’、６”、あるいは６”’を有する。電気泳動の際、各
々の断片は同じコンホメーションを有するので同じ相対移動度を持ち、６’ある
いは６”で終了する断片は６”で終了する断片をブラケティングする。ブラケテ
ィングした断片のヌクレオチドの数は分かるので、プライマ６”で増幅した未知
の断片の長さはプライマ６’と６”で増幅した既知の断片を参照して容易に決定
できる。

【００６４】図３は、短い縦列反復（ＳＴＲ）座に対する座適合ブラケティング・マーカの
製造に適用できる本発明の一実施例を示す。異なった長さのＮ対立遺伝子を含む
対立遺伝子ラダーを、側面配列プライマＰ１とＰ２を使用して、ＳＴＲ座を含む
ゲノムＤＮＡの複数サンプルから作る。ＰＣＲ増幅対立遺伝子はプラスミド・ベ
クタへとクローニングを行い、そしてバクテリアへと転換させた。最も短い対立
遺伝子、および最も長い対立遺伝子、あるいは通常の対立遺伝子を分離する。こ
れらの対立遺伝子はおのおの、５’末端のプライマＰ１と同一で、３’末端のプ
ライマＰ２と同一のヌクレオチド側面配列で終了する。

【００６５】プライマＰ１は蛍光マーカ、放射能マーカあるいは他の適当なマーカで標識を
する。従って、センス・ストランドおよびアンチセンス・ストランドを分離した
時、センス・ストランドを標識することになる。

【００６６】プライマＰ２はＳＴＲ座の復帰プライマである。プライマＰ２はある数（Ｘ）
のヌクレオチドを付加することにより変異させて長いＰ２プライマを形成するか
、あるいは、ある数（Ｙ）のヌクレオチドを削ることにより短いＰ２プライマを
形成する。付加あるいは削除したヌクレオチドの数は、のぞましくは同数である
。さらに、ＳＴＲ座の反復ユニットに含まれるヌクレオチドの数を付加、あるい
は削除し、生成したブラケティング・マーカがＳＴＲ領域より長さが短いか、長
いヌクレオチドの固定反復数となるようにすることが最も望ましい。

【００６７】図３に示したように、短いＰ２プライマは最も短い対立遺伝子にハイブリッド
され、長いＰ２プライマは最も長い対立遺伝子にハイブリッドされる。鋳型とし
て短い対立遺伝子と長い対立遺伝子を使用することで、標識したＰ１前進プライ
マと各々結合した短いＰ２プライマおよび長いＰ２プライマからの延長生成物が
増幅される。図３から分かるように、短いＰ２プライマとの延長生成物は変異前
のプライマＰ２にあったＹ部分を欠落しており、長いＰ２プライマとの延長生成
物は変異前のプライマＰ２では無かったＸ部分を有する。従って延長生成物は、
変異前のプライマＰ１とＰ２で作ったＰＣＲ生成物より大きいあるいは小さい既
知の数のヌクレオチドを有し、またこれら生成物は変異前のプライマＰ１とＰ２
で作ったＰＣＲ生成物にしっかりとブラケティングすることになる。

【００６８】ブラケティング・マーカの長さは正確に分かり（Ｘ加算とＹ減算から）、また
変異前のプライマＰ１とＰ２で作ったＰＣＲ対立遺伝子生成物と同様な電気泳動
の移動度を有し、遺伝子座の既知あるいは共通の対立遺伝子領域と重複しないの
で、これらの座適合ブラケティング・マーカはＳＴＲ座の長さを正確に決定でき
る。

【００６９】図４は、自然にある対立遺伝子または共通の対立遺伝子より短い、あるいは長
い変異対立遺伝子を作るために、多型領域そのものの反復ユニットを削除したり
挿入したりする構成を示す。一対の古典的ＳＴＲプライマ、前進プライマ５およ
び復帰プライマ６”によりゲノムＤＮＡから増幅した古典的ＰＣＲ生成物は、反
復領域から２つの部分に分割される。古典的生成物の５’部分は、反復領域から
復帰プライマ７’と７”それぞれ対になった古典的前進プライマ５により増幅さ
れる。復帰プライマ７’は短い変異対立遺伝子の反復ユニットの半分を有する。
復帰プライマ７”は長い変異対立遺伝子を作るため必要な反復ユニットの半分を
有する。古典的生成物の３’部分は、反復領域からの前進プライマ８’と８”と
それぞれペアを組んだ古典的復帰プライマ６”により増幅される。前進プライマ
８’は短い対立遺伝子を作るための反復ユニットの半分を含む。前進プライマ８
”は長い対立遺伝子を作るための反復ユニットの残り半分を含む。反復領域から
の４つのプライマの各々はその５’末端のエキストラ・ヌクレオチドで始まり、
それは例えばＥａｍ１１０４Ｉシームレス制限酵素により認識され、反復ユニッ
ト・ヌクレオチドで連続し、３’末端の側面配列ヌクレオチドで終わる。ＰＣＲ
の後、４つの断片の各々はシームレス制限酵素（例えば、Ｅａｍ１１０４Ｉ）に
より消化され、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結されて２つの断片になる。プライ
マ・ペア７’と５により増幅した断片はプライマ・ペア８’と６”により増幅し
た断片により連結されて短い対立遺伝子あるいは最短の通常対立遺伝子を形成す
る。プライマ・ペア７”と５により増幅された断片はプライマ・ペア８”と６”
により増幅された断片と連結させて長い対立遺伝子あるいは最長の通常対立遺伝
子を形成する。電気泳動分離の際、最短、最長通常対立遺伝子は自然にある対立
遺伝子あるいは「通常の」対立遺伝子をブラケティングし、正確な長さ決定が可
能となる。

【００７０】

【実施例】

本発明の利点を説明し、当業者が同じものを使用できるように以下に例を提示
する。しかし、これらの例は添付の請求の範囲に記載されている請求項を限定す
るものではない。

【００７１】例１ＴＣＲＡ遺伝子座由来のＶ７ファミリ遺伝子の多型ＣＤＲ３領域長さ測定用の
遺伝子座適合ブラケティング・マーカの製造

【００７２】リンパ球生成の間、各ＴＣＲＡ遺伝子は５０以上のＡＶ部分遺伝子、６３以上
のＡＪ部分遺伝子、および単一のＡＣ部分遺伝子の各一種よりの生体組み換えを
通じて得る（デービス ”Ｄａｖｉｓ”著：ネーチャ３３４：３９４−４０２，
１９８８；およびモス ”Ｍｏｓｓ”著：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：
１１５３−１１５９，１９９３等を参照）。ＡＶ部分とＡＣ部分間の多型ＣＤＲ
３領域の長さおよび配列はヌクレオチド削除およびＮヌクレオチド付加によりＡ
Ｊ部分の変異性の部分から作られる。ＴＣＲＡＣＤＲ３領域長さの範囲は０−
１７ａａである。（発明者リュウ、Ｄ．，ダウ，Ｐ．等の米国特許出願Ｎｏ．０
８／５５９，２０５を参照。なお、これは本願の引例として示す。）配列相同に
基づき、ＴＣＲＡ遺伝子は３２ファミリにグループ分けされ、それらの多型ＣＤ
Ｒ３領域は、共通ＡＣ部分復帰プライマとの組み合わせでファミリ特異ＡＶ部分
前進プライマにより増幅される。これら遺伝子部分は各ＴＣＲＡＶ遺伝子ファミ
リのＣＤＲ３断片長さ多型に対する側面配列として働く。

【００７３】共通ＡＣ部分プライマを使用して、全てのＴＣＲＡＶファミリのＣＤＲ３断片
長さ多型の増幅における下流の側面配列とハイブリッドするので、電気泳動の際
に短いＤＮＡ断片および長いＤＮＡ断片を増幅し、古典的に増幅した断片をブラ
ケティングするために、２つの追加ＡＣ部分プライマが作られ古典的ＡＣ部分プ
ライマ結合位置からの５’と３’に位置したＡＣ配列とハイブリッドする。

【００７４】この方法の原理は全てのＡＶファミリに適用できる。なぜなら、各ファミリに
特異の異なったＡＶ上流側面プライマと関連して、同じ下流側面のＡＣ部分プラ
イマを多型ＣＤＲ３領域の増幅用に使用するからである。しかし、新たに作った
ＡＣプライマは熱的に、かつ、ペアを作るファミリ特異ＡＶプライマの各々と適
合する配列でなければならない。均質のＰＣＲ鋳型を用いたので、熱適合性は因
子とはならず、以下に説明する同じ新しい作りのＡＣ部分プライマをどのペア間
とも不適合な配列を除外する全ての２８ＡＶ部分プライマとうまくペアを組める
ようにする。不適合プライマ・ペアは、各ＡＶファミリに対する適合ペアが見つ
かるまで、別のＡＶあるいはＡＣ特異配列とハイブリッド形成するように再構成
することが可能である。

【００７５】Ｔ細胞クローンＮｏ．２６３からのｃＤＮＡは分離ＰＣＲ反応で増幅した。各
反応は、側面ＡＣ部分の５’末端の初めの１２９ｎｔを増幅する共通ＡＣ１２９
復帰プライマと共に２９のＴＣＲＡＶファミリ（ジェネビ ”Ｇｅｎｅｖｅｅ”
著、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｏｎｏｌ．２２：１２６１−１２６９，１９９３年参照
）の一つに対して特異な前進プライマを使用している。Ｔ細胞クローンは一方だ
けの反応から特異生成物を作り出した。非特異生成物は配列決めのゲル電気泳動
の際の断片長さ決め又は、配列決めにより排除された。ＡＶ７−ＡＣ１２９プラ
イマ・ペアで増幅したｃＤＮＡは、単クローンで、２７ｎｔのＣＤＲ３領域長さ
を有し、ｎｔのＡＪ２６遺伝部分を表し、３４９ｎｔの全断片長さを有すること
が分かった。さらに、分子クローン（Ｎｏ．１４７）がＰＢＭＣ由来のＡＶ７−
ＡＣ１２９増幅の多クローンｃＤＮＡの分子クローニングから得られた。ブラン
トエンドのＰＣＲ生成物のクローニングはｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ク
ローニング・キット（ストラータジェーン：”Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ”製、カリ
フォルニア州ラジョラ在）で行った。配列決めの際、Ｍ１４７は３０ｎｔのＣＤ
Ｒ３長さを有し、ＡＪ５遺伝子部分を表し、３５２ｎｔの断片長さを有した。

【００７６】古典的ＡＣ部分復帰プライマはＡＣ部分の５’５７ｎｔを増幅するので、古典
的生成物よりも３０ｎｔ短いあるいは長い生成物を生み出すＡＣ部分の５’２７
および８７ｎｔをそれぞれ増幅するように、長短復帰ＡＣ部分プライマは作られ
た。このように、鋳型としてクローンＮｏ．１４７ＤＮＡで、これらブラケティ
ング・マーカが０から６０ｎｔのＣＤＲ３領域を取り囲み、それによりサンプル
ＴＣＲＡＤＮＡの予測ＣＤＲ長さ範囲を取り囲むことになる。

【００７７】３つのＴＣＲＡＣ部分プライマ全ては、蛍光検出用にＣｙ５で５’標識した。
図５Ａ−Ｂは３ＡＣ部分プライマが分離ＰＣＲ反応でＡＶ７部分プライマと結合
したことを示しており、これらＡＣプライマは６０ｎｔ離れたＰＣＲ生成物を生
成した。図５ＡはクローンＮｏ．１４７が対応の断片長さ２５０，２８０および
３１０ｂｐを有することを示す。図５ＢはクローンＮｏ．２６３がその３ｎｔ短
いＣＤＲ３領域と関係のある長さ２４７，２７７，３０７の断片を有することを
示す。

【００７８】これらのクローンからのＤＮＡプラスＡＶ７／ＡＣ５７プライマ・ペアで増幅
し、配列決めした別の１５クローンからのＰＣＲ増幅したＡＶ７ファミリ特異Ｄ
ＮＡは、上記したようにブラケティング標準として、遺伝子座無作用１００／３
５０ｂｐおよび２００／３５０ｂｐマーカとＣＡ２７とＣＡ８７遺伝子座適合マ
ーカを使用して電気泳動断片解析により測定した。結果は配列により決定した長
さと比較した。２４７−３０７ｂｐブラケティング・マーカ・ペアをＡ．Ｌ．Ｆ
．エクスプレスで用いた時、測定した最大偏差は０．３ｎｔ（平均０．１０±０
．１３ｎｔ）で、これは１．５ｎｔ未満の望ましい値の内にある。２５０／３１
０ｂｐブラケティング・マーカ・ペアに対して、偏差は０．６ｎｔ（平均０．２
５±０．１５ｎｔ）で高く、ＡＶ７ファミリ特異ブラケティング・マーカの２ペ
ア間のＣＤＲ３領域配列の不均一性を反映している。真の断片長さからの最も大
きな偏差（４．２５±０．２３ｎｔ）は１００／３５０ｂｐ遺伝子座無作用マー
カで判明した。２００／３５０ｂｐ無作用の標準マーカを使用した時、平均偏差
は１．０８±０．１１ｎｔに減少した。これは１００と２００ｂｐ標準マーカ間
の配列不均一性の効果、およびサンプルＤＮＡに対するブラケティング標準の窮
屈さを示している。

【００７９】例２ＴＣＲＡ遺伝子座由来のＶ１６ファミリ遺伝子の多型ＣＤＲ３領域長さ測定用
の遺伝子座適合ブラケティング・マーカの製造

【００８０】リンパ球生成の間、各ＴＣＲＢ遺伝子は４５ＴＲＣＢＶ部分遺伝子、２ＢＤ部
分遺伝子、１３ＢＪ部分遺伝子、および２ＢＣ部分遺伝子の各々よりの生体組み
換えを通じて得る（デービス ”Ｄａｖｉｓ”著：ネーチャ３３４：３９４−４
０２，１９８８；およびローウェン ”Ｒｏｗｅｎ”著：サイエンス２７２：１
７５５−１７６２，１９９６等を参照）。ＢＶ部分とＢＣ部分間の多型ＣＤＲ３
領域の長さおよび配列はヌクレオチド削除およびＮヌクレオチド付加によりＢＤ
およびＢＪ部分の変異性部分から作られる。配列相同に基づき、ＴＣＲＢ遺伝子
は２５のファミリあるいはサブファミリにグループ分けし、それらの多型ＣＤＲ
３領域は、共通ＢＣ部分の復帰プライマとの組み合わせで異なったファミリ特異
ＢＶ前進プライマにより増幅される。これら遺伝子部分は各ＴＣＲＢＶ遺伝子フ
ァミリのＣＤＲ３多型に対する側面配列として働く。

【００８１】共通ＢＣ部分プライマをブラケティングするため、２つの別なＢＣ部分プライ
マを作り、ＢＶファミリ特異プライマとの組み合わせで短いＤＮＡ断片および長
いＤＮＡ断片を増幅するために古典的ＢＣ部分プライマから５’および３’に位
置したＢＣ配列とハイブリッドした。増幅したＤＮＡ断片長さは電気泳動の際に
古典的に増幅した断片をブラケティングした。原理では、この技術は全てのＢＶ
ファミリに適用できる。なぜなら、それらの同一あるいは高度に類似したＢＣ部
分が、それらの５’側面ファミリ特異ＢＶプライマと関連して、共通３’側面Ｂ
Ｃプライマを全てのＢＶ遺伝子の多型ＣＤＲ３領域の増幅に使用できるからであ
る。しかし、新たに作ったＢＣプライマは熱的に、かつ、ペアを作るファミリ特
異ＢＶプライマの各々と適合する配列でなければならない。高度に均質のＰＣＲ
鋳型を用いたので、熱適合性はさほど重要ではなく、以下に説明する同じ新しい
作りのＢＣ部分プライマをどのペア間とも不適合な配列を除外する全ての２５Ｂ
Ｖ部分プライマとうまくペアを組めるようにする。不適合プライマ・ペアは、各
ＢＶファミリに対する適合ペアが見つかるまで、別のＢＶあるいはＢＣ特異配列
とハイブリッド形成するように再構成することが可能である。

【００８２】Ｔ細胞クローンＮｏ．２９６用のｃＤＮＡは２５分離ＰＣＲ反応用の鋳型とし
て作用した。各々は、側面ＢＣ部分の５’末端の初めの５４ｎｔを増幅した共通
ＢＣ５４復帰プライマに関連して、２５のＴＣＲＢＶファミリ（リュウ著、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８７：１３９−１５０，１９９５参照）の一つに
対し特異な前進プライマを用いた。このＴ細胞クローンは、ＢＶ１６ファミリ特
異プライマのみ有する特異生成物を生成した。非特異増幅生成物は、この生成物
が同じ機器でＤＮＡサイクル配列決めによる適切な配列の、あるいは自動ポリア
クリルアミド配列ゲル電気泳動の際にＢＶファミリに対する適切な長さ範囲内に
あると決めることにより除外された。

【００８３】ＢＶ１６−ＢＣ１６８プライマ・ペアで増幅したｃＤＮＡは、その配列により
決定したように３６３ｂｐの長さを有する単クローン性であった。そのＣＤＲ３
領域は３０ｎｔであり、ＢＪ１．２遺伝子部分を用いた。古典的ＢＣ部分復帰プ
ライマはＢＣ部分の５’末端の５４ｎｔを増幅するので、ＢＣ部分の５’２４ｎ
ｔ増幅の短い復帰プライマおよびＢＣ部分の５’９２ｎｔを増幅する長い復帰プ
ライマが構成された。この３つのＢＣ部分プライマの一組がフルオレセイン標識
して生成され、別の物はＣｙ５で標識した。

【００８４】古典的ＢＣ５４復帰プライマと組み合わせたファミリ特異ＢＶ１６プライマは
、Ｖ部分の３’末端領域と、ＣＤＲ３領域全体と、Ｊ領域全体と、Ｃ遺伝子部分
の５’末端から位置５４を取り囲むＴＣＲ特異断片を発生した。この断片の配列
は２４９ｂｐであった。別のＤＮＡ断片を、ＣＢ５４プライマの代わりにＢＣ２
４プライマあるいはＢＣ９２プライマでＰＣＲ反応を繰り返すことにより生成し
た。このようにして、ＢＣ部分３’延長の長さを除いて２４９ｂｐ断片と同一の
遺伝子座特異配列の２１９ｂｐおよび２８７ｂｐのＴＣＲＢＶ１６特異断片が作
られた。

【００８５】図６は、古典的２４９ｂｐ生成物とブラケティングする２１９ｂｐおよび２８
７ｂｐ遺伝子座特異生成物の分離を示す。Ａ．Ｌ．Ｆ．機器での電気泳動を行っ
た時、２４９ｂｐ断片はこれらの遺伝子座適合マーカで測定して−０．３ｎｔの
偏差を記録した。同じレーンで共電気泳動をおこなった１００／３００ｂｐ遺伝
子座無作用標準は、−１．５ｎｔの偏差で測定するので２４９ｂｐ生成物を信頼
をもって識別できなかった。１２の別なＢＶ１６特異Ｔ細胞クローンが識別され
、これらＴＣＲ３ＣＤＲ３領域はクローンＮｏ．２９６と共に測定された。２
１９／２８７ｂｐ遺伝子座特異ブラケティング・ペアで記録された平均絶対偏差
は０．５２±０．３８ｎｔであった。偏差の範囲は−０．３から＋０．８ｎｔで
あり、ＢＣ部分の長さの違いに加え、ＣＤＲ３領域と個別のクローンを有するブ
ラケティング座適合マーカのＪ部分との間での部分配列不適合を反映している。
同じレーンでの共電気泳動した１００／３００ｂｐブラケティング無作用標準ペ
アでの測定では、平均絶対偏差は０．８１±０．４９ｎｔであった。

【００８６】異なった運転条件での影響、主に温度上昇などでのこれらの結果についての影
響を知るために、この実験をＡ．Ｌ．Ｆ．エクスプレスで繰り返した。そして、
測定した絶対偏差は遺伝子座適合ブラケティング標準を用いて０．１７±０．２
１ｎｔに低下したが、同じレーンで遺伝子座共電気泳動によるものは３．３１±
０．７４に増加した。この結果は、無作用標準と比較した遺伝子座適合標準の、
運転条件の変化での偏差の変化に対する相対抵抗を示している。遺伝子座無作用
標準と遺伝子座特異ＤＮＡ間の大きな配列および長さの不適合は、異なった運転
条件が異なった移動度を増大させることになり、それが大きな測定誤差を生み出
す。ゲル・ポリマ、電気泳動バッファ、移動路の長さ等はＡ．Ｌ．Ｆ機器および
Ａ．Ｌ．Ｆ．エクスプレス機器と同一である。

【００８７】全体的に、これらの結果は、ＴＣＲ遺伝子の電気泳動測定がブラケティング座
無作用内部標準に比べてブラケティング座適合内部レーン標準で実施する時に、
偏差の量が１．５ｎｔ未満の必要値内で信頼できるように改善されたことを示す
。これらの測定誤差の差は、ＣＤＲ３領域でアミノ酸の追加あるいは削除により
３ｎｔの倍数だけ長さが違うのでＴＣＲ断片長さを電気泳動により決める時に深
刻となる。従って、多型ＣＤＲ３断片は誤差が１．５ｎｔ未満なら互いに確実に
区別することができる。

【００８８】例３側面配列の変異によりＳＴＲ遺伝子座ＣＳＦ１ＰＯ、ＦＥＳＦＰＳ、Ｆ１３Ａ
０１用の遺伝子座適合ブラケティング・マーカの製造

【００８９】３つのＳＴＲ遺伝子座用の遺伝子座適合ブラケティング・マーカは、各遺伝子
座から長い対立遺伝子あるいは短い対立遺伝子の末端に複数のヌクレオチドを加
えたり、削除したりすることにより作製した。ＳＴＲ分子を測定するのと同様の
電気泳動移動度を有するブラケティング・マーカを作るため、４つのヌクレオチ
ドを以下に示す手順でプロメガ製の対立遺伝子ラダー最長の対立遺伝子の末端に
加えるか、最短の対立遺伝子から削除した。

【００９０】初めに、各ラダー（ストラッタジェーン ”Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ”製のＰＣ
Ｒ−ＳｃｒｉｐｔａｍｐＳＫ（＋）クローニングキット）内にある最短およ
び最長対立遺伝子を分離するためにプロメガ社製の３種の対立遺伝子ラダー、Ｃ
ＳＦ１ＰＯ、ＦＥＳＦＰＳ、Ｆ１３ＡＯ１をプラスミド・ベクタにクローンし、
バクテリアに形質転換させた。

【００９１】二番目に、３種のＳＴＲ遺伝子座の各々に対して２種の復帰プライマを作製し
た。これらの復帰プライマは表１に示してあり、オリジナルのプライマ配列の５
’末端でゲノム配列の４ｎｔを削除するか、あるいは反復またはゲノムＤＮＡ配
列の４ｎｔを加えることにより作製した。

【００９２】三番目に、公知のプライマ配列（表１）に基づき配列の変更なしで前進プライ
マをその５’末端でフルオレセインで標識した。

【００９３】四番目に、３種の遺伝子座の各々から分離した最短対立遺伝子を、フルオレセ
インで標識した前進プライマとペアにした最短復帰プライマを有するＰＣＲ内の
鋳型として使用した。最長の対立遺伝子はフルオレセイン標識前進プライマとペ
アにした、それ自体の長化復帰プライマにより増幅させた。

【００９４】各遺伝子座について作製したブラケティング・マーカを遺伝子座特異対立遺伝
子ラダーとしてポリアクリルアミド・ゲルの同じレーンに乗せ、Ａ．Ｌ．Ｆ．自
動ＤＮＡシーケンサで電気泳動を行った。図７Ａ−ＣはＳＴＲＬｏｃｉＣＳ
Ｆ１ＰＯ、ＦＥＳＦＰＳ、およびＦ１３ＡＯ１用の遺伝子座適合ブラケティング
・マーカがそれらの起源の対立遺伝子にしっかりとブラケティングすることを示
している。

【００９５】例４電気泳動移動度の換算における遺伝子座適合ブラケティングＳＴＲマーカの確
認

【００９６】遺伝子座適合ブラケティングＳＴＲマーカをそれらの遺伝子座の対立遺伝子の
電気泳動測定を換算するために外部あるいは内部標準として電気泳動を行い、標
準遺伝子座無作用ブラケティング・マーカと各遺伝子座からの対立遺伝子ラダー
の最短および最長の真の対立遺伝子をマーカとして使用した時と比較した。各デ
ータ・ポイントに対し、決定は５種のポリアクリルアミド配列決めゲルの各々の
少なくとも３本の分散レーンで泳動した３種のＳＴＲ遺伝子座全てについて行っ
た。比較対象の外部マーカあるいは内部マーカの異なったセットを常に同じゲル
・レーンで共電気泳動した。そして、予期値からの各測定値の絶対偏差を算出し
た。結果は表２に示す。

【００９７】

【表２】

【００９８】遺伝子座無作用標準ラダーあるいは対立遺伝子ラダーのどちらかで成る外部標
準マーカは等しく劣っていた。四量体縦列反復対立遺伝子の区別は測定誤差が２
ｎｔ未満でなくてはならないので、これらは３種の遺伝子座のどの対立遺伝子間
も確実に区別できなかった。

【００９９】内部ブラケティング標準として適用した時、標準遺伝子座無作用マーカは良好
な働きをしたが、一緒に用いた３種のＳＴＲ遺伝子座全てに対しては、遺伝子座
適合ブラケティング標準よりも５．６倍も高い偏差を作った。短い真の対立遺伝
子および長い真の対立遺伝子はブラケティング標準として用いた時に、それらの
配列が製造した遺伝子座適合ブラケティング標準より測定した対立遺伝子と適合
性があったので、変異対立遺伝子より少ない偏差であった。

【０１００】標準遺伝子座無作用のブラケティング・マーカと組み合わせた標準遺伝子座無
作用外部ラダーは、それ自体による標準遺伝子座無作用内部ブラケティング・マ
ーカと比べて偏差について向上はなかった。対立遺伝子外部標準プラス外部ブラ
ケティング遺伝子座適合マーカは、内部ブラケティング遺伝子座適合マーカによ
る偏差をブラケティング・マーカとしての内部対立遺伝子のレベルに下方修正し
た。

【０１０１】そして遺伝子座適合ブラケティング標準を、２つの核ファミリの７つの個体か
ら誘導されたサンプルＤＮＡ対立遺伝子とＫ５６２対照サンプルの長さを測定す
るために使用した。測定偏差は、表２に示したＳＴＲ対立遺伝子ラダーについて
得た値にほぼ同じであった：ＣＳＦ１ＰＯ０．２８±０．１２ｎｔ；ＦＥＳＦ
ＰＳ０．２６±０．１５ｎｔ；およびＦ１３ＡＯ１０．２２±０．１８ｎ
ｔ。

【０１０２】内部遺伝子座適合ブラケティング標準は真の対立遺伝子の測定で低い標準偏差
を示した。この発見は、移動度がそれらを誘導した対立遺伝子と同様に高いので
異なったレーン毎およびゲル毎の泳動条件で、それらの移動度が測定している対
立遺伝子と見当のあった変化をし、それにより測定した偏差が比較的一定に維持
されることを表す。

【０１０３】例５ＤＮＡ断片長さを測定するための泳動時間の使用

【０１０４】短いブラケティング（ｓｂ）および長いブラケティング（ｌｂ）遺伝子座適合
あるいは特異マーカ、およびブラケティングした未知の（ｕ）サンプル対立遺伝
子の泳動時間（ＲＴ）は未知の（ｕ）断片長さを算出するために使用できる。等
式１および２はＡ．Ｌ．Ｆ．製の機器で得た泳動時間（ＲＴ）からＣＳＦ１ＰＯ
、ＦＥＳＦＰＳ、Ｆ１３Ａ０１遺伝子座の未知の（ｕ）サンプル対立遺伝子全て
の長さ（Ｌ）を算出するため使用する。各遺伝子座に対するｓｂマーカおよびｌ
ｂマーカは、各遺伝子座の側面復帰ＰＣＲプライマへのゲノムＤＮＡ配列の４ｎ
ｔの減算あるいは加算の条件の下に作られた。

【０１０５】等式１Ｒａｔｅ（分／ｎｔ）＝ＲＴｌｂ−ＲＴｓｂ／Ｌｌｂ−Ｌｓｂ等式２Ｌｕ＝ＲＴｕ−ＲＴｓｂ／Ｒａｔｅ＋Ｌｓｂ

【０１０６】各遺伝子座に対する測定断片のＳＤおよび算出した平均偏差は以下のように小
さい：ＣＳＦ１ＰＯ０．０９±０．０７ｎｔ、ＦＥＳＦＰＳ０．１８±０．
１８ｎｔ、Ｆ１３Ａ０１０．１７±０．２０ｎｔ。

【０１０７】Ｆ１３ＡＯ１由来遺伝子座適合標準のブラケティング、およびフラグメント・
マネージャ（商標；ＦｒａｇｍｅｎｔＭａｎａｇｅｒ）ソフトウェア（０．１
６および０．１４ｎｔ）あるいはＲＴｓ（０．１６および０．１２ｎｔ）のどち
らかによる断片長さの計算により測定したＡ．Ｌ．Ｆ．システムおよびＡ．Ｌ．
Ｆ．エクスプレス・システムとの間の低い平均対立遺伝子偏差では極めてわずか
な差しかない。しかし、遺伝子座無作用標準マーカを使用する時、２つのシステ
ム間の平均偏差は両装置で高くなり、Ａ．Ｌ．Ｆ．による偏差がＡ．Ｌ．Ｆ．エ
クスプレスによる偏差とくらべ２倍を超える大きさである（１．２５と０．６０
ｎｔ、１．２５と０．６０ｎｔ）。

【０１０８】この観測は、異なった操作条件に曝されたサンプル対立遺伝子と遺伝子座適合
標準の相対移動度の変化にたいする抵抗を示す。これらの計算をおこなう中で泳
動速度ＲＴの有用性は、サンプル対立遺伝子を識別するために適切に設計したコ
ンピュータ・ソフトウェアにより使用可能となる。泳動速度を使用するよりも固
定時間でのバンド移動距離を比較するという他の電気泳動システムでは、移動距
離も適切に設計されたコンピュータ・プログラムの使用で泳動時間の時と類似方
法で遺伝子座適合あるいは特異マーカにより換算可能である。

【０１０９】例６増幅対象のＳＴＲ多型領域内の縦列反復ユニットの数の修正を通じた遺伝子座
特異ブラケティング・マーカの作成および電気泳動換算用のブラケティング標準
マーカの確認

【０１１０】対立遺伝子ＤＮＡ断片の３’あるいは５’末端でｎｔを加えたり、あるいは削
除したりすることにより作られた遺伝子座適合マーカよりはるかに「遺伝子座特
異」的であるブラケティング・マーカとして使用するための変異対立遺伝子を作
るために、ＳＴＲ対立遺伝子の多型（反復）領域の縦列反復ユニットの加減を使
用することができる。一元ではない反復配列の場合では、コア反復ユニットの加
減が通常行われる。短縮した側面配列による３．２対立遺伝子を有する４−１６
反復ユニットの対立遺伝子範囲を持つ遺伝子座Ｆ１３Ａ０１が、どのようにこれ
らのマーカが作られるか説明するために一例として使われる。

【０１１１】初めに、２つの（長短）復帰プライマと２つの（長短）前進プライマを反復領
域（表１，Ｆ１３Ａ０１ｒｅｖ２５１−Ｅａｍ−１、Ｆ１３Ａ０１ｒｅｖ２７５−Ｅａｍ−９、Ｆ１３Ａ０１ｆｗｄ２６８−Ｅａｍ−２、および
Ｆ１３Ａ０１ｆｗｄ２４８−Ｅａｍ−９）から設計する。各プライマは、制限
酵素Ｅａｍ１１０４で認識可能で、所望の数の反復ヌクレオチドを続け、また３
’末端で特異側面配列で終了することのできる５’末端で６ｎｔを組み込む。

【０１１２】二番目に、反復領域から２つの復帰プライマが分離ＰＣＲ内で古典的Ｆ１３Ａ
０１前進プライマとそれぞれペアを組み、例３のステップ１でのクーロンニング
した長い対立遺伝子あるいは、プライマ・ハイブリッド形成用の反復ユニットを
適切な数含む遺伝子座Ｆ１３Ａ０１からの対立遺伝子を増幅する。反復領域から
の２つの前進プライマの各々は分離したＰＣＲ内で古典的Ｆ１３Ａ０１復帰プラ
イマとそれぞれペアを組み、クーロニングした同じ長い対立遺伝子あるいは、プ
ライマ・ハイブリッド形成用の反復ユニットを適切な数含む遺伝子座Ｆ１３Ａ０
１からの対立遺伝子を増幅する。

【０１１３】三番目に、第二ステップからの各ＰＣＲ生成物をＥａｍ１１０４（ストラータ
ジェーン製）で消化させ、２％ＮｕＳｉｅｖｅ（ＦＭＣバイオプロダクト製）ミ
ニゲル上で電気泳動させる。所望長さの消化ＰＣＲ生成物をＮｕＳｉｅｖｅゲル
から回収してＱＩＡＥＸＩＩ（キアジェン；Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州
チャツワース在）で精製する。

【０１１４】四番目に、Ｆ１３Ａ０１ｆｗｄ１９０前進プライマとペアになったＦ１３Ａ０
１ｒｅｖ２５１−Ｅａｍ−１復帰プライマと、Ｆ１３Ａ０１ｒｅｖ４８４復帰プ
ライマとペアになったＦ１３Ａ０１ｆｗｄ２６８−Ｅａｍ−２前進プライマから
作った２種の消化した短いＰＣＲ生成物は、製品の指示書に従ってＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（ボーリンガー・マンハイム製）によって連結されて、２つの反復ユニッ
トを有する短い遺伝子座特異ブラケティング・マーカを形成する。Ｆ１３Ａ０１
ｆｗｓ１９０前進プライマとペアになったＦ１３Ａ０１ｒｅｖ２７５−Ｅａｍ−
９復帰プライマと、Ｆ１３Ａ０１ｒｅｖ４８４復帰プライマとペアになったＦ１
３Ａ０１ｆｗｄ２４８−Ｅａｍ−９前進プライマから作った２種の消化した長い
ＰＣＲ生成物は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって連結されて、１７の反復ユニット
を有する長い遺伝子座特異ブラケティング・マーカを形成する。

【０１１５】五番目に、この長短の遺伝子座特異ブラケティング・マーカを遺伝子座特異プ
ライマによって増幅し、複製用のＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔａｍｐ（ＳＫ＋）クロ
ーニングキット（ストラータジェーン製）で直接プラスミドＤＮＡにクローニン
グする。

【０１１６】他にも、遺伝子座特異変異対立遺伝子を作るために有用な公知の突然変異生成
技術があり、それらは当分野での研究者に公知である。

【０１１７】市販の変異対立遺伝子は１−２の反復ユニットの存在、あるいは不在によって
のみ隣接する対立遺伝子からＤＮＡ配列を選択的に区別する。従って、真の対立
遺伝子どうしと同じ関係をそれらの隣接する対立遺伝子に与えることになる。別
の状況、例えば不完全な対立遺伝子の存在などでは、変異対立遺伝子の反復数は
反復ユニットを割ったり、倍数をかけたりすることにより最も近い隣接対立遺伝
子から選択的に区別できる。そして、真の対立遺伝子のＲＴは換算マーカとして
の変異対立遺伝子により識別用に使用できる。なぜなら、ブラケティングした多
型領域の一画分としての長さが、短い変異対立遺伝子から長い変異対立遺伝子の
全体泳動時間間隔によって分けられた短いマーカからのＲＴ間隔の画分に比例す
ることになるのからである。

【０１１８】市販の変異対立遺伝子ブラケティング・マーカの別な重要な利点は、同じ側面
領域（flanking region）に結合することにより多型ゲノム遺伝子座を増幅するように設計されたＰＣＲプライマ・キットによる鋳型ＤＮＡの増幅である。変異
対立遺伝子マーカが真の対立遺伝子と同じあるいは長い側面配列(flanking sequ
ence)と結合し鋳型となるので、それらはＰＣＲで使用された遺伝子座特異プライマにより共増幅され、その遺伝子座からの未知のゲノムＤＮＡ対立遺伝子を増
幅する。

【０１１９】共増幅したマーカとサンプルＤＮＡを共に電気泳動の同じレーンに乗せる。マ
ーカとサンプルＤＮＡは同じ区別標識を共有し重複せずに泳動するので容易に検
出される。ブラケティング・マーカは未知のＤＮＡ断片長さを正確に測定するば
かりでなく、サンプル分析におけるＰＣＲステップにたいする積極的な制御の役
目も果たす。

【０１２０】図８Ａ−ＣはゲノムＤＮＡサンプルＳＴＲ１０３（８Ａ）、対照ＤＮＡＫ５
６２（８Ｂ）、Ｆ１３Ａ０１対立遺伝子ラダー（８Ｃ）をそれぞれ用いて、同じ
ＰＣＲ管内で共増幅されたＦ１３Ａ０１特異の長短ブラケティング・マーカの電
気泳動スキャンを示す。３つの非遺伝子座適合標準マーカ（２５０，３００，３
５０ｎｔ）を比較のために各レーンに乗せた。長短の変異対立遺伝子と真の対立
遺伝子が各対立遺伝子の反復ユニットの数に基づいた対立遺伝子数によって設計
される。３００ｎｔ標準マーカは図８Ｃの対立遺伝子８を重複することで不明瞭
にする。ＰＣＲ生成物の各グループは３本の異なったレーンで電気泳動を行う。
ブラケティング標準マーカ（２５０／３５０、ファーマシア製）とブラケティン
グ遺伝子座特異マーカ（２７５／３３５、短および長）により測定した平均分散
量と標準偏差は、サンプルＤＮＡからの対立遺伝子３．２と６に対して１．３２
±０．３９ｎｔ対−０．２０±０．０５ｎｔであり、対照ＤＮＡＫ５６２から
の対立遺伝子４および５に対して−１．１７±０．４０ｎｔ対−０．０５±０．
０７ｎｔであり、対立遺伝子ラダーの全ての対立遺伝子に対して−０．４７±０
．３１ｎｔ対−０．０２±０．０８ｎｔである。

【０１２１】遺伝子座特異ブラケティング・マーカと同じＰＣＲ管内のＤＮＡサンプルとの
共増幅の別な利点は、ブラケティング・マーカとサンプルＤＮＡの両方からのＰ
ＣＲ生成物はＴａｑＤＮＡポリメラーゼにより３’末端に付加したエキストラ・
ヌクレオチドと同じ部分を有することである。測定対象のサンプルＤＮＡの部分
へのＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるエキストラ・ヌクレオチドの付加は、換算
標準ＤＮＡの別な部分が別なＰＣＲ増幅でエキストラ・ヌクレオチドを受け取っ
たり、換算標準ＤＮＡがＰＣＲ生成物でなかったり、Ｔａｑ関連ＰＣＲ生成物で
なかったりするなら、測定誤差の原因となる。さらに、共増幅条件下では、Ｔａ
ｑＤＮＡポリメラーゼがゲノムＤＮＡからスタッタ・ピークを含む非特異生成物
をほとんど生成しないように見える。

【０１２２】図９は、各レーンの２００と３００ｎｔの標準ＤＮＡマーカが明らかなエキス
トラ・ヌクレオチド付加なしで対称的なピークを有することを示す。ゲノムＤＮ
ＡサンプルＫ５６２からのＦ１３ＡＯ１遺伝子座特異プライマで増幅した短い変
異対立遺伝子および２つの真の対立遺伝子が、断片の多数部にエキストラ・ヌク
レオチドが付加したこのによりピークが右よりにずれることを示す。ゲノムＤＮ
Ａサンプル１０８から増幅した短い変異対立遺伝子と２つの真の対立遺伝子はピ
ークをずらすには不十分な断片の少数部へのエキストラ・ヌクレオチドの付加を
示す。ゲノムサンプル１０９から増幅した短い変異対立遺伝子と２つの真の対立
遺伝子は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ断片の約二分の一へのエキス
トラ・ヌクレオチドの付加による二相ピークを示す。

【０１２３】ブラケティング遺伝子座特異マーカは、何らかの理由で古典的プライマ・ペア
の修正の必要がある場合に、ＰＣＲ用延長鋳型を作るため古典的プライマ・ペア
結合位置を超えて側面領域に延長可能である。例えば、古典的プライマ・ペアの
一方とペアを組む代わりに、反復領域ペアからの復帰プライマＦ１３Ａ０１ｒｅ
ｖ２５１−Ｅａｍ−１は前進プライマＦ１３Ａ０１ｆｗｄ１（表１）とペアを組
み、ＰＣＲ増幅の際に古典的前進プライマより上流にエキストラ１８９ｎｔを産
する。同様に、反復領域ペアからの前進プライマＦ１３Ａ０１ｆｗｄ２４８−Ｅ
ａｍ−２は復帰プライマＦ１３Ａ０１ｒｅｖ６２８（表１）とペアを組み、古典
的復帰プライマより下流にエキストラ１４６ｎｔを産する。

【０１２４】図１０はｆｗｄ１とＥａｍ−１のプライマ・ペアからの２６０ｂｐ（レーン２
）ＰＣＲ生成物と、Ｅａｍ−２とｒｅｖ６２８プライマ・ペアからの３６９ｂｐ
（レーン３）ＰＣＲ生成物を示す。Ｅａｍ１１０４により消化された後、２ＤＮ
Ａ断片はＴ４ＤＮＡリガーゼにより互いに連結され、古典的プライマ・ペアによ
り再度増幅された。図１０のレーン４は延長鋳型からの増幅した２７５ｂｐの短
いブラケティング・マーカを示す。図１０に示された全てのサンプルＤＮＡ生成
物は配列決めにより検証された。それ故、延長した連結ＤＮＡ断片（Ｆ１３Ａ０
１ｆｗｄ１−ｒｅｖ６２８）は、５’および３’側面配列を有するように設計さ
れたプライマ・ペアにより未知のＤＮＡサンプルを用いた共増幅用の鋳型として
使用できる。

【０１２５】遺伝子座適合ブラケティング・マーカ、遺伝子座特異ＳＴＲマーカ、および遺
伝子座特異変異対立遺伝子の共電気泳動およびＰＣＲまたはｍＰＣＲ共増幅用の
キットは次に示すもののどれか、あるいは全てを含む。１）測定対象の各遺伝子
座用の長短遺伝子座特異ブラケティング・マーカ用ＤＮＡ鋳型、２）各遺伝子座
に対する特異５’と３’側面配列に結合するＰＣＲプライマ・ペア、３）ＰＣＲ
に適したデオキシリボース・ヌクレオチド三燐酸（ｄＮＴＰｓ）とバッファ、４
）ＰＣＲに適した熱安定のＤＮＡポリメラーゼ、５）一定量のサンプルＤＮＡが
予め調製した鋳型ＤＮＡと適合するようにしたサンプルＤＮＡの抽出と計量用の
指示および試薬。全血液からゲノムＤＮＡを抽出するため使用した典型的な試薬
はＮＨ４Ｃｌ、酢酸カリウム、ＲＮアーゼＡ、イソプロパノール、エタノール
、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、ＮａＯＨである。ブラケティング遺伝子座適合マーカある
いはブラケティング遺伝子座特異マーカを用いる換算によってＤＮＡサンプル断
片の長さを測定するためにコンピュータ・ソフトウェアを設計することが可能で
ある。未知の遺伝子座の対立遺伝子を含むサンプルＤＮＡを用いて、遺伝子座適
合ブラケティング・マーカあるいは遺伝子座特異ＳＴＲマーカのＰＣＲおよびｍ
ＰＣＲでの共増幅および共電気泳動を識別（遺伝子型）の目的に使用でき、特に
、２−２０の遺伝子座で行う時に強力となる。

【０１２６】上記のように本発明は望ましい実施例について説明したが、本発明は請求の範
囲に記載の精神および範囲内で改良、変更可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実行で使用される一方策を示す概略図。

【図２】本発明の実行で使用される別の方策を示す概略図。

【図３】本発明の実行で使用される別の方策を示す概略図。

【図４】本発明の実行で使用される更に別な方策を示す概略図。

【図５】例１によるポリアクリルアミド電気泳動ゲル・レーンのコンピュータ処理され
たフラグメント・マネージャ（ＦｒａｇｍｅｎｔＭａｎａｇｅｒ、商標）スキ
ャンであり、ＴＣＲＡＶ７遺伝子の多型ＣＤＲ３領域に対する座適合ブラケティ
ング・マーカを示す。

【図６】例２によるポリアクリルアミド電気泳動ゲル・レーンのフラグメント・マネー
ジャ（ＦｒａｇｍｅｎｔＭａｎａｇｅｒ、商標）スキャンであり、ＴＣＲＢＶ
１６遺伝子の多型ＣＤＲ３領域に対する座適合ブラケティング・マーカを示す。

【図７】例３によるポリアクリルアミド電気泳動ゲルのレーンのフラグメント・マネー
ジャ（ＦｒａｇｍｅｎｔＭａｎａｇｅｒ、商標）スキャンであり、側面配列の
変異によるＳＴＲＬｏｃｉＣＳＦ１０ＰＯ、ＦＥＳＦＰＳ、およびＦ１３Ａ
Ｏ１に対する座適合ブラケティング・マーカを示す。

【図８】例６によるポリアクリルアミド電気泳動ゲルのレーンのフラグメント・マネー
ジャ（ＦｒａｇｍｅｎｔＭａｎａｇｅｒ、商標）スキャンであり、多型領域内
の縦列反復ユニットの数を増減することにより作られたＳＴＲ座Ｆ１３ＡＯ１に
対する座適合ブラケティング・マーカと、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるエ
キストラ・ヌクレオチドの差異付加のＤＮＡ断片ピークへの効果を示す。

【図９】例６によるポリアクリルアミド電気泳動ゲルのレーンのフラグメント・マネー
ジャ（ＦｒａｇｍｅｎｔＭａｎａｇｅｒ、商標）スキャンであり、各々が短い
変異体対立遺伝子ブラケティング・マーカと一緒の、３つの異なったゲノムＤＮ
ＡサンプルからＦ１３Ａ０１座のＰＣＲ共増幅後に視覚化したＤＮＡ断片ピーク
へのＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるエキストラ・ヌクレオチド付加の効果を
示す。

【図１０】レーン１におけるＤＮＡ換算標準マーカを示すアガローズ・ゲル電気泳動スキ
ャンの写真であり、５’側面配列（レーン２）からの前進プライマＦ１３Ａ０１
と組み合わせた復帰プライマＦ１３Ａ０１ｒｅｖ２５１−Ｅａｍ−１によりゲノ
ムＤＮＡのＦ１３Ａ０１座から増幅された延長側面領域；および連結生成物（レ
ーン２＋３）からの古典的なＦ１３Ａ０１座特異プライマ・ペアによる２７５ｂ
ｐ短Ｆ１３Ａ０１変異体対立遺伝子のレーン４増幅。

【符号の説明】

１，５，８’、８” 前進プライマ２，３，４，６，７’７”復帰プライマ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA11 CA20 EA04 HA08 HA11 HA14 HA19 4B029 AA07 FA15 4B063 QA12 QQ03 QQ42 QQ52 QR08 QR62 QS16 QS25 QS34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】遺伝子座の多型領域のＤＮＡ断片長さを決めるための遺伝子
座適合マーカを生成するプライマ・セットにおいて、ＤＮＡサンプルの遺伝子座の多型領域の側面に並ぶ上流側面配列および下流側
面配列に、それぞれハイブリッド形成する一次前進プライマおよび一次復帰プラ
イマであり、該一次前進プライマおよび復帰プライマの少なくとも一つが第一検
出標識を有し、該一次前進プライマは該ＤＮＡサンプルのＤＮＡのアンチセンス
・ストランドにハイブリッドし、該一次復帰プライマは該ＤＮＡサンプルのＤＮ
Ａのセンス・ストランドにハイブリッドし、該一次前進プライマおよび復帰プラ
イマは該多型領域を含む該ＤＮＡサンプルの第一部分の側面に位置し、初めに、該ＤＮＡのセンス・ストランドおよび該多型領域の下流にある第一、
第二位置にそれぞれハイブリッドする第一および第二の二次復帰プライマであり
、該第一位置は該ＤＮＡサンプルの該第一部分内に位置し、該第二位置は該第一
部分の下流に位置したことを特徴とする、プライマ・セット。
【請求項２】該第一、第二復帰プライマ用の第二および第三検出標識をさ
らに有することを特徴とする請求項１に記載のプライマ・セット。
【請求項３】該第一、第二の二次復帰プライマは該一次復帰プライマより
、それぞれ短いあるいは長いヌクレオチドの数であることを特徴とする請求項１
に記載のプライマ・セット。
【請求項４】遺伝子座の多型領域のＤＮＡ断片長さを決めるための遺伝子
座適合マーカを生成するプライマ・セットにおいて、ＤＮＡサンプルの遺伝子座の多型領域の側面に並ぶ上流側面配列および下流側
面配列に、それぞれハイブリッド形成する一次前進プライマおよび一次復帰プラ
イマであり、該一次前進プライマおよび復帰プライマの少なくとも一つが第一検
出標識を有し、該一次前進プライマは該ＤＮＡサンプルのＤＮＡのアンチセンス
・ストランドにハイブリッドし、該一次復帰プライマは該ＤＮＡサンプルのＤＮ
Ａのセンス・ストランドにハイブリッドし、該一次前進プライマおよび復帰プラ
イマは該多型領域を含む該ＤＮＡサンプルの第一部分の側面に位置し、初めに、該ＤＮＡのアンチセンス・ストランドおよび該多型領域の上流にある
第一、第二位置にそれぞれハイブリッドする第一および第二の二次前進プライマ
であり、該第一位置は該ＤＮＡサンプルの該第一部分内に位置し、該第二位置は
該第一部分の上流に位置したことを特徴とする、プライマ・セット。該第一、第二復帰プライマ用の第二および第三検出標識をさらに有することを
特徴とする請求項１に記載のプライマ・セット。
【請求項５】該第一、第二前進プライマ用の第二および第三検出標識をさ
らに有することを特徴とする請求項４に記載のプライマ・セット。
【請求項６】該第一、第二の二次復帰プライマは該一次前進プライマより
、それぞれ短いあるいは長いヌクレオチドの数であることを特徴とする請求項４
に記載のプライマ・セット。
【請求項７】遺伝子座の多型領域のＤＮＡ断片長さを決める方法は、遺伝子座の多型領域の下流にある第一位置および第二位置でＤＮＡのセンス・
ストランドとハイブリッド形成する第一および第二二次復帰プライマを調製する
ステップと、該多型領域の上流および下流側面配列にそれぞれハイブリッド形成する該第一
、第二二次復帰プライマと一次前進プライマと一次復帰プライマとの組み合わせ
を用いて、該多型領域の対立遺伝子に対する短い、また長い遺伝子座適合ブラケ
ティング・マーカをポリメラーゼ連鎖反応により増幅するステップであり、該一
次前進プライマはＤＮＡのアンチセンス・ストランドにハイブリッド形成し、該
一次復帰プライマはＤＮＡのセンス・ストランドにハイブリッド形成し、該一次
前進プライマおよび一次復帰プライマは該多型領域を有する該ＤＮＡの第一部分
の側面に位置し、該第一二次復帰プライマは該第一部分にある位置でハイブリッ
ド形成し、該第二二次復帰プライマは該第一部分の下流の位置でハイブリッド形
成し、各対立遺伝子用の短いおよび長い遺伝子座適合マーカを検出するステップを有
することを特徴とする方法。
【請求項８】該検出ステップは、電気泳動により短いおよび長い遺伝子座
適合マーカを分離するステップを有することを特徴とする請求項７に記載の方法
。
【請求項９】ＤＮＡサンプルの多型領域の上流および下流側面配列にそれ
ぞれハイブリッド形成する一次前進プライマと一次復帰プライマを増幅するステ
ップであり、該一次前進プライマと一次復帰プライマの少なくとも一方が第一検
出標識を有し、該一次前進プライマは該ＤＮＡサンプルのＤＮＡのアンチセンス
・ストランドにハイブリッド形成し、該一次復帰プライマは該ＤＮＡサンプルの
ＤＮＡのセンス・ストランドにハイブリッド形成し、該一次前進プライマおよび
一次復帰プライマは該多型領域を有する該ＤＮＡの第一部分の側面に位置し、該多型領域の下流にある第一、第二位置でＤＮＡの該センス・ストランドにそ
れぞれハイブリッド形成する第一、第二二次復帰プライマで、該第一位置は該Ｄ
ＮＡサンプルの該第一部分内にあり、該第二位置は該第一部分の下流に位置し、該第一部分より、それぞれ短い、および長い遺伝子座適合ブラケティング・マ
ーカを該増幅ステップより得るステップを有するプロセスより生成することを特
徴とする多型遺伝子座のＤＮＡ断片長さを決めるための遺伝子座適合マーカ。
【請求項１０】多型遺伝子座のＤＮＡ断片長さを決めるための遺伝子座適
合マーカの製造方法において、ＤＮＡサンプルの多型領域の上流および下流側面配列にそれぞれハイブリッド
形成する一次前進プライマと一次復帰プライマを増幅するステップであり、該一
次前進プライマと一次復帰プライマの少なくとも一方が第一検出標識を有し、該
一次前進プライマは該ＤＮＡサンプルのＤＮＡのアンチセンス・ストランドにハ
イブリッド形成し、該一次復帰プライマは該ＤＮＡサンプルのＤＮＡのセンス・
ストランドにハイブリッド形成し、該一次前進プライマおよび一次復帰プライマ
は該多型領域を有する該ＤＮＡの第一部分の側面に位置し、該多型領域の下流にある第一、第二位置でＤＮＡの該センス・ストランドにそ
れぞれハイブリッド形成する第一、第二二次復帰プライマで、該第一位置は該Ｄ
ＮＡサンプルの該第一部分内にあり、該第二位置は該第一部分の下流に位置し、該第一部分より、それぞれ短い、および長い遺伝子座適合ブラケティング・マ
ーカを該増幅ステップより得るステップを有することを特徴とする遺伝子座適合
マーカの製造方法。
【請求項１１】ＤＮＡサンプルの多型領域の上流および下流側面配列にそ
れぞれハイブリッド形成する一次前進プライマと一次復帰プライマを増幅するス
テップであり、該一次前進プライマと一次復帰プライマの少なくとも一方が第一
検出標識を有し、該一次前進プライマは該ＤＮＡサンプルのＤＮＡのアンチセン
ス・ストランドにハイブリッド形成し、該一次復帰プライマは該ＤＮＡサンプル
のＤＮＡのセンス・ストランドにハイブリッド形成し、該一次前進プライマおよ
び一次復帰プライマは該多型領域を有する該ＤＮＡの第一部分の側面に位置し、該多型領域の上流にある第一、第二位置でＤＮＡの該アンチセンス・ストラン
ドにそれぞれハイブリッド形成する第一、第二二次復帰プライマで、該第一位置
は該ＤＮＡサンプルの該第一部分内にあり、該第二位置は該第一部分の上流に位
置し、該第一部分より、それぞれ短い、および長い遺伝子座適合ブラケティング・マ
ーカを該増幅ステップより得るステップを有するプロセスより生成することを特
徴とする、多型遺伝子座のＤＮＡ断片長さを決めるための遺伝子座適合マーカ。
【請求項１２】遺伝子座の多型領域の上流にある第一位置および第二位置
でＤＮＡのアンチセンス・ストランドとハイブリッド形成する第一および第二二
次前進プライマを調製するステップと、該多型領域の上流および下流側面配列にそれぞれハイブリッド形成する該第一
、第二二次前進プライマと一次前進プライマと一次復帰プライマとの組み合わせ
を用いて、該多型領域の対立遺伝子に対する短い、また長い遺伝子座適合ブラケ
ティング・マーカをポリメラーゼ連鎖反応により増幅するステップであり、該一
次前進プライマはＤＮＡのアンチセンス・ストランドにハイブリッド形成し、該
一次復帰プライマはＤＮＡのセンス・ストランドにハイブリッド形成し、該一次
前進プライマおよび一次復帰プライマは該多型領域を有する該ＤＮＡの第一部分
の側面に位置し、該第一二次復帰プライマは該第一部分にある位置でハイブリッ
ド形成し、該第二二次復帰プライマは該第一部分の上流の位置でハイブリッド形
成し、各対立遺伝子用の短いおよび長い遺伝子座適合マーカを検出するステップを有
することを特徴とする、遺伝子座の多型領域のＤＮＡ断片長さを決めるための方
法。
【請求項１３】遺伝子座を含む短い縦列反復（ＳＴＲ）にたいする遺伝子
座適合マーカを調製する方法において、遺伝子座を含むＳＴＲから増幅した対立遺伝子ラダーあるいはゲノムＤＮＡを
プラスミド・ベクタにクローニングするステップで、該対立遺伝子ラダーは該Ｓ
ＴＲ遺伝子座を有するゲノム配列用の一次前進プライマおよび一次復帰プライマ
から作られ、プラスミド・ベクタをホストに転換するステップと、該対立遺伝子ラダーあるいはゲノムＤＮＡ内の短い対立遺伝子および長い対立
遺伝子を分離するステップと、標識した一次前進プライマを作るため一次前進プライマを標識するステップと
、該一次復帰プライマから第一の既知数のヌクレオチドを削除し、また、該一次
復帰プライマに第二の既知数のヌクレオチドを付加することにより、ＳＴＲ遺伝
子座にたいする短い二次復帰プライマおよび長い二次復帰プライマを調製するス
テップと、該標識した一次前進プライマと該短い二次復帰プライマと共にＰＣＲの鋳型と
して該短い対立遺伝子を使用するステップと、該標識した一次前進プライマと該長い二次復帰プライマと共にＰＣＲの鋳型と
して該長い対立遺伝子を使用するステップとを有する方法。
【請求項１４】ヌクレオチドのＳＴＲ配列を含むＤＮＡサンプルの多型領
域の上流側面配列および下流側面配列とそれぞれハイブリッド形成する一次前進
プライマと一次復帰プライマと、該ＤＮＡサンプルのＤＮＡのセンス・ストランドとハイブリッド形成する２つ
の二次復帰プライマと、該ＤＮＡサンプルの該ＤＮＡのアンチセンス・ストランドにハイブリッド形成
する２つの二次前進プライマとを有し、該２つの二次復帰プライマと２つの二次
前進プライマは該多型領域内のオリゴヌクレオチド配列とハイブリッド形成する
ことを特徴とする、短い縦列反復（ＳＴＲ）を含む多型遺伝子座の対立遺伝子の
ＤＮＡ断片長さを決定するための遺伝子座特異短い縦列反復マーカを作るプライ
マ・セット。
【請求項１５】短い縦列反復（ＳＴＲ）配列を有する多型遺伝子座の対立
遺伝子のＤＮＡ断片長さを決める方法において、ＤＮＡのセンス・ストランドとハイブリッド形成する２つの二次復帰プライマ
とヌクレオチドのＳＴＲ配列を含むＤＮＡのアンチセンス・ストランドとハイブ
リッド形成する２つの二次前進プライマを調製するステップであり、該２つの二
次復帰プライマと該２つの二次前進プライマが該ＳＴＲ配列を含む該ＤＮＡの多
型領域内のオリゴヌクレオチド配列にハイブリッド形成し、該多型領域の上流側面配列とハイブリッド形成する第一前進プライマと組み合
わせて該２つの二次復帰プライマと、該多型領域の下流側面配列とハイブリッド
形成する一次復帰プライマと組み合わせて該２つの二次前進プライマを使用して
、ポリメラーゼ連鎖反応により該多型領域からのＰＣＲ生成物を増幅するステッ
プであり、該増幅ステップは２つの短いＰＣＲ生成物と２つの長いＰＣＲ生成物を作り、
該２つの短いＰＣＲ生成物の第一生成物は一端に該２つの二次復帰プライマの第
一プライマを有し、もう一端に該一次前進プライマを有し、該２つの短いＰＣＲ
生成物の第二生成物は一端に該二次前進プライマの第一プライマを有し、もう一
端に該一次復帰プライマを有し、該２つの長いＰＣＲ生成物の第一生成物は一端
に該２つの二次復帰プライマの第二プライマを有し、もう一端に該一次前進プラ
イマを有し、該２つの長いＰＣＲ生成物の第二生成物は一端に該二次前進プライ
マの第二プライマを有し、もう一端に該一次復帰プライマを有する、短い変異対立遺伝子マーカを形成するため該２つの短いＰＣＲ生成物を結合す
るステップと、長い変異対立遺伝子マーカを形成するため該２つの長いＰＣＲ生成物を結合す
るステップと、該短い変異対立遺伝子マーカと長い変異対立遺伝子マーカを検出するステップ
を有することを特徴とする方法。
【請求項１６】ＤＮＡサンプルの短縦列反復（ＳＴＲ）多型現象の上流側
面配列および下流側面配列とハイブリッド形成する一次前進プライマおよび一次
復帰プライマを用いて、該ＤＮＡサンプルのＤＮＡのセンス・ストランドとハイ
ブリッド形成する２つの二次復帰プライマと該ＤＮＡサンプルのＤＮＡのアンチ
センス・ストランドとハイブリッド形成する２つの二次前進プライマとを増幅す
るステップで、該２つの二次復帰プライマと該２つの二次前進プライマが該多型
領域内でヌクレオチドとハイブリッド形成して、少なくとも２つの短いＤＮＡ生
成物と２つの長いＤＮＡ生成物を作り、該２つの短いＤＮＡ生成物を結合して短い変異対立遺伝子マーカを作るステッ
プと、該２つの長いＤＮＡ生成物を結合して長い変異対立遺伝子マーカを作るステッ
プとを有するプロセスにより作られることを特徴とする、遺伝子座のＳＴＲ多型
現象のＤＮＡ配列長さを決定するための遺伝子座特異ＳＴＲマーカ。
【請求項１７】ＤＮＡサンプルの短い縦列反復（ＳＴＲ）多型現象の上流
側面配列および下流側面配列とハイブリッド形成する一次前進プライマおよび一
次復帰プライマを用いて、該ＤＮＡサンプルのＤＮＡのセンス・ストランドとハ
イブリッド形成する２つの二次復帰プライマと該ＤＮＡサンプルのＤＮＡのアン
チセンス・ストランドとハイブリッド形成する２つの二次前進プライマとを増幅
するステップで、該２つの二次復帰プライマと該２つの二次前進プライマが該多
型領域内でヌクレオチドとハイブリッド形成して、少なくとも２つの短いＤＮＡ
生成物と２つの長いＤＮＡ生成物を作り、該２つの短いＤＮＡ生成物を結合して短い変異対立遺伝子マーカを作る短ＤＮ
Ａ生成物結合ステップと、該２つの長いＤＮＡ生成物を結合して長い変異対立遺伝子マーカを作る長ＤＮ
Ａ生成物結合ステップとを有することを特徴とする、短縦列反復（ＳＴＲ）配列
を含む多型遺伝子座のＤＮＡ断片長さを決定するための遺伝子座特異短縦列反復
マーカを製造する方法。
【請求項１８】少なくとも１つの測定対象遺伝子座に対する短および長遺
伝子座特異ブラケティング・マーカ用のＤＮＡ鋳型を有することを特徴とする、
遺伝子座適合ブラケティング・マーカ、遺伝子座特異ＳＴＲマーカ、および遺伝
子座特異変異対立遺伝子のＰＣＲあるいは複数ＰＣＲ共増幅および共電気泳動用
キット。
【請求項１９】測定対象の複数の遺伝子座に対するＤＮＡ鋳型を有するこ
とを特徴とする、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】ＰＣＲに適したｄＮＴＰおよびバッファと、ＰＣＲに適した熱安定ＤＮＡポリメラーゼと、一定量のサンプルＤＮＡが予め調剤した鋳型ＤＮＡに適合するようにサンプル
ＤＮＡ抽出および計量用の指示および試薬の、少なくとも１つを有することを特
徴とする請求項１８に記載のキット。