PL162338B1 - do wykrywania sekwencji nukleotydów PL PL PL PL PL - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania sekwencji nuklrotydów, zwłaszcza obecności lub nieobecności jednego, lub więcej niżjednego wariantu sekwencji nukleotydów przez amplifikację lub jej nieobecność oraz zestaw diagnostyczny do wykrywania sekwencji nukleotydów.

Wynalazek jest szczególnie interesujący w diagnostycznym screeningu próbek DNA w stanach odziedziczonych, predyspozycjach lub mutacjach somatycznych i dostarcza, między innymi, ogólnego sposobu łatwego wykrywania mutacji punktowych. Jest on też użyteczny w wykrywaniu i typowaniu patogenów zakaźnych przez analizę ich DNA lub RNA.

Znanych jest u człowieka kilkaset chorób genetycznych, które wynikają z poszczególnych mutacji na poziomie DNA. Molekularna podstawa pewnych z tych chorób jest już znana i badania szybko doprowadzają do ujawnienia molekularnej podstawy tych chorób genetycznych, dla których charakter mutacji nie jest obecnie znany. Gdy nie jest znana molekularna podstawa stanów odziedziczonych, diagnozę zaburzenia lub umiejscowienie nośników można uzyskać w informatywnych rodowodach techniką RFLP stosując sondy DNA w genetycznym powiązaniu z miejscem choroby. Tak więc, obecnie, dystrofię mięśni Duchenne'a, zwłóknienie torbielowate i pląsawicę Huntingtona, między innymi, można, na przykład, diagnozować stosując technikę RFLP. Badanie to wymaga jednak oddzielnego przeprowadzenia w odniesieniu do każdego stanu i wymagana jest znaczna ilość pracy, gdyż w każdym przypadku wymaga się, między innymi, oczyszczania DNA, trawienia enzymami restrykcyjnymi, elektroforezy w żelu agarozowym, blottingu metodą Southerna, hybrydyzacji, wykrycia ehybrydyzowanrJ sondy genowej i analizy rodowodu. Co do innych niektórych stanów odziedziczonych wiadomo, że towarzyszą one jednopunktowym mutacjom w genach, ale każdy z tych stanów musi być analizowany oddzielnie i powstają dalsze określone trudności, gdy mutacje punktowe są niejednorodne. Tak na przykład, ponad 40 rozmaitych mutacji punktowych może spowodować j3--alasemię i co najmniej 5, a prawdopodobnie znacznie więcej niż 12, hemofilię A. W odniesieniu do tego niejednorodnego charakteru, każdy potencjalny punkt mutacji powinien obecnie być analizowany oddzielnie. Może to być związane z kompleksową analizą haplotypu RFLP z użyciem licznych enzymów restrykcyjnych.

Implikuje się pewną ilość mutacji punktowych w komórkach somatycznych w rozwoju rozmaitych nowotworów, np. mutacje punktowe w onkogenie ras [J.L. Boos i in., Naturę, 327, 293 (1987)].

Zgłoszenie patentu europejskiego nr 87 302 196.8 (Publikacja nr 237 362),Cetus Corporation, opisuje sposób wykrywania obecności lub nieobecności co najmniej jednej zmiany nukleotydów w sekwencji jednego, lub więcej niż jednego kwasu nukleinowego zawartego w próbce, który to sposób obejmuje:

(a) działanie na próbkę, łącznie lub kolejno, czterema różnymi trifosforanami nukleotydów, czynnikiem polimeryzacji trifosforanów nukleotydów, oraz jednym primerem oligonukleotydowym dla każdej nici każdego kwasu nukleinowego, co do którego oczekuje się, że

162 338 zawiera wspomnianą zmianę w warunkach hybrydyzacji, tak, że aby wykryć każdą nić kwasu nukleinowego zawierającego każdą odmienną zmianę syntetyzuje się produkt wydłużenia każdego primera komplementarny do każdej nici kwasu nukleinowego, zawierającego każdą odmienną zmianę, przy czym wspomniany primer, lub primery, wybiera się tak, aby był zasadniczo komplementarny do każdej nici kwasu nukleinowego zawierającego każdą odmienną zmianę, tak, że produkt wydłużenia syntetyzowany z jednego primera, gdy zostanie oddzielony od jego materiału komplementarnego, może służyć jako matryca do syntezy produktu wydłużenia innego primera, (b) działanie na próbkę w warunkach denaturujących w celu oddzielenia produktów wydłużenia primera od ich matryc, jeżeli obecna jest zmiana (zmiany), którą miało się wykryć, (c) działanie na próbkę, łącznie lub kolejno, wspomnianymi czterema trifosforanami nukleotydów, czynnikiem polimeryzacji tnfosforanów nukleotydów, primerami oligonukleotydowymi tak, że syntetyzowany jest produkt wydłużenia primera przy zastosowaniu każdej z pojedynczych nici wytworzonych w stadium (b)jako matrycy, przy czym stadia (b) i (c) powtarza się tyle razy, ile wystarcza do uzyskania wykrywalnej amplifikacji kwasu nukleinowego zawierajcego zmianę (zmiany) sekwencji, jeżeli jest obecna, (d) przytwierdzenie produktu ze stadium (c) do membrany, (e) działanie na membranę w warunkach hybrydyzacji znakowaną sondą oligonukleotydową specyficzną wobec sekwencji, zdolną do hybrydyzacji z sekwencją amplifikowanego kwasu nukleinowego tylko wtedy, jeżeli sekwencja sondy jest komplementarna do regionu amplifikowanej sekwencji, oraz (f) wykrycie, czy sonda zhybrydyzowała z amplifikowaną sekwencją w próbce kwasu nukleinowego.

Wykrycie obecności lub nieobecności co najmniej jednej zmiany nukleotydów może w pewnych specjalnych sytuacjach być osiągalne różnymi technikami. Tak więc, w rzadkich przypadkach, gdy mutacja punktowa tworzy lub niszczy miejsce restrykcyjne (np. w niedokrwistości sierpowatokomórkowej) trawienie enzymami restrykcyjnymi można zastosować albo przed, albo po amplifikacji [F.F. Chehab i in., Naturę, 329, 293 (1987)]. Oprócz tego, w odniesieniu do kwasu nukleinowego z dużą delecją w sekwencji, można otrzymywać primery do amplifikacji dla regionów z oczekiwaną delecją jak przy delecji 23 kilopar zasad powodującej σ-talasemię; w tych przypadkach niemożność amplifikowania sekwencji, która uległa delecji potwierdzają i przez to, na przykład, ma wartość diagnostczną w σ-talasemii [F.F. Chehab i in., Naturę, 329, 293 (1987)].

Sposób amplifikacji z Publikacji Europejskich Zgłoszeń Patentowych nr 237 362 zapewnia korzyści w stosunku do RFLP (polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych) i techniki oligonukleotydów specyficznych względem alleli, jak opisali np. Kan i Dozy, Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 75, 5631 (1978), Rubin i Kan, Lancet, 1985-1, 75 (1985), Conner i in., Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 80, 78 (1983), Kidd i in., Naturę, 304, 230 (1983) i Piratsu i in., New England Journal of Medidine, 309, 284 (1983).

Tym niemniej jednak, publikacja opisu patentu europejskiego nr 237 362 opisuje sposób związany z nieróżnicującą amplifikacją określonej sekwencji, o którą chodzi, nieuchronnie pociągającą za sobą potrzebę dużej ilości dalszych czasochłonnych stadiów wykrywania związanych albo z przyszłym użyciem znakowanej sondy oligonukleotydowej specyficznej wobec sekwencji, która może być niezbędna do odróżnienia sekwencji różniących się tak nieznacznie, jak tyko jednym nukleotydem i/lub użyciem specyficznej endonukleazy restrykcyjnej w tych ograniczonych przypadkach, gdy mutacja puntkowa, o którą chodzi, tworzy lub niszczy sekwencję rozpoznawaną przez enzymy i/lub z użyciem bezpośrednich metod sekwencjonowania amplifikowanego DNA [patrz C. Wong i in., Naturę, 330, 384 (1987)].

Istnieje zapotrzebowanie na prosty sposób bezpośredniego wykrywania różnicy dotyczącej co najmniej pojedynczej zasady w kwasach nukleinowych takich, jak genomowy DNA, w których stadia wykrywania są zminimalizowane, dając w wyniku sposób, którym można prowadzić proces szybko, dokładnie i łatwo, z minimalną tylko wprawą wykonującego.

Podstawę wynalazku stanowi odkrycie, ze przez wybranie sekwencji nukleotydów primera oligonukleotydowego w sposób najbardziej odpowiedni możliwe jest selektywne osiągnięcie wyd6

162 338 łużenia primera, albo o sekwencji zawierającej oczekiwany nukleotyd wariantowy, albo o odpowiedniej sekwencji zawierającej nukleotyd normalny, albo zapobieżenie temu wydłużeniu primera ze znacznym uproszczeniem w ten sposób niezbędnych sposobów wykrywania.

Według wynalazku sposób wykrywania obecności lub nieobecności co najmniej jednego wariantowego nukleotydu w jednym, lub więcej niz jednym kwasie nukleinowym zawartym w próbce, polega na działaniu na próbkę, łącznie lub kolejno, odpowiednimi trifosforanami nukleozydów, czynnikiem polimeryzacji trifosforanów nukleozydów i primerem diagnostycznym dla diagnostycznej części docelowej sekwencji zasad w warunkach hybrydyzacji, przy czym sekwencja nukleotydów wspomnianego primera diagnostycznego jest taka, ze jest zasadniczo komplementarna ze wspomnianą częścią diagnostyczną, nukleotyd końcowy primera diagnostycznego jest komplementarny albo z oczekiwanym wariantowym nukleotydem, albo z odpowiednim nukloetydem normalnym, przy czym produkt wydłużenia primera diagnostycznego jest syntetyzowany gdy wspomniany nukleotyd końcowy primera diagnostycznego jest komplementarny z odpowiednim nukleotydem w decelowej sekwencji zasad, a nie jest ten produkt wydłużenia syntetyzowany, gdy wspomniany końcowy nukleotyd primera diagnostycznego me jest komplementarny z odpowiednim nukleotydem w docelowej sekwencji zasad, oraz wykrywanie obecności lub nieobecności oczekiwanego nukleotydu wariantowego na podstawie obecności lub nieobecności produktu wydłużenia.

Należy zaznaczyć, że podczas gdy sposób według niniejszego wynalazku jest szczególnie interesujący przy wykrywaniu obecności lub nieobecności mutacji punktowych, sposób ten można również zastosować do wykrywania obecności lub nieobecności delecji, w tym delecji więcej niż jednego nukleotydu jak też obecności lub nieobecności substytucji więcej niż jednego nukleotydu. Pod tym względem jest po prostu niezbędne znanie stosownych nukleotydów, zwłaszcza stosownego końcowego nukleotydu, tak, że można odpowiednio wyznaczyć niezbędny primer diagnostyczny (primery diagnostyczne).

Należy zaznaczyć, że każdy wytworzony produkt wydłużenia można wykryć w jakikolwiek dogodny sposób, np. jako postać jedno- lub dwuniciową.

Dalej należy zaznaczyć, że każdy wytworzony produkt wydłużenia można, jeżeli jest to pożądane, amplifikować stosując polimerazową reakcję łańcuchową (PCR), jak opisano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 4 683 195 i 4 683 202, przez zastosowanie Q-j3 replikazy, jak opisano w PCT Patent Publication W087/062701 w Biotechnology, tom 6, październik 1988, przez zastosowanie amplifikacji kwasu nukleinowego na podstawie transkrypcji z Siska Corporation, jak opisano w PCT Patent Publication WO88/1O315, albo przez zastosowanie amplifikacji liniowej. W związku z tym, wyrażenia „amplifikacja liniowa używa się w niniejszym opisie w odniesieniu do amplifikacji przy użyciu pojedynczego primera dla każdej części diagnostycznej w obecności czynnika polimeryzacji i odpowiednich trifosforanów nukleotydów, przez co przeprowadza się amplifikację przez wydłużenie primera w oparciu o użycie jako matrycy pojedynczej nici kwasu nukleinowego w próbce.

W pierwszym i szczególnie korzystnym sposobie realizacji wynalazku, sposób obejmuje:

działanie na próbkę, łącznie lub kolejno, odpowiednimi trifosforanami nukleozydów, czynnikiem polimeryzacji trifosforanów nukleozydów, primerem diagnostycznym dla diagnostycznej części docelowej sekwencji zasad i odpowiednim primerem amplifikacji w warunkach hybrydyzacji, przy czym sekwencja nukleotydów wspomnianego primera diagnostycznego jest taka, że jest zasadniczo komplementarna ze wspomnianą częścią diagnostyczną, końcowy nukleotyd primera diagnostycznego jest komplementarny albo z oczekiwanym nukleotydem wariantowym, albo z odpowiednim nukleotydem normalnym, przy czym produkt wydłużenia primera diagnostycznego jest syntetyzowany gdy wspomniany nukleotyd końcowy primera diagnostycznego jest komplementarny z odpowiednim nukleotydem w docelowej sekwencji zasad, a nie jest ten produkt wydłużenia syntetyzowany, gdy wspomniany nukleotyd końcowy primera diagnostycznego nie jest komplementarny z odpowiednim nukleotydem w docelowej sekwencji zasad i każdy wytworzony produkt wydłużania primera diagnostycznego nadaje się do służenia jako matryca do syntezy

162 338 7 produktu wydłużenia wspomnianego primera amplifikacji po oddzieleniu od jego materiału komplementarnego,

2/ działanie na próbkę w warunkach denaturujących w celu oddzielenia produktu wydłużenia primera od jego matrycy, gdy wspomniany produkt wydłużania primera został wytworzony.

3/ kontaktowanie pojedynczych mci wytworzonych w stadium (2), albo łącznie, albo kolejno, z odpowiednimi trifosforanami nukleozydów, czynnikiem polimeryzacji trifosforanów nukleozydów, primerem diagnostycznym i primerem amplifikacji jak zdefiniowano w niniejszym opisie, przez co, gdy jest to możliwe, syntetyzuje się dalsze produkty wydłużania, stosując pojedyncze nici wytworzone w stadium (2) jako matryce,

4/ powtarzanie stadiów (2) i (3) wystarczającą ilość razy by uzykać wykrywalną amplifikację odpowiedniej sekwencji nukleotydów, oraz 5/ wykrycie obecności lub nieobecności oczekiwanego nukleotydu wariantowego na podstawie obecności lub nieobecności produktu amplifikacji otrzymanego w stadium (4).

W drugim sposobie realizacji niniejszego wynalazku działa się na wspomnianą próbkę, łącznie lub kolejno, albo (a) pierwszym primerem diagnostycznym o sekwencji zasadniczo komplementarnej do części diagnostycznej sekwencji pierwszego kwasu nukleinowego, pierwszy primer diagnostyczny ma końcowy nukleotyd komplementarny ze wspomnianym oczekiwanym nukleotydem wariantowym, oraz drugim primerem diagnostycznym o sekwencji zasadniczo komplementarnej z częścią diagnostyczną sekwencji drugiego kwasu nukleinowego, drugi pirmer diagnostyczny ma końcową sekwencję komplementarną z oczekiwanym jako komplementarnym nukleotydem wariantowym, albo (b) pierwszym primerem diagnostycznym o sekwencji zasadniczo komplementarnej z częścią diagnostyczną sekwencji pierwszego kwasu nukleinowego, przy czym pierwszy primer diagnostyczny ma nukleotyd końcowy komplementarny z nukleotydem normalnym, który odpowiada wspomnianemu oczekiwanemu nukleotydowi wariantowemu, oraz drugim primerem diagnostycznym o sekwencji zasadniczo komplementarnej do części diagnostycznej sekwencji drugiego kwasu nukleinowego, przy czym drugi primer diagnostyczny ma nukleotyd końcowy komplementarny z nukleotydem normalnym, który odpowiada wspomnianemu oczekiwanemu nukleotydowi wariantowemu; wspomniany nukleotyd końcowy pierwszego primera diagnostycznego i wspomniany nukleotyd końcowy drugiego primera diagnostycznego występują albo oba przy 5'-końcu, albo oba przy 3'-końcu odpowiednich primerów i sekwencja pierwszego kwasu nukleinowego ma sens odwrotny do sekwencji drugiego kwasu nukleinowego. Toteż, w tym sposobie realizacji, drugi primer diagnostyczny można uważać za primer amplifikacji jak podano powyżej i w dalszej części niniejszego opisu.

Ten drugi sposób realizacji może umożliwić wyróżnianie i wzrost specyficzności, gdyż każdy produkt artefaktowy wymaga prymowama na stosownym zakończeniu (na ogół zakończeniu 3') dwóch błędnie skojarzonych nukleotydów, a nie na pojedynczym końcu, jak w tym przypadku, w którym używa się tylko pojedynczego primera diagnostycznego.

Wykrycia obecności lub nieobecności oczekiwanego nukleotydu wariantowego można dokonać np. sposobem opisanym w dalszej części niniejszego opisu.

W trzecim sposobie realizcji wynalazku poddaje się próbkę DNA zawierającego oczekiwany nukleotyd wariantowy amplifikacji, np. na drodze amplifikacji liniowej, jak zdefiniowano w niniejszym opisie, np. tak, jak to opisano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 4683 195 i 4683 202, w PCT Patent Publication W087/06270, w Biotechnology, tom 6, październik 1988 lub w PCT Patent Publication WO88/1O315 i na produkt amplifikacji działa się primerem diagnostycznym dla diagnostycznej części docelowej sekwencji zasad w warunkach hybrydyzacji, w obecności odpowiednich trifosforanów nukleozydów i czynnikiem polimeryzacji trifosforanów nukleozydów, przy czym sekwencja nukleotydów wspomnianego primera diagnostycznego jest taka, że jest on zasadniczo komplementarny ze wspomnianą częścią diagnostyczną, a nukleotyd końcowy primera diagnostycznego jest komplementarny albo z oczekiwanym nukleotydem wariantowym, albo z odpowiednim nukleotydem normalnym.

Tak więc, w trzecim sposobie realizacji zwykłą amplifikację przeprowadzić można w pożądanej ilości cykli i z hybrydyzacją z primerem diagnostycznym podjętą w stadium następnym, przed stadium wykrywania. Nie ma potrzeby zastosowania primera amplifikacji.

Trzeci sposób realizacji budzi zainteresowanie, ponieważ można znacznie zmniejszyć wymaganą ilość czynnika (czynników) polimeryzacji (np. co najmniej o połowę), tak jak i ilość użytych trifosforanów nukleozydów i ilość urządzeń ogrzewczych do Polimerazowej Reakcji Łańcuchowej (PCR). Tak więc, trzeci sposób realizacji ułatwia uzyskanie znacznej oszczędności jeśli chodzi o koszty. Co więcej, ponieważ stadium amplifikacji można przeprowadzić w zakresie dogodnych temperatur, bez niedogodności, ten trzeci sposób realizacji wymaga jedynie tego, żeby bardziej wrażliwe na temperaturę stadium hybrydyzacji z sondą diagnostyczną przeprowadzić od razu, zmniejszając dzięki temu jeszcze dalsze ryzyko fałszywego prymowania końcowego błędnego skojarzenia (na ogół 3'-skojarzenia) primera diagnostycznego. Ten trzeci sposób realizacji zapewnia więc potencjalnie bardziej wiarygodny i pewny sposób do wykorzystania przez niefachowców, bardziej tolerancyjny wobec błędu. Dalej, ten trzeci sposób realizacji pozwala ominąć zapotrzebowanie na specjalne stadium ograniczania polimerazowej reakcji łańcuchowej, ponieważ początkowa amplifikacja zapewnia swoje własne, wewnętrzne, ograniczenie.

Jeżeli jest to pożądane, primer diagnostyczny może nieść sygnał lub piętno, co nie powinno być połączone z ryzykiem zniszczenia, np. w technice cyklicznej w wysokiej temperaturze, takiej jak PCR. Znakowanie przeprowadzić można np. stosując odpowiednie znakujące lub sygnalizujące ugrupowanie, takie jak fosfataza alkaliczna lub peroksydaza z chrzanu, jak to opisano.

Pod tym względem interesujące może być zastosowanie do znakowania enzymów termostabilnych, takich jak fosfataza otrzymana z Thermus aquaticus.

Czwarty i korzystny sposób realizacji wynalazku modyfikuje trzeci sposób jego realizacji przez wprowadzenie jako cechy znamiennej zastosowania dwóch primerów diagnostycznych, jak opisano w drugim sposobie realizacji wynalazku, przy czym drugi primer diagnostyczny potencjalnie służy jako primer amplifikacji.

Tak więc, w czwartym sposobie realizacji wynalazku, próbkę zawierającą DNA obejmujący oczekiwany nukleotyd wariantowy, poddaje się amplifikacji i na amplifikowany produkt działa się, łącznie lub kolejno, albo; a/ pierwszym primerem diagnostycznym o sekwencji zasadniczo komplementarnej do części diagnostycznej sekwencji pierwszego kwasu nukleinowego, przy czym pierwszy primer diagnostyczny ma nukleotyd końcowy komplementarny ze wspomnianym oczekiwanym nukleotydem wariantowym, oraz drugim primerem diagnostycznym o sekwencji zasadniczo komplementarnej z częścią diagnostyczną drugiej sekwencji kwasu nukleinowego, przy czym drugi primer diagnostyczny ma końcowy nukleotyd komplementarny z nukleotydem, który jest komplementarny ze wspomnianym oczekiwanym nukleotydem wariantowym, albo b/pierwszym primerem diagnostycznym o sekwencji zasadniczo komplementarnej z częścią diagnostyczną sekwencji pierwszego kwasu nukleinowego, przy czym pierwszy primer diagnostyczny ma końcowy nukleotyd komplementarny z nukleotydem normalnym, który odpowiada wspomnianemu oczekiwanemu nukleotydowi wariantowemu, oraz drugim primerem diagnostycznym o sekwencji zasadniczo komplementarnej z częścią diagnostyczną drugiego kwasu nukleinowego, przy czym drugi primer diagnostyczny ma końcowy nukleotyd komplementarny z nukleotydem, który jest komplementarny ze wspomnianym nukleotydem normalnym odpowiadającym wspomnianemu oczekiwanemu nukleotydowi wariantowemu, przy czym wspomniany nukleotyd końcowy pierwszego primera diagnostycznego i wspomniany drugi primer diagnostyczny są oba albo przy 5'-końcu, albo oba przy 3'-końcu odpowiednich primerów i sekwencja pierwszego kwas nukleinowego jest komplementarna z sekwencją drugiego kwasu nukleinowego.

Na ogół, wspomniany nukleotyd końcowy pierwszego primera diagnostycznego i wspomniany nukleotyd końcowy drugiego primera diagnostycznego oba występują przy 3' -końcu odpowiednich primerów.

Czwarty sposób realizacji wynalazku łączy więc potencjalne korzyści powyżej zdefiniowanych: drugiego i trzeciego sposobu realizacji wynalazku, którym są, między innymi: potencjalny wzrost specyficzności, obniżony koszt oraz pewniejsza i sprzyjająca użytkownikowi technika.

Wykrycie obecności lub nieobecności oczekiwanego nukleotydu wariantowego można przeprowadzić np. tak, jak to opisano w dalszej części niniejszego opisu.

Należy zaznaczyć, że amplifikowany produkt, na który podziałano albo jak w (a), albo jak w (b), jak uprzednio zdefiniowano w niniejszym opisie, można poddać, jeżeli jest to pożądane,

162 338 jednemu, lub więcej niż jednemu cyklowi. Gdy przeprowadza się różnorodne cykle, można uzyskać dalszy produkt, będący hybrydą produktów wydłużania primerów diagnostycznych. Rozmaite produkty tworzyć się będą w stosunkach zależnych od względnych stosunków oryginalnej PCR (polimerazowa reakcja łańcuchowa) primerowych oligonuklotydów i dodanych diagnostycznych oligonukleotydów primerowych.

Gdy amplifikację przeprowadza się przez zastosowanie albo primerów: diagnostycznego i amplifikacji, albo dwóch primerów diagnostcznych, np. jak opisano w pierwszym i drugim sposobie postępowania przy amplifikacji opisanego w publikacji opisu patentu europejskiego nr 237 362, stadia (a) denaturacji w celu oddzielenia produktów wydłużania primera od ich matrycy i (b) kontaktowania pojedynczych nici tak otrzymanych, albo łącznie, albo kolejno, z odpowiednimi trofosforanami nukleozydów, czynnikiem polimeryzacji trifosforanów nukleozydów i stosownych primerów wydłużania, korzystnie powtarza się co najmniej 5 razy (cykle) aż do nieokreślonej ich liczby, zwłaszcza gdy primer jest oporny na amplifikację, bez uszczerbku dla wynalazku. Korzystniej stosuje się 15-60, np 15-30 razy (cykli) jeżeli próbka zawiera ludzki DNA genomowy. Jeżeli próbka zawiera komórki, korzystnie ogrzewa się je przed stadium (a) w celu eskponowania ich kwasów nukleinowych na reagenty. W tym stadium omija się oczyszczanie kwasów nukleinowych przed dodaniem reagentów. W tym względzie należy zaznaczyć, że wynalazek przedstawia sobą znaczne ulepszenie w stosunku do poprzednich sposobów postępowania, nawet jeżeli oczyszczanie DNA z próbki przeprowadza się przed przystąpieniem do amplifikacji.

Należy zdawać sobie sprawę z tego, że w stadium (b) kontakt między pojedynczymi nićmi wytworzonymi w stadium (s) i odpowiednimi trifosforanami nukleozydów, czynnikiem polimeryzacji trifosforanów nukleozydów, primerem (primerami), np. primerem (primerami) diagnostycznym, i/lub primerem (primerami) amplifikacji można zrealizować albo za pomocą dodania tych materiałów do mieszaniny reakcyjnej po oddzieleniu produktu wydłużania primera od jego matrycy (stadium a), albo tez oprzeć się można na materiałach już występujących w mieszaninie reakcyjnej. Rzeczywiście, w każdym stadium sposobu według wynalazku dodać można jakiegokolwiek jednego, lub więcej, różnych trifosforanów nukleozydów i/lub czynnika polimeryzacji i/lub primera (primerów), np. primera (primerów) diagnostycznego i/lub primera (primerów) amplifikacji.

Piątym i korzystnym sposobem realizacji wynalazku jest sposób jak zdefiniowano w powyższej części niniejszego opisu, w którym amplifikacji dokonuje się za pomocą wydłużenia primera w oparciu o zastosowanie pojedynczej nici kwasu nukleoinowego próbki jako matrycy.

Tak więc, w tym sposobie realizacji wydłużenie primera uzyskuje się w oparciu o zastosowanie tej samej nici kwasu nukleinowego jako próbki, przy czym nieobecny jest primer amplifikacji. Stąd też amplifikacja ma charakter raczej arymetryczny niż wykładniczy. Amplifikacja wykładnicza jest osiągalna, przynajmniej w teorii, w przypadku polimerazowych reakcji łańcuchowych (PCR). Korzyść odnoszona z tego piątego sposobu realizacji wynalazku (określanego także w tekście niniejszego opisu jako amplifikacja liniowa) polega na tym, że produkty artefaktowe, jeżeli powstaną, nie mogą podlegać amplifikacji wykładniczej.

Amplifikację liniową przeprowadzić można z wykorzystaniem każdych dogodnych środków. I tak, można jej dokonać za pomocą użycia komplementarnych trifosforanów nukleozydów w obecności czynnika polimeryzacji trifosforanów nukleozydów w celu wytworzenia produktów wydłużania primera o nieokreślonej długości gdy istnieje wystarczający stopień komplementarności między primerem diagnostycznym i kwasem nukleinowym próbki.

Korzystnie, gdy ma się zastosować wszystkie komplementarne trifosforany nukleozydów, kwas nukleinowy próbki poddaje się trawieniu endonukleazą, przy czym endonukleazę restrykcyjną dobiera się tak, aby zapewnić to, ze rozszczepienia kwasu nukleinowego próbki dokonuje się w miejscu odpowiednim do dopuszczenia wytworzenia produktów wydłużenia primera o ustalonej długości. Tym niemniej jednak, można przeprowadzić korzystnie amplifikację liniową w obecności tylko 1, korzystnie tylko 2 lub dogodnie tylko 3 trifosforanów nukleozydów, tak, że primer diagnostyczny w jego stanie związanym (to jest zhybrydyzowanym z kwasem nukleinowym próbki) może rozciągać się tylko tak daleko, jak na to pozwoli obecność 12 lub 3 trifosforanów nukleozy10

162 338 dów. Gdy w kwasie nukleinowym próbki obecny jest trifosforan nukleozydu, dla którego nie ma komplementarnego trifosforanu nukleozydu, to wydłużanie primera ustanie.

Jeżeli jest to pożądane, można przeprowadzić amplifikację liniową w temperaturze topnienia (Tm) sekwencji. W tej temperaturze primer diagnostyczny zhybrydyzowany z komplementarną sekwencją w kwasie nukleinowym próbki istnieje w równowadze z wolnym primerem diagnostycznym w roztworze i tak primer diagnostyczny (ewentualnie w postaci rozciągniętej) zostaje szybko zhybrydyzowany i zdenaturowany z kwasu nukleinowego próbki. Jeżeli jest to pożądane, amplifikację liniową próbki można także przeprowadzić za pomocą ascylacji termicznej, która byłaby na ogół związana z szybką fluktuacją temperatury około temperatury topnienia sekwencji.

Jeżeli obecne są jedynie 1 2 lub 3 trifosforany nukleozydów, to primer diagnostyczny będzie rozciągać się tylko tak daleko, jak na to pozwoli obecność tych trifosforanów nukleozydów. Jak wskazano powyżej, gdy zaistnieje błędne skojarzenie między np. 3'-zakończeniem primera diagnostycznego i odpowiednim trifosforanem nukleozydu w kwasie nukleinowym próbki, nie nastąpi wydłużanie primera. Gdy jednak, 3'-końcowy trifosforan nukleozydu jest komplementarny z odpowiednim trifosforanem nukleozydu w kwasie nukleinowym próbki, wydłużanie primera nastąpi.

Gdy używa się tylko 1, 2 lub 3 trifosforanów nukleozydów, i są one w użyciu, końcowy trifosforan nukleozydu rozciągniętego primera diagnostycznego zostaje użyty tylko raz, a potem może okazać się korzystne użycie trifosforanu dideoksynukleozydu jako trifosforanu nukleozydu, który w użyciu stanowić będzie końcowy trifosforan nukleozydu produktu wydłużania primera diagnostycznego. Będzie to pomagać w wytworzeniu wyraźnie zakończonego wydłużenia primera diagnostycznego.

Jeżeli jest to pożądane, jeden lub więcej niż jeden spośród trifosforanów nukleozydów obecnych w mieszaninie reakcyjnej w celu włączenia do wydłużanego primera (primerów) można piętnować lub znakować w jakikolwiek dogodny sposób. I tak np., jeden, lub więcej niż jeden spośród trifosforanów nukleozydów może być znakowany fluorescencyjnie. To znakowanie trifosforanów nukleozydów budzi szczególne zainteresowanie w odniesieniu do piątego sposobu realizacji wynalazku, w którym wytwarzanie produktu wydłużania primera diagnostycznego można wykryć przez wykrywania piętnowanego lub znakowanego trifosforanu (trifosforanów) nukleozydu włączonego do produktu wydłużania. Gdy nie tworzy się produkt wydłużania, nie ma miejsca włączanie i piętnowane lub znakowane trifosforany nukleozydów mogą być, np. wymyte. Bardziej szczegółowo, piąty sposób realizacji wynalazku omija problem amplifikacji produktów artefaktowych i dzięki temu umożliwia osiągnięcie dobrego zróżnicowania w obecności piętnowanego lub znakowanego trifosforanu (trifosforanów) nukleozydu. Gdy dokonuje się amplifikacji np. za pomocą użycia PCR jakiekolwiek wytwarzanie produktu artefaktowego może dać w wyniku amplifikację tego produktu i przez to włączanie piętnowanego lub znakowanego trifosforanu nukleozydu, zmniejszając w wyniku tego zróżnicowanie.

W uzupełnieniu powyższego, może być pożądane, aby primer diagnostyczny niósł jednego z członków immunologicznie wiążącej się pary, np. antygen lub przeciwciało, lub jednego z członków pary tworzącej kompleks, np. biotynę, do połączenia się z drugim członkiem wspomnianej wiążącej się pary lub pary tworzącej kompleks, w celu zatrzymania na fazie stałej.

Wynalazek dotyczy także zestawu do wykrywania obecności lub nieobecności co najmniej jednego nukleotydu wariantowego w jednym, lub więcej niż jednym kwasie nukleinowym zawartym w próbce, który to zestaw obejmuje: (1) primer diagnostyczny dla każdej diagnostycznej części docelowej sekwencji zasad, przy czym sekwencja nukleotydów każdego primera diagnostycznego jest taka, że jest on zasadniczo komplementarny ze wspomnianą częścią diagnostyczną, przy czym końcowy nukleotyd primera diagnostycznego jest komplementarny albo ze wspomnianym nukleotydem wiariantowym, albo z odpowiednim nukleotydem normalnym tak, że w użyciu syntetyzowany jest produkt wydłużania primera diagnostycznego, gdy wspomniany końcowy nukleotyd primera diagnostycznego jest komplementarny z odpowiednim nukleotydem w docelowej sekwencji zasad, a produkt wydłużania nie jest syntetyzowany, gdy wspomniany nukleotyd końcowy primera diagnostycznego nie jest komplementarny z odpowiednim nukleotydem w docelowej

162 338 11 sekwencji zasad, (2) każdy z czterech różnych trifosforanów nukleozydów, oraz (3) czynnik polimeryzacji trifosforanów nukleozydów w (2).

Korzystnie zestaw według wynalazku dodatkowo zawiera primer amplifikacji odpowiadający każdemu primerowi diagnostycznemu, przy czym sekwencja nukleotydów primera amplifikacji jest taka, że każdy produkt wydłużania odpowiedniego primera diagnostycznego może po oddzieleniu do jego materiału komplementarnego służyć jako matryca do syntezy produktu wydłużania primera amplifikacji. I tak np., zestaw według wynalazku zawiera któryś, lub oba, z zestawów primerów diagnostycznych wyszczególnionych powyżej w odniesieniu do drugiego sposobu realizacji wynalazku, jak zdefiniowano powyżej.

Zestaw według wynalazku może także, jeżeli jest to pożądane, obejmować wewnętrzne primery kontrolne, tam, gdzie jest to właściwe.

Tym niemniej jednak, szczególnie korzystne jest, aby zestaw według wynalazku obejmował primery PCR (polimerazowa reakcja łańcuchowa) i primer diagnostyczny (jak wyżej zdefiniowano) w odniesieniu do każdego oczekiwanego nukleotydu wariantowego. Jeżeli jest to pożądane, zestaw może dodatkowo zawierać któryś, lub oba, z zestawów primerów diagnostycznych wyszczególnionych powyżej w odniesieniu do drugiego sposobu realizacji wynalazku.

Każdy z materiałów wyszczególnionych w (i), (2) i (3) i/lub primer amplifikacji można dokładnie zapakować w oddzielny pojemnik, ale, korzystnie, wszystkie można połączyć w pojedynczym pojemniku, do którego dodaje się materiał przeznaczony do zanalizowania. Korzystnie pojedynczy pojemnik dodatkowo zawiera bufor.

Należy rozumieć, że gdy zestaw według wynalazku zawiera obydwa zestawy primerów diagnostycznych (a) i (b) wyszczególnionych powyżej w odniesieniu do drugiego sposobu realizacji wynalazku, obydwa zestawy primerów diagnostycznych nie będą wspólnie obecne w pojedynczym pojemniku, aczkolwiek każdy zestaw primerów może być obecny wspólnie z każdym z materiałów wyszczególnionych w (2) i (3) ι/lub primerami amplifikacji w oddzielnych pojemnikach. Gdy próbkę, która ma być badana, powinna być wstępnie amplifikowana według publikacji opisu patentu europejskiego nr 237 362, może okazać się korzystne włączenie primerów PCR, jak również primera (primerów) diagnostycznych w pojedynczym pojemniku wspólnie z materiałami z (2) i (3) powyżej. Tym niemniej, jeżeli jest to pożądane, primer (primery) diagnostyczny może być obecny w oddzielnym pojemniku do dalszego użycia po przeprowadzeniu amplifikacji.

Termin „trifosforan nukleozydu“ używa się w niniejszym opisie do nukleozydów obecnych albo w DNA, albo w RNA i przez to obejmuje on nukleozydy, do których jako zasada włączonajest adenina, cytozyna, guanina, tymina i uracyl, a ugrupowaniem cukrowym jest deoksyryboza lub ryboza. Ogólnie, deoksyrybonukleozydy stosuje się w połączeniu z polimerazą DNA. Tym nie mniej jednak, należy zdawać sobie sprawę z tego, że można zastosować inne zmodyfikowane zasady zdolne do tworzenia par zasad z jedną ze zwykłych zasad, adeniną, cytozyną, guaniną, tyminą i uracylem. Do tych zmodyfikowanych zasad należy np. 8-azaguanina i hipoksantyna.

Termin „nukleotyd“, tak jak stosuje się go w niniejszym opisie, może odnosić się do nukleotydów obecnych albo w DNA albo w RNA, tak więc obejmuje on nukleotydy, do których jako zasada włączona jest adenina, cytozyna, guanina, tymina i uracyl, a ugrupowaniem cukrowym jest deoksyryboza lub ryboza. Tym niemniej jednak, należy zdawać sobie sprawę z tego, że można użyć w primerze diagnostycznym i primerze amplifikacji stosowanych w niniejszym wynalazku, innych zmodyfikowanych zasad zdolnych do tworzenia par zasad z jedną ze zwykłych zasad, adeniną, cytozyną, guaniną, tyminą i uracylem. Te zmodyfikowane zasady obejmują np. 8-azaguaninę i hipoksantynę.

Należy podkreślić, że gdy sposobu według wynalazku używa się do wykrycia obeności lub nieobecności oczekiwanego nukleotydu wariantowego, który sąsiaduje z częścią docelowej sekwencji zasad nie zawierającą wszystkich czterech różnych nukleotydów, to produkt wydłużania primera diagnostycznego i, jeżeli jest to pożądane, produkt wydłużania primera amplifikacji można tworzyć w obecności tylko właściwych odpowiednich trifosforanów nukleozydów i wszystkie cztery różne trifosforany nukleozydów mogą nie być potrzebne.

Czynnikiem polimeryzacji trifosforanów nukleozydów może być każdy związek lub układ, który będzie działać w kierunku dokonania syntezy produktu wydłużania primera, włącznie z

162 338 enzymami. Do odpowiednich w tym zastosowaniu enzymów należy np. polimeraza DNA IE. coli, fragment Klenowa polimerazy DNA I E. coli, polimeraza DNA T4, inne dostępne polimerazy DNA, odwrotna transkryptaza i inne enzymy, włącznie z enzymami termostabilnymi. Termin „enzym termostabilny tak jak stosuje się go w mniejszym opisie, odnosi się do enzymu, który jest stabilny przy ogrzewaniu i oporny na ciepło, a także katalizuje (ułatwia) połączenie nukleotydów w prawidłowy sposób z utworzeniem produktów wydłużania primera, które to produkty są komplementarne z każdą nicią kwasu nukleinowego. Na ogół synteza inicjowana będzie na końcu 3' każdego primera i będzie postępować w kierunku 5' wzdłuz nici matrycowej aż do zkończenia syntezy, tworząc cząsteczki o różnej długości. Tym niemniej jednak, mogą istnieć enzymy, na przykład enzymy termostabilne, które inicjują syntezę na końcu 5' i synteza ta postępuje w odmiennym kierunku przy zastosowaniu tego samego procesu, jak opisano powyżej.

Korzystnym enzymem termostabilnym, który można zastosować w sposobie według wynalazku, jest enzym, który można ekstrahować i oczyścić z Thermus aquaticus. Enzym ten ma masę cząsteczkową około 86000-90000 daltonów, jak opisano w publikacji opisu patentu europejskiego nr 237362 (patrz także publikacja opisu patentu europejskiego nr 258017). Thermus aquaticus szczep YT1 jest dostępny bez ograniczeń w American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Mary-land, USA, jako ATCC 25 104

Wyrażenie „część diagnostyczna, tak jak się go używa w niniejszym opisie, oznacza tę część docelowej sekwencji zasad (jak zdefiniowano w dalszej części niniejszego opisu), która zawiera jako swój końcowy nukleotyd potencjalny nukleotyd wariantowy, którego obecność lub nieobecność ma być wykryta. Ogólnie, potencjalny nukleotyd wariantowy będzie się znajdować na 5'zakończeniu części diagnostycznej, ponieważ na ogół synteza produktów wydłużania primera będzie inicjowana na końcu 3' każdego primera, jak opisano powyżej. Tym niemniej jednak, gdy ma użyć czynnika polimeryzacji, który inicjuje syntezę na końcu 5' primera diagnostycznego i postępuje ona w kierunku 3' wzdłuż nici matrycowej, az do zakończenia się syntezy, „część diagnostyczna będzie zawierać potencjalny nukleotyd wariantowy na swoim końcu 3'. Primery diagnostyczne zostaną również prawidłowo, pod tym względem, zaprojektowane, jak to podano poniżej.

Wyrażenie „docelowa sekwencja zasad, tak jak się go używa w niniejszym opisie, oznacza sekwencję nukleotydów zawierającą co najmniej jedną część diagnostyczną (jak zdefiniowano w poprzedniej części niniejszego opisu). I tak np., w pojedynczym teście dotyczącym /3-talasemii sekwencja docelowa może obejmować do 60, np. 50 części diagnostycznych, przy czym każda część diagnostyczna zawiera pojedynczy potencjalny nukleotyd wariantowy.

Termin „oligonukleotyd, tak jak się go używa w niniejszym opisie, obejmuje dwa, lub więcej niż dwa deoksyrybonukleotydy lub rybonukleotydy, korzystnie więcej niż trzy. Dokładna jego wielkość zależeć będzie od wielu czynników, takich jak temperatura reakcji, stężenie soli, obecność formamidu i obecność innej bliskiej mutacji (lub więcej mz jednej mutacji), tak jak w chorobie sierpowatokomórkowej Hb C, co z kolei zależy od ostatecznej funkcji lub zastosowania oligonukleotydu. Dokładna sekwencja oligonukleotydu może również zależeć od pewnej liczby czynników opisanych w poprzedniej części niniejszego opisu. Oligonukleotyd można otrzymać syntetycznie lub za pomocą klonowania.

Termin „primer, tak jak się go używa w niniejszym opisie, odnosi się do oligonukleotydu, czy to występującego w naturze, jak oczyszczonej pozostałości po trawieniu restrykcyjnym, czy to wytworzonego syntetycznie, który jest zdolny do działania jako punkt inicjacji syntezy, gdy znajduje się w warunkach, w których indukowana jet synteza produktu wydłużania primera komplementarnego do nici kwasu nukleinowego, to jest w obecności odpowiednich trifosforanów nukleozydów i czynnika polimeryzacji, takiego jak polimeraza DNA w odpowiednim buforze (termin „bufor obejmuje pH, siłę jonową, kofaktory ltd) i w odpowiedniej temperaturze.

Primer korzystnie jest jednoniciowy, a to dla maksymalnej wydajności przy amplifikacji, ale alternatywnie może on być dwuniciowy. Jeśli jest dwuniciowy, najpierw działa się na niego tak, aby rozdzielić jego nici przed zastosowaniem do otrzymywania produktów dwuniciowych. Korzystnie primer jest oligonukleotydem. Musi on być wystarczająco długi, aby prymować syntezę produktów wydłużania w obecności czynnika polimeryzacji. Dokładna długość primerów zależeć będzie od

162 338 wielu czynników, w tym temperatury oraz źródła primera i zastosowanej metody. I tak np., w zależności od skomplikowania sekwencji docelowej, primery: diagnostyczny i amplifikacji typowo zawierają 12-35, np. 15-35 nukleotydów, aczkolwiek mogą one zawierać więcej lub mniej nukleotydów. Krótka cząsteczka primera na ogół wymaga niższej temperatury do utworzenia wystarczająco stabilnych kompleksów hybrydowych z matrycą.

Termin „komplementarny z“ używany jest w niniejszym opisie do określania nukleotydu, który będzie tworzyć parę zasad z innym specyficznym nukleotydem. Tak trifosforan adenozyny jest komplementarny z trifosforanem urydyny, albo trifosforanem tymidyny i trifosforan guanozyny jest komplementarny z trifosforanem cytydyny. Należy zdawać sobie sprawę z tego, że chociaż trifosforan tymidyny i trifosforan guanozyny mogą tworzyć parę zasad w pewnych okolicznościach, nie są uważane za komplementarne dla celów niniejszego opisu. Należy też rozumieć, że chociaż trifosforan adenozyny i trifosforan cytozyny mogą tworzyć parę zasad w pewnych okolicznościach, nie są uważane za komplementarne dla celów niniejszego opisu. To samo stosuje się do trifosforanu cytozyny i trifosforanu uracylu.

Primery w niniejszym opisie są tak wybierane, aby były „zasadniczo komplementarne z różnymi niciami każdej specyficznej sekwencji, którą ma się amplifikować. Oznacza to, że primery muszą być komplementarne w stopniu dostatecznym do tego, aby hybrydyzować z ich odpowiednimi niciami. Tak więc, sekwencja primera nie musi być dokładnym odbiciem sekwencji matrycy. I tak np., gdy primer diagnostyczny obejmuje sekwencję nukleotydów, w której 3'-końcowy nukleotyd jest komplementarny albo z oczekiwanym nukleotydem wariantowym, albo z nukleotydem normalnym, niekomplementarny fragment nukleotydu może być przyłączony do 5'-końca primera, z pozostałością sekwencji primera komplementarną z częścią diagnostyczną docelowej sekwencji zasad. Tym niemniej zwykle primery wykazują ścisłą komplementarność z wyjątkiem takiego rozmiaru, w którym mogą być obecne niekomplementarne nukleotydy przy uprzednio ustalonym zakończeniem primera, jak to opisano w poprzedniej części niniejszego opisu.

Tym niemniej, należy zdawać sobie sprawę z tego, że w pewnych okolicznościach synteza produktu wydłużania primera może zostać indukowana i zachodzi nawet w obecności niekomplementarnej 3'-końcowej reszty, fen artefaktowy produkt może powstać w wyniku zastosowania zbyt niskiej temperatury (i w tym przypadku temperaturę można podnieść), zbyt długiego czasu inkubacji/łączenia (i w tym przypadku czas można skrócić), zbyt wysokiego stężenia soli (i w tym przypadku stężenie soli można obniżyć), zbyt wysokiego stężenia enzymu, zbyt wysokiego stężenia trifosforanu nukleozydu, nieprawidłowego pH lub nieprawidłowej długości primera oligonukleotydowego. Wszystkie te czynniki dyskutowane są w publikacji opisu patentu europejskiego nr 237 362. Głównym źródłem produktów artefaktowych jest prawdopodobnie dopuszczenie do zbyt dużego spadku temperatury, a przez to dopuszczenie do zbyt małej możliwości zbliżenia, np. w wyniku usunięcia mieszaniny reakcyjnej z cyklicznych urządzeń ogrzewczych, nawet na krótko, np. w celu dodania czynika polimeryzacji (np. pohmerazy Tag), zwłaszcza w pierwszym cyklu reakcji.

W uzupełnieniu powyższego stwierdziliśmy, że takie artefaktowe wyniki mogą także być skutkiem zastosowania primera diagnostycznego, który jest szczególnie bogaty w reszty G (guanozyna) i C (cytydyna). Primer diagnostyczny może zwiększyć pod tym względem trudności, jeżeli jest bogaty w G/C jako całość, albo szczególnie jeśli jest bogaty w G/C na jego właściwym, normalnie 3', końcu. Oprócz tego, ścisły charakter łączenia się zasad w regionie właściwego, normalnie 3', końca primera diagnostycznego może w zastosowaniu być przyczyną wyniku artefaktowego. Tak więc, obecność As (adenozyna) przy łączeniu się zasad w regionie właściwego, normalnie 3', końca primera wykazuje tendencję do zwiększenia specyficzności, podczas gdy obecność Gs (guanozyna) nie powoduje tego. Dalej, ścisły charakter błędnego skojarzenia przy właściwym, normalnie 3', końcu primera diagnostycznego może być ważnyrń czynnikiem, czy otrzymuje się, czy nie otrzymuje się wyniku artefaktowego. Tak więc np. błędne skojarzenie AA lub CT normalnie nie daje wyniku w hybrydyzacji, ale błędne skojarzenie GT lub AC może dać w rezultacie hybrydyzację w dostatecznym stopniu do powstania produktu (produktów) artefaktowego. Można uniknąć wyników artefaktowych przez przemyślane wprowadzenie jednej, lub więcej niż jednej błędnie kojarzonej reszty, albo jeśli jest to pożądane, delecji lub insercji do primera diagnostycznego w celu destabilizacji primera diagnostycznego w celu łączenia się w trakcie hybrydyzacji.

162 338

Tak więc np. każdą lub ponad 10, np. 6 nukleotydów, sąsiadujących z zakończeniem błędnie kojarzonym, można zmienić w celu wprowadzenia dalszego błędnego kojarzenia. Na ogół, tylko jedno błędne kojarzenie w uzupełnieniu końcowego błędnego kojarzenia może być niezbędne, umiejscowione np. jako 1, 2 lub 3 zasada od końcowego błędnego kojarzenia. Tak więc, np. w przypadku odniesienia do ustalenia obecności normalnej homozygoty, heterozygoty lub pozornej homozygoty, pod względem allela Z genu σ-1-antytrypsyny, stwierdziliśmy, że można otrzymać dobre wyniki, jeżeli dokona się zmiany trzeciego nukleotydu od 3'-końcowego nukleotydu w celu tworzenia błędnego skojarzenia przy stosowaniu. Tak więc, np. stwierdziliśmy, że obecność C zamiast A jako trzeciego nukleotydu od zakończenia 3'primera diagnostycznego umożliwia łatwe zróżnicowanie między normalną homozygotą, heterozygotą i pozorną homozygotą w odniesieniu do allela Z. Najlepszy układ primera diagnostycznego można więc ustalić na drodze bezpośrednich eksperymentów w oparciu o powyższe kryteria, które to eksperymentowanie leży w możliwościach fachowców-biologów molekularnych.

Termin „primer diagnostyczny używa się w niniejszym opisie w odniesieniu do primera o takiej sekwencji nukleotydów, że jego końcowy nukleotyd dobrany jest tak, aby był komplementarny albo z oczekiwanym nukleotydem wariantowym, albo z odpowiednim nukleotydem normalnym, tak, że syntetyzowany jest produkt wydłużenia primera diagnostycznego, gdy końcowy nukleotyd primera diagnostycznego jest komplementarny z odpowiednim nukleotydem końcowym odpowiedniej części diagnostycznej docelowej sekwencji zasad, ale nie jest syntetyzowany wspomniany produkt wydłużania, gdy końcowy nukleotyd primera diagnostycznego nie jest homologiczny z odpowiednim nukleotydem końcowym odpowiedniej części diagnostycznej docelowej sekwencji zasad.

Termin „primer amplifikacji stosowany jest w niniejszym opisie w odniesieniu do primera, który jest zdolny do hybrydyzowania z nicią kwasu nukleinowego, który jest komplementarny z nicią kwasu nukleinowego, z którym primer diagnostyczny zdolny jest do hybrydyzacji. Primer amplifikacji ma taką sekwencję nukleotydów, że zdolny jest do hybrydyzacji z produktem wydłużania primera diagnostycznego, po oddzieleniu od jego materiału komplementarnego, dzięki czemu produkt wydłużania priemra diagnostycznego służy jako matryca do syntezy proudktu wydłużania primera amplifikacji, ułatwiając przez to amplifikację.

Tak więc, wynalazek dotyczy przynajmniej w części polepszenia sposobów amplifikacji, takich jak sposób opisany w publikacji opisu patentu europejskiego nr 237 362, w którym ulepszenie umożliwia selektywną amplifikację sekwencji albo zawierającej oczekiwany nukleotyd wariantowy, jeśli jest obecny, albo zawierającej nukleotyd normalny, jeśli jest obecny, upraszczając w ten sposób wykrycie, przy uniknięciu sekwencjonowania, specyficznych wobec alleli oligonukleotydów i trawienia enzymami restrykcyjnymi. Tak więc, dla danej zmiany nukleotydów, np. mutacji punktowej, jej obecność lub nieobecność można wykryć albo 1/ za pomocą wyznaczenia primera diagnostycznego tak, aby zawierał odpowiedni nukleotyd końcowy komplementarny z oczekiwaną zmianą nukleotydów tak, że synteza produktu amplifikacji będzie wskazywać obecność oczekiwanej zmiany nukleotydów, a nieobecność produktu amplifikacji będzie wskazywać nieobecność oczekiwanej zmiany nukleotydów, albo 2/ przez wyznaczenie primera diagnostycznego tak, aby zawierał odpowiedni nukleotyd końcowy komplementarny z odpowiednim nukleotydem normalnym tak, że synteza produktu amplifikacji będzie wskazywać nieobecność oczekiwanej zmiany nukleotydów, a nieobecność produktu amplifikacji będzie wskazywać obecność oczekiwanej zmiany nukleotydów. W tym względzie odwołania się w niniejszym opisie do „odpowiedniego nukleotydu końcowego oznaczają końcowy nukleotyd primera, od którego, przy zastosowaniu, mogłaby być inicjowana synteza, jeżeli byłaby możliwa. Tak więc, na ogół czynnik polimeryzacji mógłby inicjować syntezę przy 3'-końcu primera, a odpowiedni nukleotyd końcowy byłby na ogół 3'-końcowym nukleotydem.

Potwierdzenie obecności lub nieobecności np. danej mutacji punktowej można uzyskać przez przyjęcie obu sposobów: alternatywnego sposobu postępowania (1) i alternatywnego sposobu postępowania (2), jak wyszczególniono powyżej. Kombinacja tych dwóch sposobów postępowania

162 338 15 dostarcza metody wykrywania heterozygot, wartościowej w analizie dominujących stanów odziedziczonych oraz w wykrywaniu nośników recesywnych stanów odziedziczonych.

W korzystnym sposobie realizacji, sposób według wynalazku jest przeznaczony do wykrywania obecności lub nieobecności więcej niż jednego oczekiwanego nukleotydu wariantowego w tej samej próbce. Fakt nadawania się sposobu według wynalazku do selektywnej amplifikacji sekwencji zależnej od uprzednio ustalonej sekwencji nukleotydów primerów diagnostycznych umożliwia zróżnicowanie różnorodnych produktów amplifikacji w sposób prosty, dokładny i przy minimalnej wprawie wykonawcy, umożliwiając dzięki temu dostarczenie pewnej techniki do screeningu pojedynczej próbki pod względem różnorodnych zmian nukleotydów. Tak więc, wynalazek budzi szczególne zainteresowanie jeśli chodzi o screening pojedynczej próbki DNA lub RNA pod względem pakieru stanów odziedziczonych, takich jak zaburzenia genetyczne, predyspozycje i mutacje somatyczne prowadzące do różnych chorób. Wspomniany DNA lub RNA można np. ekstrahować z krwi lub materiału tkankowego, takiego jak kosmyki kosmówki lub komórki owodniowe, różnymi metodami, takimi jak opisane przez Maniatisa i in., Molecular Cloning, 280-281 (1982). Oprócz tego, w miarę poznawania podstawy molekularnej dalszych stanów odziedziczonych, te dalsze stany można będzie w prosty sposób włączyć do sposobu screeningu według wynalazku.

Różnorodne produkty amplifikacji można odróżnić z wykorzystaniem rozmaitych metod. Tak więc, można np. zastosować sondy dla każdego oczekiwanego produktu amplifikacji, przy czym każda sonda niesie różny i odróznialny sygnał' lub resztę zdolną do wytworzenia sygnału.

Takie sygnały i reszty zdolne do wytworzenia sygnałów są szczegółowo przedyskutowane w publikcji opisu patentu europejskiego nr 246 864, ale mogą np. obejmować układ amplifikacji na fazie stałej opisany przez C.G. Wanga w World Biotech Report, tom 2, cz. 2, str. 33-37 (1986), (Diagnostics Healthcare Proceedings of the conference held in November 1986, San Francisco), w którym mikrokuleczki wytworzone z wieloma pierwiastkami śladowymi sprzęga się z sondą. Obecność specyficznych sond można wykryć na drodze analizy fluorescencyjnej w promieniach X. Techniki te powinny, na ogół, być proste i do bezpośredniego zastosowania, ponieważ niezbędne powinno być wykrycie tylko istnienia produktu amplifikacji, a nie odróżnienie sekwencji różniących się tak nieznacznie, jak pojedynczym nukleotydem.

Znacznie prostsza i korzystna metoda odróżniania produktów amplifikacji obejmuje selekcję sekwencji nukleoetydów primerów amplifikacji, tak, że długość każdego produktu amplifikacji tworzonego podczas stosowania sposobem według wynalazku jest różna. W tym względzie ilość par zasad obecnych w produkcie amplifikacji jest dyktowana przez odległość między primerami diagnostycznymi i amplifikacji. Tak więc, primery amplifikacji można tak wyznaczyć, że każdy potencjalny nuleotyd wariantowy wykazuje związek z potencjalnym produktem amplifikacji o różniącej się długości.

Obecność lub nieobecność danego potencjalnego nukleotydu wiariantowego można wykryć technikami elektroforetycznymi, w których otrzymane, różniące się produkty amplifikacji można rozdzielić ze względu na ich masę cząsteczkową, a przez to zidentyfikować np. za pomocą autoradiografii lub technik fluorescencyjnych. Długość różniących się produktów może odróżniać się tylko pojedynczym nukleotydem, ale korzystnie długość będzie odróżniać się co najmniej trzema nukleotydami. Sposób według wynalazku korzystnie stosuje się przy użyciu barwnika interkalacyjnego, takiego jak bromek etydyny, który można uwidocznić jako pomarańczową fluorescencję po naświetleniu UV. Tak więc, obecność lub nieobecność licznych potencjalnych nukleotydów wariantowych w pojedynczej próbce można określić szybko, dokładnie i łatwo. Jeżeli jest to pożądane, primer (primery): diagnostyczny i/lub amplifikacji można znakować lub piętnować np. przez użycie fluoroforu. Tak więc, np. każdy różniący się primer diagnostyczny lub amplifikacji może nieść różny fluorofor tak, że wyniki pakietu testów można odczytać z żelu do elektroforezy, np. za pomocą skanera laserowego, co umożliwia automatyzację sposobu według wynalazku.

Alternatywnie, obecność lub nieobecność produktu amplifikacji można w prosty sposób ocenić przez użycie rozpuszczalnika zdolnego do selektywnego rozpuszczenia trifosforanów nukleozydów, ale niezdolnego do rozpuszczenia sekwencji nukleotydów, np. DNA. Kwas trichlorooctowy (TCA) jest przykładem takiego właśnie rozpuszczalnika. I tak np. obecność lub nieobec16

162 338 ność produktu amplifikacji można określić za pomocą wytrącenia TCA z mieszanin reakcyjnych po amplifikacji. Gdy włączenie odpowiednich trifosforanów nukleozydów nastąpiło w seriach reakcji wykładniczych, to w następstwie będzie obecna większa ilość materiału nierozpuszczalnego w TCA, niż gdy nie nastąpiło wydłużenie primera diagnostycznego. Ilościową ocenę nierozpuszczalnego materiału można przeprowadzić znanymi metodami. I tak np., trifosforany nukleozydów można piętnować (np. markerem promieniotwórczym lub fluorescencyjnym), mieszaninę reakcyjną można poddać np. odwirowaniu, obecny płyn zdekantować i albo do produktu nierozpuszczalnego, albo do płynu, zastosować odpowiednie metody wykrywania, stakie jak zliczanie przy promieniotwórczości lub oznaczanie fluorescencji

Wynalazek dotyczy też zestawu do wykrywania obecności lub nieobecności co najmniej jednego nukleotydu wariantowego w jednym, lub więcej niz w jednym kwasie nukleinowym zawartym w próbce, który to zestaw obejmuje sekwencję nukleotydów od około 5 do 50 par zasad, przy czym końcowy nukleotyd tej sekwencji jet komplementarny albo z oczekiwanym nukleotydem wariantowym, związanym ze znanym zaburzeniem genetycznym, albo z odpowiednim nukleotydem normalnym, przy czym pozostałość wspomnianej sekwencji jest zasadniczo komplementarna z odpowiednią docelową sekwencją zasad, sąsiadującą z oczekiwanym nukleotydem wariantowym albo z odpowiednim nukleotydem normalnym, przy czym wspomniana sekwencja nukleotydów jest taka, że przy zastosowaniu w charakterze primera diagnostycznego w sposobie według wynalazku syntetyzowany jest produkt wydłużania primera diagnostycznego, gdy wspomniany oligonukleotyd końcowy primera diagnostycznego jest komplementarny z odpowiednim nukleotydem w docelowej sekwencji zasad, a nie jest syntetyzowany produkt wydłużania, gdy wspomniany nukleotyd końcowy primera diagnostycznego nie jest komplementarny z odpowiednim nukleotydem w docelowej sekwencji zasad.

Dogodnie nukleotyd końcowy, komplementarny albo z oczekiwanym nukleotydem wariantowym, albo z nukleotydem normalnym, znajduje się przy końcu 3' sekwencji nukleotydów. Korzystnie oczekiwany nukleotyd wariantowy wynika z mutacji punktowej odpowiedniej sekwencji normalnej.

Wspomniana sekwencja nukleotydów może zawierać np. 10 do 50 par zasad, np. 10 do 36 par zasad.

Sekwencja nukleotydów jak zdefiniowano bezpośrednio powyżej może zawierać nukleotyd końcowy o sekwencji nukleotydów, która jest komplementarna z nukleotydem wariantowym wynikającym ze zmiany odpowiedniego nukleotydu normalnego, odpowiednio w (i) A, (ii) G, (iii) C, (iv) T lub U.

Wynalazek dotyczy też zestawu do wykrywania obecności lub nieobecności co najmniej jednego nukleotydu wariantowego w jednym, lub więcej niz w jednym kwasie nukleinowym zawartym w próbce, który to zestaw obejmuje też zestaw dwóch sekwencji nukleotydów jak zdefiniowano powyżej, przy czym nukleotyd końcowy jednej sekwencji jest komplementarny z oczekiwanym nukletoydem wariantowym związanym ze znanym zaburzeniem genetycznym, a nukleotyd końcowy drugiej sekwencji jest komplementarny z odpowiednim nukleotydem normalnym.

W zakres wynalazku wchodzą też sondy zawierające sekwencję nukleotydów jak zdefiniowano w poprzedniej części niniejszego opisu, niosące piętno lub komponent markerowy.

Przykładowo wyszczególniono następujące zaburzenia genetyczne, przy wykazaniu mutacji odpowiedzialnych za zaburzenie i stosownych odnośników z piśmiennictwa dla każdej mutacji. Sekwencje nukleotydów i sondy jak zdefiniowano w poprzedniej części niniejszego opisu mogą np. mieć za podstawę zaburzenia genetyczne wyszczególnione poniżej, przy czym sekwencja stosowanej sekwencji nukletoydów lub sondy może zostać wyprowadzona z odpowiednich odnośników z piśmiennictwa wyszczególnionych w tabeli.

162 338

Tabela

Mutacje powodujące chorobę genetyczną A Autosomalne

Choroba	Mutacja	Odnośnik
Niedobór antytrombiny III	CG-TG	Duchange i in , Nucleic Acids Research, 14, 2408 (1986)
Polineuropatia amyloidowa	CG-CA AG-GC AG-GG	S Maeda i in , Mol Biol Med , 329-338 (1986) M R Wallace i in , J Clin. Invest . 78, 6-12 (1986) MR Wallace i in , J Clin Invest , 78, 6-12 (1986)
Niedobór σ-1-antytrypsyny	TG-CG CG-CA GAT-GTT CTT-CTC GGC-TGC	T Nukiwa i in , J Biol Chem , 261, 15989-15994 (1986) V J Kidd i in , Naturę, 304, 230-234 (1983) Asp 256 - Val, Egzon III nie doniesiono delecja kodonu 51 (normalny) M Malton w druku Arg 39-Cys, Egzon II I wariant, me doniesiono
Niedobór deaminazy adenozynowej	CG-CA AA-AG CT-CG	DT Bonthron i in , J Clin Invest , 76, 894- 897 (1985) D Valeno i in , EMBO J , 5, 113-119 (1986) D Valeno i in., EMBO J ,5, 113-119(1986)
Niedobór apolipoproteiny E	GT-GC	Gladaras i in , J Biol Chem , 262, 2310-2315 (1987)
Cukrzyca, łagodna	TC-CC TC-TG TG-TT	M Haneda i in , Proc Natl Acad. Sci USA 80, 63665370(1983) S Shoelson i in., Naturę, 302, 540-543 (1983) S. Shoelson i in , Naturę, 302, 540-543 (1983)
Choroba Gauchera, typ 2	CT-CC	S Tsuji i in , N Engl. J Med , 316, 570-575 (1987)
Hiperinsuhnemia, rodzinna	CG-CA CA-GA	Y Shibasaki i in , J Clin Invest , 76, 378-380 (1985) SJ Chan i in , Proc Natl. Acad Sci USA, 84,2194-2197 (1987)
Choroba	Mutacja	Odnośnik
Niedobór immunoglobuliny H	CT-CG CG-TG	J Stavnezer-Nordgren i in , Science, 230 458,461 (1985) J Stavnezer-Nordgren i in., Science, 230 458,461 (1985)
Niedobór receptora LDL	GG-GA	M A Lehrman i in ,Cell, 41, 735-743 (1985)
Kostnienie niedoskonałe (typ III)	TG-TT	D H Cohn i in , Proc Natl Acad Sci. USA, 83 6045604-7(1986)
Fenyloketonuria	AG-AA CG-TG	A G Dilella i in , Naturę, 322, 779-803 (1986) A G Dilella i in , Naturę, 327, 333-336 (1987)
Niedobór białka C	CG-TG GG-GC	G Romeo i in , Proc Natl Acad Sci USA, 84, 28292832 (1987) G Romeo i in , Proc Natl Acad Sci USA, 84, 28292832(1987)
Niedobór fosforylazy nukleozydów purynowych	TG-TA	SR Williams i in., J Biol. Chem , 262,2332-2339(1987)
Niedokrwistość sierpowatokomórkowa	GAG-GTG	J C Chang i Y W Kan, Lancet, 1127-1129 (1981), S H. Orkinun ,NewEng J Med ,307,32-36(1982),orazB.J. Conner i in , Proc Natl Acad Sci USA, 80, 278-282 (1983)
Choroba tangerska	AG-AT	S W Law, Η B Brewer, J Biol Chem 260, 12810-

128814(1985)

Choroba /J-Talasemia

Klasa mutanta	Typ	Odnośnik
1	2	3
a/ Niefunkcjonalny mRNA Mutanty nonsensowne
/1/ kodon 17 (A-T)	0	J C Chang i in , Proc. Natl Acad Sci USA, 76, 2886 (1979)
/2/ kodon 39 (C-T)	0	RF Trecartin i in., J Clin Invest, 68 1012 (198HF F. Chehab i in , Lancet i, 3 (1986)
/3/ kodon 15(C-A)	0	Η H Kazazian i in , Eur Molec Biol. org J., 3, 593 (1984)
/4/ kodon 37 (G-A)	0	C D Boehm i in , Blood, 67, 1185 (1986)
/5/ kodon 121 (G-T)	0	Η H Kazazian i in , Am. J Hum Genet , 38, A860 (1986)
Mutanty z przesunięciem ramki
/6/ - 2 kodon 8	0	S H Orkin i in J Biol Chem, 256, 9 782 (1981)
/7/ - 1 kodon 16	0	Η H Kazazian i in , Eur molec. Biol org. J, 3, 593 (1984)
/8/ - 1 kodon 44	0	A J Kinmburgh i in , Nucleic Acids Res , 10, 5421 (1982)
/9/ - 1 kodon 8/9	0	Η H Kazazian un , Eur molec Biol.org J, 3,593(1984)

oraz C Wong i in , Proc Natl Acad. Sci USA, 83,6529 (1986)

162 338

1	2	3
/10/ - 4 kodony 41/42	0	Η H Kazazian i m , Eur molec. Biol orgn J, 3, 593 (1984) oraz A Kimura i in J Biol Chem , 258, 2748 (1983)
/11/ - 1 kodon 6	0	HH Kazazian i in , Am J Hum Genet ,35,1028(1983)
/12/ + kodon 71/72	0	TC Cheng i in , Proc Natl Acad. Sci USA, 81, 2821 (1984)
/b/ Mutanty przetwarzania RNA Zmiany miejsc składania
/1/ IVS 1 pozycja 1 GT-AT	0	SH Orkinim .Naturę, 296,627 (1982)orazR Treisman i in , Naturę, 302, 591 (1983)
/2/ IVS 1 pozycja 1 GT-TT	0	Η H Kazazian i m , Eur molec, Biol org J, 3, 593 (1984)
/3/ IVS 2 pozycja 1 GT-AT	0	SH Orkinnn.,Nature,296,627(1982)orazR Treisman iin. Celi, 29, 903 (1982)
/4/ IVS 1 3'-komec - 17 bp	0	H F Bunn i in , Haemo - globin molecular genetic and climcal aspects, str 283 (Saunders, Philadelphia, 1986)
/5/ IVS I 3'-koniec - 25 bp	0	Η H Kazazian i in , Eur molec Biol org J , 3, 593 (1984) oraz S.H Orkin i in ,J Biol Chem , 258, 7249 (1983)
/6/ IVS 2 3'-koniec AG-CG	0	B J Padamlam i in , Am J Hematol , 22, 259 (1986)
/7/ IVS 2 3'-koniec AG-CG	0	SE Antonarakis i in., Proc Natl Acad Sci USA, 81, 1154(1984), oraz G.F. Atweh i in, Nucleic Acids Res , 13, 777(1985)
Zmiany zgodności
/8/ IVS 1 pozycja 5 /G-C/	+	H.H. Kazazian i in , Eur molec Biol org J 3593(1984) oraz R Treisman i in , Naturę, 302, 591 (1983)
/9/ IVS 1 pozycja /G-T/	0	C Wongiin.,Proc Natl. Acad Sci USA,83,6529(1986) oraz G.F Atweh i in , Nucleic Acids Res , 13, 777 (1985)
/10/ IVS 1 pozycja 6 /T-C/	+	S.H Orkiniin.,Naturę,296,627(1982)orazG F Atweh i in , Am J Hum Genet, 38, 85 (1986)
Wewnętrzne zmiany IVS
/11/ IVS 1 pozycja 110 /G-A/	+	D Westaway i in Nucleic Acids Res, 9, 1777 (1981)
/12/ IVS 2 pozycja 705 /T-G/	+	C Dobkin i in , Proc Natl Acad Sci USA, 80, 1184 (1983)
/13/ IVS 2 pozycja 745 /C-G/	+	S.H Orkin i in., Naturę, 296,627 (1982)oraz R. Treisman i in, Naturę, 302, 591 (1983)
/14/ IVS 2 pozycja 654 /C-T/	0	TC Cheng i in., Proc Natl Acad. Sci USA, 81,2821 (1984)
/15/ IVS1 pozycja 116/T-G/		EA Feingold i in , Ann NY Acad. Sci ,445,159(1985)
Substytucje w regionie kodującym
/16/ kodon 26 /G-A/		S L Theinnn.,J Med Genet (wdruku, 1986)orazS H Orkin i in., Naturę, 300, 768 (1982)
/17/ kodon 24/T-A/	+	Goldsmith i in., Proc Natl Acad Sci USA, 88, 2318 (1983)
/18/ kodon 27 /G-T/	Knos sos	S H Orkin i in , Blood, 64, 311 (1984)
/c/ Mutanty transkrypcyjne
/1/- 88 C-T		C Wond i in , Proc Natl Acad Sci USA, 83, 6529 (1986), S.H Orkin i in., J. Biol Chem , 259,8679 (1984)
/2/ - 87 C-G	+	OrkinS H nn .Naturę,296,627(1982)orazR Treisman i in , Naturę, 302, 591 (1983)
/3/-31 A-G	+	Y Takihara i in., Blood, 67, 547 (1986)
/4/ - 29 A-G	+	SE Antonarakis i in , Proc Natl Acad Sci USA 81, 1154 (1984) oraz C Wong i in , Proc. Natl Acad Sci USA, 83, 6529(1986)
/5/ - 28 A-C	+	S Surrey i in , J Biol Chem., 260, 6507 (1985)
/6/ - 28 A-G	+	S H Orkin i in , Nuci Acids Res , 11, 4727, (1983)
/d/ Mutant poliadenylacji
/1/ AATAAA - AACAAA	+	SH Orkin i in , Eur molec Biol org J , 4, 453 (1985)
/e/ Delecje
/1/3'/J/-619 bp/	0	R A Spntz i in Nucleic Acids Res , 10, 8025 (1982) oraz S H Orkin i in , Proc Natl Acad Sci USA, 76, 2400 (1979)
/2/ 571 /-1,35 kb/	O HbF	B.J Padamlam i in , Blood, 64, 941 (1984)
/3/ β /-10 kb/	O HbF	JG Gilman i in Br, J Haemat , 56, 339 (1984)

+ = Mutant /J.talaksemn /$’/, który powoduje zmniejszenie tworzenia łańcucha /3-globiny, O = Mutant /B°/, który powoduje brak tworzenia łańcucha /3-globiny.

162 338

Tabela

Choroba

Niedobór izomerazy triozofosforanowej

Niedobór dekarboksylazy uroporfirynogennej

Mutacja Odnośnik

AG-AC I O. Daar lin.. Proc. Natl. Acad Sci USA,83,7903-7907 (1986)

CG-GA H De Verneuil i m , Science, 234, 732-734 (1986)

Tabela B Związane z X

Choroba	Gen	Mutacja	Odnośnik
Hemofilia A	Czynnik VIII	CG-TG /24/	J Gitschier i in , Naturę, 315, 427-430 (1985)
		CG-TG /26/	J Gitschier i in., Naturę, 315, 427-430 (1985)
		CG-TG/18/	S E Antonarakis i in , N. Engl ) Med., 313, 842-848 (1985)
		CG-CA /26/	J Gitschier i in , Science, 232, 1415^1416 (1986)
		CG-TG /18/	H Youssoufian i in., Naturę, 324, 380-382 (1986)
		CG-TG /22/	H Youssoufian i in , Naturę, 324, 380-382 (1986)
		CG-TG /22/	H Youssoufian i in , Naturę, 324, 380-382 (1986)
Hemofilia B	Czynnik IX	CG-CA	A K Bentley i in., Celi, 45, 343-348 (1986)
		GT-TT	D J G Rees i in., Naturę, 316, 643-645 (1985)
		GA-GG	L M Davis i in , Blood, 69, 140-143 (1987)

SM Forrest, G C Cross, A Speer, D Gardner-Medwin,J Burn i K.E Davies Preferential deletion of exons in Duchenne and Becker muscular dystrophies, Naturę, 320, 638-640 (1987). M Koenig, E P Hoffman, C J. Bertselson, A.P. Monaco, C Feener i L M Kunkel Cempleeecloningofthe Duchenne muscular dystrophy (DMD)cDN A and preliminary genomie organisation of the DMDgene in normal and affected individuals, Celi, 50, 509-517 (1987).

SB Malhotra, KA Hart, Hj Klamut, NST Thomas, SE Bodrug, A.H M Burghes, M Bobrow, PS Harper, M.W Thpmpson, P N Ray i R G. Worton· Frame-shift deletions in patients with Duchenne and Becker muscular dystrophy, Science, 242, 755-759,(1988).

A P Read, R C Mountford, S M Forrest, S J Kenwnck, K E Davies i R Harris· Patterns of exon deletions in Duchenne and Becker muscular dystrophy, Hum Gener, 80, 152-156(1988) JS Chamberlain, R A. Gibbs, J.E. Ranier, P N. Nguyen i C.T. Caskey. Deletion screenmgof the DmD loeus via multiplex DNA amplification, Nuc. Ac Res , 16,23,11141-11156(1988). R.G Roberts, C.G. Cole.K A Han, M, Bobrow i D R Bentley Rapid carner and prenatal diagnosisof Ducennee and Becker muscular dystrophy, Nuc. Ac Res, 17,2,811 (1989)

Często tylko niewielkie ilości genomowego DNA są dostępne do analizy. Stwierdzono, że specyficzność primerów diagnostycznych dla stosownych normalnych lub wariantowych sekwencji nukleotydów można dogodnie ocenić przez zwiększenie ilości kopii sekwencji (lub większej ilości sekwencji) nukleotydów w badaniu hybrydyzacji. Można to osiągnąć np. przez skonstruowanie dwuniciowej „kasety obejmującej sekwencję normalną połączoną z sekwencją wariantową, przy czym błędne skojarzenie między dwoma nukleotydami na sąsiadujących niciach korzystnie położone jest ku środkowi kasety. Następnie kopie kasety dogodnie otrzymuje się przez wprowadzenie jej do plazmidu-gospodarza z następującą rephkacją plazmidu i wyodrębnieniem żądanych sekwencji wszystkich przy zastosowaniu technik dobrze znanych w tej dziedzinie. Technika ta jest stosownie zilustrowana na figurze 10.

Wynalazek niniejszy jest opisany poniżej, w celu lepszego zrozumienia, tytułem przykładu, z odniesieniem do załączonych rysunków, na których: fig. 1/a/ i 1/b/ ilustruje pierwszy sposób realizacji wynalazku, a na fig. 1/c/ przedstawiono typowe wyniki takiego testu, uzyskane elektroforetycznie, fig. 2/a/i 2/b/ ilustruje drugi sposób realizacji wynalazku, fig. 3 ilustruje korzystny sposób rozróżniania różnorodnych produktów amplifikacji. Fig. 4/a/ i 4/b/ ilustruje trzeci sposób realizacji wynalazku. Fig. 5/a/, /b/ i /c/ ilustruje czwarty sposób realizacji wynalazku. Na fig. 6 (nie w skali) przedstawiono ludzki gen al antytrypsyny, a na fig. 7 przedstawiono wyniki uwidocznienia pasm w żelu otrzymanym w przykładzie I i II. Na fig. 8 przedstawiono wyniki uwidocznienia pasm w żelu, w którym ścieżki 1-4 reprezentują wyniki uzyskane w przykładzie III, ścieżki 5-8 przedstawiają część wyników z przykładu IV, a ścieżka 9 reprezentuje marker wielkości. Na fig. 9 przedstawiono wyniki uwidocznienia pasm w żelu otrzymanym w przykładzie IV. Fig. 10 ilustruje zastosowanie kasetowego układu plazmidowego do amplifikacji żądanego dupleksu DNA. Fig. 11 ilustruje piąty sposób ralizacji wynalazku (liniową amplifikację). Na fig. 12 przedstawiono wyniki uwidocznienia pasm w żelu otrzymanym w przykładzie V. Na figurze 13 przedstawiono wyniki uwidocznienia pasm w żelu otrzymanym w przykładzie VI. Figura 1 ilustruje pierwszy sposób realizacji wynalazku. Na fig. 1/a/ przedstawiono zdenaturowane nici genomowego DNA zawierającego prawidłowy nukleotyd /N/ w pozycji, w której np. w wyniku zaburzenia genetycznego, mógłby się znajdować przypuszczalny nukleotyd wariantowy. Kontaktowanie nici kwasu nuklei20

162 338 nowego w warunkach hybrydyzacji z sondą diagnostyczną zawierającą 3'-terminalny nukleotyd komplementarny do prawidłowego nukleotydu /-N/ w obecności odpowiednich trifosforanów nukleozydów i czynnika polimeryzującego trifosforany nukleozydów, daje w rezultacie wydłużenie diagnostycznego primera w kierunku 3 jak pokazano na fig. 1/b/. Jeśli stosuje się diagnostyczny primer, w którym 3'-terminalny nukleotyd jest komplementarny do przewidywanego wariantowego nukleotydu /-M/, nie zachodzi takie wydłużenie łańcucha. Każdy produkt wydłużenia łańcucha diagnostycznego primera można następnie denaturować i wytworzony zdenaturowany produkt hybrydyzować z primerem amplifikacji /A/ uzyskując w ten sposób dalsze wydłużenie łańcucha. Produkt o wydłużonym łańcuchu można następnie zdenaturować i powtarzać proces aż do osiągnięcia amplifikacji. Region genomowego DNA podlegający amplifikacji z primerem diagnostycznym jest oznaczony na fig. 1/b/jako DG. Produkty diagnostyczne z tego regionu są odpowiedzialne za pasma oznaczone jako DG na fig. 1/c/.

W próbie kontrolnej PCR (reakcja łańcuchowa z polimerazą/ primery /P/ oznaczone jako P na fig. 1/a/ mogą być użyte w innym, oddzielnym, miejscu nici kwasu nukleinowego lub z inną nicią kwasu nukleinowego, np. w innym chromosomie np. w przypadku ludzkiego DNA. To oddzielne miejsce jest oznaczone jako PCR na fig. 1/c/, a produkty kontrolne PCR z tego miejsca są odpowiedzialne za pasma oznaczone jako PCR na fig. 1/c/. Należy zauważyć, że pasma oznaczone jako PCR mogą przedstawiać większe lub mniejsze produkty niż produkt reprezentowany przez pasmo oznaczone DG.

Na figurze 1/c/ przedstawiono wyniki metody pokazanej na fig. 1/a/ i 1/b/ w postaci pasm rozszczepionych podczas elektroforezy na żelu agarozowym w odniesieniu do np. zaburzenia genetycznego spowodowanego przez punktową mutację badaną z użyciem odpowiedniego diagnostycznego primera -M lub -N. Gdy badany podmiot jest nosicielem /C/ zaburzenia genetycznego, będą widoczne pasma zarówno prawidłowej sekwencji nukleotydów /N/ jak i wariantowej sekwencji nukleotydów /M/. Prawidłowe homozygoty /N/ będą wykazywały pasmo odpowiadające prawidłowej sekwencji nukleotydów, ale nie będą wykazywały pasma odpowiadającego wariantowemu nukleotydowi [co oz naczono jako ( )], a homozygoty w przypadku choroby spowodowanej mutacją (osobnicy z zaburzeniami genetycznymi (D)) nie będą wykazywały pasma odpowiadającego prawidłowej sekwencji nukleotydów [co oznaczono jako ( )], ale będą wykazywały pasmo odpowiadające wariantowej sekwencji nukleotydów.

Figura 2 ilustruje drugi sposób realizacji wynalazku. Dla każdej nici dwuniciowego kwasu nukleinowego stosuje się oddzielny primer. W /a/ primery diagnostyczne są tak skonstruowane, że 3'-terminalny nukleotyd jest komplementarny do nukleotydu prawidłowego. Dalej sposób prowadzi się tak jak opisano w odniesieniu do fig. 1 ale z dwoma różnymi primerami diagnostycznymi inicjującymi amplifikację, jeżeli obecny jest właściwy nukleotyd. Zatem w tym sposobie realizacji drugidiagnostycznyprimerjestrównoważnyzprimereimamplifikacji/A/nafig. l.Takwięcnafig.22a/ amplifikacja będzie zapoczątkowana przez primery /-N i N-/, a nie przez diagnostyczne primery zawierające 3'-terminalne nukleotydy komplementarne do wariantowej sekwencji nukleotydowej /-M i M-/. Przeciwny przypadek jest przedstawiony na fig. 2/b/, gdzie w próbce w niciach kwasów nukleinowych występuje wariantowa sekwencja. Wyniki tej metody, pokazanej na fig. 2, można przedstawić w podobny sposób jak na fig. 1/c/ z tym, że odniesienia do prawidłowej i wariantowej sekwencji /N i M/ będą odpowiadały parom takich sekwencji. Na fig. 2 litera P odnosi się do PCR primerów stosowanych jako kontrolne.

Na figurze 3 przedstawiono jeden sposób rozróżniania różnorodnych produktów amplifikacji umożliwiającego zatem badanie pojedynczej próbki RNA lub DNA na zespół stanów odziedziczonych. Dwie nici (zdenuturowanego) DNA lub RNA w próbce są przedstawione jako zawierające trzy oddzielne loci ponumerowane 1, 2 i 3. Dalszy region usunięty z tych loci jest wykorzystany do PCR amplikacji jako kontrolny. W odniesieniu do locus (1) stosuje się 20-merowy diagnostyczny primer (5'-N 3') wraz z innym 20-merowym primerem diagnostycznym (3'N-5'). Jeżeli amplifikacja zajdzie w locus(l), uzyska się 39-merowy produkt amplifikacji. Wobec tego, że na fig. 3 3'terminalny nukleotyd jest prawidłowy jak odnośny nukleotyd w badanej próbce, amplifikacja zajdzie. Podobnie zajdzie amplifikacja,jeżeli odnośny nukleotyd w badanej próbcejest wariantowym

162 338 21 nukleotydem, a stosowane diagnostyczne primery będą także zawierały 3'-terminalny wariantowy nukleotyd.

Jednakże nie zajdzie taka amplifikacja, gdy nastąpi błędne skojarzenie pomiędzy odnośnym nukleotydem w próbce i 3'-termmalnym nukleotydem diagnostycznego primera. Diagnostyczne primery dla locus(2) są tak skonstruowane, aby w przypadku amplifikacji dawały 49-merowy produkt amplifikacji, a dla locus, (3) - 59-merowy produkt amplifikacji. Ponieważ, jak widać z powyższego, wielkość pasma produktu amplifikacji jest sumą wielkości dwóch diagnostycznych primerów minus 1, w celu scharakteryzowania każdego locus można przeprowadzić różne testy z pojedynczą próbką w jednym naczyniu reakcyjnym przez odpowiednie zaprojektowanie poszczególnych primerów diagnostycznych. Gdy wzrasta suma wielkości diagnostycznych primerów, produkty amplifikacji można rozszczepić np. na żelu agarozowym. Można uzyskać korzystniejszy rozdział, jeżeli diagnostyczne primery są znakowane w dowolny dogodny sposób i produkty amplifikacji są rozszczepione np. na żelu akryloamidowym. Na fig. 3 litera P odnosi się do PCR primerów stosowanych jako kontrolne.

Na figurze 4 przedstawiono trzeci sposób realizacji wynalazku, w którym przeprowadza się konwencjonalną amplifikację sekwencji kwasu nukleinowego zawierającej prawidłowy nukleotyd w pozycji, w której mógłby znajdować się przypuszczalny wariantowy nukleotyd, na przykład stosując konwencjonalne PCR primery. Podobnie zaszłaby konwencjonalna amplifikacja, gdyby zamiast nukleotydu prawidłowego znajdował się przypuszczalny nukleotyd wariantowy. Produkt amplifikacji kontaktuje się z diagnostycznym primerem jak opisano uprzednio w odniesieniu do trzeciego sposobu realizacji wynalazku. Gdy produkt amplifikacji obejmuje sekwencję kwsów nukleinowych zawierającą prawidłowy nukleotyd jak opisano powyżej i stosuje się diagnostyczny primer zawierający 3'-terminalny prawidłowy nukleotyd, powstanie produkt wydłużenia diagnostycznego primera [przy zastosowaniu sekwencji nukleotydów wytworzonej przez konwencjonalną PCR amplifikację (określonej tu jako PCR produkt kontrolny) jako matrycy] pod warunkiem, że obecne są odpowiednie trifosforany nukleozydów i czynnik do polimeryzacji trifosforanów. Primer amplifikacji nie będzie potrzebny, ponieważ matryca dla wytworzenia produktu wydłużenia diagnostycznego primeru będzie juz zamplifikowana. Obecność lub nieobecność produktu wydłużenia diagnostycznego primera (oznaczonego jako DG na fig. 4A/b/ jak również obecność PCR kontrolnego produktu (oznaczonego jako PCR na fig. 4/b/) można wykryć, np. techniką elektroforetyczną.

Należy zauważyć, że produkt wydłużenia diagnostycznego primera powstanie także wówczas, gdy PCR produkt kontrolny będzie zawierał wariantowy nukleotyd, a stosowany primer diagnostyczny zawiera 3'-terminalny nukleotyd komplementarny do nukleotydu wariantowego.

Pasma wytworzonych produktów można uwidocznić np. tak jak przedstawiono na fig. 4/b/. Symbol N-, M-, C-, N, D, DG i PCR są objaśnione w odniesieniu do fig. 1/c/. Jednak pasmo produktu wydłużenia diagnostycznego primera ma mniejszy ciężar cząsteczkowy niż pasmo kontrolne PCR (jak pokazano na fig. 4b). W tym przypadku pasmo kontrolne reprezentuje rzeczywistą kontrolę wewnętrzną, ponieważ jeden z PCR primerów służy jako primer amplifikacji do amplifikacji produktu wydłużenia diagnostycznego primera. Gdy produkt kontrolny PCR zawiera, wariantowy nukleotyd, a primer diagnostyczny ma 3'-terminalny prawidłowy nukleotyd i vice versa, nie tworzy się produkt wydłużenia.

W razie potrzeby trzeci sposób realizacji wynalazku można przeprowadzić kontaktując na początku testu próbkę, która ma być badana, nie tylko z PCR primerami ale także z primerem diagnostycznym. Nie jest zatem konieczne opóźnienie użycia diagnostycznego primera aż do osiągnięcia żądanego stopnia amplifikacji kontrolnego produktu PCR. Rzeczywiście primer diagnostyczny można stosować razem z PCR primerami lub w dowolnym czasie po ich użyciu. Badanie można zatem przeprowadzić, np. przez zwykłe dodanie badanej próbki do jednego zbiornika, w którym znajdują się PCR primery, primer diagnostyczny, odpowiednie trifosforany nukleozydów i czynnik do polimeryzacji trifosforanów nukleozydów. Wytworzone produkty, a zatem i widoczne pasma produktów, będą takie same jak opisane powyżej i przedstawione na fig. 4.

162 338

Na figurze 5 przedstawiono czwarty sposób realizacji wynalazku, w którym przeprowadza się konwencjonalną amplifikację jak opisano w odniesieniu do fig. 4. Tak otrzymany produkt amplifikacji kontaktuje się następnie w warunkach hybrydyzacji albo z /a/ dwoma oddzielnymi primerami diagnostycznymi, określonymi powyżej, z których każdy zawiera 3'-terminalny prawidłowy nukleotyd, albo z /b/ dwoma diagnostycznymi primerami, określonymi powyżej, z których każdy zawiera 3'-terminalny wariantowy nukleotyd (patrz fig. 5a). Powstawanie produktów wydłużenia po jednym cyklu będzie świadczyć o tym, czy próbka kwasu nukleinowego zawiera prawidłowy czy wariantowy nukleotyd, a techniki elektroforetyczne będą dawały pasmo wzorcowe podobne do przedstawionego na fig. 5b. Należy zauważyć jednakże, że gdy stosuje się dwa diagnostyczne primery, jeden primer diagnostyczny służy jako primer amplifikacji dla drugiego primera diagnostycznego. W razie potrzeby zatem otrzymany dowolny produkt (produkty) może sam być poddawany amplifikacji. Tak więc po kilku dalszych cyklach, powstaną produkty o nizszym ciężarze cząsteczkowym niż produkty przedstwione przez dodatkowe pasmo na fig. 5c, w ilościach zależnych od względnych stosunków początkowych oligonukleotydów PCR primera i dodanych diagnostycznych primerów. Produkty amplifikacji PCR można łatwo odróżnić od produktów amplifikacji wydłużonego primera diagnostycznego przez np. zwiększenie lub zmniejszenie odległości od miejsc wiązania PCR primerów w genomie.

W razie potrzeby czwarty sposób realizacji wynalazku można przeprowadzić kontaktując badaną próbkę na początku badania nie tylko z PCR primerami ale także z diagnostycznymi primerami. Nie jest zatem konieczne opóźnienie użycia diagnostycznego primera aż do osiągnięcia żądanego stopnia amplifikacji kontrolnego produktu PCR. Rzeczywiście primery diagnostyczne można stosować razem z primerami PCR albo w dowolnym czasie po ich zastosowaniu. Test można zatem przeprowadzić np. przez zwykłe dodawanie badanej próbki do jednego zbiornika, który zawiera PCR primery, diagnostyczne primery, odpowiednie trifosforany nukleozydów i czynnik do polimeryzacji trifosforanów nukleozydów. Jeżeli test przeprowadza się w ten sposób, powstają produkty diagnostyczne o niższym ciężarze cząsteczkowym względem powyższych, dając tym samym dodatkowe pasma przedstawiono na fig. 5.

Na figurze 6 (nie w skali) przedstawiony jest ludzki gen α 1-antytrypsyny, dobrze znany w technice [G.L. Long i in., Biochemistry, + 23 str. 4828-4837, 1984], w kstórym pokazano m.in. względne pozycje egzonów III i IV, w których odpowiednio mają miejsce potencjalne SiZ mutacje białka al antytrypsyny. Zwłaszcza figura 6 obrazuje egzon III genu al antytrypsyny i pokazuje pozycję wariantu S, w którym kodon GAA jest zmutowany do GTA, powodując w rezultacie powstawanie reszty waliny w pozycji 264 zamiast reszty kwasu glutaminowego. Może być użyty primer I o następującej sekwencji:

5' CCCACCTTCCCCTCTCTCCAGGCAAATGGG 3' I która hybrydyzuje z pozycjami 7440-7469 genu al antytrypsyny i, albo primer II o następującej sekwencji:

5' GGGCCTCAGTCCCAAATGGCTAAGAGGTG 3' II albo primer Ha (CT 3' błędne skojarzenie oparte na II) o sekwencji:

5' GGGCCTCAGTCCCAACATGGCTAAGAGGTT 3' Ha z których każdy jest zaprojektowany dla pozycji 7770-7799 genu al antytrypsyny.

Na figurze przedstawiono także egzon V genu al antytrypsyny i pokazano pozycję wariantu Z, w którym kodon GAG jest zmutowany do A AG powodując w rezultacie powstawanie reszty lizyny w pozycji 342 zamiast reszty kwasu glutaminowego. Dogodnie może być użyty primer III o sekwencji:

5' TGTCCACGTGAGCCTTGCTCGAGGCCTGGG 3' III która hybrydyzuje z pozycjami 9890-9919 genu a antytrypsyny, i primer IV o sekwencji:

5' GAGACTTGGTATTTTGTTCAATCATTAAG 3' IV która hybrydyzuje z pozycjami 10081-10109 genu a antytrypsyny. Podstawowa numeracja, wyszczególniona powyżej, jest podana według Biochem. 23, 4828-4837, 1984.

Na figurze 7 przedstawiono wyniki uwidocznienia pasm w żelu otrzymanym w przykładach I i

II. Ścieżka 1 reprezentuje plazmid zawierający egzon V i rozszczepiony przez Alu I; ścieżka 2 pokazuje markera wielkości, którym jest DNA bakteriofaga 0 Χ174 rozszczepiony przez Hae III;

162 338 ścieżka 3 dotyczy amplifikacji egzonu III z primerami I i II określonymi powyżej i amplifikacji egzonu V z primerami III i IV określonymi powyżej, w tej samej mieszaninie reakcyjnej do produktów o 360 i 220 parach zasad odpowiednio. Ścieżka 4 wykazuje, że nie zachodzi amlifikacja egzonu III, gdy stosuje się primery I i Ila, określone powyżej, ale zachodzi amplifikacja egzonu V, gdy stosuje się określone powyżej primery III i IV. Ścieżka 5 przedstawia ujemną próbę kontrolną, w której stosuje się primery I, II, III i IV w warunkach odpowiednich do promowania amplifikacji, ale w której me jest obecny genomowy DNA.

Ścieżki 1-3 na fig. 8 pokazują wyniki z przykładu III, ścieżki 5-8 przedstawiają wyniki użycia prawidłowych i mutantowych diagnostycznych primerów, w których me nastąpiła destabilizacja zgodnie z przykładem IV, a ścieżka 9 dotyczy markera wielkości bakteriofaga 0 Χ174. Ścieżka 1 pokazuje wynik użycia następującej sekwencji nukleotydów:

5' TGGTGATGATGATATCGTGGGTGAGTTCATTTT V jako primera diagnostycznego i oligonukleotydu I, określonego powyżej, jako primera amplifikacji· . .

Użyty ludzki genomowy DNA pochodził z prawidłowej homozygoty zawierającej prawidłowy nukleotyd /A/ w potencjalnym punkcie mutacji S w ludzkim genie al antytrypsyny. Wyraźnie jest widoczny spodziewany produkt amplifikacji 0 267 parach zasad. Ścieżka 2 pokazuje wynik zuzycia następującej sekwencji nukleotydów:

5' TGGTGATGATATCGTGGGTGAGTTCATTTA VI jako primera diagnostycznego i oligonukleotydu I, określonego powyżej, jako primera amplifikacji. Użyty ludzki genomowy DNA pochodził z prawidłowej z homozygoty zawierającej prawidłowy nukleotyd /A/ w potencjalnym punkcie mutacji S w ludzkim genie al antytrypsyny. W obecności błędnego skojarzenia A-A nie powstaje produkt amplifikacji o 267 parach zasad. Ścieżka 3 pokazuje kontrolne pasmo oparte na ludzkim genie apolipoproteiny B przy stosowaniu sekwencji

5' AATGAATTTATCAGCCAAAACTTTTACAGG XII i

5' CTCTGGGAGCACAGTACGAAAAACCACTT XIV

Ścieżka 4 na lewo jest pusta.

Ścieżka 5 przedstawia wynik użycia następującej sekwencji nukleotydów:

5' CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACG 3' VII jako diagnostycznego primera w przykładzie IV. Diagnostyczny primer zawiera 3'-terminalny nukleotyd /G/ zdolny do tworzenia pary zasad z prawidłowym nukleotydem /C/ w potencjalnym punkcie mutacji Z, poza tym jest całkowicie komplementarny do DNA próbki. Użyta próbka DNA pochodziła z prawidłowej homozygoty zawierającej prawidłowy nukleotyd /C/ w potencjalnym punkcie mutacji Z w ludzkim genie al antytrypsyny.

Ścieżka 6 przedstawia wynik użycia następującej sekwencji nukleotydów:

5' CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACA 3' VIII jako diagnostycznego primera w przykładzie IV. Diagnostyczny primer zawiera 3'-terminalny nukleotyd /A/ zdolny do tworzenia pary zasad z mutantowym nukleotydem /T/ w punkcie mutacji Z, ale jest całkowicie komplementarny z DNA próbki. Użyta próbka DNA pochodziła z prawidłowej homozygoty zawierajcąej prawidłowy nukleotyd /C/ w potencjalnym punkcie mutacji Z w ludzkim genie al antytrypsyny. Ścieżka 7 przedstawia wynik użycia sekwencji nukleotydów VII jako jprimera diagnostycznego w przykładzie IV. Użyta próbka DNA pochodziła z homozygoty z zaburzeniem genetycznym w genie ludzkiej al antytrypsyny, zawierającej mutantowy nukleotyd /T/ w punkcie mutacji Z.

Ścieżka 8 przedstawia wynik użycia sekwencji nukloetydów VIII jako primera diagnostycznego w przykładzie IV. Użyta próbka DNA pochodziła z homozygoty z zaburzeniem genetycznym w genie ludzkiej al antytrypsyny, zawierającej mutantowy nukleotyd /T/ w punkcie mutacji Z. W każdym z testów, do których odnoszą się ścieżki 5-8 jako primera amplifikacji używano sekwencję nukleotydów IV, określoną powyżej.

Można zauważyć, ze obecność błądnego skojarzenia A-C (ścieżka 6) nie hamuje całkowicie powstawania produktu amplifikacji o 150 parach zasad, a obecność błędnego skojarzenia GT hamuje nawet w mniejszym stopniu (ścieżka 7).

162 338

Na figurze 9 przedstawiono wynik uwidocznienia pasm w żelu otrzymanym w przykładzie IV. Ścieżki 1 i 14 dotyczą DNA bakteriofaga Χ174 rozszczepionego za pomocą Hae III. Ścieżka 2 przedstawia wynik użycia sekwencji nukleotydowej;

5' CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATAGACG 3' IX jako primera diagnostycznego w obecności próbki DNA zawierającego prawidłowy nukleotyd /C/ w potencjalnym punkcie mutacji Z w ludzkim genie al antytrypsyny (próbka DNA z prawidłowej homozygoty). Diagnostyczny primer zawiera celową zmianę (podkreślone A w sekwencji IX zamiast C) od 3' końca ale 3'-terminalny nuklotyd /G/ zdolny jest do tworzenia pary z prawidłowym nukleotydem /C/ w potencjalnym punkcie mutacji Z.

Ścieżka 3 przedstawia wynik stosowania sekwencji nukleotydowej;

5' CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATAGACA 3' X jako diagnostycznego primera w obecności próbki DNA zawierającego prawidłowy nukleotyd /C/ w potencjalnym punkcie mutacji z (próbka DNA z prawidłowej homozygoty). Diagnostyczny primer zawiera celową zmianę (podkreślone A w sekwencji X zamiast C) w piątym nukleotydzie od 3'końca, a 3'terminalny nukleotyd /A/ jest zdolny do tworzenia pary z mutantowym nukleotydem /T/ jeśli taki znajduje się w potencjalnym miejscu mutacji Z.

Ścieżka 4 przedstawia wynik stosowania sekwencji nukleotydowej IX (określonej powyżej) jako diagnostycznego primera w obceności próbki DNA z heterozygoty z mutacją Z, a zatem nosiciela zaburzenia genetycznego polegającego na niedoborze ludzkiej al antytrypsyny.

Ścieżka 5 przedstawia wynik stosowania sekwencji nukleotydowej X (określonej powyżej) jako diagnostycznego primera w obecności próbki DNA z heterozygoty z mutacją Z, a zatem nosiciela zaburzenia genetycznego polegającego na niedoborze ludzkiej al antytrypsyny.

Ścieżka 6 przedstawia wynik użycia sekwencji nukleotydowej IX (określonej powyżej) jako diagnostycznego primera w obecności próbki DNA z homozygoty dotniętej zaburzeniem genetycznym ludzkiej al antytrynsyny.

Ścieżka 7 przedstawia wynik użycia sekwencji nukleotydowej X (określonej powyżej) jako diagnostycznego primera w obecności próbki DNA z homozygoty dotkniętej zaburzeniem genetycznym ludzkiej al antytrypsyny.

Ścieżka 8 przedstawia wynik stosowania sekwencji nukleotydowej:

5' CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGCCG 3' XI jako primera diagnostycznego w obecności próbki DNA zawierającej prawidłowy nukleotyd /C/ w potencjalnym punkcie mutacji Z ludzkiego genu X al antytrypsyny (próbka DNA z prawidłowej homozygoty). Diagnostyczny primer zawiera celową zmianę (podkreślone C w sekwencji XI zamiast A) w trzecim nukleotydzie od 3' końca, ale 3'-terminalny nukleotyd /G/ zdolny jest do tworzenia pary z prawidłowym nukleotydem /C/ w potencjalnym punkcie mutacji Z.

Ścieżka 9 przedstawia wynik stosowania sekwencji nukleotydowej:

5' CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGCCA 3' XII jako diagnostycznego primera w obecności próbki DNA zawierającej prawidłowy nukleotyd /C/ w potencjalnym punkcie mutacji Z (próbka DNA z prawidłowej homozygoty). Diagnostyczny primer zawiera celową zmianę (pokreślone C w sekwencji XII zamiast A) w trzecim nukleotydzie od 3' końca, a 3'-termrnalny nukleotyd /A/ zdolny jest do tworzenia pary z mutantowym nukleotydem /T/, jeżeli występuje on w potencjalnym punkcie mutacji Z.

Ścieżka 10 przedstawia wynik stosowania sekwencji nukleotydowej XI, określonej powyżej, jako primera diagnostycznego w obecności próbki DNA z heterozygoty z mutacją Z, a zatem nosiciela zaburzenia genrycznego polegającego na niedoborze ludzkiej al 1 antytrypsyny.

Ścieżka 11 przedstawia wynik stosowania sekwencji nukleotydowej XII, określonej powyżej, jako primera diagnostycznego w obecności próbki DNA z heterozygoty z mutacją Z, a zatem nosiciela zaburzenia genetyczengo ludzkiej al antytrypsyny.

Ścieżka 12 przedstawia wynik stosowania sekwencji nukleotydowej XI, określonej powyżej, jako primera diagnostycznego w obecności próbki DNA z homozygoty dotkniętej zaburzeniem genetycznym ludzkiej al antytrypsyny.

Ścieżka 13 przedstawia wynik stosowania sekwencji nukleotydowej XII, określonej powyżej, jako primera diagnostycznego w obecności próbki DNA z homozygoty dotkniętej zaburzeniem genetycznym ludzkiej al antytrypsyny.

162 338 25

W każdym teście reprezentowanym przez ścieżki 2-13 stosowano sekwencję nukleotydową IV jako primer amplifikacji oraz sekwencje nukleotydowe XIII i XIV:

AATGAATTTATCAGCCAAAACTTTTACAGG XIII CTCTGGGAGCACAGTACGAAAAACCACTT XIV stosowane jako kontrolne. Pasma odpowiadające sekwencjom kontrolnym są oznaczone jako /C/ na fig. 9 i odpowiadają produktowi amplifikacji o 510 parach zasad z egzonu 26 ludzkiego genu apoliproteiny B.

Na figurze 10 przedstawiono zastosowanie kasetowego układu plazmidowego. Plazmid pAT 153 zawierający region oporności na ampicylinę (Ap^r) i tetracyklinę (Tc^r) oraz miejsca restrykcji dla EcoRI, BamHI i Sal I trawi się za pomocą EcoRI i BamHI. Syntetyczną kasetę, zawierającą dupleks DNA z błędnie skojarzonym nukleotydem (w centrum) odpowiedzialny za obecność zarówno prawidłowej jak i wariantowej sekwencji, liguje się stosując ligazę DNA χ T4 z plazmidem gospodarza, jak pokazano narysunku.

Poniżej podano szczegółowy opis układu: Wytworzono syntetyczne kasety DNA, z których każda zawierała dwa połączone 65-metrowe DNA zawierające restrykcyjne końce właściwe dla EcoRI i Barn HI 1 środkową parę zasad, która jest błędnie skojarzona i jest odpowiedzialna za wariantowy nukleotyd. Kasety te wprowadzono do plazmidu gospodarza pAT 153 jak opisano powyżej i po transformacji wyizolowano klony wrażliwe na tetracyklinę 1 wyekstrahowano plazmid. Ekstrakty plazmidowe były następnie użyte w drugorzędowej transformacji w celu otrzymania klonów z prawidłowymi lub wariantowymi insertami. Aby sprawdzić, czy klony zawierają kompletną prawidłową czy zmutowaną sekwencję, sekwencjonowano około 2//g każdego z nich, po denaturacji NaOH,z zastosowaniem polimerazy DNA T4 (Seąuenase, US Biochemicals) i primera z końcem znakowanym 32P. Gdy znaleziono co najmniej jedną prawidłową i jedną wariantową sekwencję każdego typu, hodowano każdy z reprezentatywnych typów w masie, wyekstrahowano plazmid i oczyszczono w gradiencie CsCl. Następnie kasety trawiono Sal I, ekstrahowano układem fenol/chloroform, wytrącono i przemyto 70% etanolem. Kasety wówczas nadawały się do użycia, np. w reakcjach łańcuchowych z polimerazą, w celu określenia wrażliwości i specyficzności różnych oligonukleotydów.

Figura 11 ilustruje piąty sposób realizacji wynalazku (liniowa amplifikacja). W a/ jest pokazana prawidłowa genomowa sekwencja DNA wraz z dwoma diagnostycznymi primerami, z których jeden jest komplementarny przy 3'końcu do prawidłowej genomowej sekwencji DNA, a drugi zawiera nukleotyd komplementarny przy 3'końcu do przewidywanego nukleotydu wriantowego. W b/ pokazana jest wariantowa genomowa sekwencja DNA wraz z tymi samymi primerami diagnostycznymi. Gdy z primerami kontaktuje się którąkolwiek genomową sekwencję DNA w warunkach odpowiednich dla komplementarnej hybrydyzacji, w obu przypadkach zajdzie hybrydyzacja. Dodanie wszystkich czterech trifosforanów nukleozydów w warunkach odpowiednich dla wydłużenia primera doprowadzi tylko do wydłużonego produktu w przypadku a/ primera o prawidłowej sekwencji i b/ primera o wariantowej sekwencji, wydłużeniu natomiast innego primera zapobiega błędne skojrzenie. Ponadto, jak pokazano na fig. 11 w części c/ gdy zamiast czterech dodaje się tylko trzy lub mniej odpowiednich trifosforanów nukleozydów, wydłużenie odpowiedniego primera w danym punkcie jest uniemożliwione z powodu braku odpowiedniego trifosforanu/ów/ nukleozydu.

Na figurze 12 przedstawiono wyniki uwidocznienia pasm w żelu otrzymanym w przykładzie V.

Ścieżki 1 i 2 odpowiadają DNA z prawidłowej homozygoty (MM), ścieżki 3 i 4 odpowiadają DNA z heterozygoty (MS), a ścieżki 5 i 6 - DNA z wariantowej homozygoty (SS). W badaniach, którym odpowiadają ścieżki 1, 3 i 5 stosowano oligonukleotyd XXII (prawidłowy) a w badaniach, którym odpowiadają ścieżki 2, 4 i 6 - oligonukleotyd XXI (wariantowy). Jak przewidywano wydłużenie oligonukleotydu me zachodzi w przypadku ścieżek 2 lub 5. Pasma wykrytego produktu wskazano na rysunku za pomocą szewronów.

Na figurze 13 przedstawiono wyniki uwidocznienia pasm w żelu otrzymanym w przykładzie VI.

Ścieżka z lewego brzegu odnosi się do markerów wielkości stosowanych do potwierdzenie wielkości otrzymanych produktów. Ścieżki 1 1 2 odpowiadają DNA z prawidłowej homozygoty

162 338 (MM), ścieżki 3 i 4 odpowiadają DNA z heterozygoty (MZ), a ścieżki 5 i 6 - DNA z wariantowej homozygoty (ZZ). W badaniach, którym odpowiadają ścieżki 1,3 i 5 stosowano primery XIX i XI, a w badaniach których dotyczą ścieżki 2, 4 i 6 - primery XII i XX. Jak przewidywano wydłużenie primeru nie zachodzi w przypadku ścieżek 2 lub 5. Pasma wykrytego produktu wskazano na rysunku za pomocą szewronów.

Sekwencja locus S w genie al antytrypsyny (egzon III). Zasady przedstawione w dolnym zestawieniu określają prawidłową sekwencję każdego locus. Podkreślone zasady w primerach przedstawiają celowe błędne skojarzenia wstawione w celu destabilizacji primerów. Współrzędne są wyznaczone przez Longa i in. (1984).

Biochemistry 23 4828-4837

5' CCCTGATGAGGGGAAACTACAGCACCTGGT XXI

5' GAATGATGAGGGGAAAATAAAGAAAATGGA XXXII

5'CTTCCTGCCTGATGAGGGGAAACTACAGCACCTGGa

3'GAAGGACGGACTACTCCCCTTTGATGTCGTGGACCt aAAATGAACTCACCCACGATATCATCACCAAGTTCCTGGAAA 3' tTTTACTTGAGTGGGTGCTATAGTAGTGGTTCAAGGACCTTT 5'

TTTTACTTGAGTGGGTGCTATAGTAGTGGT 5' XXIII

ATTTACrTGAGTGGGTGCTATAGTAGTGGT 5' XXIV

CACACCTCTTAGCCATGTTGGGACTGAGGCCCATCAGGACTGGC 3' GTGTGGAGAATCGGTACAACCCTGACTCCGGGTAGTCCTGACCG 5' GTGGAGAATCGGTACAACCCTGACTCCGGG 5'

TTGGAGAATCGGTACAACCCTGACTCCGGG 5'

Sekwencja locus Z w genie al antytrypsyny (egzon V)

Zasady przedstawione w dolnym zestawieniu określają prawidłową sekwencję każdego locus. Podkreślone zasady w primerach przedstawiają celowe błędne skojarzenie wstawione w celu destabilizacji primerów

5' CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCCTCGACA XVI

5' CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCCTCGACG XV

5' CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACA X

5' CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATAGACG IX

5' CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGCCA XII

5' CCGTGCATAAGGATGTGCTGAAAATAGACG XI

5' CCGTGCATAAGGCGGGGCGGACCACGGAAA VIII

5' CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACG VII

5'TCCAGGCCGTGCCTCCGGCCGCTGACCATCGCCg

3'AGGCACGGCACGTACCCCGACACGACTGGTAGCTGc gAGAACGGGACTGAACTGAAGCTGCTGGGGCATGCCCCTAGAGGCC 3' cCCCCCAGGTGAGTTGGACGACCCCGGCACCCACATCTCCGG 5'

CCCCCCACCTGACTTCGACGACCCCGGTCC 5' XVII

TTCCTCACCCGCCTCCGACGACCCCGCAA 5' XVIII CTCCTCACCCGACTCCGACCCCGGCAC 5' XIX

TTCACCACCTGACTTCGACGACCCCGGTCC 5' XX

Wynalazek ilustrują, nie ograniczając jego zakresu, następujące przykłady. W przykładach, jeśli me stwierdzono inaczej, substancje stosowano w następujących ilościach lub stężeniach:

Substrat DNA: ' μ% x ludzkiego genomowego DNA;

oligonukleotydy. lOOpmoli każdego odpowiedniego oligonukleotydu; trifosforany deoksynukleozydów: każdy w końcowym stężeniu 1,5 mM; bufor (końcowe stężenia w mieszaninie reakcyjnej):

67mMtris (pH 8,8 z HC1), 16,6mM siarczanu amonu, 6,7 mM chlorku magnezu, 10 mM /J-merkaptoetanolu, 6,7 uM EDTA, bufor obciążający: 35% Ficollu 70- (Ficoll 70 jest syntetycznym polimerem wytworzonym przez kopohmeryzację sacharozy i epichlorohydryny, o średnim ciężarze cząsteczkowym 70000;

162 338 27 produkt f-my Pharmacia), 200 x mMTris-octanu 100 mM octanu sodu, 5 mM EDTA,0,2% błękitu bromofenolowego;

markery wielkości: DNA bakteriofaga 0 Χ174 rozszczepiony za pomocą Hae III; Wielkość pasm w parach zasad jest następująca: 1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118 i 72.

Przykład I. 1/rg ludzkiego genomowego DNA, 100 pmoli każdego z oligonukleotydów I, II, III i IV jak zdefiniowano w poprzedniej części niniejszego opisu, każdy z czterech trifosforanów deoksynukleozydów w stężeniu końcowym 1,5 mM i bufor w końcowych stężeniach wyszczególnionych powyżej, miesza się w 1,5 ml probówce mikrowirówkowej z nakrętką i objętość doprowdza do 100μ1 jałową wodą destylowaną. Probówkę zamyka się i umieszcza w łaźni z wrzącą wodą na 5 minut. Reakcję inicjuje się dodaniem Ιμΐ polimerazy Taq zawierającego 1 jednostkę enzymu (Anglian Biotech, seria 3, rozcieńczenie do 1 jednostki/μΐ powyższym buforem). Probówkę inkubuje się w temperaturze 58°C w ciągu 4 minut, a następnie w temperaturze 91°C w ciągu 2 minut. Ten reżym 58°C/91°C ogrzewanie/chłodzenie powtarza się przez 5 dalszych cykli, w tym momencie dodaje się dalszą jednostkę enzymu (jak wyżej). Reżym 58°C/91°C ogrzewanie/chłodzenie kontynuuje się przez 6 dalszych cykli, a następnie dodaje się dalszą jednostkę enzymu (jak wyżej). Powyższy reżym ogrzewanie/chłodzenie kontynuuje się przez inne 6 cykli, a następnie dodaje dalszą jednostkę enzymu (jak wyżej), następuje innych 5 cykli i dodanie dalszej jednostki enzymu (jak wyżej), a następnie dalsze dwa cykle i dodanie dalszej jednostki enzymu (jak wyżej). Po tym reżymie następuje inkubacja w temperaturze 58°C w ciągu 20 minut.

Wykrycie produktów amplifikacji przeprowadza się przez połączenie 15μ1 mieszaniny reakcyjnej z 5μ1 buforu do nanoszenia na zel, a następnie elektroforezę w żelu agarozowym (3% ,,NuSieve“) zawierającym bromek etydyny w stężeniu 2μg/ml. Elektroforezę prowadzi się wobec markerów wielkości w celu potwierdzenia prawidłowej wielkości produktów amplifikacji. Materiał w żelu uwidacznia się za pomocą transiluminatora (długość fali 300 nm) i wykonuje się fotografię polaroidową. Ścieżka 3 na figurze 7 przedstawia wyniki tego uwidocznienia. Tak więc, ścieżka 3 przedstawia amplifikację egzonu III z primerami I i II, jak zdefiniowano w poprzedniej części opisu, z wytworzeniem produktu o 360 parach zasad i amplifikację egzonu V z primerami III i IV, jak zdefiniowano w poprzedniej części opisu, z wytworzeniem produktu o 220 parach zasad.

Przykład II. Powtarza się sposób według przykładu I, z tą różnicą, że primer II zastępuje się primerem Ila, jak zdefiniowano w poprzedniej części niniejszego opisu. Figura 7, ścieżka 4 przedstawia wyniki uwidocznienia żelu otrzymanego w tym przykładzie. Można stwierdzić, że nie nastąpiła amplifikacja egzonu III przy użyciu primrów I i la, jak zdefiniowano w poprzedniej części mniejszego opisu, ale amplifikacja ta nastąpiła w przypadku egzonu V z primerami III i IN, jak zdefiniowano w poprzedniej części niniejszego oisu, z wytworzeniem takiego samego produktu o 220 parach zasad, co w przykładzie I. Tak więc, przykład II wykazuje, że błędne skojarzenie przy 3'-końcu oligonukleotydowego primera zapobiega lub przynajmniej częściowo hamuje inicjację aktywności polimerazy.

Przykład III. Allel S ludzkiej σ-1-antytrypsyny.

\μ% ludzkiego genomowego DNA i 100 pmoli każdego z oligonukleotydów wyszczególnionych poniżej, każdy z czterech trifosforanów deoksynukleozydów w stężeniu końcowym 1,5 mM i bufor w końcowych stężeniach wyszczególnionych powyżej miesza się w, 1,5 ml probówce mikrowirówkowej z nakrętką i doprowadza objętość do 100μΙ jałową wodą destylowaną. Probówkę zamyka się i umieszcza w łaźni z wrzącą wodą na 5 minut. Reakcję inicjuje się dodaniem 1μ1 polimerazy Taq zawierającego 1 jednostkę enzymu (Anglian Biotech, seria 3, rozcieńczenie do 1 jednostki/μΐ powyższym buforem). Probówkę inkubuje się w stemperaturze 58°C w ciągu 4 minut, a następnie w temperaturze 91 °C w ciągu 2 minut. Ten reżym 58°C/91°C ogrzewanie/chłodzenie powtarza się przez 5 dalszych cykli, w tym momencie dodaje się dalszą jednostkę enzymu (jak wyżej). Reżym 58°C/91°C - ogrzewanie/chłodzenie kontynuuje się przez dalszych 6 cykli, a następnie dodaje się dalszą jednostkę enzymu (jak wyżej). Powyższy reżym ogrzewanie/chłodzenie kontynuuje się przez inne 6 cykli, a następnie dodaje dalszą jednostkę enzymu (jak wyżej) następuje innych 5 cykli i dodanie dalszej jednostki enzymu (jak wyżej), a następnie dalsze 2 cykle i dalszej jednostki enzymu (jak wyżej). Po tym reżymie następuje inkubacja w temperaturze 58°C w ciągu 20 minut.

162 338

Na podstawie powyższego protokołu przeprowadzono następujące testy:

a) zastosowanym oligonukleotydem jest 5'TGGTGATGATATCGTGGGTGAGTTCATTTT V orazoligonukleotyd oznaczony 1jak zdefiniowano w powyższej części niniejszego opisu. Stosowanym ludzkim DNA genomowym jest DNA od normalnej homozygoty nie dotkniętej zaburzeniem genetycznym dotyczącym σ-1-antytrypsyny ludzkiej, oraz

b) zastosowanym oligonukleotydem jest TGGTGATGATATCGTGGGTGAGTTCATTTA VI oraz oligonukleotyd oznaczony I jak zdefiniowano w powyższej części niniejszego opisu. Stosowanym ludzkim DNA genomowym jest DNA od normalnej homozygoty nie dotkniętej zaburzeniem genetycznym dotyczącym σ-1-antytrypsyny ludzkiej.

Wykrycia produktów amplifikacji dokonuje się za pomocą połączenia 15 μ\ mieszaniny reakcyjnej z 5/zl buforu do nanoszenia na zel, a następnie elektroforezy w żelu agarozowym (3% „NuSieve“) zawierającym bromek etydyny w stężeniu 2//g/ml). Elektroforezę prowadzi się wobec markerów wielkości (ścieżka 9 na figurze 8) w celu potwierdzenia prawidłowej wielkości produktów amplifikacji. Materiał w żelu uwidacznia się za pomocą transiluminatora (długość fali 300 nm) i wykonuje się fotografię polaroidową. Ścieżka 1 i 2 na figurze 8 przedstawia wyniki tego uwidoczniania. Tak więc, ścieżka 1 pokazuje, ze amplifikacja zachodzi, gdy stosuje się sekwencję nukleotydu V mającą 3'-końcowy nukleotyd komplementarny z odpowiednim nukleotydem przy potencjalnym punkcie mutacji S w próbce użytego DNA i wytworzony został produkt amplifikacji o 267 parach zasad. Jednak ścieżka 2 pokazuje, ze amplifikacja nie zachodzi, gdy powstaje błędne skojarzenie przy 3'-zakończeniu primera diagnostycznego, przy czym użyty primer diagnostyczny ma nukleotyd /A/ przy swym 3'-zakończemu, który błędnie skojarzył się z nukleotydem /A/ w potencjalnym punkcie mutacji S w próbce DNA od normalnej homozygoty.

Przykład IV. Allel Z.

1pg ludzkiego genomowego DNA i lOOpmoli każdego z oligonukleotydów wyszczególnionych poniżej, każdy z czterech trifosforanów deoksynukleozydów w stężeniu końcowym 1,5 mM i bufor w stężeniach końcowych wyszczególnionych powyżej miesza się w, 1,5 ml probówce mikrowirówkowej z nakrętką i doprowadza objętość do 100μΐ jałową wodą destylowaną. Probówkę zamyka się i umieszcza w łaźni z wrzącą wodą na 5 minut. Reakcję inicjuje się dodaniem 1 μ\ polimerazy Taq zawierającego 0,5 jednostki enzymu (Anglian Biotech, seria 9, rozcieńczenie do 0,5 jednostki/μΙ powyższym buforem). Probówkę inkubuje się w temperaturze 60°C w ciągu 4 minut, a następnie w temperaturze 91°C w ciągu 2 minut. Ten reżym 60°C/91°C ogrzewanie/chłodzenie kontynuuje się przez dalszych 5 cykli, w tym momencie dodaje się dalsze 0,5 jednostki enzymu (jak wyżej). Reżym 60°C/91°C - ogrzewanie/chłodzenie kontynuuje się przez dalszych 6 cykli, a następnie dodaje się dalsze 0,5 jednostki enzymu (jak wyżej). Powyższy reżym ogrzewanie/chłodzenie kontynuuje się przez inne 6 cykli, a następnie dodaje dalsze 0,5 jednostki enzymu (jak wyżej), następnie innych 5 cykli i dodanie dalsze 0,5 jednostki enzymu (jak wyżej) a następnie dalsze trzy cykle i dalsze dodanie 0,5 jednostki enzymu (jak wyżej). Po tym reżymie następuje inkubacja w temperaturze 60°C w ciągu 20 minut.

Na podstawie powyższego protokołu przeprowadzono następujące testy:

a) zastosowanymi oligonukleotydami są IX i IV jak zdefiniowano w powyższej części niniejszego opisu, a zastosowanym ludzkim DNA genomowym jest DNA od normalnej homozygoty nie dotkniętej zaburzeniem genetycznym dotyczącym σ-1-antytrypsyny ludzkiej,

b) zastosowanymi oligonukleotydami są X i IV jak zdefiniowano w powyższej części niniejszego opisu, a zastosowanym ludzkim DNA genomowym jest DNA od normalnej homozygoty nie dotkniętej zaburzeniem genetycznym dotyczącym σ-1-antytrypsyny ludzkiej,

c) zastosowanymi oligonukleotydami są IX i IV jak zdefiniowano w powyższej części niniejszego opisu, a zastosowanym ludzkim DNA genomowym jest DNA od hterozygoty z allelem Z σ-1-antytrypsyny,

d) zastosowanymi oligonukleotydami są X i IV jak zdefiniowano w powyższej części niniejszego opisu, a zastosowanym ludzkim DNA genomowym jest DNA od heterozygoty z allelem Z σ-1-antytrypsyny,

162 338

e) zastosowanymi oligonukleotydami są IX i IV jak zdefiniowano w powyższej części niniejszego opisu, a zastosowanym ludzkim DNA genomowym jest DNA od homozygoty(ZZ) dotkniętej zaburzeniem genetycznym dotyczącym a-l-antytrypsyny ludzkiej,

f) zastosowanymi oligonukleotydami są X i IV jak zdefiniowano w powyższej części mniejszego opisu, a zastosowanym ludzkim DNA genomowym jest DNA od homozygoty (ZZ) dotkniętej zaburzeniem genetycznym dotyczącym α-1-antytrypsyny ludzkiej,

g) zastosowanymi oligonukleotydami są XI i IV jak zdefiniowano w powyższej części niniejszego opisu, a zastosowanym ludzkim DNA genomowym jest DNA od normalnej homozygoty nie dotkniętej zaburzeniem genetycznym dotyczącym α-1-antytrypsyny ludzkiej,

h) zastosowanymi oligonukleotydami są XII i IV jak zdefiniowano w powyższej części niniejszego opisu, a zastosowanym ludzkim DNA genomowym jest DNA od normalnej homozygoty nie dotkniętej zaburzeniem genetycznym a-l-antytrypsyny ludzkiej,

i) zastosowanymi oligonukleotydami są XI i IV jak zdefiniowano w powyższej części niniejszego opisu, a zastosowanym ludzkim DNA genomowym jest DNA od heterozygoty z allelem Z a-l-antytrypsyny ludzkiej,

j) zastosowanymi oligonukleotydami są XII i IV jak zdefiniowano w powyższej części niniejszego opisu, a zastosowanym ludzkim DNA genomowym jest DNA od heterozygoty z allelem Z a-l-antytrypsyny ludzkiej,

k) zastosowanymi oligonukleotydami są XI i IV jak zdefiniowano w powyższej części niniejszego opisu, a zastosowanym ludzkim DNA genomowym jest DNA od homozygoty (ZZ) dotkniętej zaburzeniem genetycznym dotyczącym α-1-antytrypsyny ludzkiej,

l) zastosowanymi oligonukleotydami są XII i IV jak zdefiniowano w powyższej części niniejszego opisu, a zastosowanym ludzkim DNA genomowym jest DNA od homozygoty (ZZ) dotkniętej zaburzeniem genetycznym dotyczącym α-1-antytrypsyny.

W każdym teście używa się sekwencji nukleotydów XIII i XIV jako kontroli amplifikacji.

Wykrycia produktów amplifikacji dokonuje się za pomocą połączenia 15μ1 mieszaniny reakcyjnej z 5μ1 buforu do nanoszenia na żel, a następnie elektroforezy w 1,4% żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny w stężeniu 0,5j7g/ml. Elektroforezę prowadzi się wobec markerów wielkości jak zdefiniowano w powyższej części niniejszego opisu w celu potwierdzenia prawidłowej wielkości produktów amplifikacji. Materiał w żelu uwidacznia się za pomocą transiluminatora (długość fali 300 nm) i wykonuje się fotografię polaroidową. Ścieżki 2-13 na figurze 9 przedstawiają wyniki tego uwidoczniania. Ścieżki 1 i 14 przedstawiają pasma markerów wielkości. I tak, ścieżki 2-7 pokazują, że destabilizacja primera diagnostycznego przez zmianę piątego nukleotydu o 3'-zakończenia nie jest w pełni skuteczna pod względem umożliwienia primerowi odróżnienia próbki normalnego i mutantowego DNA w warunkach reakcji. Tym niemniej jednak, ścieżki 8-13 pokazują, ze zmiana trzeciego nukleotydu od 3'-zakończenia primera diagnostycznego jest skuteczna pod względem umożliwiania primerowi odróżnienia próbki normalnego i mutantowego DNA, co nadaje wartość diagnostyczną wobec normalnych homozygot, heterozygot (nosicieli) lub homozygot ZZ dotkniętych zaburzeniem genetycznym dotyczącym a-l-antytrypsyny ludzkiej.

Powyższe eksperymenty z tego przykładu przeprowadzone zostały również z zastosowaniem primeru diagnostycznego, w którym nie przeprowadzono dodatkowych destabilizujących zmian nukleotydów i w którym zmieniono siódmy nukleotyd od 3'-zakończenia (A do C), w celu osiągnięcia destabilizacji. W każdym przypadku primer diagnostyczny okazał się nie w pełni skuteczny w zróżnicowaniu między próbką normalnego a mutantowego DNA, który to fakt zilustrowano na figurze 8, ścieżki 5-8, w odniesieniu do primera diagnostycznego bez dodatkowych, destabilizujących, zmian nukleotydów.

Przykład V. Jako primerów używa się ohgortukleotydów XXII (normalny) i XXI (wariant). W tym przykładzie mieszanina dNTP (A, G i T) daje primer wydłużony o 7 zasad, na matrycy, przed zapotrzebowaniem na trifosforan nukleozydu C. Tm dla tych oligonukleotydów obliczono jako 94°C stosując wzór: Tm = 4 (G + C) i 2 (A + T), ale uważa się, że jest on słuszny tylko dla oligonukleotydów do 23-merowych i tak dobrano preferencyjnie 75°C.

Oligonukleotydy (każdy w ilości 8 pmoli) piętnuje się przy 5'-końcowej grupie hydroksylowej, stosując d[³²P]-ATP (Amersham, 2//Ci) i 4 jednostki kinazy polinukleotydowej T4 w mieszaninie

162 338 reakcyjnej o objętości 80μ\ zawierającej 5-mMTris.Cl pH 7,6,10 mM MgCb, 5 mM DTT, 100μΜ spermidynę i 100μΜ EDTA. Reakcję kinazową prowadzi się w temperaturze 37°C w ciągu 20 minut, a następnie sprawdza się znakowane oligonukleotydy w elektroforezie w żelu denaturującym 15% poliakryloamid (8M mocznik/proces wstępny 1 godzina, 500 V; proces główny 4 godziny, 800 V).

Używa się dwóch plazmidów, jednego o sekwencji normalnej (MM) w locus S egzonu III ludzkiego genu a-l-antytrypsyny, oraz drugiego, o sekwencji wariantowej, odpowiadającej wariantowej homozygocie (SS). Zestawia się 6 probówek, 2 dla każdego możliwego typu DNA. Dla homozygot używa się 1 fmola odpowiedniego plazmidu, ale heterozygotę symuluje się stosując 0,5 fmola obydwóch plazmidów. Tworzy się 200-k.rotny nadmiar piętnowanego ohgonukleotydu w każdej probówce, dodając 200 fmoli (2/1 piętnowanego roztworu), albo normalnego (XXII), albo wariantowego (XXI) oligonukleotydu do każdego typu DNA. Każda probówka zawiera 3dNTP (A, G i T, Pharmacia) do końcowego stężenia 5 mM (każdy) w mieszaninie reakcyjnej o objętości 20μ1 zawierającej 6,7 mM EDTA, 6,7 mM MgCb, 67 mM Tris HC1 pH 8,8,10 mM merkaptoetanol

16,6 mM siarczan amonowy. Objętość mieszanin reakcyjnych powiększa się trzykrotnie, to jest używa się 60μ1 w każdym przypadku, aby zgładzić wpływ odparowywania. Probówki ogrzewa się do wrzenia na 5 minut, a następnie przetrzymuje na lodzie aż do dodania do każdej probówki 3 jednostek polimerazy Taq (Cetus 1 w rozcieńczeniu 5 stosując 1,5 mM MgCU, 50 mM KC1,10 mM Tris pH 8,3 i 0,1% żelatyna, z otrzymaniem 1 jednostki/μ1). Probówki wiruje się przy 13000 obr/min w ciągu 2 minut i 2/1 próbki dodaje do 5μ1 barwnika formamid/błękit bromofenolowy.

Następnie probówki pozostawia się w temperaturze 75°C w łaźni wodnej. Po upływie 4 godzin probówki wyjmuje się z łaźni, wiruje przy 13000 obr/min w ciągu minuty, pobiera się inne 2/1 próbki i dodaje się do 5 μ1 barwnika. Następnie umieszcza się je znowu w łaźni wodnej w temperaturze 75°C. Po upływie 6 godzin probówki ponownie wyjmuje się i do każdej z nich dodaje się dalsze 3 jednostki polimerazy Taq, wiruje w ciągu minuty przy 13000 obr/min i dodaje kroplę lekkiego oleju mineralnego (Sigma) do złagodzenia odparowywania, ale nie pobiera się próbki. Probówki pozostawia się w temperaturze 75°C na noc. Po upływie 24 godzin od końca początkowego wirowania probówki usuwa się z łaźni wodnej, odwirowuje w ciągu minuty i końcowe 2μ1 próbki dodaje do 5μ1 barwnika. Wszystkie próbki poddaje się elektroforezie, proces wstępny (1 godzina, 500 V), na żelu denaturującym 15% poliakryloamid / 8 M mocznik w 1 x buforze TBE (0,089 M Tris-boran, 0,089 kwas borowy, 0,002 M EDTA) w ciągu 5 1/2 godziny przy 880 V. Żel poddaje się autoradiografii przez noc w temperaturze pokojowej bez ekranów na niskoczułej błonie fotograficznej. Wyniki uwidoczniono na figurze 12.

Ścieżki 1 i 2 odpowiadają DNA od normalnej homozygoty (MM), ścieżki 3 i 4 DNA od heterozygoty MS i ścieżki 5 i 6 DNA od homozygoty wariantowej (SS). W odniesieniu do ścieżek 1, 3 i 5 użyto nukleotydu XXII (normalny), a w odniesieniu do ścieżek 2, 4 i 6 nukleotydu XXI (wariant). Jak przewidywano, wydłużanie oligonukleotydu me nastąpiło, w odróżnieniu do ścieżek lub 5. Wykryte pasma produktu wskazano znakami.

Przykład VI. Ing kasetowego plazmidowego DNA, lOOpmoli każdego z primerów oligonukleotydowych

TTACTTTCACCAGCGTTTTCTGGGTGAGCAA oraz

TATGCGACTCCCTGCATTAGGAGCAGCCCA, każdy z czterech trifosforanów deoksynukleozydów w stężeniu końcowym 1,5 mM i bufor w stężeniach końcowych wyszczególnionych powyżej, miesza się w 1,5 ml probówce mikrowirówkowej i objętość doprowadza się do 100μ1 jałową wodą dejonizowaną (Milli-Q). Probówkę zamyka się i umieszcza w łaźni z wrzącą wodą na 5 minut. Reakcję inicjuje się za pomocą dodania 2 jednostek polimerazy TAQ (Cetus) i mieszaninę zabezpiecza lekkim olejem mineralnym (Sigma) w celu zapobieżenia odparowywaniu. Probówkę inkubuje się w temperaturze 60°C wciągu 4 minut i w temperaturze 90°C w ciągu 2 minut. Ten sposób postępowania powtarza się przez, ogółem, 30 cykli.

Następnie usuwa się 60μ1 mieszaniny reakcyjnej i dodaje do niej 60 pmoli albo primerów XIX i XI (normalne), albo primerów XII i XX (warianty). Następnie dodaje się 1 jednostkę polimerazy Taq (Cetus) w celu zainicjowania dalszej reakcji. Następnie mieszaninę inkubuje się w temperaturze

162 338

92°C w ciągu 2 minut, a po tym w temperaturze 60°C w ciągu 4 minut. Ten sposób postępowania powtarza się przez, ogółem, 4 cykle. Wykrycie produktów amplifikacji przeprowadza się za pomocą połączenia 10/zl próbek z mieszaniny reakcyjnej z buforem do nanoszenia na żel, a następnie elektroforezy w 3% żelu agarozowym („Nu Sieve“/FMC Bioproducts) zawierającym bromek etydyny w stężeniu 0,5/rg/ml. Materiał na żelu uwidacznia się za pomocą transiluminatora (długość fali 300 nm) i wykonuje się fotografię polaroidową. Wyniki przedstawia figura 13. Ścieżka w głębi na lewo pokazuje markery wielkości użyte do potwierdzania wielkości otrzymanych produktów. Ścieżki 1 i 2 odpowiadają DNA od homozygoty normalnej (MM), ścieżki 3 i 4 DNA od heterozygoty (MZ) i ścieżki 5 i 6 DNA od homozygoty wariantowej (ZZ). W odniesieniu do ścieżek 1, 3 i 5 użyto primerów XIX i XI, a w odniesieniu do ścieżek 2, 4 i 6 primerów XII i XX. Jak przewidywano, wydłużanie primera nie występowało w odniesieniu do ścieżki 2 lub 5. Wykryte pasma produktu wskazano znakami.

Fig. 12.

3 t 5 6

Fig 1 (a)

5'-N-----_3>

--------N-5'

M-5'

Fig. 11 (b)

5'-M-3' »------M--5'

N--5' ! Fig Uc) wydłużenie primer ograniczenie wymaganych d NTP

Fig 13.

? 3 4 5 6

Fig 10

Transformacja

Fig.9.

i .3,ió 7 8910Π1213Κ

Fig 7

2 3

Fig. 8

3 5 7 9

Fig 5(a}

5'

3’

3'

5'

F/g5(b)

162 338

Fig k(a)

53j'»-t

M-5

-S— N-N N-

	N
	N

-3'

Fig.C(b)

7677 779

Fig 3 © ©O

N N_N

3'—-N-Ń5'		3* /Ś' P
1 N	N		N
%Th~—	Z5_n	30	-N----,	5Λ 3
5' 3'	5'	3' 5'	3	P

Fig 2(a)

5'---; 3' ^b 3-----n_5 3-------P¹ ?

i'---—5

5'-^N----3' 3'

OR

Fig 2(b) s'-a-3'

3------M-5' 3'-.....-^TT3' p'

3'--S'

5'-M-----3' 5'W-------3'

P

Fig. 1(a)

i N		P ł.
N-5'		—Ti;
OR M-5'		i 5
5' 3'	5'3'
z- N	T

Fig Kb)

DG

Fig lc)

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz Cena 10 000 zł

Claims (15)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wykrywania sekwencji nukleotydów zwłaszcza, obecności lub nieobecności co najmniej jednego nukleotydu wariantowego w jednym, lub więcej niż jednym kwasie nukleinowym zawartym w próbce, znamienny tym, że działa się na próbkę, łącznie lub kolejno, odpowiednimi trifosforanami nukleozydów, czynnikiem polimeryzacji trifosforanów nukleozydów i primerem diagnostycznym dla diagnostycznej części docelowej sekwencji zasad w warunkach hybrydyzacji, przy czym sekwencja nukleotydów primera diagnostycznego jest taka, że jest zasadniczo komplementarna z częścią diagnostyczną, nukleotyd końcowy primera diagnostycznego jest komplementarny albo z oczekiwanym nukleotydem wariantowym, albo z odpowiednim nukleotydem normalnym, w wyniku czego produkt wydłużania primera diagnostycznego jest syntetyzowany gdy nukleotyd końcowy primera diagnostycznego jest komplementarny z odpowiednim nukleotydem w docelowej sekwencji zasad, a nie jest ten produkt wydłużania syntetyzowany, gdy nukleotyd końcowy primera diagnostycznego nie jest komplementarny z odpowiednim nukleotydem w docelowej sekwencji zasad, oraz wykrywa się obecność lub nieobecność oczekiwanego nukleotydu wariantowego na podstawie obecności lub nieobecności produktu wydłużania.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że 1/ działa się na próbkę, łącznie lub kolejno, odpowiednimi trifosforanami nukleozydów, czynnikiem polimeryzacji trifosforanów nukleozydów, primerem diagnostycznym dla diagnostycznej części docelowej sekwencji zasad i odpowiednim primerem ampliflkacji w warunkach hybrydyzacji, przy czym sekwencja nukleotydów primera diagnostycznego jest taka, że zasadniczo komplementarna z częścią diagnostyczną, końcowy nukleotyd primera diagnostycznego jest komplementarny albo z oczekiwanym nukleotydem wariantowym, albo z odpowiednim nukleotydem normalnym, w wyniku czego produkt wydłużania primera diagnostycznego jest syntetyzowany gdy nukleotyd końcowy primera diagnostycznego jest komplementarny z odpowiednim nukleotydem w docelowej sekwencji zasad, a nie jest ten produkt wydłużania syntetyzowany gdy nukleotyd końcowy primera diagnostycznego nie jest komplementarny z odpowiednim nukleotydem w docelowej sekwencji zasad, przy czym każdy wytworzony produkt wydłużania primera diagnostycznego nadaje się do służenia jako matryca do syntezy produktu wydłużania primera ampliflkacji po oddzieleniu od jego materiału komplementarnego, 2/ działa się na próbkę w warunkach denaturujących w celu oddzielenia produktu wydłużania od jego matrycy, gdzie produkt wydłużania primera zostaje wytworzony, 3/ kontaktuje się pojedyncze nici wytworzone w stadium (2), albo łącznie, albo kolejno, z odpowiednimi trifosforanami nukleozydów, czynnikiem polimeryzacji trifosforanów nukleozydów, primerem diagnostycznym i primerem ampliflkacji, jak zdefiniowano w niniejszym opisie, w wyniku czego, gdy jest to możliwe, syntetyzuje się dalsze produkty wydłużania stosując pojedyncze nici wytworzone w stadium (2) jako matryce, 4/ powtarza się stadia (2) i (3) wystarczającą ilość razy aby uzyskać wykrywalną amplifikację odpowiedniej sekwencji nukleotydów, oraz 5/ wykrywa się obecność lub nieobecność oczekiwanego nukleotydu wariantowego na podstawie obecności lub nieobecności produktu ampliflkacji otrzymanego w stadium (4).
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że działa się na próbkę, łącznie lub kolejno, albo (a) pierwszym primerem diagnostycznym o sekwencji zasadniczo komplementarnej z częścią diagnostyczną sekwencji pierwszego kwasu nukleinowego, przy czym pierwszy primer diagnostyczny ma nukleotyd końcowy komplementarny z oczekiwanym nukleotydem wariantowym, oraz drugim primerem diagnostycznym o sekwencji zasadniczo komplementarnej z częścią diagnostyczną sekwencji drugiego kwasu nukleinowego, przy czym drugi primer diagnostyczny ma nukleotyd końcowy komplementarny zkomplementarnym oczekiwanym nukleotydem wariantowym,albo (b) pierwszym primerem diagnostycznym o sekwencji zasadniczo komplementarnej z częścią diagnostyczną sekwencji pierwszego kwasu nukleinowego, przy czym pierwszy primer diagnostyczny ma nukleotyd końcowy komplementarny z nukleotydem normalnym, który odpowiada

   162 338 oczekiwanemu nukleotydowi wariantowemu, oraz drugim primerem diagnostycznym o sekwencji zasadniczo komplementarnej z częścią diagnostyczną sekwencji drugiego kwasu nukleinowego, przy czym drugi primer diagnostyczny ma nukleotyd końcowy komplementarny z nukleotydem normalnym, który odpowiada oczekiwanemu nukleotydowi wariantowemu, przy czym nukleotyd końcowy pierwszego primera diagnostycznego i nukleotyd końcowy drugiego primera diagnostycznego występują albo oba przy 5'-końcu, albo oba przy 3'-końcu odpowiednich primerów i sekwencja pierwszego kwasu nukleinowego ma sens odwrotny do sekwencji drugiego kwasu nukleinowego.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że najpierw amplifikuje się przynajmniej część kwasu nukleinowgo próbki zawierającego oczekiwany nukleotyd wariantowy i stosuje tak otrzymany produkt amplifikacji jako próbkę, na którą ma się działać.
5. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że najpierw amplifikuje się przynajmniej część kwasu nukleinowego próbki zawierającego oczekiwany nukleotyd wariantowy i stosuje tak otrzymany produkt amplifikacji jako próbkę, na którą ma się działać.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że powtarza się działanie na kwas nukleinowy próbki co najmniej raz, w wyniku czego uzyskuje się liniową amplifikację produktu wydłużania stosując tę samą docelową sekwencję zasad jako matrycę.
7. 7. Sposób według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, znamienny tym, że nukleotyd końcowy primera diagnostycznego, komplementarny albo z oczekiwanym nukleotydem wariantowym, albo z odpowiednim nukleotydem normalnym, znajduje się przy 3'-końcu primera diagnostycznego.
8. 8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że działa się na próbkę 12 lub 3 trifosforanami nukleozydów, w wyniku czego produkt wydłużania, który ma być tworzony, może rozciągać się tylko tak daleko, jak na to pozwoli obecność tylko 1, 2 lub 3 trifosforanów nukleozydów.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że działa się na próbkę trzema trifosforanami nukleozydów.
10. 10. Zestaw diagnostyczny do wykrywania sekwencji nukleotydów, zwłaszcza obecności lub nieobecności co najmniej jednego nukleotydu wariantowego w jednym, lub więcej niż jednym kwasie nukleinowym zawartym w próbce, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydów od około 5 do 50 par zasad, przy czym końcowy nukleotyd tej sekwencji jest komplementarny albo z oczekiwanym nukleotydem wariantowym związanym ze znanym zaburzeniem genetycznym, albo z odpowiednim nukleotydem normalnym, przy czym pozostałość wspomnianej sekwencji jest zasadniczo komplementarna z odpowiednią docelową sekwencją zasad, sąsiadującą z oczekiwanym nukleotydem wariantowym, albo z odpowiednim nukleotydem normalnym, przy czym sekwencja nukleotydów jest taka, ze przy zastosowaniu w charakterze primera diagnostycznego w sposobie według wynalazku syntetyzowany jest produkt wydłużania primera diagnostycznego, gdy nukleotyd końcowy primera diagnostycznego jest komplementarny z odpowiednim nukleotydem w docelowej sekwencji zasad, a nie jest syntetyzowany produkt wydłużania, gdy nukleotyd końcowy primera diagnostycznego nie jest komplementarny z odpowiednim nukleotydem w docelowej sekwencji zasad.
11. 11. Zestaw według zastrz. 10, znamienny tym, że nukleotyd końcowy znajduje się przy 3'-końcu sekwencji nukleotydów.
12. 12. Zestaw według zastrz. 10 albo 11, znamienny tym, że oczekiwany nukleotyd wariantowy jest wynikiem mutacji punktowej odpowiedniej sekwencji normalnej.
13. 13. Zestaw według któregokolwiek z zastrz. 10-12, znamienny tym, że nukleotyd końcowy jednej sekwencji jest komplementarny z oczekiwanym nukleotydem wariantowym związanym ze znanym zaburzeniem genetycznym, a nukleotyd końcowy drugiej sekwencji jest komplementarny z odpowiednim nukleotydem normalnym.
14. 14. Zestaw diagnostyczny do wykrywania sekwencji nukleotydów zwłaszcza obecności lub nieobecności co najmniej jednego nukleotydu wariantowego w jednym, lub więcej niż jednym kwasie nukleinowym zawartym w próbce, znamienny tym, że obejmuje (1) primer diagnostyczny dla każdej części diagnostycznej docelowej sekwencji zasad, przy czym sekwencja nukleotydów każdego primera diagnostycznego jest taka, że jest on zasadniczo komplementarny z częścią diagnostyczną, nukleotyd końcowy primera diagnostycznego jest komplementarny albo z oczeki4 wanym nukleotydem wariantowym, albo z odpowiednim nukleotydem normalnym tak, że w użyciu syntetyzowany jest produkt wydłużania primera diagnostycznego gdy końcowy nukleotyd primera diagnostycznego jest komplementarny z odpowiednim nukleotydem w docelowej sekwencji zasad, a produkt wydłużania nie jest syntetyzowany, gdy nukleotyd końcowy primera diagnostycznego nie jest komplementarny z odpowiednim nukleotydem w docelowej sekwencji zasad, (2) każdy z czterech różnych trifosforanów nukleozydów, oraz (3) czynnik polimeryzaji trifosforanów nukleozydów w (2).
15. 15. Zestaw według zastrz. 14, raamienny tym, ze obejm uje zestaw dwóch primerów diagnostycznych dla każdej części diagnostycznej docelowej sekwencji zasad, przy czym nukleotyd końcowy jednego primera diagnostycznego jest komplementarny z oczekiwanym nukleotydem wariantowym związanym ze znanym zaburzeniem genetycznym, a nukleotyd końcowy drugiego primera syntetycznego jest komplementarny z odpowiednim nuklrotydem normalnym.