DK175527B1

DK175527B1 - Fremgangsmåde til påvisning af nukleotidsekvenser

Info

Publication number: DK175527B1
Application number: DK198901180A
Authority: DK
Inventors: Clive Robert Newton; Alexander Fred Markham
Original assignee: Astrazeneca Ab
Priority date: 1988-03-10
Filing date: 1989-03-10
Publication date: 2004-11-22
Also published as: FI891126A; KR970003151B1; AU3124689A; EP0332435A3; DK118089A; JP2853864B2; PL278176A1; CN1039618A; ATE75262T1; FI891126A0; DK118089D0; EP0332435B1; CA1323592C; IL89545A; EP0332435A2; ES2039294T5; NO174825B; PT89980A; PL162338B1; NZ228266A

Description

DK 175527 B1 l

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til påvisning af tilstedeværelsen eller fraværet af en eller flere afvigende nukleotidsekvenser ved forstærkning eller manglen derpå.

5 Den foreliggende opfindelse er af særlig interesse i den diagnostiske screening af DNA-prøver for medfødte tilstande, prædispositioner eller somatiske mutationer og tilvejebringer bl.a. en generel metode til let påvisning af punktmutationer.

Den er også anvendelig til påvisning og typebestemmelse af infektiøse patogener ved analyse af deres DNA eller RNA.

10

Adskillige hundrede genetiske sygdomme vides at eksistere i mennesket, hvilke sygdomme resulterer fra særlige mutationer på DNA-niveauet. Den molekylære basis for visse af disse sygdomme er allerede velkendt, og forskningen åbenbarer hurtigt den molekylære basis for sådanne genetiske sygdomme, for 15 hvilke naturen af mutationen i øjeblikket er ukendt. I de tilfælde, hvor den præcise molekylære basis for den medfødte tilstand ikke er kendt, kan diagnose af sygdommen eller loka-tionen af bærere tilvejebringes i informsstamtavler ved hjælp af RFLP-teknologi under anvendelse af DNA-sonder i genetisk binding med sygdoms 1ocuset. Således kan Duchenné muskeldys-20 trofi, cystisk fibrose og Huntington's Chorea bl.a. i dag f.eks. diagnoseres under anvendelse af RFLP-teknologi. En sådan undersøgelse er imidlertid nødvendig at udføre separat med hensyn til hver tilstand, og der kræves en væsentlig mængde arbejde, idet hvert tilfælde bl.a. kræver DNA-oprens-ning, restriktionsenzymfordøjelse, agarosegelelektroforese, 25 Southern-aftryk, hybridi ser ing, påvisning af hybridiseret gensonde og stamtavleanalyse. Visse andre medfødte tilstande vides at være forbundet med enkeltpunktmutationer i gener, men hver af disse tilstande må analyseres separat, og der opstår yderligere særlige vanskeligheder, når punktmutationerne er heterogene. Således kan f.eks. mere end 40 forskel-30 lige punktmutationer forårsage β-thalassæmi, og mindst 5 og sandsynligvis mange flere end 12 punktmutationer kan forårs- I DK 175527 B1

I I

age hæmofili A. Med hensyn til disse heterogene tilstande må I

hvert potentielt mutationspunkt i øjeblikket kræve at blive I

analyseret separat. Dette kan involvere kompleks RFLP-haplo- I

typeanalyse med mangfoldige restriktionsenzymer. I

I I

I En række punktmutationer i somatiske celler er blevet ind- I

draget i udviklingen af forskellige cancerformer, f.eks. I

punktmutationer inden for ras-oncogenet (J.L. Boos med flere, I

I Nature 327, 293 (1987)). I

I 10 I

Η I europæisk patentansøgning nr. 87302196.8 (publiceringsnr. I

I 237.362) beskrives en fremgangsmåde til påvisning af tiiste- I

deværelsen eller fraværet af mindst én nukleotidvariation i I

sekvens i en eller flere nukleinsyrer, som er indeholdt i en I

15 prøve, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man: I

(a) under hybrid i seringsbetingelser behandler prøven I

under ét eller i rækkefølge med fire forskellige nukleotid- I

triphosphater, et middel til polymerisation af nukleotidtri- I

I 20 phosphaterne og en oligonukleotidprimer for hver streng af I

I hver nukleinsyre, som mistænkes for at indeholde variationen, I

H således at der for hver nukleinsyrestreng, som indeholder I

hver forskellige variation til påvisning, syntetiseres et I

forlængelsesprodukt af hver primer, hvilket produkt er I

H 25 komplementært til hver nukleinsyrestreng, hvori primeren I

I eller primerne er udvalgt således, at de i alt væsentligt er I

I komplementære til hver nukleinsyrestreng, som indeholder hver I

forskellig variation, således at forlængelsesproduktet, som - I

er syntetiseret fra en primer, når det er separaret fra dets |

30 komplement, kan tjene som en skabelon til syntese af forlæn- I

gelsesproduktet af den anden primer; I

(b) behandler prøven under denaturerende betingelser for I

at separere primerforlængelsesprodukterne fra deres skabelo- I

35 ner, hvis variationen/variationerne, der skal påvises, er til I

stede; I

DK 175527 B1 I

(c) behandler prøven under ét eller i rækkefølge med de I

fire nukleotidtriphosphater, et middel til polymer i sation af I

nukleotidtriphosphaterne, og ol igonukleotid-primere, således I

at der syntetiseres et pr i mer for længel sesprodukt under anven-

5 delse af hver af enkeltstrengene, som er fremstillet i trin I

(b) , som en skabelon, hvori trin (b) og (c) gentages et I

tilstrækkeligt antal gange til at resultere i påviselig I

forstærkning af nukleinsyren indeholdende sekvensvariationen/ I

variationerne, hvis den/de til stede, I

(d) fæstner produktet fra trin (c) til en membran; I

(e) behandler membranen under hybridiseringsbetingelser I

med en mærket sekvens-specifik oligonukleotidsonde, som kun I

15 er i stand til at hybridisere med den forstærkede nukleoinsy- I

I resekvens, hvis en sekvens af sonden er komplementær til en I

I region i den forstærkede sekvens; og I

I (f) påviser hvorvidt prøven er hybridiseret til en for- I

I 20 stærket sekvens i nukleinsyreprøven.

I Påvisningen af tilstedeværelsen eller fraværet af mindst én I nukleotidvariation kan i visse specielle situationer opnås I ved forskellige teknikker. I de usædvanlige tilfælde, hvor I 25 punktmutationerne danner eller ødelægger et restriktionssted I (f.eks. seglcel le-anæmi), kan restriktionsensymfordøjelse så- I ledes anvendes enten før eller efter forstærkning. [F.F. Che- I hab med flere, Nature 329, 293, (1987)]. Med hensyn til store I deleterede nukleinsyresekvenser kan primere til forstærkning I 30 endvidere fremstilles til regioner inden for den mistænkte I deletion, således som 23 kb deletionen, som forårsager a- I thalassæmi; i sådanne tilfælde bekræfter den mislykkede be- I stræbelse på at forstærke den deleterede sekvens deletionen, I og er således f.eks. diagnostisk for α-thalassæmi [F.F. Che- I 35 hab med flere, Nature 329, 293 (1987)].

I Forstærkningprocessen i europæisk patentpublikation nr.

I 237.362 giver visse fordele i forhold til RFLP (restriktions- I DK 175527 B1

fragmen11ængdepolymorfisme) og a 11e1 spec ifikke oligonukleo- I

tidteknikker, som f.eks. er beskrevet af Kan og Dozy, Pro- I

ceedings of the National Academy of Sciences (USA) 75, 5631 I

I (1978), Rubin og Kan, Lancet, 1985-1,75(1985), Conner med I

I 5 flere, Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), I

80, 78 ( 1983), Kidd med flere, Nature, 304, 230 (1983) og I

Piratsu med flere, New England Journal of Medicine, 309, 284 I

I (1983). I

10 Ikke desto mindre beskrives i den europæiske patentpublika- I

I tion nr. 237.362 en fremgangdmåde, som involverer den tilfæl- I

I dige forstærkning af en særlig sekvens af interesse, som I

I uundgåeligt resulterer i behovet for en række tidsforbrugende I

I yder 1 i gere påvisningstrin, som involverer enten den yderlige- I

I 15 re anvendelse af en mærket sekvens-specifik oligonukleotid- I

I sonde, som måske skal være i stand til at skelne mellem se- I

I kvenser, som afviger ved så lidt som et enkelt nukleotid I

og/eller anvendelsen af en specifik restriktionsendonuklease I

I i sådanne begrænsede tilfælde, hvor punktmutationen af inter- I

I 20 esse danner eller ødelægger enzymgenkendelsessekvensen og/ I

I eller anvendelsen af direkte sekvensbestemmelsesmetoder på I

I det forstærkede 0ΝΑ [C. Wong med flere, Nature 330, 384 I

I (1987)]. I

I 25 Der er et behov for en enkel metode til direkte at påvise I

I mindst en enkelt baseforskel i nukleinsyrer, såsom genom-DNA, I

I i hvilken metode påvisningstrinnene gøres mindst mulige, I

I hvilket resulterer i en metode, der kan udføres hurtigt, ak- I

kurat og let med minimal operatøruddannelse. I

I 30 I

I Den foreliggende opfindelse er baseret på den opdagelse, at I

I ved hensigtsmæssigt at udvælge nukleotidsekvensen for en I

I olegonukleotid-primer er det muligt selektivt at opnå pri- I

I mer-forlængelse enten af en sekvens indeholdende et mi stænkt, I

I 35 afvigende nukleotid eller den tilsvarende sekvens indehol- I

I dende det normale nukleotid eller at forhindre en sådan I

I primer-forlængelse, hvorved de nødvendige påvisn ingsproce- I

I durer således forenkles væsentligt. I

DK 175527 B1 I

Ifølge et træk ved den foreliggende opfindelse anvises en I

fremgangsmåde til påvisning af tilstedeværelsen eller fravæ- I

ret af mindst et afvigende nukleotid i en eller flere nukle- I

insyrer, som er indeholdt i en prøve, hvilken fremgangsmåde I

S er ejendommelig ved, at den omfatter, at man: I

under hybri di serende betingelser behandler prøven under ét I

eller i rækkefølge med passende nukleosidtriphosphater, et I

middel til polymerisation af nukleosidtriphosphaterne og en I

10 diagnostisk primer til en diagnostisk andel af en målbase- I

sekvens, idet nukleotidsekvensen i den diagnostiske primer er I

således, at den i alt væsentligt er komplementær til den I

diagnostiske andel, idet et terminalt nukleotid i den diagnostiske primer enten er komplementært til det mistænkte, 15 afvigende nukleotid eller til det tilsvarende normale nukleotid, hvorved der syntetiseres et forlængelsesprodukt af den di agnost i ske primer, når det terminale nukleotid i den diagnostiske primer er komplementært til det tilsvarende nukleotid i mål basesekvensen, og idet der ikke syntetiseres 20 noget for 1ænge1 sesprodukt, når det terminale nukleotid i den diagnostiske primer ikke er komplementær til det tilsvarende nukleotid i må 1 basesekvensen; og påviser tilstedeværelsen eller fraværet af det mistænkte afvigende nukleotid ud fra tilstedeværelsen eller fraværet af et forlængelsesprodukt.

25

Det skal forstås, at skønt fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er af særlig interesse ved påvisning af til-I stedeværelsen eller fraværet af punktmutationer, er frem- I gangsmåden ligeledes anvendelig til påvisning af tilstedevæ- I 30 reisen eller fraværet af deletioner, indbefattende deletioner I af mere end et nukleotid, såvel som til påvisning af tilste- I deværelsen eller fraværet af substitutioner af mere end et I nukleotid. I denne henseende er blot nødvendigt at kende de I relevante nukleotider, især det relevante terminale nukleo- I 35 tid, således at den nødvendige diagnostiske primer eller de I nødvendige diagnostiske primere kan udformes hensigtsmæssigt.

I DK 175527 B1

Det skal forstås, at et hvilket som helst dannet forlængel-

sesprodukt kan påvises i en hvilken som helst hensigtsmæssig I

form, f.eks. i enkelt- eller dobbeltstrenget form.

5 Det skal yderligere forstås, at et hvilet som helst opnået forlængelsesprodukt om ønsket kan være forstærket ved hjælp af polymerasekædereaktionen (PCR), som er beskrevet i US-pa- tentskrifterne nr. 4.683.195 og 4.683.202, ved hjælp af an- vendeisen af (3-β~Γβρ1icase, som beskrevet i PCT patentpubli- 10 kation W087/06270 og i Biotechnology, bind 6, oktober 1988, H ved anvendelse af den transkriptionsbaserede nukleinsyrefor- stærkning fra Siska Corporation som beskrevet i PCT Patent- H publikation W088/10315, eller ved anvendelsen af lineær for- stærkning. I denne sammenhæng anvendes udtrykket "lineær for- 15 stærkning" heri til at referere til forstærkning under anven- delse af en enkelt primer til hver diagnostisk andel i nærvæ- reisen af et middel til polymerisation og hensigtsmæssige nukleotidtriphosphater, hvorved forstrækning sker ved hjælp af primer-forlængelsen på basis af anvendelsen af en enkelt 20 streng af prøvenukleinsyre som skabelon.

I en første og særligt foretrukket udførelsesform af den fo- I religgende opfindelse er fremgangsmåden ejendommelig ved, at I den omfatter, at man*.

I 25 ' 1) under hybridiserende betingelser behandler prøven under ét I eller i rækkefølge med hensigtsmæssige nukleosidtriphospha- ter, et middel til polymerisation af nukleosidtriphosphater- ne, en diagnostisk primer til en diagnostisk andel af en mål- 30 basesekvens og en tilsvarende forstærkningsprimer, idet nu- | kleotidsekvensen i den diagnostiske primer er således, at den I i alt væsentligt er komplementær til den diagnostiske andel, I idet et terminalt nukleotid i den diagnostiske primer enten I er komplementært til det mistænkte, afvigende nukleotid eller I 35 til det tilsvarende normale nukleotid, hvorved der syntetise-

I res et forlængelsesprodukt af den diagnostiske primer, når I

I det terminale nukleotid i den diagnostiske primer er komple-

DK 175527 B1 I

mentært til det tilsvarende nukleotid i målbasesekvensen, og I

idet der ikke syntetiseres noget forlængelsesprodukt, når det H

terminale nukleotid i dén diagnostiske primer ikke er komple- I

mentært til det tilsvarende nukleotid i målbasesekvensen; I

5 idet et hvilket som helst forlængelsesprodukt af den dannede I

diagnostiske primer er i stand til at tjene som en skabelon I

for syntese af et for længe!sesprodukt af den nævnte forstærk- ningsprimer efter separation fra dets komplement;

10 2) behandler prøven under denaturerende betingelser til sepa- I

ration af pri merforlængel sesproduktet fra dets skabelon, hvor I

et sådant forlængelsesprodukt dannes; I

3) bringer de i trin (2) dannede enkeltstrenge i kontakt I

15 med, enten samlet eller i rækkefølge, hensigtsmæssige nukle- I

os idtriphosphater, et middel til polymerisation af nukleosid- I

I triphosphaterne, en diagnostisk primer og en forstærknings- I

I primer, som heri defineret, hvorved der, hvor det er muligt, I syntetiseres yderligere forlængelsesprodukter under anven- I 20 delse af de i trin (2) fremstillede enkeltstrenge som skabe- I Ioner; I 4) gentager trin (2) og (3) et tilstrækkeligt antal gange til I at resultere i påviselig forstærkning af den pågældende nu- I 25 kleotidsekvens; : og.

I 5) påviser tilstedeværelsen eller fraværet af det mistænkte, I afvigende nukleotid ud fra tilstedeværelsen eller fraværet af I et i trin (4) opnået forstærkningsprodukt.

I 30 I I en anden udførelsesform af den foreliggende opfindelse be- I handles prøven under ét eller i rækkefølge med enten I (a) en første diagnostisk primer med en sekvens som i alt væ- I 35 sentligt er komplementært til en diagnostisk andel af en før- I ste nukleinsyresekvens, idet den første diagnostiske primer I har et terminalt nukleotid, som er komplementært til det mis- I DK 175527 B1 H tænke, afvigende nukleotid, og en anden diagnostisk primer H med en sekvens som i alt væsentligt er komplementær til en H diagnostisk andel af en anden nukleinsyresekvens, idet den H anden diagnostiske primer har et terminalt nukleotid, som er H 5 komplementært til det komplementære, mistænkte, afvigende H nukleotid; eller H (b) en første diagnostisk primer med en sekvens som i alt væ- sentligt er komplementær til en diagnostisk andel af en før- H 10 ste nukleinsyresekvens, hvilken første diagnostiske primer H har et terminalt nukleotid, som er komplementært til det nor-

male nukleotid, hvilket svarer til det mistænkte, afvigende I

H nukleotid, og en anden diagnostisk primer med en sekvens som H i alt væsentligt er komplmentært til en diagnostisk andel af H 15 en anden nukleinsyresekvens, hvilket anden diagnostiske primer har et terminalt nukleotid, som er komplementært til H det normale nukleotid, hvilket svarer til det mistænkte, af- vigende nukleotid; 20 idet det terminale nukleotid i den første diagnostiske primer H og det terminael nukleotid i den anden dagnostiske primer en- ten begge er ved 5'-enden eller begge er ved 3'-enden i de respektive primere og den første nukleinsyresekvens er i mod- sat sence i forhold til den anden nukleinsyresekvens.

I denne udførelsesform kan den anden diagnostiske primer der- for betragtes som værende en forstærkningsprimer, som der er I refereret til ovenfor og i det efterfølgende.

H 30 Denne anden udførelsesform kan muliggøre forøget skelneevne og specificitet, eftersom et hvilket som helst artefakt pro- I dukt kræver, at priming finder sted ved den relevante termi- I nåle ende (generelt den 3’-terminale ende hos umage (eng.: I mis-matched) oligonukleotider frem for ved en enkelt ende, 35 som det er tilfældet, hvor kun en enkelt diagnostisk primer I anvendes.

DK 175527 B1 I

Påvisning af tilstedeværelsen eller fraværet af et mistænkt, I

afvigende nukleotid kan f.eks. ske som beskrevet,herefter . I

I en tredié udførelsesform af den foreliggende opfindelse I

5 underkastes en prøve omfattende DNA, som indeholder et mis- I

tænkt, afvigende nukleotid, for forstærkning, f.eks. ved li-- I

neær forstærkning, som heri defineret eller f.eks. som be- I

skrevet i US-patentskrifterne nr. 4.683.195 og 4.683.202, i I

PCT patentpublikation W087/06270, i Biotechnology, bind 6, I

10 oktober 1988, eller i PCT patentpublikation W088/10315, og I

forstærkningsproduktet behandles med en diagnostisk primer I

for en di agnost i sk andel af en mål basesekvens under hybrid i -serende betingelser i nærværelsen af hensigtsmæssige nukleo-I sidtriphosphater og et middel til polymerisation af nukleo- I 15 sidtriphosphaterne, idet nukleotidsekvensen i den diagno- I stiske primer er således, at den i det væsentlige er komple- I mentær til den diagnostiske andel, idet det terminale nukleo- I tid i den diagnostiske primer enten er komplementært til det I mistænkte, afvigende nukleotid eller til det tilsvarende nor- I 20 male nukleotid.

I I denne tredie udførelsesform af opfindelsen kan der således I gennemføres konventionel forstærkning i et ønsket antal cyk- I lusser og hybridisering med den diagnostiske primer som gen- I 25 stand for det næste trin forud for påvisningstri nnet. Det er I ikke nødvendigt at anvende nogen forstærkningsprimer.

I DK 175527 B1 Η H den diagnostiske sonde bliver udført en gang, hvilket således yderligere reducerer risikoen for falsk priming af en termi- H nal, umage (generelt 3'-umage) diagnostisk primer. Ifølge H denne tredie udførelsesform anvises der således en potentielt H 5 mere troværdig og robust fremgangsmåde til ikke-ekspertbrug, H som er mere overbærende med operatørfejl. Denne tredie H udførel sesform kommer ønsket om et ekstra pol ymerasekædere- H akt ionskontrol trin i forkøbet, eftersom den indledende for- H stærkning tilvejebringer sin egen interne kontrol.

I 10

Den diagnostiske primer kan om ønsket bære et signal eller H mærke, som ikke ville være i risiko for at blive destrueret, H f.eks. i en høj-temperatur-cyklus-teknik såsom PCR. F.eks, H kan mærkning gennemføres under anvendelse af en passende H 15 mærknings- eller signalenhed, såsom alkalisk phosphatase H eller peberrods-peroxidase, som beskrevet.

I den henseende kan anvendelsen af termostabile enzymer til H mærkning, såsom phosphatase hidrørende fra Thermus aquaticus, 20 have interesse.

I en fjerde og foretrukket udførelsesform af den foreliggende opfindelse er den tredie udførelsesform af den foreliggende opfindelse modificeret ved indføring af det træk at anvende I 25 to diagnostiske primere, som beskrevet i den anden udførel- I sesform af den foreliggende opfindelse, hvilken anden diagno- stisk primer eventuelt tjener som en forstærkningsprimer.

I I den fjerde udførélsesform af den foreliggende opfindelse I 30 underkastes en prøve omfattende DNA, som indeholder et mis- I tænkt, afvigende nukleotid, således for forstærkning, og det I forstærkede produkt behandles under ét eller i rækkefølge med enten: 35 a) en første diagnostisk primer med en sekvens som i alt værn sentligt er komplementær til en diagnostisk andel af en første nukleinsyresekvens, hvilken første diagnostiske primer

DK 175527 B1 I

har et terminalt nukleotid, som er komplementært til det I

mistænkte, afvigende nukleotid, og en anden diagnostisk pri- I

mer med en sekvens som i alt væsentligt er komplementær til I

en diagnostisk andel af en anden nukleinsyresekvens, hvilken 5 anden diagnostiske primer har et terminalt nukleotid, som er

komplementært til nukleotidet, som er komplementært til det I

mistænkte, afvigende nukleotid, eller I

b) en første diagnostisk primer med en sekvens som i alt ve- I

10 sentligt er komplementær til en diagnostisk andel af en før ste nukleinsyresekvens, hvilken første diagnostiske primer har et terminalt nukleotid, som er komplementært til det nor-I male nukleotid, hvilket svarer til det mistænkte, afvigende I nukleotid, og en anden diagnostisk primer med en sekvens som I 15 i alt væsentligt er komplementær til en diagnostisk andel af I en anden nukleinsyresekvens, hvilken anden diagnostiske I primer har et terminalt nukleotid, som er komplementært til I nukleotidet, hvilket er komplementært til det normale nukle- I otid, der svarer til det mistænkte, afvigende nukleotid; I 20 I idet det terminale nukleotid i den første diagnostiske primer I enten begge er ved 5'-enden eller begge er ved 3'-enden af de I respektive primere, og idet den første nukleinsyresekvens er I komplementær til den anden nukleinsyresekvens.

I 25 I Generelt er det terminale nukleotid i den første diagnostiske I primer og det terminale nukleotid i den anden diagnostiske i I primer hver især ved 3'-enden af deres respektive primere.

I 30 I den fjerde udførelsesform af den foreliggende opfindelse I kombineres således de mulige fordelé hos de ovenfor definere- I de anden og tredje udførelsesformer af opfindelsen, hvilke I fordele blandt andet er en eventuelt forøget specificitet, I reduceret omkostning og en mere robust, brugervenlig teknik.

I 35 I Påvisning af tilstedeværelsen eller fraværet af et mistænkt, I afvigende nukleotid kan f.eks. ske som beskrevet herefter.

I DK 175527 B1 I

I I

Det skal forstås, at det forstærkede produkt, som én gang er I

B behandlet med enten (a) eller (b) som tidligere defineret I

heri, om ønsket kan underkastes en eller flere endelige cyk- I

lusser. Hvor der gennemføres adskillige cyklusser kan der I

5 opnås et yderligere produkt, som er en hybrid af forlængel- I

B sesprodukterne af de diagnostiske primere. De forskellige, I

B produkter vil dannes i forhold, som afhænger af de relative I

B forhold mellem den oprindelige PCR {polymerase-kæde-reakti- I

B on)-primer oligonuk1eoti der og de tilsatte diagnostiske pri- I

B 10 mero1 igonuk1eoti der. I

B Hvor der er gennemført forstærkning enten ved anvendelse af I

B diagnostiske primere og forstærkningspri mere eller ved an- I

B vendelse af to diagnostiske primere, f.eks. som beskrevet i I

B 15 den første og anden udførelsesform af den foreliggende opfin- I

B delse, eller som del af den forstærkningsprocedure, som er I

beskrevet i europæisk patentpublikation nr. 237.362, idét I

trinnene (a) denaturering for at separere primerforlængelses- I

produkter fra deres skabelon og (b) sammenbringning af de I

20 derved opnåede enkeltstrenge enten under ét eller i rækkeføl- I

ge med hensigtsmæssige nukleosidtriphosphater, et middel til I

polymerisation af nukleosidtriphosphaterne, og de relevante I

primere til syntetisering af yderligere forlængelsesproduk- I

ter; fortrinsvis gentages mindst fem gange (cyklusser) op til I

25 et ikke nærmere afgrænset antal, især hvor primeren er re- I

fraktær over for forstærkning, uden skade for den foreliggen- I

de opfindelse. Der anvendes mere foretrukket 15-60, f.eks. I

15-30 gange (cyklusser), hvis prøven indeholder human genom I

DNA. Hvis prøven omfatter celler, opvarmes de fortrinsvis før I

30 trin (a) for at udsætte nukleinsyrerne deri for reagenserne. I

Dette trin undgår oprensning af nukleinsyrerne forud for I

reagenstilsætning. I denne henseende skal det forstås, at den I

foreliggende opfindelse repræsenterer en væsentlig forbedring I

i forhold til tidligere processer, selv hvis der udføres DNA- I

35 oprensning fra en prøve forud for forstærkningsforsøget. I

Det skal forstås, at kontakten i trin (b) mellem de i trin I

(a) fremstillede enkeltstrenge og de hensigtsmæssige nukleo- I

13 DK 175527 B1 sidtriphosphater, et middel til polymerisation af nukleosid-triphosphaterne, primenen eller primerne, f.eks. den diagnostiske primer eller de diagnostiske primere og/eller for-stærkningsprimeren eller f orstærkni'ngspr imerne kan gennemfø-•5 res enten ved tilsætning af disse materialer til reaktions blandingen efterfulgt af separation af primerforlængelsesproduktet fra dets skabelon (trin a) eller der må sættes lid til de materialer, som allerede er til stede i reaktionsblandin- gen. Et hvilket som helst eller flere forskellige nukleosid-10 triphosphater og/eller polymerisationsmidlet og/eller prime- ren eller primerne, f.eks. den diagnostiske primer eller de diagnostiske primere og/eller forstærkningsprimeren kan tilsættes, på et hvilket som helst tidspunkt af fremgangsmåden I ifølge opfindelsen.

I 15 I Ifølge en femte og foretrukket udførelsesform af den forelig- I gende opfindelse anvises der en fremgangsmåde, som tidligere I defineret heri, hvori forstærkning sker ved hjælp af primer- I forlængelse, der er baseret på anvendelsen af en enkelt I 20 streng af prøvenukleinsyre som skabelon.

I I denne udførelsesform gennemføres primerforlængelse således I på basis af anvendelsen af den samme streng af prøvenuklein- I syre som skabelon, idet der ikke er nogen forstærkningsprimer I 25 til stede. Forstærkning er således ari tmetrisk frem for eks- I ponentiel, idet eksponentiel forstærkning er mulig i det I mindste i teorien med polymerasekædereakti onerne (PCR). For- I delen ved denne femte udførelsesform af den foreliggende op- I findelse (også refereret til heri som lineær forstærkning) I "30 er, at artefakte produkter, hvis de fremstilles, ikke selv I kan udsættes for eksponentiel forstærkning.

I Lineær forstærkning kan gennemføres ved hjælp af en hvilken I som helst konventionel metode og kan således gennemføres ved I 35 hjælp af anvendelsen af komplementære nukleosidtriphosphater I i nærværelse af et polymerisationsmiddel til nukleosidtri- I phosphaterne til dannelse af primerforlængelsesprodukter af

I DK 175527 B1 I

I 14 I

ikke nærmere bestemt længde, hvor en tilstrækkelig grad af I

komplementaritet er til stede mellem den diagnostiske primer I

og prøvenukleinsyren. I

5 Når alle komplementære nukleosidtriphosphater skal anvendes, I

I underkastes prøvenukleinsyren fortrinsvis endonukleasefordø- I

jelse, idet restriktionsendonukleasen vælges således, at det I

sikres, at spaltning af prøvenukleinsyren sker på et sted, I

som er egnet til at muliggøre dannelsen af primerfolængelses- I

10 produktermed fastsat længde. Det er imidlertid fordelagtigt, I

at den lineære forstærkning kan udføres i nærværelse af kun I

et, fordelagtigt kun to eller fortrinsvis kun tre nukleosid- I

triphosphater, således at den diagnostiske primer i sin bin- I

dingsti 1 stand (dvs. hybridiseret til prøvenukleinsyren) kun I

15 kan forlænges så langt som tilstedeværelsen af kun 1, 2 eller I

3 nukleosidtriphosphater vil muliggøre. Når et nukleosidtri- I

I phosphat en gang er til stede i prøvenukleinsyren, hvortil I

der ikke er noget komplementært nukleosidtriphosphat til ste- I

de, vil primerforlængelse ophøre. I

I 20 I

Den lineære forstærkning kan om ønsket gennemføres ved se- I

I kvensens smeltetemperatur (Tm). Ved denne temperatur er den I

diagnostiske primer, som er hybridiseret til den komplemen- I

tære sekvens i prøvenukleinsyren, i ligevægt med den diagno- I

I 25 stiske primer, som findes frit i opløsningen, og således hy- I

I bri diseres den diagnostiske primer (eventuelt i forlænget I

form) hurtigt til og denatureres fra prøvenukleinsyren. Den I

lineære forstærkning kan også om ønsket gennemføres ved ter- I

misk oscillation. En sådan term i sk ose i 11 at i on ville generelt I

I 30 involvere hurtig temperatursvingning omkring sekvensens sme 1 - I

I tetemperatur. I

I Hvis kun 1, 2 eller 3 nukleosidtriphosphater.er til stede vil I

I den diagnostiske primer så kun forlænges så langt, som til- I

35 stedeværelsen af disse nukleosidtriphosphater vil muliggøre. I

I Som anført ovenfor vil der i de tilfælde, hvor der er en uma- I

I gethed (eng.: mismatch) mellem f.eks. den 3'-terminale ende i I

15 DK 175527 B1

den diagnostiske primer og det tilsvarende nukleosidtriphos- I

phat i prøvenuklei nsyren, ikke finde nogen primerforlængelse I

sted. I de tilfælde, hvor det 3’-terminale nukleosidtriphos- I

phat er komplementært til det tilsvarende nukleosidtriphos- I

5 phat i prøvenukleinsyren vil pr imerfor længel ser imidlertid I

finde sted. I

Hvor der kun anvendes 1, 2 eller 3 nukleosidtriphosphater, og I

hvor det terminale nukleos i dtriphosphat i den forlængede di- I

10 agnostiske primer kun anvendes én gang i brug, kan det være I

fordelagtigt at anvende et dideoxynukleosidtriphosphat som I

nukleosidtriphosphatet, hvilket i brug vil udgøre det termi- I

nåle nukleosidtriphosphat i det diagnostiske primer-forlænge- I

de-produkt. Dette vil hjælpe til produktion af en klart af- I

15 grænset forlængelse af den diagnostiske primer. I

Om ønsket kan en eller flere af nukleosidtriphosphaterne, som I

I er til stede i reaktionsblandingen med det formål at blive I

I inkorporeret i den forlængede primer eller de forlængede pr i - I

I 20 mere, være mærket eller markeret på en hvilken som helst kon- I

I ventionel måde. Således kan f.eks. et eller flere af nukleo- I

I sidtriphosphaterne være fluorescensmærket. Denne mærkning af I

I nukleosidtriphosphaterne er af særlig interesse i forhold til I

I den femte udførelsesform af den foreliggende opfindelse, hvor I

I 25 fremstilling af et forlængelsesprodukt af den diagnostiske I

I primer kan påvises ved påvisning af det eller de mærkede I

I eller markerede nukleosidtriphosphater, som er inkorporeret i I

forlængelsesproduktet. Når der ikke dannes noget forlængel- I

sesprodukt, finder der ingen inkorporering sted, og de mærke- I

I 30 de eller markerede nukleosidtriphosphater kan f.eks. bor t- I vaskes. Nærmere bestemt undgås i den femte udførelsesform af I den foreliggende opfindelse problemet med forstærkning af I artefakte produkter, og gør det således muligt at opnå god I skelneevne i nærværelsen af det eller de mærkede eller marke- I 3 5 rede nukleos idtriphosphater. Når forstærkning gennemføres I f.eks. ved anvendelsen af PCR kan en hvilken som helst frem- I stilling af et artefakt produkt resultere i forstærkning af

I DK 175527 B1 I

I 16 I

I dette produkt, og således vil inkorporering af det mærkede eller markerede nukleo- I

I sidtriphosphat derved reducere skelneevne. I

I tilknytning til det ovenstående kan det være ønskeligt, at den diagnostiske primer bæ- I

5 rer en bestanddel af et immunologisk bindingspar, f.eks. et antigen eller et antistof, el- I

ler en bestanddel af et kompleksdannende par, f.eks. biotin, til binding den anden be- I

I standdel af bindingsparret eller det kompleksdannende par med det formål at blive I

I fastholdt på fast fase. I

I lø Betegnelsen "nukleosidtriphosphat" anvendes heri til at refe- I

I rere til nukleosider, som er til stede i enten DNA eller RNA, I

I og omfatter således nukleosider, som inkorporerer adenin, cy- I

I tosin, guanin, thymin og uracil som base, idet sukkerenheden I

I er deoxyribose eller ribose. Generelt vil deoxyribonukleosi- I

I der blive anvendt sammen med en ONA-polymerase. Det skal I

I 15 imidlertid forstås, at der kan anvendes andre modificerede I

I baser, som er i stand til at danne basepar med en af de kon- I

I ventionelle baser adenin, cytosin, guanin, thymin og uracil. I

I Sådanne modificerede baser omfatter f.eks. 8-azaguanin og I

I hypoxanthin. I

I 20 Betegnelsen "nukleotid" som anvendt heri kan referere til nu- I

I kleotider, som er til stede i enten DNA eller RNA, og omfat- I

I ter således nukleotider, som inkorporerer adenin, cytosin, I

I guanin, thymin og uracil som base, idet sukkerenheden er de- I

I oxyribose eller ribose. Det skal imidlertid forstås, at andre H

I modificerede baser, som er i stand til at danne basepar med I

I 25 en af de konventionelle baser adenin, cytosin, guanin, thy- I

I min og uracil, kan anvendes i den diagnostiske primer og for- I

I stærkningsprimeren, der anvendes ifølge den foreliggende op-

I findelse. Sådanne modificerede baser omfatter f.eks. 8-aza- H

I guanin og hypoxanthin. H

I 3ø Det skal forstås, at i de tilfælde, hvor fremgangsmåden iføl- H

I ge den foreliggende opfindelse skal anvendes til påvisning af H

DK 175527 B1 tilstedeværelsen eller fraværet af et mistænkt, afvigende nu-kleotid, som er naboliggende til en andel af må 1 basesekvensen, og som ikke indeholder alle fire forskellige nukleoti-der, kan et forlængelsesprodukt af den diagnostiske primer og 5 om ønsket et forlængelsesprodukt af forstærkningsprimeren dannes i nærværelse af kun de passende tilsvarende nukleosid-triphosphater, og alle fire forskellige nukleosidtriphos-phater ville ikke være nødvendige.

10 Midlet til polymerisation af nuk1eosidtriphosphaterne kan være en hvilken som helst forbindelse eller et hvilket som helst system, som vil virke til at fuldføre syntesen af primerforlængelsesprodukter, indbefattende enzymer. Velegnede enzymer til dette formål omfatter f.eks. E. coli DNA-polyme-15 rase I, Klenow fragment af E. coli DNA-polyroerase I, T4 DNA-polyinerase, andre tilgængelige DNA-polymeraser, omvendt tran-skriptase og andre enzymer, herunder termostabi1e enzymer. Betegnelsen "termostabi1t enzym" som anvendt heri refererer til et enzym, som er varmestabilt og varmemodstandsdygtigt, 20 og som katalyserer (letter) kombination af nukleotiderne på en korrekt måde til dannelse af pr imerforlængelsesprodukter-I ne, som er komplementære til hver nukleinsyrestreng. Syntesen I vil generelt begynde ved 3’-enden hos hver primer Og skride I fremad i 5'-retningen langs skabelonstrengen, indtil syntesen I 25 slutter, idet der produceres molekyler med forskellige læng- I der. Oer kan være enzymer, f.eks. termostabile enzymer, som I imidlertid begynder syntesen ved 5'-enden og skrider fremad i I den anden retning under anvendelse af den samme proces som I beskrevet ovenfor. Et foretrukket termostabilt enzym, som kan I 30 anvendes i fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, I er et sådant, som kan ekstraheres og oprenses fra Thermus I aquaticus. Et sådant enzym har en molekylvægt fra ca.

I 86.000-90.000 dalton som beskrevet i europæisk patentpub1 ika- I tion nr. 237.362 (se også europæisk patentpublikation nr.

I 35 258.017). Thermus aquaticus stamme YT1 er tilgængelig uden I begrænsning fra American Type Culture Collection, 12301 I Parlawn Drive, Rockville, Maryland, USA som ATCC 25.104.

I ,- DK 175527 B1

1¾ I

Udtrykket "diagnostisk andel" som anvendt heri betyder den I

I andel af målbasesekvensen (som er defineret herefter), der I

som dens terminale nukleotid indeholder det eventuelle, af- I

vigende nukleotid, hvis tilstedeværelse eller fravær skal på- I

I 5 vises. Det eventuelle, afvigende nukleotid vil generelt være I

ved den 5'-terminale ende i den diagnostiske andel, eftersom I

I syntese af primerforlængelsesprodukter generelt vil begynde I

I ved 3'-enden hos hver primer som beskrevet ovenfor. Når der I

I imidlertid skal anvendes et middel til polymerisation, som I

I 10 begynder syntesen ved 5'-enden i den diagnostiske primer og I

I skrider fremad i 3'-retningen langs skabelonstrengen, indtil I

I syntesen slutter, vil den "diagnostiske andel" indeholde det I

I eventuelle, afvigende nukleotid ved sin 3'-ende. De diagno- I

I stiske primere vil også være hensigtsmæssigt udformet i denne I

I 15 henseende, som anført nedenfor. I

Udtrykket "målbasesekvens" som anvendt heri betyder en nukle- I

otidsekvens omfattende mindst en diagnostisk andel (som tid- I

ligere defineret). Således kan målsekvensen f.eks. i en I

20 enkelt undersøgelse for Ø-thalassæmi indeholde op til 60, I

f.eks. 50 diagnostiske andele, idet hver diagnostisk andel I

indeholder et enkelt, eventuelt afvigende nukleotid. I

Betegnelsen "oligonukleotid" som anvendt heri er defineret I

25 som et molekyle, der er sammensat af to eller flere deoxy- I

ribonulkeotider eller ribonukleotider, fortrinsvis mere end I

tre. Dets eksakte størrelse vil afhænge af mange faktorer, I

såsom reaktionstemperaturen, saltkoncentrationen, tilstedevæ- I

reisen af formamid og tilstedeværelsen af en anden nær muta- I

30 tion eller andre nære mutationer, såsom i seglcelle HbC-syg- I

dom, som igen afhænger af den endelige funktion eller anven- I

delse af oligonukleotidet. 01igonukleotidets eksakte sekvens I

kan også afhænge af en række faktorer, som vil blive beskre- I

vet herefter. 01igonukleotidet kan være afledt syntetisk I

35 eller ved kloning. I

Betegnelsen "primer" som anvendt heri referer til et oligonu- I

kleotid, som enten forekommer naturligt som i en oprenset re- I

^ DK 175527 B1 I

striktionsfordøjelse eller er fremstillet syntetisk, og som I

er i stand til at virke som et punkt til begyndelse af syn- I

tese, når det anbringes under forhold, hvor syntese af et I

primerforlængelsesprodukt, som er komplementært til en nukle- I

5 insyrestreng, induceres, dvs. i nærværelse af hensigtsmæssigt I

nukleosidtriphosphater og et middel til polymerisation, såsom I

DNA-po1 ymerase, i en passende puffer ("puffer" omfatter pH- I

værdi, ionstyrke, cofaktorer- etc.) og ved en hensigtsmæssig I

temperatur. I

Primeren er fortrinsvis enkeltstrenget til maksimal effekti- I

vitet ved forstærkning, men kan alternativt være dobbelt- I

strenget. Hvis primeren er dobbeltstrenget, behandles den I

først for at separere dens strenge, før den anvendes til I

15 fremstilling af forlængelsesprodukter. Primeren er fortrins- I

vis et ol igodeoxyribonuk1eotid . Primeren må være tilstrække- I

ligt lang til at igangsætte (eng.: prime) syntesen af forlæn- I

gelsesprodukter i nærværelse af midlet til polymerisation. De I

eksakte længder af primerne vil afhænge af mange faktorer, I

20 herunder temperatur og kilde til primer samt anvendelse af I

metoden. Afhængigt af mål sekvensens kompleksitet indeholder I

de diagnostiske primere og forstærkni ngsprimerne typisk 12-35, f.eks. 15-35 nukleotider, skønt de kan indeholde flere eller færre nukleotider. Korte primermolekyler kræver gene-25 relt lavere temperaturer til dannelse af tilstrækkeligt stabile hybridkomplekser med skabelonen.

Betegnelsen "komplementært til" anvendes heri i forbindelse med nukleotider og skal betyde et nukleotid, som vil danne 30 basepar med et andet specifikt nukleotid. Således er adeno-sintriphosphat komplementært til ur idintriphosphat eller thymidintriphosphat, og guanosintriphosphat er komplementært til cyt i dintriphospha t. Det skal forstås, at skønt thymidintriphosphat og guanosintriphosphat kan danne basepar under 35 visse omstændigheder, anses de ikke for at være komplementære til formålene ifølge opfindelsen. Det skal også forstås, at skønt cytosintriphosphat og adenosintriphosphat kan danne I DK 175527 B1 I 2.0 H basepar under visse omstændigheder, betragtes de ikke som H værende komplementære til formålene ifølge opfindelsen. Det H samme gælder for cytosintriphosphat og uraci1 triphosphat.

5 Primerne heri er udvalgt til at være "i alt væsentligt" kom- H plementære til de forskellige strenge i hver specifik se- H kvens, der skal forstærkes. Dette betyder, at primerne må H være tilstrækkeligt komplementære til at hybridisere med de- H res respektive strenge. Primersekvensen behøver derfor ikke H 10 at afspejle skabelonens nøjagtige sekvens. I de tilfælde hvor H den diagnostiske primer omfatter en nukleotidsekvens, i hvil- ken det 3'-terminale nukleotid er komplementært til enten det mistænkte, afvigende nukleotid eller det tilsvarende, normale H nukleotid, kan et ikke-komplementært nukleotidfragment f.eks.

15 være bundet til primerens 5'-ende, idet resten af primersek- vensen er komplementær til den diagnostiske andel af målbase- skvensen. Primerne har imidlertid sædvanligvis nøjagtig kom- plementaritet, undtagen for så vidt som ikke-komplementære nukleotider kan være til stede ved en forudbestemt primer- 20 ende som tidligere beskrevet heri.

Oet skal imidlertid forstås, at under visse omstændigheder kan syntese af et diagnostisk primerforlængelsesprodukt indu- ceres til at finde sted selv i nærværelsen af en ikke-komple- 25 mentær 3'-terminal rest. Dette artefakte resultat kan stamme I fra anvendelsen af en for lav temperatur, i hvilket tilfælde temperaturen kan forhøjes, for lang tids inkubering/sammen- slutning (eng.: annealing), i hvilket tilfælde tiden kan I reduceres, for høj saltkoncentration, i hvilket tilfældet I 30 saltkoncentrationen kan reduceres, for høj enzymkoncentrati- on, for høj nukleosidtriphosphatkoncentration, en ukorrekt pH-værdi eller en ukorrekt længde af oligonukleotidprimer.

I Alle disse faktorer er diskuteret i europæisk patentpub 1 ika- tion nr. 237.362. En større kilde til artefakte produkter er 35 sandsynligvis, at reaktionstemperaturen får Tov til at falde for meget og således muliggør for lav stringens, f.eks. ved I at fjerne reaktionsblandingen fra varmecyk1usorganet, skønt DK 175527 B1 kun i kort tid f.eks. for at tilsætte midlet til polymerisation (f.eks. Taq-polymerase) især i den første reaktionscyklus. I tilknytning til det ovenstående har det vist sig, at sådanne artefakte resultater også kan opstå fra anvendelsen 5 af en diagnostisk primer, som er særligt rig på G(guanosin)-og C(cytidin)-rester. En diagnostisk primer kan give anledning til vanskelighed i denne henseende, hvis den er rig på G/C som helhed, eller især hvis den er rig på G/C ved sin relevante ende, normalt 3*-enden. Endvidere kan baseparrin-10 gens præcise natur i den relevante, normalt 3'-enderegion i den diagnostiske primer ved brug være årsagen til et artefakt resultat. Tilstedeværelsen af As(adenosin) i baseparringen i den relevante, normalt 3'-enderegion i den diagnostiske primer har således en tendens til at forbedre specificitet, 15 hvilket tilstedeværelsen af Gs (guanosin) ikke gør. Endvidere kan den præcise natur af umagetheden (eng.: mismatch) ved den relevante, normalt 3'-ende i den diagnostiske primer være en vigtig faktor til, hvorvidt der opnås et artefakt resultat eller ej. Således resulterer f.eks. en AA- eller CT-umagethed 20 normalt ikke i hybridisering, men en GT- eller AC-umagethed kan resultere i forskellig grad af hybridisering til at resultere i dannelse af et artefakt produkt eller artefakte produkter. Artefakte resultater kan undgås ved med fuldt overlæg at indføre en eller flere yderligere umage rester 25 eller om ønsket deletioner eller indsættelser i den diagnostiske primer til destab i lisering af pr i meren ved yderligere at reducere bindingen under hybridisering.

Således kan f.eks. et hvilket som helst eller flere end 10, 30 f.eks. 6 nukleotider, som er naboliggende til den terminale umagethed, ændres til indførsel af yderligere umagethed. Generelt er kun en umagethed i tilknytning til den terminale umagethed nødvendig, anbragt f.eks. 1, 2 eller 3 baser fra den terminale umagethed. I forbindelse med f.eks. konstate-35 ringen af tilstedeværelsen af en normal homozygot, heterozy-got eller påvirket homozygot med hensyn til Z-allelen af αΐ-antitrypsi ngenet har det således vist sig, at gode resul- I DK 175527 B1 I 11 tater kan opnås, hvis det tredje nukleotid fra det 3'-termi-

nåle nukleotid i brug ændres til dannelse af en umagethed. I

Således har det f.eks. vist sig, at tilstedeværelsen af C i I

stedet for A som det tredje nukleotid fra 3'-enden i den I

5 diagnostiske primer gør det muligt let at skelne normale I

homozygoter, heterozygoter og påvirkede homozygoter med hen- I

syn til Z-allelen. Den bedste udformning af diagnostisk I

primer kan således fastlægges ved direkte eksperimenteren på I

basis af de ovennævnte kriterier, idet en sådan eksperimen- I

10 teren er godt inden for den uddannede molekylærbiologs fær- I

dighed. I

I Betegnelsen "diagnostisk primer" anvendes heri til at refere- I

re til den primer, som har en nukleotidsekvens således, at et I

I 15 terminalt nukleotid deraf er udvalgt til enten at være kom- I

plementært til det mistænkte, afvigende nukleotid eller til I

I det ti 1 svarende normale nukleotid, således at der syntetise- I

res et forlængelsesprodukt af den diagnostiske primer, når I

H det terminale nukleotid i den diagnostiske primer er komple- I

I 20 mentært til det pågældende terminale nukleotid i den tilsva- I

I rende diagnostiske andel af målbasesekvensen, men således, at I

I der ikke syntetiseres noget forlængelsesprodukt, når det ter- I

I minale nukleotid i den diagnostiske primer ikke er homologt I

med det pågældende terminale nukleotid i den tilsvarende I

25 diagnostiske andel af målbasesekvensen. I

Betegnelsen "forstærkningsprimer" anvendes heri til at refe- I

rere til en primer, som er i stand til at hybridisere til nu- I

kleinsyrestrengen, som er komplementær til den nukleinsyre- I

30 streng, hvortil den diagnostiske primer er i stand til at hy- I

bridisere, hvilken "forstærkningsprimer" har en nukleotidse- I

kvens således, at den er i stand til at hybridisere til et I

diagnostisk primerforlængelsesprodukt efter separation fra I

dets komplement, hvorved det diagnostiske primerforlængelses- I

35 produkt tjener som en skabelon til syntese af et forlængel- I

sesprodukt af forstærkningsprimeren og derved letter for- I

stærkning. I

DK 175527 B1 I

Den foreliggende opfindelsen er således i det mindste delvis rettet mod en forbedring af forstærkningsprocesser, såsom den

proces, der er beskrevet i europæisk patentpublikation nr. I

237.362, hvori forbedringen gør det muligt selektivt at for- I

5 stærke enten en sekvens indeholdende et mistænkt, afvigende nukleotid, hvis det er til stede, eller en sekvens indehol-

dende det tilsvarende normale nukleotid, hvis det er til ste- I

de, hvilket således forenkler påvisning, medens sekvensbe-

stemmende, allelspecifikke ol igonukleotider og restriktions- I

10 fordøjelse undgås. For en given nukleotidvariation, f.eks.

punktmutation, kan dens tilstedeværelse eller fravær således påvises enten 1) ved at udforme den diagnostiske primer til at have et passende terminalt nukleotid, som er komplementært til den mistænkte nukleotidvariation, således at syntesen af 15 et forstærket produkt vil være tegn på tilstedeværelsen af den mistænkte nukleotidvariation, og fraværet af et forstærket produkt vil være tegn på fraværet af den mistænkte nukleotidvariation; eller 2) ved at udforme den diagnostiske primer til at have et passende terminalt nukleotid, som er kom-20 plementært til det tilsvarende normale nukleotid, således at syntesen af et forstærket produkt vil være tegn på fraværet af den mistænkte nukleotidvariation, og fraværet af et forstærket produkt vil være tegn på tilstedeværelsen af den mistænkte nukleotidvariation. Referencer heri til det "passende 25 terminale nukleotid" betyder i denne henseende det terminale nukleotid i primeren, hvorfra syntesen om muligt ville begynde i brug. Eftersom midlet til polymerisation generelt ville begynde syntese ved pr i merens 3'-ende, ville det passende terminale nukleotid således generelt være det 3'-termi-30 nåle nukleotid.

Bekræftelse på tilstedeværelsen eller fraværet af f.eks. en given punktmutation kan opnås ved at vælge at. bruge både alternativ procedure (1) og alternativ procedure (2), som er 35 beskrevet ovenfor. En kombination af de to fremgangsmåder t i 1 vejebri nger en metode til påvisning af heterozygoter, som vil have værdi for analysen af dominante, medfødte tilstande og ved påvisning af bærere af recessive, medfødte tilstande.

I ^ DK 175527 B1

Η I en foretrukket udførelsesform er den foreliggende opfindel- I

se rettet mod påvisning af tilstedeværelsen eller fraværet af I

mere end et mistænkt, afvigende nukleotid i den samme prøve. I

Evnen ifølge den foreliggende opfindelse til selektivt at I

5 forstærke sekvenser afhængigt af den forudbestemte nukleotid' I

sekvens i de diagnostiske primere gør det muligt på enkel I

måde, akkurat og med minimal operatørfærd ighed at skelne I

mangfoldige forstærkningsprodukter, hvilket således gør det I

muligt at tilvejebringe en robust teknik til screening af en I

10 enkelt prøve for mangfoldige nukleotidvariationer. Den fore- I

liggende opfindelse har således særlig interesse ved scree- I

ning af en enkelt prøve af DNA eller RNA for en gruppe af I

medfødte tilstande, såsom genetiske sygdomme, prædispositio- I

ner og somatiske mutationer, der fører til forskellige syg- I

I 15 domme. Sådant DNA eller RNA kan f.eks. ekstraheres fra blod I

eller vævsmateriale, såsom chorion-villi eller amniotiske I

celler ved en række teknikker, såsom sådanne, der er beskre- I

vet af Maniatis et al. Molecular Cloning (1982), 280-281. I

I Efterhånden som den molekylære basis for yderligere medfødte I

20 tilstande bliver kendt kan disse yderligere tilstande end- I

I videre ganske enkelt inkluderes i screenings-teknikken ifølge I

I den foreliggende opfindelse. I

Mangfoldige forstærkningsprodukter kan skelnes ved hjælp af I

25 en række tekniker. Således kan der f.eks. anvendes sonder til I

hvert mistænkte, forstærkede produkt, idet hver sonde bærer I

et forskelligt og skelneligt signal eller rest, der er i I

stand til at give et signal. I 1 2 3 4 5 6

Sådanne signaler og rester, som er i stand til at give et I

2

signal er detaljeret diskuteret i den europæiske patentpubli- I

3

kation nr. 246.864, men kan f.eks. omfatte fastfase-forstærk- I

4

ningssystemet, som er beskrevet af C. G. Wang i World Biotech I

5

Report 1986, bind 2, del 2, side 33-37, (Diagnostics Health- I

6

care Proceedings fra konferencen holdt i november 1986, San I

Francisco), i hvilket system mikroperler, som er dannet med I

mange udvalgte sporelementer, er konjugeret til sonden. I

DK 175527 B1

Tilstedeværelsen af specifikke sonder kan påvises ved røntgenstrålef 1uorescensanalyse. Sådanne teknikker ville generelt være enkle og direkte at anvende, eftersom det kun ville være nødvendigt at påvise eksistensen af et forstærkningsprodukt, 5 fremfor at skelne mellem sekvenser, der afviger med så lidt som et enkelt nukleotid.

En meget mere enkel og foretrukket metode til at skelne forstærkningsprodukter fra hinanden omfatter udvælgelse af nu-10 kleotidsekvenserne i forstærkningsprimerne således, at længden af hvert forstærkningsprodukt, som er dannet ved hjælp af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, er forskellig. I denne henseende dikteres antallet af basépar, som er til stede i et forstærkningsprodukt, af afstanden mellem 15 de diagnostiske primere og f orstærkn i ngspr i nierne . Forstærkningsprimerne kan således være udformet på en sådan måde, at hvert eventuelt afvigende nukleotid er forbundet med et eventuelt forstærkningsprodukt af forskellig længde. 1 2 3 4 5 6

Tilstedeværelsen eller fraværet af et givet, eventuelt, af 2 vigende nukleotid, kan således fordelagtigt påvises ved elek- 3 troforeseteknikker, i hvilke de opnåede forskellige, forstær 4 kede produkter kan fordeles efter deres molekylvægt og der 5 ved identificeres f.eks. ved hjælp af autoradiografi- eller 6 f 1 uorescensteknikker. Længderne hos de forskellige produk ter kan afvige med blot et enkelt nukleotid, men fortrinsvis vil længderne afvige med mindst 3 nukleotider. Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse gennemføres fortrinsvis I ved anvendelsen af et indskydende farvestof, såsom ethidium- I 30 brom id, der kan ses som en orange fluorescens ved ultraviolet I bestråling. Således kan tilstedeværelsen eller fraværet af et I stort antal eventuelle, afvigende nukleotider i en enkelt I prøve hurtigt, akkurat og let bestemmes. Den eller de diagno- I stiske primere og/eller forstærkningsprimeren eller forstærk- I 35 ningsprimerne kan om ønsket være markerede eller mærkede I f.eks. ved anvendelsen af en fluorophor. Således kan f.eks.

I hver forskellig diagnostisk primer eller forstærkningsprimer I DK 175527 B1 I zta

H bære en forskellig fluorophor således, at resultaterne fra en I

H gruppe af undersøgelser kan ses fra en elektroforesegel, f.eks. ved hjælp af 1 aserscanner, hvilket således muliggør 5 automatisering af fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Alter- nativt kan tilstedeværelsen eller fraværet af et forstærket produkt ganske enkelt fastsættes ved hjælp af anvendelsen af et opløsningsmiddel, som er i stand til selektivt at opløse nukleosidtriphosphater, men ikke i stand til at opløse en nukleotidsekvens (f.eks. DNA). Trich1oreddikesyre (TCA) er et 10 eksempel på et sådant opløsningsmiddel. Tilstedeværelsen eller fraværet af et forstærket produkt kan således f.eks.

bestemmes ved TCA-præcipitering af forstærkede reakt ionsblan- dinger. I de tilfælde, hvor inkorporering af de pågældende nukleosidtriphosphater har fundet sted i en eksponentiel reaktionsrække, vil så i . alt væsentligt større mængder, af J5 TCA-uopløseligt materiale være til stede end, hvor der ikke har fundet forlængelse af den diagnostiske primer sted. Kvan- titativ bestemmelse af uopløseligt materiale kan udføres ved I kendte metoder. Således kan f.eks. nukleosidtriphosphaterne I være mærkede (f.eks. ved hjælp af en radioaktiv eller fluo- rescerende markør), reaktionsblandingen kan underkastes I 20 f*eks. centrifugering, den tilstedeværende flydende del kan dekanteres fra og enten det flydende eller uopløselige pro- I dukt kan udsættes for hensigtsmæssige påvisningsteknikker, I såsom radioaktiv tælling eller fluorescensbestemmelse.

2> DK 175527 B1

Oet terminale nukleotid, som er komplementart til enten et mistænkt, afvigende nukleotid eller til det tilsvarende nor-male nukleotid, er hensigtsmæssigt ved nukleotidsekvensens 3'-ende. Det mistænkte, afvigende nukleotid hidrører fortrinsvis fra en punktmutation af den tilsvarende normale sekvens.

Nukleotidsekvensen kan f.eks. have 10 til 50 bp, f.eks. 10 jq til 36 bp.

Som eksempel er de følgende kendte genetiske sygdomme beskre-15 vet detaljeret, idet de ansvarlige mutationer for sygdommen og en relevant litteraturreference for hver mutation er vist.

I Nukleotidsekvenser og -sonder som tidligere defineret kan I f.eks. være baseret på de genetiske sygdomme, som er beskre- I vet detaljeret nedenfor, idet sekvensen af den relevante nu- I k 1 eotidsekvens eller -sonde kan fås fra den relevante litte- I 20 raturreference, som er angivet i tabellen.

I DK 175527 B1 I 28

Tabel - Mutationer, der forårsager genetisk sygdom I

A Autosomal I

5 Sygdom Mutation Reference I

Antithrombin Ill-mangel CG - TG Ouchange et al,Nucleic I

Acids Research I

I 14:2408 (1986) I

I I

Amyloid po1yneuropati CG - CA Maeda S. et al., I

I Mol .Biol.Med, I

I 329-338 (1986) I

I AC - GC Wallace M. R. et al, I

I 15 J. C1 in Invest I

I 78:6-12 (1986) I

I AG ** GG Wallace M. R. et al, I

I J. Cl i n Invest I

78:6-12 (1986) I

20 I

I α-1-antitrypsi nmange 1 TG - CG Nukiwa T. et al., I

I J.Biol.Chem. 261: I

I 15989-15994 (1986) I

I CG - CA Kidd V.J. et al., I

I 25 Nature 304:230-234 I

I (1983) I

I GAT - GTT Asp 256 - Val, Exon I

I III; ikke rapporteret I

I CTT - CTC deletion of codon 51 I

I 30 (normal) M. Malton, in I

I press. I

I GGC - TGC Arg39 - Cys, Exon II; I

I I variant, ikke rap- I

I porteret I

I 35 I

Base-par Mutation Reference 29 DK 175527 B1

Adenosin-deaminase-mange1 CG - CA Bonthron DT et al, J . Cl i n Invest 5 76:894-897 (1985) AA - AG Valerio D. et al, EMBO J. 5:113-119 (1985) 10

CT - CG

Apol ipoprotein E-mangel GT - GC Cladaras et al J.Biol. Chefn. 262: 15 2310-2315 (1987)

Diabetes mellitus, mild TC - CC Haneda M. et al, Proc.

Natl.Acad.Sci.USA 80:6366-6370 (1983) 20 TC - TG Shoelson S. et al..

Nature 302:540-543 (1983)

25 TG - TT

Gaucher's sygdom type 2 CT - CC Tsuji S. et al., N.

Eng 1.0.Med. 316: 570-575 (1987) 30

Hyperinsulisme, familieer CG - CA Shibasaki Y. et al., J.Cl i n.Invest 75:378-380 (1985) 1 CA - GA ChanSJ. et al.,

Proc.Natl.Acad.Sci.

USA 84:2194-2197 (1987)

I DK 175527 B1 I

I 30 I

I Sygdom Mutation Reference I

Immunoglobulin kappa- CT - CG Stavnezer-Nordgren J. I

I mangel et al.( Science 230: I

I 5 458-461 (1985) I

CG -> TG I

LDL receptor-mangel GG - GA Lehrman MA et al., I

I Cel! 41:735-743 (1985) I

I I

Osteogenesis imperfecta TG - TT Cohn DH et al., I

I (type II) Proc. Natl. Acad, Sci. I

I USA 83:6045-5047(1986) I

15 Pheny1ketonuri AG - AA Dilella AG et al. Na- I

I ture 322:799-803 I

I (1986) I

I CG - TG Dilella AG et al., Na- I

I ture 327:333-336 I

I 20 (1987) . I

I Protein C-mangel CG - TG Romeo G et al., Proc. I

I Natl.Acad.Sci.USA 84: I

2829-2832 (1987) I

GG - GC I

I 25 I

I Purinnukleosidphosphory- TG - TA Williams SR. et al., I

lasemangel J.Biol.Chem. 262: I

I 2332-2339 (1987) I

30 Seglcel leanæmi GAG - GT6 Chang JC og Kan YW. I

I Lancet 2, 1127-9 I

I (1981); Orkin SH. et I

I al» New Eng. J. Med. I

I 307, 32-6 (1982); og I

I 35 Conner BJ et al. Proc. I

I Nat 1.Acad.Sci.USA.,80, I

I 278-82 (1983). I

31

Sygdom Mutation Reference DK 175527 B1

Tangier-sygdom AG - AT Law SW. Brewer HB, J.

Biol.Chem. 260:12810- 5 128814 (1985)

Sygdom /5-Tha 1 assæmi

Mutant-k1 asse Type Reference 10 a) ikke-funktionelt mRNA Nonsense mutanter (1) codon 17 (A-Τ') 0 Chang JC et al.,Proc.

Nat 1.Acad.Sc i.USA 76:2886 (1979) 15 (2) codon 39 (C—T) 0 Trecartin RF et al., J.Cl i n.Invest. 68 : 1012 (1981) og Chehab, FF et a 1 . , 20 Lancet i: 3(1986) (3) codon 15 (C-A) 0 Kazazian HH et al.'

Eur.Molec. Biol.org.J.

3: 593 (1984) 25 (4) codon 37 (G—A) 0 Boehm. CD et al.,

Blood 67: 1185 (1986) (5) codon 121 (G—T) 0 Kazazian HH et al., 30 Ann.J.Hum.Genet. 38: A860 (1985)

Rammeskiftmutanter (6) - 2 codon 8 0 Orkin SH et al., J.

35 Biol.Cheni.256: 9782 (1981)

I DK 175527 B1 I

I 32 I

Mutant-klasse Type Reference I

I (7) - 1 codon 16 0 Kazazian HH et al., I

I Eur.molec.Biol.org. I

I 5 · J. 3: 593 (1984) I

(8) - i codon 44 O Kinniburgh. AJ et al I

I Nuclec Acids Res I

I 10: 5421 (1982) I

I I

I (9) - 1 codoner 8/9 O Kazazian HH et al, I

I Eur.molec.Biol.org. I

I J.3: 593 (1984) og I

Wong C et al, Proc. I

I 15 Nat 1. Acad. Sc i.USA I

I 83: 6529 (1986) I

I (10)-4codoner(41/42) O Kazazian, HH et al . I

Eur.molec.Biol.org. I

I 20 J 3:593 (1984) og I

I Kimura A, et al., J. I

I Biol.Che. 258: 2748 I

(1983) I

25 (11) - 1 codon 6 O Kazazian HH et al. I

Am . J.Hum . Genet. 35: I

1028 (1983) I 1

35 I

+ 1 codoner 71/72 O Cheng TC et al.,

30 Proc.Nat 1. Acad. Sc i . I

USA 81: 2821 (1984) I

33

Mutantklase Type Reference_ DK 175527 B1 (b) RNA-bearbejdningsmutanter Sammensplejsningssted-5 ændringer (1) IVS 1 position 1 GT-AT 0 Orkin, SH et al.

Nature 295:627 (1982) og Treisman R, et al. Nature 302:591 (1983) 10 (2) IVS 1 position 1 GT-TT 0 Kazazian, HH et al.

I Eur.molec.Biol.org.

I J.3: 593 (1984) I 15 (3) IVS 2 position 1 GT-AT O Orkin, SH et al., Na- I ture 296, 627 (1982) I og Treisman, R et al.

I Cel! 29: 903 (1982) I 20 (4) IVS 1 3'-ende:-17 bp O Bunn HF et al., Haemo- I _ globin: molecular ge- I net i c and clinical I aspects, s.283 (Saun- I ders, Philadelphia I 25 1986 ) I (5) IVS 1 3’-ende:-25 bp O Kazazian, HH et al., I Eur. molec.Bio1.org.J.

I 3: 593 (1984) og I 30 Orkin, SH et al. J.

I Biol.Chem. 258: 7249 I (1983) I (6) IVS 2 3'-ende: AG-CG O Padanilam BO, et al.

I 35 Am.J.Hematol 22:259 I (1986) I DK 175527 B1 I 34

Mutant-klasse Type Reference I

(7) IVS 2 3'-ende: AG-CG O Antonarakis SE, et al. I

Proc.Nat 1. Acad. Sc i. USA I

I 5 81:1154 (1984) og I

I Atweh GF et a 1. I

Nucleic Acids Res. 13: I

777 (1985) I

10 Consensus-forandri nger I

I (8) IVS 1 position 5 (G-C) + Kazazian, HH et al. I

Eur.molec.Biol.org. I

J. 3: 593 (1984) og I

I 15 Treisman, R et al. I

Nature 302:591 (1983) I

I (9) IVS 1 position (G-T) O Wong C et al., Proc. I

I Nat 1. Acad. Sc i.USA, 83: I

I 20 6529 ( 1986) og I

I Atweh, GF et al. I

Nucleic Acids Res. 13: I

I 777 (1985) I

I 25 (10) IVS 1 position 6 (T-C) + Orkin, SH et al. I

Nature 296:627 (1982) I

I og Atweh GF et al . , I

I Am.J.Hum.Genet 38: 85 I

1 (1986) I

I 30 Interne I VS-forandri nger I

I (11) IVS 1 position 110 (G-»A) + Westaway, D et al. I

I Nucleic Acids Res. 9; I

I 1777 (1981) I

I 35 I

I (12) IVS 2 position 705 (T-G) + Dobkin, C et al.,Proc. I

I Natl.Acad.Sci.USA 80: I

I 1184 (1983) I

35

Mutant-klasse Type Reference DK 175527 B1 (13) IVS 2 position 745 (C—G) + Orkin, SH et al., Na ture 296: 627 (1982) .5 og Treisman, R et al.

Nature 302: 591 (1983) (14) ivs 2 position 654 (C-T) 0 Cheng 7C et al., Proc.

Natl.Acad.Sci. USA

10 81: 2821 (1984) (15) IVS 1 position 116 (T-G) ? Feingold EA et al

Ann.N.Y. Acad.Sci.

445: 159 (1985) 15

Kodningsregionsubstitutioner (16) codon 26 (G - A) /3+,/3e Thein SL et al.

J.Med.Genet. (in 20 press 1986) og I „ Orkin SH et al. Natu- I re 300: 768 (1982) I (17) codon 24 (T - A) + Goldsmith et al. Proc.

I 2 S

Natl.Acad.Sci USA 88: I 2318 (1983) I codon 27 (G - T) 8+,øknossos Orkin SH et al.. Blood I 64:311 (1984) I 10 I >5 I DK 175527 B1

I 36 I

I Mutant-k 1 asse Type Reference I

(c) Transkripti onsmutanter I

I 5 (1) -88 C - T + Wong, C et al., Proc. I

I Nat!.Acad.Sci.USA 83: I

6529(1386) I

I Orkin SH et al. J. I

I Biol.Chem. 259: I

I 10 8679 (1984) I

I (2) -87 C - G + Orkin SH et al, Natu- I

I re 296: 627 (1982) og I

Treisman R et al., Na- I

I 15 ture 302: 591 (1983) I

I (3) -31 A - G + TakiharaYetal. I

I Blood 67:547 (1986) I

I 20 (4) -29 A - G + Antonarakis SE et al. I

I Proc.Nat 1. Acad.Sci. USA I

I 81: 1154 (1984) og I

I Wong C et al., Proc. I

I Natl.Acad.Sci.USA 83: I

I 25 6529 (1986) I

I (5) -28 A - C + Surrey S et al., J. I

I Bio!.Chem.260:6507 I

I (1985) 1

I 30 I

I (6) -28 A - G + Orkin SH et al. I

I Nucleic Acids Res. I

I 11: 4727 (1983) I

I 35 I

DK 175527 B1 I

Mutant-klasse Tvpe Reference H

(d) Polyadenyler i ngsmutant I

5 (1) AATAAA-AACAAA + Orkin SH et al., Eur. I

mo 1ec.Bi o 1.org.0. 4: I

453 (1985) I

(e) Deletioner I

10 I

(1) 3'p(-619 bp) 0 Spritz. RA et al. I

Nucleic Acids Res. I

10:8025 (1982) og I

Orkin, SH et al., Proc.

I Nat 1.Acad.Sci.USA

I 76: 2400 (1979) I (2) 5'8(-l,35kb) 0 HbF Padanilam. BJ et al.

I Blood 64: 941 (1984) I 20 I (3)./5 (- 10kb) 0 HbF Gilman. JG et al.

I Br.J.Haemat. 56: 339 I (1984) I 25 + = Ø-Thalassæmi-mutant (β-), som forårsager reduceret p-gΙοί b i nkædeprodukt i on: 0 = en mutant (Be), som forårsager mang- I lende β-g1 obinkædeprodukti on.

I Sygdom Mutation Reference I 30 I Triosephosphati some- AG - AC Daar 10 et al., Proc.

I rase-mangel Nat 1.Acad.Sci.USA 83: I 7903-7907 (1986) I 35 U r oporphy r i nogen GO * GA De Verneuil H. et al.

I decarboxylase-mangel Science 234:732-734 I (1986) I DK 175527 B1 I ' 38 B X-bundet

Sygdom Gen Mutation Reference

I 5 Hæmofili A Faktor-VIII CG - TG(24) Gitschier J. et al. I

Nature 315:427-430 I (1985) I CG - TG( 2 6 )

I CG - TG(18) Antonarakis SE et al. I

I 10 N.Engl.J.Med. 313: I

642-848 (1985) I

I CG - CA(26) Gitschier J. et al.« I

I Science 232: 1415- I

1418 (1986) I

I 15 CG -» TG{18) Youssoufian H. et al. I

Nature 324: 380-382 I

I (1986) I

I CG - TG(22) I

I .20 I

I Hæmofiji B Faktor IX CG - CA Bentley AK et al. I

Cell 45: 343-348 I

(1986) I

GT - TT Rees DJG et al . I

25 Nature 316: 643-645 I

(1985) I

CA - GG Davis LM et al.. Blood I

69:140-143 (1987) I

30 Eksempler på deletioner kan findes i: I

S. M. Forrest, G. C. Cross, A. Speer, D. Gardner-Medwin, J. I

Burn og K. E. Davies (1987), Preferential deletion of exons in I

Duchénne and Becker muscular dystrophies. Nature 320, I

35 638-640. I

M* Koenig, E. P. Hoffman, C. J, Bertselson, A. P. Monaco, C. I

Feener og L. M. Kunkel (1987), Complete cloning of the Duchen- I

39 DK 175527 B1 I ne muscular dystrophy (0M0) cDNA and preliminary genomic or- I ganisation of the DMD gene in normal and affected individu- I als. Cell 50, 509-517.

I 5 S. B. Malhotra, K. A. Hart, H. J. Klamut, N. S. T. Thomas, S.

I E. Bodrug, A. Η. M. Burghes, M. Bobrow, P. S. Harper, M.W.

I Thompson, P. N Ray og R. G. Morton (1988) Frame-shift dele- I tions in patients with Duchenne and Becker muscular dystrophy, I Science 242, 755-759.

I 10 I A. P. Read, R. C. Mountford, S. M. Forrest, S. J. Kenwrick, I K. E. Davies og R. Harris (1988), Patterns of exon deletions I in Duchenne and Becker muscular dystrophy. Hum. Genet. 80, I 152-156.

I 15 I 0. S. Chamberlain, R. A. Gibbs, J. E. Ranier, P. N. Nguyen og I C. T. Caskey (1988), Deletion screening of the DMD locus via I multiplex DNA amplification. Nuc, Ac. Res. 16: 23, I 11141-11156.

I 20 I R. G. .Roberts, C. G. Cole, K. A. Hart, M. Bobrow og D. R.

I Bentley (1989), Rapid carrier and prenatal diagnosis of Du- I chenne and Becker muscular dystrophy, Nuc. Ac. Res. 17: I 2,811.

I 25 I Ofte er kun små manger af genom-DNA tilgængelige for analyse.

Det har vist sig, at spec i ficiteten af diagnostiske pr i mere I for relevante normale eller afvigende nukleotidsekvenser I hensigtsmæssigt kan fastsættes, ved øgning af antallet af ko- 30 pier af nukleotidsekvensen eller nukleotidsekvenserne i hy- I bri di ser ingsbestemme1 sen. Dette kan f.eks. opnås ved kon- I struering af en dobbeltstrenget "kassette" omfattende en nor- I mal sekvens, der er sammensluttet til en afvigende sekvens, I idet umagetheden mellem to nukleotider på naboliggende stren- I 35 ge fortrinsvis er til stede mod kassettens midte. Kopier af I kassetten opnås derefter hensigtsmæssigt ved dens indføring i I en plasmidvært efterfulgt af repli kation af plasmi det og i so- I DK 175527 B1 I 40

H lering af de ønskede sekvenser, idet der i hele forløbet εη- I

I vendes teknikker, der er velkendte på området. Denne teknik I

er bekvemt illustreret på fig. 10. I

I 5 Ked henblik på at den foreliggende opfindelse skal forstås I

mere fuldstændigt er den beskrevet herefter ved hjælp af ek- I

sempler sammen med reference til den ledsagende tegning, I

I hvor I

10 fig. 1(a) og 1(b) viser den første udførelsesform af opfin- I

delsen, I

fig. 1(c) et typisk resultat af en sådan undersøgelse, som I

I kan vises elektroforetisk, I

I 15 I

I fig. 2(a) og 2(b) den anden udførelsesform af den foreliggen- I

de opfindelse, I

fig. 3 en foretrukket metode til at skelne imellem mangfoldige I

20 forstærkningsprodukter, I

fig. 4(a) og 4(b) den tredje udførelsesform af den forelig- I

I gende opfindelse, I

I 25 fig. 5(a), (b) og (c) den fjerde udførelsesform af den fore- I

I liggende opfindelse, I

I fig. 5 (som ikke er tegnet i fuld målestok) det humane ol- I

I antitrypsi ngen, og I

I 30 I

I fig. 7 resultatet af visualisering af den i eksempel l og 2 I

opnåede gel, I

fig. 8 resultatet af visualisering af en gel, hvori smalle I

35 streger 1-4 repræsenterer resultaterne fra eksempel 3, smalle I

streger 5-8 repræsenterer en andel af resultaterne fra eksem- I

pel 4, og smal streg 9 repræsenterer en størrelsesmarkør, I

41 i DK 175527 B1 fig. S resultaterne af visualisering af den i eksempel i opnåede gel , fig. 10 anvendelsen af et kassettepi asmidsystem til forstærk-5 ning af en ønsket DNA-duplex, fig. 11 den femte udførelsesform {lineær forstærkning) af opfindelsen, 10 fig. 12 resultaterne af visualisering af den i eksempel 5 opnåede gel, og fig. 13 resultaterne af visualisering af den i eksempel 6 opnåede gel .

15

Fig. 1 illustrerer fremgangsmåden ifølge den første udførelsesform af den foreliggende opfindelse. Fig. 1(a) viser denaturerede genom-DNA-strenge indeholdende et normalt nukleotid (N) i den position, hvor der f.eks. som et resultat af en 20 genetisk sygdom kan være et mistænkt, afvigende nukleotid til ! stede.. Ved under hybridi serende betingelser at bringe nukle-insyrestrengen i kontakt med en diagnostisk sonde med et 3'-terminalt nukleotid, som er komplementært til det normale I nukleotid (-N) i nærværelse af passende nukleosidtriphospha- i I 25 ter og et middel til polymerisation af nukleosidtriphosphater- I ne, fremkommer kædeforlængelse af den diagnostiske primer i I 3'-retningen som vist på fig. 1(b). En sådan kædeforlængelse I opstår ikke, når .der anvendes en diagnostisk primer, hvori det I 3’-terminale nukleotid er komplementært til det mistænkte, af- I 30 vigende nukleotid (-M). Et hvilket som helst kædeforlængelses- I produkt af den diagnostiske primer kan derefter denatureres, I og der kan opnås en. forstærkningspri mer (A), som er hybridise- I ret til det denaturerede produkt til dannelse af et yderligere I kædeforlængelsesprodukt. Kædeforlængelsesproduktet kan deref- I 35 ter denatureres, og processen kan gentages til opnåelse af I forstærkning. Genom DNA-regionen, som er genstand for for- I stænkning med den diagnostiske primer, betegnes DG på fig.

I DK 175527 B1 I 42

1(b). De diagnostiske produkter fra denne region er ansvarlige I

for de bånd, som betegnes DG på fig. 1(c). Som en kontrol kan I

der anvendes PCR (polymerasekædereaktion)-primere (P), som I

betegnes P på fig. 1(a), på et separat sted på nukleinsyre- I

5 strengen eller på en anden nukleinsyrestreng, f.eks. på et I

andet kromosom, der er i betragtning, f.eks. human DNA. Dette I

separate sted betegnes PCR på fig. 1(c), og PCR-kontrolpro- I

dukterne fra dette sted er ansvarlige for de bånd, som beteg- I

I nes PCR på fig. 1(c). Det skal forstås, at de bånd, der be- I

I 10 tegnes PCR, kan repræsentere enten større eller mindre pro- I

dukter end det produkt, som repræsenteres af det bånd, der I

betegnes DG. I

Fig. 1(c) viser resultatet af fremgangsmåden, der er vist på I

15 fig. 1(a) og 1(b) i form af bånd, der er opløst ved agarose- I

I gelelektroforese i henhold til f.eks. en genetisk sygdom, som I

I er forårsaget af en punktmutation, og som er analyseret under I

I anvendelse af enten den -H eller -N diagnostiske primer som I

hensigtsmæssigt. Når det undersøgte emne er en bærer (C) af I

20 den genetiske sygdom, vil der ses bånd i henhold til både de I

normale (N)-nuk1eotidsekvenser og den afvigende nukleotidse- I

kvens (M). Normale homozygoter (N) vil vise et bånd i henhold I

H til den normale nukleotidsekvens, men intet bånd [afbildet som I

I {)) til stede i henhold til det afvigende nukleotid, og homo- I

I 25 zygoter for den sygdomsfremkaldénde mutation (emner med den I

genetiske sygdom (D)) vil ikke vise noget bånd [afbildet som I

()] til stede i henhold til den normale nukleotidsekvens, men I

et bånd til stede i henhold til den afvigende nukleotidsek- I

vens. I

3 0 I

Fig. 2 illustrerer den anden udførelsesform af den forelig- I

gende opfindelse. Der anvendes en diagnostisk primer for hver I

streng af en dobbeltstrenget nukleinsyre. På fig. 2(a) er de I

diagnostiske primere udformet således, at det 3’-terminale I

35 nukleotid er komplementært til det normale nukleotid. Frem- I

gangsmåden skrider således fremad som beskrevet i henhold til I

fig. 1, men med to forskellige diagnostiske primere til at I

43 DK 175527 B1 begynde forstærkning, hvis dét relevante nukleotid er til stede. Den anden diagnostiske primer er således i denne udførelsesform ækvivalent til forstærkningsprimeren (A) på fig.

1. På fig. 2(a) vil forstærkning således begynde ved primer--5 ne (-N og N-), men ikke ved diagnostiske primere med 3'-ter-minale nukleotider, der er komplementære til den afvigende nukleotidsekvens {-M og M -). Det omvendte er tilfældet på fig. 2(b), eftersom den afvigende sekvens er til stede i prøvens nuklei nsyrestrenge. Resultaterne ved at gennemføre den 10 på fig. 2 viste fremgangsmåde kan repræsenteres på en måde svarende til den, der er vist på fig. 1(c), men referencerne deri til normal og afvigende (N og M) vil svare til par af sådanne sekvenser. På fig. 2 refererer bogstavet P til. de POR-primere, der anvendes som en kontrol.

15

Fig. 3 viser en måde, hvorpå mangfoldige forstærkningsprodukter kan skelnes fra hinanden, hvilket gør det muligt at undersøge en enkelt prøve af RNA eller DNA for en gruppe medfødte tilstande. To strenge (denaturerede) af DNA eller RNA 20 fra en prøve er afbildet indeholdende tre separate loci, der er nummereret 1, 2 og 3. En yderligere region, som er fjernet fra disse loci, anvendes til PCR-forstærkning til at tjene som en kontrol. Med hensyn til locus (1) anvendes en 20-mer diagnostisk primer (5'-N 3') sammen med en yderiigere 20-mer 25 (3 * N- 5 1 ) diagnostisk primer. Hvis’forstærkning finder sted ved locus (1) vil der opnås et 39-mer forstærkningsprodukt. Eftersom det 3'-terminale nukleotid på figuren er normalt ligesom det relevante nukleotid i testprøven vil forstærkning finde sted. Tilsvarende vil forstærkning finde sted, hvis det rele-30 vante nukleotid i testprøven er et afvigende nukleotid, og hvis de anvendte diagnostiske primere også bærer et 3'-termi-nalt afvigende nukleotid.

Der vil imidlertid ikke opstå en sådan forstærkning, når der 35 opstår en umagethed mellem det relevante nukleotid i prøven og det 3’-terminale nukleotid i den diagnostiske primer. Ved locus (2) er de diagnostiske primere udformet til at give et I DK 175527 B1

I 44 I

49-mer forstærkningsprodukt, hvis forstærkning finder sted, I

I og ved locus (3) er de diagnostiske primere udformet til at I

give et 59-mer forstærkningsprodukt, hvis forstærkning finder I

sted. Eftersom forstærkningsproduktbåndstørreisen er summen I

5 af størrelserne på de to diagnostiske primere minus 1, som det I

I kan ses af det ovenstående, er det muligt at udføre mangfol- I

dige undersøgelser på en enkelt prøve i et enkelt reaktions- I

I kar ved passende udformning af de individuelle diagnostiske I

I primere til karakterisering af hvert locus, der har interes- I

I 10 se. Efterhånden som størrelsen af summen af størrelserne af I

I de diagnostiske primere stiger, kan forstærkningsprodukter I

I opløses f.eks. på agarosege ler. Forbedret opløsning kan være I

I mulig, hvis de diagnostiske primere er mærkede eller markere- I

I de på en hvilken som helst konventionel måde og derefter I

I 15 opløst f.eks. på en acrylamidgel. På fig. 3 refererer bog- I

stavet P til de PCR-primere, der anvendes som en kontrol. I 1

Fig. 4 viser den tredje udførelsesform af den foreliggende I

I opfindelse, hvor konventionel forstærkning gennemføres af en I

I 20 nuk1ei nsyresekvens indeholdende et normalt nukleotid i den I

I positijon, hvor et mistænkt, afvigende nukleotid kunne være til I

stede, idet der f.eks. anvendes konventionelle PCR-primere. I

I Konventionel forstærkning ville ligeledes finde sted, hvis I

det mistænkte, afvigende nukleotid var til stede i stedet for I

25 det normale nukleotid. Forstærkningsproduktet bringes i kon- I

takt med en diagnostisk primer, som tidligere beskrevet heri, I

i forbindelse med den tredje udfcrelsesform af opfindelsen. I

Når det forstærkede produkt omfatter en nukleinsyresekvens, I

der indeholder et normalt nukleotid, som beskrevet ovenfor, I

30 og når den diagnostiske primer med et 3'-terminalt normalt I

nukleotid anvendes, vil der dannes et forlængelsesprodukt af I

diagnostisk primer [under anvendelse af nukleotidsekvensen, I

der er fremstillet ved hjælp af konventionel PCR-forstærk- I

ning, (refereret til heri som PCR-kontrolproduktet) som en I

35 skabelon] forudsat, at passende nukleosidtriphosphater og et I

middel til polymerisation af nukleosidtriphosphaterne er til I

stede. Det vil ikke være nødvendigt med nogen forstærknings- I

45 DK 175527 B1 primer, eftersom skabelonen til fremstilling af det diagnostiske primerforlængelsesprodukt allerede vil være forstærket. Tilstedeværelsen eller fraværet af det diagnostiske primer-for længel sesprodukt , som betegnes DG på fig. 4(b), såvel som 5 tilstedeværelsen af PCR-kontrolproduktet (betegnes PCR på fig. 4(b)) kan påvises f.eks. ved hjælp af elektroforesetek-nikker.

Det skal forstås, at et diagnostisk primerforlængelsesprodukt 10 også vil dannes, når PCR-kontrolproduktet indeholder et af vigende nukleotid, og den anvendte diagnostiske primer har et 3 ' - termina 11, komplementært, afvigende nukleotid.

De resulterende produktbånd kan visualiseres f.eks. som vist 15 på fig. 4(b). Symbolerne N-, M-, C-, N, D, DG og PCR er som defineret i forbindelse med fig. 1(c). Det diagnostiske pri-merextensionsproduktbånd har imidlertid en lavere molekylvægt end PCR-kontrolbåndet (som vist på fig. 4(b)). I dette tilfælde repræsenterer kontrolbåndet en sand indre kontrol, I

20 eftersom en af PCR-primerne tjener som forstærkningspri meren til forstærkning af det diagnostiske primerforlængelsesprodukt. Når PCR-kontrolproduktet indeholder et afvigende nukleotid, og den diagnostiske primer har et 3'-terminalt, normalt nukleotid og omvendt vil der ikke dannes noget forlængelses-25 produkt.

Den tredje udførelsesform af den foreliggende opfindelse kan om ønsket gennemføres ved i begyndelsen af undersøgelsen at bringe prøven, der skal undersøges, i kontakt med ikke kun • 30 PCR-primerne, men også med den diagnostiske primer. Det er således ikke nødvendigt at forsinke anvendelse af den diagnostiske primer, indtil der er opnået en ønsket grad af forstærkning af PCR-kontrolproduktet. Den diagnostiske primer , kan faktisk anvendes samtidig med eller på et hvilket som 35 helst tidspunkt, efter PCR-primerne er blevet anvendt. Under søgelsen kan derfor gennemføres f.eks. ved simpel tilsætning af prøven, der skal undersøges, til en enkelt beholder, hvil-

I DK 175527 B1 I

I 46 I

ken beholder omfatter PCR-primerne, den diagnostiske primer, I

passende nukleosidtriphosphater og et middel til polymerise- I

tion af nukleosidtriphosphaterne. De opnåede produkter og så- I

I ledes de produktbånd, der ses, vil være de samme, som er be- I

I 5 skrevet ovenfor og afbildet på fig. 4. I

Fig. 5 afbilder den fjerde udførelsesform af den foreliggen- I

I de opfindelse, hvor konventionel forstærkning gennemføres som I

I beskrevet i forbindelse med fig. 4. Det således opnåede for- I

I 10 stærkningsprodukt bringes derefter under hybridiserende be- I

I tingelser i kontakt med enten (a) to separate diagnostiske I

I primere som tidligere defineret heri hver med et 3'-termi- I

I nalt, normalt nukleotid, eller (b) to diagnostiske primere, I

I som tidligere defineret heri, hver med et 3'-terminalt, af- I

I 15 vigende nukleotid (se fig. 5a). Dannelsen af forlængelsespro- I

dukter efter en enkelt cyklus vil vise, hvorvidt prøvenukle- I

insyren indeholder det normale eller det mistænkte, afvigende I

I nukleotid, idet elektroforeseteknikker giver et båndmønster I

I svarende til det, der er vist på fig. 5b. Det skal imidler- I

I 20 tid forstås, at når der anvendes to diagnostiske primere, I

I tjener, den ene diagnostiske primer som forstærkningsprimer I

for den anden diagnostiske primer. Et hvilket som helst op- I

I nået forlængelsesprodukt eller hvilke som helst opnåede for- I

længe 1 sesprodukter kan derfor om ønsket selv underkastes for- I

25 stærkning. Således vil der efter adskillige yderligere cyk- I

lusser dannes lavere molekylvægtprodukter, såsom sådanne, der I

er vist ved det yderligere bånd på fig.. 5c, i forhold, der I

afhænger af de relative forhold mellem de oprindelige PCR- I

pr imeroligonukleoti der og de tilsatte diagnostiske primere. I

30 PCR-forstærkningsprodukterne kan let skelnes fra de diagno- I

stiske primerforlængelsesforstærkn i ngsprodukter ved f.eks. at I

øge eller mindske afstanden mellem bindingsstederne for PCR- I

primerne på genomet. I 1

Den fjerde udførelsesform af den foreliggende opfindelse kan I

om ønsket gennemføres ved i begyndelsen af undersøgelsen at I

bringe prøven, der skal undersøges, i kontakt med ikke kun I

DK 175527 Bl 47 I PCR-primerne, men også med de diagnostiske primere. Det er I således ikke nødvendigt at forsinke anvendelse af den diagno- I stiske primer, indtil der er opnået en ønsket grad af for- I stærkning af PCR-kontrolproduktet. De diagnostiske primere I 5 kan faktisk anvendes samtidig med eller på et hvilket som I helst tidspunkt efter, PCR-primerne er blevet anvendt. Under- I søgelsen kan derfor f.eks. gennemføres ved simpel tilsætning I af prøven, der skal undersøges, til en enkelt beholder, hvil- I ken beholder indeholder PCR-primerne, de diagnostiske pri- I 10 mere, passende nukleosidtriphosphater og et middel til poly- I merisat i on af nukleosidtriphosphaterne. Hvis undersøgelsen I gennemføres på denne måde, vil de diagnostiske produkter med I lavere molekylvægt, som der er refereret til ovenfor, dannes, I hvilket således giver anledning til de yderligere bånd, som I 15 er afbildet på fig. 5.

I Figur 6 (ikke i fuld målestok) afbilder det humane al-anti- I trypsingen, som er velkendt på området [Long G. L., et al I Biochemistry, bind 23, side 4828-4837, (1984)3, hvoraf blandt I 20 andet fremgår de relative positioner af exonerne III og V, I som henholdsvis bærer de eventuelle S- og Z-mutationer af I al-ant itrypsinprotei net. Figuren afbilder især exon III af I αΐ-antitrypsingenet og viser positionen for S-varianten, hvor I codonet GAA muteres til GTA resulterende i fremstilling af en I 25 valinrest ved aminosyre 264 i stedet for eh giutaminsyrerest.

I Der kan hensigtsmæssigt anvendes en primer I med sekvensen:

I 5' CCCACCTTCCCCTCTCTCCAGGCAAATGGG 3' I

I 3 0 I som hybridiserer til positioner 7440-7469 på al-antitrypsin- I . genet, og enten en primer II med sekvensen:

I 5' GGGCCTCAGTCCCAACATGGCTAAGAGGTG 3' II

I 35 I eller en primer Ila (en CT 3’-umagethed baseret på II) med I sekvensen:

I DK 175527 B1 I

I 48 I

I 5' CGGCCTCAGTCCCAACATGGCTAAGAGGTT 3' Ila I

5 som hver især er udformet til positioner 7770-7799 på I

αΐ-antitrypsingenet. I

I Figuren afbilder yderligere exon V af al-antitrypsi ngenet og I

I viser positionen af Z-varianten, hvor codonet GAG muteres til I

H 10 AAG resulterende i fremstillingen af en lysinrest ved amino- I

syreposition 342 i stedet for en giutaminsyrerest. Der kan I

hensigtsmæssigt anvendes en primer III med sekvensen: I

I 5' TGTCCACGTGAGCCTTGCTCGAGGCCTGGG 3' III I

15 I

I som hybridiserer til positioner 9590-9919 på αΐ-antitrypsin- I

genet, og en primer IV med sekvensen: I

20 I

5' GAGACTTGGTATTTTGTTCAATCATTAAG 3’ 17 I

som hybridiserer til positioner 10081-10109 på αΐ-antitryp- I

singenet. Basenummerer i ngen, som er detaljeret beskrevet I

25 ovenfor, er i overensstemmelse med Biochem., 23 4828-4837, I

1984. I

Figur 7 viser resultatet af visualisering af den i eksempel 1 I

og 2 opnåede gel. Streg 1 repræsenterer et plasmid indehol- I

30 dende exon V og spaltet med Alu l; streg 2 viser en størrel- I

sesmarkør, som er bakteriofag φ X174 DNA, som er spaltet med I

Hae III; streg 3 viser forstærkning af exon III med primer I I

. og II, som tidligere defineret heri, og forstærkning af exon I

V med primer III og IV, som tidligere defineret heri, i den I

35 samme reaktionsblanding til dannelse af produkter med hen- I

holdsvis 350 bp og 220 bp. Streg 4 viser, at ingen forstærkn- I

ing af exon III har fundet sted under anvendelse af primer I I

DK 175527 B1 I

og Ila, som tidligere defineret heri, men at forstærkning af I

exon V med primer III og IV, som tidligere defineret heri, I

har fundet sted. Streg 5 viser en negativ kontrol, i hvilken I

primer I, II, III og IV er til stede under betingelser, som I

5 er effektive til at fremme forstærkning, men i hvilken der I

ikke er noget genom DNA til stede. I

Figur 8 viser ved streg 1-3 resultaterne af eksempel 3, ved I

streg 5-8 resultaterne af at anvende normale og mutante diag- I

10 nostiske primere, hvor der ikke er blevet gennemført nogen

destabi1 i ser ing i overensstemmelse med eksempel 4, og streg 9 I

viser størrelsesmarkør-bakteriofag Φ X174. Streg 1 viser I

I resultatet af anvendelse af nukleotidsekvensen: I

I 15 5'TGGTGATGATATCGTGGGTGAGTTCATTTT V I

I som den diagnostiske primer og oligonukleotidet, som betegnes I

I I, og som tidligere er defineret heri, som forstærkningspri - I

I 20 meren. Det anvendte humane genom DNA var fra en normal homo- I

I zygot -med et normalt nukleotid (A) til stede ved det even- I

I tuelle S-mutationspunkt på det humane αΐ-antitrypsingen. Det I forventede 267 bp-forstærkningsprodukt er klart synligt.

I Streg 2 viser resultatet af anvendelse af nukleotidsekvensen: I 25

I 5 'TGGTGATGATATCGTGGGTGAGTTCA2TTA VI

I 30 som den diagnostiske primer og oligonukleotidet, som betegnes I I, og som tidligere er defineret heri, som forstærkningspri - I meren. Det anvendte humane genom DNA var fra en normal homo- I zygot med et normalt nukleotid (A) til stede ved det even-

I tuelle S-mutati onspunkt på det humane αΐ-antitrypsi ngen. I

I 35 nærværelsen af en A-A-umagethed dannes der ikke noget 267 I bp-forstærkningsprodukt. Streg 3 viser et kontrolbånd, som er I baseret på det humane apol ipoprote in B-gen, idet de anvendte I sekvenser er I DK 175527 B1 Η

H AATCAATTTATCAGCCAAAACTTTTACACG XIII

og

CTCTGGGAGCACAGTACGAAAAACCAC7T XIV

Streg A henstår blank.

Streg 5 viser resultatet af anvendelse af nukleotidsekvensen:

I 15 5’CCGTGCATAAGGCTGTG CTGACCATCGACG 3’ VII

I som en diagnostisk primer i eksempel 4. Den diagnostiske primer bærer det 3'-terminale nukleotid (G), som er i stand H til at danne basepar med et normalt nukleotid (C) ved det ?0 eventuelle 2-mutati onspunkt, og er ellers fuldstændigt kom- plemen-tært til DNA-prøven. Den anvendte DNA-prøve var fra en I normal homozygot med et normalt nukleotid (C) til stede ved det mulige 2-mutationspunkt på det humane al-antitrypsingen.

I * Streg 6 viser resultatet af anvendelse af nuk 1 eotidsekvensen : ^5

I 5'CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACA 3 * VIII

I som en diagnostisk primer i eksempel 4. Den diagnostiske I primer bærer det 3'-terminale nukleotid (A), som er i stand I til at danne basepar med et mutant nukleotid (T) ved 2- mutationspunktet, men er ellers fuldstændig komplementært til DNA-prøven. Den anvendte DNA-prøve var fra en normal homozy- got med et normalt nukleotid (C) til stede ved det eventuelle I 3 $ Z-mutationspunkt på det humane al-antitrypsingen. Streg 7 viser resultatet af anvendelse af nuk1eotidsekvensen med I formlen (VII) som en diagnostisk primer i eksempel 4. Den an-

DK 175527 B1 I

vendte DNA-prøve var fra en homozygot, som var angrebet med I

den humane αΐ-antitrypsin-genetiske sygdom, og som havde et I

mutant nukleotid (T) ved Z-mutationspunktet. Streg 8 viser I

resultatet af anvendelse af nukleotidsekvensen med formlen I

5 VIII som en diagnostisk primer i eksempel 4. Den avendnte I

DNA-prøve var fra en homozygot, som var angrebet med den hu-

mane αΐ-antitrypsi n-genetiske sygdom, og som havde et mutant I

nukleotid (T) ved Z-mutationspunktet. Nukle.ot idsekvensen for I

forstærkningsprimeren, som blev anvendt i hver af undersegel- 10 serne, og som er vist ved stregerne 5-8, har formlen IV, som tidligere defineret heri. Det kan ses, at fremstilling af et 150 bp-forstærkningsprodukt ikke fuldt ud undertrykkes · ved tilstedeværelsen af en A-C-umagethed (streg 6) og endnu mindre undertrykkes ved tilstedeværelsen af en GT-umagethed 15 (streg 7).

Figur 9 viser resultatet af visualisering af den i eksempel 4 opnåede gel. Streg 1 og 14 viser størrelsesmarkør-bakterio-fag X174-DNA, som er spaltet med Hae III; streg 2 viser re-20 sultatet af anvendelse af nukleotidsekvensen:

I 5' CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATAGACG 3' IX

I 25 som en diagnostisk primer i nærværelsen af prøve-DNA roed et I normalt nukleotid (C) til stede ved det eventuelle Z-mutati- I onspunkt på det humane αΐ-antitrypsingen (prøve-DNA fra en I normal homozygot). Den diagnostiske primer bærer en bevidst I forandring (understreget i sekvensen IX - A i stedet for C) I 30 med hensyn til det femte nukleotid fra 3'-terminuset, men et I 3'-terminalt nukleotid (G), der er i stand til at danne base- I par med et normalt nukleotid (C) til stede ved det eventuelle I Z-mutati onspunkt. Streg 3 viser resultatet af anvendelse af I nukleotidsekvensen: I 35

I 5’CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATAGACA 3’ X

I DK 175527 B1 I 52 H som en diagnostisk primer i nærværelsen af prøve-DNA med et normalt nukleotid (C) til stede ved det eventuelle Z-mutati- onspunkt (prøve-DNA fra en normal homozygot). Den diagnosti- H 5 ske primer bærer en bevidst forandring (understreget i sek- vens X - A i stedet for C) med hensyn til det femte nukleo- tid fra 3’-terminus og et 3'-terminalt nukleotid (A), som er i stand til at danne basepar med et mutant nukleotid (T), hvis det er til stede; ved det eventuelle Z-mutationspunkt; 10 streg 4 viser resultatet af anvendelse af nukleotidsekvensen IX (som tidligere defineret heri) som en diagnostisk primer i nærværelse af prøve-DNA fra en heterozygot for Z-mutationen og således en bærer af den humane al-antitrypsinmangél-gene- tiske sygdom; streg 5 viser resultatet af anvendelse nukleo- 15 tidsekvensen X (som tidligere defineret heri) som en diagno- stisk primer i nærværelse af prøve-ONA fra en heterozygot for Z-mutationen og således en bærer af den humane al-antitryp- I sinmangel-genetiske sygdom. Streg 6 viser resultatet af H anvendelse af nukleotidsekvensen IX (som tidligere defineret H 20 heri) som en diagnostisk primer i nærværelse af prøve-DNA fra en homozygot, som er angrebet med den humane αΐ-antitrypsin- -genetiske sygdom, streg 7 viser resultatet af anvendelse af I nukleotidsekvensen X (som tidligere defineret heri) som en I diagnostisk primer i nærværelsen af prøve-DNA fra en homozy- I 25 got, som er angrebet med den humane al-antitrypsin-genetiske I sygdom.

I Streg 8 viser resultatet af anvendelse af nukleotidsekvensen: 30 - 5’CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGCCG 3’ XI 1 som en diagnostisk primer i nærværelse af prøve-DNA med et I normalt nukleotid (C) til stede ved det eventuelle Z-muta- 35 tionspunkt på det humane αΐ-antitrypsingen (prøve-DNA fra en normal homozygot). Den diagnostiske primer bærer en bevidst forandring (understreget i sekvensen XI - C i stedet for A)

DK 175527 B1 I

med hensyn til det tredie nukleotid fra 3'-terminus, men et I

31-terminalt (G), som er i stand til at danne basepar med et

normalt nukleotid (C) til stede ved det eventuelle Z-mutati- I

onspunkt; streg 9 viser resultatet af anvendelse af nukleo- I

5 tidsekvensen:

5' CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGCCA 3' XII

10 som en diagnostisk primer i nærværelse af prøve-DNA med et normalt nukleotid (C) til stede ved det eventuelle Z-muta-tionspunkt (prøve-DNA fra en normal homozygot). Den diagno-I stiske primer bærer en bevidst forandring (understreget i I sekvens XII - C i stedet for A) med hensyn til det tredie I 15 nukleotid fra 3’-terminus og et 3’-terminalt nukleotid (A)# I som er i stand til at danne basepar med et mutant nukleotid I (T), hvis det er til stede, ved det eventuelle Z-mutations- I punkt; streg 10 viser resultatet af anvendelse af nukleotid- I sekvensen XI (som tidligere defineret heri) som en diagno- I 20 stisk primer i nærværelse af prøve-DNA fra en heterozygot for I Z-mutationen og således en bærer af den humane al-antitryp- I s i nmangel-genet i ske sygdom; streg 11 viser resultatet af I anvendelse af nukleotidsekvensen aXII (som tidligere defi- I neret heri) som en diagnostisk primer i nærværelse af I 25 prøve-DNA fra en heterozygot for Z-mutationen og således en I bærer af den humane αΐ-antitrypsin-genetiske sygdom. Streg 12 I viser resultatet af anvendelse af nukleotidsekvensen XI (som I tidligere defineret.her i) som en diagnostisk primer i nærvæ- I relse af prøve-DNA fra en homozygot, som er angrebet med den I 30 humane αΐ-antitrypsi nmangel-genet i ske sygdom. Streg 13 viser I resultatet af anvendelse af nukleotidsekvensen XII (som tid- I ligere defineret heri) som en diagnostisk primer i nærværelse I af prøve-DNA fra en homozygot, som er angrebet med den humane I αΐ-antitrypsi n-genet i ske sygdom.

I 35 I I hver af stregerne 2-13 blev nukleotidsekvensen med formlen I IV anvendt som forstærkningsprimeren, og nukleotidsekvenserne I DK 175527 B1 I 54 H med formel XIII:

AATGAATTTATCAGCCAAAACTTTTACAGG XIII

5 og formel XIV: H .. accactt xiv blev anvendt som en kontrol. De bånd, der svarer til kon- H 10 trollen, er markeret (C) på figuren 9 og svarer til et 510 bp-forstærkningsprodukt fra exon 26 i det humane apolipo- H protein B-gen.

Figur 10 illustrerer anvendelsen af et kassetteplasmidsystem.

15 Plasmidet pAT 153 med regioner, der bibringer antibiotikumre- sistens overfor ampicillin (Apr) og tetracyklin (Tcr) såvel som med restriktionsstederne ecoRI, BamHI og Sall fordøjes med EcoRI og BamHI. Den syntetiske kassette, som omfatter en I DNA-duplex sammen med et umage nukleotid (i centrum), hvilket 20 skyldes tilstedeværelsen af både en normal og afvigende se- I kvens, ligeres under anvendelse af T4 DNA-ligase ind i plas- I midværten som vist. Plasmidet replikeres derefter og udvælges

I som vist. I

25 Systemet illustreres mere detaljeret som følger: syntetiske DNA-kassetter fremstilledes, som hver omfattede to sammen- I sluttede 65-merer med EcoRI- og BamHI-restriktionstermini, og idet midterbaseparret er umage på grund af et afvigende nu- kleotid. Disse kassetter indførtes i pAT153-plasmidværter, I 30 som beskrevet ovenfor, og efter transformation isoleredes I tetracyklinfølsomme kloner, og plasmid ekstraheredes. Plas- midekstrakterne blev derefter anvendt i en anden transformation til tilvejebringelse af kloner med enten normale eller afvigende indsættelser. For at eftervise at klonerne inde-35 holdt den fuldstændige normale eller mutante sekvens, blev 2 pg af hver sekvensbestemt efter NaOH-denaturering og under anvendelse af T4 DNA-polymerase (Sequenase, US Biochemicals) 55 DK 175527 B1 og 32p-endemærket primer. Når mindst én normal og én variant af hver type var blevet fundet, blev en repræsentativ klon af hver dyrket i store mængder, hvorefter plasmidet ekstrahere-des og oprensedes under anvendelse af en CsCl-gradient. Kas-5 setterne blev derefter fordøjet med Sall, ekstraheret med pheno1/ch1oroform, præcipiteret og vasket med 70% ethanol. Kassetterne var derefter parate til at blive anvendt, f.eks. i polymerasekædereakti oner, til fastlæggelse af følsomheden og specificiteten af de forskellige oligonukleoti der.

10

Figur 11 viser den femte udførelsesform (lineær forstærkning) af opfindelsen. På figur 11 a) vises en normal genom DNA-se-kvens sammen med to diagnostiske primere, hvoraf den ene er komplementær ved dens 3*-terminal til den normale genom DNA-15 sekvens, og den anden primer har et nukleotid, som er komplementært til det mistænkte, afvigende nukleotid ved dets 3'-terminal. På figur 11 b) vises en afvigende, genom ONA-se-kvens sammen med de samme to diagnostiske primere. Når hver genom DNA-sekvens bringes i kontakt med primerne under betin-20 gelser, som muliggør komplementær hybridisering, vil hybridi-sering finde sted i begge tilfælde. Tilsætning af alle fire nukleosidtriphosphater under betingelser, som muliggør pri-merdoelængelse, vil kun føre til et forlænget produkt i tilfældet af a) den normale sekvens-pr i mer og b) den afvigende 25 sekvénsprimer, idet forlængelse af den anden primer forhindres ved umagetheden. Som vist på figur 11 c), hvor der kun er tilsat tre eller færre passende nukleosidtriphosphater i stedet for fire, forhindres forlængelse af den pågældende primer endvidere ved et givet punkt på grund af mangelen på 30 det passende nukleosidphosphat eller de passende nukleosidtri phosphater.

Figur 12 viser resultaterne visualisering af den i eksempel 5 opnåede gel.

Streg 1 og 2 svarer til DNA for en normal homozygot (MM) , streg 3 og 4 til DNA for en heterozygot(MS) og streg 5 og 6 35 I DK 175527 B1

I 56 I

til DNA for en afvigende homozygot(SS). Med hensyn til stre- I

gerne 1, 3 og 5 var der anvendt oligonukleotid XXII (normal), I

og med til hensyn til stregerne 2, 4 og 6 var der anvendt I

oligonukleotid XXI (afvigende). Som forudset fandt der ikke I

5 oligonukleotidforlængelse sted i forbindelse med stregerne 2 I

eller 5. De påviste produkbånd er angivet ved hjælp af I

vinkler. I

Figur 13 viser resultateterne af visualisering af den i ek- I

10 sempel 6 opnåede gel. I

H Stregen yderst til venstre viser anvendte størrelsesmarkører I

til at fastslå de opnåede produkters størrelser. Streg 1 og 2 I

svarer til DNA fra en normal homozygot{MM), streg 3 og 4 til I

15 DNA fra en heterozygot(MZ) og streg 5 og 6 til DNA fra en af- I

vigende homozygot(ZZ). Med hensyn til stregerne 1, 3 og 5 I

blev primerne XIX og XI anvendt; for stregerne 2, 4 og 6 blev I

H primerne XII og XX anvendt. Som forventet fandt primerforlæn- I

gelse ikke sted i forbindelse med stregerne 2 og 5. De påvi- I

20 ste produktbånd er angivet ved hjælp af vinkler. I

Sekvens for α-1-antitrypsin S-locus (exon III), I

I Baserne, som er vist med små bogstaver, afbilder den normale I

I 25 sekvens for hvert locus. Understregede baser i primerne viser I

I den bevidste umagethed, der er indført til destabi1isering af I

primerne. Koordinaterne er som foreskrevet af Long et al I

(1984) Bi ochemi stry 23:4828-4837. I

I 3 0 5’ GCCTGATGAGGGGAAA.CTACAGCACCTGGT XXI I

I 5' GCCTGATGAGGGGAAACTACAGCACCTGGA XXII I

I 5' CTTCCTGCCTGATGAGGGGAAACTACAGCACCTGGa I

I 3» GAAGGACGGACTACTCCCCTTTGATGTCGTGGACCt I

I 35 1 I

I 7642 I

DK 175527 B1 I

7718

aAAATGAACTCACCCACGATATCATCACCAAGTTCCTGGAAA 3’ I

tTTTACTTGAGTGGGTGCTATAGTAGTGGTTCAAGGACCTTT 5' I

TTTTACTTGAGTGGGTG CTATAGTAGTGGT 5' XXIII I

ATTTACTTGAGTGGGTGCTATAGTAGTGGT 5' XXIV I

10 I

CACACCTCTTAGGCATGTTGGGACTGAGGCCCATCAGGACTGGC 3' GTGTGGAGAATCGGTACAACCCTGACTCCGGGTAGTCCTGACCG 5' I 7811 I 15 GTGGAGAATCGGTACAACCCTGACTCCGGG 5' I TTGGAGAATCGGTACAACCCTGACTCCGGG 5' I 20 I Sekvens for α-1-antitrypsin Z locus (exon V).

I Baserne, som er vist med små bogstaver, afbilder den normale I 25 sekvens for hvert locus. Understregede baser i primerne viser I den bevidste umagethed, der er indført til destab i 1 i ser ing af I primerne.

I 5' CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCCTCGACA XVI

I 5· CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCCTCGACG XV

I 5’ CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATAGACA X

I 5' CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATAGACG IX

I 5' CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGCCA XII

I 5* CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGCCG XI

I 35 5' CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACA VIII

I 5' CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACG VII

DK 175527 B1 I 58

5' TCCAGGCCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACg I

3' AGGTCCGGCACGTATTCCGACACGACTGGTAGCTGc I

I I

I 9954 I

I

10030 . I

I I

I gAGAAAGGGACTGAAGCTGCTGGGGCCATGTTTTTAGAGGCC 3'. I

10 cTCTTTCCCTGACTTCGACGACCCCGGTACAAAAATCTCCGG 5’ I

CTCTTTCCCTGACTTCGACGACCCCGGTAC 5’ XVII I

TTCTTTCCCTGACTTCGACGACCCCGGTAC 5' XVIII I

15 CTCATTCCCTGACTTCGACGACCCCGGTAC 5' XIX I

I TTCATTCCCTGACTTCGACGACCCCGGTAC 5' XX I

Opfindelsen illustreres, men begrænses ikke af de følgende I

I 20 eksempler. Medmindre andet er angivet, er de anvendte mate- I

I rialer i eksemplerne angivet i de følgende mængder eller kon- I

centrationer: I

Substrat-DNA: 1 pg human genom ONA I

25 01 igonukleoti der: 100 pmol af hvert pågældende o 1 igonuk1eotid I

Deoxynukleosidtriphosphater: hver ved en siutkoncentration på I

1,5 «Μ, I

Buffer (slutkoncentrationer i reaktionsblanding): I

30 67 mM Tris (pH 8,8 med HC1) I

16,6 mM ammoniumsulfat I

6.7 mM magnesiumchlor id I

10 mM β-mercaptoethano1 I

6.7 μΜ EDTA I

35 I

Belastningsbuffer: I

35 % "Ficoll 70" - (Ficoll 70 er en syntetisk po- I

, 59 DK 175527 B1 lymer, som er fremstillet ved copolymer isation af saccharose og ephich1 orhydrin, hvilken copolymer har en middelmolekyl.vægt på ca. 70.000 - produkt fra Pharmacia) 5 200 mM trisacetat 100 mM natriumacetat

5 mM EDTA

0,2 % bromphenolblåt.

10 Størrelsesmarkører: Bakteriofag φ X174-DNA, som er spaltet med Hae III, størrelse på bånd i basepar er: 1353, 1078, 872, 503, 310, 281, 271, 234, 194, 118 og 72.

Eksempel l 15 1 pg genom DNA, 100 pmol af hvert af ol igonukleotiderne I, II, III og IV, som tidligere defineret heri, 1,5 mM (slut-koncentration) af hvert af de fire deoxynukleosidtriphospha-ter og buffer i de ovenfor anførte siutkoncentrationer blev 20 blandet i et 1,5 ml skruelågs-mikrocentrifuge-rør, og volu menet indstilledes til 100 μΐ med sterilt, destilleret vand. Røret blev forseglet og anbragt i et kogende vandbad i 5 minutter. Reaktionen indledtes ved tilsætning af 1 μΐ Taq-polymerase indeholdende 1 enzymenhed (Anglian Biotech batch 3 25 fortyndet til 1 enhed/μΐ .med den ovenfor nævnte buffer).

Røret inkuberedes ved 58 "C i 4 minutter og derefter ved 91°C i 2 minutter. 58 eC/91 eC-opvarmnings/afkø 1 ings-ku ren fort sattes i 5 yderligere cyklusser, på hvilket tidspunkt 1 yderligere enzymenhed (som ovenfor) blev tilsat. 58 °C/91*C-op-30 varmnings/afkøl ings-kuren fortsattes derefter i yderligere 6 cyklusser efterfulgt af tilsætningen af 1 yderligere enzymenhed (som ovenfor). Den ovenfor nævnte opvarmnings/afkølings-kur fortsattes i yderligere 6 cyklusser erterfulgt af tilsætning af 1 yderligere enzymenhed (som ovenfor), derefter 35 i endnu 5 cyklusser efterfulgt af tilsætningen af 1 yderligere enzymenhed (som ovenfor) og derefter i yderligere 2 cyklusser efterfulgt af tilsætningen af 1 yderligere enzymen-

I DK 175527 B1 I

I 60 I

hed (som ovenfor). Denne kur efterfulgtes derefter af inku- I

I bering ved 58eC i 20 minutter. I

Påvisning af forstærkningsprodukterne gennemførtes ved at I

5 kombinere 15 μΊ fra reaktionsblandingen med en separat 5 μΐ I

gel belastningsbuffer efterfulgt af elektroforese på en aga- I

I rosegel (3% "NuSieve") indeholdende ethidiumbromid (2 pg/ml). I

B Elektroforese udførtes over for størrelsesmarkerer for at I

B fastslå forstærkningsprodukternes korrekte størrelser. Gelen I

I 10 visualiseredes på en transreflektor (300 nm bølgelængde) og I

I et poloraoidfotografi . Streg 3 på figuren 7 viser resultatet I

af denne visualisering. Således viser streg 3 forstærkning af I

exon III med primer I og II, som tidligere defineret heri, I

B til dannelse af et 360 bp-produkt og forstærkning af exon V I

B 15 med primer III og IV, som tidligere defineret heri, til dan- I

B nelse af et 220 bp-produkt. I

B Eksempel 2 I

B 20 Eksempel 1 blev gentaget, men primeren II blev erstattet med I

B primeren Ila, som tidligere defineret heri. Figuren 7, streg I

B 4, viser resultatet af visualisering af den i dette eksempel I

B opnåede gel. Det kan ses, at der ikke har fundet nogen for- I

B stærkning af exon III sted under anvendelse af primerne I og I

B 25 Ila, som tidligere defineret heri, men at forstærkning af I

B exon V med primerne III og IV, som tidligere defineret heri, I

B har fundet sted til dannelse af det samme 220 bp-produkt som I

B i eksempel 1. I

B 30 Eksempel 2 viser således, at en umagethed ved 3'-enden i en I

B ol igonukleotidprimer forhindrer eller i det mindste i det væ- I

B sentlige inhiberer initieringen af polymeraseaktivitet. I

I Eksempel 3 I

I 35 I

S-allel i human α-1-antitrypsin I

61 DK 175527 B1 1 pg human genom DNA, 100 pmol af hvert af oligonukleotider-ne, som er beskrevet detaljeret nedenfor, 1,5 mM (slutkoncen-trat i on) af hvert af de fire deoxynukleosidtriphosphater og buffer i de ovenfor anførte s 1 utkoncentrati oner blev blandet 5 i et 1,5 ml skruelågs-mikrocentrifuge-rør, og volumenet indstilledes til 100 μΐ med sterilt, destilleret vand. Røret blev forseglet og anbragt i et kogende vandbad i 5 minutter.. Reaktionen indledtes ved tilsætning af 1 μΐ Taq-polymerase indeholdende 1 enzymenhed (Anglian Biotech batch 3 fortyndet I 10 til 1 enhed/μΐ med den ovenfor nævnte buffer). Røret inku- I beredes ved 58°C i 4 minutter og derefter ved 91eC i 2 minut- I ter. 58°C/91eC-opvarmnings/afkølings-kuren fortsattes i 5 I yderligere cyklusser, på hvilket tidspunkt 1 yderligere enzy- I menhed (som ovenfor) blev tilsat. 58°C/91°C-opvarmnings/af- I 15 kølings-kuren fortsattes derefter i yderligere 6 cyklusser I efterfulgt af tilsætningen af 1 yderligere enzymenhed (som I ovenfor). Den ovenfor nævnte opvarmnings/afkø 1 ings-kur fort- I sattes i yderligere 6 cyklusser erterfulgt af tilsætningen af I yderligere 1 enzymenhed (som ovenfor), derefter i endnu 5 I 20 cyklusser efterfulgt af tilsætningen af 1 yderligere enzym- I enhed (som ovenfor) og derefter i yderligere 2 cyklusser I efterfulgt af tilsætningen af 1 yderligere enzymenhed (som I ovenfor). Denne kur efterfulgtes derefter af inkubering ved I 58°C i 20 minutter.

I 25 I De følgende undersøgelser udførtes på basis af den ovenfor I nævnte protokol: I a) de anvendte oligonukleotider var: I ' 30

I 5'TGGTGATGATATCGTGGGTGAGTTCATTTT V

I og det o 1 igonuk 1 eotid, som betegnes I, og som tidligere er I 35 defineret heri. Det anvendte humane genom DNA var fra en nor- I mal homozygot, som ikke var angrebet af den humane al-anti- I trypsi n-genet i ske sygdom; og I DK 175527 B1 I 62

H b) de anvendte oligonukleotider var: I

TCGTGATGATATCGTGGGTGAGTTCATTTA VI

H 5 og det oligonukleotid, som betegnes I, og som tidligere er defineret her i. Det anvendte humane genom DNA var fra en nor* mal homozygot, som ikke var angrebet med den humane al-anti- trypsin-genetiskesygdom.

10 Påvisning af forstærkningsprodukterne gennemførtes ved at I

kombinere 15 μΐ fra reaktionsblandingen med en separat 5 μΐ I

gel belastn ingsbuffer efterfulgt af elektroforese på en agaro- I

segel (3% "NuSieve") indeholdende ethidiumbromid (2 pg/ml). I

Elektroforese udførtes over for størrelsesmarkører (streg 9 I

15 på figuren 8) for at fastslå forstærkningsprodukternes kor- I

rekte størrelser. Gelen visualiseredes på en transreflektor I

H (300 nm bølgelængde), og der blev taget et poloraoidfotogra- I

fi. Stregerne 1 og 2 på figuren 8 viser resultatet af denne I

visualisering. Således viser streg 1, at forstærkning sker i I

I 20 de tilfælde, hvor nukleotidsekvensen med formlen V anvendes , I

hvilken sekvens har et 3'-terminalt nukleotid, som er komple- I

mentært til det tilsvarende nukleotid ved det eventuelle S- I

I mutationspunkt i den anvendte prøve-DNA, og et 267 bp-for- I

I stærkningsprodukt dannes. Streg 2 viser imidlertid, at der |

25 ikke finder nogen forstærkning sted i de tilfælde, hvor der I

opstår en umagethed ved 3'-terminus i den diagnostiske pri- I

I mer, idet den anvendte diagnostiske primer har nukleotidet I

(A) ved dens 3’-terminus, hvilket er umage til nukleotidet I

(A) i det eventuelle S-mutationspunkt i en DNA-prøve fra en I

I 30 normal homozygot. I

I Eksempel 4 I

I Z-allel

I 35 I

I 1 μ g genom DNA, 100 pmol af hvert af de nedenfor beskrevne I

I oligonukleotider, 1,5 mM (s 1utkoncentrati on) af hvert af de I

DK 175527 B1 I

63 I

fire deoxynuc1eosidtriphosphater og buffer i de ovenfor an- I

førte slutkoncentrationer blev blandet i et 1,5 ml skruelågs- I

mi krocent ri fuge-rør , og volumenet indstilledes til 100 μΐ med I

sterilt, destilleret vand. Røret blev forseglet og anbragt i I

5 et kogende vandbad i 5 minutter. Reaktionen indledtes ved I

tilsætning af 1 μ 1 Taq-polymerase indeholdende 0,5 enzymenhe- I

der (Anglian Biotech batch 9 fortyndet til 0,5 enheder/μΐ med I

den ovenfor nævnte buffer). Røret inkuberedes ved 60°C i 4 I

minutter og derefter ved 91 °C i 2 minutter. 60°C/91eC-op- I

10 varmn ings/afkøl ings-kuren fortsattes i 5 yderligere cyklus- I

ser, på hvilket tidspunkt der ti Isattes 0,5 yderligere enzym- I

enheder (som ovenfor). 50°C/9leC-opvarmnings/afkøl ings-kuren I

fortsattes derefter i yderligere 6 cyklusser efterfulgt af I

tilsætningen af 0,5 yderligere enzymenheder (som ovenfor). I

I 15 Opvarmnings/afkølings-kuren ovenfor fortsattes i yderligere 6 I

I cyklusser erterfulgt af tilsætningen af yderligere 0,5 enzym- I

enheder (som ovenfor), derefter i endnu 5 cyklusser efter- I

I fulgt af tilsætningen af 0,5 yderligere enzymenheder (som I

I ovenfor) og derefter i yderligere 3 cyklusser efterfulgt af I

I 20 tilsætningen af yderligere 0,5 enzymenheder (som ovenfor). I

Denne kur efterfulgtes derefter af inkubering ved 60eC i 20 I

minutter. I

I De følgende undersøgelser blev gennemført på basis af den I

I 25 ovenævnte protokol: I

I a) de anvendte oligonukleoti der var IX og IV, som tidligere I

I er defineret heri, og det anvendte humane genom DNA var fra I en normal homozygot, som ikke var angrebet med den humane I 30 αΐ-antitrypsi n-genet i ske sygdom; b) de anvendte oligonukleotider var X og IV, som tidligere er defineret heri, og det anvendte humane genom DNA var fra en I normal homozygot, som ikke var angrebet med den humane al-an- 35 titrypsi n-genet i ske sygdom; I c) de anvendte ol igonukleotider var IX og IV, som tidligere I er derfineret heri, og det anvendte humane genom DNA var en I DK 175527 B1 I 64 H heterozygot for human αΐ-antitrypsin-Z-allel;

d) de anvendte oligonukleotider var X og IV, som tidligere er I

defineret heri, og det anvendte humane genom ONA var fra en I

5 heterozygot for human al-antitrypsin-Z-allel; I

e) de anvendte oligonukleotider var IX og IV, som tidligere I

er defineret heri, og det anvendte humane genom DNA var fra I

en homozygot (ZZ), som var angrebet med αΐ-antitrypsin-syg- I

10 dommen; I

I f) de anvendte oligonukleotider var X og IV, som tidligere er I

defineret heri, og det anvendte humane genom ONA var fra en I

homozygot (ZZ), som var angrebet med αΐ-antitrypsin-sygdom- I

15 men; I

g) de anvendte oligonukleotider var XI og IV, som tidligere I

defineret heri, og det anvendte humane genom ONA var fra en I

normal homozygot, som ikke var angrebet med den humane al-an- I

I 20 titrypsin-genetiske sygdom; I

h) de anvendte oligonukleotider var XII og IV, som tidligere I

I er defineret heri, og det anvendte humane genom DNA var fra I

H en normal homozygot, som ikke var angrebet med den humane I

25 al-antitrypsi n-genet i ske sygdom; I

I i ) de anvendte oligonukleotider var XI og IV, som tidligere I

I er defineret heri, og det anvendte humane genom DNA var fra I

en heterozygot for human al-antitrypsin-Z-allel; 1

I 30 I

I j) de anvendte ol igonukleotider var XII og IV, som tidligere I

I er defineret heri, og det anvendte humane genom DNA var fra I

I en heterozygot for human al-antitrypsin-Z-allel; I

I 35 k) de anvendte oligonukleotider var XI og IV, som tidligere I

I er defineret heri, og det anvendte humane genom ONA var fra I

I en homozygot (ZZ), som var angrebet med αΐ-antitrypsin-syg- I

I dommen; I

65 DK 175527 B1 1) de anvendte oligonukleotider var XII og IV, som tidligere er defineret heri, og det anvendte humane genom ONA var fra en homozygot (ZZ), som var angrebet med al-antitrypsin-syg-dommen.

5 I hver undersøgelse anvendtes nukleotidsekvenserne med formlerne XIII og XIV som en forstærkningskontrol.

Påvisning af forstærkningsprodukterne gennemførtes ved kom-10 binering af 15 μΐ fra reaktionsblandingen med en separat 5 μΐ gel belastningsbuffer efterfulgt af elektroforese på en 1,4% agarosegel indeholdende ethidiumbromid (0,5 pg/ml). Elektroforese udførtes over for størrelsesmarkører (som tidligere defineret heri), for at fastslå forstærkningsprodukternes I 15 korrekte størrelser. Gelen visualiseredes på en transreflek- I tor (300 nm bølgelængde), og der blev taget et polaroid- I fotografi. Stregerne 2-13 fra figuren 9 viser resultatet af I denne visualisering, idet stregerne 1 og 14 repræsenterer I størrelsesmarkørernes bånd. Således viser stregerne 2-7, at I 20 destabi1 i ser ing af den diagnostiske primer ved ændring af det I femte nukleotid fra 3'-terminus ikke er fuldt ud effektivt I til af gøre primeren i stand til at skelne mellem en normal I og en mutant DNA-prøve under disse reaktionsbetingelser.

I Stregerne 8-13 viser imidlertid at ændring af det tredie nu- I 25 kleotid fra 3'-terminus i den diagnostiske primer er effek- I tiv til at gøre primeren i stand til at skelne mellem en nor- I mal og en mutant DNA-prøve og kan således være diagnostisk I " for normale homozygoter, heterozygoter (bærere) eller ZZ- I homozygoter, som er angrebet af human al-antitrypsin-sygdom.

I 30 I De ovenstående forsøg i dette eksempel er også blevet gennem- I ført under anvendelse af en diagnostisk primer, hvor der ikke I er blevet foretaget nogen yderligere destabi1iserende nukleo- I tidforandringer, og hvor det syvende nukleotid fra 3'-termi- I 35 nus er blevet ændret (A til C) til at bevirke destabilise- I ring. I hvert tilfælde var den diagnostiske primer ikke fuldt I ud effektiv til at skelne mellem en normal og en mutant DNA- I DK 175527 B1 I 66

prøve, hvilken kendsgerning er illustreret på figuren 8, hvor I

stregerne 5-8 med hensyn til den diagnostiske primer ikke har I

nogen yderligere destabi1iserende nukleotidforandringer. I

I 5 Eksempel 5 I

I 01igonukleotiderne XXII (normal) og XXI (afvigende) blev an- I

vendt som primere. I dette eksempel vil dNTP-blandingen af A, I

G og T give en primer forlænget med 7 baser på skabelonen, I

10 før C-nukleotidtriphosphatet kræves. Tm for disse oligonucle- I

I otider var beregnet til at være 94 “C under anvendelse af I

formlen Tm = 4(G + C) og 2(A + T), men dette menes kun at være I

relevant for oligonuc1eoti der op til 23-merer, og således I

blev 75 eC valgt som det foretrukne. I

I 15 I

01 i gonukl eot i derne (8 pmol af hver) blev mærket ved den 5’- I

terminale hydroxy 1 gruppe under anvendelse af d32P ATP I

I (Amersham 2pCi) og T4-polynukleotidkinase (4 enheder) i et 80 I

I μ 1 reaktionsvolumen indeholdende 5 mM tris.Cl pH-værdi 7,6, I

20 lOmM MgCl2, 5 mM DTT, 100 μΜ spermidin og 100 μΜ EDTA. Kina- I

H sereaktionen gennemførtes ved 37“C i 20 minutter, hvorefter I

de mærkede oligonukleotider blev kontrolleret ved elektrofo- I

I rese på en 15% polyacrylamid-denaturerende gel/8M urinstof I

I (præ-kørsel l time, 500V, hoved-kørsel 4 timer 800V). I

I 25 I

Der blev anvendt to plasmider, hvor den ene indeholdt den I

normale sekvens (MM) for S-locuset på exon III i det humane I

αΐ-antitrypsingen, og den anden indeholdt den afvigende sek- I

vens svarende til den afvigende homozygot (SS). Der blev sat |

30 seks rør op, 2 af hver mulige DNA-type. 1 fmol af det pågæl- I

dende plasmid blev anvendt til homozygoterne, men heterozy- I

goten blev simuleret ved anvendelse af 0,5 fmol af begge I

plasm iderne. I hvert rør blev dannet et 200-gange overskud af I

mærket o 1 igonuk1eotid ved tilsætning af 200 fmol (2 μΐ af den I

35 mærkede opløsning) af enten det normale (XXII) eller afvi- I

gende (XXI) ol igonukleotid til hver DNA-type. Hver.t rør inde- · I

holdt 3 dNTPerne A, G og T (Pharmacia) til en s 1 utkoncentra- I

67 DK 175527 B1 tion på 5 mM af hver i et reakt ionsvoluroen på 20 μΐ indeholdende 6,7 mM EDTA, 6,7 mM MgCl2, 67 mM Tris HC1 pH 8,8, 10 mm mercaptoethano 1 og 16 mM ammoniumsulfat. Reakt ionsvo1 Urnerne blev tredoblet, dvs. der anvendtes 60 μΐ i hvert tilfælde for 5 at mindske fordampningseffekterne. Rørene blev kogt i 5 mi nutter og derefter holdt på is, før der til hvert rør tilsattes 3 enheder Taq-polymerase (Cetus 1 i 5 fortynding med 1,5 mM MgCl2, 50 mM KC1, 10 mM Tris pH 8,3 og 0,01 % gelatine til at give 1 enhed/μΐ ) . Disse rør blev centrifugeret ved 10 13.000 o/m i 2 minutter, og der blev sat en 2 μΐ prøve til 5 μΐ formamid/bromphenolblåt-farvestof. Rørene blev derefter hensat ved 75 *C i et vandbad. Efter 4 timer fjernedes rørene, centrifugeredes i 1 minut ved 13.000 o/m, hvorefter der blev udtaget en anden 2μ1 prøve og sat til 5μ1 farvestof.

15 Rørene blev derefter igen hensat i vandbad ved 75 eC, Efter 6 timer fjernedes rørene igen, og yderligere 3 enheder Taq-polymerase blev sat til hvert rør, der centrifugeredes i 1 minut ved 13.000 o/m, og en dråbe af let mineralolie (Sigma) blev tilsat for at mindske fordampning, men der blev ikke .20 fjernet noget prøve. Rørene blev derefter hensat ved 75eC

natten over. Efter 24 timer, beregnet på slutningen af den indledende centrifugering, blev rørene fjernet fra vandbadet, centrifugeret i 1 minut, og de endelige 2 μΐ prøver sat til 5 μΐ farvestof. Alle prøverne blev elektroforesebehand1 et ved 25 en præ-kørsel (1 time 500V) på 15% denaturerende-polyacryl- amidgel/8M urinstof i 1 x TBE buffer (0,089 M Tris borat, 0,089 borsyre, 0,002M EDTA) i fem en halv time ved 880V. Gelerne blev derefter autoradiograferet natten over ved stuetemperatur uden nogen skærm på langsom fotografisk film. Re-30 sultaterne er vist på figuren 12.

Stregerne 1 og 2 svarer til DNA for en normal homozygot(MM), stregerne 3 og 4 til DNA for en heterozygot(MS) og stregerne 5 og 6 til DNA for en afvigende homozygot(SS). Med hensyn til 35 stregerne 2, 3 og 5 blev oligonukleotid XXII (normal) anvendt, og med hensyn til stregerne 2, 4 og 6 blev oligonukleotid XXI (afvigende anvendt. Som forudset fandt der ikke nogen oligo- I DK 175527 B1 68

nukleotidexforlængelse sted i forbindelse med stregerne 2 el- I

ler 5. De påviste produktbånd er angivet ved vinkler. I

Eksempel 6 I

I I

1 ng kassetteplasmid DNA, 100 pmol af hver af oligonukleotid- I

primerne, I

TTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAA og · TATGCGACTCCCTGCATTAGGAGCAGCCCA, I

I 10 I

B 1,5 mM (slutkoncentration) af hvert af de fire deoxynukleo- I

B sidtriphsophater og buffer i de ovenfor angivne slutkoncen- I

B trationer blev blandet i et 1,5 ml skruelågs-mikrocentrifuge- I

B rør, og volumenet blev indstillet til 100 μΐ med sterilt, I

B 15 deioniseret vand (Milli-Q). Røret blev forseglet og anbragt i I

B et kogende vandbad i 5 minutter. Reaktionen blev indledt ved I

B tilsætning af 2 enheder Taq-polymerase (Cetus), og blandingen I

B forsegledes med let mineralolie (Sigma) til forhindring af I

B fordampning. Røret blev inkuberet ved 60“C i 4 minutter ef- I

B 20 terfulgt af 90*0 i 2 minutter. Denne procedure blev gentaget I

B til et total på 30 cyklusser. I

B 50 μΐ af reaktionsblandingen blev derefter fjernet, og 60 I

B pmol af enten primerne XIX og XI (normal) eller primerne XII I

B 25 og XX (afvigende) blev sat dertil. 1 enhed Taq-polymerase I

B (Cetus) blev derefter tilsat til igangsætning af yderligerre I

B reaktion. Blandingen blev inkuberet ved 92*0 i 2 minutter I

fl efterfulgt af 60*C i 4 minutter. Denne procedure blev gen- I

B taget til et total på 4 cyklusser. Påvisning af forstærkning- I

B 30 sprodukterne blev gennemført ved kombinering af 10 μΐ prøver I

B fra reaktionsblandingen med en gelbelastnings-"buffer" efter- I

B fulgt af elektroforese på en 3% agarosegel ("Nu Sieve", FMC I

B Bioproducts) indeholdende 0,5 pg/ml ethidiumbromid. Gelen I

B visualiseredes på en transreflektor (300 nm bølgelængde og I

B 35 et polaroidfotografi blev taget. Resultaterne er vist på fi- I

B guren 13. Stregen yderst til venstre viser anvendte størrel- I

B sesmarkører til at fastslå de opnåede produkters størrelser. I

DK 175527 B1 69

Stregerne 1 og 2 svarer til DNA fra en normal homozygot(MM), stregerne 3 og 4 til DMA fra en heterozygot(MZ) og stregerne 5 og 6 til DNA fra en afvigende homozygot(ZZ). Med hensyn til stregern 1,3 og 5 blev primerne XIX og XI anvendt; for stre-5 gerne 2, 4 og 6 blev primerne XII og XX anvendt. Som forventet fandt primerforlængelse ikke sted med hensyn til stregerne 2 eller 5. De påviste produktbånd er angivet ved hjælp af vinkler.

10 15 20 25 1 35

Claims

1. Fremgangsmåde til påvisning af tilstedeværelsen eller fra- I I 5 været af mindst et afvigende nukleotid i en eller flere nu- I kleinsyrer, som er indeholdt i en prøve, kendeteg- I net ved, at den omfatter, at man: I H behandler prøven under ét eller i rækkefølge med passende nu- I kleosidtriphosphater, et middel til polymerisation af nukleo- I I 10 sidtriphosphaterne og en diagnostisk primer for en diagnos- I I tisk andel af en målbasesekvens, idet nukleotidsekvensen i I I den diagnostiske primer er således, at den i alt væsentligt I er komplementær til den diagnostiske andel, idet et terminalt I nukleotid i den diagnostiske primer enten er komplementært I 15 til det mistænkte, afvigende nukleotid eller til det tilsva- I rende normale nukleotid, hvorved der syntetiseres et forlæn- I gelsesprodukt af den diagnostiske primer, når det terminale I nukleotid i den diagnostiske primer er komplementært til det I tilsvarende nukleotid i mål basesekvensen, idet der ikke syn- I 20 tetiseres noget forlængelsesprodukt, når det terminale nukle- I otid i den diagnostiske primer ikke er komplementært til det I tilsvarende nukleotid i må 1 basesekvensen; og påviser tiiste- I deværelsen eller fraværet af det mistænkte, afvigende nukleo- I tid ud fra tilstedeværelsen eller fraværet af et forlængel- I 25 sesprodukt. I

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, I I at den omfater, at man: I I 1) under hybridiserende betingelser behandler prøven under ét I I 30 eller i rækkefølge med passende nukleosidtriphosphater, et I I middel til polymerisation af nukleosidtriphosphaterne, en I diagnostisk primer for en diagnostisk andel af en målbasesek- I I vens og en tilsvarende forstærkningsprimer, idet nukleotid- I I sekvensen i den diagnostiske primer er således, at den i alt I I 35 væsentligt er komplementær til den diagnostiske andel, idet I I et terminalt nukleotid i den diagnostiske primer enten er I I komplementært til det mistænkte, afvigende nukleotid eller I 7] DK 175527 B1 til det tilsvarende normale nukleotid, hvorved der syntetiseres et forlængelsesprodukt af den diagnostiske primer, når det terminale nukleotid i den diagnostiske primer er komplementært til det tilsvarende nukleotid i mål basesekvensen, 5 idet der ikke syntetiseres noget forlængelsesprodukt, når det terminale nukleotid i den diagnostiske primer ikke er komplementært til det tilsvarende nukleotid i mål basesekvensen; idet et hvilket som helst dannet forlængelsesprodukt af den diagnostiske primer er i stand til at tjene som en skabelon 10 for syntese af et forlængelsesprodukt af forstærkningsprimer-en efter separation fra dets komplement; 2. behandler prøven under denaturerende betingelser for at separere primerforlængelsesprodukt fra dets skabelon, når et sådant forlængelsesprodukt dannes; 15 3) bringer de i trin (2) fremstillede enkeltstrenge enten un der ét eller i rækkefølge i kontakt med passende nukleosid-triphosphater, et middel til polymerisation af nukleosidtri -phosphaterne, en diagnostisk primer og en f orstærkningspr.imer som heri defineret, til, hvor det er muligt, at syntetisere 20 yderligere forlængelsesprodukter under anvendelse af de i trin (2) fremstillede enkeltstrenge som skabeloner; 4. gentager trinnene (2) og (3) et tilstrækkeligt antal gange til at resultere i påviselig forstærkning af den pågældende nuk1eotidsekvens; og 25 5) påviser tilstedeværelsen eller fraværet af det mistænkte, afvigende nukleotid ud fra tilstedeværelsen eller fraværet af et i trin (4) opnået forstærkningsprodukt.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, k e nde tegnet ved, 30 at den omfatter, at man behandler prøven under ét eller i rækkefølge med enten (a) en første diagnostisk primer med en sekvens, i alt væsentligt er komplementær til en diagnostisk andel af en første nukleinsyresekvens, hvilken første diagnostiske primer 35 har et terminalt nukleotid, som er komplementært til det mistænke, afvigende nukleotid, og en anden diagnostisk primer med en sekvens som i alt væsentligt er komplementær til en I 72 DK 175527 B1 H diagnostisk andel af en anden nukleinsyresekvens, hvilken anden diagnostiske primer har et terminalt nukleotid, som er komplementært til det komplementære, mistænkte, afvigende nu- kleotid; eller 5 (b) en første diagnostisk primer med en sekvens, som i alt væsentligt er komplementær til en diagnostisk andel af en I første nukleinsyresekvens, hvilken første diagnostiske primer I I har et terminalt nukleotid, som er komplementært til det nor- I male nukleotid, der svarer til det mistænkte, afvigende nu- I H 10 kleotid, og en anden diagnostisk primer med en sekvens, som i I H alt væsentligt er komplementær til en diagnostisk andel af en I anden nukleinsyresekvens, hvilken anden diagnostiske primer I har et terminalt nukleotid, som er komplementært til det nor- I male nukleotid, der svarer til det mistænkte, afvigende nu- I I 15 kleotid; I idet det terminale nukleotid i den første diagnostiske pri- I mer og det terminale nukleotid i den anden diagnostiske pri- I mer enten begge er ved 5'-enden eller begge er ved 3'-enden I hos de respektive primere, og idet den første nukleinsyre- I 20 sekvens er i den modsatte sense i forhold til den anden nu- I k1ei nsyresekvens. I

4. Fremgangsmåde ifølge krav i, kendetegnet ved, I I at den omfatter, at man først forstærker mindst en del af I 25 prøvenukleinsyren, som indeholder det mistænkte, afvigende I I nukleotid, og anvender det således opnåede forstærkningspro- I dukt som den prøve, der skal behandles. I

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, I I 30 at den omfatter, at man først forstærker mindst en del af I I prøvenukleinsyren, som indeholder det mistænkte, afvigende I nukleotid, og anvender det således opnåede forstærkningspro- I dukt som den prøve, der skal behandles. I I 35

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, I I at den yderligere omfatter, at man gentager prøvenukleinsyre- I I behandlingen mindst én gang, hvorved der opnås lineær for- I ^ DK 175527 B1 stærkn ing af et forlængelsesprodukt under anvendelse åf den samme må 1basésekvens som skabelon.

7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at det terminale nukleotid i den diagnostiske primer, hvilket nukleotid enten er komplementært til det mistænkte, afvigende nukleotid eller til det tilsvarend normale nukleotid, er ved 3'-enden i den diagnostiske primer. 10

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at prøven behandles med 1, 2 eller 3 nukleosidtriphosphater, hvorved et forlængelsesprodukt, som skal dannes, kun forlænges så langt som tilstedeværelsen af kun 1, 2 eller 3 nukleosidtriphosphater 15 vil muliggøre.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, k e n d e t e g n e t ved, at prøven behandles med tre nukleosidtriphosphater. 20