JP2853864B2 - ヌクレオチド配列を検出する方法 - Google Patents
ヌクレオチド配列を検出する方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は一つまたはそれ以上の変異ヌクレオチド配列
の存在または不在をその増幅または欠如により検出する
方法およびそのキットに関する。
の存在または不在をその増幅または欠如により検出する
方法およびそのキットに関する。
本発明は、遺伝条件、素質または体細胞突然変異のた
めのDNA試料の診断上のスクリーニングに特に関係があ
り、なかんずく点突然変異の容易な検出のための方法を
提供する。また、そのDNAまたはRNAの分析による感染病
原菌の検出および型の検査に有用である。
めのDNA試料の診断上のスクリーニングに特に関係があ
り、なかんずく点突然変異の容易な検出のための方法を
提供する。また、そのDNAまたはRNAの分析による感染病
原菌の検出および型の検査に有用である。
従来の技術 DNAレベルの特定の突然変異による数百の遺伝疾患が
ヒトに存在することが知られている。ある種のこれらの
疾病の分子論的根拠はすでに知られており、現在突然変
異の性質がまだ知られていないこれらの遺伝疾患のため
の分子論的根拠も研究により急速に明らかにされつつあ
る。遺伝的条件のための正確な分子論的根拠が知られて
いないものでも疾患座位を持つ遺伝的関連においてDNA
プローブを用いるRFLP技術により、情報を与える家系に
担体の異常または位置の診断が提供されるであろう。こ
のようにして現在例えばデュシェンヌ筋ジストロフィ
ー、嚢胞性線維症およびなかんずくハンチングトン舞踏
症がRFLP技術を用いて診断されている。しかしながら、
そのような試験は各々の条件に関して別々に実施する必
要がありかなりの量の仕事が必要とされ、各々の場合に
ついてなかんずくDNA精製、制限酵素消化、アガロース
ゲル電気泳動、サザンブロッティング、ハイブリダイゼ
ーション、ハイブリダイズした遺伝子プローブの検出お
よび系統分析を必要とする。ある種の他の遺伝条件は遺
伝子に単一点突然変異を伴う事が知られているが、各々
のこれらの条件は別々に分析されなければならないし、
さらに、点突然変異が不均質である場合特に困難であ
る。このように例えば40以上の異なった点突然変異がβ
−サラセミアを起こすことができ、少なくとも５つ多分
12以上の点突然変異が血友病Ａを起こすことができる。
これらの不均質条件に関し、現在各々の潜在する突然変
異点が別々に分析される必要があろう。このことは複数
の制限酵素による複雑なRFLP単一型分析が含まれること
になろう。
ヒトに存在することが知られている。ある種のこれらの
疾病の分子論的根拠はすでに知られており、現在突然変
異の性質がまだ知られていないこれらの遺伝疾患のため
の分子論的根拠も研究により急速に明らかにされつつあ
る。遺伝的条件のための正確な分子論的根拠が知られて
いないものでも疾患座位を持つ遺伝的関連においてDNA
プローブを用いるRFLP技術により、情報を与える家系に
担体の異常または位置の診断が提供されるであろう。こ
のようにして現在例えばデュシェンヌ筋ジストロフィ
ー、嚢胞性線維症およびなかんずくハンチングトン舞踏
症がRFLP技術を用いて診断されている。しかしながら、
そのような試験は各々の条件に関して別々に実施する必
要がありかなりの量の仕事が必要とされ、各々の場合に
ついてなかんずくDNA精製、制限酵素消化、アガロース
ゲル電気泳動、サザンブロッティング、ハイブリダイゼ
ーション、ハイブリダイズした遺伝子プローブの検出お
よび系統分析を必要とする。ある種の他の遺伝条件は遺
伝子に単一点突然変異を伴う事が知られているが、各々
のこれらの条件は別々に分析されなければならないし、
さらに、点突然変異が不均質である場合特に困難であ
る。このように例えば40以上の異なった点突然変異がβ
−サラセミアを起こすことができ、少なくとも５つ多分
12以上の点突然変異が血友病Ａを起こすことができる。
これらの不均質条件に関し、現在各々の潜在する突然変
異点が別々に分析される必要があろう。このことは複数
の制限酵素による複雑なRFLP単一型分析が含まれること
になろう。
例えばrasオンコジーン内の点突然変異のごとく、体
細胞中の多くの点突然変異が種々の癌の発生に含まれて
いる［J.L.Boosら、ネーチャー327,292（1987）］。
細胞中の多くの点突然変異が種々の癌の発生に含まれて
いる［J.L.Boosら、ネーチャー327,292（1987）］。
セタス（Cetus）コーポレーションのヨーロッパ特許
出願第87302196.8号（公開第237,362号）は試料中に含
まれる１つまたはそれ以上の核酸において配列中の少く
とも１つのヌクレオチド変異の存在または不在を検出す
る方法を記載しており、その方法は： （ａ）一緒にまたは連続的に４つの異ったヌクレオチド
三リン酸、ヌクレオチド三リン酸の重合化剤、および前
記変異を含むと思われる各々の核酸の鎖のための１つの
オリゴヌクレオチド プライマーでハイブリダイゼージ
ョン条件下試料を処理し、各々の核酸鎖が検出されるべ
き各々の異った変異を含むようにし、各々の核酸鎖と相
補的である各々のプライマーの延長生成物を合成し、前
記プライマーまたはプライマー類は各々の異なった変異
を含む各々の核酸に実質的に相補的になるように選択さ
れており、そのためそれがその相補物から分離された場
合、１つのプライマーから合成された延長制生成物は他
のプライマーの延長生成物の合成のための鋳型として働
くことができ； （ｂ）変性条件下試料を処理し、もし検出されるべき変
異が存在するならその鋳型からプライマー延長生成物を
分離し； （ｃ）一緒にまたは連続的に前記４つのヌクレオチド三
リン酸、ヌクレオチド三リン酸の重合剤、およびオリゴ
ヌクレオチド プライマーで試料を処理し、工程（ｂ）
で産生された各々の単一鎖を鋳型として使用してプライ
マー延長生成物が合成され、配列変異を含む核酸がもし
存在するなら検出可能になるほど増幅されるまで十分な
回数、工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返し； （ｄ）工程（ｃ）の生成物を膜に固定し； （ｅ）ハイブリダイゼーション条件下、プローブの配列
が増幅配列の領域と相補的である場合のみ増幅核酸配列
でハイブリダイズ可能な標識配列−特異的オリゴヌクレ
オチド プローブで膜を処理し；および （ｆ）核酸試料中の増幅配列へプローブがハイブリダイ
スしたかどうかを検出することから成っている。
出願第87302196.8号（公開第237,362号）は試料中に含
まれる１つまたはそれ以上の核酸において配列中の少く
とも１つのヌクレオチド変異の存在または不在を検出す
る方法を記載しており、その方法は： （ａ）一緒にまたは連続的に４つの異ったヌクレオチド
三リン酸、ヌクレオチド三リン酸の重合化剤、および前
記変異を含むと思われる各々の核酸の鎖のための１つの
オリゴヌクレオチド プライマーでハイブリダイゼージ
ョン条件下試料を処理し、各々の核酸鎖が検出されるべ
き各々の異った変異を含むようにし、各々の核酸鎖と相
補的である各々のプライマーの延長生成物を合成し、前
記プライマーまたはプライマー類は各々の異なった変異
を含む各々の核酸に実質的に相補的になるように選択さ
れており、そのためそれがその相補物から分離された場
合、１つのプライマーから合成された延長制生成物は他
のプライマーの延長生成物の合成のための鋳型として働
くことができ； （ｂ）変性条件下試料を処理し、もし検出されるべき変
異が存在するならその鋳型からプライマー延長生成物を
分離し； （ｃ）一緒にまたは連続的に前記４つのヌクレオチド三
リン酸、ヌクレオチド三リン酸の重合剤、およびオリゴ
ヌクレオチド プライマーで試料を処理し、工程（ｂ）
で産生された各々の単一鎖を鋳型として使用してプライ
マー延長生成物が合成され、配列変異を含む核酸がもし
存在するなら検出可能になるほど増幅されるまで十分な
回数、工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返し； （ｄ）工程（ｃ）の生成物を膜に固定し； （ｅ）ハイブリダイゼーション条件下、プローブの配列
が増幅配列の領域と相補的である場合のみ増幅核酸配列
でハイブリダイズ可能な標識配列−特異的オリゴヌクレ
オチド プローブで膜を処理し；および （ｆ）核酸試料中の増幅配列へプローブがハイブリダイ
スしたかどうかを検出することから成っている。
少くとも１つのヌクレオチド変異の存在または不在の
検定はある種の特定の状態においては別の方法でも達成
されるかもしれない。点突然変異が制限部位を創造また
は破壊するような特異な場合においては（例えば鎌状赤
血球性貧血）、増幅前または後に、制限酵素消化を用い
られるであろう［F.F.Chehabら、ネーチャー329,293,
（1987）］。さらに核酸配列の大規模な欠失に関して
は、増幅のためのプライマーはα−サラセミアを引き起
こす23kb欠失のごとき疑われる欠失内の領域に対して調
製されるであろうし；そのような場合欠失配列を増幅し
ない事で欠失を確認し、そのような例はα−サラセミア
の診断［F.F.Chehabら、ネーチャー329,293,（1987）］
である。
検定はある種の特定の状態においては別の方法でも達成
されるかもしれない。点突然変異が制限部位を創造また
は破壊するような特異な場合においては（例えば鎌状赤
血球性貧血）、増幅前または後に、制限酵素消化を用い
られるであろう［F.F.Chehabら、ネーチャー329,293,
（1987）］。さらに核酸配列の大規模な欠失に関して
は、増幅のためのプライマーはα−サラセミアを引き起
こす23kb欠失のごとき疑われる欠失内の領域に対して調
製されるであろうし；そのような場合欠失配列を増幅し
ない事で欠失を確認し、そのような例はα−サラセミア
の診断［F.F.Chehabら、ネーチャー329,293,（1987）］
である。
ヨーロッパ特許公開第237,362号は、RFLP（制限酵素
切断片多型）および例えばKanおよびDozy、プロシーデ
ィングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンス（USA）75,5631（1978）,RubinおよびKan,ラ
ンセット,1985−I,75（1985）,Connerら、プロシーディ
ングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サ
イエンス（USA），80,78（1983）,Kiddら、ネーチャ
ー，304,230（1983）およびPiratsuら、ニュー イング
ランド ジャーナル オブ メディシン309,284（198
3）に記載されているごとき対立形質特異性オリゴヌク
レオチド技術に対してある種の利点を持っている。
切断片多型）および例えばKanおよびDozy、プロシーデ
ィングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンス（USA）75,5631（1978）,RubinおよびKan,ラ
ンセット,1985−I,75（1985）,Connerら、プロシーディ
ングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サ
イエンス（USA），80,78（1983）,Kiddら、ネーチャ
ー，304,230（1983）およびPiratsuら、ニュー イング
ランド ジャーナル オブ メディシン309,284（198
3）に記載されているごとき対立形質特異性オリゴヌク
レオチド技術に対してある種の利点を持っている。
ヨーロッパ特許公開第237,362号が関心ある特定の配
列の無差別の増幅を含む方法を記載しているにもかかわ
らず、ほんの１つのヌクレオチドが異なる配列間の区別
を可能にするのに必要とされる標識配列特異性オリゴヌ
クレオチド プローブの更なる使用および／または関心
ある点突然変異が酵素認識配列を創造または破壊する限
られた場合の特異的制限酵素の使用および／または増幅
DNAへの直接シークェンシング法［C.Wongら、ネーチャ
ー330,384（1987）を参照されたい］の使用を含む多数
の時間がかかる更なる検出工程を必要とするのは免れが
たい。
列の無差別の増幅を含む方法を記載しているにもかかわ
らず、ほんの１つのヌクレオチドが異なる配列間の区別
を可能にするのに必要とされる標識配列特異性オリゴヌ
クレオチド プローブの更なる使用および／または関心
ある点突然変異が酵素認識配列を創造または破壊する限
られた場合の特異的制限酵素の使用および／または増幅
DNAへの直接シークェンシング法［C.Wongら、ネーチャ
ー330,384（1987）を参照されたい］の使用を含む多数
の時間がかかる更なる検出工程を必要とするのは免れが
たい。
発明が解決しようとする問題点 ゲノムDNAのごとき核酸中の少くとも１つの単一塩基
の相異を直接的に検出する簡便な方法に対する要望があ
り、その検出工程を最小にすれば、作業者が熟練しなく
ても迅速に正確におよび容易に実施できる方法となるで
あろう。
の相異を直接的に検出する簡便な方法に対する要望があ
り、その検出工程を最小にすれば、作業者が熟練しなく
ても迅速に正確におよび容易に実施できる方法となるで
あろう。
問題を解決するための手段 本発明は、適当にオリゴヌクレオシド プライマーの
ヌクレオシド配列を選択することにより、疑わしい変異
ヌクレオチドを含む配列または正常ヌクレオチドを含む
対応する配列のプライマー延長を選択的に達成するかま
たはそのようなプライマーの延長を妨ぐことが可能であ
り、それ故、必要な検出方法がかなり簡便化される。
ヌクレオシド配列を選択することにより、疑わしい変異
ヌクレオチドを含む配列または正常ヌクレオチドを含む
対応する配列のプライマー延長を選択的に達成するかま
たはそのようなプライマーの延長を妨ぐことが可能であ
り、それ故、必要な検出方法がかなり簡便化される。
本発明の１つの様相に従うと、試料中に含まれる１つ
またはそれ以上の核酸中の少くとも１つの変異ヌクレオ
チドの存在または不在を検出する方法が提供され、その
方法は： 一緒にまたは連続的に適当なヌクレオチド三リン酸、
ヌクレオチド三リン酸の重合剤および標的塩基配列の診
断部分のための診断プライマーでハイブリダイゼーショ
ン条件下試料を処理し、前記診断プライマーのヌクレオ
チド配列は前記診断部分に対して実質的に相補的になっ
ており、診断プライマーの末端ヌクレオチドは疑われる
変異ヌクレオチドまたは対応する正常ヌクレオチドに対
して相補的なものであり、それにより、診断プライマー
の延長生成物は診断プライマーの前記末端ヌクレオチド
が標的塩基配列中の対応するヌクレオチドと相補的な場
合合成され、診断プライマーの前記末端ヌクレオチドが
標的塩基配列の対応するヌクレオチドが相補的でない場
合は延長生成物は合成されない；および延長生成物が存
在するかまたは不在であるかより疑わしい変異ヌクレオ
チドの存在または不在を検出する。
またはそれ以上の核酸中の少くとも１つの変異ヌクレオ
チドの存在または不在を検出する方法が提供され、その
方法は： 一緒にまたは連続的に適当なヌクレオチド三リン酸、
ヌクレオチド三リン酸の重合剤および標的塩基配列の診
断部分のための診断プライマーでハイブリダイゼーショ
ン条件下試料を処理し、前記診断プライマーのヌクレオ
チド配列は前記診断部分に対して実質的に相補的になっ
ており、診断プライマーの末端ヌクレオチドは疑われる
変異ヌクレオチドまたは対応する正常ヌクレオチドに対
して相補的なものであり、それにより、診断プライマー
の延長生成物は診断プライマーの前記末端ヌクレオチド
が標的塩基配列中の対応するヌクレオチドと相補的な場
合合成され、診断プライマーの前記末端ヌクレオチドが
標的塩基配列の対応するヌクレオチドが相補的でない場
合は延長生成物は合成されない；および延長生成物が存
在するかまたは不在であるかより疑わしい変異ヌクレオ
チドの存在または不在を検出する。
本発明の方法は点突然変異の存在または不在の検出に
特に関しているが、本方法は１つ以上のヌクレオチドの
欠失を含む欠失の存在または不在の検出、同様に、１つ
以上のヌクレオチドの置換の存在または不在の検出にも
等しく応用できる事が理解されなければならない。この
点で関連したヌクレオチド、特に関連した末端ヌクレオ
チドを知る事が必要なだけであり、必要な診断プライマ
ー（類）は適切にデザインできるであろう。
特に関しているが、本方法は１つ以上のヌクレオチドの
欠失を含む欠失の存在または不在の検出、同様に、１つ
以上のヌクレオチドの置換の存在または不在の検出にも
等しく応用できる事が理解されなければならない。この
点で関連したヌクレオチド、特に関連した末端ヌクレオ
チドを知る事が必要なだけであり、必要な診断プライマ
ー（類）は適切にデザインできるであろう。
形成された延長生成物は例えば単一または二重鎖型の
任意の都合のよい型で検出されるであろう事が理解され
るであろう。
任意の都合のよい型で検出されるであろう事が理解され
るであろう。
得られる延長生成物は、もし望むなら米国特許第4683
195号および4683202号に記載されているごとくポリメラ
ーゼ連鎖反応（PCR）により、PCT特許公開WO87/06270お
よびバイオテクノロジー,6巻,1988年10月に記載されて
いるごときＱ−ベータ レプリカーゼを使用し、PCT特
許公開WO88/10315に記載されているごときシスカ（Sisk
a）コーポレーションの転写に基ずく核酸増幅を使用
し、また線状増幅を使用して増幅される事がさらに理解
されるであろう。これに関連して本明細書で使用される
表現“線状増幅”とは重合化の為の試薬および適切なヌ
クレオチド三リン酸存在下、各々の診断部分のための単
一のプライマーを使用する増幅を称し、それにより、増
幅は鋳型としての試料核酸の単一鎖の使用に基ずくプラ
イマー延長に影響される。
195号および4683202号に記載されているごとくポリメラ
ーゼ連鎖反応（PCR）により、PCT特許公開WO87/06270お
よびバイオテクノロジー,6巻,1988年10月に記載されて
いるごときＱ−ベータ レプリカーゼを使用し、PCT特
許公開WO88/10315に記載されているごときシスカ（Sisk
a）コーポレーションの転写に基ずく核酸増幅を使用
し、また線状増幅を使用して増幅される事がさらに理解
されるであろう。これに関連して本明細書で使用される
表現“線状増幅”とは重合化の為の試薬および適切なヌ
クレオチド三リン酸存在下、各々の診断部分のための単
一のプライマーを使用する増幅を称し、それにより、増
幅は鋳型としての試料核酸の単一鎖の使用に基ずくプラ
イマー延長に影響される。
第１の特に好適な本発明の実施態様において、その方
法は以下の工程からなっている： １） 一緒にまたは連続的に、適当なヌクレオシド三リ
ン酸、ヌクレオシド三リン酸の重合化のための試薬、標
的塩基配列の診断部分のための診断プライマーおよび対
応する増幅プライマーでハイブリダイゼーション条件下
試料を処理し、前記診断プライマーのヌクレオチド配列
は前記診断部分と実質的に相補的になっており、診断プ
ライマーの末端ヌクレオチドは疑われる変異ヌクレオチ
ドかまたは対応する正常ヌクレオチドと相補的になって
おり、それにより前記診断プライマーの末端ヌクレオチ
ドが標的塩基配列中の対応するヌクレオチドと相補的で
ある場合診断プライマーの延長生成物が合成され、前記
診断プライマーの末端ヌクレオチドが標的塩基配列中の
対応するヌクレオチドと相補的でない場合延長生成物は
合成されず；生成した診断プライマーの任意の延長生成
物がその相補体から分離した後は前記増幅プライマーの
延長生成物の合成のための鋳型として働くことができ； ２） そのような延長生成物が形成されたものはその鋳
型からプライマー延長生成物を分離するため変性条件下
試料を処理し； ３） 工程（２）で産生された単一鎖生成物を、適切な
ヌクレオシド三リン酸類と一緒にまたは連続的に、ヌク
レオシド三リン酸と重合化のための試薬、診断プライマ
ーおよび増幅プライマーと先に定義したごとく接触せし
め、それにより、可能ならば工程（２）で産生して単一
鎖を鋳型としてさらなる延長生成物を合成し； ４） 工程（２）および（３）を十分な回数繰り返して
適切なヌクレオチド配列が検出可能になるまで増幅し；
および ５） 工程（４）で得られる増幅生成物の存在または不
在から、疑われる変異ヌクレオチドの存在または不在を
検出する。
法は以下の工程からなっている： １） 一緒にまたは連続的に、適当なヌクレオシド三リ
ン酸、ヌクレオシド三リン酸の重合化のための試薬、標
的塩基配列の診断部分のための診断プライマーおよび対
応する増幅プライマーでハイブリダイゼーション条件下
試料を処理し、前記診断プライマーのヌクレオチド配列
は前記診断部分と実質的に相補的になっており、診断プ
ライマーの末端ヌクレオチドは疑われる変異ヌクレオチ
ドかまたは対応する正常ヌクレオチドと相補的になって
おり、それにより前記診断プライマーの末端ヌクレオチ
ドが標的塩基配列中の対応するヌクレオチドと相補的で
ある場合診断プライマーの延長生成物が合成され、前記
診断プライマーの末端ヌクレオチドが標的塩基配列中の
対応するヌクレオチドと相補的でない場合延長生成物は
合成されず；生成した診断プライマーの任意の延長生成
物がその相補体から分離した後は前記増幅プライマーの
延長生成物の合成のための鋳型として働くことができ； ２） そのような延長生成物が形成されたものはその鋳
型からプライマー延長生成物を分離するため変性条件下
試料を処理し； ３） 工程（２）で産生された単一鎖生成物を、適切な
ヌクレオシド三リン酸類と一緒にまたは連続的に、ヌク
レオシド三リン酸と重合化のための試薬、診断プライマ
ーおよび増幅プライマーと先に定義したごとく接触せし
め、それにより、可能ならば工程（２）で産生して単一
鎖を鋳型としてさらなる延長生成物を合成し； ４） 工程（２）および（３）を十分な回数繰り返して
適切なヌクレオチド配列が検出可能になるまで増幅し；
および ５） 工程（４）で得られる増幅生成物の存在または不
在から、疑われる変異ヌクレオチドの存在または不在を
検出する。
本発明の第２の実施態様においては、前記試料を、 （ａ）第１の核酸配列の診断部分に対し実質的に相補的
な配列を持つ第１の診断プライマー、第１の診断プライ
マーは前記疑わしい変異ヌクレオチドに対し相補的な末
端ヌクレオチドを持ち、および第２の核酸配列の診断部
分に対し実質的に相補的な配列を持つ第２の診断プライ
マー、第２の診断プライマーは疑われる変異ヌクレオチ
ドに相補的なものに対して相補的な末端ヌクレオチドを
持つ；かまたは （ｂ）第１の核酸配列の診断部分に実質的に相補的な配
列を持つ第１の診断プライマー、第１の診断プライマー
は前記疑わしい変異配列に対応する正常なヌクレオチド
に対し相補的な末端ヌクレオチドを持ち、および第２の
診断プライマーは第２の核酸配列の診断部分に実質的に
相補的な配列を持ち、第２の診断プライマーは前記疑わ
しい変異ヌクレオチドに対応する正常ヌクレオチドに相
補的な末端ヌクレオチドを持つ； と一緒にまたは連続的に処理し、前記第１の診断プライ
マーの末端ヌクレオチドおよび前記第２の診断プライマ
ーの末端ヌクレオチドは両方とも別のプライマーの５′
末端または両方３′末端であり、第１の核酸配列は第２
の核酸配列に対し、逆の向きである。
な配列を持つ第１の診断プライマー、第１の診断プライ
マーは前記疑わしい変異ヌクレオチドに対し相補的な末
端ヌクレオチドを持ち、および第２の核酸配列の診断部
分に対し実質的に相補的な配列を持つ第２の診断プライ
マー、第２の診断プライマーは疑われる変異ヌクレオチ
ドに相補的なものに対して相補的な末端ヌクレオチドを
持つ；かまたは （ｂ）第１の核酸配列の診断部分に実質的に相補的な配
列を持つ第１の診断プライマー、第１の診断プライマー
は前記疑わしい変異配列に対応する正常なヌクレオチド
に対し相補的な末端ヌクレオチドを持ち、および第２の
診断プライマーは第２の核酸配列の診断部分に実質的に
相補的な配列を持ち、第２の診断プライマーは前記疑わ
しい変異ヌクレオチドに対応する正常ヌクレオチドに相
補的な末端ヌクレオチドを持つ； と一緒にまたは連続的に処理し、前記第１の診断プライ
マーの末端ヌクレオチドおよび前記第２の診断プライマ
ーの末端ヌクレオチドは両方とも別のプライマーの５′
末端または両方３′末端であり、第１の核酸配列は第２
の核酸配列に対し、逆の向きである。
それ故本実施態様では、第２の診断プライマーは前に
称したごとくおよびこれ以後も増幅プライマーと考えら
れる、 この第２の実施態様は区別を可能にし特異性を増加せ
しめるであろう、なぜなら人為的生成物は発火薬が単一
診断プライマーのみが使用される場合の単一末端よりも
ミスマッチしたオリゴヌクレオチドの関連のある末端
（一般的には３′−末端）にある事を必要とするからで
ある。
称したごとくおよびこれ以後も増幅プライマーと考えら
れる、 この第２の実施態様は区別を可能にし特異性を増加せ
しめるであろう、なぜなら人為的生成物は発火薬が単一
診断プライマーのみが使用される場合の単一末端よりも
ミスマッチしたオリゴヌクレオチドの関連のある末端
（一般的には３′−末端）にある事を必要とするからで
ある。
疑われる変異ヌクレオチドの存在または不在の検出は
例えば後で記載するごとく達成されるであろう。
例えば後で記載するごとく達成されるであろう。
本発明の第３の実施態様において、疑われる変異ヌク
レオチドを含むDNAからなる試料は増幅を受ける、例え
ば本明細書に定義されたごとき線状増幅により、または
例えば米国特許第4,683,195号および4,683,202号、PCT
特許公開WO87/06270,バイオテクノロジー,6巻,1988年10
月、またはPCT特許公開WO88/10315に記載されているご
とくして、増幅生成物をハイブリダイゼーション条件下
適当なヌクレオシド三リン酸およびヌクレオシド三リン
酸の重合化剤の存在下、標的塩基配列の診断部分のため
の診断プライマーで処理し、前記診断プライマーのヌク
レオチドは前記診断部分に対し実質的に相補的であり、
診断プライマーの末端ヌクレオチドは疑われる変異ヌク
レオチドかまたは対応する正常ヌクレオチドに対し相補
的である。
レオチドを含むDNAからなる試料は増幅を受ける、例え
ば本明細書に定義されたごとき線状増幅により、または
例えば米国特許第4,683,195号および4,683,202号、PCT
特許公開WO87/06270,バイオテクノロジー,6巻,1988年10
月、またはPCT特許公開WO88/10315に記載されているご
とくして、増幅生成物をハイブリダイゼーション条件下
適当なヌクレオシド三リン酸およびヌクレオシド三リン
酸の重合化剤の存在下、標的塩基配列の診断部分のため
の診断プライマーで処理し、前記診断プライマーのヌク
レオチドは前記診断部分に対し実質的に相補的であり、
診断プライマーの末端ヌクレオチドは疑われる変異ヌク
レオチドかまたは対応する正常ヌクレオチドに対し相補
的である。
それ故、本発明のこの第３の実施態様では、所望の数
のサイクル通常の増幅が実施され、検出工程の前に、診
断プライマーとのハイブリダイゼーションが次の工程と
して試みられる。増幅プライマーは用いる必要がない。
のサイクル通常の増幅が実施され、検出工程の前に、診
断プライマーとのハイブリダイゼーションが次の工程と
して試みられる。増幅プライマーは用いる必要がない。
必要とされる重合のための試薬（類）の量がかなり減
少し（例えば少くとも半減する）、使用されるヌクレオ
シド三リン酸の量もであり、かわりに多数のポリメラー
ゼ連鎖反応（PCR）過熱器を使用するのでこの第３の実
施態様は興味を引く。それ故、この第３の実施態様では
かなりの費用の倹約が達成可能である。さらに増幅工程
はこの第３の実施態様に不利な点を与える事なく通常の
温度範囲で達成され、ただより温度に敏感に試みられた
診断プローブとのハイブリダイゼーションが一度達成さ
れた事を必要とするので、さらに末端が不適合（一般的
には３′−不適合）な診断プライマーの為の発現の危険
性を減少せしめる。この第３の実施態様はこのように非
熟練者使用に対して潜在的に信頼がおける少々の事には
大丈夫な方法を提供し、作業者の失敗をより許容するも
のである。最初の増幅はそれ自身の内部制御であるので
この第３の実施態様はさらに余分のポリメラーゼ連鎖反
応制御工程に対する必要性も未然に防ぐ。
少し（例えば少くとも半減する）、使用されるヌクレオ
シド三リン酸の量もであり、かわりに多数のポリメラー
ゼ連鎖反応（PCR）過熱器を使用するのでこの第３の実
施態様は興味を引く。それ故、この第３の実施態様では
かなりの費用の倹約が達成可能である。さらに増幅工程
はこの第３の実施態様に不利な点を与える事なく通常の
温度範囲で達成され、ただより温度に敏感に試みられた
診断プローブとのハイブリダイゼーションが一度達成さ
れた事を必要とするので、さらに末端が不適合（一般的
には３′−不適合）な診断プライマーの為の発現の危険
性を減少せしめる。この第３の実施態様はこのように非
熟練者使用に対して潜在的に信頼がおける少々の事には
大丈夫な方法を提供し、作業者の失敗をより許容するも
のである。最初の増幅はそれ自身の内部制御であるので
この第３の実施態様はさらに余分のポリメラーゼ連鎖反
応制御工程に対する必要性も未然に防ぐ。
もし所望するなら診断プライマーは分解の危険性がな
い（例えばPCRのごとき高温環化技術）信号または標識
を運ぶことができる。例えば記載されているごとくアル
カリホスファターゼまたは西洋ワサビ ペルオキシダー
ゼのごとき適当な標識化または信号発生部分を用いて標
識できる。この点でテルムス アクアチクス （Thermu
s apuaticus）から誘導されるホスファターゼのごとき
標識化のための熱安定酵素の応用が興味があろう。
い（例えばPCRのごとき高温環化技術）信号または標識
を運ぶことができる。例えば記載されているごとくアル
カリホスファターゼまたは西洋ワサビ ペルオキシダー
ゼのごとき適当な標識化または信号発生部分を用いて標
識できる。この点でテルムス アクアチクス （Thermu
s apuaticus）から誘導されるホスファターゼのごとき
標識化のための熱安定酵素の応用が興味があろう。
本発明の第４の好適な実施態様は本発明の第３の実施
態様を本発明の第２の実施態様で記載した２つの診断プ
ライマーを用いる特色を導入する事で改良したものであ
り、第２の診断プライマーは潜在的に増幅プライマーと
して働く。
態様を本発明の第２の実施態様で記載した２つの診断プ
ライマーを用いる特色を導入する事で改良したものであ
り、第２の診断プライマーは潜在的に増幅プライマーと
して働く。
それ故本発明の第４の実施態様においては疑われる変
異ヌクレオチドを含むDNAは増幅を受け、増幅された生
成物を： （ａ） 第１の核酸配列の診断部分に対し実質的に相補
的な配列を持つ第１の診断プライマー、第１の診断プラ
イマーは前記疑われる変異ヌクレオチドに対し相補的な
末端ヌクレオチドを持ち、および第２核酸配列の診断部
分に対し実質的に相補的な配列を持つ第２の診断プライ
マー、第２の診断プライマーは前記疑われる変異ヌクレ
オチドに対し相補的なヌクレオチドに対し相補的な末端
ヌクレオチドを持ち；または （ｂ） 第１の核酸配列の診断部分に対し実質的に相補
的な配列を持つ第１の診断プライマー、第１の診断プラ
イマーは前記疑われる変異ヌクレオチドに対応する正常
ヌクレオチドに対し相補的な末端ヌクレオチドを持ち、
および第２の核酸配列の診断部分に対し実質的に相補的
な配列を持つ第２の診断プライマー、第２の診断プライ
マーは前記疑われる変異ヌクレオチドに対応する前記正
常ヌクレオチドに対し相補的なヌクレオチドに対し相補
的な末端ヌクレオチドを持つ；と一緒にまたは連続的に
処理し、前記第１の診断プライマーの末端ヌクレオチド
および前記第２の診断プライマーは両方とも別個のプラ
イマーの５′末端か両方とも３′末端にあり、第１の核
酸配列は第２の核酸配列と相補的である。
異ヌクレオチドを含むDNAは増幅を受け、増幅された生
成物を： （ａ） 第１の核酸配列の診断部分に対し実質的に相補
的な配列を持つ第１の診断プライマー、第１の診断プラ
イマーは前記疑われる変異ヌクレオチドに対し相補的な
末端ヌクレオチドを持ち、および第２核酸配列の診断部
分に対し実質的に相補的な配列を持つ第２の診断プライ
マー、第２の診断プライマーは前記疑われる変異ヌクレ
オチドに対し相補的なヌクレオチドに対し相補的な末端
ヌクレオチドを持ち；または （ｂ） 第１の核酸配列の診断部分に対し実質的に相補
的な配列を持つ第１の診断プライマー、第１の診断プラ
イマーは前記疑われる変異ヌクレオチドに対応する正常
ヌクレオチドに対し相補的な末端ヌクレオチドを持ち、
および第２の核酸配列の診断部分に対し実質的に相補的
な配列を持つ第２の診断プライマー、第２の診断プライ
マーは前記疑われる変異ヌクレオチドに対応する前記正
常ヌクレオチドに対し相補的なヌクレオチドに対し相補
的な末端ヌクレオチドを持つ；と一緒にまたは連続的に
処理し、前記第１の診断プライマーの末端ヌクレオチド
および前記第２の診断プライマーは両方とも別個のプラ
イマーの５′末端か両方とも３′末端にあり、第１の核
酸配列は第２の核酸配列と相補的である。
一般に前記第１の診断プライマーの末端ヌクレオチド
および前記診断プライマーの末端ヌクレオチドは各々そ
の別個のプライマーの３′末端にある。
および前記診断プライマーの末端ヌクレオチドは各々そ
の別個のプライマーの３′末端にある。
本発明の第４の実施態様にはのように先に定義した本
発明の第２および第３の実施態様の潜在的利点を合わせ
持っており、これらはなかんずく潜在的に特異性を増加
せしめ、費用を倹約し、より丈夫な、使用者に親しみ易
い技術である。
発明の第２および第３の実施態様の潜在的利点を合わせ
持っており、これらはなかんずく潜在的に特異性を増加
せしめ、費用を倹約し、より丈夫な、使用者に親しみ易
い技術である。
疑われる変異ヌクレオチドの存在または不在の検出は
例えば後で記載するごとく達成される。
例えば後で記載するごとく達成される。
増幅された生成物が前に定義したごとき（ａ）かまた
は（ｂ）で一度処理されると所望されるごとく一つまた
はそれ以上の最終的サイクルに供される事が理解される
であろう。多数のサイクルが達成された場合、更なる生
成物が得られるであろうし、これは診断プライマーの延
長生成物のハイブリッドである。本来のPCR（ポリメラ
ーゼ連鎖反応）プライマー オリゴヌクレオチドおよび
添加した診断プライマー オリゴヌクレオチドの相対的
比率に依存して種々の生成物が形成されるであろう。
は（ｂ）で一度処理されると所望されるごとく一つまた
はそれ以上の最終的サイクルに供される事が理解される
であろう。多数のサイクルが達成された場合、更なる生
成物が得られるであろうし、これは診断プライマーの延
長生成物のハイブリッドである。本来のPCR（ポリメラ
ーゼ連鎖反応）プライマー オリゴヌクレオチドおよび
添加した診断プライマー オリゴヌクレオチドの相対的
比率に依存して種々の生成物が形成されるであろう。
増幅が診断および増幅プライマー使用かまたは、例え
ば本発明の第１および第２の実施態様またはヨーロッパ
特許公開第237,362号に記載されている増幅方法の一部
に記載されているごとき２つの診断プライマーの使用に
より増幅が達成される場合、工程（ａ）その鋳型からプ
ライマー延長生成物を分離するため変性せしめ、および
（ｂ）そのようにして得られた単一鎖を一緒にまたは連
続的に、適当なヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド三
リン酸の重合化剤、および別個のプライマーと接触せし
めて更なる延長生成物を合成する；を少くとも５回（サ
イクル）から特にプライマーが本発明に損失を与えるこ
となく増幅に抵抗する不定の数まで好適には繰り返す。
さらに良好であるのは、もし試料がヒトゲノムDNAを含
む場合、15−60例えば15−30回（サイクル）が用いられ
る。もし試料が細胞であるなら、好適にはその中の核酸
を試薬に曝露する為工程（ａ）の前に加熱する。この工
程で試薬添加に先だつ核酸の精製を避ける。この点で
は、試みられる増幅に先だってたとえ試料からのDNA精
製が行われても、以前の方法よりもかなりの改良を本発
明が示す事が理解されるであろう。
ば本発明の第１および第２の実施態様またはヨーロッパ
特許公開第237,362号に記載されている増幅方法の一部
に記載されているごとき２つの診断プライマーの使用に
より増幅が達成される場合、工程（ａ）その鋳型からプ
ライマー延長生成物を分離するため変性せしめ、および
（ｂ）そのようにして得られた単一鎖を一緒にまたは連
続的に、適当なヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド三
リン酸の重合化剤、および別個のプライマーと接触せし
めて更なる延長生成物を合成する；を少くとも５回（サ
イクル）から特にプライマーが本発明に損失を与えるこ
となく増幅に抵抗する不定の数まで好適には繰り返す。
さらに良好であるのは、もし試料がヒトゲノムDNAを含
む場合、15−60例えば15−30回（サイクル）が用いられ
る。もし試料が細胞であるなら、好適にはその中の核酸
を試薬に曝露する為工程（ａ）の前に加熱する。この工
程で試薬添加に先だつ核酸の精製を避ける。この点で
は、試みられる増幅に先だってたとえ試料からのDNA精
製が行われても、以前の方法よりもかなりの改良を本発
明が示す事が理解されるであろう。
工程（ｂ）において工程（ａ）で生産された単一鎖お
よび適当なヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド三リン
酸の重合化剤、プライマー（類）、例えば診断プライマ
ー（類）および／または増幅プライマー（類）間の接触
がその鋳型からのプライマー延長生成物の分離（工程
ａ）に続くこれらの物質の反応混合物への添加によりま
たは反応混合物内にすでに存在している物質に依存して
達成されるであろう事が評価されるであろう。実際、任
意の１つまたは他の異ったヌクレオシド三リン酸および
／または重合剤および／またはプライマー（類）、例え
ば診断プライマー（類）および／または増幅プライマ
ー、は本発明の方法の任意の段階で添加できる。
よび適当なヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド三リン
酸の重合化剤、プライマー（類）、例えば診断プライマ
ー（類）および／または増幅プライマー（類）間の接触
がその鋳型からのプライマー延長生成物の分離（工程
ａ）に続くこれらの物質の反応混合物への添加によりま
たは反応混合物内にすでに存在している物質に依存して
達成されるであろう事が評価されるであろう。実際、任
意の１つまたは他の異ったヌクレオシド三リン酸および
／または重合剤および／またはプライマー（類）、例え
ば診断プライマー（類）および／または増幅プライマ
ー、は本発明の方法の任意の段階で添加できる。
本発明の第５の良好な実施態様に従うと、前に定義し
たごとく、鋳型としての試料核酸の単一鎖の使用に基づ
いたプライマー延長により増幅が達成される方法が提供
される。
たごとく、鋳型としての試料核酸の単一鎖の使用に基づ
いたプライマー延長により増幅が達成される方法が提供
される。
それ故この実施態様では鋳型としての試料核酸の同一
の鎖の使用に基づいてプライマー延長が達成され、増幅
プライマーは存在しない。それ故増幅は指数的というよ
り算術的であり、指数的増幅はポリメラーゼ要求反応
（PCR）により少くとも理論的には可能である。本発明
の第５の実施態様の利点は（また本明細書において線状
増幅と称される）人為的生成物がもし産生されてもそれ
自身指数的増幅に供される事ができない事である。
の鎖の使用に基づいてプライマー延長が達成され、増幅
プライマーは存在しない。それ故増幅は指数的というよ
り算術的であり、指数的増幅はポリメラーゼ要求反応
（PCR）により少くとも理論的には可能である。本発明
の第５の実施態様の利点は（また本明細書において線状
増幅と称される）人為的生成物がもし産生されてもそれ
自身指数的増幅に供される事ができない事である。
線状増幅は任意の通常の手段により達成され、および
ヌクレオシド三リン酸の重合化剤の存在下相補ヌクレオ
シド三リン酸の使用により達成されるであろうし、診断
プライマーおよび試料核酸間に十分な程度の相補性が存
在する不定の長さのプライマー延長生成物を産生する。
良好にはすべての相補ヌクレオシド三リン酸が用いられ
た試料核酸がエンドヌクレアーゼ消化に供され、選択さ
れた制限エンドヌクレアーゼは決まった長さのプライマ
ー延長生成物の形成を充分可能にする部位で試料核酸の
切断を達成するのに確実にするためである。しかしなが
ら、都合よく線状増幅は１のみ、都合よくは２のみまた
は好適には３ヌクレオシド三リン酸のみの存在下達成さ
れるので、その結合状態の診断プライマー（即ち試料核
酸にハイブリダイズしている）は1,2または３ヌクレオ
シド三リン酸の存在が許される限り延長できる。試料核
酸中にヌクレオシド三リン酸が存在しても、それに対す
る相補ヌクレオシド三リン酸が存在しないと、プライマ
ー延長は中止されるであろう。
ヌクレオシド三リン酸の重合化剤の存在下相補ヌクレオ
シド三リン酸の使用により達成されるであろうし、診断
プライマーおよび試料核酸間に十分な程度の相補性が存
在する不定の長さのプライマー延長生成物を産生する。
良好にはすべての相補ヌクレオシド三リン酸が用いられ
た試料核酸がエンドヌクレアーゼ消化に供され、選択さ
れた制限エンドヌクレアーゼは決まった長さのプライマ
ー延長生成物の形成を充分可能にする部位で試料核酸の
切断を達成するのに確実にするためである。しかしなが
ら、都合よく線状増幅は１のみ、都合よくは２のみまた
は好適には３ヌクレオシド三リン酸のみの存在下達成さ
れるので、その結合状態の診断プライマー（即ち試料核
酸にハイブリダイズしている）は1,2または３ヌクレオ
シド三リン酸の存在が許される限り延長できる。試料核
酸中にヌクレオシド三リン酸が存在しても、それに対す
る相補ヌクレオシド三リン酸が存在しないと、プライマ
ー延長は中止されるであろう。
もし望むなら線状増幅は配列の融点（Tm）でも達成さ
れる。この温度では試料核酸中の相補配列へハイブリダ
イズする診断プライマーは溶液中の遊離の診断プライマ
ーと平衡になっており、それ故診断プライマー（任意の
延長型で）は急速にハイブリダイズし、試料核酸から変
性される。もし望むなら線状増幅はまた温度を振動せし
めても達成される。そのような温度振動は一般的に配列
の融点での急速な温度変動が含まれるであろう。
れる。この温度では試料核酸中の相補配列へハイブリダ
イズする診断プライマーは溶液中の遊離の診断プライマ
ーと平衡になっており、それ故診断プライマー（任意の
延長型で）は急速にハイブリダイズし、試料核酸から変
性される。もし望むなら線状増幅はまた温度を振動せし
めても達成される。そのような温度振動は一般的に配列
の融点での急速な温度変動が含まれるであろう。
もし1,2または３ヌクレオシド三リン酸のみが存在す
ると、診断プライマーはこれらのヌクレオシド三リン酸
の存在がゆるされる限りでのみ延長されるであろう。前
に示したごとく、例えば診断プライマーの３′末端と試
料拡散中の対応するヌクレオシド三リン酸の間でミスマ
ッチがある場合、プライマーの延長は達成されないであ
ろう。しかしながら、３′末端ヌクレオシド三リン酸が
試料核酸中の対応するヌクレオシド三リン酸と相補的な
場合、プライマー延長は達成されるであろう。
ると、診断プライマーはこれらのヌクレオシド三リン酸
の存在がゆるされる限りでのみ延長されるであろう。前
に示したごとく、例えば診断プライマーの３′末端と試
料拡散中の対応するヌクレオシド三リン酸の間でミスマ
ッチがある場合、プライマーの延長は達成されないであ
ろう。しかしながら、３′末端ヌクレオシド三リン酸が
試料核酸中の対応するヌクレオシド三リン酸と相補的な
場合、プライマー延長は達成されるであろう。
1,2または３ヌクレオシド三リン酸のみが使用され、
延長診断プライマーの末端ヌクレオシド三リン酸が一度
のみ使用される場合、ヌクレオシドとしてジデオキシヌ
クレオシド三リン酸の使用が便利であり、その使用によ
り、診断プライマー延長生成物の末端ヌクレオシド三リ
ン酸が構成されるであろう。この事は、診断プライマー
の明らかな終結延長の産生の手助けとなるであろう。
延長診断プライマーの末端ヌクレオシド三リン酸が一度
のみ使用される場合、ヌクレオシドとしてジデオキシヌ
クレオシド三リン酸の使用が便利であり、その使用によ
り、診断プライマー延長生成物の末端ヌクレオシド三リ
ン酸が構成されるであろう。この事は、診断プライマー
の明らかな終結延長の産生の手助けとなるであろう。
もし望むなら延長プライマー（類）内へ取り込ませる
目的で、反応混合物中に存在する１つまたはそれ以上の
ヌクレオシド三リン酸を任意の便利な方法で標識または
マークしてもよい。それ故例えば１つまたはそれ以上の
ヌクレオシド三リン酸は蛍光的に標識されるであろう。
診断プライマーの延長生成物の生成が延長生成物に取り
込まれた標識または印をつけたヌクレオシド三リン酸
（類）を検出する事により検出できる場合、このヌクレ
オシド三リン酸の標識化は本発明の第５の実施態様と関
連して特に興味がもてる。取り込みがおこらないと延長
生成物が形成されず、標識または印をつけたヌクレオシ
ド三リン酸は例えば洗い流されるであろう。特に、本発
明の第５の実施態様は人為的生成物の増幅の問題を回避
でき、標識化または印をつけたヌクレオシド三リン酸
（類）の存在下、良好な区別が達成されるのを可能にす
る。増幅が例えばPCRの使用により達成された場合、人
為的生成物の産生でもその生成物は増幅され、それ故標
識または印をつけたヌクレオシド三リン酸の取り込みは
それにより差別を減少させる。
目的で、反応混合物中に存在する１つまたはそれ以上の
ヌクレオシド三リン酸を任意の便利な方法で標識または
マークしてもよい。それ故例えば１つまたはそれ以上の
ヌクレオシド三リン酸は蛍光的に標識されるであろう。
診断プライマーの延長生成物の生成が延長生成物に取り
込まれた標識または印をつけたヌクレオシド三リン酸
（類）を検出する事により検出できる場合、このヌクレ
オシド三リン酸の標識化は本発明の第５の実施態様と関
連して特に興味がもてる。取り込みがおこらないと延長
生成物が形成されず、標識または印をつけたヌクレオシ
ド三リン酸は例えば洗い流されるであろう。特に、本発
明の第５の実施態様は人為的生成物の増幅の問題を回避
でき、標識化または印をつけたヌクレオシド三リン酸
（類）の存在下、良好な区別が達成されるのを可能にす
る。増幅が例えばPCRの使用により達成された場合、人
為的生成物の産生でもその生成物は増幅され、それ故標
識または印をつけたヌクレオシド三リン酸の取り込みは
それにより差別を減少させる。
前記のことに加え、診断プライマーは免疫学的結合対
の一部、（例えば抗原または抗体）または複合体形成対
の一部（例えばビオチン）を運んでいるのが望ましく、
前記結合対または形成対の他の一部と結合せしめ、固相
上に補足する目的のためである。
の一部、（例えば抗原または抗体）または複合体形成対
の一部（例えばビオチン）を運んでいるのが望ましく、
前記結合対または形成対の他の一部と結合せしめ、固相
上に補足する目的のためである。
本発明の更なる様相に従うと、試料中に含まれる１つ
またはそれ以上の核酸中の少くとも１つの変異ヌクレオ
チドの存在または不在を検出するためのキットが提供さ
れる、そのキットは： （１） 標的塩基配列の各々の診断部分のための診断プ
ライマー、各々の診断プライマーのヌクレオチド配列は
前記診断部分に対し実質的に相補的にされており、診断
プライマーの末端ヌクレオチドは疑われる変異ヌクレオ
チドまたは対応する正常ヌクレオチドに相補的であり、
その使用の際標的塩基配列中の対応するヌクレオチドに
前記診断プライマーの末端ヌクレオチドが相補的な場合
診断プライマーの延長生成物が合成され、前記診断プラ
イマーの末端ヌクレオチドが標的塩基配列の対応するヌ
クレオチドに相補的でない場合延長生成物は合成されな
い； （２）各々４つの異ったヌクレオシド三リン酸；および （３）（２）のヌクレオシド三リン酸の重合化剤からな
っている。
またはそれ以上の核酸中の少くとも１つの変異ヌクレオ
チドの存在または不在を検出するためのキットが提供さ
れる、そのキットは： （１） 標的塩基配列の各々の診断部分のための診断プ
ライマー、各々の診断プライマーのヌクレオチド配列は
前記診断部分に対し実質的に相補的にされており、診断
プライマーの末端ヌクレオチドは疑われる変異ヌクレオ
チドまたは対応する正常ヌクレオチドに相補的であり、
その使用の際標的塩基配列中の対応するヌクレオチドに
前記診断プライマーの末端ヌクレオチドが相補的な場合
診断プライマーの延長生成物が合成され、前記診断プラ
イマーの末端ヌクレオチドが標的塩基配列の対応するヌ
クレオチドに相補的でない場合延長生成物は合成されな
い； （２）各々４つの異ったヌクレオシド三リン酸；および （３）（２）のヌクレオシド三リン酸の重合化剤からな
っている。
便利なように本発明のキットはさらに、各々の診断プ
ライマーに対応する増幅プライマー、増幅プライマーの
ヌクレオチド配列は、その相補体から分離後、対応する
診断プライマーの延長生成物が増幅プライマーの延長生
成物の合成のための鋳型として働くようにされている。
例えば、本発明のキットは先に定義した第２の実施態様
に関連して詳述された両方の組の診断プライマーからな
る。
ライマーに対応する増幅プライマー、増幅プライマーの
ヌクレオチド配列は、その相補体から分離後、対応する
診断プライマーの延長生成物が増幅プライマーの延長生
成物の合成のための鋳型として働くようにされている。
例えば、本発明のキットは先に定義した第２の実施態様
に関連して詳述された両方の組の診断プライマーからな
る。
もし望むなら本発明のキットはまた、適当な内部制御
プライマーを含ませてもよい。
プライマーを含ませてもよい。
しかしながら、本発明のキットが各々の疑われる変異
ヌクレオチドに関するPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）プ
ライマーおよび診断プライマー（後に定義されるごと
き）からなるのが特に良好である。もし望むなら本キッ
トはさらに本発明の第２の実施態様に関して前に詳述し
た診断プライマーの両方の組を含んでもよい。
ヌクレオチドに関するPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）プ
ライマーおよび診断プライマー（後に定義されるごと
き）からなるのが特に良好である。もし望むなら本キッ
トはさらに本発明の第２の実施態様に関して前に詳述し
た診断プライマーの両方の組を含んでもよい。
（１），（２）および（３）で詳述した各々の物質お
よび／または増幅プライマーは便宜上別の容器に包装さ
れるが、良好であるのはすべてのものが１つの容器に合
併され、それに分析される物質を添加する。便利なよう
にその単一容器にはさらに緩衝液が含まれるであろう。
よび／または増幅プライマーは便宜上別の容器に包装さ
れるが、良好であるのはすべてのものが１つの容器に合
併され、それに分析される物質を添加する。便利なよう
にその単一容器にはさらに緩衝液が含まれるであろう。
本発明のキットが本発明の第２の実施態様に関連して
前に詳述された両方の組の診断プライマー（ａ）および
（ｂ）を含む場合、診断プライマーの両方の組は一緒に
単一の容器には存在しないであろう。けれども、プライ
マーの各々の組は別々の容器にはいった（２）および
（３）で詳述した各々の物質および／または増幅プライ
マーとは一緒に存在してもよい。試験される試料がヨー
ロッバ特許公開第237,362号に従って最初に増幅される
場合、１つの容器に前記（２）および（３）の物質と一
緒に診断プライマー（類）と同様に都合よくPCRプライ
マーも含まれていてもよい。しかしながらも望むなら、
増幅が達成された後に使用するため別の容器内に診断プ
ライマー（類）が存在していてもよいであろう。
前に詳述された両方の組の診断プライマー（ａ）および
（ｂ）を含む場合、診断プライマーの両方の組は一緒に
単一の容器には存在しないであろう。けれども、プライ
マーの各々の組は別々の容器にはいった（２）および
（３）で詳述した各々の物質および／または増幅プライ
マーとは一緒に存在してもよい。試験される試料がヨー
ロッバ特許公開第237,362号に従って最初に増幅される
場合、１つの容器に前記（２）および（３）の物質と一
緒に診断プライマー（類）と同様に都合よくPCRプライ
マーも含まれていてもよい。しかしながらも望むなら、
増幅が達成された後に使用するため別の容器内に診断プ
ライマー（類）が存在していてもよいであろう。
本明細書で使用される術語“ヌクレオシド三リン酸”
はDNAかまたはRNAに存在するヌクレオシドを称し、それ
故塩基としてアデニン、シトシン、グアニン、チミンお
よびウラシルが取り込まれ、糖部分はデオキシリボース
またはリボースであるヌクレオシドを含んでいる。一般
的に、デオキシリボヌクレオシドがDNAポリメラーゼと
共に使用されるであろう。しかしながら通常の塩基アデ
ニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルの１
つと塩基対形成ができる他の修飾塩基も使用されるであ
ろう。そのような修飾塩基は例えば８−アザグアニンお
よびヒポキサンチンが挙げられる。
はDNAかまたはRNAに存在するヌクレオシドを称し、それ
故塩基としてアデニン、シトシン、グアニン、チミンお
よびウラシルが取り込まれ、糖部分はデオキシリボース
またはリボースであるヌクレオシドを含んでいる。一般
的に、デオキシリボヌクレオシドがDNAポリメラーゼと
共に使用されるであろう。しかしながら通常の塩基アデ
ニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルの１
つと塩基対形成ができる他の修飾塩基も使用されるであ
ろう。そのような修飾塩基は例えば８−アザグアニンお
よびヒポキサンチンが挙げられる。
本明細書で使用される術語“ヌクレオチド”はDNAま
たはRNAに存在するヌクレオチドを称し、それ故塩基と
してアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラ
ジルが取り込まれ、糖部分はデオキシリボースまたはリ
ボースであるヌクレオチドを含んでいる。しかしながら
通常の塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよ
びウラシルの１つと塩基対形成ができる他の修飾塩基も
本発明で使用される診断プライマーおよび増幅プライマ
ーに使用できる。そのような修飾塩基には例えば８−ア
ザグアニンおよびヒポキサンチンが挙げられる。
たはRNAに存在するヌクレオチドを称し、それ故塩基と
してアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラ
ジルが取り込まれ、糖部分はデオキシリボースまたはリ
ボースであるヌクレオチドを含んでいる。しかしながら
通常の塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよ
びウラシルの１つと塩基対形成ができる他の修飾塩基も
本発明で使用される診断プライマーおよび増幅プライマ
ーに使用できる。そのような修飾塩基には例えば８−ア
ザグアニンおよびヒポキサンチンが挙げられる。
本発明の方法が、全ての４つの異ったヌクレオチドを
含まない標的塩基配列の部分に隣接する疑われる変異ヌ
クレオチドの存在または不在の検出のために使用する場
合診断プライマーの延長生成物およびもし望むなら増幅
プライマーの延長生成物は適当な応答するヌクレオシド
三リン酸のみの存在で形成され、４つの異なったヌクレ
オシド三リン酸のすべては必要でない事が理解されよ
う。
含まない標的塩基配列の部分に隣接する疑われる変異ヌ
クレオチドの存在または不在の検出のために使用する場
合診断プライマーの延長生成物およびもし望むなら増幅
プライマーの延長生成物は適当な応答するヌクレオシド
三リン酸のみの存在で形成され、４つの異なったヌクレ
オシド三リン酸のすべては必要でない事が理解されよ
う。
ヌクレオシド三リン酸の重合化のための試薬はプライ
マー延長生成物の合成に達成に機能するであろう任意の
化合物または系（酵素を含む）である。この目的に適し
た酵素には例えば大腸菌DNAポリメラーゼＩ、大腸菌DNA
ポリメラーゼＩのクレノー断片、T4DNAポリメラーゼ、
他の入手可能なDNAポリメラーゼ、逆転写酵素、および
熱抵抗性酵素を含む他の酵素が挙げられる。本明細書で
使用する術語“熱抵抗酵素”とは熱に安定で、熱抵抗性
であり、正しい様式でヌクレオチドの結合を触媒（容易
に）し、各々の核酸鎖に相補適なプライマー延長生成物
を形成するものである。一般的に、各々のプライマーの
３′末端から合成が開始され、鋳型鎖の５′の方向に沿
って合成が終結するまで進み、異った長さの分子を産生
する。しかしながら、例えば熱抵抗性酵素のごとく前記
と同一の方法を使いながら５′末端から合成を開始し他
の方向へ進む酵素もある。本発明の方法で使用できる好
適な熱抵抗酵素はテルムス アクアチクス Thermus ad
uaticus）から抽出、精製できるものである。この酵素
は約86,000−90,000ダルトンの分子量を持ち、ヨーロッ
パ特許公開第237,362号（またヨーロッパ特許公開第25
8,017号も参照されたい）に記載されている。テルムス
アクアチクス （Thermus aduaticus）株YT1は制限を
受けずに、アメリカン タイプ カルチャー コレクシ
ョン，（12301 パークロン ドライブ、ロックビル、
メリーランド,USA）からATCC 25,104号として入手可能
である。
マー延長生成物の合成に達成に機能するであろう任意の
化合物または系（酵素を含む）である。この目的に適し
た酵素には例えば大腸菌DNAポリメラーゼＩ、大腸菌DNA
ポリメラーゼＩのクレノー断片、T4DNAポリメラーゼ、
他の入手可能なDNAポリメラーゼ、逆転写酵素、および
熱抵抗性酵素を含む他の酵素が挙げられる。本明細書で
使用する術語“熱抵抗酵素”とは熱に安定で、熱抵抗性
であり、正しい様式でヌクレオチドの結合を触媒（容易
に）し、各々の核酸鎖に相補適なプライマー延長生成物
を形成するものである。一般的に、各々のプライマーの
３′末端から合成が開始され、鋳型鎖の５′の方向に沿
って合成が終結するまで進み、異った長さの分子を産生
する。しかしながら、例えば熱抵抗性酵素のごとく前記
と同一の方法を使いながら５′末端から合成を開始し他
の方向へ進む酵素もある。本発明の方法で使用できる好
適な熱抵抗酵素はテルムス アクアチクス Thermus ad
uaticus）から抽出、精製できるものである。この酵素
は約86,000−90,000ダルトンの分子量を持ち、ヨーロッ
パ特許公開第237,362号（またヨーロッパ特許公開第25
8,017号も参照されたい）に記載されている。テルムス
アクアチクス （Thermus aduaticus）株YT1は制限を
受けずに、アメリカン タイプ カルチャー コレクシ
ョン，（12301 パークロン ドライブ、ロックビル、
メリーランド,USA）からATCC 25,104号として入手可能
である。
本明細書で使用される表現“診断部分”とはその末端
ヌクレオチドとして潜在的な変異ヌクレオチドを含み、
その存在又は不在が検出されるべき標的塩基配列（後で
定義）の部分を意味する。一般的に、前に記載したごと
く各々のプライマーの３′末端からプライマー延長生成
物の合成が一般的に開始されるであろうので、潜在的変
異ヌクレオチドは診断部分の５′末端にあるであろう。
しかしながら、診断プライマーの５′末端で合成を開始
し、鋳型鎖の３′方向へ合成が終結するまで進行する重
合化のための試薬を使用すると“診断部分”はその３′
末端に潜在的変異ヌクレオチドを含むことになるであろ
う。以下に示すこの点を考慮し診断プライマーはまた適
切に計画されるであろう。
ヌクレオチドとして潜在的な変異ヌクレオチドを含み、
その存在又は不在が検出されるべき標的塩基配列（後で
定義）の部分を意味する。一般的に、前に記載したごと
く各々のプライマーの３′末端からプライマー延長生成
物の合成が一般的に開始されるであろうので、潜在的変
異ヌクレオチドは診断部分の５′末端にあるであろう。
しかしながら、診断プライマーの５′末端で合成を開始
し、鋳型鎖の３′方向へ合成が終結するまで進行する重
合化のための試薬を使用すると“診断部分”はその３′
末端に潜在的変異ヌクレオチドを含むことになるであろ
う。以下に示すこの点を考慮し診断プライマーはまた適
切に計画されるであろう。
本明細書で使用する表現“標的塩基配列”とは少くと
も１つの診断部分（前に定義した）を含むヌクレオチド
配列を意味する。例えばβ−サラセミアの一回の試験で
は標的配列は60まで含み（例えば50診断部分）、各々の
診断部分は１つの潜在的変異ヌクレオチドを含んでい
る。
も１つの診断部分（前に定義した）を含むヌクレオチド
配列を意味する。例えばβ−サラセミアの一回の試験で
は標的配列は60まで含み（例えば50診断部分）、各々の
診断部分は１つの潜在的変異ヌクレオチドを含んでい
る。
本明細書で使用される術語“オリゴヌクレオチド”は
２つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたは
リボヌクレオチドを含む（好適なのは３つ以上）分子と
して定義される。その厳密な大きさは、反応温度、塩濃
度、ホルムアミドの存在および鎌型赤血球HbC症のごと
き他の類似の突然変異体の存在などの多くの因子に依存
し、それは順次にオリゴヌクレオチドの最終的機能また
は使用に依存している。実際、オリゴヌクレオチドの厳
密な配列はまた後で記載するごとく多数の因子に依存し
ている。オリゴヌクレオチドは合成的またはクローニン
グにより誘導される。
２つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたは
リボヌクレオチドを含む（好適なのは３つ以上）分子と
して定義される。その厳密な大きさは、反応温度、塩濃
度、ホルムアミドの存在および鎌型赤血球HbC症のごと
き他の類似の突然変異体の存在などの多くの因子に依存
し、それは順次にオリゴヌクレオチドの最終的機能また
は使用に依存している。実際、オリゴヌクレオチドの厳
密な配列はまた後で記載するごとく多数の因子に依存し
ている。オリゴヌクレオチドは合成的またはクローニン
グにより誘導される。
本明細書で使用される術語“プライマー”はオリゴヌ
クレオチドを称し、制限消化後精製された自然に存在す
るものでも合成的に産生されたものでもよく、核酸鎖に
相補的なプライマー延長生成物の合成が誘導される条件
下に置かれると、即ち適切なヌクレオシド三リン酸、お
よびDNAポリメラーゼのごとき重合化剤の存在下、適切
な緩衝液中（“緩衝液”はpH、イオン強度、コファクタ
ーを含む）、適切な温度で合成の開始点として作用でき
るものである。
クレオチドを称し、制限消化後精製された自然に存在す
るものでも合成的に産生されたものでもよく、核酸鎖に
相補的なプライマー延長生成物の合成が誘導される条件
下に置かれると、即ち適切なヌクレオシド三リン酸、お
よびDNAポリメラーゼのごとき重合化剤の存在下、適切
な緩衝液中（“緩衝液”はpH、イオン強度、コファクタ
ーを含む）、適切な温度で合成の開始点として作用でき
るものである。
プライマーは増幅の際最高の効率をあげるように好適
には単一鎖であるが、二重鎖でもよい。もし二重鎖なら
ば、プライマーは延長生成物の調製に使用する前に処理
してその鎖を分離する。好適には、プライマーはオリゴ
デオキシリボヌクレオチドである。プライマーは重合剤
の存在下、延長生成物の合成の発火点となるため十分長
くなければならない。プライマーの厳密な長さは温度お
よびプライマー源および使用する方法などの多くの因子
に依存するであろう。例えば、標的配列の複雑さに依存
するが、典型的には診断および増幅プライマーは12−35
ヌクレオチド（例えば15−35ヌクレオチド）を含むが、
それ以上またはそれ以下のヌクレオチドを含む場合もあ
るかもしれない。短いプライマーは一般的に低い温度を
必要とし鋳型と十分安定なハイブリッド複合体を形成す
る。
には単一鎖であるが、二重鎖でもよい。もし二重鎖なら
ば、プライマーは延長生成物の調製に使用する前に処理
してその鎖を分離する。好適には、プライマーはオリゴ
デオキシリボヌクレオチドである。プライマーは重合剤
の存在下、延長生成物の合成の発火点となるため十分長
くなければならない。プライマーの厳密な長さは温度お
よびプライマー源および使用する方法などの多くの因子
に依存するであろう。例えば、標的配列の複雑さに依存
するが、典型的には診断および増幅プライマーは12−35
ヌクレオチド（例えば15−35ヌクレオチド）を含むが、
それ以上またはそれ以下のヌクレオチドを含む場合もあ
るかもしれない。短いプライマーは一般的に低い温度を
必要とし鋳型と十分安定なハイブリッド複合体を形成す
る。
本明細書で使用される術語“相補的”とはヌクレオチ
ドに関連し、他の特定のヌクレオチドと塩基対をつくる
ヌクレオチドを意味する。それ故アデノシン三リン酸は
ウリジン三リン酸またはチミン三リン酸と相補的であ
り、グアノシン三リン酸はシチジン三リン酸と相補的で
ある。チミジン三リン酸およびグアノシン三リン酸はあ
る種の条件下塩基対ではあるが、本明細書の目的のため
には相補的を見なされない事を理解されたい。またシト
シン三リン酸およびアデノシン三リン酸もある種の条件
下塩基対であるが本明細書の目的のためには相補的と見
なされない事も理解されるであろう。同様の事がシトシ
ン三リン酸およびウラシル三リン酸にも応用される。
ドに関連し、他の特定のヌクレオチドと塩基対をつくる
ヌクレオチドを意味する。それ故アデノシン三リン酸は
ウリジン三リン酸またはチミン三リン酸と相補的であ
り、グアノシン三リン酸はシチジン三リン酸と相補的で
ある。チミジン三リン酸およびグアノシン三リン酸はあ
る種の条件下塩基対ではあるが、本明細書の目的のため
には相補的を見なされない事を理解されたい。またシト
シン三リン酸およびアデノシン三リン酸もある種の条件
下塩基対であるが本明細書の目的のためには相補的と見
なされない事も理解されるであろう。同様の事がシトシ
ン三リン酸およびウラシル三リン酸にも応用される。
本明細書でのプライマーは増幅されるべき各々の特定
の配列に異った鎖に“実質的に”に相補的になるように
選択されている。この事はプライマーはその別個の鎖に
ハイブリダイズするため十分に相補的でなければならな
い事を意味している。それ故、プライマー配列は鋳型の
厳密な配列を反映する必要はない。例えば診断プライマ
ーが３′末端ヌクレオチドが疑われる変異ヌクレオチド
または対応する正常ヌクレオチドと相補的なヌクレオチ
ド配列を含む場合、プライマーの５′−末端に非相補的
ヌクレオチドフラグメントが結合してもよく、ただし、
プライマー配列の残りの部分は標的塩基配列の診断部分
と相補的である。しかしながら、普通にはプライマーは
前に記載したごとく前もって決められたプライマー末端
に存在してもよい非相補的ヌクレオチド以外は厳密な相
補性を持っている。
の配列に異った鎖に“実質的に”に相補的になるように
選択されている。この事はプライマーはその別個の鎖に
ハイブリダイズするため十分に相補的でなければならな
い事を意味している。それ故、プライマー配列は鋳型の
厳密な配列を反映する必要はない。例えば診断プライマ
ーが３′末端ヌクレオチドが疑われる変異ヌクレオチド
または対応する正常ヌクレオチドと相補的なヌクレオチ
ド配列を含む場合、プライマーの５′−末端に非相補的
ヌクレオチドフラグメントが結合してもよく、ただし、
プライマー配列の残りの部分は標的塩基配列の診断部分
と相補的である。しかしながら、普通にはプライマーは
前に記載したごとく前もって決められたプライマー末端
に存在してもよい非相補的ヌクレオチド以外は厳密な相
補性を持っている。
しかしながら、ある環境下では非相補的３′−末端残
基存在下においても診断プライマー延長生成物の合成が
誘導されるのを理解されたい。この人為的結果は非常に
低い温度を使用したとき（この場合温度を上げられる）
インキュベーション／アニーリングの時間が非常に長す
ぎた場合（この場合時間を短くできる）、非常に高い塩
濃度を使用したとき（この場合塩濃度を減少できる）、
非常に高い酵素濃度の使用、非常に高いヌクレオシド三
リン酸濃度の使用、誤ったpHまたは正しくない長さのオ
リゴヌクレオチドプライマーの使用などにより引き起こ
される。すれべのこれらの因子はヨーロッパ特許公開第
237,362に議論されている。人為的生成物の主たる原因
は多分反応温度を非常に低く落ちたままにしたためであ
り、このため厳重さが低下している（例えば反応混合物
の熱循環装置からの除去により、短いけれど例えば重合
化のための試薬を加えるため（例Taqポリメラーゼ）、
特に最初の反応サイクルにおいて）。前記のことに加
え、Ｇ（グアノシン）、おびＣ（シチジン）残基が特に
豊富な診断プライマーの使用によってもそのような人為
的結果が生じる事が明らかになった。この点でもし全体
としてG/Cが豊富であるかまたは特に関連する通常３′
末端でG/Cが豊富な場合診断プライマーの使用が困難と
なる。さらに診断プライマーの通常関連する３′末端領
域での塩基対生成の正確な性質によりその使用において
人為的結果が生じる。それ故診断プライマーの関連する
通常３′末端領域の塩基対生成におけるAs（アデノシ
ン）の存在は特に改良される傾向にあるが、一方Gs（グ
アノシン）の存在はまだである。さらに、診断プライマ
ーの関連する通常３′末端でのミスマッチの正確な性質
が人為的結果が得られるかどうかの重要な因子であろ
う。例えばAAまたはCTミスマッチは通常ハイブリダイゼ
ーションに影響しないが、GTまたはATミスマッチはハイ
ブリダイゼーションにかなりの程度影響し、人為的生成
物を生成する結果となる。ハイブリダイゼーション間の
結合性をさらに減少せしめプライマーを不安定化させる
ため診断プライマー内へわざと１つまたはそれ以上のさ
らにミスマッチせしめた残基を、またはもし望むなら欠
失または挿入を導入する事により人為的結果を避ける事
ができるであろう。
基存在下においても診断プライマー延長生成物の合成が
誘導されるのを理解されたい。この人為的結果は非常に
低い温度を使用したとき（この場合温度を上げられる）
インキュベーション／アニーリングの時間が非常に長す
ぎた場合（この場合時間を短くできる）、非常に高い塩
濃度を使用したとき（この場合塩濃度を減少できる）、
非常に高い酵素濃度の使用、非常に高いヌクレオシド三
リン酸濃度の使用、誤ったpHまたは正しくない長さのオ
リゴヌクレオチドプライマーの使用などにより引き起こ
される。すれべのこれらの因子はヨーロッパ特許公開第
237,362に議論されている。人為的生成物の主たる原因
は多分反応温度を非常に低く落ちたままにしたためであ
り、このため厳重さが低下している（例えば反応混合物
の熱循環装置からの除去により、短いけれど例えば重合
化のための試薬を加えるため（例Taqポリメラーゼ）、
特に最初の反応サイクルにおいて）。前記のことに加
え、Ｇ（グアノシン）、おびＣ（シチジン）残基が特に
豊富な診断プライマーの使用によってもそのような人為
的結果が生じる事が明らかになった。この点でもし全体
としてG/Cが豊富であるかまたは特に関連する通常３′
末端でG/Cが豊富な場合診断プライマーの使用が困難と
なる。さらに診断プライマーの通常関連する３′末端領
域での塩基対生成の正確な性質によりその使用において
人為的結果が生じる。それ故診断プライマーの関連する
通常３′末端領域の塩基対生成におけるAs（アデノシ
ン）の存在は特に改良される傾向にあるが、一方Gs（グ
アノシン）の存在はまだである。さらに、診断プライマ
ーの関連する通常３′末端でのミスマッチの正確な性質
が人為的結果が得られるかどうかの重要な因子であろ
う。例えばAAまたはCTミスマッチは通常ハイブリダイゼ
ーションに影響しないが、GTまたはATミスマッチはハイ
ブリダイゼーションにかなりの程度影響し、人為的生成
物を生成する結果となる。ハイブリダイゼーション間の
結合性をさらに減少せしめプライマーを不安定化させる
ため診断プライマー内へわざと１つまたはそれ以上のさ
らにミスマッチせしめた残基を、またはもし望むなら欠
失または挿入を導入する事により人為的結果を避ける事
ができるであろう。
更なるミスマッチを導入するには末端のミスマッチに
隣接するヌクレオチドの例えば10のうち１つまたはそれ
以上（例えば６）変えなければならない。一般的には末
端ミスマッチに加えたただ１つのミスマッチが例えば末
端ミスマッチから1,2または３塩基のところに位置して
必要とされる。それ故、例えば正常ホモ接合、ヘテロ接
合、α１アンチトリプシン遺伝子のＺ対立形質に関して
影響せしめたホモ接合の存在の決定に関連して、もし
３′末端ヌクレオチドから第３番目のヌクレオチドを変
化せしめて使用の際ミスマッチを発生せしめたら良好な
結果を得る事が観察された。それ故例えば診断プライマ
ーの３′末端から３番目のヌクレオチドとしてＡの代わ
りにＣを存在せしめると正常ホモ接合、ヘテロ接合およ
びＺ対立形質に関して影響せしめたヘテロ接合を容易に
区別する事も可能になった。診断プライマーの最良のデ
ザインは前記の指標に基ずく端的な実験から決定される
であろう、そのような実験は熟練した分子生物学者の能
力による。
隣接するヌクレオチドの例えば10のうち１つまたはそれ
以上（例えば６）変えなければならない。一般的には末
端ミスマッチに加えたただ１つのミスマッチが例えば末
端ミスマッチから1,2または３塩基のところに位置して
必要とされる。それ故、例えば正常ホモ接合、ヘテロ接
合、α１アンチトリプシン遺伝子のＺ対立形質に関して
影響せしめたホモ接合の存在の決定に関連して、もし
３′末端ヌクレオチドから第３番目のヌクレオチドを変
化せしめて使用の際ミスマッチを発生せしめたら良好な
結果を得る事が観察された。それ故例えば診断プライマ
ーの３′末端から３番目のヌクレオチドとしてＡの代わ
りにＣを存在せしめると正常ホモ接合、ヘテロ接合およ
びＺ対立形質に関して影響せしめたヘテロ接合を容易に
区別する事も可能になった。診断プライマーの最良のデ
ザインは前記の指標に基ずく端的な実験から決定される
であろう、そのような実験は熟練した分子生物学者の能
力による。
本明細書で使用される術語“診断プライマー”とはヌ
クレオチド配列を持つプライマーを示し、その末端ヌク
レオチドは疑われる変異ヌクレオチドまたは対応する正
常ヌクレオチドと相補的となるように選択されており、
そのため、診断プライマーの末端ヌクレオチドが標的塩
基配列の対応する診断部分の適当な末端ヌクレオチドと
相補的な場合診断プライマーの延長生成物が合成される
が、しかし、診断プライマーの末端ヌクレオチドが標識
塩基配列の対応する診断部分の適当な末端ヌクレオチド
と相同でない場合はそのような延長生成物は合成されな
い。
クレオチド配列を持つプライマーを示し、その末端ヌク
レオチドは疑われる変異ヌクレオチドまたは対応する正
常ヌクレオチドと相補的となるように選択されており、
そのため、診断プライマーの末端ヌクレオチドが標的塩
基配列の対応する診断部分の適当な末端ヌクレオチドと
相補的な場合診断プライマーの延長生成物が合成される
が、しかし、診断プライマーの末端ヌクレオチドが標識
塩基配列の対応する診断部分の適当な末端ヌクレオチド
と相同でない場合はそのような延長生成物は合成されな
い。
本明細書で使用される術語“増幅プライマー”とは診
断プライマーがハイブリダイズできる核酸鎖に対し相補
的である核酸鎖にハイブリダイズできるプライマーを称
し、“増幅プライマー”はヌクレオチド配列を持ち診断
プライマー延長生成物へ、その相補体から分離された後
ハイブリダイズでき、そのため診断プライマー延長生成
物は増幅プライマー延長生成物の合成のための鋳型とし
て働き、それにより増幅を容易にする。
断プライマーがハイブリダイズできる核酸鎖に対し相補
的である核酸鎖にハイブリダイズできるプライマーを称
し、“増幅プライマー”はヌクレオチド配列を持ち診断
プライマー延長生成物へ、その相補体から分離された後
ハイブリダイズでき、そのため診断プライマー延長生成
物は増幅プライマー延長生成物の合成のための鋳型とし
て働き、それにより増幅を容易にする。
それ故、少くとも一部として、ヨーロッパ特許公開第
237,362号に記載されている方法のごとき増幅過程の改
良が本発明の請求の範囲に含まれ、改良においては、も
し存在すれば疑われる変異ヌクレオチドを含む配列また
はもし存在すれば対応する正常ヌクレオチドを含む配列
を選択的に増幅する事を可能にし、そのため配列決定、
対立形質特異的オリゴヌクレオチドおよび制限消化など
を避け検出を簡素化する。それ故与えられたヌクレオチ
ド変異（例えば点突然変異）のその存在または不在は
１）疑われるヌクレオチド変異に相補的な適当な末端ヌ
クレオチドを持つ診断プライマーをデザインすることに
より、増幅生成物の合成が疑われるヌクレオチド生成物
の存在の指標であろうし、および増幅生成物の不在が疑
われるヌクレオチド変異の不在の指標であろう；または
２）対応する正常ヌクレオチドに相補的な適当な末端ヌ
クレオチドを持つ診断プライマーをデザインする事によ
り、増幅物の合成が疑われるヌクレオチド変異の不在の
指標であろうし、増幅物の不在は疑われるヌクレオチド
変異の存在の指標となるであろう；により検出される。
この点において本明細書で言及した“適当な末端ヌクレ
オチド”とは使用によりもし可能ならば合成を開始する
プライマーの末端ヌクレオチドを意味する。このため一
般的に重合化のための試薬はプライマーの３′末端で合
成を開始するので、適当な末端ヌクレオチドは一般的に
はヌクレオチドの３′末端に存在する。
237,362号に記載されている方法のごとき増幅過程の改
良が本発明の請求の範囲に含まれ、改良においては、も
し存在すれば疑われる変異ヌクレオチドを含む配列また
はもし存在すれば対応する正常ヌクレオチドを含む配列
を選択的に増幅する事を可能にし、そのため配列決定、
対立形質特異的オリゴヌクレオチドおよび制限消化など
を避け検出を簡素化する。それ故与えられたヌクレオチ
ド変異（例えば点突然変異）のその存在または不在は
１）疑われるヌクレオチド変異に相補的な適当な末端ヌ
クレオチドを持つ診断プライマーをデザインすることに
より、増幅生成物の合成が疑われるヌクレオチド生成物
の存在の指標であろうし、および増幅生成物の不在が疑
われるヌクレオチド変異の不在の指標であろう；または
２）対応する正常ヌクレオチドに相補的な適当な末端ヌ
クレオチドを持つ診断プライマーをデザインする事によ
り、増幅物の合成が疑われるヌクレオチド変異の不在の
指標であろうし、増幅物の不在は疑われるヌクレオチド
変異の存在の指標となるであろう；により検出される。
この点において本明細書で言及した“適当な末端ヌクレ
オチド”とは使用によりもし可能ならば合成を開始する
プライマーの末端ヌクレオチドを意味する。このため一
般的に重合化のための試薬はプライマーの３′末端で合
成を開始するので、適当な末端ヌクレオチドは一般的に
はヌクレオチドの３′末端に存在する。
例えば与えられた点突然変異の存在または不在の確認
は、上に示した両方の変法（１）および変法（２）を採
用することにより得られるであろう。２つの方法の組み
合わせにより優性遺伝条件の分析に、および劣性遺伝条
件の担体の検出に価値があろうヘテロ接合の検出のため
の方法も提供する。
は、上に示した両方の変法（１）および変法（２）を採
用することにより得られるであろう。２つの方法の組み
合わせにより優性遺伝条件の分析に、および劣性遺伝条
件の担体の検出に価値があろうヘテロ接合の検出のため
の方法も提供する。
好適な実施態様において本発明は同一試料中の１つ以
上の疑われる変異ヌクレオチドの存在または不在の検出
も請求の範囲に含む。診断プライマーの前もって決定さ
れなヌクレオチド配列に依存して選択的に配列を増幅す
る本発明の能力は、多数の増幅生成物の区別を簡単に、
正確におよび取り扱い者の最小の技術で可能にし、その
ため多くのヌクレオチド変異のための単一試料のスクリ
ーニングのための力強い技術を提供する事が可能になっ
た。本発明はそれ故、種々の疾患につながる遺伝性障
害、素因および体細胞突然変異のごとき遺伝条件の総合
テストのためのDNAまたはRNAの単一試料のスクリーニン
グに特に関係している。そのようなDNAまたはRNAは例え
ばManiatisらにより〔モレキュラー クローニング（19
82）,280−281〕記載されているごとき種々の技術を用
いて、血液または絨毛または羊膜細胞から抽出される。
さらに、遺伝的条件の分子論的基礎がより知られるよう
になれば、これらの更なる条件は簡単に本発明のスクリ
ーニング技術に含ませることができる。
上の疑われる変異ヌクレオチドの存在または不在の検出
も請求の範囲に含む。診断プライマーの前もって決定さ
れなヌクレオチド配列に依存して選択的に配列を増幅す
る本発明の能力は、多数の増幅生成物の区別を簡単に、
正確におよび取り扱い者の最小の技術で可能にし、その
ため多くのヌクレオチド変異のための単一試料のスクリ
ーニングのための力強い技術を提供する事が可能になっ
た。本発明はそれ故、種々の疾患につながる遺伝性障
害、素因および体細胞突然変異のごとき遺伝条件の総合
テストのためのDNAまたはRNAの単一試料のスクリーニン
グに特に関係している。そのようなDNAまたはRNAは例え
ばManiatisらにより〔モレキュラー クローニング（19
82）,280−281〕記載されているごとき種々の技術を用
いて、血液または絨毛または羊膜細胞から抽出される。
さらに、遺伝的条件の分子論的基礎がより知られるよう
になれば、これらの更なる条件は簡単に本発明のスクリ
ーニング技術に含ませることができる。
多増幅生成物は種々の他の技術でも区別することがで
きるであろう。それ故例えば各々の疑われる増幅生成物
に対するプローブが使用されるであろうし、各々のプロ
ーブは異った区別可能な信号また信号を産生できる残基
を運んでいる。
きるであろう。それ故例えば各々の疑われる増幅生成物
に対するプローブが使用されるであろうし、各々のプロ
ーブは異った区別可能な信号また信号を産生できる残基
を運んでいる。
そのような信号および信号を産生できる残基について
は我々のヨーロッパ特許公開第246,864に詳細に議論し
てあるが、多くの選択された微量元素で形成したマイク
ロビーズがプローブに結合してある、Wang C.G.らの
（ワールド バイオテクノロジー レポート1986,第２
巻，第２部33−37ページ、診断学、健康管理会議議事録
1986年11月、サンフランシスコにて）固相増幅系も含ま
れる。特異的プローブの存在はΧ−線蛍光分析により検
出できる。このような技術は単一ヌクレオチドのごとき
わずかな配列の相違を区別するというより増幅生成物の
存在を検出することだけが必要であるので一般的に簡単
で端的に応用できるであろう。
は我々のヨーロッパ特許公開第246,864に詳細に議論し
てあるが、多くの選択された微量元素で形成したマイク
ロビーズがプローブに結合してある、Wang C.G.らの
（ワールド バイオテクノロジー レポート1986,第２
巻，第２部33−37ページ、診断学、健康管理会議議事録
1986年11月、サンフランシスコにて）固相増幅系も含ま
れる。特異的プローブの存在はΧ−線蛍光分析により検
出できる。このような技術は単一ヌクレオチドのごとき
わずかな配列の相違を区別するというより増幅生成物の
存在を検出することだけが必要であるので一般的に簡単
で端的に応用できるであろう。
増幅生成物を区別するより単純で良好な方法は、本発
明の過程の間生成する各々の増幅された生成物の長さが
異なるように増幅プライマーのヌクレオチド配列を選択
する事である。この点においては増幅生成物中に存在す
る塩基対の数は診断および増幅プライマーの離れた距離
により決められる。それ故各々の潜在的変異ヌクレオチ
ドが異なった長さの潜在的増幅生成物を伴うように増幅
プライマーをデザインできるであろう。
明の過程の間生成する各々の増幅された生成物の長さが
異なるように増幅プライマーのヌクレオチド配列を選択
する事である。この点においては増幅生成物中に存在す
る塩基対の数は診断および増幅プライマーの離れた距離
により決められる。それ故各々の潜在的変異ヌクレオチ
ドが異なった長さの潜在的増幅生成物を伴うように増幅
プライマーをデザインできるであろう。
与えられた潜在的変異ヌクレオチドの存在または不在
は都合よく電気泳動技術によってもそれ故検出され、得
られた異なった増幅生成物はその分子量に従って分布
し、そのため例えばオートラジオグラフィーまたは蛍光
技術により同定される。異なった生成物の長さは単一の
ヌクレオチドのみの相違であるが、しかし好適なのは長
さが少なくとも３ヌクレオチド分異なるであろう。本発
明の方法は紫外線照射によりオレンジ色の蛍光を発して
視覚化できるエチジウム ブロミドのごとき挿入色素を
使用しても良好に達成される。それ故単一試料中の複数
の潜在的変異ヌクレオチドの存在または不在が迅速、正
確および容易に決定される。もし望むなら診断プライマ
ー（類）および／または増幅プライマー（類）は例えば
蛍光発色団を使用して印または標識をつけられよう。そ
れ故、試験の結果を電気泳動から、例えばレーザースキ
ャナーから読みとられるように例えば各々の異ったプラ
イマーまたは増幅プライマーが異った蛍光発色団を運ん
でいてもよく、それ故本発明の方法の自動化も可能にす
る。もしくは、増幅生成物の存在または不在は単に選択
的にヌクレオシド三リン酸を溶解できるが、しかし、ヌ
クレオチド配列（例えばDNA）を溶解できない溶媒を使
用して評価されるであろう。トリクロロ酢酸（TCA）は
そのような溶媒の例である。それ故例えば、増幅生成物
の存在または不在は増幅反応混合物のTCA沈殿により決
定されるであろう。適当なヌクレオシド三リン酸の取り
込みが指数関数的反応で起こった場合、診断プライマー
の延長が起こならい場合よりかなりの量のTCA不溶性物
質が存在することになる。不溶性物質の定量は既知の方
法で達成されるであろう。それ故例えばヌクレオシド三
リン酸を標識し（例えば放射性または蛍光マーカー）、
反応混合物を例えば遠心分離し、存在する液体はデカン
トして廃棄し、液体または不溶性生成物を例えば放射活
性計測または蛍光決定のごとき適切な検出技術にかけ
る。
は都合よく電気泳動技術によってもそれ故検出され、得
られた異なった増幅生成物はその分子量に従って分布
し、そのため例えばオートラジオグラフィーまたは蛍光
技術により同定される。異なった生成物の長さは単一の
ヌクレオチドのみの相違であるが、しかし好適なのは長
さが少なくとも３ヌクレオチド分異なるであろう。本発
明の方法は紫外線照射によりオレンジ色の蛍光を発して
視覚化できるエチジウム ブロミドのごとき挿入色素を
使用しても良好に達成される。それ故単一試料中の複数
の潜在的変異ヌクレオチドの存在または不在が迅速、正
確および容易に決定される。もし望むなら診断プライマ
ー（類）および／または増幅プライマー（類）は例えば
蛍光発色団を使用して印または標識をつけられよう。そ
れ故、試験の結果を電気泳動から、例えばレーザースキ
ャナーから読みとられるように例えば各々の異ったプラ
イマーまたは増幅プライマーが異った蛍光発色団を運ん
でいてもよく、それ故本発明の方法の自動化も可能にす
る。もしくは、増幅生成物の存在または不在は単に選択
的にヌクレオシド三リン酸を溶解できるが、しかし、ヌ
クレオチド配列（例えばDNA）を溶解できない溶媒を使
用して評価されるであろう。トリクロロ酢酸（TCA）は
そのような溶媒の例である。それ故例えば、増幅生成物
の存在または不在は増幅反応混合物のTCA沈殿により決
定されるであろう。適当なヌクレオシド三リン酸の取り
込みが指数関数的反応で起こった場合、診断プライマー
の延長が起こならい場合よりかなりの量のTCA不溶性物
質が存在することになる。不溶性物質の定量は既知の方
法で達成されるであろう。それ故例えばヌクレオシド三
リン酸を標識し（例えば放射性または蛍光マーカー）、
反応混合物を例えば遠心分離し、存在する液体はデカン
トして廃棄し、液体または不溶性生成物を例えば放射活
性計測または蛍光決定のごとき適切な検出技術にかけ
る。
本発明の更なる特色に従えば、本発明の方法に使用す
るための約５から50bpのヌクレオチド配列が提供され、
前記配列の末端ヌクレオチドは既知の遺伝子障害に伴う
疑われる変異ヌクレオチドかまなは対応する正常ヌクレ
オチドと相補的であり、前記配列の残りは疑われる変異
ヌクレオチドに隣接する対応標的塩基配列かまたは対応
する正常ヌクレオチドと実質的に相補的であり、前記ヌ
クレオチド配列は本発明の方法で診断プライマーとして
使用された場合標的塩基配列中の対応するヌクレオチド
と前記診断プライマーの末端ヌクレオチドが相補的な診
断プライマーの延長生成物が合成され、前記診断プライ
マーの末端ヌクレオチドが標的塩基配列中の対応するヌ
クレオチドに対し相補的でない時は延長生成物は合成さ
れない。
るための約５から50bpのヌクレオチド配列が提供され、
前記配列の末端ヌクレオチドは既知の遺伝子障害に伴う
疑われる変異ヌクレオチドかまなは対応する正常ヌクレ
オチドと相補的であり、前記配列の残りは疑われる変異
ヌクレオチドに隣接する対応標的塩基配列かまたは対応
する正常ヌクレオチドと実質的に相補的であり、前記ヌ
クレオチド配列は本発明の方法で診断プライマーとして
使用された場合標的塩基配列中の対応するヌクレオチド
と前記診断プライマーの末端ヌクレオチドが相補的な診
断プライマーの延長生成物が合成され、前記診断プライ
マーの末端ヌクレオチドが標的塩基配列中の対応するヌ
クレオチドに対し相補的でない時は延長生成物は合成さ
れない。
都合のよいように疑われる変異ヌクレオチドかまたは
対応する正常ヌクレオチドに相補的な末端ヌクレオチド
はヌクレオチド配列の３′末端にある。好適には、疑わ
れる変異ヌクレオチドは対応する正常配列の点突然変異
で生じたものである。
対応する正常ヌクレオチドに相補的な末端ヌクレオチド
はヌクレオチド配列の３′末端にある。好適には、疑わ
れる変異ヌクレオチドは対応する正常配列の点突然変異
で生じたものである。
前記ヌクレオチド配列は例えば10から50bps（例えば1
0から36bps）である。
0から36bps）である。
本発明の４つの更なる特色に従うと、直ぐ上で定義し
たヌクレオチド配列を提供でき、ヌクレオチド配列の末
端ヌクレオチドは変異ヌクレオチドと相補的であり、対
応する正常ヌクレオチドが（ｉ）A,（ii）G,（iii）C,
（iv）ＴまたはＵに各々変化した結果得られたものであ
る。
たヌクレオチド配列を提供でき、ヌクレオチド配列の末
端ヌクレオチドは変異ヌクレオチドと相補的であり、対
応する正常ヌクレオチドが（ｉ）A,（ii）G,（iii）C,
（iv）ＴまたはＵに各々変化した結果得られたものであ
る。
本発明の他の特色に従うと、前に定義した２つのヌク
レオチド配列の組が提供され、１つの配列の末端ヌクレ
オチドは既知の遺伝子障害に伴う疑われる変異ヌクレオ
チドと相補的であり、化の配列の末端ヌクレオチドは対
応する正常ヌクレオチドと相補的である。
レオチド配列の組が提供され、１つの配列の末端ヌクレ
オチドは既知の遺伝子障害に伴う疑われる変異ヌクレオ
チドと相補的であり、化の配列の末端ヌクレオチドは対
応する正常ヌクレオチドと相補的である。
さらに本発明に他の特色に従うと前に定義した標識ま
たはマーカー成分を運ぶヌクレオチド配列を含むプロー
ブが提供される。
たはマーカー成分を運ぶヌクレオチド配列を含むプロー
ブが提供される。
例により以下の既知の遺伝子障害を詳述し、疾患に関
与する突然変異および各々の突然変異に関連する文献を
示してある。
与する突然変異および各々の突然変異に関連する文献を
示してある。
欠失の例は下記文献にみられる： Foerrest SM,Cross GC,Speer A,Gardner−Medwin D,B
urn J,およびDavies KE（1987）デュシェンヌおよびベ
ッカー筋ジストロフィーにおけるエクソンの選択的欠失
Nature 320,638−640。
urn J,およびDavies KE（1987）デュシェンヌおよびベ
ッカー筋ジストロフィーにおけるエクソンの選択的欠失
Nature 320,638−640。
koening M,Hoffman EP,Bertselson CJ.Monaco AP,Fee
ner CおよびKunkel LM（1987）デュシェンヌ筋ジストロ
フィー（DMD）cDNAの完全クローニングおよび正常およ
び感染個体のDMD遺伝子の予備的遺伝子構成、Cell 50,5
09−511。
ner CおよびKunkel LM（1987）デュシェンヌ筋ジストロ
フィー（DMD）cDNAの完全クローニングおよび正常およ
び感染個体のDMD遺伝子の予備的遺伝子構成、Cell 50,5
09−511。
Malhotra SB,Hart KA,Klamut HJ,Thomas NST,Bodrug
SE,Burghes AHM,Bobrow Horper PS,Thompson MW,Ray P
N,およびWorton RG（1988）デュシェンヌおよびベッカ
ー筋ジストロフィー患者におけるフレーム−シフト欠失
Science 242,755−759。
SE,Burghes AHM,Bobrow Horper PS,Thompson MW,Ray P
N,およびWorton RG（1988）デュシェンヌおよびベッカ
ー筋ジストロフィー患者におけるフレーム−シフト欠失
Science 242,755−759。
Read AP,Mounttord RC,Forrest SM,Kenwrick SJ,Davi
s KE,およびHarris R（1988）デュシェンヌおよびベッ
カー筋ジストロフィーにおけるエクソン欠失の型、Hum,
Genet 80,152−156。
s KE,およびHarris R（1988）デュシェンヌおよびベッ
カー筋ジストロフィーにおけるエクソン欠失の型、Hum,
Genet 80,152−156。
Chamberlain JS.Gibbs RA,Ranier JE.Nguyen PNおよ
びCaskey CT（1988）多DNA増幅によるDMD座位の欠失ス
クリーニング、Nuc.Ac Res.16;23,11141−11156。
びCaskey CT（1988）多DNA増幅によるDMD座位の欠失ス
クリーニング、Nuc.Ac Res.16;23,11141−11156。
Roberts RG,Cole CG,Hart KA,Bobrow MおよびBentley
DR（1989）デュシェンヌおよびベッカー筋ジストロフ
ィーの迅速担体および胎児期診断Nuc.Ac Res.17:2,81
1。
DR（1989）デュシェンヌおよびベッカー筋ジストロフ
ィーの迅速担体および胎児期診断Nuc.Ac Res.17:2,81
1。
しばしば非常に少量のゲノムDNAしか分析のため入手
可能でない。関連する正常または変異ヌクレオチド配列
に対する診断プライマーの特異性はハイブリダイゼーシ
ョン検定中ヌクレオチド配列のコピーの数を増加せしめ
る事により便利に評価できる事が知られている。この事
は例えば、正常配列が変異配列ヘアニールされたものか
らなる二重鎖“カセット”を構成する事により達成さ
れ、相接するする鎖の２つのヌクレオチドの間のミスマ
ッチは好適にはカセットの中央部に向かって存在してい
る。次にカセットのコピーが、プラスミド宿主への挿入
続いてのプラスミドの複製および所望の配列の単離によ
り都合よく得られるが、用いたすべての技術はこの分野
ではよく知られているものである。この技術は都合よく
図10に示してある。
可能でない。関連する正常または変異ヌクレオチド配列
に対する診断プライマーの特異性はハイブリダイゼーシ
ョン検定中ヌクレオチド配列のコピーの数を増加せしめ
る事により便利に評価できる事が知られている。この事
は例えば、正常配列が変異配列ヘアニールされたものか
らなる二重鎖“カセット”を構成する事により達成さ
れ、相接するする鎖の２つのヌクレオチドの間のミスマ
ッチは好適にはカセットの中央部に向かって存在してい
る。次にカセットのコピーが、プラスミド宿主への挿入
続いてのプラスミドの複製および所望の配列の単離によ
り都合よく得られるが、用いたすべての技術はこの分野
ではよく知られているものである。この技術は都合よく
図10に示してある。
本発明をより十分に理解してもらうため、以下に例に
より付随する図を参照しながら記載する。
より付随する図を参照しながら記載する。
図中：−図１（ａ）および１（ｂ）は本発明の第１の実
施態様を図示しており、図１（ｃ）は電気泳動的に示さ
れているそのような試験の典型的結果であり； 図２（ａ）および２（ｂ）は本発明の第２の実施態様
を図示しており； 図３は多増幅生成物を区別するための好適な方法を図
示しており； 図４（ａ）および４（ｂ）は本発明の第３の実施態様
を図示しており； 図５（ａ）および５（ｂ）は本発明の第４の実施態様
を図示しており； 図６（比例してはいない）はヒトα１抗トリプシン遺
伝子を示しており；および 図７は実施例１および２で得られたゲルを可視化した
結果を示している。
施態様を図示しており、図１（ｃ）は電気泳動的に示さ
れているそのような試験の典型的結果であり； 図２（ａ）および２（ｂ）は本発明の第２の実施態様
を図示しており； 図３は多増幅生成物を区別するための好適な方法を図
示しており； 図４（ａ）および４（ｂ）は本発明の第３の実施態様
を図示しており； 図５（ａ）および５（ｂ）は本発明の第４の実施態様
を図示しており； 図６（比例してはいない）はヒトα１抗トリプシン遺
伝子を示しており；および 図７は実施例１および２で得られたゲルを可視化した
結果を示している。
図８はゲルを可視化した結果を示しており、図中レー
ン１−４は実施例３の結果を、レーン５−８は実施例４
の結果の比率を表わしており、レーン９はサイズマーカ
ーを表わしている。
ン１−４は実施例３の結果を、レーン５−８は実施例４
の結果の比率を表わしており、レーン９はサイズマーカ
ーを表わしている。
図９は実施例４で得られたゲルの可視化の結果を示し
ている。
ている。
図10は所望のDNA二重体を増幅するカセットプラスミ
ド系の使用を図示している。
ド系の使用を図示している。
図11は本発明の第５図の実施態様（線状増幅）を図示
している。
している。
図12は実施例５で得られたゲルの可視化の結果を示し
ている。
ている。
図13は実施例６で得らてたゲルの可視化の結果を示し
ている。
ている。
図１は本発明の第１の実施態様の方法を図示してい
る。図１（ａ）は正常ヌクレオチド（Ｎ）を含む変性ゲ
ノムDNA鎖を示し、その中の特定の位置に（例えば遺伝
子障害の結果による）疑われる変異ヌクレオチドが存在
しているであろう。ハイブリゼイション条件下、適当な
ヌクレオシド三リン酸およびヌクレオシド三リン酸の重
合化のための試薬の存在下核酸鎖を正常ヌクレオチドに
対し相補的な３′−末端ヌクレオチドを持つプローブ
（−Ｎ）を接触せしめると図１（ｂ）に示したごとく
３′−の方向ち診断プライマーの鎖延長が生じる。疑わ
れる変異ヌクレオチドに３′−末端ヌクレオチドが相補
的であるような診断プライマー（−Ｍ）を使用してもそ
のような鎖延長は起こらない。診断プライマーの任意の
鎖延長生成物が次に変性され増幅プライマー（Ａ）を変
性生成物にハイブリダイズすると更に鎖延長生成物が得
られる事になる。鎖延長生成物を次に変性しこの過程を
繰り返せば増幅が達成される。診断プライマーで増幅さ
れるゲノムDNAの領域は図１（ｂ）にDGで示してある。
この領域の診断生成物は図１（ｃ）のDGで示されるバン
ドに対応する。対照として図１（ａ）でＰで示されるPC
R（ポリメラーゼ連鎖反応）プライマー（Ｐ）を核酸鎖
の別の位置または他の核酸鎖（例えばヒトDNAの他の染
色体）に使用する。この別の部位は図１（ｂ）でPCRで
示されており、この部位からのPCR対照生成物は図１
（ｃ）でPCRで示されているバンドに対応する。PCRで示
されたバンドはDGで示されたバンドにより表わされた生
成物より大きいかまたは小さい生成物を表わす事が理解
されるであろう。図１（ｃ）は図１（ｂ）および１
（ｂ）で示された方法の結果をアガロースゲル電気泳動
上分割されたバンドの形で示しており、例えば点突然変
異により起こされた遺伝子障害に関して適切に−Ｍまた
は−Ｎ診断プライマーを使用して分析されている。試験
された検体が遺伝子障害の担体（Ｃ）である場合正常
（Ｎ）ヌクレオチド配列および変異ヌクレオチド配列
（Ｍ）の両方に関してバンドが観察されている。正常ホ
モ接合体（Ｎ）では正常ヌクレオチド配列に関してはバ
ンドの存在が示されたが、変異ヌクレオチドに関しては
バンドは存在しない〔（）で示されている〕および疾患
を起こす突然変異〔遺伝子障害の検体（Ｄ）〕のホモ接
合体では正常ヌクレオチド配列に関してはバンドを示さ
ず〔（）で示してある〕、変異ヌクレオチド配列に関し
てはバンドが存在している。
る。図１（ａ）は正常ヌクレオチド（Ｎ）を含む変性ゲ
ノムDNA鎖を示し、その中の特定の位置に（例えば遺伝
子障害の結果による）疑われる変異ヌクレオチドが存在
しているであろう。ハイブリゼイション条件下、適当な
ヌクレオシド三リン酸およびヌクレオシド三リン酸の重
合化のための試薬の存在下核酸鎖を正常ヌクレオチドに
対し相補的な３′−末端ヌクレオチドを持つプローブ
（−Ｎ）を接触せしめると図１（ｂ）に示したごとく
３′−の方向ち診断プライマーの鎖延長が生じる。疑わ
れる変異ヌクレオチドに３′−末端ヌクレオチドが相補
的であるような診断プライマー（−Ｍ）を使用してもそ
のような鎖延長は起こらない。診断プライマーの任意の
鎖延長生成物が次に変性され増幅プライマー（Ａ）を変
性生成物にハイブリダイズすると更に鎖延長生成物が得
られる事になる。鎖延長生成物を次に変性しこの過程を
繰り返せば増幅が達成される。診断プライマーで増幅さ
れるゲノムDNAの領域は図１（ｂ）にDGで示してある。
この領域の診断生成物は図１（ｃ）のDGで示されるバン
ドに対応する。対照として図１（ａ）でＰで示されるPC
R（ポリメラーゼ連鎖反応）プライマー（Ｐ）を核酸鎖
の別の位置または他の核酸鎖（例えばヒトDNAの他の染
色体）に使用する。この別の部位は図１（ｂ）でPCRで
示されており、この部位からのPCR対照生成物は図１
（ｃ）でPCRで示されているバンドに対応する。PCRで示
されたバンドはDGで示されたバンドにより表わされた生
成物より大きいかまたは小さい生成物を表わす事が理解
されるであろう。図１（ｃ）は図１（ｂ）および１
（ｂ）で示された方法の結果をアガロースゲル電気泳動
上分割されたバンドの形で示しており、例えば点突然変
異により起こされた遺伝子障害に関して適切に−Ｍまた
は−Ｎ診断プライマーを使用して分析されている。試験
された検体が遺伝子障害の担体（Ｃ）である場合正常
（Ｎ）ヌクレオチド配列および変異ヌクレオチド配列
（Ｍ）の両方に関してバンドが観察されている。正常ホ
モ接合体（Ｎ）では正常ヌクレオチド配列に関してはバ
ンドの存在が示されたが、変異ヌクレオチドに関しては
バンドは存在しない〔（）で示されている〕および疾患
を起こす突然変異〔遺伝子障害の検体（Ｄ）〕のホモ接
合体では正常ヌクレオチド配列に関してはバンドを示さ
ず〔（）で示してある〕、変異ヌクレオチド配列に関し
てはバンドが存在している。
図２は本発明の第２の実施態様を図示している。二重
鎖核酸の各々の鎖の為の診断プライマーが使用されてい
る。（ａ）では診断プライマーは３′−末端ヌクレオチ
ドが正常ヌクレオチドに対し相補的になるようにデザイ
ンされている。方法は図１に関連して記載されたごとく
進行せしめるが、もし関連するヌクレオチドが存在する
ならば２つの異なった診断プライマーで増幅を開始す
る。それ故この実施態様においては第２の診断プライマ
ーが図１の増幅プライマー（Ａ）と等価である。それ故
図２（ａ）における増幅はプライマー（−ＮおよびＮ
−）により開始されるであろうが、変異ヌクレオチド配
列に相補的な３′−末端ヌクレオチドを持つ診断プライ
マー（−ＭおよびＭ−）では開始されない。試料の核酸
鎖に変異配列が存在するので図２（ｂ）では逆の事が真
実である。図２に示した方法を達成した結果は図１
（ｃ）に示したものと同じ方法で表わされるであろう
が、その中の正常および変異（ＮおよびＭ）については
そのような配列の組に対応するであろう。図２におい
て、文字Ｐは対照として使用されたPCRプライマーを表
わす。
鎖核酸の各々の鎖の為の診断プライマーが使用されてい
る。（ａ）では診断プライマーは３′−末端ヌクレオチ
ドが正常ヌクレオチドに対し相補的になるようにデザイ
ンされている。方法は図１に関連して記載されたごとく
進行せしめるが、もし関連するヌクレオチドが存在する
ならば２つの異なった診断プライマーで増幅を開始す
る。それ故この実施態様においては第２の診断プライマ
ーが図１の増幅プライマー（Ａ）と等価である。それ故
図２（ａ）における増幅はプライマー（−ＮおよびＮ
−）により開始されるであろうが、変異ヌクレオチド配
列に相補的な３′−末端ヌクレオチドを持つ診断プライ
マー（−ＭおよびＭ−）では開始されない。試料の核酸
鎖に変異配列が存在するので図２（ｂ）では逆の事が真
実である。図２に示した方法を達成した結果は図１
（ｃ）に示したものと同じ方法で表わされるであろう
が、その中の正常および変異（ＮおよびＭ）については
そのような配列の組に対応するであろう。図２におい
て、文字Ｐは対照として使用されたPCRプライマーを表
わす。
図３は多増幅生成物が区別される１つの方法を示して
おり、それにより遺伝条件の総合テストのために試験さ
れるRNAまたはDNAが単一試料で可能である。試料のDNA
またはRNAの２つの鎖（変性）が示してあり、1,2および
３の番号を付けた別々の３つの座位を含んでいる。これ
らの座位から除かれた別の領域がPCR増幅に使用され対
照として働く。座位（１）に関しては20−mer診断プラ
イマー（５′−N3′）をさらに20mer（３′Ｎ−５）診
断プライマーと一緒に使用される。もし座位（１）で増
幅が起こったとしたら39−mer増幅生成物が得られるで
あろう。図中３′−末端ヌクレオチドが正常で試験試料
中のヌクレオチドと関連しているので増幅がおこるであ
ろう。同様に、試験試料中の関連ヌクレオチドが変異ヌ
クレオチドであり、使用された診断プライマーがまた
３′−末端変異ヌクレオチドを運んでいれば増幅が起こ
るであろう。しかしながら試料中の関連ヌクレオチドと
診断プライマーの３′−末端ヌクレオチドの間でミスマ
ッチが起こればそのような増幅はおこらないであろう。
座位（２）では診断プライマーはもし増幅が起これば49
−mer増幅生成物を得るようにデザインされており、座
位（３）では診断プライマーはもし増幅が起これば59−
mer増幅生成物を得るようにデザインしてある。前記の
ことからわかるように増幅生成物ハンドサイズは２つの
診断プライマーのサイズの合計から１を引いたものであ
り、適切にデザインされた個々の診断プライマーにより
単一反応容器中単一試料での多くの試験を実施するのが
可能であり、興味ある各々の座位を特徴付ける。診断プ
ライマーのサイズの合計のサイズが増加すると、増幅生
成物は例えばアガロースゲル上で分割する事が可能にな
る。もし診断プライマーが常法により標識化または印を
つけられると分解能の改良が可能になり例えばアクリル
アミドゲルで分割される。図３において文字Ｐは対照と
して使用されたPCRプライマーを示している。
おり、それにより遺伝条件の総合テストのために試験さ
れるRNAまたはDNAが単一試料で可能である。試料のDNA
またはRNAの２つの鎖（変性）が示してあり、1,2および
３の番号を付けた別々の３つの座位を含んでいる。これ
らの座位から除かれた別の領域がPCR増幅に使用され対
照として働く。座位（１）に関しては20−mer診断プラ
イマー（５′−N3′）をさらに20mer（３′Ｎ−５）診
断プライマーと一緒に使用される。もし座位（１）で増
幅が起こったとしたら39−mer増幅生成物が得られるで
あろう。図中３′−末端ヌクレオチドが正常で試験試料
中のヌクレオチドと関連しているので増幅がおこるであ
ろう。同様に、試験試料中の関連ヌクレオチドが変異ヌ
クレオチドであり、使用された診断プライマーがまた
３′−末端変異ヌクレオチドを運んでいれば増幅が起こ
るであろう。しかしながら試料中の関連ヌクレオチドと
診断プライマーの３′−末端ヌクレオチドの間でミスマ
ッチが起こればそのような増幅はおこらないであろう。
座位（２）では診断プライマーはもし増幅が起これば49
−mer増幅生成物を得るようにデザインされており、座
位（３）では診断プライマーはもし増幅が起これば59−
mer増幅生成物を得るようにデザインしてある。前記の
ことからわかるように増幅生成物ハンドサイズは２つの
診断プライマーのサイズの合計から１を引いたものであ
り、適切にデザインされた個々の診断プライマーにより
単一反応容器中単一試料での多くの試験を実施するのが
可能であり、興味ある各々の座位を特徴付ける。診断プ
ライマーのサイズの合計のサイズが増加すると、増幅生
成物は例えばアガロースゲル上で分割する事が可能にな
る。もし診断プライマーが常法により標識化または印を
つけられると分解能の改良が可能になり例えばアクリル
アミドゲルで分割される。図３において文字Ｐは対照と
して使用されたPCRプライマーを示している。
図４は本発明の第３の実施態様を示しており、その中
では例えば通常のPCRプライマーを用いて正常ヌクレオ
チド（その中の特定の位置に疑われる変異ヌクレオチド
が存在するであろう）を含む核酸配列の通常の増幅が達
成されている。同様にもし正常ヌクレオチドの代わりに
疑われる変異ヌクレオチドが存在していても通常の増幅
が実施される。増幅生成物は本発明の第３の実施態様に
関連して前に記載したごとくして診断プライマーと接触
せしめる。増幅生成物が前に記載したごとく正常ヌクレ
オチドを含む核酸配列を含み、使用された診断プライマ
ーが３′−末端正常ヌクレオチドの場合診断プライマー
の延長生成物が形成されるであろう〔通常のPCR増幅に
より生成するヌクレオチド配列（以後PCR対照生成物と
称する）を鋳型として使用し〕（適当なヌクレオシド三
リン酸およびヌクレオチド三リン酸の重合化剤存在
下）。診断プライマー延長生成物の産生のための鋳型は
すでに増幅されているであろうので増幅プライマーは必
要でない。図４（ｂ）でDGで示される診断プライマー延
長生成物の存在または不在はPCR対照生成物〔４図
（ｂ）にPCRで示してある〕の存在と同様にして例えば
電気泳動技術により検出される。
では例えば通常のPCRプライマーを用いて正常ヌクレオ
チド（その中の特定の位置に疑われる変異ヌクレオチド
が存在するであろう）を含む核酸配列の通常の増幅が達
成されている。同様にもし正常ヌクレオチドの代わりに
疑われる変異ヌクレオチドが存在していても通常の増幅
が実施される。増幅生成物は本発明の第３の実施態様に
関連して前に記載したごとくして診断プライマーと接触
せしめる。増幅生成物が前に記載したごとく正常ヌクレ
オチドを含む核酸配列を含み、使用された診断プライマ
ーが３′−末端正常ヌクレオチドの場合診断プライマー
の延長生成物が形成されるであろう〔通常のPCR増幅に
より生成するヌクレオチド配列（以後PCR対照生成物と
称する）を鋳型として使用し〕（適当なヌクレオシド三
リン酸およびヌクレオチド三リン酸の重合化剤存在
下）。診断プライマー延長生成物の産生のための鋳型は
すでに増幅されているであろうので増幅プライマーは必
要でない。図４（ｂ）でDGで示される診断プライマー延
長生成物の存在または不在はPCR対照生成物〔４図
（ｂ）にPCRで示してある〕の存在と同様にして例えば
電気泳動技術により検出される。
PCR対照生成物が変異ヌクレオチドを含み、使用され
た診断プライマーが変異ヌクレオチドと相補的な３′−
末端を持っている場合診断プライマー延長生成物がまた
形成されるであろう事を理解するであろう。
た診断プライマーが変異ヌクレオチドと相補的な３′−
末端を持っている場合診断プライマー延長生成物がまた
形成されるであろう事を理解するであろう。
得られた生成物バンドは例えば図４（ｂ）に示したご
とく可視化される。記述Ｎ−,M−,C−,N,D,DGおよびPCR
は図１（ｃ）に関連して定義したとおりである。しかし
ながら診断プライマー延長生成物バンドはPCR対照バン
ドよりも低い分子量を持っている（図4bに示されてい
る）。この場合PCRプライマーの１つが診断プライマー
延長生成物の増幅のための増幅プライマーとして働くの
で対照バンドは真の内部対照を表わす。PCR対照生成物
が変異ヌクレオチドを含み、診断プライマーが３′−末
端正常ヌクレオチドを含む場合逆に延長生成物は形成さ
れない。
とく可視化される。記述Ｎ−,M−,C−,N,D,DGおよびPCR
は図１（ｃ）に関連して定義したとおりである。しかし
ながら診断プライマー延長生成物バンドはPCR対照バン
ドよりも低い分子量を持っている（図4bに示されてい
る）。この場合PCRプライマーの１つが診断プライマー
延長生成物の増幅のための増幅プライマーとして働くの
で対照バンドは真の内部対照を表わす。PCR対照生成物
が変異ヌクレオチドを含み、診断プライマーが３′−末
端正常ヌクレオチドを含む場合逆に延長生成物は形成さ
れない。
もし望むなら本発明の第３の実施態様は試験の最初に
試験される試料をPCRプライマーのみでなく、診断プラ
イマーとも接触せしめて達成される。それ故PCR対照生
成物の望まれる程度の増幅が達成されるまで遅らせられ
た診断プライマーの使用は必要なくなる。実際、診断プ
ライマーは一緒にまたはPCRプライマーが用いられた後
の任意の時間に使用できる。それ故試験は例えば試験さ
れるべき試料を１つの容器に単に添加するだけで達成さ
れ、その容器にはPCRプライマー、診断プライマー、適
当なヌクレオシド三リン酸およびヌクレオシド三リン酸
の重合化剤が含まれている。得られた生成物および生成
物バンドは前に記載したごとく同様にして可視化でき図
４に示してある。
試験される試料をPCRプライマーのみでなく、診断プラ
イマーとも接触せしめて達成される。それ故PCR対照生
成物の望まれる程度の増幅が達成されるまで遅らせられ
た診断プライマーの使用は必要なくなる。実際、診断プ
ライマーは一緒にまたはPCRプライマーが用いられた後
の任意の時間に使用できる。それ故試験は例えば試験さ
れるべき試料を１つの容器に単に添加するだけで達成さ
れ、その容器にはPCRプライマー、診断プライマー、適
当なヌクレオシド三リン酸およびヌクレオシド三リン酸
の重合化剤が含まれている。得られた生成物および生成
物バンドは前に記載したごとく同様にして可視化でき図
４に示してある。
図５は本発明の第４の実施態様を表したものであり、
通常の増幅が図４に関連して記載したごとくして達成さ
れる。このようにして得られた増幅生成物はハイブリダ
イゼーション条件下、（ａ）前に定義したごとき２つの
別々の診断プライマーで各々は３′−末端正常ヌクレオ
チドを持つまたは（ｂ）前に定義したごとき２つの診断
プライマーで各々は３′−末端変異ヌクレオチドを持つ
（図5a参照）と接触せしめる。単一サイクルに続く延長
生成物の形成は試料核酸が正常または疑われる変異ヌク
レオチドを含むかどうかを示すであろうし、電気泳動技
術により図5bに示したものと同じバンドパターンが得ら
れる。しかしながら２つの診断プライマーが使用されて
いるが、１つの診断プライマーは他の診断プライマーの
ための増幅プライマーとして働くことを理解されたい。
それ故もし望むなら、得られる任意の延長生成物はそれ
自身増幅に供される。それ故多数の更なるサイクル後図
5c中の付加的なバンドで示されるもののごとき低分子量
生成物が最初のPCRプライマーオリゴヌクレオチドおよ
び添加した診断プライマーの相対的比に依存した比で形
成される。PCR増幅生成物は診断プライマー延長増幅生
成物から例えばゲノム上のPCRプライマーの結合部位か
ら離れている距離を増加または減少せしめる事により容
易に区別されるであろう。
通常の増幅が図４に関連して記載したごとくして達成さ
れる。このようにして得られた増幅生成物はハイブリダ
イゼーション条件下、（ａ）前に定義したごとき２つの
別々の診断プライマーで各々は３′−末端正常ヌクレオ
チドを持つまたは（ｂ）前に定義したごとき２つの診断
プライマーで各々は３′−末端変異ヌクレオチドを持つ
（図5a参照）と接触せしめる。単一サイクルに続く延長
生成物の形成は試料核酸が正常または疑われる変異ヌク
レオチドを含むかどうかを示すであろうし、電気泳動技
術により図5bに示したものと同じバンドパターンが得ら
れる。しかしながら２つの診断プライマーが使用されて
いるが、１つの診断プライマーは他の診断プライマーの
ための増幅プライマーとして働くことを理解されたい。
それ故もし望むなら、得られる任意の延長生成物はそれ
自身増幅に供される。それ故多数の更なるサイクル後図
5c中の付加的なバンドで示されるもののごとき低分子量
生成物が最初のPCRプライマーオリゴヌクレオチドおよ
び添加した診断プライマーの相対的比に依存した比で形
成される。PCR増幅生成物は診断プライマー延長増幅生
成物から例えばゲノム上のPCRプライマーの結合部位か
ら離れている距離を増加または減少せしめる事により容
易に区別されるであろう。
もし望むなら本発明の第４の実施態様を試験されるべ
き試料を試験の最初からPCRプライマーのみでなく診断
プライマーと接触せしめて達成することができる。それ
故PCR対照生成物の望まれる程度の増幅が達成されるま
で遅らせられた診断プライマーの使用は必要なくなる。
実際、診断プライマーは一緒にまたはPCRプライマーが
用いられた後の任意の時間に使用できる。それ故試験は
例えば試験されるべき試料を１つの容器に単に添加する
だけで達成され、その容器にPCRプライマー、診断プラ
イマー、適当なヌクレオシド三リン酸およびヌクレオシ
ド三リン酸の重合化剤が含まれている。もし試験がこの
方法で実施されると、上で参照したより分子量の低い診
断生成物が生成し、それにより図５に示した付加的なバ
ンドを与える事になる。
き試料を試験の最初からPCRプライマーのみでなく診断
プライマーと接触せしめて達成することができる。それ
故PCR対照生成物の望まれる程度の増幅が達成されるま
で遅らせられた診断プライマーの使用は必要なくなる。
実際、診断プライマーは一緒にまたはPCRプライマーが
用いられた後の任意の時間に使用できる。それ故試験は
例えば試験されるべき試料を１つの容器に単に添加する
だけで達成され、その容器にPCRプライマー、診断プラ
イマー、適当なヌクレオシド三リン酸およびヌクレオシ
ド三リン酸の重合化剤が含まれている。もし試験がこの
方法で実施されると、上で参照したより分子量の低い診
断生成物が生成し、それにより図５に示した付加的なバ
ンドを与える事になる。
図６（比例していない）はこの分野でよく知られてい
るヒトα１抗トリプシン遺伝子［Long G.L.らBiochemis
try Vol 23 p4828−4837（1984）］が描いてあり、なか
んずく別々にα１抗トリプシンタンパク質の潜在的Ｓお
よびＺ突然変異を運んでいるエクソンIIIおよびＶの相
対的位置を示している。特に図はα１抗トリプシン遺伝
子のエクソンIIIが描かれており、コドンGAAがGTAに突
然変異しグルタミン酸残基の代わりのアミノ酸264にお
けるバリン残基産生を生じているＳ変異体の位置を示し
ている。
るヒトα１抗トリプシン遺伝子［Long G.L.らBiochemis
try Vol 23 p4828−4837（1984）］が描いてあり、なか
んずく別々にα１抗トリプシンタンパク質の潜在的Ｓお
よびＺ突然変異を運んでいるエクソンIIIおよびＶの相
対的位置を示している。特に図はα１抗トリプシン遺伝
子のエクソンIIIが描かれており、コドンGAAがGTAに突
然変異しグルタミン酸残基の代わりのアミノ酸264にお
けるバリン残基産生を生じているＳ変異体の位置を示し
ている。
下記の配列を持つプライマーI: （α１抗トリプシン遺伝子の7440−7469位にハイブリダ
イズし、） および下記の配列を持つプライマーII: または下記の配列を持つプライマーII a（IIに基ずいた
LT3′ミスマッチ体）： （各々はα１抗トリプシン遺伝子の7770−7799位の為に
デザインされている） が都合よく使用できる。
イズし、） および下記の配列を持つプライマーII: または下記の配列を持つプライマーII a（IIに基ずいた
LT3′ミスマッチ体）： （各々はα１抗トリプシン遺伝子の7770−7799位の為に
デザインされている） が都合よく使用できる。
図はさらにα１抗トリプシン遺伝子のエクソンＶを描い
ており，コドンGAGがAAGに突然変異し、グルタミン酸残
基の代わりにアミノ酸の342位でリジン残基が産生され
ているＺ変異の位置が示してある。下記の配列を持つプ
ライマーIII: （α１抗トリプシン遺伝子の9890−9919位にハイブリダ
イズする） および下記の配列を持つプライマーIV: （α１抗トリプシン遺伝子の10081−10109位にハイブリ
ダイズする） が都合よく使用できる。塩基番号の詳細はBiochem 23 4
828−4837,1984に従った。
ており，コドンGAGがAAGに突然変異し、グルタミン酸残
基の代わりにアミノ酸の342位でリジン残基が産生され
ているＺ変異の位置が示してある。下記の配列を持つプ
ライマーIII: （α１抗トリプシン遺伝子の9890−9919位にハイブリダ
イズする） および下記の配列を持つプライマーIV: （α１抗トリプシン遺伝子の10081−10109位にハイブリ
ダイズする） が都合よく使用できる。塩基番号の詳細はBiochem 23 4
828−4837,1984に従った。
図７は実施例１および２で得られたゲルの可視化の結果
を示している。レーン１はエクソンＶを含むプラスミド
をAlu Iで切断したものを示し；レーン２はサイズマー
カーであり、バクテリオファージφΧ 174 DNAをHae II
Iで切断した；レーン３はエクソンIIIをプライマーＩお
よびIIによる前に定義したごき増幅およびエクソンＶの
プライマーIIIおよびIVによる前に定義したごとき増幅
であり同じ反応混合物から各々360bpおよび220bpの生成
物を得た。レーン４は前に定義したごとくプライマーＩ
およびII aを使用するとエクソンIIIの増幅はおきない
事を示しているが、プライマーIIIおよびIVではエクソ
ンＶの増幅が達成されている。レーン５は負の対照であ
りプライマーI,II,III,およびIVが増幅の促進に効果的
な条件下存在しているが、その中にゲノムDNAは存在し
ていない。図８はレーン１−３に実施例３の結果を、レ
ーン５−８には正常および突然変異診断プライマーを使
用した結果であり、実施例４に従った不安定化は影響し
ていない。およびレーン９はバイテリオファージφΧ 1
74のサイズマーカーを示している。レーン１は配列： のヌクレオチドを診断プライマー、前に定義したＩと称
されるオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとして使用
した結果を示している。使用されたヒトゲノムDNAはヒ
トα１抗トリプシン遺伝子の潜在的Ｓ突然変異点に存在
し正常ヌクレオチド（Ａ）を持つ正常ホモ接合体からの
ものである。期待される267bp増幅生成物が明らかに認
められる。レーン２は配列： のヌクレオチドを診断プライマーとしておよびＩと称さ
れるオリゴヌクレオチドを前に定義したごとく増幅プラ
イマーとして使用した結果を示している。使用されたヒ
トゲノムDNAはヒトα１抗トリプシン遺伝子の潜在的Ｓ
突然変異的に存在する正常ヌクレオチド（Ａ）を持つ正
常ホモ接合体からのものである。Ａ−Ａミスマッチの存
在のため267bp増幅生成物は形成されない。レーン３は
ヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子に基づいた対照バンド
を示し使用された配列は である。
を示している。レーン１はエクソンＶを含むプラスミド
をAlu Iで切断したものを示し；レーン２はサイズマー
カーであり、バクテリオファージφΧ 174 DNAをHae II
Iで切断した；レーン３はエクソンIIIをプライマーＩお
よびIIによる前に定義したごき増幅およびエクソンＶの
プライマーIIIおよびIVによる前に定義したごとき増幅
であり同じ反応混合物から各々360bpおよび220bpの生成
物を得た。レーン４は前に定義したごとくプライマーＩ
およびII aを使用するとエクソンIIIの増幅はおきない
事を示しているが、プライマーIIIおよびIVではエクソ
ンＶの増幅が達成されている。レーン５は負の対照であ
りプライマーI,II,III,およびIVが増幅の促進に効果的
な条件下存在しているが、その中にゲノムDNAは存在し
ていない。図８はレーン１−３に実施例３の結果を、レ
ーン５−８には正常および突然変異診断プライマーを使
用した結果であり、実施例４に従った不安定化は影響し
ていない。およびレーン９はバイテリオファージφΧ 1
74のサイズマーカーを示している。レーン１は配列： のヌクレオチドを診断プライマー、前に定義したＩと称
されるオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとして使用
した結果を示している。使用されたヒトゲノムDNAはヒ
トα１抗トリプシン遺伝子の潜在的Ｓ突然変異点に存在
し正常ヌクレオチド（Ａ）を持つ正常ホモ接合体からの
ものである。期待される267bp増幅生成物が明らかに認
められる。レーン２は配列： のヌクレオチドを診断プライマーとしておよびＩと称さ
れるオリゴヌクレオチドを前に定義したごとく増幅プラ
イマーとして使用した結果を示している。使用されたヒ
トゲノムDNAはヒトα１抗トリプシン遺伝子の潜在的Ｓ
突然変異的に存在する正常ヌクレオチド（Ａ）を持つ正
常ホモ接合体からのものである。Ａ−Ａミスマッチの存
在のため267bp増幅生成物は形成されない。レーン３は
ヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子に基づいた対照バンド
を示し使用された配列は である。
レーン４は空のまま残してある。
レーン５は配列： のヌクレオチドを実施例４の診断プライマーとして使用
した結果である。診断プライマーは潜在的Ｚ突然変異点
の正常ヌクレオチド（Ｃ）と塩基対形成が可能な３′末
端ヌクレオチド（Ｇ）を運んでいる。使用された試料DN
Aはヒトα１抗トリプシン遺伝子の潜在的Ｚ突然変異点
に存在する正常ヌクレオチド（Ｃ）を持つ正常ホモ接合
体からのものである。レーン６は配列： のヌクレオチドを実施例４において診断プライマーとし
て使用した結果を示している。診断プライマーはＺ突然
変異点の突然変異体ヌクレオチド（Ｔ）と塩基対形成で
きる３′末端ヌクレオチド（Ａ）を運んでいるが、しか
し他の点では試料DNAに対し完全に相補的である。使用
された試料DNAはヒトα１抗トリプシン遺伝子の潜在的
Ｚ突然変異点に存在する正常ヌクレオチド（Ｃ）を持つ
正常ホモ接合体からなるものである。レーン７は式VII
のヌクレオチド配列を実施例４において診断プライマー
として使用した結果である。使用された試料DNAはヒト
α１抗トリプシン遺伝子障害により影響を受けたホモ接
合体およびＺ突然変異点の突然変異体ヌクレオチド
（Ｔ）を持つものからのものである。レーン８は式VIII
のヌクレオチド配列を実施例４において診断プライマー
として使用した結果を示した。使用された試料DNAは、
ヒトα１抗トリプシン遺伝子障害により影響されたホモ
接合体およびＺ突然変異点の突然変異体ヌクレオチド
（Ｔ）を持つものからのものである。レーン５−８に示
した試験の各々で使用された増幅プライマーのヌクレオ
チド配列は前に定義した式IVのものである。150bp増幅
生成物の産生はＡ−Ｃミスマッチ（レーン６）の存在で
は十分に抑えられておらず、GTミスマッチの存在（レー
ン７）ではより抑えられていない。図９は実施例４で得
られたゲルの可視化の結果を示している。レーン１およ
び14はサイズマーカーバクテリオファージΧ 174 DNAの
Hae IIIによる切断を示し；レーン２は配列： のヌクレオチドを診断プライマーとして、ヒトα１抗ト
リプシン遺伝子の潜在的Ｚ突然変異点に存在する正常ヌ
クレオチド（Ｃ）を持つ試料DNA（試料DNA）は正常ホモ
接合体から）の存在下使用した結果を示している。診断
プライマーは３′末端から５番目のヌクレオチドに関し
て計画的な変更物を（配列ＩΧに下線−Ｃの代わりに
Ａ）運んでいるが３′−末端ヌクレオチド（Ｇ）は潜在
的Ｚ突然変異点に存在する正常ヌクレオチド（Ｃ）と塩
基対形成できる。レーン３は配列： のヌクレオチドを診断プライマーとして、潜在的Ｚ突然
変異点に存在する正常ヌクレオチド（Ｃ）を持つ試料DN
A存在下（試料DNAは正常ホモ接合体から）使用した結果
を示している。診断プライマーは３′末端から５番目の
ヌクレオチドに関して計画された変更物（配列Χ中に下
線−Ｃの代わりにＡ）を運んでいるが３′末端ヌクレオ
チド（Ａ）はもし存在するなら潜在的Ｚ突然変異点の突
然変異体ヌクレオチド（Ｔ）と塩基対形成ができ；レー
ン４はヌクレオチド配列ＩΧ（前に定義した）を診断プ
ライマーとして、Ｚ突然変異のためのヘテロ接合体から
の、およびそれ故ヒトα１抗トリプシン欠乏症遺伝子障
害を運ぶ試料DNAの存在下で使用した結果を示してい
る；レーン５はヌクレオチドΧ（前に定義した）を診断
プライマーとして、Ｚ突然変異のためのヘテロ接合体か
らのおよびそれ故ヒトα１抗トリプシン欠乏症遺伝子障
害を運ぶ試料DNAの存在下で使用した結果を示してい
る。レーン６はヌクレオチド配列ＩΧ（前に定義した）
を診断プライマーとして、ヒトα１抗トリプシン遺伝子
障害で影響されたホモ接合体からの試料DNA存在下使用
した結果を示している。レーン７はヌクレオチド配列Χ
（前に定義した）を診断プライマーとして、ヒトα１抗
トリプシン遺伝子障害で影響を受けたホモ接合体からの
試料DNAの存在下で使用した結果を示している。
した結果である。診断プライマーは潜在的Ｚ突然変異点
の正常ヌクレオチド（Ｃ）と塩基対形成が可能な３′末
端ヌクレオチド（Ｇ）を運んでいる。使用された試料DN
Aはヒトα１抗トリプシン遺伝子の潜在的Ｚ突然変異点
に存在する正常ヌクレオチド（Ｃ）を持つ正常ホモ接合
体からのものである。レーン６は配列： のヌクレオチドを実施例４において診断プライマーとし
て使用した結果を示している。診断プライマーはＺ突然
変異点の突然変異体ヌクレオチド（Ｔ）と塩基対形成で
きる３′末端ヌクレオチド（Ａ）を運んでいるが、しか
し他の点では試料DNAに対し完全に相補的である。使用
された試料DNAはヒトα１抗トリプシン遺伝子の潜在的
Ｚ突然変異点に存在する正常ヌクレオチド（Ｃ）を持つ
正常ホモ接合体からなるものである。レーン７は式VII
のヌクレオチド配列を実施例４において診断プライマー
として使用した結果である。使用された試料DNAはヒト
α１抗トリプシン遺伝子障害により影響を受けたホモ接
合体およびＺ突然変異点の突然変異体ヌクレオチド
（Ｔ）を持つものからのものである。レーン８は式VIII
のヌクレオチド配列を実施例４において診断プライマー
として使用した結果を示した。使用された試料DNAは、
ヒトα１抗トリプシン遺伝子障害により影響されたホモ
接合体およびＺ突然変異点の突然変異体ヌクレオチド
（Ｔ）を持つものからのものである。レーン５−８に示
した試験の各々で使用された増幅プライマーのヌクレオ
チド配列は前に定義した式IVのものである。150bp増幅
生成物の産生はＡ−Ｃミスマッチ（レーン６）の存在で
は十分に抑えられておらず、GTミスマッチの存在（レー
ン７）ではより抑えられていない。図９は実施例４で得
られたゲルの可視化の結果を示している。レーン１およ
び14はサイズマーカーバクテリオファージΧ 174 DNAの
Hae IIIによる切断を示し；レーン２は配列： のヌクレオチドを診断プライマーとして、ヒトα１抗ト
リプシン遺伝子の潜在的Ｚ突然変異点に存在する正常ヌ
クレオチド（Ｃ）を持つ試料DNA（試料DNA）は正常ホモ
接合体から）の存在下使用した結果を示している。診断
プライマーは３′末端から５番目のヌクレオチドに関し
て計画的な変更物を（配列ＩΧに下線−Ｃの代わりに
Ａ）運んでいるが３′−末端ヌクレオチド（Ｇ）は潜在
的Ｚ突然変異点に存在する正常ヌクレオチド（Ｃ）と塩
基対形成できる。レーン３は配列： のヌクレオチドを診断プライマーとして、潜在的Ｚ突然
変異点に存在する正常ヌクレオチド（Ｃ）を持つ試料DN
A存在下（試料DNAは正常ホモ接合体から）使用した結果
を示している。診断プライマーは３′末端から５番目の
ヌクレオチドに関して計画された変更物（配列Χ中に下
線−Ｃの代わりにＡ）を運んでいるが３′末端ヌクレオ
チド（Ａ）はもし存在するなら潜在的Ｚ突然変異点の突
然変異体ヌクレオチド（Ｔ）と塩基対形成ができ；レー
ン４はヌクレオチド配列ＩΧ（前に定義した）を診断プ
ライマーとして、Ｚ突然変異のためのヘテロ接合体から
の、およびそれ故ヒトα１抗トリプシン欠乏症遺伝子障
害を運ぶ試料DNAの存在下で使用した結果を示してい
る；レーン５はヌクレオチドΧ（前に定義した）を診断
プライマーとして、Ｚ突然変異のためのヘテロ接合体か
らのおよびそれ故ヒトα１抗トリプシン欠乏症遺伝子障
害を運ぶ試料DNAの存在下で使用した結果を示してい
る。レーン６はヌクレオチド配列ＩΧ（前に定義した）
を診断プライマーとして、ヒトα１抗トリプシン遺伝子
障害で影響されたホモ接合体からの試料DNA存在下使用
した結果を示している。レーン７はヌクレオチド配列Χ
（前に定義した）を診断プライマーとして、ヒトα１抗
トリプシン遺伝子障害で影響を受けたホモ接合体からの
試料DNAの存在下で使用した結果を示している。
レーン８は配列： のヌクレオチドを診断プライマーとしてヒトα１抗トリ
プシン遺伝子の潜在的Ｚ突然変異点に存在する正常ヌク
レオチド（Ｃ）を持つ試料DNA存在下で使用した結果を
示している（試料DNAは正常ホモ接合体から）。診断プ
ライマーは３′末端から３番目のヌクレオチドに関して
計画的な変更物（配列Χ Iに下線−Ａの代わりにＣ）を
運んでおり、３′末端（Ｇ）は潜在的Ｚ突然変異点に存
在する正常ヌクレオチド（Ｃ）と塩基対形成できる；レ
ーン９は配列： のヌクレオチドを診断プライマーとして、潜在的Ｚ突然
変異点に存在する正常ヌクレオチド（Ｃ）を持つ試料DN
Aの存在下で（試料DNAは正常ホモ接合体から）使用した
場合の結果を示している。診断プライマーは３′末端か
ら３番目のヌクレオチドに関して計画的な変異物（配列
Χ IIに下線−Ａの代わりにＣ）を運んでおり、３′末
端ヌクレオチド（Ａ）はもし存在するなら潜在的Ｚ突然
変異点の突然変異体ヌクレオチド（Ｔ）と塩基対形成で
きる； レーン10はヌクレオチド配列Χ I（前に定義した）を
診断プライマーとして、Ｚ突然変異のためのヘテロ接合
体から、およびそれ故ヒトα１抗トリプシン欠乏症遺伝
子障害を運ぶ試料DNAの存在下で使用した結果を示し
た；レーン11はヌクレオチド配列Χ II（前に定義し
た）を診断プライマーとして、Ｚ突然変異のためのヘテ
ロ接合体からのおよびそれ故、ヒトＩα抗トリプシン遺
伝子を運ぶ試料DNAの存在下で使用した結果を示した。
レーン12はヌクレオチド配列Χ I（前に定義した）を診
断プライマーとして、ヒトα１抗トリプシン欠乏症遺伝
子障害で影響せしめたホモ接合体からのDNA試料の存在
下で使用した結果を示している。レーン13はヌクレオチ
ド配列Χ II（前に定義した）を診断プライマーとし
て、ヒトα１抗トリプシン遺伝子障害により影響を及ぼ
したホモ接合体からの試料DNA存在下使用した結果を示
す。
プシン遺伝子の潜在的Ｚ突然変異点に存在する正常ヌク
レオチド（Ｃ）を持つ試料DNA存在下で使用した結果を
示している（試料DNAは正常ホモ接合体から）。診断プ
ライマーは３′末端から３番目のヌクレオチドに関して
計画的な変更物（配列Χ Iに下線−Ａの代わりにＣ）を
運んでおり、３′末端（Ｇ）は潜在的Ｚ突然変異点に存
在する正常ヌクレオチド（Ｃ）と塩基対形成できる；レ
ーン９は配列： のヌクレオチドを診断プライマーとして、潜在的Ｚ突然
変異点に存在する正常ヌクレオチド（Ｃ）を持つ試料DN
Aの存在下で（試料DNAは正常ホモ接合体から）使用した
場合の結果を示している。診断プライマーは３′末端か
ら３番目のヌクレオチドに関して計画的な変異物（配列
Χ IIに下線−Ａの代わりにＣ）を運んでおり、３′末
端ヌクレオチド（Ａ）はもし存在するなら潜在的Ｚ突然
変異点の突然変異体ヌクレオチド（Ｔ）と塩基対形成で
きる； レーン10はヌクレオチド配列Χ I（前に定義した）を
診断プライマーとして、Ｚ突然変異のためのヘテロ接合
体から、およびそれ故ヒトα１抗トリプシン欠乏症遺伝
子障害を運ぶ試料DNAの存在下で使用した結果を示し
た；レーン11はヌクレオチド配列Χ II（前に定義し
た）を診断プライマーとして、Ｚ突然変異のためのヘテ
ロ接合体からのおよびそれ故、ヒトＩα抗トリプシン遺
伝子を運ぶ試料DNAの存在下で使用した結果を示した。
レーン12はヌクレオチド配列Χ I（前に定義した）を診
断プライマーとして、ヒトα１抗トリプシン欠乏症遺伝
子障害で影響せしめたホモ接合体からのDNA試料の存在
下で使用した結果を示している。レーン13はヌクレオチ
ド配列Χ II（前に定義した）を診断プライマーとし
て、ヒトα１抗トリプシン遺伝子障害により影響を及ぼ
したホモ接合体からの試料DNA存在下使用した結果を示
す。
レーン２−13の各々の場合、式IVの配列を増幅プライ
マーとして使用し、式Χ III: および式Χ IV のヌクレオチド配列を対照として使用した。対照に対応
するバンドは図９においてＣの印がついており、ヒトア
ポリポタンパク質Ｂ遺伝子のエクソン26からの510bp増
幅生成物に対応する。図10はカセットプラスミド系の使
用を例示している。アムピシリン（Apr）およびテトラ
サイクリン（Tcr）抵抗性を与える領域を持ち、同様にE
coR I,BamH IおよびSa l I制限部位を持つプラスミドpA
T153をEcoR IおよびBamH Iで消化する。正常および変異
配列の両方が存在するためによるミスマッチしたヌクレ
オチド（中心部に）を持つDNA二重部を含む合成カセッ
トをT4DNAリガーゼを用いて示したごとく宿主プラスミ
ドに結合しせめる。プラスミドは次に複製され、示した
ごとくに選択される。本系は以下に更に詳しく例示され
る：合成DNAカセットを調製する、各々はEcoR IおよびB
amH I制御末端を持ち、中央部塩基対は変異ヌクレオチ
ドのためミスマッチした２つのアニール化65mersを含ん
でいる。これらのカセットを上に記載したごとくしてpA
T153プラスミド宿主に導入し、形質転換後、テトラサイ
クリン感受性クローンを単離しプラスミドを抽出する。
プラスミド抽出物は次に第２の形質転換に使用し、正常
または変異挿入物を持つクローンを提供する。クローン
が完全正常または突然変異体配列のどちらかを含むかを
確認するために、各々約２μｇで配列決定しNaOH変性
後、T4DNAポリメラーゼ（シークエナーゼ,US バイオケ
ミカルズ）および32P末端標識プライマーを使用する。
各々の型の少くとも一つの標準および一つの変異が観察
できていれば、各々の代表的クローンを大量に増殖せし
め、プラスミドを抽出し、CsClグラジェントを用いて精
製する。カセットをSal Iで消化し、フェノール／クロ
ロホルムで抽出し、沈殿後70％エタノールで洗浄する。
これでカセットはいつでも使用でき、例えばポリメラー
ゼ連鎖反応において種々のオリゴヌクレオチドの感度お
よび特異性を決定する。
マーとして使用し、式Χ III: および式Χ IV のヌクレオチド配列を対照として使用した。対照に対応
するバンドは図９においてＣの印がついており、ヒトア
ポリポタンパク質Ｂ遺伝子のエクソン26からの510bp増
幅生成物に対応する。図10はカセットプラスミド系の使
用を例示している。アムピシリン（Apr）およびテトラ
サイクリン（Tcr）抵抗性を与える領域を持ち、同様にE
coR I,BamH IおよびSa l I制限部位を持つプラスミドpA
T153をEcoR IおよびBamH Iで消化する。正常および変異
配列の両方が存在するためによるミスマッチしたヌクレ
オチド（中心部に）を持つDNA二重部を含む合成カセッ
トをT4DNAリガーゼを用いて示したごとく宿主プラスミ
ドに結合しせめる。プラスミドは次に複製され、示した
ごとくに選択される。本系は以下に更に詳しく例示され
る：合成DNAカセットを調製する、各々はEcoR IおよびB
amH I制御末端を持ち、中央部塩基対は変異ヌクレオチ
ドのためミスマッチした２つのアニール化65mersを含ん
でいる。これらのカセットを上に記載したごとくしてpA
T153プラスミド宿主に導入し、形質転換後、テトラサイ
クリン感受性クローンを単離しプラスミドを抽出する。
プラスミド抽出物は次に第２の形質転換に使用し、正常
または変異挿入物を持つクローンを提供する。クローン
が完全正常または突然変異体配列のどちらかを含むかを
確認するために、各々約２μｇで配列決定しNaOH変性
後、T4DNAポリメラーゼ（シークエナーゼ,US バイオケ
ミカルズ）および32P末端標識プライマーを使用する。
各々の型の少くとも一つの標準および一つの変異が観察
できていれば、各々の代表的クローンを大量に増殖せし
め、プラスミドを抽出し、CsClグラジェントを用いて精
製する。カセットをSal Iで消化し、フェノール／クロ
ロホルムで抽出し、沈殿後70％エタノールで洗浄する。
これでカセットはいつでも使用でき、例えばポリメラー
ゼ連鎖反応において種々のオリゴヌクレオチドの感度お
よび特異性を決定する。
図11は本発明の第５の実施態様（線状増幅）を例示し
ている。（ａ）においては正常ゲノムDNA配列が２つの
診断プライマーと共に示されており、プライマーの１つ
はその３′末端が正常ゲノムDNA配列に対し相補的であ
り、第２のプライマーはその３′末端に疑われる変異ヌ
クレオチドに相補的である。（ｂ）においては変異ゲノ
ムDNA配列が同一の２つの診断プライマーと一緒に示し
てある。両方のゲノムDNA配列が相補的ハイブリダイゼ
ーションを可能にする条件下プライマーと接触せしめる
と、両方の場合ともハイブリダイゼーションが起こるで
あろう。プライマー延長を可能にする条件下４つすべて
のヌクレオシド三リン酸を添加すると（ａ）では正常配
列プライマー、および（ｂ）では変異配列プライマーの
みの延長体生成となり、他のプライマーの延長はミスマ
ッチのため妨げられている。さらに（Ｃ）に示したごと
く、ただ３つまたはそれ以下の適当なヌクレオシド三リ
ン酸が４つに代わって添加されており、適当なプライマ
ーの延長は適当なヌクレオシド三リン酸の欠乏により与
えられた点で妨げられている。
ている。（ａ）においては正常ゲノムDNA配列が２つの
診断プライマーと共に示されており、プライマーの１つ
はその３′末端が正常ゲノムDNA配列に対し相補的であ
り、第２のプライマーはその３′末端に疑われる変異ヌ
クレオチドに相補的である。（ｂ）においては変異ゲノ
ムDNA配列が同一の２つの診断プライマーと一緒に示し
てある。両方のゲノムDNA配列が相補的ハイブリダイゼ
ーションを可能にする条件下プライマーと接触せしめる
と、両方の場合ともハイブリダイゼーションが起こるで
あろう。プライマー延長を可能にする条件下４つすべて
のヌクレオシド三リン酸を添加すると（ａ）では正常配
列プライマー、および（ｂ）では変異配列プライマーの
みの延長体生成となり、他のプライマーの延長はミスマ
ッチのため妨げられている。さらに（Ｃ）に示したごと
く、ただ３つまたはそれ以下の適当なヌクレオシド三リ
ン酸が４つに代わって添加されており、適当なプライマ
ーの延長は適当なヌクレオシド三リン酸の欠乏により与
えられた点で妨げられている。
図12は実施例５で得られたゲルの可視化の結果を示し
ている。
ている。
レーン１および２は正常ホモ接合体（MM）のDNAに対
応し、レーン３および４はヘテロ接合体（MS）のDNAに
対応し、レーン５および６は変更ホモ接合体（SS）のDN
Aに対応している。レーン1,3および５に関してはオリゴ
ヌクレオチドΧΧ II（正常）が使用され、レーン2,4及
び６に関してはオリゴヌクレオチドΧΧ I（変異）が使
用される。予期されたオリゴヌクレオチド延長がレーン
２または５に関して起こらなかった。検出された生成物
バンドは山形で示されている。
応し、レーン３および４はヘテロ接合体（MS）のDNAに
対応し、レーン５および６は変更ホモ接合体（SS）のDN
Aに対応している。レーン1,3および５に関してはオリゴ
ヌクレオチドΧΧ II（正常）が使用され、レーン2,4及
び６に関してはオリゴヌクレオチドΧΧ I（変異）が使
用される。予期されたオリゴヌクレオチド延長がレーン
２または５に関して起こらなかった。検出された生成物
バンドは山形で示されている。
図13は実施例６で得られたゲルの可視化の結果を示し
ている。
ている。
Ｉ番左のレーンは得られた生成物の大きさの確認のた
めに使用されサイズマーカーを示している。レーン１お
よび２は正常ホモ接合体（MM）からのDNAに対応し、レ
ーン３および４はヘテロ接合体（MZ）からのDNAおよび
レーン５および６は変異ホモ接合体（ZZ）からのDNAに
対応する。レーン1,3および５に関してはプライマーΧ
IΧおよびΧ Iが使用され;1,2,4および６に関してはプ
ライマーΧ IIおよびΧΧが使用された。予期されるご
とくレーン２または５に関してはプライマー延長が起こ
らなかった。検出されたバンドは山型で示してある。
めに使用されサイズマーカーを示している。レーン１お
よび２は正常ホモ接合体（MM）からのDNAに対応し、レ
ーン３および４はヘテロ接合体（MZ）からのDNAおよび
レーン５および６は変異ホモ接合体（ZZ）からのDNAに
対応する。レーン1,3および５に関してはプライマーΧ
IΧおよびΧ Iが使用され;1,2,4および６に関してはプ
ライマーΧ IIおよびΧΧが使用された。予期されるご
とくレーン２または５に関してはプライマー延長が起こ
らなかった。検出されたバンドは山型で示してある。
α−１−抗トリプシンＳ座位の配列（エクソンIII） 下の組に描かれた塩基は各々の座位の正常配列を示し
ている。プライマー中下線を引かれた塩基はプライマー
を不安定化するため挿入された計画的なミスマッチを示
している。 はLongらにより帰属された通りであ
る（Biochemistry 23:4828−4837） α−１抗トリプシンＺ座位の配列（エクソンＶ） 下の組に描かれた塩基は各々の座位の正常配列を示し
ている。プライマー中の下線を引かれた塩基はプライマ
ーを不安定化するため挿入された計画的なミスマッチを
示している。
ている。プライマー中下線を引かれた塩基はプライマー
を不安定化するため挿入された計画的なミスマッチを示
している。 はLongらにより帰属された通りであ
る（Biochemistry 23:4828−4837） α−１抗トリプシンＺ座位の配列（エクソンＶ） 下の組に描かれた塩基は各々の座位の正常配列を示し
ている。プライマー中の下線を引かれた塩基はプライマ
ーを不安定化するため挿入された計画的なミスマッチを
示している。
本発明を以下の実施例により例示するがそれに限定さ
れるわけではない。実施例において特に記載しない限り
使用される物質は以下の量または濃度である。
れるわけではない。実施例において特に記載しない限り
使用される物質は以下の量または濃度である。
基質DNA:1μｇ ヒトゲノムDNA オリゴヌクレオチド：各々適当なオリゴヌクレオチドに
ついて100ピコモル デオキシヌクレオシド三リン酸：各々の最終濃度1.5mM 緩衝液（反応混合物中での最終濃度）： 67 mM トリス（pH8.8HClで） 16.6mM 硫酸アンモニウム 6.7mM 塩化マグネシウム 10 mM β−メルカプトエタノール 6.7μM EDTA 展開緩衝液:35％フィコール70−（フィコール70はショ
糖およびエピクロロヒドリンの共重合により作られた合
成重合体、共重合物は約70.000の平均分子量を持つ、フ
ァルマシアの製品） 200mM トリス−酢酸 100mM 酢酸ナトリウム 5mM EDTA 0.2％ ブロモフェノール ブルー サイズマーカー:Hae IIIで切断したバクテリオファージ
φΧ174 DNA; 塩基対で表わしたバンドの大きさは以下のごとくであ
る： 1353,1078,872,603,310,281,271,234,194,118および72 実施例１ １μｇのヒトゲノムDNA、各100pmoleの上で定義した
オリゴヌクレオチドI,II,IIIおよびIV,1.5mM（最終濃
度）の４種のデオキシヌクレオシド三リン酸、および上
述の最終濃度の緩衝液を1.5mlのスクリューキャップ微
量遠心チューブ内で混合し、滅菌蒸留水で体積を100μ
に合わせた。チューブを密閉し、沸騰水中に５分間置
いた。反応は、１ユニットの酵素を含むTaqポリメラー
ゼ溶液１μ（アングリアン・バイオテク社 バッチ３
を上記緩衝液で１ユニット／μに希釈したもの）を加
えることにより開始させた。チューブを58℃で４分間、
続いて91℃で２分間インキュベートした。58℃/91℃加
熱／冷却過程を、さらに５サイクル行い、１ユニットの
酵素（上述）をさらに添加した。次に、58℃/91℃加熱
／冷却過程をさらに６サイクル続け、さらに１ユニット
の酵素（上述）を添加した。上記の加熱／冷却過程をさ
らに６サイクル行い、さらに１ユニットの酵素（上述）
を加え、また５サイクルを行い、１ユニットの酵素（上
述）をさらに添加、またさらに２サイクル行いさらに１
ユニットの酵素（上述）を加えた。以上のサイクルに続
いて58℃で20分間インキュベートした。
ついて100ピコモル デオキシヌクレオシド三リン酸：各々の最終濃度1.5mM 緩衝液（反応混合物中での最終濃度）： 67 mM トリス（pH8.8HClで） 16.6mM 硫酸アンモニウム 6.7mM 塩化マグネシウム 10 mM β−メルカプトエタノール 6.7μM EDTA 展開緩衝液:35％フィコール70−（フィコール70はショ
糖およびエピクロロヒドリンの共重合により作られた合
成重合体、共重合物は約70.000の平均分子量を持つ、フ
ァルマシアの製品） 200mM トリス−酢酸 100mM 酢酸ナトリウム 5mM EDTA 0.2％ ブロモフェノール ブルー サイズマーカー:Hae IIIで切断したバクテリオファージ
φΧ174 DNA; 塩基対で表わしたバンドの大きさは以下のごとくであ
る： 1353,1078,872,603,310,281,271,234,194,118および72 実施例１ １μｇのヒトゲノムDNA、各100pmoleの上で定義した
オリゴヌクレオチドI,II,IIIおよびIV,1.5mM（最終濃
度）の４種のデオキシヌクレオシド三リン酸、および上
述の最終濃度の緩衝液を1.5mlのスクリューキャップ微
量遠心チューブ内で混合し、滅菌蒸留水で体積を100μ
に合わせた。チューブを密閉し、沸騰水中に５分間置
いた。反応は、１ユニットの酵素を含むTaqポリメラー
ゼ溶液１μ（アングリアン・バイオテク社 バッチ３
を上記緩衝液で１ユニット／μに希釈したもの）を加
えることにより開始させた。チューブを58℃で４分間、
続いて91℃で２分間インキュベートした。58℃/91℃加
熱／冷却過程を、さらに５サイクル行い、１ユニットの
酵素（上述）をさらに添加した。次に、58℃/91℃加熱
／冷却過程をさらに６サイクル続け、さらに１ユニット
の酵素（上述）を添加した。上記の加熱／冷却過程をさ
らに６サイクル行い、さらに１ユニットの酵素（上述）
を加え、また５サイクルを行い、１ユニットの酵素（上
述）をさらに添加、またさらに２サイクル行いさらに１
ユニットの酵素（上述）を加えた。以上のサイクルに続
いて58℃で20分間インキュベートした。
増幅した産物の検出は、15μの反応混合液を５μ
のゲル泳動緩衝液と混合し、エチルジウムブロマイド
（２μ/ml）を含むアガロースゲル（３％“NuSiev
e"）電気泳動によって行なった。電気泳動はサイズマー
カーと比較して行い、増幅産物の大きさが正しいことを
確認した。ゲルはトランスイルミネーター（波長300n
m）上で可視化し、ポラロイド写真を撮影した。第７図
のレーン３は上で定義したプライマーＩとプライマーII
を用いたエクソンIIIの増幅により360bpの産物が生じた
もの、上で定義したプライマーIIIとプライマーIVを用
いたエクソンＶの増幅により220bpの産物が生じたもの
を示している。
のゲル泳動緩衝液と混合し、エチルジウムブロマイド
（２μ/ml）を含むアガロースゲル（３％“NuSiev
e"）電気泳動によって行なった。電気泳動はサイズマー
カーと比較して行い、増幅産物の大きさが正しいことを
確認した。ゲルはトランスイルミネーター（波長300n
m）上で可視化し、ポラロイド写真を撮影した。第７図
のレーン３は上で定義したプライマーＩとプライマーII
を用いたエクソンIIIの増幅により360bpの産物が生じた
もの、上で定義したプライマーIIIとプライマーIVを用
いたエクソンＶの増幅により220bpの産物が生じたもの
を示している。
実施例２ 上で定義したプライマーIIのかわりにプライマーII a
を用いて実施例１を繰り返した。第７図のレーン４は本
実施例で得られたゲルを可視化した結果を示している。
上述のプライマーＩとプライマーII aを用いた場合には
エクソンIIIの増幅は見られないが、上述のプライマーI
IIおよびプライマーIVによるエクソンＶの増幅によって
実施例１の場合と同様に同じ220bpの産物が精製れれた
ことが示されている。
を用いて実施例１を繰り返した。第７図のレーン４は本
実施例で得られたゲルを可視化した結果を示している。
上述のプライマーＩとプライマーII aを用いた場合には
エクソンIIIの増幅は見られないが、上述のプライマーI
IIおよびプライマーIVによるエクソンＶの増幅によって
実施例１の場合と同様に同じ220bpの産物が精製れれた
ことが示されている。
以上のように、実施例２はオリゴヌクレオチドの３′
末端のミスマッチがポリメラーゼ活性の開始を妨げる、
あるいは少くとも実質的に抑制することを示唆してい
る。
末端のミスマッチがポリメラーゼ活性の開始を妨げる、
あるいは少くとも実質的に抑制することを示唆してい
る。
実施例３ ヒトα−１−アンチトリプシンのＳアリル（allele） １μのヒトゲノムDNA、100pmoleの後述の各オリゴ
ヌクレオチド、各1.5mM（最終濃度）の４種のデオキシ
ヌクレオシド三リン酸、および上述の最終濃度の緩衝液
を1.5mlスクリューキャップ微量遠心チューブ内で混合
し、滅菌蒸留水で体積を100μを合わせた。チューブ
を密閉し、沸騰水中に５分間置いた。反応は１ユニット
の酵素を含む１μのTaqポリメラーゼ溶液（アングリ
アン・バイオテク バッチ３を上述の緩衝液で１ユニッ
ト／μに希釈したもの）を添加することにより開始し
た。チューブを58℃で４分間インキュベートし、次に91
℃で２分間インキュベートした。58℃/91℃加熱／冷却
過程をさらに５サイクル繰り返し、その時点でさらに１
ユニットの酵素（上述）を添加した。続いて、58℃/91
℃加熱／冷却過程をさらに６サイクル行い、さらに１ユ
ニットの酵素（上述）を添加した。上述の加熱／冷却過
程をさらに６サイクル行なってさらに１ユニットの酵素
（上述）を添加し、またさらに５サイクル行い１ユニッ
トの酵素（上述）をさらに加え、さらに２サイクル行い
１ユニットの酵素（上述）をさらに添加した。以上の過
程に続いて58℃で20分間インキュベートした。
ヌクレオチド、各1.5mM（最終濃度）の４種のデオキシ
ヌクレオシド三リン酸、および上述の最終濃度の緩衝液
を1.5mlスクリューキャップ微量遠心チューブ内で混合
し、滅菌蒸留水で体積を100μを合わせた。チューブ
を密閉し、沸騰水中に５分間置いた。反応は１ユニット
の酵素を含む１μのTaqポリメラーゼ溶液（アングリ
アン・バイオテク バッチ３を上述の緩衝液で１ユニッ
ト／μに希釈したもの）を添加することにより開始し
た。チューブを58℃で４分間インキュベートし、次に91
℃で２分間インキュベートした。58℃/91℃加熱／冷却
過程をさらに５サイクル繰り返し、その時点でさらに１
ユニットの酵素（上述）を添加した。続いて、58℃/91
℃加熱／冷却過程をさらに６サイクル行い、さらに１ユ
ニットの酵素（上述）を添加した。上述の加熱／冷却過
程をさらに６サイクル行なってさらに１ユニットの酵素
（上述）を添加し、またさらに５サイクル行い１ユニッ
トの酵素（上述）をさらに加え、さらに２サイクル行い
１ユニットの酵素（上述）をさらに添加した。以上の過
程に続いて58℃で20分間インキュベートした。
以下のテストは上述の過程に基づいて行われたもので
ある。
ある。
ａ） 使用したオリゴヌクレオチドは および、上で定義したオリゴヌクレオチドＩある。用い
たヒトゲノムDNAは、ヒトα１アンチトリプシンの遺伝
的異常を持たない正常ホモ二倍体細胞由来のものであ
る：また、 ｂ）使用したオリゴヌクレオチドは および、上で定義したオリゴヌクレオチドＩである。用
いたヒトゲノムDNAは、ヒトα１アンチトリプシンの遺
伝的異常を持たない正常ホモ二倍体細胞由来のものであ
る。
たヒトゲノムDNAは、ヒトα１アンチトリプシンの遺伝
的異常を持たない正常ホモ二倍体細胞由来のものであ
る：また、 ｂ）使用したオリゴヌクレオチドは および、上で定義したオリゴヌクレオチドＩである。用
いたヒトゲノムDNAは、ヒトα１アンチトリプシンの遺
伝的異常を持たない正常ホモ二倍体細胞由来のものであ
る。
増幅産物の検出は、15μの反応混合液と、別の５μ
のゲル泳動緩衝液を混合してエチジウムブロマイド
（２μ/ml）を含むアガロースゲル（３％“NuSiev
e"）での電気泳動によって行なった。電気泳動は、増幅
産物のサイズが正しいことを確認するためにサイズマー
カー（第８図のレーン９）に対して行なった。ゲルはト
ランスイルミネーター（波長300nm）上で可視化し、ポ
ラロイド写真を撮影した。第８図のレーン１および２
は、この可視化の結果を示したものである。レーン１
は、用いた試料DNA内のＳ突然変異の可能性がある部位
に対応するヌクレオチドと相補性のある３′末端ヌクレ
オチドを有するヌクレオチド配列Ｖを用いた場合に増幅
が行なわれ、267bpの増幅産物が生成されていることを
示している。一方レーン２は、正常ホモ二倍体細胞由来
のDNA試料のＳ変異の可能性がある部位内のヌクレオチ
ド（Ａ）とミスマッチするヌクレオチド（Ａ）を３′末
端に持つ診断用プライマーを用い、診断用プライマーの
３′末端にミスマッチが生じる場合には増幅が見られな
いことを示している。
のゲル泳動緩衝液を混合してエチジウムブロマイド
（２μ/ml）を含むアガロースゲル（３％“NuSiev
e"）での電気泳動によって行なった。電気泳動は、増幅
産物のサイズが正しいことを確認するためにサイズマー
カー（第８図のレーン９）に対して行なった。ゲルはト
ランスイルミネーター（波長300nm）上で可視化し、ポ
ラロイド写真を撮影した。第８図のレーン１および２
は、この可視化の結果を示したものである。レーン１
は、用いた試料DNA内のＳ突然変異の可能性がある部位
に対応するヌクレオチドと相補性のある３′末端ヌクレ
オチドを有するヌクレオチド配列Ｖを用いた場合に増幅
が行なわれ、267bpの増幅産物が生成されていることを
示している。一方レーン２は、正常ホモ二倍体細胞由来
のDNA試料のＳ変異の可能性がある部位内のヌクレオチ
ド（Ａ）とミスマッチするヌクレオチド（Ａ）を３′末
端に持つ診断用プライマーを用い、診断用プライマーの
３′末端にミスマッチが生じる場合には増幅が見られな
いことを示している。
実施例４ Ｚアリル １μのヒトゲノムDNA、100pmoleの後述の各オリゴ
ヌクレオチド、各1.5mM（最終濃度）の４種のデオキシ
ヌクレオシド三リン酸、および上述の最終濃度の緩衝液
を1.5mlスクリューキャップ微量遠心チューブ内で混合
し、滅菌蒸留水で体積を100μに合わせた。チューブ
を密閉し、沸騰水中に５分間置いた。反応は0.5ユニッ
トの酵素を含む１μのTaqポリメラーゼ溶液（アング
リアン・バイオテク バッチ９を上述の緩衝液で0.5ユ
ニット／μに希釈したもの）を添加することにより開
始した。チューブを60℃で４分間インキュベートし、次
に91℃で２分間インキュベートした。60℃/91℃加熱／
冷却過程をさらに５サイクル繰り返し、その時点でさら
に0.5ユニットの酵素（上述）を添加した。続いて、60
℃/91℃加熱／冷却過程をさらに６サイクル行い、さら
に0.5ユニットの酵素を添加した。上述の加熱／冷却過
程を６サイクル行い0.5ユニットの酵素（上述）をさら
に加え、さらに５サイクル行い0.5ユニットの酵素（上
述）をさらに添加し、さらに３サイクル行なった後、さ
らに0.5ユニットの酵素（上述）を添加した。以上の過
程に続いて60℃で20分間インキュベートした。
ヌクレオチド、各1.5mM（最終濃度）の４種のデオキシ
ヌクレオシド三リン酸、および上述の最終濃度の緩衝液
を1.5mlスクリューキャップ微量遠心チューブ内で混合
し、滅菌蒸留水で体積を100μに合わせた。チューブ
を密閉し、沸騰水中に５分間置いた。反応は0.5ユニッ
トの酵素を含む１μのTaqポリメラーゼ溶液（アング
リアン・バイオテク バッチ９を上述の緩衝液で0.5ユ
ニット／μに希釈したもの）を添加することにより開
始した。チューブを60℃で４分間インキュベートし、次
に91℃で２分間インキュベートした。60℃/91℃加熱／
冷却過程をさらに５サイクル繰り返し、その時点でさら
に0.5ユニットの酵素（上述）を添加した。続いて、60
℃/91℃加熱／冷却過程をさらに６サイクル行い、さら
に0.5ユニットの酵素を添加した。上述の加熱／冷却過
程を６サイクル行い0.5ユニットの酵素（上述）をさら
に加え、さらに５サイクル行い0.5ユニットの酵素（上
述）をさらに添加し、さらに３サイクル行なった後、さ
らに0.5ユニットの酵素（上述）を添加した。以上の過
程に続いて60℃で20分間インキュベートした。
以下のテストは上述の過程に基づいて行なったもので
ある：− ａ） 用いたオリゴヌクレオチドは上述のＩΧおよびIV
であり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプ
シン遺伝的異常を持たない正常ホモ二倍体細胞由来のも
のである： ｂ） 用いたオリゴヌクレオチドは上述のΧおよびIVで
あり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプシ
ン遺伝的異常を持たない正常ホモ二倍の体細胞由来のも
のである： ｃ） 用いたオリゴヌクレオチドは上述のＩΧおよびIV
であり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプ
シン Ｚアリルに関してヘテロ二倍体である細胞由来の
ものである。
ある：− ａ） 用いたオリゴヌクレオチドは上述のＩΧおよびIV
であり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプ
シン遺伝的異常を持たない正常ホモ二倍体細胞由来のも
のである： ｂ） 用いたオリゴヌクレオチドは上述のΧおよびIVで
あり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプシ
ン遺伝的異常を持たない正常ホモ二倍の体細胞由来のも
のである： ｃ） 用いたオリゴヌクレオチドは上述のＩΧおよびIV
であり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプ
シン Ｚアリルに関してヘテロ二倍体である細胞由来の
ものである。
ｄ）用いたオリゴヌクレオチドは上述のΧおよびIVであ
り、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプシン
Ｚアリルに関してヘテロ二倍体である細胞由来のもの
である。
り、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプシン
Ｚアリルに関してヘテロ二倍体である細胞由来のもの
である。
ｅ） 用いたオリゴヌクレオチドは上述のＩΧおよびIV
であり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプ
シン異常であるホモ二倍体（ZZ）細胞由来のものであ
る。
であり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプ
シン異常であるホモ二倍体（ZZ）細胞由来のものであ
る。
ｆ） 用いたオリゴヌクレオチドは上述のΧおよびIVで
あり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプシ
ン異常であるホモ二倍体（ZZ）細胞由来のものである： ｇ） 用いたオリゴヌクレオチドは上述のΧ IおよびIV
でり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプシ
ン遺伝的異常を持たない正常ホモ二倍体細胞由来のもの
である： ｈ） 用いたオリゴヌクレオチドは上述のΧ IIおよびI
Vであり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプ
シン遺伝的異常を持たない正常ホモ二倍体細胞由来のも
のである： ｉ）用いたオリゴヌクレオチドは上述のΧ IおよびIVで
あり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプシ
ン Ｚアリルに関してヘテロ二倍体細胞由来のものであ
る： ｊ）用いたオリゴヌクレオチドは上述のΧ IIおよびIV
であり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプ
シン Ｚアリルに関してヘテロ二倍体細胞由来のもので
ある： ｋ）用いたオリゴヌクレオチドは上述のΧ IおよびIVで
あり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプシ
ン異常であるホモ二倍体（ZZ）細胞由来のものである： ｌ） 用いたオリゴヌクレオチドは上述のΧ IIおよびI
Vであり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプ
シン異常であるホモ二倍体（ZZ）細胞由来のものであ
る： 各テストにおいて、ヌクレオチド配列Χ IIIおよびΧ
IVは増幅のコントロールとして用いた。
あり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプシ
ン異常であるホモ二倍体（ZZ）細胞由来のものである： ｇ） 用いたオリゴヌクレオチドは上述のΧ IおよびIV
でり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプシ
ン遺伝的異常を持たない正常ホモ二倍体細胞由来のもの
である： ｈ） 用いたオリゴヌクレオチドは上述のΧ IIおよびI
Vであり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプ
シン遺伝的異常を持たない正常ホモ二倍体細胞由来のも
のである： ｉ）用いたオリゴヌクレオチドは上述のΧ IおよびIVで
あり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプシ
ン Ｚアリルに関してヘテロ二倍体細胞由来のものであ
る： ｊ）用いたオリゴヌクレオチドは上述のΧ IIおよびIV
であり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプ
シン Ｚアリルに関してヘテロ二倍体細胞由来のもので
ある： ｋ）用いたオリゴヌクレオチドは上述のΧ IおよびIVで
あり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプシ
ン異常であるホモ二倍体（ZZ）細胞由来のものである： ｌ） 用いたオリゴヌクレオチドは上述のΧ IIおよびI
Vであり、用いたヒトゲノムDNAはヒトα１アンチトリプ
シン異常であるホモ二倍体（ZZ）細胞由来のものであ
る： 各テストにおいて、ヌクレオチド配列Χ IIIおよびΧ
IVは増幅のコントロールとして用いた。
増幅産物の検出は、15μの反応混合液と、別の５μ
のゲル泳動緩衝液を混合してエチジウムブロマイド
（0.45μg/ml）を含む1.4％アガロースゲルでの電気泳
動によって行なった。電気泳動は、増幅産物のサイズが
正しいことを確認するためにサイズマーカーに対して行
なった。ゲルはトランスイルミネーター（波長300nm）
上で可視化し、ポラロイド写真を撮影した。第９図のレ
ーン２〜13は、この可視化の結果を示したものであり、
レーン１および14はサイズマーカーのバンドを示してい
る。レーン２〜７は、上述の反応条件下でプライマーが
正常DNA試料と変異体DNA試料を区別できるようにするに
は、３′末端から５番目のヌクレオチドの変化による診
断用プライマーの不安定化では十分に効果的ではないこ
とをし示している。しかしながら、レーン８〜13は、診
断用プライマーの３′末端から３番目のヌクレオチドの
変化が、プライマーが正常DNA試料と変異体DNA試料を区
別できるようになるために効果的であることを示してお
り、これにより正常ホモ二倍体、ヘテロ二倍体（キャリ
ア）、あるいはヒトα１アンチトリプシン異常であるZZ
ホモ二倍体の診断を行なうことができる。
のゲル泳動緩衝液を混合してエチジウムブロマイド
（0.45μg/ml）を含む1.4％アガロースゲルでの電気泳
動によって行なった。電気泳動は、増幅産物のサイズが
正しいことを確認するためにサイズマーカーに対して行
なった。ゲルはトランスイルミネーター（波長300nm）
上で可視化し、ポラロイド写真を撮影した。第９図のレ
ーン２〜13は、この可視化の結果を示したものであり、
レーン１および14はサイズマーカーのバンドを示してい
る。レーン２〜７は、上述の反応条件下でプライマーが
正常DNA試料と変異体DNA試料を区別できるようにするに
は、３′末端から５番目のヌクレオチドの変化による診
断用プライマーの不安定化では十分に効果的ではないこ
とをし示している。しかしながら、レーン８〜13は、診
断用プライマーの３′末端から３番目のヌクレオチドの
変化が、プライマーが正常DNA試料と変異体DNA試料を区
別できるようになるために効果的であることを示してお
り、これにより正常ホモ二倍体、ヘテロ二倍体（キャリ
ア）、あるいはヒトα１アンチトリプシン異常であるZZ
ホモ二倍体の診断を行なうことができる。
本実施例の上述の実験は、不安定化させるための付加
的なヌクレオチド置換が導入されていない診断用プライ
マー、および、不安定化のために３′末端から７番目の
ヌクレオチドを置換した（ＡからＣ）診断用プライマー
を用いても実施した。いずれの場合も診断用プライマー
は正常DNA試料と変異体DNA試料を区別するためには十分
に効果的ではなかった。不安定化のための付加的なヌク
レオチド置換を有さない診断用プライマーに関しては第
８図のレーン５〜８に効果を示す。
的なヌクレオチド置換が導入されていない診断用プライ
マー、および、不安定化のために３′末端から７番目の
ヌクレオチドを置換した（ＡからＣ）診断用プライマー
を用いても実施した。いずれの場合も診断用プライマー
は正常DNA試料と変異体DNA試料を区別するためには十分
に効果的ではなかった。不安定化のための付加的なヌク
レオチド置換を有さない診断用プライマーに関しては第
８図のレーン５〜８に効果を示す。
実施例５ オリゴヌクレオチドΧΧ II（正常）およびΧΧ I
（変異体）をプライマーとして用いた。本実施例におい
ては、A,G,およびＴのdNTP混合液によって、Ｃヌクレオ
シド三リン酸が必要となる前に７ベース伸長したプライ
マーが得られる。これらのオリゴヌクレオチドはTmは、
Tm＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）の公式から94℃と計算
されるが、これは23merまでのオリゴヌクレオチドに対
してのみ適合すると考えられており、ここでは75℃を選
択した。
（変異体）をプライマーとして用いた。本実施例におい
ては、A,G,およびＴのdNTP混合液によって、Ｃヌクレオ
シド三リン酸が必要となる前に７ベース伸長したプライ
マーが得られる。これらのオリゴヌクレオチドはTmは、
Tm＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）の公式から94℃と計算
されるが、これは23merまでのオリゴヌクレオチドに対
してのみ適合すると考えられており、ここでは75℃を選
択した。
オリゴヌクレオチド（各8pmole）の５′末端の水酸基
を、5mM Tris−Cl pH 7.6,10mM MgCl2,5mM DTT.100μＭ
スペルミジン,100μM EDTAを含む80μの反応溶液中
で、d32P ATP（アマシャム２μCi）およびT4ポリヌクレ
オチドキナーゼ（４ユニット）を用いて標識した。キナ
ーゼ反応は37℃で20分間行い、標識されたオリゴヌクレ
オチドは15％ポリアクリルアミド変性ゲル/8M尿素で電
気泳動することにより確認した（前泳動500V 1時間、主
泳動800V 4時間）。
を、5mM Tris−Cl pH 7.6,10mM MgCl2,5mM DTT.100μＭ
スペルミジン,100μM EDTAを含む80μの反応溶液中
で、d32P ATP（アマシャム２μCi）およびT4ポリヌクレ
オチドキナーゼ（４ユニット）を用いて標識した。キナ
ーゼ反応は37℃で20分間行い、標識されたオリゴヌクレ
オチドは15％ポリアクリルアミド変性ゲル/8M尿素で電
気泳動することにより確認した（前泳動500V 1時間、主
泳動800V 4時間）。
プラスミドは、一つはヒトα１−アンチトリプシン遺
伝子のエクソンIIIのＳ領域の正常配列（MM）を含むも
ので、もう一つは変異体ホモ二倍体（SS）に対応する変
異配列を含む、２種類を用いた。それぞれ可能な型のDN
A2種について、６本のチューブを準備した。ホモ二倍体
には1 fmoleの適当なプラスミドを使用したが、ヘテロ
二倍体は双方のプラスミドを0.5fmoleずつ使用すること
によってシュミレートした。正常（ΧΧ II）あるいは
変異体（ΧΧ I）オリゴヌクレオチド200fmole（標識し
た溶液２μ）を各々の型のDNAに加えることによって
各チューブ内に200倍過剰の標識オリゴヌクレオチドを
調製した。各チューブには、6.7mM EDTA,6.7mM MgCl2,6
7mM Tris−HCl pH 8.8,10mMメルカプトエタノール、お
よび16.6mM 硫酸アンモニウムを含む20μの反応溶液
中に、最終濃度が各5mMとなるように3dNTPs.A.G.および
Ｔ（ファルアシア）を加えた。蒸発の影響を減じるた
め、それぞれ使用の際に反応体積を３倍すなわち60μ
とした。各チューブに３ユニットのTaqポリメラーゼ
（シータス1.5mM MgCl2,50mM KCl,10mM Tris pH 8.3,0.
01％ゼラチンで５倍に希釈し、１ユニット／μとす
る）を添加する前に、チューブを５分間沸騰水中につ
け、氷上に置いた。チューブを13000rpmで２分間遠心
し、２μのアリコートを５μのホルムアミド／ブロ
モフェノールブルー染色剤に加えた。次にチューブを75
℃のウォーターバス中に置いた。４時間後、チューブを
取り出し、１分間13000rpmで遠心して、さらに２μの
アリコートを採って５μの染色液に加えた。続いて、
チューブを75℃のウォーターバス内に戻した。６時間後
チューブを再度取り出し、さらに３ユニットのTaqポリ
メラーゼを各チユーブに添加して13000rpmで１分間遠心
し、蒸発を防ぐために１滴のライトミネラルオイル（シ
グマ）を加えたが、アリコートは採らなかった。そして
チユーブを75℃で一晩置いた。最初の遠心の終わりから
計算して24時間後、チューブをウォーターバスから取り
出し、１分間遠心して最後の２μのアリコートを５μ
の染色液に加えた。全てのアリコートを前泳動（500V
1時間）した15％変性ポリアクリルアミドゲル/8M尿素
を用い、１×TBE緩衝液（0.89M Tris−ほう酸、0.089M
ほう酸、0.002M EDTA）中で880Vで５時間半電気泳動
を行なった。続いてゲルを低速感光フィルムで、スクリ
ーンを用いずに室温で一晩オートラジオグラフにかけ
た。結果を第12図に示す。
伝子のエクソンIIIのＳ領域の正常配列（MM）を含むも
ので、もう一つは変異体ホモ二倍体（SS）に対応する変
異配列を含む、２種類を用いた。それぞれ可能な型のDN
A2種について、６本のチューブを準備した。ホモ二倍体
には1 fmoleの適当なプラスミドを使用したが、ヘテロ
二倍体は双方のプラスミドを0.5fmoleずつ使用すること
によってシュミレートした。正常（ΧΧ II）あるいは
変異体（ΧΧ I）オリゴヌクレオチド200fmole（標識し
た溶液２μ）を各々の型のDNAに加えることによって
各チューブ内に200倍過剰の標識オリゴヌクレオチドを
調製した。各チューブには、6.7mM EDTA,6.7mM MgCl2,6
7mM Tris−HCl pH 8.8,10mMメルカプトエタノール、お
よび16.6mM 硫酸アンモニウムを含む20μの反応溶液
中に、最終濃度が各5mMとなるように3dNTPs.A.G.および
Ｔ（ファルアシア）を加えた。蒸発の影響を減じるた
め、それぞれ使用の際に反応体積を３倍すなわち60μ
とした。各チューブに３ユニットのTaqポリメラーゼ
（シータス1.5mM MgCl2,50mM KCl,10mM Tris pH 8.3,0.
01％ゼラチンで５倍に希釈し、１ユニット／μとす
る）を添加する前に、チューブを５分間沸騰水中につ
け、氷上に置いた。チューブを13000rpmで２分間遠心
し、２μのアリコートを５μのホルムアミド／ブロ
モフェノールブルー染色剤に加えた。次にチューブを75
℃のウォーターバス中に置いた。４時間後、チューブを
取り出し、１分間13000rpmで遠心して、さらに２μの
アリコートを採って５μの染色液に加えた。続いて、
チューブを75℃のウォーターバス内に戻した。６時間後
チューブを再度取り出し、さらに３ユニットのTaqポリ
メラーゼを各チユーブに添加して13000rpmで１分間遠心
し、蒸発を防ぐために１滴のライトミネラルオイル（シ
グマ）を加えたが、アリコートは採らなかった。そして
チユーブを75℃で一晩置いた。最初の遠心の終わりから
計算して24時間後、チューブをウォーターバスから取り
出し、１分間遠心して最後の２μのアリコートを５μ
の染色液に加えた。全てのアリコートを前泳動（500V
1時間）した15％変性ポリアクリルアミドゲル/8M尿素
を用い、１×TBE緩衝液（0.89M Tris−ほう酸、0.089M
ほう酸、0.002M EDTA）中で880Vで５時間半電気泳動
を行なった。続いてゲルを低速感光フィルムで、スクリ
ーンを用いずに室温で一晩オートラジオグラフにかけ
た。結果を第12図に示す。
レーン１およびーン２は正常ホモ二倍体（MM）の、DN
A、レーン３およびレーン４はヘテロ二倍体（MS）のDN
A、レーン５およびレーン６は変異体ホモ二倍体（SS）
のDNAに対応する。レーン1,3,5ではオゴヌクレオチドΧ
Χ II（正常）が用いられ、レーン2,4,6についてはオリ
ゴヌクレオチドΧΧ I（変異体）が用いられた。予想さ
れたように、オリゴヌクレオチドの伸長はレーン２ある
いは５については起こらなかった。検出された産物のバ
ンドはＶ字形で示されている。
A、レーン３およびレーン４はヘテロ二倍体（MS）のDN
A、レーン５およびレーン６は変異体ホモ二倍体（SS）
のDNAに対応する。レーン1,3,5ではオゴヌクレオチドΧ
Χ II（正常）が用いられ、レーン2,4,6についてはオリ
ゴヌクレオチドΧΧ I（変異体）が用いられた。予想さ
れたように、オリゴヌクレオチドの伸長はレーン２ある
いは５については起こらなかった。検出された産物のバ
ンドはＶ字形で示されている。
実施例６ 1ngのカセットプラスミドDNA、各100pmoleのオリゴヌ
クレオチドプライマー 各1.5mM（最終濃度）の４種のデオキシヌクレオシド三
リン酸、および上述の最終濃度の緩衝液を1.5mlのスク
リューキャップ微量遠心チューブ内で混合し、滅菌脱イ
オン水（ミリＱ（Milli−Ｑ）で体積を100μに合わせ
た。チューブを密閉し、沸騰水中に５分間置いた。反応
は２ユニットのTaqポリメラーゼ（シータス）を加える
ことによって開始し、蒸発を防ぐために混合液をライト
ミネラルオイル（シグマ）で密閉した。チューブを60℃
で４分間インキュベートし、続いて90℃で２分間インキ
ュベートした。この過程を計30サイクル繰り返した。
クレオチドプライマー 各1.5mM（最終濃度）の４種のデオキシヌクレオシド三
リン酸、および上述の最終濃度の緩衝液を1.5mlのスク
リューキャップ微量遠心チューブ内で混合し、滅菌脱イ
オン水（ミリＱ（Milli−Ｑ）で体積を100μに合わせ
た。チューブを密閉し、沸騰水中に５分間置いた。反応
は２ユニットのTaqポリメラーゼ（シータス）を加える
ことによって開始し、蒸発を防ぐために混合液をライト
ミネラルオイル（シグマ）で密閉した。チューブを60℃
で４分間インキュベートし、続いて90℃で２分間インキ
ュベートした。この過程を計30サイクル繰り返した。
次に、60μの反応溶液を分注し、60pmoleのプライ
マーΧ IΧとΧ I（正常）、あるいはプライマーΧ II
とΧΧ（変異体）の何れかをそれに加えた。１ユニット
のTaqポリメラーゼ（シータス）を加えてさらなる反応
を開始させた。混合液を92℃で２分間インキュベートし
た後、60℃で４分間インキュベートした。この過程を計
４サイクル繰り返した。増幅産物の検出は、反応混合物
から採った10μのアリコートをゲル泳動“緩衝液”と
混合した後、0.5μg/エチジウムブロマイドを含む３％
アガロースゲル（“NuSieve"FMC バイオプロダクツ）で
の電位泳動によって行った。ゲルはトランスイルミネー
ター（波長300nm）上で可視化し、ポラロイド写真を撮
影した。結果を第13図に示す。左端のレーンは、得られ
た産物のサイズを確認するために用いたサイズマーカー
を示している。レーン１および２は正常ホモ二倍体（M
M）由来のDNA、レーン３および４はヘテロ二倍体（MZ）
由来のDNA、レーン５および６は変異体ホモ二倍体（Z
Z）由来のDNAに対応する。レーン1,3,および５について
はプライマーΧ IΧおよびΧ Iが用いられており、レー
ン2,4,および６に関してはプライマーΧ IIおよびΧΧ
が用いられた。予想されたように、レーン２あるいは５
ではプライマーの伸長が起こらなかった。検出された産
物のバンドはＶ字型で示している。
マーΧ IΧとΧ I（正常）、あるいはプライマーΧ II
とΧΧ（変異体）の何れかをそれに加えた。１ユニット
のTaqポリメラーゼ（シータス）を加えてさらなる反応
を開始させた。混合液を92℃で２分間インキュベートし
た後、60℃で４分間インキュベートした。この過程を計
４サイクル繰り返した。増幅産物の検出は、反応混合物
から採った10μのアリコートをゲル泳動“緩衝液”と
混合した後、0.5μg/エチジウムブロマイドを含む３％
アガロースゲル（“NuSieve"FMC バイオプロダクツ）で
の電位泳動によって行った。ゲルはトランスイルミネー
ター（波長300nm）上で可視化し、ポラロイド写真を撮
影した。結果を第13図に示す。左端のレーンは、得られ
た産物のサイズを確認するために用いたサイズマーカー
を示している。レーン１および２は正常ホモ二倍体（M
M）由来のDNA、レーン３および４はヘテロ二倍体（MZ）
由来のDNA、レーン５および６は変異体ホモ二倍体（Z
Z）由来のDNAに対応する。レーン1,3,および５について
はプライマーΧ IΧおよびΧ Iが用いられており、レー
ン2,4,および６に関してはプライマーΧ IIおよびΧΧ
が用いられた。予想されたように、レーン２あるいは５
ではプライマーの伸長が起こらなかった。検出された産
物のバンドはＶ字型で示している。
図１（ａ）および１（ｂ）は本発明の第１の実施態様を
図示しており、図１（ｃ）は電気泳動的に示されている
そのような試験の典型的結果であり： 図２（ａ）および２（ｂ）は本発明の第２の実施態様を
図示しており； 図３は多増幅生成物を区別するための好適な方法を図示
しており； 図４（ａ）および４（ｂ）は本発明の第３の実施態様を
図示しており； 図５（ａ）,5（ｂ）および５（ｃ）は本発明の第４の実
施態様を図示しており； 図６（比例してはいない）はヒトα１抗トリプシン遺伝
子を示しており；および 図７は実施例１および２で得られたゲルを可視化した結
果を示している。 図８はゲルを可視化した結果を示しており、図中レーン
１−４は実施例３の結果を、レーン５−８は実施例４の
結果の比率を表わしており、レーン９はサイズマーカー
を表わしている。 図９は実施例４で得られたゲルの可視化の結果を示して
いる。 図10は所望のDNA二重体を増幅するカセットプラスミド
系の使用を図示している。 図11（ａ）,11（ｂ）および11（ｃ）は本発明の第５の
実施態様（線状増幅）を図示している。 図12は実施例５で得られたゲルの可視化の結果を示して
いる。 図13は実施例６で得られたゲルの可視化の結果を示して
いる。
図示しており、図１（ｃ）は電気泳動的に示されている
そのような試験の典型的結果であり： 図２（ａ）および２（ｂ）は本発明の第２の実施態様を
図示しており； 図３は多増幅生成物を区別するための好適な方法を図示
しており； 図４（ａ）および４（ｂ）は本発明の第３の実施態様を
図示しており； 図５（ａ）,5（ｂ）および５（ｃ）は本発明の第４の実
施態様を図示しており； 図６（比例してはいない）はヒトα１抗トリプシン遺伝
子を示しており；および 図７は実施例１および２で得られたゲルを可視化した結
果を示している。 図８はゲルを可視化した結果を示しており、図中レーン
１−４は実施例３の結果を、レーン５−８は実施例４の
結果の比率を表わしており、レーン９はサイズマーカー
を表わしている。 図９は実施例４で得られたゲルの可視化の結果を示して
いる。 図10は所望のDNA二重体を増幅するカセットプラスミド
系の使用を図示している。 図11（ａ）,11（ｂ）および11（ｃ）は本発明の第５の
実施態様（線状増幅）を図示している。 図12は実施例５で得られたゲルの可視化の結果を示して
いる。 図13は実施例６で得られたゲルの可視化の結果を示して
いる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00
Claims (13)
- 【請求項１】試料中に含まれる一種以上の核酸内の少な
くとも一つの変異ヌクレオチドの有無を検出する方法で
あって、以下のことを含む方法： 適当なヌクレオシド３リン酸、ヌクレオシド３リン酸の
重合のための試薬、および標的塩基配列の診断領域のた
めの診断用プライマーによって、同時あるいは順に、ハ
イブリダイズ条件下で試料を処理すること、ここにおい
て該診断用プライマーのヌクレオチド配列は該診断領域
に実質的に相補的であり、診断用プライマーの３′末端
のヌクレオチドは予想される変異ヌクレオチドあるいは
それに対応する正常なヌクレオチドに相補的であり、そ
れによって診断用プライマーの該末端のヌクレオチドが
標的塩基配列中の対応するヌクレオチドと相補的である
場合には診断用プライマーの伸長産物が合成され、診断
用プライマーの該末端ヌクレオチドが標的塩基配列中の
対応するヌクレオチドと相補的でない場合には伸長産物
が合成されない：および、伸長産物の有無から推測され
る変異ヌクレオチドの有無を検出すること。 - 【請求項２】以下に述べることを含む特許請求の範囲第
１項記載の方法： １） 適当なヌクレオシド３リン酸、ヌクレオシド３リ
ン酸の重合のための試薬、標的塩基配列の診断領域のた
めの診断用プライマー、および対応する増幅用プライマ
ーによって、同時あるいは順に、ハイブリダイズ条件下
で試料を処理することであって、該診断用プライマーの
ヌクレオチド配列は該診断領域に実質的に相補的であ
り、診断用プライマーの３′末端のヌクレオチドは予想
される変異ヌクレオチドあるいはそれに対応する正常な
ヌクレオチドに相補的であり、それによって診断用プラ
イマーの該末端のヌクレオチドが標的塩基配列中の対応
するヌクレオチドと相補的である場合には診断用プライ
マーの伸長産物が合成され、診断用プライマーの該末端
ヌクレオチドが標的塩基配列中の対応するヌクレオチド
と相補的でない場合には伸長産物が合成されず：合成さ
れた診断用プライマーの伸長産物は全て、その相補鎖か
ら分離した後に該増幅用プライマーの伸長産物合成のた
めの鋳型として使用することができる： ２） 変性条件下で試料を処理し、上記伸長産物が形成
された鋳型からプライマー伸長産物を分離すること： ３） 過程２）で産生された１本鎖を、適当なヌクレオ
シド３リン酸、ヌクレオシド３リン酸の重合反応のため
の試薬、診断用プライマー、およびここで定義した増幅
用プライマーと、同時あるいは順に接触させ、それによ
って、可能な場合には過程２）で産生された１本鎖を鋳
型として用いてさらに伸長産物を合成させること： ４） 過程２）および３）を十分な回数繰り返し、適当
なヌクレオチド配列の増幅産物が検出できるようにする
こと： ５） 過程４）で得られた増幅産物の有無から、推測さ
れる変異体ヌクレオチドの有無を検出すること。 - 【請求項３】（ａ）第一の核酸配列の診断領域に実質的
に相補的な配列を有する第一の診断用プライマー（該第
一の診断用プライマーは、該推測される変異ヌクレオチ
ドに相補的な末端ヌクレオチドを有する）、および、第
二の核酸配列の診断領域に実質的に相補的な配列を有す
る第二の診断用プライマー（該第二の診断用プライマー
は、相補的な推測される変異ヌクレオチドに相補的な末
端ヌクレオチドを有する）：あるいは （ｂ）第一の核酸配列の診断領域に実質的に相補的な配
列を有する第一の診断用プライマー（該第一の診断用プ
ライマーは、該推測される変異ヌクレオチドに対応する
正常ヌクレオチドに相補的な末端ヌクレオチドを有す
る）、および、第二の核酸配列の診断領域に実質的に相
補的な配列を有する第二の診断用プライマー（該第二の
診断用プライマーは、該推測される変異ヌクレオチドに
対応する正常ヌクレオチドに相補的な末端ヌクレオチド
を有する）： の何れかで、同時あるいは順に試料を処理することを含
み、第一の診断用プライマーの該末端ヌクレオチド及び
第二の診断用プライマーの該末端ヌクレオチドが、それ
ぞれのプライマーの双方の３′側であり、第一の核酸配
列が第二の核酸配列の裏向きである、特許請求の範囲第
１項記載の方法。 - 【請求項４】最初に、推測される変異ヌクレオチドを含
む試料核酸の少なくとも一部を増幅し、それによって得
られた増幅産物を処理するための試料として用いること
を含む、特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項５】最初に、推測される変異ヌクレオチドを含
む試料核酸の少なくとも一部を増幅し、それによって得
られた増幅産物を処理するための試料として用いること
を含む、特許請求の範囲第３項記載の方法。 - 【請求項６】試料核酸処理を少なくとも一回繰り返し、
それにより同一の標的塩基配列を鋳型として用いて伸長
産物の線型増幅を行うことをさらに含む、特許請求の範
囲第１項記載の方法。 - 【請求項７】試料がヌクレオシド３リン酸の１、２、あ
るいは３で処理され、それによって、生成される伸長産
物がヌクレオシド３リン酸の１、２、あるいは３のみの
存在で可能な部位までしか伸長されない、特許請求の範
囲第６項記載の方法。 - 【請求項８】試料が３種のヌクレオシド３リン酸で処理
される、特許請求の範囲第７項記載の方法。 - 【請求項９】配列の３′末端ヌクレオチドが、既知の遺
伝的異常に関連した推測される変異ヌクレオチド、ある
いはそれに対応する正常ヌクレオチドの何れかと相補的
であり、該配列の残りが推測される変異ヌクレオチドあ
るいは対応する正常ヌクレオチドに隣接した対応する標
的塩基配列に実質的に相補的である、特許請求の範囲第
１項から第８項の何れか１項に記載の方法で使用するた
めの５から50bpのヌクレオチド配列を含む試薬。 - 【請求項１０】推測される変異ヌクレオチドが対応する
正常配列の点変異の結果である、特許請求の範囲第９項
記載の試薬。 - 【請求項１１】一つの配列の末端ヌクレオチドが既知の
遺伝的異常に関連した推測される変異ヌクレオチドに相
補的であり、もう一つの配列の末端ヌクレオチドが対応
する正常ヌクレオチドに相補的である、特許請求の範囲
第９項又は第10項に記載の二つの試薬の組。 - 【請求項１２】特許請求の範囲第１項から第８項の何れ
かに記載の方法で使用するためのキットで、以下のもの
を含むもの： １） 標的塩基配列の各診断領域のための診断用プライ
マーであって、各診断用プライマーのヌクレオチド配列
は、該診断領域に実質的に相補的であり、診断用プライ
マーの３′末端ヌクレオチドは推測される変異ヌクレオ
チドあるいはそれに対応する正常ヌクレオチドに相補的
であるもの： ２） ４種の異なるヌクレオシド３リン酸：および、 ３） ２）のヌクレオシド３リン酸の重合反応のための
試薬。 - 【請求項１３】一つの診断用プライマーの末端ヌクレオ
チドが既知の遺伝的異常に関連した推測される変異ヌク
レオチドに相補的で、もう一つの診断用プライマーの末
端ヌクレオチドが対応する正常ヌクレオチドに相補的で
ある、標的塩基配列の各診断領域のための二つの診断用
プラィマーの組を含む、特許請求の範囲第12項記載のキ
ット。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB888805692A GB8805692D0 (en) | 1988-03-10 | 1988-03-10 | Method of detecting nucleotide sequences |
| GB888814170A GB8814170D0 (en) | 1988-06-15 | 1988-06-15 | Method of detecting nucleotide sequences |
| GB8814170.0 | 1988-06-15 | ||
| GB8805692 | 1988-06-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0242999A JPH0242999A (ja) | 1990-02-13 |
| JP2853864B2 true JP2853864B2 (ja) | 1999-02-03 |
Family
ID=26293607
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1059492A Expired - Lifetime JP2853864B2 (ja) | 1988-03-10 | 1989-03-10 | ヌクレオチド配列を検出する方法 |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5595890A (ja) |
| EP (1) | EP0332435B2 (ja) |
| JP (1) | JP2853864B2 (ja) |
| KR (1) | KR970003151B1 (ja) |
| CN (1) | CN1034673C (ja) |
| AT (1) | ATE75262T1 (ja) |
| AU (1) | AU614584B2 (ja) |
| BR (1) | BR8901136A (ja) |
| CA (1) | CA1323592C (ja) |
| DE (1) | DE68901285D1 (ja) |
| DK (1) | DK175527B1 (ja) |
| ES (1) | ES2039294T5 (ja) |
| FI (1) | FI891126A (ja) |
| GR (2) | GR3004442T3 (ja) |
| HU (1) | HUT52565A (ja) |
| IE (1) | IE61148B1 (ja) |
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| MY (1) | MY104957A (ja) |
| NO (1) | NO174825B (ja) |
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| PL (1) | PL162338B1 (ja) |
| PT (1) | PT89980B (ja) |
| TN (1) | TNSN89026A1 (ja) |
| YU (1) | YU49789A (ja) |
| ZW (1) | ZW3388A1 (ja) |
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