HUT52565A - Process and diagnostical set for detecting of nucleotid sections - Google Patents
Process and diagnostical set for detecting of nucleotid sections Download PDFInfo
- Publication number
- HUT52565A HUT52565A HU891126A HU112689A HUT52565A HU T52565 A HUT52565 A HU T52565A HU 891126 A HU891126 A HU 891126A HU 112689 A HU112689 A HU 112689A HU T52565 A HUT52565 A HU T52565A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- nucleotide
- diagnostic
- primer
- sequence
- terminal
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 280
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 272
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 93
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 53
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 129
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 79
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 49
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 45
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 42
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 37
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 35
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 34
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 29
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 29
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 claims description 29
- -1 nucleotide lipid Chemical group 0.000 claims description 26
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 24
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 24
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 23
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 20
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 19
- 101710081722 Antitrypsin Proteins 0.000 claims description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 15
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 claims description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 12
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000001475 anti-trypsic effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 11
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 11
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 11
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 7
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 7
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 claims description 5
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 claims description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 claims description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 claims description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 3
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 claims description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 2
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 claims description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims 3
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 claims 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims 2
- XUHRVZXFBWDCFB-QRTDKPMLSA-N (3R)-4-[[(3S,6S,9S,12R,15S,18R,21R,24R,27R,28R)-12-(3-amino-3-oxopropyl)-6-[(2S)-butan-2-yl]-3-(2-carboxyethyl)-18-(hydroxymethyl)-28-methyl-9,15,21,24-tetrakis(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20,23,26-nonaoxo-1-oxa-4,7,10,13,16,19,22,25-octazacyclooctacos-27-yl]amino]-3-[[(2R)-2-[[(3S)-3-hydroxydecanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CCCCCCC[C@H](O)CC(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]1[C@@H](C)OC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CO)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC1=O)[C@@H](C)CC XUHRVZXFBWDCFB-QRTDKPMLSA-N 0.000 claims 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims 1
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 claims 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 claims 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims 1
- 241000245665 Taraxacum Species 0.000 claims 1
- 235000005187 Taraxacum officinale ssp. officinale Nutrition 0.000 claims 1
- 102000008068 Tensins Human genes 0.000 claims 1
- 108010088950 Tensins Proteins 0.000 claims 1
- YQNQNVDNTFHQSW-UHFFFAOYSA-N acetic acid [2-[[(5-nitro-2-thiazolyl)amino]-oxomethyl]phenyl] ester Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(=O)NC1=NC=C([N+]([O-])=O)S1 YQNQNVDNTFHQSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000009858 acid secretion Effects 0.000 claims 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000011166 aliquoting Methods 0.000 claims 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 claims 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 claims 1
- 230000003205 diastolic effect Effects 0.000 claims 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 claims 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims 1
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 claims 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims 1
- 229940059904 light mineral oil Drugs 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 230000002981 neuropathic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 claims 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 claims 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims 1
- 238000005496 tempering Methods 0.000 claims 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 claims 1
- 238000009941 weaving Methods 0.000 claims 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 14
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 12
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 5
- 239000012985 polymerization agent Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 4
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 3
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 3
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 2
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 2
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000020763 muscle atrophy Effects 0.000 description 2
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 2-bromophenol Chemical class OC1=CC=CC=C1Br VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 241001658044 Beata Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXRFDZFCGOPDTD-UHFFFAOYSA-M Cetrimide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C CXRFDZFCGOPDTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100272852 Clostridium botulinum (strain Langeland / NCTC 10281 / Type F) F gene Proteins 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 102100031785 Endothelial transcription factor GATA-2 Human genes 0.000 description 1
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N EtOH Substances CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000182067 Fraxinus ornus Species 0.000 description 1
- 235000002917 Fraxinus ornus Nutrition 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001066265 Homo sapiens Endothelial transcription factor GATA-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010023644 Lacrimation increased Diseases 0.000 description 1
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 244000024873 Mentha crispa Species 0.000 description 1
- 235000014749 Mentha crispa Nutrition 0.000 description 1
- 241000877378 Mogera wogura Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001290308 Thalassoma Species 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000609666 Tuber aestivum Species 0.000 description 1
- PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N UTP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 241001516476 Vanda Species 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000003113 alkalizing effect Effects 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- KRALOLGXHLZTCW-UHFFFAOYSA-L calcium;2-acetyloxybenzoate Chemical compound [Ca+2].CC(=O)OC1=CC=CC=C1C([O-])=O.CC(=O)OC1=CC=CC=C1C([O-])=O KRALOLGXHLZTCW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 101150015424 dmd gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 1
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 230000004317 lacrimation Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000003534 oscillatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 229940088336 primor Drugs 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 108700042226 ras Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 108010040614 terminase Proteins 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- AXVOAMVQOCBPQT-UHFFFAOYSA-N triphos Chemical compound C=1C=CC=CC=1P(C=1C=CC=CC=1)CCP(C=1C=CC=CC=1)CCP(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 AXVOAMVQOCBPQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 229950010342 uridine triphosphate Drugs 0.000 description 1
- PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N uridine-triphosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Communication Cables (AREA)
- Suspension Of Electric Lines Or Cables (AREA)
- Nonwoven Fabrics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
PÉLDÁNY Λ
IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES PLC
52565“’
158/777 £j
LJÁfi/ÍS ÉS DIAGNOSZTIKAI KÉSZLET NUKLEOTID SZEKVENCIÁK DETEKTÁIÁSARA
A bejelentés napja: .1989· 03· 08.
Elsőbbségei:'1988. 03. 10, / ö8 85692 / GB és
1988. 86. 15. / 86 14178.8 / GB
Kivonat
A bejelentés olyan eljárásra, valamint olyan diagnosztikai készletre vonat Rozik, amelyekkel ineg lehet határozni egy vagy több nukleinsavat tartalmazó mintában legalább egy variáns-nukleotid jelenletét vagy hiányát.
A mintát megfelelő nukleozid-trifoszfátokkal, a nukleozid-trifoszfátok polimerizálására alkalmas szerrel és a célbázis-szekvencia. egy diagnosztikai szakaszához való diagnosztikai primerrel kezelik hibridizációs körúlraények Között. Az említett diagnosztikai primer nukleotid szekvenciája gyakorlatjíilag komplementere az említett szakasznak. A diagnosztikai primer egyik terminális nuKleotidja komplementere akár -akár a feltételezett variáns-nukleotidnak, akár a megfelelő normál nukleotidnak. A diagnosztikai primer extenziós terméke keletkezik abbah az esetben, ha a diagnosztikai primer említett terminális nukleoticíja komplementere a célbázis-szekvenciában levő megfelelő' nukleotidnak. A feltételezett variáns-nukleotid jelenlétére vagy hiányára valamely extenziós termék jelenlétéből vagy hiányából lehet következtetni.
KC. TÉTELI PÉLDÁNY z
Képviselői <i
BUDAPESTI 14. SZ. ÜGYVÉDI MUNKAKÖZÖSSÉG ί>Μς c tZú 4/f P
52565-7
Br.Tóth-Urbán László és Dr.Jalsovszky Györgyné Ügyvédek
158/777
ELJÁRÁj LS DIAGNOSZTIKAI KÉSZLET NUKLbOTID SZEKVENCIÁK DETEKTÁLÁSÁRA
IMPERIAL CHEMICAL INDUSTKIES j?LC, London, Nagy-Britannla
Feltalálóki
NEWTON ellve Róbert, Aincham/hortwiah, Cheshire,
MARKHAM Alexander Ered, Goostrey/Crewe, Cheshlre,
Nagy-Britannia
A bejelentés napjai 1989.03« 08.
Elsőbbségei: 1986. 03· 10. (88 03692) Nagy-Britannia
1988. 06. 15. (88 14170.0) Nagy-Britannla találmányunk egy vagy több különböző nukleotidszekvencia jelenlétének vagy hiányénak a kimutatására szolgáló lánohozzssabbitásos eljárásra, valamint aa annak az eljárásnak a megvalósításához szükséges diagnosztikai készletre vonatkozik·
Találmányunk különös érdeklődésre tarthat számot a DM3— minták diagnosztikai ssürővizsgálata területén as örökletes állapotokkal, hajlamokkal vagy a szomatikus mutációkkal össsefüggésben és - többek között * általánosan használható módszerként alkalmazható a pontsait áoiók egyszerű kimutatására· Jól használható a találmányunk szerinti eljárás fertőző kórokozók kimutatására és besorolására is, a kórokozók DBS-e vagy RMS-e alapján·
Tudomásunk szerint több száz olyan genetikai betegség fordul elő embereknél, amelyeket a DKS szintjén bekövetkező, sajátságos mutáoiók okosnak· Szék közül néhánynak már ismerjük a molekuláris magyarázatát· A folyamatosan végzett kutatások hamarosan tisztázzák a molekuláris összefüggéseket azoknál a genetikai betegségeknél is, amelyeknél a mutáció jellege jelenleg nem ismeretes* Ha nem ismerjük pontosan az örökletes állapot molekuláris okait, a rendellenesség diagnózisát vagy a hordozók lelőhelyét megismerhetjük as információs családfa-analisis eredményeiből· A családfa-analislst a beteg lokussssal genetikai kapcsolatban levő DKS-minták RHJ> /restriction fragment length polymorphism/ módszerrel végzett elemzésével hajtjuk végre· így jelenleg - többek között - a Duchenne izomsorvadást, a cisztás fibrósist és a Huntington vi tus táncot lehet diagnosztizálni as HfHt-elj ár ászai· Székét a vizsgálatokat azonban külön-külön keU elvégezni as egyes állapotokra vonatkozóan, és ez sok munkát igényel· Egyebek között minden egyes • ·
- ívesekben tisztitani kell a DBS-t, végre kell hajtani a restrito· dós enzimes digerálást, as agaró· gélelaktroforézisét, a Scuthern-ssáritást, a hibridizálást, a hibridisált génminta asonoslkását és a családiaelemsést·
Vnnak olyan örökletes állapotok is» amelyek - ismereteink szerint - a génekben egy ponton végbemenő mutációkkal vannak össszefüggésben· Ezeket as állapotokat asonban külön-külön kell vizsgálni és további különleges nehézségek merülnek fel abban as esetben, ha a pontontáoiók heterogének» így például több mint 40 különböző pontmutádó idézhet elő béta*thalagsaemiát és legalább öt · vulóssinüleg asonban még 12-nél is több - pontmutádó válthat ki haemophilia A-t. Esőkre a bonyolult körülményökre való tekintettel minden egyes pontmutádót külön vizsgálat tárgyává kell tenni· A vizsgálatot komplex BlXB-genomdemséssel lehet végrehajtani, több kulcshelyen hasítani képes restrikciós enslaoto» kel·
Kimutatták, hogy a szomatikus sejtekben végbemenő ssámos pontmutáció sserepet játesik különböső rákbetegségek kifejlődésében! például ilyenek a ras onkogénben végbemenő pontmutációk / ί·Ι>· Boos és munkatársai» kature 327» 29J JWtfU /* !
A üetus Qarporation a 87J02196.8. as· európai szabadalmi bejelentésben - amelynek a közzétételi ssána. 257,^62 - eljárást ismertet» amellyel ki lehat mutatni egy vagy több nukleinsavat tartalmasé mintákban legalább egy nukleotid-variáns jelenlétét vagy hiányát a szekvenciákban· Ez as eljárás a következő műveletekből áll:
a/ a mintát együttesen vagy egymást követően négy különböső nukleotid-trifossfáttal, a nukleodd-trif oszf átok polimerizál^· * 4 * sára alkalmas szerrel és agy, as említett variánst hlbrldisálási körülmények kösött feltehetőleg tartalmasé minden egyes nukle* insavesálhos megfelelő oligonukleotld primőrrel keseUk olyan módon, hegy a meghatárosai kívánt minden egyes különböző variánst tartalmasé minden egyes nukleinsavasálhos aslntetisálják minden egyes primer minden egyes extenslóe termékét, amelyek kiegészítik as egyes nnklelnsavasálakat ι as említett prímért vagy primerekot úgy válasstják ki, hogy as/ok/ gyakorlatilag kiegészítsék as egyes különböző variánsokat tartalmasé egyes nukleinsavssálakat, hogy as egyik prlmsrból ssintetisált oxtenzióa termék · ha elválasszák komplementerjétői - templátként ásol·gálhaeson a másik primer axtensiós termékének a asintetisálásdhősi h/ a mintát denaturáló körülmények között tartják, hogy elkülönítsék a primer extensiés terméke kot a templátjaiktól, ha jelen vannak a kimutatni kívánt variánsoki c/ a mintát együttesen vagy egymást követőiig as említett négy nokleotid-trifossfúttal, a nukleotid-trifosáfátok palimé* risálására alkalmas szerről és ollgoanklootid primorekkol kese* Hk olyan módon, hogy a b/ művelet során templátként előállított minden egyes egyedi szál felhaasnálásával primer extensiés terméket szintetizálnak! a b/ és as a/ műveleteket annyiszor Ismétlik meg, hogy éaslelhető legyen a szokvonciavarláns/oka/t tartalmasé nukleinsav lineáris lánonövekedése, amennyiben jelen van ilyen nukleinsavi d/ a 0/ művelettel előállított terméket rögsitik egy membránon!
e/ a membránt hibridlsálé körülmények kösött kezelik egy * 5* olyan jelzett· szekvonole^speoifikua oligonukleotld mintával, amely csak abban as esetiben képes hibridizálódnl a meghoo*» ssabbltott nnkleinsav-saekvenoiácval, ha a minta egyik szekvenciája a meghosszabbított szekvenciának egy régiójában a komplementere; és f/ megvizsgálják, hogy a minta hibridlzálódott-e a nuklelnsav ninta agy lineárisan meghosszabbodott szekvenciájára·
Kéhány különleges esetben eltérő megoldásokkal lehat detektálni, hogy jelen van-e, illetve hiány zito-e legalább egy nukleotld variáns· így ásókban a esokatlan esetekben, amelyekben a pontmutáoió létrehoz vagy lerombél egy hasítási helyet / például sarlósejtes vérszegénység esetén /· a restrikciós enzimes dlgerálást akár a lánohoeszabbitás előtt, akár a lánchosszabbítás után végre lehet hajtani / f ·?· Ohehab és munkatársait Katusé· JgSL· 295 /1987/ /· Sőt, ami a nagy méretű, de* léoiós nukleinsav-ssekvenciákat illeti, a lineáris lánohosssábbitáahos primereket lehet előállítani a feltételesett deléclón belüli tartományokhoz, <gy például as e? ét okosó kilobáaiaos deléolóhoz· Ilyen esetekben a lánohosszabbitéz meghiúsulása a hiányos saekvenoiánál megerősíti a deléoió fennállását és ennél fogva például as alfa-thalaesaenia diagnózisát / W* Ohehab és munkatársait Hature, Jga» 295 /1967/ /· á 257 J62· ss« európai szabadalmi leírásban ismertetett lánohosszabbitásl eljárásnak vannak bizonyos előnyei as Rfü» eljárással és as allél-speoiflkue ollgonnkleotld technikákkal szemben, amint est például a kögetkeső szakirodalmi helyeken megállapitjákt
- Kan és Oosyt froocedingz of the Kationul Acadeay of Sói- 6 *>
encea /ÜSA/· 75. 5651 /1978/1
- Bubin és Kant Láncét* 19θ5*1* 75 /1985/1
- Conner és munkatársait Proceedings of the National Aoademy of Scíenoea /USA/, ££· 7&· /1983/1
- Rídd és munkatársait Natúré* 304. 23O. /198?/1 valamint • Piratsu és munkatársait New Bngland Jour/nal of Medicina, 284. /1983/.
Mindemellett a 237 362. sz. európai szabadalmi leírásban ismertetnek egy olyan eljárást* amely magába foglalja egy fontos partikuláris szekvencia válogatás nélküli lánonövelését* amelynek eredményeképpen elkerülte tétlenül szükség van számos időt rabló detektálási műveletre a továbbiakban. Ezeknek a müve la töknek a soránt a/ további olyan Jelzett* szekvencianspecifikus oligonukleotid mintát kell alkalmazni* amelynek különbséget kell tudnia tenni olyan szekvenciák között* amelyek akár csak olyan kis mértékben különböznek egymástól mint egyetlen nukleotidi és/vagy b/ specifikus endonukleáz hasitóenzimet kell alkalmasai azokban a meghatározott esetekben* ahol a Jelentős pontmutáoió enzimfelismerő szekvenciát hoz létre vagy semmisít megj és/vagy c/ közvetlen szekventáló módszereket kell alkalmazni a meghosszabbított láncú DNS-ben /lásdt C. Wong és munkatársait Natúré* 384. /1987/ /.
Szükség van egy olyan egyszerű módszerre, amellyel közvetlenül lehet detektálni nukleinsavakban legalább egy egybázisnyi különbséget /például genom DNS-bsn/* amelyhas minimális szánra detektálási művelet kell* amelyet ennek következtében gyorsan* pontosan és könnyen lehat alkalmazni, minimális kezelői szakkép· zettaéggel#
Találmányunk azon a felismorésen alapszik, hogy mennyiben megfelelően kiválasztjuk egy ollgonnklootid primőrnek a nukle· otid saekvonciáját, végre leheti hajtani a prlnez lánchoaazabbitá· aát akár egy olyan szekvenciával, amely a feltételezett variáns nukleotidot tartalmazza, akár a normál nukleotidot tartalmazó megfelelő azekvonolával, illetve meg lehet akadályozni a prb· mer ilyen jellegű lánonövekadését óz igy lényegében egyazerüsltani lehet a szükséges detektálási eljárást#
Találmányunknak az egyik megvalósítási módja lehetőséget nyújt legalább egy variáns nuklootid jelenlétének vagy hiányán nak a kimutatására egy vagy több olyan nukleinsövbaa, amelyet a minta tartalmas# Bz a módszer a következői a/ a mintát együttesen vagy egymást követően megfelelő nukleozld-trifoazf átokkal, a nukleozid-trifossfátok polimerizál lázára alkalmas szerrel és a cél bázisssekvenoia diagnosztikai részéhez illő diagnosztikai primőrrel késeijük hibridiaáló körülmények közötti a nevezett diagnosztikai primer nukleotid szekvenciájának olyannak kell IsMie, hogy alapjában véve kiegészítse az említett diagnosztikai részt l a diagnosztikai réz* egyik terminális nokleotidja a feltételezett variáns-oukleotld» nak vagy a megfelelő normál nukleotldnür a komplementere, Így a diagnosztikai primőrnek egy lánohosazabbitásoe terméke jön létre szintézissel, ha a diagnosztikai primőrnek az említett terminális nukleotidja a cél bázisszekvenciában levő megfelelő nuklootidnak a komplementere és nem azlntotizálódlk semmilyen termék abban az esetben, ha a diagnosztikai primer emlitett tér· minális nokleotidja nőm komplementere a oél bázlaszekvenoiában — 8 · levő Mgfelelő nukleotidnaki b/ megállapítjuk a feltételezett variáns-nukleotid jelenlé» tét vagy hiányát annak slagján* hogy jelen van-e egy eztenslóe termék·
Meg kell említenünk, hogy módszerünk - noha találmányunk különös jelentőségű a pontmutációk jelenlétének vagy hiányának a kimutatásában - nagyon jól alkalma aható deléalók meglétének vagy hiányának a kimutatásává is* beleértve egy nukleotidnál több nukleotid dslécióit is* továbbá egynél több nukleotid helyettesítéséinek a meglétét, illetve a hiányát is lehet a ta» lálmőnyunk a serinti módszerrel detektálni· Ebben a vonatkozásban egyszerűen csak ismerni kell a megfelelő nukleotidokat* főleg a releváns terminális nukleotidot* hogy a szükséges diagnosztikai primer/eke/t megfelelően mag lehessen tervezni*
Essél kapcsolatban meg kell jegyezni* hogy bármely képződött extenziós terméket akármilyen formában detektálhatunk* például egyezálas vagy két szálas formában·
Azt is el kell mondanunk* hogy bármely keletkezett eztenzlós terméket - amennyiben szükség van rá - meg lehet hosszabbítani polimeráz láncreakcióval fSQR/ » amint ezt a 4 68J 202* ez* és a 4 68J 195· aa* amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leír ásókban ismertették -* <é-béta replikán alkalmazásával* szint azt a W087/06270* sz« PC® közzétételben és a Bloteohnology 6» kötetében 1968 októberében ismsrtettéki transzkripciós bázisú nukleinea>-ampli£ikáoióval /Siska Oorporation/, ahogy azt a W068/10515· ez· közzétételben ismertették vagy lineáris amplifikáoió alkalmazásával· Ebben az összefüggésben a lineáris ampliflkáció kifejezést arra a lánohossrabbitásra alkalmazzuk* * φ * amelynek során egyetlen primőrt használunk minden egye* dia» ! nosztikai részhez egy polimerizáló ezer· valamint megfelelő nukleotid-trlfozzfátok Jelenlétében) a lánohosssabbltást olyan primer extenzióval hajtjuk végret amelynek a során templátként alkalmasunk egy nukleinsav mintában lévő egyszeres szálat·
Találmányunknak először egy különösen előnyös megvalósítási módját ismertettük, amely a következő műveletekből áll)
1/ á mintát hibridizáló körülmények között együttese® vagy egymást követően megfelelő nukleozi&»trifoszfátokkalt a nukleozl&»trifoosfátok pollmerizáláeár* alkalmas szerrel· a oél b&> sisesekvencla diagnosztikai részéhez megfelelő diagnosztikai, prl* 1 merről ée egy megfelelő amplifikációs primőrrel keseljüki az említett diagnosztikai primer nnkleotid szekvenciájának olya» | nak kell lennie, hogy kiegészítse lényegében as említett dia» noeztikai részt) a diagnosztikai primer terminális nukleotidjá» !
nak olyannak kell lenni·· hogy vagy kiegészítse a feltételezett variáns-nukleotidot vagy komplementere legyen a megfelelő normál nukleotidnek· így a diagnosztikai primőrnek egy extenziés terméke Jön létre abban az esetben· ha a diagnosztikai primo» nek az említett terminális nukleotidja komplomontore a oél bázisszekvenciában levő megfelelő nukleotid· Sem keletkezik szintetizált extensiós termék abban az esetben, ha a diagnosztikai primer említett terminális nukleotidja nem komplementer· a oél bázleazekvenciáben levő megfelelő nukleotidnak· á diagnosztikai primernek bármelyik extenziós terméke képes arrat hogy tenplát szerepet Játsszon as említett aiaplifikúcióe primer extenziós termékének a szintézisében· miután elválasztásra került a komplementerétől·
2» A mintát denaturálja! körülmények között tartjuk· hogy • 10 · elkülönítsük a primőr extenzióa terméket a templátjától azokban az esetekben· amelyek sorén ilyen extenziós termék képződött·
3* A 2· művelet során keletkezett egyszeres szálakat érint· közte tjük együttesen vagy egymást követően alkalma nukleosld· •trif ossf átokkal» a nukleozid-trif oszf átok polimerlzálására al· kajmas szerrel» egy diagnosztikai primőrrel és egy előzőekben már definiált amplifLkáoiós primőrről· Azokban az esetekben» amelyéknél lehetséges» további extenziós termékeket szintetizál lünk olyan módon» hogy templátként alkalmazzuk a 2· művelet során keletkezett egyszeres szálakat·
4· a 2» ée a 5· műveletet elegendő számban ismételjük meg ahhoz» hogy detektálható lehessen a megfelelő nukleotid esetevem el* lánchosszabbodáea·
5. Detektáljuk a feltételesett variánmmklootid jelenlétét vagy hiányát annak alapján» hogy jelen vame a 4· művelet során kapott amplüikáoiós tenaék«/4/·
A találmányunk szerinti eljárás egy másik megvalósítása eo· rán az adott mintát együttesen vagy egymást követően késeijük e/ egy olyan diagnosztikai primőrrel, amelynek van egy» as első jonkleinsav^ezekvenolának egyik diagnosztikai réssá^lg^^ komplementer szekvenoiájai as első diagnosztikai primőrnek van egy olyan terminális nukleotidja, amely komplementere as emll· tett» feltételezett variáne-nuklootidnaki és a második diagnosztikai primőrnek van egy olyan szekvenciája, amely lényegóban komplementere a második nukleinsav-saekvencia egyik diagnoss· tikai résséaefci a második diagnosztikai primőrnek van egy olyan terminállá nukleotidja» amely komplementere a feltételezett variáns-nukleotidnaki vagy • · ♦ * u h/ egy olyan /első/ diagnosatikai primőrrel» esélynek egy asekvenciája lényegében komplementere aa elad nukleinsar»e88te» Vandának egy diagnosatikai réaaéveli a második diagnosatikai primőrnek van egy olyan terminális nukleotidja» amely komplemen» tere annak a normál nukleotidnak, amely megfelel aa említett feltételezett variáns-nukleotidnaki valamint egy olyan /második/ diagnosatikai primőrrel, amelynek aa egyik szekvenciája lényegében komplementere egy második nukleinea^-ssekvonola egyik diagnosatikai részéheki a második diagnosztikai primőrnek van egy olyan terminállá nukleotidja, amely komplementere annak a normál nuklootídnak» amely megfelel aa említett foltételeaett variánó-nukleotidnaki aa első diagnosatikai primer említett terminális nukleotidja és a második diagnosztikai primer emli* tett terminális nukleotidja a megfelelő primőröknek vagy as as $· vagy a j· véghelyset ében vannak /mind a kettő/ és aa első nukleinaav-ssokvenoia a második nukleinsav^-eaekvenciával ellen» tét os irányítottsága·
Találmányunknak önnél a megvalósítási módjánál fe sfteOdik diagnosatikai primőrt a már említett és as est követően említés*» re kerülő utalásoknak megfelelően amplifikáoióe primőrnek lehat tekinteni·
Találmányunknak ea a második megvalósítási módja lehetővé teasi, hogy a megkülönböztethet ős ég és a specifikusság növekedjék» minthogy bármely mesterségesen előállított termék létrejöttében kedvezőbb, ha a láncnövekedés két hibás párosítással kaletkosett oligonukleotid megfelelő láncvégén indul meg» mintsem egyetlen lánovégon abban az esetben» amikor osak egyetlen diagnosatikai prímért alkalmasunk·
Sgy feltételeseit variáns-nukleotid jelenlétének vagy hl» * 12 ányának a kimutatása például a következőkhöz ismertetésre kerülő módon történheti
Találmányunknak a harmadik megvalósítási módja szerint egy, feltételezett variáns-nukleotidot tartalmazó DSS-t magába foglaló mintát léncnövolésnek vetünk aláj például a már leírtak szerint lineáris láncnövelésnek, vagy olyan láncnövelésnek, amely például a 4 68? 195« sz· és a 4 685 202« sz· amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, a #087/06270. sz. alatt közzétett PCT-boJelontósben, a Biotechnology 1988 októberi 6« számét* bán vagy a «1088/10515· az« alatt közzétett PCT-bojolentősben került isrertetésre· A kapott anyagot a cél bázisszokvencia agy diagnosztikai szakaszán egy diagnosztikai primőrrel kezeljük hibridizáló körülmények között, megfelelő nukleozid-trifoszfátok és egy, a nukleosid-trifoszfátok polimerizálására alkalmas szer Jelenlétében· az említett diagnosztikai primer nuklootid szekvenciája olyan, hogy lényegében kiegészíti a nevezett diagnoezX.
tikai szakaszt· A diagnosztikai prirrnr egyik terminális nukleotidja vagy & feltételezett vorláas-nukleotid ktsuplomentere vagy a megfelelő normál nukleotidnak a komplementere ·
Így találmányunknak ezzel a honaadik megvalósítási módjával úgy lehet elérni a hagyományos láncnövelést, hogy megfelelő számú ciklust alkalmazunk és a következő lépésben a diagnosztikai primőrrel megkíséreljük a hibrldizálást, a detektálási műveletet megelőzően·
Ez a harmadik megoldási mód Jelentős, mert alkalmazása esetén Jelentős mértékben csökkenteni lehet - például legalább felére a pollmriaáléshoz szükséges ozer/oka/t és ugyancsak jelentős mértékben csökkenteni lehet a nukloozid^trifoszfátok mennyiségét· valamint aa alkalmazott fütőberendezésok számát a polimerén • ·
lánsreakoló /W lej átszabásához· így eszel a harmadik megváló* eitáal móddal jelentőé költségeket letet megtakarattani. Sőt, mivel a láncnövelési műveletet megfelelő hőmérsékleb-bartcmánytea letet végrehajtani káros következmények nélkül,ennek a megoldásnak a megvalósítása osak azt igényli, hogy a diagnosstikai mintával csupán egyszer hajtsuk végre a hőmérséklet sseiapontiából kényes hibridizálásti igy még tovább csökkenttető aa a ve* szély, hogy egy végtelyaetben - általában a 5* véghelyaatben * hibásan párosodott diagnosztikai primer nem megfelelő lánonövekedést imitson meg· így találmányunknak a >· megvalósítási mód* 4a lehetőséget ad arra, hogy szakképzettséggel nem rendelte a ők kesében is megbízható, probléma nélkül alkalsasható eljárássá váljék, minthogy non érzékeny a munkavégzés köbben elkövetett hibákkal ssemben· 1 harmadik módszer alkalmazása esetén továbbá nincs szükség arra, hogy a polimerás lánoreakoiót külön szabályozzuk, minthogy a meginduló lánonövokedésnok megvan a maga belső szabályozása*
Ha szükséges, olyan jelzett diagnosztikai primőrt is lehet alkalmasod, amely nincs kitéve a bomlás veszélyének - például abban az esetben, hu az alkalmazott ciklusos eljárás magas hőmérsékletet igényel» igy például polimer áz láncreakció lej átess** táea esetén· amint leírtuk, a jelzettséget biztosítani letet például megfelelő, jelzett molekularésszel, igy búzikuu fossfa*házzal vagy torma perozidázzal*
Sszel összefüggésben jelentősége letet annak, hogy jelzésre termoetabil enzimeket, igy Ihermne aquatieuaból származó foszfátéit alkalmazzunk· • ·
A negyedik és előnyösen alkalmazható magvalósítás! módja találmányunknak a harmadik megvalósítási mód módosítása, amely szerint - uj megoldásként - két diagnosztikai primőrt alkalmazzunk csakúgy mint a találmányunk szór in ti második megoldás esetén. A második diagnosztikai primer potenciálisan láncnővolő prlmórként szolgál· így a találjjngurk negyedik megvalósítási módja szerint a föltételezett nukleotidot tartalmazó DSS-t magába foglaló mintát láncnövelésnek vetjük alá, majd az igy kapott terméket együttesen vagy egymást kövotően kezeljük akár a/ egy /első/ diagnosztikai primőrrel, amelynek van egy, • lényegében az első nukleinsav-szekvencia diagnosztikai szakaszát kiegészítő szekvenciáját az első diagnosztikai primőrnek van egy olyan terminális szekvenciába, smoly a nevezett feltételezett variáns-nnkleotidnak a komplementere! a második diagnosztikai primőrnek van egy olyan szekvenciába, amely lényegében komplementere · második nukleinsav-azekvanda egyik diagnosztikai szakaszának! a második diagnosztikai primőrnek van egy olyan terminális nukleotidba, amely komplementere annak a nukleotidnak, ame^F komplementere a nevezett, feltételezett variáns-nukleotldJMkl vagy b/ egy /ele6/ diagnosztikai primőrről, amelynek van egy, az első nuklaXnsav-szokvenela eg^ik diagnosztikai szakaszával lényegében komplementer szekvenciába! az első diagnosztikai primőrnek van egy olyan terminális nuklootidja, amely kcmplomoaWa annak a normál nukleotidnak, amely megfelel a nevezett feltételezett varláns-nukleotidnaki a másik diagnosztikai primőrnek van egy olyan szekvenciába, amely lényegében komplementere a második nukleinsav-ezekvoncla egyik diagnosztikai szakaszának!
• ♦ * · * 15 * a második diagnosztikai primőrnek van egy olyan terminális nők» leotidJa. amely komplementere annak a műdeotidnak· amely kennie— 4PW » ^▼^WFprw^PWPP WMW ^P pl^R^WwV *^W 4ΡΡ4Ι^Ρ·^^4·Ρρρ mentese a neveset* feltételeseit variáne-mikleotidnak megfelelő, említett normál nuklootldnaki as eled diagnosztikai primer említett terminális nuklcotidja és a második diagnoestikal primer említett terminális nuklcotidja egyaránt a megfelelő primőröknek vagy as 5* vagy a 5* véghelysetében van és as első nukleinsav-asekvencia komplementere a második nukleinsat^sekvonelának·
Általában mind, as első diagnosstlkai primer neveseit terminális nukleotldja, mind, a második diagnosstlkai primer terminél 110 önkleotldja a megfelelő primerek >· véghely setében van»
A találmányunk sserinti negyedik megoldás így kombinálja a találmányunk sserinti· korábban már ismertetésre került más©· dik és harmadik megoldás sserinti lehetséges előnyökett altos!» masásával egyebek kösőtt igy lehetséges a specifikusság megnő» velőse, a költségek esőkkentése és egy kevéssé kényes· as alkalmasé ssámára kényelmesebb módsser alkalmazása.
A feltételeset! vaviáns»nnklootid jelenlétét vagy hiányát aa est követőleg ismertetésre kerülő módszerrel lehet például végrehajtani·
Megemlítjük, hogy a lánonövelés aomán keletkezett, a korábban definiált a/ szerint vagy b/ szerint egyszer koséit terméket - amennyiben szükség van rá - alá lehet vetni egy vagy több befejező ciklusnak· Abban as esetben· ha több oikluat hajtunk végre» egy olyan* további terméket kaphatunk* amely hibridje a diagnosstlkai primerek extenzlós termékeinek, a különböző termékeket olyan mennyiségi arányban lehet megkapni* amely függ aa eredeti -PGR /polymerase okain reaction/ primer nukleotidjalnak és as addiclós diagnosztikai primer oligonukleotidjalnak as arányából#
Akár diagnosstitoi és emplifikáclóz primerokkcl» akár - mint találmányunk első és második megvalósítási módjánál - két diagnosztikai prinesrel» akár úgy» ahogy ez ismar totósra került a 2J7 >62· ss« európai leírás szerinti láncnövolási eljárás keretében· a primer axtenaiós termékeknek a templátJaiktól való elválasztást célzó a/ denaturáláai műveletet» valamint azt a műveletet» amelynek során as egyszeres szálakat» amelyeket ilyen módon kaptunk» érintkeibetjük együttesen vagy egymást követőleg megfelelő nakleozid-taifossf átokkal» a nuklaozld-trlfossfátok polimarizálására alkalmas taerrel és a megfelelő primerekkel további extensiós termékek előállítása céljából» célszerűen legalább ötször * a felső határ nincs megállapítva - ismételjük ciklusosam különösen abban az esetben» ha a primer nehezen vehető rá a lánonövelésrei mindez nem Jelent hátrányt a találmányunk szerinti megoldásra· Abban az esetben» ha a minta emberi genom DHS-t tartalmas» még célszerűbben úgy Járónk el» hogy 15 - θ°» például 15-5° oiklust alkalmazunk. Abban az esetben» ha a minta sejteket tartalmaz» a mintát célszerű felnelegiteni az a/ művelet alkalmazása előtt» hogy a nukleinsavak ki legyenek téve a reagensek hatásának. Bnnél a műveletnél nem szükséges a nutoleinsavak tisztítása a reagensadagolást megelőzően. Bzzel kepczelatosan megemlítjük» hogy a találmányunk szerinti megoldás alkalmazása sokkal előnyösebb a már ismert eljárások alkalmazásához képest még abban az esetben is» ha BHS-tisztitást hajtunk végre a láncnövelés megkísérlését megelőzően.
Megjegyezzük» hogy a b/ művelet során az a/ művelet eredményeként keletkezett egyszeres szálakat és a megfelelő nukleozid-trifoszfátokat» a nokleoMd-trifossfátok polimerizálásáea ♦ · · ·
- 17 szolgáló szert* a prlmer/eke/t · például a diagnoeztlkal prl* mor/eke/t ée/vagy as amplifikációs primor/oke/t Mg úgy érintkestetjök egymással* hogy & primer extenzlós terméknek a tomplátjától való elválasstása után hozzáadjuk azokat as anyagokat a reakcióé légyhas /a/ művelet/» akár azokra as anyagokra hagyat* kosunk* amely ok mát jelen vannak a reakcióologyben· Valójában a különböső nukloozld*trlfossfátckból és/vagy a polimerizáló szerből és/vagy a prlmer/ek/ből bármelyiket» illetve akármelyiket * beleértve as amplifikáoiós primőrt is - be lehet adagolni a találmányunk szerinti eljárás bármelyik fázisában* például a diagnosstikai primov/eke/t és/vagy as amplifikáoiós prímért·
A találmányunk szerinti megoldás ötödik - előnyösen alkalmasható - megvalósítási módja al előzőkben leírtakhoz hasonlóan olyan megoldás* amely során a láncnövelést olyan primer e»» tenaióval valósítjuk meg* amely a nuklsissay minta egyszeres «ιφΐ Aliink mint tenplátnak as alkalmazásán alapsaík· így ennél a megvalósítási módnál a primer Oxtonziót a nuklsinsav minta ugyanazon sBáljának mint templátnak as alkab» masásával hajtjuk végrei nincs jelen amplifikáoiós primer· így a láncnövekedés inkább számtani haladván? szerint történik* semmint hogy exponenciális lenne· Exponenciális lánonövekedást * legalábbis elméletben * a polimerás láncreakciók eredményeként /PCR/ lehet elérni· Találmányunk esen ötödik megvalósítási módjának - amelyre a leírásunkban lineáris láncnövekedésként is hivatkozunk - as as előnye* hegy a mesterséges termékek
- amennyiben létrejönnek - nőm képesek exponenciális láncnöve* kedésre·
Lineáris láncnövelést bármilyen alkalmas megoldással végre lehet haj tani i így például komplementer nukleosid^trifossfátok
- 18 alkalmazásával a nukleozld-trlíossfátok polimcrlzálására aikalmás ezer jelenlétében olyan, közepes lánohosezuságu primer ez· tenzlós termékek előállítása céljából* amelyknél a diagnosztikai primer és a minta nuklelnsavja közötti komplementaritás mértéke megfelelő·
Abban as esetben* ha as összes komplementé» nukleosld-trifossfátot alkalmasai kívánjak* a mintában levő nukleinsavat endonukleázcs digerálásnak vetjük all· A hasító hatása ondónak· leás enzimet úgy választjuk ki* hogy a hasítás a nuklelnsav mintának azon a helyén követhessék be* amely lehetővé teszi megadott hosszúságú primer extenslóe termékek képződését* Sszel kapcsolatban azonban meg kell említeni* hogy a lineáris lánonövelést csak egy* előnyösen kettő* célszerűen három nnkleosid· -trlfossfát jelenlétében lehet végrehajtani! Így a diagnosztikai primer a kötésállapotában /vagyis a minta nukleinsavjáhos hlbrldizálédva/ osak olyan mértékig tud növekedni* amennyire a jelenlevő 1*2 vagy j trifossfát /nukleozld-trifOBSfát/ megengedi, Mihelyt egy olyan nukleosld-trlfossfát van jelen a minta nukleinsavjában, amelynek viszont nlnos jelen a komplementer ntkleosiŐRtrlfossfátja* a primer lánonövekedése megáll·
Amennyiben szükséges* a lineáris láncnövelést végre lehet hajtani a szekvencia olvadáspontján /®z/· a minta nnkleinsavban leVÖ komplementer szekvenciára hibrldlsáf lódott diognoestikai primer egyensúlyi állapotban van as Oldatban szabad állapotban jelenlevő diagnosztikai primőrrel* és így as adott esetben eztendált állapotban jelenlevő diagnosztikai primer gyorsan hibridizálédlk a minta nuklelnsavra és denaturálédik réla« Abban az esetben* ha szükség van rá* a lineáris láncnövelést végre lehet hajtani termikus oszcillál ássál is·
- 19 Ilyen termikus ossollláláe esetén a hőmérséklet éltalában gyorsan ingadosik a asekvenala olvadáspontja körül·
Abban as esetben* ha csak 1*2 vagy 5 mkleosid-trifossf át van jelen* a diagnosstitei primőrnek osak olyan mártékben növök* ssik a lánoa* amilyen mértékben esőknek a nukloosid^trifossf^* toknak a jelenléte megengedi.
Amint korábban már említettük* abban as esetben* ha hibás párosodás jön létre például a diagnosstikal primer 3* terminális végosoportja és a minta nukleinsavban laté megfelelő xaikle* osid’-trifoasfát kösött* nem jétasódik le a primer lánonövehedósé· Abban as esetben vissont* amikor a j· helyset ben levő xmkleosiá-trifosafát komplementere a minta nukleinsavben levő megfelelő nukleoaid-trifoasfátnak* a primer-lánonövekodée vég»
Abban as esetben» ha osafc 1*2 wgy > imkloosid^trlfoesfátot alkalmasimik és as alkalmasáé során as extenddlt dlagnosstikal primer terminális nukleoaidMU’ifossfátját oaak egysser hassnáljuh* előnyös lobét mzkleosid-trifossfétként didesoxl-nnkleosiő-trifossfát alkalmasáén· A didosoxl*nukleosid*trifossfát as alkalmasás során a diagnoastikai primer extendált termékének a terminális nukleozld-trifoosfétja less* Bonok eredményeként a diagnoestütai primőrnek a terminális lénanövekodése világosan áttekinthető less·
Abban as osttben* ha agy vagy több nukleoaid-trifossfát van jelen a reakolóologyben· ssükség esetén bármilyen alkalmas módon meg lehet őket jelölni· / A nukleosid-trifosáfátok abból a óéiból vannak jelen» hogy be legyenek építve as extendált primőrökbe·/ Így például egy vagy több nuklaosid-trifossfétet meg lehet jelölni fluoressoenoiásan· A nukloosidr-trifoasf átoknak —
oz a fajt» ciQgJelöléae különösen a találmányunk ötödik megválósiti ási módjával kapcsolatban Jelentős* amelynél a diagnosztikai primer egyik extenziós termékének a létrejöttét úgy lehet észlelni* hogy detektáljuk as extenzióo termékbe beépített* megjelölt nuklsozid trfoesfátc/ka/t· Abban as esetben» ha nem keletkezik egyáltalán extenaiós termék» nem megy végbe beépülés és a megjelölt nukleozid-trif ossfáto/ka/t el lehet távolítani példán! mosással. Részletesebben arról van eső» hogy a találmányunk ötödik megvalósítási módjával el lehet kerülni a mesterséges termékek láncnövekedósével kapcsolatos problémákat ás így megjelölt nakleozld-trifossfát/ok/ Jelenlétében Jó megkülönböztethetőséget lehet biztosítani· Abban as esetben» ha a lánonövelést például POR alkalmazásával hajtjuk végre» akármilyen mesterséges 'termék is Jön létre* as ennek a terméknek a láncnövekedését eredményesheti és így a megjelölt nukloozidi-trif oszf át beépülése ennek következtében csökkenti a megkülönböztethetőséget·
As említetteken túlmenően szükség lehet arra* hogy a diagnosztikai primer hordóssá as immunológiai kötbérnek egyik tagját* például az antigént vagy as antitestet vagy egy kcmplexképaö pár egyik tagját - például biotint - hogy kötés jöjjön létre az említett kötőpár másik tagjával* illetve pár képződjék a szilárd fázison való mogkötődéshea·
Találmányunknak van egy további tárgya isi diagnosztikai késsiet* amelynek a segítségével ki lehet mutatni egy minta egy vagy több nuklslnsavjában legalább egy variáns-nukleotidinak a Jelenlétét vagy a hiányát· Ez a diagnosztikai készlet a követkesőket tartalmassal /1/ egy diagnosztikai primőrt a oél bázisszekvencia min- 21 den egyez diagnosztikai szakaszához» minden egyes diagnosztikai primőrnek olyan a nukleotid szekvenciája, hogy lényegében komplementere az említett diagnosztikai szakasznak» a diagnosztikai primer egyik terminális nukleotidja vagy komplementer· a feltételezett vorláns-nukleotidnak vagy komplementere a megfelelő normál nukleotidnak» ilyen módon a dlagnoez tilsai primer egy oxtonziós terméke akkor szintetizálódik, ha a diagnosztikai primőrnek az említett terminális nukleotidja komplementer· a cél bázisszekvenoiában található megfelelő nukleotidnaki nőm sslntotizálódik semmilyen cxtenziós termák abban az esetben, ha a kai primer említett terminális nukleotidja ne» kmsp— lementen· a oél báaiaazekvenaiában található megfelelő nnklootldraki /2/ a négy különböző nukleozidrtrifoezfát mindegyike» és /5/ egy olyan szer, amely alkalmas a /2/· pontban említett nukleozid-trlfoszfátok polimerizálására#
A találmányunk szerinti diagnosztikai készlet célszerűen tartalmas még egy olyan amplifikációs prímért is, amely megfelel minden egyes diagnosztikai primőrnek» az scupllfikációs megfelelő primőrnek a nukleotid szekvenciája olyan, hogy a diagnosztikai primer bármely extenziós termék· - a komplementjétől való elválasztást követően - tcmplátként szolgálhat az ampUfikációe primer extenziós termékének szintéziséhez« A találmányunk szerinti diagnosztikai készlet magába foglalhatja például a találmányunk második megvalósítási módjával kapcsolatosan már részletesen említett diagnosztikai primőrökből álló készletek egyikét Vagy mindkét készletet·
Abban az esetben, ha szükség van rá, a találmányunk szerinti .: .··. .: :···.··.
: ··: : ···. .··.
··· ·· ··· ··· ·· dinCTnrtnatlleai kÓZSlot belső tamtpQll—pglaareket ifi
Esnél kapcsolatban meg kell onlitenünk* hogy különösen célszerű* ha a találmányunk szerinti diagnosztikai készlet K® /polyaerase ohain reaotion/ primőröket és egy - a későbbiekben meghatározásra kerülő - diagnosztikai primőrt tartalmaz* minden egyes feltételezett variáns-nuklootidra vonatkozóan· Abban az esetben, ha szükség van rá, a diagnosztikai készlet tartalmazhat még ezeken kívül egyet vagy kettőt azok közül a diagnosztikai primerek közül, amelyeket a találmányunk második mogvalósitád. módjával kapcsolatban korábban már részletesebben ismertettünk·
Az /1/, /2/ és /5/ pontban megjelölt anyagok bármelyikét és/vagy az amplifikáoiós primőrt megfelelően tárolhatjuk külön edényekben* célszerűen azonban az említett anyagokat együttesen tároljuk egyetlen edényben* amelybe beadagoljuk ez elemezni kívánt anyagot# Abban az esetben* ha ogyotian edényt alkalmazunk* célszerűen úgy járunk el* hogy puffért is alkalmasunk·
Megemlítjük, hogy amennyiben a találmányunk szerinti diagnosztikai készlet az /a/ diagnosztikai primerek mindkét sorozatát, valamint a korábban részletezett Zb/ szerinti anyagokat tartalmazza* a találmányunk szerinti második megvalósítási sód alkalmazása esetén mindkét diagnosztikai primer sorozatot nem szabad egyetlen edénybe együttesen helyezni* bár a primer sorozatok mindegyike együttesen jelen lehet bármelyik* oz /2/ és /5/ pontban szereplő anyaggal és/vagy ampllfikációe primer okkel külön konténerekben·
Abban az esetben* ha a vizsgálat tárgyát képező mintát kezdetben a 257 562. ez· európai szabadalmi leírás szerint vetjük alá lánonövelésnek* célszerűen úgy járhatunk el* ha egyet» len edénybe helyezzük el a PöB-primerokot és a diagnosztikai primerfeke/t as eftőaőek során ismertetett· /2/ és /5/ pont szerinti anyagokkal· Abban as esetben azonban, ha szükséges» a diagnosztikai primo»/oko/t külön edénybe is helyezhetjük, hogy azután kerülhessenek felhasználóra» ha a láncnövekedés már végbement·
Leírásunkban ‘’nukleoMd-tri£oszfátanM olyan nukleosidokat értünk, amelyek akár a BKS-bon, akár as RUS-ben vannak Jelent igy ide tartoznak azok a nukleozidok, amelyekben adenin, citosin, guanán » tinin és uracll fordul elő bázisként és a oukor-molekularész dezoxi-ribós vagy ribés* A desoxl-sibonukleosádo kát általában együtt alkalmazzuk egy W-polimer ászai· Ezzel kapcsolatban asonban megemlítjük» hogy alkalmazni lehet aás» olyan modifikált bázisokat is, amelyek képesek a hagyományos adenin, citosin, guanln, tinin és uracll bázisokkal bástohpáro sodásra· Ezek közé a modifikált bázisok közé tartozik például a 8· π népin ni n és a hipoosantin·
A leírásunkban használt nukleotid kifejezés olyan nuklootidokra vonatkozik» amelyek vagy űKS-ben vagy SHB-ben vannak Jelent igy például olyan nukleotidokra, amelyekben adenin, citozin, guanln, tinin és uraall molekularéss van mint bázis, a cukor-oolekularész pedig dezoxl-ribóB vagy ribés* Eszel kapcsolatban azonban megemlítjük, hogy a találmányunk szerint alkalmazott dlasnosztlkal Dolmenben vazr mannái An nrlmoben egyéb olyan modifikált bázisok is lehetnek, amelyek képesek bázis-párosodásra a hagyományos bázisok valamelyikével» igy as adenlsnel, a dtozlnnal, a guaninnal» a timlnnel és as uraoillal· Szűk közé a modifikált bázisok közé t^rtoeik néldául a ö—Qzaguanln és a πτ p T
Megjegyezzük, hogy amennyiben a találmányunk szerinti el• · · · — — járással egy olyan feltételezett variáns-nukleotidnak kívánjuk meghatározni a jelenlétét vagy a hiányát, amety variáns nuklacH tid egy olyan oélbázisszekvonaia-ezakaBahoa csatlakozik, amely nem tartalmazza mind a négy különböző nukleotidot, a diagnoss* tikai prímernok egy extenziós termékét és - amennyiben szükség van rá - az aoplifikáoiós primer egy extenziós termékét elő lehet állítani abban az esetben, ha csupán a megfelelő xmkleozid· -trif oszf átok vannak jeleni mind a négy különböző nukleozld-trlfossf át jelenléte nem szükséges*
A nukleozid-trifoszf átok polimorizálásához alkalmazott szer bármely olyan vegyűlet vagy több vegyületből álló kompozíció lehet, amely szintetizálni tudja a primer extenziós termékeket, beleértve az enzimeket is· Srre a óéira megfelelően használható enzim például az B* coli DSS Polímcráz I, az B# coli hKS pnllmeráa I Klencw-fra^aantama, a DHS polimerás, egyéb rendelkezésre álló 3HS polimarázok, a fordított trenszkriptás és más enzimek, beleértve a tornostabil enzimeket·
A leírásban használatos termostabil enzim” kifejezés olyan enzimre vonatkozik, amely hőhatásra nem bomlik és a hővel asz»» ben ellenálló, valamint katalizálja /megkönnyíti/ kifejezetten a nukleotidok vegyülését /vegyi reakcióba lépését/, hogy olyan primer extenziós termékek keletkezzenek, amelyek komplementerei minden egyes nuklainsavszálnak· A salntóaie általában minden agyas primőrnek a 5* véghelyzetében indul meg és a teaplátszál mentén az 5* véghelyzot irányban halad előre egészen addig, amíg be nem fejeződik,és ilyen módon különböző hosszúságú molekulák keletkeznek* Bázel kapcsolatban azonban meg kell említenünk, hogy lőhetnek olyan enzimek is, például toriaoetabil anzimok, amelyek a szintézist az 5* végholyzetben indítják meg, majd a szintézis • · · · • 25más irányban halad olőre az előzőkben leírt eljárás alkalmazásakor· Célszerűen olyan termostabil enzimet lehet alkalmazni a találmányunk szerinti eljárás megvalósít ásókar, amelyet £her* mos a^uaticuaból lehet kinyerni oxtrahálásaal és tisztítással· Ennek az enzimnek a molekulatömege mintegy 86 000 - 90 000 dal·» tan» mint ez a 2J7 362· az európai szabadalmi közzétételt leírásban olvasható /lásd a 258 017« sz· európai közzétételi leírást is/· Otermus aauaticus XT1 szál minden megszorítás nélkül beszerezhető as Amexican $ype Culture Colleotionból» 12J01 «
Parklawn Drive» Rockville, Maryland, USA, mint ATOO 25,104·
A tál áimán-onnl· ismertetése közben használt diagnosztikai szokass kifejezés a későbbiekben definiálásra kerülő célbásle-szekvenciának azt a szakaszát jelenti, amely terminális nukle* okidként tartalmazza a potenciális varláns-nukleotidot, amelynek a jelenlétét vagy hiányát kell kimutatnunk· A potenciális variáns-űukleotid általában a diagnosztikai szakasznak as 5* véghely setében van, minthogy általában - amint est korábban már említettük - minden egyes primer esetében a 5· véghelysetben indul meg a primer extenzlós termékek szintetizálódása»
Abban as esetben azonban, amikor olyan polimerisációz szer kerül alkalmazásra, amely a szintézist a diagnosztikai primer 5· véghelyzetében indítja meg és a 5· helyset irányában vizái előre a teoplátssál mentén amíg a szintézis be nem fejeződik, a diagnosztikai szakasz a 5· helyzetében tartalmassá a potenciális varláns-oukleotidot· A diagnosztikai primőröket ebben a vonatkozásban és megfelelően lehet tervezni, amint est a következőkben ismertetjük·
A leírásunkban használt célbázls-saekvenola kifejezés egy olyan nukleotid-ssakvenciát jelöl, amely legalább egy» korábban — 26 * mór ismertetett diagnosztikai szakaszt tartalmaz· így például egyetlen, bét&-thalassaomiára irányuló vizsgálat esetén a célbázis-szekvencia akár 60 - például £0 - diagnosztikai szakaszt is tartalmazhat és minden egyes diagnosztikai sekaszben van egyetlen potenciális vorláns-nukleotid· ▲ találmányunk ismertetésekor használt oligonukleotld* kifejezés olyan molekulára vonatkozik, amely két vagy több dezoxirlbonuklsotidot vagy xibonukleotidot tartalmaz, célszerűen több mint hármat· te oligonukleotidnak a pontos mérete számos tényezőtől függ, Így a reakcióhőmérzóklettől, a sókonoentrációtói, a formamid jelenlététől, valamint egyéb zárt mutádó/k/ jelenlététől, amint oz a sarlósejtes Hb 0 kór esetében Íz van, amely viszont az oligonukleotld utolsó funkciójától vagy az oHgonukleotid alkalmazásától függ· A valóságban az oligonoto» lootid pontos szekvenciája is számos tényezőtől függ, amint ezt a későbbiekben tárgyalni fogjuk, te oügonukleotidot elő lobot állítani szintetikusan vagy klónozással· leírásunkban a primer kifejezésen olyan oliGonukleotidót értünk - akár természetes anyagból állítottuk elő tisztított formában hasításod digor olással, akár szintetikusan —, amely a szintézis megindításókor képos betölteni az iniciálás! pont szeapét abban az esetben, ha olyan körülményeket biztosítunk, amelyek mellett megkezdődik egy olyan primer eztendós terméknek a szintetizálódása, amely termék komplementere egy nuklelnsavszálnaki vagyis megfelelő nukloozid-trifoszfátok és egy polimsrizálószer - például alkalmas pufferben levő BRS polimeráz - jelenlétében / puff©rw-en itt p&-t, ionsrőaeéget, kofaktorokat stb· biztosító közeget értünk /, valamint megfelelő hőmérsékleten· * 27 ·
A primer célszerűen egyszeres szálú a maximális lánonövolésl hatékonyság elérése érdekében· Abban az esetben, ha kettős szálú prímért alkalmazunk, a prímért először olyan kezelésnek koll alávetni, amely elválasztja egymástól a szálakat,és csak ezt követ öle g lőhet felhasználni a prímért extenziós termék készítéséhez· Előnyös, ha a primer olieodezoxii’ibonuklootid·
A primőrnek elég hosszúnak kell lennie ahhoz, hogy megalapozza az extanziós termékek szintetizálását a polimerizáló szer jelenlétében· A primerek pontos hosszúsága sok tényezőtől függ, beleértve a hőmérsékletet , a primer forrását és a módszer alkalmazását· A diagnosztikai és az amplifikádós primerek például - a oélszekvoncia komplexitásától függően - ál» tóiéban 10 - 35, például 15 * 35 nukleotidot tartalmaznak, bár tartalmazhatnak kevesebb vegy több nukleotidot is· Abban ez esetben, ha rövid primermolokulók vannak jelen, általában alacsonyabb hőmérsékletet kell alkalmazni ahhoz, hogy a templáttal elég stabil hibridkomploxek képződjenek·
A leírásunkban akkor használjuk nuklootidokkal kapcsolatban a konplemontere” kifejezést, ha egy nukleotid. bázispárja lehet egy másik, Jellemző nukleotldnak* így például as adenoain~trlfoszfát komplementere az uridin-trifoszfátnak vagy a timidln-trifoBZfátnak és a guanozin-trifoszfát komplementer· a citidln-trlfossfátnak· Szzel kapcsolatban megjegyezzük, hogy noha a tiMdln»trlfoszfát és a guanozin-trifoszfát alkothatnak bázispárt bizonyos körülmények között, a leírásunkban hassná» latos értelemben nem tekinthetők mégsem komplementereknek· Azt is meg kell említeni, hogy bár a citozim-trifoszfát és as adenczin-trifoazfát is alkothat bázispárt bizonyos körülmények között, esek a bázisok sem tekinthetők egymás komplementerei- 26 * nek a leírásunk szerinti definíció értelmében, Ugyanez vonatkozik a citozin-trifoszf átru és az uracil-triíoszfátra is·
A leírásunk szerinti primőröket úgy választjuk ki, hogy azok '•gyakorlatilag”, alapvetően , lényegében komplementerei legyenek a hosszabbítani kívánt minden egyes különleges ezek* venoia különböző szálainak· Sa azt jelenti, hogy a prímeteknek eléggé koB^plemonteroknek keU joná^íOt ahh^a^ hogy hibridizélódjanok a megfelelő szálaikkal, fahát a primer saokvenoiának óén kall a teqplát szekvenciájának pontosan megfelelnie· J?éidóul abban az esetben, ha a diagnosztikai primer egy olyan nuklootid szekvenciát tartalmaz, amelyben a 5f véghelyzotben levő nuklootid. komplementere akár a feltételesett variáns-aakleotidnak, akár a megfelelő normál nukleotidnak, egy nemkonplementor nukleotid fragmentum kapcsolódhat a primer 5» véghelysetéhez, ugyanakkor a primer szekvencia maradéka komplementer· a célbázis-Gaekvonoia diagnosztikai szakaszának. Általában azonban a primerek pontos komplement árit ássál rendelkeznek! kivételt képez az az eset, ha namkomplementor nukleotidok vannak jelen egy előre meghatározott primor-véghalysotben, amint orré már előzőleg kitértünk,
Sszel kapcsolatban megemlítjük azonban, hogy bizonyos körülmények között egy diagnosztikai primer eztenziós termékének a szintézise még abban az esetben is beindulhat, ha egy neakomplementer ^«-helyzetű terminális maradék van jelen· Bz túl a nem természetes jelenség előfordulhat alacsony hőmérséklet alkalmazása eső tón és kiküszöbölhető a hőmérséklet emelésével! túl hosszú lűkubáaióa/hőkozelési idő osotón, amikaris kiküszöbölhető ennek az időnek a csökkentésével} tel magas sókonoentréoió alkalmazása esetén, amikeria kiküszöbölhető a zé29 koncentráció ojökkentésével) túl nagy. enzimkonöentráció esetén· ha egy xiukloozld--tx,ií‘oszfát^k túl nagy a koncentrációja· ha nem megfelelő a pH vagy nem megfelelő az oligonuklootid prisarnek a hosszúsága· Mindezek a kérdések ismertetősre kerültek a 237 562« sz· európai szabadalmi közzétételi leírásban# ·>
Abban az esetben· ha jelentős mértékben képződnek mesterséges termékek· valószínűleg előidézik a reakolóhőmérséklst ttl nagy mértékű osökkenéaét, aminek eredményeként nincsenek szigorú előírások például a reakcióolegynek a termikus körfolyamatból való eltávolít ás ám,sőt például polimerizáló szer - például Taq. poümsráz - adagolására, főleg az első re akcióciklusban· ág előbbieken kívül azt tapasztaltuk, hogy ilyen mesterséges utón jelentkező eredményük felmer ülhetnek egy olyan diagnosztikai primer alkalmazása esetén, amely különösen gazdag G /guanóéin/ és 0 /citldln/ maradékokban· Ebben a vonatkozásban nehézségot okozhat egy diagnosztikai primer, ha egészére az jellemző, hogy G/C-ben gazdag, illetve különösön akkor, ha G/C-ben , illett· különösen abban az esetben, ha releváns véghelyzetében — rend»* szerint a 3· véghelyzetben - gazdag G/C-ben· Sőt, abban az osetben, ha diagnosztikai prímért alkalmazunk, a releváns végcsoport
- általában a 3· végcsoport - szakaszán végbemenő bázispárosodáe pontos lefolyása, Jellege is okozhat mesterségesen előidézett következményt* Xgy például abban az esetben, ha ás /adonozln/ van Jelen a báaispárosodáskor a diagnosztikai primer releváns
- általában a 3· - véghelyzetében, és ennek eredményeként javul a specifikusság) ugyanakkor a Gs /guanozin/ jelenléte nem tess jótv Továbbmenve, a diagnosztikai primer releváns - általában 3* - véghelyzetében végbemenő hibás bázispárosodás pontos mikéntje fontos tényező lehet abbén a kérdésben, hogy kapunk-e * 50 ▼agy oqhl mesterségesen előidézett következményt» így például egy AA vagy 0f hibás párosoddá rendszerint nem eredményes hibridiaá^ elé·, de egy Gf rogy AC hibás párosodás eredményezhet elegendő mértékű hlbridiaálést ahhoz, hogy mesterségesen előállított termékek jöjjenek létre· A mesterséges következmény okot el lehet kerülni egy vagy több hibás párosodással létrejött mrdékok {szándékos bevezetésével, illetve - amennyiben szükség van rá - a diagnosztikai primeren belüli ctelécióktaxl vagy beillesztésekkel, hogy destabilizáljuk a prímért azzal, hogy tovább csökkentjük a kötést a hibridizálás folyamán· hibás így például az egy terminális porosodáskor szerepet játszó 10 vagy például hat nukleotid közül bármelyik vagy akár több Is megváltoztatható további hibás párosodás beépítésére· A terminális hibás porosodáson kívül általában osak egy további hibás párosodás szükséges, elhelyezve például egy, kettő vagy három bázist a terminális hibás porosodásból· így például az oU antitripszln gén Z üllőijével összefüggésben egy normál homozigóta, hoteroaigóta vagy megtámadott homozigóta jelenlétének ▼agy hiányának a kimutatásával kapcsolatban azt tapasztaltuk, hogy jó eredményeket lehet elérni abbán az esetben, ha a >· terminális nuklootidból a harmadik nukleoticLot kicseréljük /megváltoztatjuk/, hogy egy szokásos hibás párosodási idézzünk elő· Így például azt tapasztaltuk, hogy abban az esetben, ha a diagnosztikai primer 5* véghelyzetéből harmadik nukleotidként egy A helyett egy 0 van jelen* könnyen meg lőhet különböztetni normál homozigótákat, hetarozigótákat és megtámadott homozigótákat a Z alléi tekintetében· A diagnosztikai primer legkedvezőbb fel* építését igy meg lehet határozni az előbb említett kritériumokon alapuló közvetlenül végzett kísérlettel, amely bőven nem haladja meg egy gyakorlott molekuláris biológus képességeit· — 51 —
A”diagnoeztikai primer** kifejezést olyankor használjuk a leírásunkban, amika? a primőrnek van egy nukleotid {szekvenciája, amelynek a terminális nukleotldja vagy a feltételezett vatiáns-nukleotidnak vagy a megfelelő normál nukleotidnak a komplementere· Ilyen médon a diagnosztikai primőrnek egy extonziós terméke képződik abban az esetben, ha a diagnosztikai primer terminális nukleotidja komplementere a célbázis-ezokvencia megfelelő diagnosztikai szakaszában levő megfelelő terminális cukid— otidnak· Bem szintetizálódik azonban ilyen extonziós termék abban az esetben, ha a diagnosztikai primer terminális nukleotidja nem homológ a oélbázlo-ozekvencia megfelelő diagnosztikai szakaszának megfelelő terminális nuklootlójával· beírásunkban az empliflkáoióo primer” kifeje zéssel olyan primerekre utalunk, amelyek képesek hldridizálódni ahhoz a nutolelnsavszálhoz, amely komplementer© annak a nukleins&vszálnak, amelyhez a diagnosztikai primer képes hldridizálódni· Az ουψlifikáolós priEor<Hiek van egy nuklootidszekvenoiája, amelynek révén képes hibrid!zálódni egy diagnosztikai primőrből keletkezett extenziős termékre a komplementer jétől való elválasztás után. így a diagnosztikai primer extonziós terméke templátként szolgál az amplifikáoiós primer egyik extonziós termékének a szlntézéséhoz, megkönnyitvén ezáltal a láncnövekedést· találmányunk az előbb említettek szerint - legalábbis részben - azt a célt szolgálja, hogy jobbá tágye a láncnövelési eljárásokat, igy például a 257 562. ez,· európai szabadalmi közzétételi leírásban ismertetett eljárást, amely találmányunk szerint javítva lehetővé teszi, hogy szelektíven növeljük akár egy feltételezett variáns-nuklootldct tartalmazó szakaszt - ha jelen van akár a megfelelő normál nukleotidot tartalmazó szekvenciát - amennyiben jelen van. Ilyen módon egysierüsödlk
- 32 a detektálás, ugyanakkor elkerüljük a ssekventálódást, as allél-speolfikus nakleotidokat ée a restrikciós digorálást· így Így egy adott nuklootid-variáoiómk - például pontmutációnak a jelenlétét vagy a hiányát ki lehet mutatni akári
1/ egy olyan felépítésű diagnosztikai primőrrel, amelynek van egy olyan megfelelő terminállá nukleotidja, amely kompiamén· tere a feltételezett nukleotid-variációnaki olyan módon, hogy egy lánonöveléssel létrejött termék jelzi a feltételesett nutolootid-vuriáció jelenlétét, ennek a lánonövekedéssel szintetizálható terméknek a hiánya viszont jelzi a feltételezett mik— lootid-variáció hiány át ι
2« egy olyan felépítésű diagnosztikai primőrrel* amelynek van egy olyan megfelelő terminális nukleotidja, amely komplementere a megfelelő normál nukleotidnakj ilyen módon egy láno· növekodéaes termők szintetizálódása jelzi a feltételezett nutoleotid-variáeió hiányát, illetve önnek a lánc nőve kedéhea terméknek a hiánya jelzi a feltételezett nukleotid-variáció jelenlétét · Szzel kapcsolatban megemlítjük, hogy leirásunkbm a/ megfelelő terminális nukleotid a primőrnek azt a terminális mxkleot iáját jelenti, amelyből kiindulhat a szokásos szintézis, amennyiben lehetőség ven rá· így minthogy általában a polimert— aálószer indítja a szintézist a primőr 3· véghelyzetőben, a megfelelő terminális nukleotid általában a 3· helyzetű terminális nukleotid lehet·
Például egy adott pontmutáoió meglétének vagy hiányának az igazolására el lehet fogadni az előbb ismertetett 1/ és 2/ alternatív magoldások mindegyikét· i'nnek a kőt módszernek & kombinálása a hetarozigóták detektálására agy olyan módszert biztosit, amelyet jó eredménnyel lehet használni domináns örök· *35lettes állapotok elemzésére és rocessziv örökletes állapotok hordóséinak a kimutatására·
Találmányunk egyik előnyösen alkalmazható megvalósítási módja annak a detektálására szolgál, hogy egy ugyanazon mintáiban jelen van-e vagy nincs egynél több feltételezett variáns-nukleotid, A találmányunk szerinti eljárásnak as a jellemzője, hogy képesek vagyunk alkalmazásábal szelektíven növelni szekvenciákat a diagnosztikai primerek előre meghatározott nukleotid szekvenciájától függően, lehetővé teszi, hogy többszörös láno* növekedéssel keletkezett termékeket ogyazerüon, pontosan, minimális jártasságot feltételezve megkülönböztethessünk· így találAányunk jól alkalmazható módszert biktosit arra, hogy egyetlen mintában egyszerűen vizsgálhassuk meg a többszörös zmkleotid-vari Adókat* Találmányunknak ezért különös jelentősége van egyetlen W- vagy KKS-minta kiszűrésében egy sor örökletes állapottal kapcsolatban! igy például különböző betegségeket előidéző genetikai rendellenességekkel, hajlamokkal és szomatikus mutációkkal kapcsolatban· így bHS-t vagy i<NS-t ki lehet vonni vérből vagy szövetanyagokból - igy ohorionio villi-ből vagy amniotikns sejtekből számos megoldással» Ilyen megoldásokat ismertetnek Maniatis és társai / Molecular Cloning, 280-281 /1982/ /· «zen túlmenően, amint ismertté válik további örökletes feltételekkel kapcsolatosan a molekuláris magyarázat, ezeket a további föltételeket /állapotokat/ egyszerűen be lehet építeni a találmányunk szerinti szűrővizsgálatba·
A többszörös láncnövekedés eredményeként létrejött termékeket számos megoldással lehat megkülönböztetni· így például vizsgálni lőhet minden egyes feltételezett amplifikált termékre· Sbbon az esetben minden egyes minta különböző és megkülönböztethető jellel van ellátva, illetőleg olyan maradókot hordoz.
omoly képes jel létrehozására·
Ilyen jelöléseket és jelzést adni képes maradékokat ismertetünk részletesen a 246 664» sz« európai szabadalmi közzétételi leírásunkban, de ide tartozhat a szilárd fázisú láncnövelési módszer, aaslyet Wang 0,G, irt le a world Bioteoh kapart 1986· évi 2· kötetének 2« részében a 3>-57, oldalakon / a kan Franciscóban 1986 novemberében tartott konferencia. közleményeit fiiagnostics Bealthoare Pioceedings /, amely szerint több kiválasztott nyomelemmel készített Mkrogyöngyöket használtak fel a vizsgálat hoz, a mintával együtt· Speciális minták jelenlétét Bont* gen-sugár fluoreszcens analízissel lehet detektálni· Ilyen módszereket általában egyszerűen és közvetlenül lehet alkalmazni, minthogy inkább csak egy lánchosszabbitással keletkezett termék jelenlétét kell kimutatni, mintsem hogy különbséget kelljen t»»· ni szekvenciák között egy olyan kicsi valami alapján mint amilyen egyetlen nuklootid· á lánznövekedéssel keletkezett termékek megkulönoöztotésére egy sokkal egyszerűbb és célszerű módszer szerint kiválasztjuk az amplixikűöiós primerek nukleouid szekvenciáit annak alapján, hogy a találmányunk szerinti eljárás megvalósítása során keletkezett minden egyes termék hosszúsága különböző· Ezzel összefüggésben az egyes amplifikációs termékekben jelen xevő bázispárok számát a diagnosztikai és az amplifikációs primerek közötti távolság határozza mag· így az amplifikációs primőröket úgy lehet ”tervezni, hogy minden egyes potenciális vuriáns-nutoleotid különböző hosszúságú potenciális amplifikációs termékkel legyen társulva·
Bgy adott potenciális variáns-nukleotid jelenlétének vagy hiányának a kimutatása Így célszerűen eloktroforetikus eljárás• · · · · · · · · • ··· · ··· ·· • · · · « · ~ 55 * kapott» sál oldható meg, amely szerint a különböző ampliiikált tevőékeket szelektálni lehet molekulatömegük alapján» és igy azonosítani lehet őket például autoraóiografikus vagy fluoreszcens eljárásokkal· a különböző termékok molekuláinak a hosszúsága csak egyetlen nukleotiddal törhet ol egyes esetekbeni előnyé* sebb azonban» ha a hosszúságok legalább három, nukleotlányiban térnek el egymástól· A találmányunk szerinti eljárás végrehajtásakor előnyös hatású vulamilyon színezék - például otidiumbromid közbeiktatása» ámenéiben a színezéket ultraibolya besugárzással láthatóvá lehet tenni narancs fluoreszcencia révén· Ilyen módon, ha egyetlen mintában több potenciális variáns-nubleotid van jelen, a puralitás megléte vagy hiánya gyorsan» pontosan ée könnyen meghatározható·
Abban az esetben» ha szükséges» a diagnosztikai prlmer/eko/t és/vagy az amplifikációs prlmorjíeke/t mar kir ózni vagy jelölni lehet valamilyen xluorofór alkalmazásával· így például minden egyes diagnosztikai primőr vagy amplixikáoiós primer egyegy különböző fluor óiért hordozhat} igy egy vizsgálatsorozat ere&menyei például lézerscannerrel kiolvashatók egy elektroforetikus gélből és ezzel lehetővé válik a találmányunk szerinti eljárás automatikussá tétele·
Alternatív megoldásként egyszerűen lehet következtetni egy láncnöveléees termék jelenlétére vagy hiányára egy olyan oldószer alkalmazásával» amely oldószer szelektíven képes oldani a nukleozid-trifosafátokat, de nem képes oldani a nukleotid szekvenciát /például a Wá-t/· Ilyen oldószerre példa a trlklóyeoetsav /fCA/ · így például egy ampliiikált termék jelenlétét vagy hiányát meg lehet határozni triklór-ecetsavas kicsap pmjsal a lánchosszaobitás után kapott reokcióelegyből· Aboon az
- 56 esetben, ha megtörténik a megfelelő nukleozid-trifoszfáS^beépü* lése egy exponenciális reakciósoroaat során, lényegesen nagyobb mennyiségű triklór-oeetsavban oldhatatlan anyag less Jelen mint abban as esetben, amikor nem ment végbe a diagnosztikai primer láncának a növekedése·
Az oldhatatlan anyagot mennyiségileg ismert módszerekkel meg lehet határozni· így például a aukleozid-trifoszfátokat mag lehet Jelölni - például radioaktív vagy fluoreszcens markelre!/» a reakcióelegyet alá lehet vetni például centrifugáiéinak, a Jelenlevő folyadékot el lehet távolítani dékántálássál és akár a folyadékot, akár az oldhatatlan terméket alá lehet vetni valamelyik megfelelő kimutatási vizsgálatnak, például radioaktivitást lehet mérni szémlálóberondoséssol vagy meg lehet hatáBozni a fluoreszcenciát·
A találmányunknak egy további lőhet őségé szerint elő tudunk állítani egy mintegy 5 - 50 bázispárból álló nukleotid szekvenciát a találmányunk szerinti felhasználásra· Snnek a esete* venciának egy terminális nukleotidjánek komplementernek kell lennie akár az ismert genetikai rendellenességgel kapcsolatos feltételezett variáns-nukleotid, akár a megfelelő normál nuklaovid számára· Az említett szekvencia maradékának lényegében ki kell egészítenie a feltételezett variáns melletti megfelelő célbázis-szekvenciát vagy a megfelelő normál nukleotidot· Az említett nukleotid szekvenciának olyannak kell lennie, hogy abban az esetben, amikor a találmányunk szerinti eljárás során diagnosztikai primőrként alkalmazzuk, a diagnosztikai primer oxtenzlós terméke jöjjön létre szintézissel, ha a diagnosztikai primer említett terminális nukleotidja komplementere a célbázis-szekvenclában levő megfelelő nukleotidnak, illetve ne • · · · • ··· · ·«· ·» • · · · · • ·· ·· ···««· «· * 37 jöjjön létre szintézissel extenziós termék abban az esetben* ha a diagnosztikai primer említett terminális nukleotidja ma komplementere a céroázis-szekvenciában levő megfelelő aakleotidnak.
Kedvező, ha az akár egy feltételezett vurláns-nukleotldot» akár a megfelelő normál nukleotidot kiegészítő terminális nutolootid a nukleotid szekvencia 3» véghely setében van· Célszerű, ha a feltételezett variáns nukleotid a megfelelő normál szekvencia pontont adójából származik.
Áz említett nukleotid szekvencia lehet például 10 «· 50 bázispárből, például IO-36 bázispárból allé·
A találmányunk szerinti megoldásnak négy további lehetőségével olyan nukleotid szekvenciákat tudunk biztosítani mint amelyeket éppen as előbb definiáltunk· illetve olyanokat* amelyekben a nukleotid szekvencia terminális nukleotidja komplementere egy olyan variáns-nukleotldnak, amely úgy Jön létre, hogy a megfelelő normál nukleotid /1/ A-vá, /11/ ű—vé* /iii/ C-vé, /ív/ T-vé vagy ö~vé változik egymást követően.
A találmányunk tárgyát képező eljárás további lehetőségei szerint két, az előzőkben definiált nukleotid szekvenciákból álló sorozatot tudunk létrehozni. Az egyik szekvencia egy terminális nukleotidja komplementere egy olyan feltételezett v&riána-nukleotidnak* amely összefüggésben áll egy ismert genetikai rendellenességgel* a másik szekvencia egyik terminális nukleotidja pedig komplementere a megfelelő normál nukleotid^ nak.
A találmányunkkiual kapcsolatos egyik további lehetőség szerint olyan mintákat lehet készíteni, amelyek egy olyan, az előzőekben már meghatározott nukleotid szekvenciát tartalmas- • ·· w ·«·« ·· ··«*···«.
• ··· · ··· ·· • · · · · · ··· ·· ··· ··· ««
- 38 nak, amelyek egy jelzett vagy markirozott komponenst foglalnak magukban·
Példaként részletezzük a következő genetikai rendellenessé* gokat, rámutatván azokra a mutációkra, amelyek felelősek” a rend· ellenességokért, valamint isnmrtetvén minden egyes mutációra a megfelelő szakirodalmi helyet. Amint már az előzőekben definiáltuk' nukleotid szekvenciák és minták alapulhatnak például a továbbiakban részletezésre kerülő genetikai rendellenességeken! a megfelelő nukleotid szekvencia vagy minta szekvenciája a táblázatban megadott megfelelő szakirodalmi helyeken megtalálható·
X· táblázati Genetikai betegségeket okozó mutációk / A e autoszomális /
| A betegség neve | Mutáció | Irodalmi hivatkozás |
| Antitrombin XXX hiány | GG-*TG | Duohange és muakatáreali Muoleid Add Beseardh* Μ· 2SÖ8 /1986/ * |
| Amilcidotikus | og-^ga | Mazda 8» és munkatársait Mól. |
| polineutropátia | BMl. MM. 329 - 538 /1986/ | |
| AG-^GC | WaUaoe Μ. R. és munkatársaii J· Glin Invest, 2£.6 - 12 /1986/ | |
| Αβ-^GG | Wallaoe M. R. és munkatársait Journal Clin. Xnvcat* jjft· 6 - 12 /1986/ |
I. táblásait Genetikai betegségeket okosé antáolók / 1« folytatás /
| A betegség neve | Mutáció | Irodalmi hivatkozás |
| Alfa-l-antitripszin | TG->QG | Hukiwa T. és munkatársai |
| hiány | Journal Mpl. Chemt jggl· 15 W - 15 99* /1906/ | |
| · | QG—?GA | Kidd V.J. és munkatársait Natúré, JSí. 230-234 /1983/ |
| GAT-^GTT | Asp 256 * Val, Sxon III. nem publikált | |
| GfflB-^GTG | Godon 51 deléolója /normál/, M. Halton, megjelenés alatt | |
| GGO-^TGO | Arg^ Gye, Bxon II1 X variáns, nem publikált | |
| Adenozin hiány | CG-*3A | Bonthron D. T. és snnkstársait Journal Glin Invest ía· 894 - 897 /1985/ |
| AA-tAG | ValMlo D. fa ninkatteoali ΒΜΒΘ 3 5. 113 - U9 /1986/ | |
| ŰWÖG | Valerio D· és munkatársait SMBO J JU 113 * 119 /1986/ |
I* táblázati Genetikai betegségeket okosé mutációk / 2« folytatás /
| A betegség neve | Mutáció | Irodalmi hivatkozás |
| Apolipoprotein S hiány | GT~?GG | Cladaras és munkatársaiι Journal Bioi# Ohem. 262* 2510 - 2515 /1987/ |
| Dlábetes mellitus, enyhe | TC-700 | Haneda M. és munkatársait Itroc* Batl· Aoad. Bei· USA 80. 6566 * 6570 /1985/ |
| τσ-^β» | Shoelson S. és munkatársait Satura, jfía· 540 · 5*5 /1985/ | |
| • | TG—?TT | Shoalson S. és munkatársait Matúra, Jfig. 540 - 545 /1985/ |
| Gmohe»*be tagság* 2· típus | 0®~?00 | Tsui 3. és munkatársait M. sngl· J. Mád· 570 - 575 /1987/ |
| W<paw4nnw 1¾ * családi | CG-^OA | Shibasaki I# és munkatársait J. Olin. Invest, 2& - |
- 560 /1985/ • 41
1· táblásat* Genetikai betegségeket okosé mutációk / 3« folytatás /
| A betegség neve | Mutáció | Irodalmi hivatkosás |
| Hiperlncsulinémia, családi WWrW | CA-^GA | Chan 3* J, és munkatársait £roo· Kati· Acad« Sói USA, 84· 2194 - 2197 /1987/ |
| Iazaunoglobolin kappa hiány | Of-^OG CG-^BG | stavnaser - Nordgren J· és munkatársai* Soienoe«£3&· 458 - 461 /1985/ stavneser * Nordgren J. és Munkatársait Soienoe, 458 - 461 /1985/ |
| LDL-receptor-hiány | GG-^GA | Xiehsman M«Á· és munkatársait Oell, £L· 755 * 7*3 /1985/ |
| Osteogen··!· iqpertseta / IX. típus / | 16-^H | Oohn O«B· és munkatársait ftroo. Kati Acad Sci USA, M* 6045 - 6047 /1986/ |
| fenil-ke ton-uria | Afi-?AA | Dilella A,G. éa munkatársait |
Bátoré, Jg^· 799 - 803 /1W • · · ·
- 42 *
I· táblázati Genetikai betegségeket okozó ontáoiók
| / 4« Iolj«a«ée / | ||
| A betegség neve | Mutáció | Irodalmi hivatkozás |
| 7eniWroto»-uria | CG^TG | Bilella A. G. és munkatársai ι Bature, 237. 5» - 356 /1967/ |
| Protein 0 hiány | CG-zTG | Homeo G, és munkatársait Proo· Háti· Aoad· Sói· USA, fiát· 2629 * 2652 /1987/ |
| GG-^GO | Rómeó G· és munkatársai* Itoc, Kati· Aoad. Sói· USA, fii· 2829 - 2652 /1987/ | |
| Purin nukleosid foss- | TG-^TA | WiUiams S«B· és műnk»· |
| forilás hiány | tteMl· j. Mól. Ota>. á&· 2538 - 2539 /1987/ | |
| Sarlósejtes anémia | GáG-^MEG | Chang J· 0· és Kan Ϊ. W«i |
Láncot, 2* 1127 - 1129 /1981/t Orkin S*H. és snnkatázsaii Hew Bng· J· bed· JgZ> 32 - 36 /1982/1 és Gonner B«J«, valamint
I. táblásait Genetikai betegségeket okosó mutációk / 5.» folytatás /
| A betegség név* | HutAcló | Irodalmi hiwtkosás |
| munkatársait Proc» Ball· Aoad· Bei· USA, 80* 278 - 282 /1985/ | ||
| fangier-betsgeég | AB-^AS | Law se»> Btrewer H*B»i J, Mól· Chem. 12 810 - 12 8JA /1985/ |
| Xrlósfossfát isomsrás hiány | AIWAC | Sara 1,0· 4» aiakatteait Proa. Kati. AoadU Sói. HSA &. 79O>79<>7 /19MZ |
UroporfiMmogén dskamboxilás hiány
GG-2GA De Verneuil H« ás nemkatársali Science» üt·
752 * 73* /1906/
XX, táblásait BX -el kapcsolati» betegségek
| A betegség neve Gén ifiül áöió | Irodalmi hlvatkosáe |
| BeMtlUa A Vokt«r VUX σβ-?Η>/24/ | Gitaohiar J. és munkatársai t Natúré, 315· 427 * <50 /1985/ |
| CG~?TG /26/ | Gltsohier 39 és munkatársait Natúré, 315· 427 - 4J0 /1985/ |
OG-^TG /ifi/ Antonarakis éa onn*
| GG-^CA /26/ | katársait N. Nngl, Med. 842 · 848 /1985/ Gitschier 3* te munka· társait Scienoe, 2321415 - 3416 /1986/ |
| OG-^TG /18/ | Xoussouflan H· és winkatársait Natúré, Jgl· 380 - >82 /1986/ |
| CG-^TG /22/ | Xoussoufian H* és munka· társait Matúra, 380 - 382 /1986/ |
| 0Gc?TG /22/ | loussoufion H· és munka· társait Natúré, jat· 380 - 382 /1986/ |
II. táblázat* BJUezel kapcsolatos betegségek /folytatás/
| A betegség neve | Gén | mtáoió | Irodalmi hivatkozás |
| Hemofilia B | faktor IX OG-^CA | Bentley á*K· és munkatársai* Coll, *£· -348 /1986/ | |
| GT^TT | Rees D.J.G. és munkatársai* Natúré, 316« 643 - 645 /1986/ | ||
| GA^GG | Davis I»«M. és munkatársai i Blood, 60· 140-143 /1987/ | ||
| III· táblásat* | |||
| Mutáns osztály | Típus | Referencia |
a/ fiemfunkoionálie aHHS nonsens—mut ánsok /1/Kodon 17 /A T/ 0 Chajog# J« 0. és munkatársai* Proc· Kati* áoad· Sói· USA 76· 2886 /1979/ /2/ Kodon 39 /0 2/ 0 Treoartin R.X. és munkatársai· J. onn· Invest., • · — 46 —
XXX· táblásat! Béta-thalassaarnia /1, folytatás/
| Mutáns osztály | Típus | Irodalmi hivatkozás |
| 1012 /1981/ és Ghshab ?·?«, valamint munkatársai! Lenőst ii 5 /1986/ | ||
| /3/ Kodon 15 / G-*A/ | 0 | Kasazian H4U és munkatársait Búr· Moloo* Bioi· Org· Journal, JU 595 /1964/ |
| /4/ Kodon 37 / G-^A / | 0 | Beáta 0(0. éa annkatteaalt Blood, Ö2. 1185 /1986/ |
| /5/ Kodon 121 / G-^J / Frameshlft-eutánsok | 0 | Kasaslaa és munkatársait ám· J· Bum. Génét·, jg· 1860 /1986/ |
| /6/ · 2 Kodon 8 | 0 | Orkin S«H· és munkatársait J· Mól· Chem« £56· 9782 /1961/ |
| /7/ * 1 kodon 16 | 0 | Kasazian H«H· és munkatársait Búr· moloc« Mól· org· J. da 595 /1984/ |
| /8/ - 1 kodon 44 | 0 | Klnnlbngh A«J · éa munkatársait Nuolelo Aolds Rés·, M· 5421 /1962/ |
| /9/ - X kodonok 8/9 | 0 | Kasazian M. és munkatársai* ®®*· moleo· Bioi· org· J·, 1· 595 /1984/1 és w©ng 0«, |
• · ·
-47 III· táblásat t Bóta-thalassaamla /2· folytatás/
| Mutáns osztály | Típus | Irodalmi hivatkozás |
| valamint munkatársait Proc· Háti# Aoad· Sói· USA, 6529 /1906/ | ||
| /10/ - 4 ködőnek 41/43 | 0 | Kasasian B«B« és munkatársait Sur· noleo· Bioi· org. *·, Ja 595 /lWi és Kimura A·,valamint munkatársáli J· Bioi* Chem· 258· 2748 /1985/ |
| /11/ - 1 kodon 6 | 0 | Kasaslan H«M· és társait Am, y, Bum· Gsnet., J5l· 1028/1985/ |
| /12/ ♦ 1 kodonok 71/72 | © | Cheng T»C. és munkatársait Proo. Háti· Aoad· Sói· USA, &· 2821 /1984/ |
| /b/ UHS—feldolgozó mtánaok változások az illesskedéoben /1/ IVS 1 pozíció 1 GT~>AT © | Orkln S*H. és munkatársait Samura, £26. 627 /1962/, és Óraira·· 1·, valamink ramkakáxcaii aatmra, 591 /19BJ/ |
III· táblázati Béta-thalaazaemia /5. folytatás/
Hutáns osztály Típus Irodalmi hivatkozás —«—............. .......Kiteli /2/ XI® 1 poslGió 1 GT ÍZ /5/ IVS 2 pozíció 1 GT AT /4/ IVS 1 5»-véglwlyesti -17 bfr* zlspár /5/ IVS 1 3»-véghzly«Zt» -25 báziipár
Kasasian H«H· és maxikat ár sáli Sor* molac· Bioi· org· J·,
595 /1984/
Orkin S*H* és munkatérsáli Natúré, 627 /1982/| valamint Steelaman R* és munkatársaii Oell, 9Θ5 /1982/
Bonn H#y. és munkatársai i Haemoglobint molecular genetio and clinioal aspeots, 285* oldal /áaundsrs, Philadelphia, iw
Kasasian ΗΛ és lounkatársals Sut. moloo· Bioi* org, ^·> Je, 595 /19te/l valamint Orkin S<H* és munkatársait J, Bioi· Oboa· 258* 7239 /1985/
Padanilam és munkatársait ám« S* Hmtol·, 259 /1986/ /6/ IVS 2 s’-véghelyssti AQ 0® • · · · • · · • · · • ·
XIX* táblázati Béta-thalassasmia /4* folytatás/
Kutáns osztály
Típus Irodalmi hivatkozások
| /7/ IVS 2 3*-véghelyzeti as-xjg | 0 | Antosarakis S*3* és munkatársai* >xoű< Háti# Aood* Sói, USA, 1154 /1984/ |
| Konssensusváltosásokt | ||
| /8/ XVS i pozíció 5 /ű-70/ | ♦ | Kasaalan H*H* és nsunkatársáli Sor· moloc· Bioi* org* J·· 593 /1904/, valamint űsoiataan B* és munkatársai: Bature, 302» 591 /1983/ |
| /9/ X<8 1 pozioió /G-o?T/ | 0 | Wong C* és munkatársait froo* Natl* Acad* Sói, USA, fii* 6529 /1986/, valamint Atweh G*/* és munkatársait Buolsio Acids Sea· M· 777 /1985/ |
| /10/ IVS 1 poiioló 6 /T^C/ | ♦ | Orkin S*H* és aunkatárdaii Satun·, SS&9 SX? /1982/1 valamint Atweh G*F* és munka társ sít Am* J* Hűm* Gtot*, 85 /1986/ |
III· táblázat ι Béta-thalassaemia /5, folytatás/
| Kutáns osztály | típus | Irodalmi hivatkozások |
| Belső IVS-vőltozásokt | • | |
| /11/ IVS 1 pozíció 110 /Gw | ♦ | Westawey ΰ> és munkatársait Buoleio Adós Bee· & 1777 /1981/ |
| /12/ IV8 2 pozíció 70$ /t->G/ | ♦ | Dobkin 0· és munkatársait iroc· Kati, Aoad# Sci· USA, fig· 1184 /1985/ |
| /15/ XVS 2 pozíció 7*5 /0-W | ♦ | Orkin s*H· és munkatársait Natúré, 627 /1962/, valamint ITeisnan R. és munkatársait Betűre, JÖfi· 591 /1985/ |
| /14/ IVS 2 helyset 65* /0-^1/ | 0 | Cheng i»C· ée munkatársait Rroo· Háti. Aoad. Sói· ÓBA, fii· 2821 /19»!/ |
| /15/ IVS 1 helyaet 116 /T-W | T | Veingold S<A* és munkatársait Ann* b«I« Aoad· Goi· ftífi· 159 /1985/ |
A regionális szubsztitúciók kódolásai /16/ kodon 26 /Ch-^A/ fS«X>* és munkatársait
J. Ved· Génét· /1986-ban kerül s^jtó alá/ és Orkin
Hl* táblázat* Béte—thalaszaomia /6. folytatás/
| Mutáns osztály | n$ue | Irodalmi hivatkozások |
| S»H· és munkatársait Haturs, J2Ö· 768 /1982/ | ||
| /17/ lwíon » | ♦ | Goldsmlth és munkatársait ' ' * · s . » taoc· Háti· ácad· Sd· USA, gg. 2J1B /1985/ |
| /W kodon 27 /G-t>T/ | Orkin S«H· és munkatársait | |
| Knossos | Blood, 311 /1984/ | |
| /0/ Trans«talpaló# natánsokt | ‘ - V | |
| /1/ -88 0-t« | ♦ | teng 0. és munkatársait taoo· Háti· Aoad· Bal. ÜSA, S&> 6329 /1966/ | Orkin S«H· és munkatársait J. dől. Ohem· 259. 8679 /1984/ |
| /2/ -87 0-^G | ♦ | Orkin 8«M, é# munkatársait .«1 Natúr#, 296· 627 /1982/, valamint Trsisman B. és munkatársait Hature, 302 · |
| 591 Λ983/ | ||
| /3/ -51 Ateö | ♦ | Taklhara 1« és munkátár* sala Blood, 5*7 /1986/ |
• · ·♦ · · · ·· · · · • · ·· ·· • · · · «····· ·«
- 52 *
III» táblázati Béta-thalassaamia /7« folytatás/
| mtáns osztály | Tipus | Irodalmi hivatkozások |
| /4/ -29 A-^G | ♦ | Antonarakis 8*3· és munr kát ácsait Proc· Kati· Acad· Sói· USA, 1154 • /1984/, valamint Hong 0· és munkatársait Proc· Kati. Aoad· Sci. USA, 6529 /1986/ |
| /5/ -28 A-*0 | ♦ | Smxag 3» és aunkatáseal, J. Bioi. Ohenu, £ö2. 650? /1935/ |
| /6/ -28 A-^G | ♦ | Orkin &·&· és munkatársait Hucleio Aoida Bes· 21· 472? /1983/ |
| /0/ Poliadenileső mutánst | ||
| /1/ 1ATAAA~>AACAAA | ♦ | Orkin $·&· és munkatéraal« Bu>. nőies. Bioi, őre. 3., 4. 455 /1985/ |
/e/ Doléciók /2/ /-619 báaiapán/
Spritz 1y»a· és munkatársait Hucleio Aeids Bee·
20· 8025 /1982/, valamint
Orkin S«B· és munkatér- 53
III. táblázati Béta-thalassaemia /ö. folytatás/
| Mutáns osztály | Tipufl | Irodalmi hivatkozások |
| saii Proc· Háti. Acad. Sci. OSA, 2δ· 2400 /1979/ | ||
| /2/ 5’^ /-1,35 kilobázis/ | 0 Mbf | Padanilan B«J· és munka- |
| ttasali Blood, 9Λ /190»/ | ||
| /3/ (í /-10 kllobáola/ | 0 Hbf | Gilman J «&· és munkatér· sait Hasmat·, 56. 339 /1984/ |
* o béta-thalassaoMa mutáns //£*7, aroly mérsékli a béta-globin-láncok képződését « egy olyan «utána /B°/> amely mögszüntcti a ^-globin-lánook képződését
Deléciékra példákat leköt találni a következő szakirodalmi bolyéként
- forrást s«M«f Croas G>0«, Speer a, Gardner-Medoin Dm Bura J· és Davlos KJM Preferenciái deletion of axons in Buohonne and Beakor musoular dyjtrophiea, Natúré, 320. 638 » 640« / Sxonok preferenciális doléciója a Ducheom és a Beckar-féle iaaasorvadáeokban· //1987/·
- Koenig M*y Hoffman Β·>Μ Bertselson 0< Monaco Α·Ρ·, fsenor 0» és Kunkel 14U Complote oloning of the
Duchenne naiscular dyatrophy /W oDM and prellmlnary genomic organisation of the kHb gens in normál and affeo • 5* ted indiviouals, Coll# 50* 509 - 517 /1907/· /A Buchenns-féle izomsorvadás /3MD/ cD®S teljes klónozása és a DMD gén előzetes genomiálls organizációja normális és beteg egyénekben#/
- Malhotra S#B## Kart K#A#9 Klausil? H«J«9 Thoaas N# 8# Tt|
Bodrog s#st, Burghez a«H*m*9 Bobraw M## Harper fhompson
M#w«# Bay P»S· és Aorton R.G.i framo-shift deletions in patients aith Bnchenne and Beakor zusmlar dystrophy» Saienoe# SŰ&·
755 · 759 /1988/· /Aeretdeléoiók Duahonne- és Becker-fóle lzcasorvadásban szenvedő betegekben·/
- Bead a#p#9 Mountfczd R.C·# Varrest s#B## Kensrick s«J#t Davies K#E# és üarris B#i Vettetne of azon deletions in Duchenno and Beoker msoular dyatrophy# Hm· Gonot·, 152 - 156 /1988/· / 3xon»dölóciós minták a Duchenns- és a Beaksr-f éle izomsávvá» dánban·/
- Chamberlain J#S## Gibbs B#A## Ranier J#l·# Rguyen J?#B# és Oaokoy c*T»t Delotion sazeening af tbe BED locus via multiplex HU amplifioation, Βηα· Αα· Boa## ifc· 25· 11141 - 11156 /1988/· /A PhD loknos deléciós vizsgálata többsaörös IHCJ-lánonövelésen kereaztül·/
- Bobért» R#G## Oale 0»G·# Bárt K#A«# Bobrow M# és Bentloy 3«R«s Rapid o&rrier and prenatal diagnosis of Duohenne and Becteo* smscular dystrophy# Ηηα· Ao# Bee·* X2· 2 811 /1989/· / A Duohanne-és a Beoker-féle izomsorvadás gyors hordozó és prenatá» lis diagnózisa·/
Gyakran csak kis mennyiségű, genom 388 áll rendelkezésre az elemzéshez# Azt tapasztaltok# hogy diagnosztikai primőröknek a speoifiknseágát megfelelő normál vagy variáns nukleotid esek» venalákhoz megfelelően meg lehet becsülni olyan módon# hagy a • 55 hibridizációs mintában növeljük a nukleotid szekvenciamásolatok számát· Ezt el lehet érni például egy olyan kétszálae kazetta” készítésével, amely egy variáns szekvenciához csatlakozó normál szekvenciát tartalmas· Célszerű, ha a sscmszédoe szálakon lévő két nukleotid közötti hibás párosodás a kazetta közepe felé alakul ki· A kuzettamásolatokat megfelelő módon megkapjuk, ha a kazettát hevese tjük egy plasaid-gasdába, majd a plazmádét vepUkáljuk óz a keresett szekvenciát elkülönítjük· Az ozü el g műveletekkel kapcsolatos megoldások ismertek a szakterületeken· Bet a technikát megfelelően illusztrálja a 10· ábra·
Annak érdekében, hogy találmányunkat jobban megértessük, a következőkben ismertetjük a mellékelt rajzókra való hivatkozással, példaképpen*
Az 1/a/ és az 1/b/ ábrák a találmányunk első megvalósítási módját mutatják be· Az 1/c/ ábra egy ilyen vizsgálat tipikus eredményét mutat ja be elektroforetikucon· « '
A 2/a/ és a 2/b/ ábrák a találmányunk szerinti eljárás f t · második megvalósításl módját szemléltetik* t
A 3· ábrán egy célszerűen alkalmazható módszer látható a többszörös lánohosssabbitással kapott termékek megkülönböztetésére*
A 0/aZ és a 4/b/ ábrák a találmányunk szerinti harmadik megvalósítási módot szemléltetik·
Az 5/a/, az 5/b/ és as 5/c/ ábrákon tanulmányozható a találmányunk szerinti eljárás negyedik megvalósítási módja·
A 6· - nem mérethű - ábra as emberi 1 antltrIpszln gént Ismerteti*
A 7. ábrán as 1* és a 2· példák szerint előállított gél megjelenített formája tanulmányozható,
A 10» ábra bemutatja egy kazettás piaamid rendszer alkalmasását egy adott OS-duplas láncának növelése céljából,
A 11, ábra a találmányunk szerinti eljárás ötödik megvalósítási módját / a lineáris láncnövelést / illusztrálja,
A 12, ábrán az 5· példa szerint elkészített gél megjelenített formája tanulmányozható·
A 13· ábra a 6, példa szerint előállított gél megjelenített formája·
As 1, ábrán látható találmányunk első megvalósítási módja. Az 1/a· ábra denaturált genom DHS-azálakat mutat, amelyek egy normál nukleotidot /B/ tartalmaznak abban a helyzetben, amelyben - például valamilyen genetikai rendellenesség eredményeként jelen lehetne egy feltételezett variáns-mkleotid. Abban as esetben, ha a nukleinsavszálat hibridizáló körülmények között érintkeltetjük egy olyan diagnosztikai mintával, amelynek J^-helyzetü terminális nukleotidja a normál nukleotid /-K/ komplementere, akkor megfelelő nukleozid-trifoasfátok és a nukleozid-trifosáfátok políterizálására alkalmas szer jelenlétében a 3f-irányban bekövetkezik a diagnosztikai primer lánohosszabbodésa, amint es az 1/b, ábrán látható· Bem következik be ilyen lánonövekodés abban az esetben· ha olyan diaznosstikai prímért alkalmazunk* amely— nők a jhuvéghelyzetében levő nukleotídja komplementere a feltételezett veriáne-nuklootidnak Ak/· Szután a diagnosztikai primőrnek bármelyik lánonövekedéssol keletkezett termékét denaturálni lehet· Ilyen módon egy, a denaturált termékre hibridizálódott amplifikációs prímért /Á/ kapunk, hogy egy további lánonövekedéses termékhez jussunk· A lánonövekedéssel keletkezett terméket ezután denaturálni lehet, majd u folyamatot meg lehet * 57 isnátclai, további láncnövolés olórósc céljából.
Az 1/b. ábrán DG-vel Jelöltük a genom BűS-öok azt a részét* amolyan végbemegy az amplifikáció a diagnosztikai primőrrel. Az óbból a részből származó diagnosztikai termékek hozzák létre azokat a sávokat, amelyeket az 1/c. ábrán üG-vel Jelöltünk. Kontrollkéat aa 1/a. ábrán P-vel Jelölt POR /polimerén chain reaction/
ÚülönáUÓ primőröket lobot alkalmáért a nukleinsavszál különböző» helyein vagy másik nukleinsevszálon, például egy másik kromoszómán, pélr dóul hxiaán DNS esetében. Ezt a különálló helyet as l/o· ábrán PGBrol Jelöltük· Az erről a helyről származó AOR-kontrolitemékek hozzák létre azokat a sávokat* amelyeket az 1/c. ábrán IW-rcl Jelöltünk. Megemlítjük, hogy a POB-eel Jelölt sávok a DG-vel Jelölt sávok által képviselt tormékeknél képviselhetnek akár nagyobb* akár kisebb termékeket.
Az l/o. ábra az 1/a. és as 1/b. ábrán bemutatott eljárás eredményét szemlélteti* ágáról gélolektroforézissel felbontott sávok formájában, amelyek összefüggésben vannak például valamilyen pontmuöáció által okozott genetikai rendellenességgel. Az analízist megfelelő eredménnyel el lehet végezni akár as -fi* akár as -N diagnosztikai primer felhasználásával. Abban as esetben, ha a vizsgálat tárgya valamilyen genetikai rendellenesség hordozója^ sávokat lehet látni mindkét normál nukleotid szekvenoia /N/, valamint a variáns nukleotid szekvencia /&/ vonatkozásában. Normál homozigóták /&/ olyan sávot fognak mutatni, amely a normál nukleotid szekvenciával összefüggőben van Jeleni nincs azonban Jelen sáv / a rajzon ezt C ) Jelöli/ a variáns nukleotiddal és homozigótákkal összefüggésben* minthogy* minthogy a betegséget okozó mutáció /amely a 3 genetikai rendellenesség tárgya/ nem mutat Jelenlevő sávot / a rajzon ezt ( ) -val Jelöltük / a normál nukleotid szekvenciával összefüggésben* egy sávot mutat azonban a variéne-nukleotid szekvenciával összefüggésben·
A 2» ábrán látható a találmányunk szerinti eljárás második megvalósítási módja, Diagnosztikai prímért alkalmazunk egy két* szálas nukleinow mindkét száléhoz· Az a/ esetben a diagnosztikai primerokot úgy terveztük meg, hogy a 5*-véghelyzetü nukleotld komplemontore legyen a normál nukleotidnak, a folyamat igy úgy halad előre* ahogy azt as 1· ábrával összefüggésben ismertettük* do abban az esetben* ha a releváns nukleotid jelen van* két különböze diagnosztikai primer indítja meg a láncnövekedést· így ezt a aagvalóáitáai módot illetően a második diugnosztlkd primer ekvivalens az 1« ábrán látható ampliíikájxós primőrrel /A/· így a £t«ábrán látható esetben az /—«Ν és W
Kom indítanak azonban lúnenövekedést azok a diagnosztikai primerek* amelyeknek 3*-νό@* helyzetben olyan nukleotidjai vaunak* amolyok komplementerei az /-& és W varlána-nukleotid szekvenciának· A 2/b, ábrán ennek a fordítottja igaz* minthogy a minta nukloinsavszálalban a variáns szekvencia van jelen· A 2, ábrán bemutatott módszer eredményeit hasonló módon lehet reprezentálni mint azokat az eredményeket, amelyeket as l/o, ábrán mutattunk be, és variáns / K és m/ megjelölések ezen szekvenciák párjainak fognak megfelelni· A 2« ábrán a ? betű kontrollként alkalmazott atSi-ptimerokrö utal·
A J, ábrán egy olyan lehetőséget mutatunk be, amely alkalmas többszörös lúnonövokedéssol létrejött termékek mogkülönböototósérei lehetővé tévén ezzel* hogy egyetlen RNS- vagy 1ΛΙ3-<π1λ· ta vizsgálatával örökletes állapotok sorozatára kapjunk felvilágosítást· Az ábrán két /denaturált/ szálat mutatunk be egy
-59DHS- vagy RBS-mintából* A rajzon 1,2,5 számozással báron különálló helyet jelöltünk te, Bgy ezekről a helyekről eltávolított rész szolgál a kontrollként működő PGl-láaonövekedéshez* Az /1/ hellyel összefüggésben egy 2CMwr diagnosztikai primőrt /5**1 59/ alkalmaztunk egy további 20-mer diagnosztikai primőrrel /3f»-5·/ együtt* Abban az esetben, ha lánonövekedés megy végbe as /1/ helyen, egy 39-®er amplifikéciós terméket kapunk. Minthogy as ábra szerinti 3*-véghelysotü nukleotid normál / a vizsgált minta releváns nnkleotldja/, lánonövekedés megy végbe* Hasonló lánonövekedés megy végbe abban az esetben, ha a vizsgált mintában levő releváns nukleotid egy variáns-nnklöotid és as alkalmazott primer J’-végtolysetben ugyancsak egy variáns-nukleotidot hordoz·
Kern megy végbe azonban ilyen lánonövekedés abban as esetben, ha hibás párododás következik be a minta releváns nukleotidja, valamint a diagnosztikai primer 3*-végbelysetü nukleotidja között* A diagnosztikai primőröket úgy terveztük, hogy a /2/ helyen 49-mer ampliflkáoiós termék keletkezzék, amennyiben lánenövokedés megy végbe, a /3/ helyen pedig 59-mer ampllfikáclós termék keletkezzék, amennyiben lánonövekedés megy végbe* Mint ahogy az előbbiekből látni lehet, az amplifikációs terméksáv mérete a két diagnosztikai primer méreteinek as öszssega mínusz 1, többszörös vizsgálatot is végre lehet hajtani egyetlen mintán, egyetlen reakcióedényben abban az esetben, ha megfelelően megtervezzük as egyedi diagnosztikai primőröket, hogy azok jellemezzenek minden egyes fontos lokusst. Ahogy növekszik a diagnosztikai primerek össsterjedelmének a mérete, úgy lehet as aaplifikáaiós tormákéba t resolválni például aga» rés géleken* Jobb megoldás latot séges abban as esetben, ha a * 60 diagnosztikai primőröket megjelöljük vagy aarkirozsuk valamilyen alkalmas megoldással, például akrilamid gélen· A 5· ábrán látható r béta kontrollként alkalmasott POB-primerekre utal·
A 4· ábrán a találmányunk aserlnti eljárás negyedik megvalósítói módját mutatjuk be» amely szerint hagyományos láncnövelést hajtunk végre egy olyan nukleinsav saekvenoián, amely egy normál nuklectidot tartalmán abban a helyzetben, amelyben egy feltételeseit variáns-nukleotid is Jelen lehetne I például hagyományos POB-primeroket alkalmasunk# Hasonlóan hagyományos lánonövekedés menne végbe abban aa esetben, ha a feltételeseit variáns-mxkleotid lenne Jelen a normál ankleotid helyett· As amplifikációs terméket egy diagnosztikai primőréi ér intke etetjük, ahogy azt már korábban, találmányunk harmadik megvalósítói módjára! kapcsolatban már leírtuk· Abban as esetben, ha a lánonövekedéssel keletkezett termék ogy olyan nukleinsav szekvenoi* át tartalmas, amely magába foglal egy, as előzőekben ismertetett normál nukleotidot, és ha as alkalmasott diagnosstikai primőrnek van egy J^véghelyzetü normál nuklootidja, a diagnosstikai primőrből extenziós termék keletkezik egy hagyományos PCM^>lifikáoióval előállított nukleotid szekvencia felhasználóával /erre a szekvenciára itt mint KB-kontroll»termékro hivatkozunk/1 feltéve, ha Jelen vajának a megfelelő nukleoaid-trifoszfátok, valamint Jelen van a nukleoaid-trif oszf átok pollmerizálóára ni Ír ni ma a SZOT· AZDlifikáciÓB ΟΧίΒΟΧΧΘ DinCS SZtÜtSéZ# «inShagy a diagnosztikai primer láncnövekedéses termákénak as előállít tóéhoz szükséges templátnak már végbement a láncnövelése» A diagnosztikai primőrnek a 4/b· ábrán DG-vel Jelölt extenzióz termékével, valamint a 4/b. ábrán PGB-rel Jelölt PöB-kontroll-temékkel kapcsolatban a Jelenlétlet, illetve a Jelenlét hiányát ki lehet matatni például elakteafforetikus eljárással· kegjegyessük, hogy a diagnosstikai jmftmer oxtenslós terméke abban as esetben is létrejön, ha a PGB-konteoll-teriiék agy variáns—nukleotidot tartalmas és as alkalmazott diagnosstitoai pri— marnék jP-véghelysetben van egy komplementer variáns-nukleotid· ja·
A keletkeső termékek aávjait például olyan módon lehet smgjelenitenl, ahogy a 4/b, ábrán látható* ás B-, M-, 0-, S, D, DG, továbbá KB szimbólumok jelentése ugyanas, mint amit as l/o· ábrával kapcsolatban mér megadtunk* Ezzel kapcsolatban azonban meg kell ©miiténünk, hogy a diagnosztikai primer extenziós termékének a sávjáhos kisebb molekulatömeg tartozik, mint a POR— -kontroll sávjáhoa, amint es a 4/b· ábrán látható* Ebben as esetben a konteollsár valódi belső kontrollt képvisel, minthogy a rOB-primerek közül as egyik aapliffikóalós primőrként szolgál a diagnosztikai primer extenziós termékének a lánonöveléséhes· Abban as esetben, ha a KXB-konteoU-tormék variáns aukleotidot tartalmas és a dlagnosstikaA primőrnek 5*-véghelyzetben van egy normál nukleotidja - és est megfordítva * semilyen extenziós termék nem képződik.
Abban as esetben, ha ssükség van rá, a találmányunk sserlnti eljárás harmadik megvalósítási módját úgy is megoldhatjuk, hogy a vizsgálat kezdetén a vizsgálat tárgyát képeső mintát nemcsak a KR-primerekkel érintkestetjük, hanem a diagnosstikal primőrrel is« így nem ssükségea a diagnosztikai primerek alkalmazásának a késleltetése addig, amíg a PCB-kontrolI-termék láncnövekedése el nem érte a kívánt mértéket· A diagnosstikai primer valójában a KR-primerekkel együtt vagy azok után bármikor alkalmazható· A vizsgálatot ezért végre lehet hajtani például úgy, hogy a vizsgálni kívánt mintát egyszerűen beadagoljuk agy o>yai edénybe, amelyben mé® benne vannak a PCR-primerek, a dlagnos» tikai primer· a megfelelő nukleozi»tri£oszfátok és a nukleozid-trlfoszfátok pollmerizálására alkalmas ezer# A keletkezett termékok - és igy a terméksávok - ugyanazok mint amelyeket korábban már megadtunk· illetve amelyeket a 4# ábrán ábrásoltunk· ás 5· ábrán a találmányunk szerinti negyedik megvalósítási mód látható· amelynek során a 4* ábrával összefüggésben leírt módon, hagyományos láncnövekedés megy végbe# Az igy kapott amplifikációs terméket ezután hibridlsálásl körülmények között ér int ke etetjük akár a/ két, korábban már ismertetett, elkülönített diagnosztikai primerrel, amelyeknek mindegyike rendelkezik a 3*-véghölysetben egy normál nukleotiddali akár b/ két, korábban már ismertetett diagnosztikai primőrrel· amelyeknek mindegyik· rendelkezik J^-véghelyzetben egy variánsnukleotiddal, /lásd as 5/a# ábrát/·
Egyetlen ciklus során as extenslós termékek képződés· mutatni fogja* hogy a nukleinsav minta tartalmas·»· a normái vagy feltételezett variáns-nnklootidot· Blektroforetikus eljárással hasonló sáros mintákat leket kapni mint as 5/b# ábrán látható esetben· Eszel kapcsolatban azonban meg kell jegyeznünk, hogy abban az esetben, ha két diagnosztikai primőrt alkalmazunk, as egyik diagnosztikai primer aapllflkáclós primőrként szolgál a másik diagnosztikai primőrbe*· Ezért abban as esetben, ha szüksége·· bármelyik keletkezett estenslós termék maga is alávethető láncnövelésnek· Igg további többszöri ciklus után as 5/c. ábrán levő kiegészítő sávval reprezentált termékeknél — 63 ··.
alacsonyabb molekulatömegü termékek fognak keletkezni olyan arányban, amely függ as eredeti ^CB-primer oligonukleotldjainak, valamint a hozzáadott diagnosztikai címereknek as egymásra vonatkoztatott arányától· A PCa-emplifikáoiós termékeket könnyen meg lehet különböztetni a diagnosztikai címerekből lánonövekedóssal keletkezett termékektől» például olyan módon, hogy csökkentjük vagy növeljük a távolságot a gencmon levő PGB-ciaorek kötőhelyeitől.
Abban as esetben, ha szükséges, a találmányunk szerinti nogyedik msgwlósitáei módja eljárásunkul úgy is megoldható, ha a vizsgálat kezdetén a vizsgálni kívánt mintát nemcsak a POU «primerekkel érintkoztetjük, hanem a diagnosztikai primerekkel is. így nem szükséges kés lelten! a diagnosztikai címereknek az alkalmazását addig, amíg a PGB-kontroll-térméknek a lánonövekodése a kívánt mértékben végbement, A diagnosatikai c3>oare* két valójában a KSB-primorekkel együtt vagy a PCa-primeroket követően bármikor lehet alkalmazni· A vizsgálatot ezért például végre lehet hajtani egyszerűen úgy, hogy a vizsgálat tárgyát képező mintát beadagoljuk egy olyan edénybe, amely már tartalmazza a KJR-cimereket, a diagnosztikai címeveket, a megfelelő nukloozid-trifosafátokat, valamint egy, a nukleosid-trifoasfátok polimerizálására alkalmas szert. Abban aa esetben, ha a vizsgálatot ilyen módon hajtjuk végre, az előzőekben említett, alacsonyabb molekuXatömegü diagnosztikai termékek fognak keletkezni, megnövelvén ilyen módon aa 5· ábrán látható kiegészítő síW vokat·
A 6. ábrán - amely nem léptékhelyes - bemutat juk az emberi (X1 antitripszin gént, amely jól ismert a szakirodaiamban /laong G»L. és munkatársait ölooheMstry, 23· 4828 - 4837 /1984/ /·
Szén as ábrán bemutatjuk egyebek között ascAl antitripsain fehérje lehetséges S, illetve Z mutációját hordozó IXI<exon, illetve Tasson relatív helysetét· As ábra elsősorban bemutatja as ^1 antitripsain gén XXI •osonj át és jelei annak a* S variánsnak a helyse tét, amelyben a GAA kodon GIA kodonná mutálódott, és ilyen módon 264 amlnosavnál valinmaradék keletkezőtt glutaminsav-masadók helyett·
As X· primer ssekvenoiája a követkesői
5* 3» ι», aiaely hibridlzálódik az ^(1 antitripsain gén 7t40 - 7469· pozícióira· Megfelelő eredménnyel lőhet alkalmain! akár egy olyan XX· prímért, amelynek a ssekvenoiája*
5· GGŐÖOTQAGTOCCAACIASQGOTAAflAeGíG J® ΙΣ., akár egy Xla. primőrt /(3® J® hibás párosoddá a IX-ra/, amelynek a szekvenciája* '· ?
5» GGGOOÍOAfitCXJOAAOATGGC^AAGAGG®’ 3® Ila*
As előbbi három primer mindegyike as c<l antitripsain gén 7770 - 7799· pozícióihoz lett tervesve·
Bemutatjuk as ébrén továbbá as pCl antitripsain gén V· áronját, valamint annak a 2 variánsnak a helysetét, amely variánsban a GAÖ AAO-vé aaxtálódott, és ennek eredményeként as aminosav >42· helysetében a glntaminsavMnaradék helyébe lisinmaradék került·
A XXX· primőrnek a ssekvenoiája a következői
5* TGTCOAOGO»AGCOmCTOGAGGCO«WG 3» XXX·, amely hitaioisálódik asQÍl antitripsain gén 989M9Ü9· pozíciói65 ra·
A IV· primernek a szekvenciája a következői
5» GAGACMGGSAMMG^^ 3r IV., amely hibridizálódik az /1 antitrlpszin gén 10 081 — 10 109» pozícióira·
A m · és a IV· prímért ugyancsak jó eredménnyel lehet használni· Az előzőekben bemutatott bázisszámozás összhangban van a következő szakirodalmi hellyel! Biochem, 23» 4Q2B — 4857 /1984/·
A 7» ábrán megjelenítjük azt a gélt, amelyet az 1· éa a 2» példák szerint állítottunk elő· Az első nyomvonal egy olyan plasmidot reprezentál, amely e/on V-^ft art almai és Alu
I-gyel volt hasítva» A 2« nyomvonal egy térjedelemmarkert mutat, amely Has IH-mal hasított bakteriofág ^XL?4 DNS. A 3« nyomvonal as Exon III-nak az I· és II· primerekkel való, korábban már ismertetett amplifikációját mutatja be ugyanabban a reakciós légyben| az amplifikáció eredményeként 560, illetve 220 bázispárt tartalmazó termékek képződnek, az említés sorrendjében. A 4· nyomvonal arra utal, hogy nem következett be az exon III» lánc nőve kedése a korábban definiált I» és IXa· primerek használatakor, de az exon V» láncnövekedésó végbement a korábban definiált ΙΙΣ» és IV» primerek alkalmazásakor. Az 5» nyomvonal egy negatív kontrollt ábrázol, amely szerint I», II·, III·, és IV· primerek vannak jelen a lánonövekedéat elősegítő körülmények kötött, genom DNS viszont nincs jelen·
A 8. ábra 1-5» nyomvonala mutatja a 3» példa eredményeit, 5-8· nyomvonala a 4» példával összhangban azokat as eredményeket, — 66. — amelyeket destabillzálé® nélkül toptunk, normál és mutáns Mag· nosztltol primerek alkaliaazása mellett· A 9· nyomvcml mutatja a térjedelouMaarker bakteriofág φχΧ74-οϋ·
Az 1« nyomvonal mutatja azt az eredményt· amelyet akkor kapunk, ha Magnoeztikai primőrként
5» $GG®6J&GATA2(X^^ V.
nukleotld árokvonalát és ampllfikációs primőrként a korábban már definiált, I-gyel jelölt oligonukleotidot használjuk· Az alkalmazott humán genom W egy olyan normál homozigótából származik, amelyben ogy normál nnklootid /A/ van jelen az emberi o< 1 antltrlpszln gén potenciális S mutációs pontjánál· A várt 267 bázispárt» ampllfikáolóa termék világosan látható·
A 2· nyomvonal mutatja azt az eredményt, amelyet akkor kapunk, ha diagnosztikai primőrként
5* $6G5GUŰ»ASA^ VI· nukleotld szekvenciát és ampllfikációs primőrként a korábban már definiált, X-gyel jelölt ollglnukleidot használjuk· Az alkalmazott humán genom DKS egy olyan normál homozigótából származik· amelyben ogy normál nukleotld /4/ van jelen az ezberi K 1 ántitripszln gén potenciális S mutációs pontjánál· Abban as esetben, ha A*A hibás bázispárosodás van jelen, n® keletkezik 267 bázispáros smplifikációs termék·
A 3« nyomvonal egy kontrolb-sávot mutat, amely a humán apoüpoproteln B génen alapszik· Az alkalmazott szekvenciák a következők!
Aá£GáAsrsASGAőG0AAáA(mmaAae un és
xrr.
A 4. nyomvonalat üresen hagytuk·
A* 5· nyomvonal mutatja azt as eredményt^ amelyet akkor kapunk, ha a 4· példa szerint diagnosztikai primerként egy 5» 3’ vii· nukleotid szekvenciát alkalmasunk# A diagnosztikai primer ^oa?— dozza 3*-véghelyzetban azt a terminális nukleotidot /G/, mely bázlspárosodásna képes a normál nuklootlddal /0/ a » mutációs pontnál, és amely nukleotid egyébként teljes mértékben kompiémentese a minta DfíS-ének· Az alkalmazott minta DKS egy olyan normál homozigótából származik, amelybon jelen van egy normál nukleotid /0/ a honán /,1 antltrlpszlB gén lehetséges S mutációs pontjánál#
A 6· nyomvonal azt az eredményt matatja, amelyet akkor kapunk, ha diagnosztikai primőrként a 4· példa szerint a kővetkező nukleotid szekvenciát alkalmazzuk!
$* CCXJTCKJAmQGCTGÍ^ VIII.
A diagnosztikai primer 3•-helyzetben hordozza azt a terminális nukleotidot /A/, amely bázi3párooodásra képes a 2 mutációs pontnál egy mutáns nuklsotiddal /V, de amely terminális nukleotid egyébként teljes mértékben komplementere a minta SHS-nek# As alkalmazott minta DH8 egy olyan homozigótából származik, amely rendelkezik egy, a humán Al antitslpszin gén potenciális Z mutációs pontján jelenlevő normál nukleotiddal /0/·
A 7. nyomnál mutatja azt az eredményét, amelyet akkor kaptunk, amikor diagnosztikai primerként a 4» példa szerint • ·
- 6U a VXI· képlett! nukleotid szekvenciát alkalmaztuk· A IW minta agy olyan homozigótából származott, amaly a humán /1 antitripszin genetikai rendellenességet mutatta és amelynek α Z mutációs pontnál volt egy mutáns nukleotidja /1/·
A öi nyomvonal azt az eredményt ebi tatja, amelyet akkor kaptunk, amikor diagnosztikai príméiként a 4· példa szerint VÍZI· képlett! nukleotid szekvenciát alkalmaztunk· Az alkalma9 zott minta UHS-t agy olyan homozigótából kaptuk, amely a humán (/1 antitripszin genetikai rendellenes aéget mutatta és amelynek a Z mutációs pontnál volt egy mutáns nukleotidja /$/·
As >8, nyomvonalakkal bemutatott vizsgálatok esetében kivétel nélkül a korábban már definiált, IV· képlett! eaapliflkáoiós primer nukleotid szekvenciát alkalmaztuk· látható, hogy a 150 básispároe ampliílkáoiós termék keletkezését nem ssoritja teljesen háttérbe as á*C hibás bázlspárosodás / 6, nyomvonal /, és még kevésbé nyomja el a G-T hibás bázispárosodás / 7, nyomvonal /,
A 9· ábrán megjelenítettük azt a gélt, amelyet a 4* példa szerint kaptunk» Az 1» és a 14· nyomvonalok a tor jede len-mar kar bakteriofág H?4-et mutatják, amelyet Hae ZZX-raal hasítottunk· A 2· nyomvonal mutatja azt az eredményt, amelyet akkor kaptunk, amikor diagnosztikai part árként
5* QQG^A£AAtfX^^ 3* IX· képlete nukleotid szekvenciát alkalmaztunk olyan minta 0K8 Jelenlétében, amely aa emberi </1 antitripszin gén potenciális Z mutációs pontjánál rendelkezik egy normál nukleotiddal /0/ / egy nemál homozigótából származó minta W/« A diagnoaatikai •
*·> — primer hordozza azt a IX képletű szekvencián a 3* vcgholyzettől számított 5* nuklooöidnál aláhúzással xxgjQlClt változtat ácsul / 0 helyett A / kapott szekvenciát, amelynek a 5^-holyzotben lövő terminális nnkleotidja^a változtatás ellenére képes bázispár csodásra ogy, a potenciális 2 mutációs ponton jelenlevő normál nukleotiddal /0/*
A 3« nyomvonal azt az eredményt mutatja, amelyet abban az esetben kaptunk, amikor diagnosztikai primőrként a
5· 0CG®G<UTAlŰG0TG®GCTGACCAaí4pAaA >· X* képletű nuklootid szekvenciát alkalmaztuk egy olyan minta W Jelenlétében, amely a potenciális Z mutációs pontnál jelenlevő normál nukleotiddal /0/ rendelkezett* / A minta DKS normál homozigótából származott·/ A diagnosztikai primőrben van egy szándékos változtatás a 3^-végholyaettől számítva az 5* nuklootid vonatkozásában / ezt a X* szekvenciaképletben aláhúzással jelöltük* C helyett ▲/«▲>· terminális nuklaotld /A/ képes bázis* párosodéira egy mutáns nukleotiddal /T/ abban az esetben, hu az megtalálható a potenciális X mutációs ponton*
A 4* nyomvonal mutatja azt az eredményt, amelyet akkor kaptunk, amikor diagnosztikai primőrként a korábban már definiált IX* képletű nuklootid szekvenciát alkalmaztuk egy hötexozigótából származó minta hilS jelenlétében a Z mutációhoz /az emberi /. 1 antitripssin hiányt mutató genetikai rendellenesség hórdozá* ja /*
Az 5« nyomvonal azt az eredményt mutatja, amelyet akkor kaptunk, amikor diagnosztikai primőrként a korábban már definiált· X* képletű nnkleotidot alkalmaztuk egy olyan minta ŰtiS jolenlétóben, omoly S-mutádós hstorodgótéból szármadk és amely ennélfogva hordozója a humán ^1 anti tripezinr-hi dny t okosé genetikai rondellonoseégnek,
A 6« nyomvonal azt as eredményt mutatja, amelyet akkor kaptunk, amikor diagnosztikai primőrként a korábban már definiált, IX,képletű nuklootid szekvenciát alkalmatok olyan minta HB jelenlétében, amoly a humán <χ1 antitripszin genetikai rendűIle* nességet mutató homozigótából származik,
A 7, nyomvonal azt as orodiaónyt mutatja, amelyet akkor kaptunk, amikor diagnosztikai primőrként a korábbiakban már definiált, X, képletű nukleotid szekvenciát alkalmaztuk olyan minta DH3 jelenlétében, amely a humán /1 antitripszin genetikai rendo Honosa éget mutató homozigótából származik,
A 6, nyomvonal azt az eredményt mutatja, entkyrt akkor kaptunk, amikor diagnosztikai prímenként
5* QCQNCJB^2Ö50ö!6AXU5^ J* XI, képletű nukleotid szekvenciát alkalmaztunk olyan, normál homoslgótából származó minta DüS jelenlétében, amely a humán o(l antitrípszín gén potenciális 2 mutációs pontján jelenlevő normál nukleotidot /0/ tartalmas, A diagnosztikai primőrben van egy szándékos változtatás a >f-véghslyesttől számított 5, nukleotid. vonatkozásában, amelyet a XI, ssekvendaképleten aláhúzással jelöltünk! A helyett 0 van, A 5*-helyzotbon levő terminális nub· leotid /&/ ennek ellenére képes báaispároeodáara egy olyan normál nukleotlddal /0/, amely a potenciális Z mutációs ponton van jelen,
A 9, nyomvonal azt as eredményt mutatja, amelyet akkor kaptunk, amikor diagnosztikai primőrként
···*
- 71 5» OCGTGCAÍÍAAGGCTGTGCTSAÍXJATCG^SA 5’ XXX· képletű nuklootid. szekvenciát alkalma tünk olyan, normál homozigótából származó minta DHS jolonlétében, amely a hazán cZl antitripszin gén potenciális Z mutádós pontján jelenlevő normál nukleotidot /0/ tartalmas* A diagnosztikai primőrben van egy szándékos változtatás a J*-véghelyzettöl számított 3· nukleotid vonatkozásában, amelyet a XXX· szekvendaképleten alábozással jelöltünk megt A helyett ö van· A ^-helyzetben levő terminális nuklootid /4/ ennek ellenére képes básispárosodáara nnutánsegy ólyak\nukleotldcLal /1/, amely adott esetben jelen van a potenciális Z mutációs ponton·
A 10* nyomvonal azt az eredményt mutatja, amelyet akkor kaptunk, amikor diagnosztikai primőrként a korábban már definiált, XX« képlett! nukleobid szekvenciát alkalmaztuk egy Ζ-οζιtádós heterodgótából származó minta DNS jelenlétében, amely ennek következtében hordozója a barnán <Z1 antitripazin-hiányt okozó genetikai rendellenességnek·
A U· nyomvonal azt az eredményt mutatja, amelyet akkor kaptunk, amikor diagnosztikai primőrként a korábban már definiált· XXX« képletű nuklootid szekvenciát alkalmaztuk egy Z-mmtddós heterozigótából származó minta has jelenlétében· amely ennek következtében hordozója a barnán öC 1 antitripssin-hiányt okozó genetikai rendellenességnek·
A 12* nyomvonal azt az eredményt matatja· amelyet akkor kaptánk, amikor diagnosztikai primőrként a korábban már definiált· XX· képletű nuklootid szekvenciát alkalmaztuk egy olyan minta DNS jelenlétében, amely a htuaán p<l antitripezia-hiányt okozó genetikai rendoUanoseéget mutató homozigótából származott· • ·· · ···· ·· ··,···· · ♦ • ··· · ·*· ·» • · · · · ♦ ··» Bt ··, ··· t· • n A 13» nyoavonal üst aa eredményt mutatja, amelyet ükkor kaptunk, amikor diagnosztikai primőrként a korábban már definiált, XII» képletű nuklootld szekvenciát alkalmaztuk egy olyan minta DK3 jelenlétében, amely humán «41 untitrlpszin-hiányt okozó genetikai rendellenességet mutató homozigótából származott* a a-l>, nyomvonalak mindegyikénél IV, képldtü nukleotid □sokvonoiát alkalmaztunk ampllfikációs primőrként és
AATGAATTTAOOAíMJOAAMCTTTTAQAGG HU,, valamint
CTCTGQGAGOACAGaJAOQAAAAACCAOTT HV.
képletű nukleotid szekvenciákat kontrollként· A kontrollnak megfelelő sávokat megjelöltük a 9· ábrán /C/, és ez magfelel egy 510 bázispárral rendelkező ampllflkádóe terméknek a humán apollpoprotein b gén exon 26-ból*
A 10, ábra mutatja be a kazettás plozmldrondszer alkalmazását, A plazmád pA2 155-at - amelynek az antlbiotikus ellen* állóképességet tekintve az Amplcillinnel /Ap*/ és a eetraciblinnel /Tor/ összehasonlítható tartományai vannak, ugyanakkor rendelkezik Bcokl, Bűmül és Ball restrikciós helyekkel - Bcoklvul és BamHX-val digorúltuMk, A DöS-ouples mellett a mind normál, mind variáns szekvencia jelenlétének tulajdoníthatóan a centrumban hibás bázispárosodám nukleotidot is tartalmazó szintetikus kazettát T4 DBS-ügáz alkalmazásával beletettük a plazmlÓRgazdába, amint látható, A plaamidot ezt követően replikáitok és szelektáltuk, amint látható,
A rendszert a következőkben részletesebben Ismertetjűk| dzintatikus DNS-kazettákat készítettünk, amelyeknek mindé-
z
1, »73 helyzeténél·
A U/b* ábrán egy variáns genom. nSB szekvencia látható ugyanazon két diagnosztikai primőrre1 együtt* Amikor mindkét genom W3 szekvenciát ér int ke zte tjük a primőrökkel olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a kos^lomenter hibridizációt, mindkét esetben hibridizáció megy végbe* A primer láncnövekedését lehetővé tevő körülmények között mind a négy nukloozidr-trifoszfátnak az adagolása csak egy estendált termék keletkezéséhez vezet, ha a/ normál szekvenoiás primer vagy b/ variáns szekvenciáé primer van jelen* Egyéb primerek láncnövekedését lűegakadályozza a hibás bázispárcsodás* Sőt, amint oz a 11/c* ábrán látható* ahol olyan eljárásról van szó, amely szerint csak három vagy annál kevesebb megfelelő nnkloozid^trifoszfátot adagoltunk be, a megfelelő primer láncnövekodését egy adott pontnál meggátolja a megfelelő mkleosid-trifoszfátokxiak vagy-trifoazfátnak a hiánya*
A 12« ábrán megjelenítettük ez 5* példa szerint előállított gélt*
Az 1* és a 2* nyomvonalak megfelelnek egy normál hooozlr» gótához való I>K3-nek /W, a 3* és a 4* nyomvonalak megfelelnek egy hetorozlgófcáhcz /W való UKS-nek és az 5·, valamint, a 6» nyomvonalak megfelelnek egy variáns homozigótához /33/ való hHS-nek« Ag 1,3, valamint 3« nyomvonalak vonatkozásában normál Wl, oligonnkleotidc ir használtunk, a 2*4* valamint 6* nyomvonalak vonatkozásában pedig ΠΙ, /változó, variáns/ oligonukleotidot* Amint előre látható volt* nem ment végbe oligonukleotid7* -lánonövokedés a 2« és 5* nyomvonalakkal összefüggésben# Az észlelt torméksávokat az ábrán jelzés mutatja·
A ÍJ# ábrán megjelenitettük a 6« példa szerint előállított gélt· A halszélen lövő nyomvonal olyan terjodslem-m^karekre vonatkozik, amelyeket a keletkezett termékek nagyságának a megállapítása céljából használunk# Az 1# és a 2# nyomvonal megfelel egy normál homozigótából /MM/ származó WS-nek# A 3# és a 4# nyomvonal megfelel egy hoterozigótóból /W származó DKS-nek· Az 5# és a 6# nyomvonal megfelel egy variáns homozigótából /22/ származó DNS-nek· Az 1,3# valamint 5* nyomvonalak vonatkopásában XXX# és XX# primőröket alkalmaztunk! a 2*#4#, valamint 6# nyomvonalak vonatkozásában pedig XIÍ# és XX, prímaretet* Mint az várható volt, nem mont végbe a primer láncnövekodése a 2# és 5* nyomvonalakkal összefüggésben* Aa észlelt terméksávokat az ábrán jelzések mutatják# *
AS 41 antitelDfialn S Inkímgénak /azon XII/ a aaataraaalfcto
A kisbetűvel irt bázisok az egyes lokuszok normál szekvenciáját jelölik# A primőrökben as aláhúzott bázisok mutatják a szándékosan elkövetett hibás párosítást, a primerek de stabilizálása érdekében· A szekvenciákat úgy rendeltük egymáshoz, ahogy bong és munkatársai megtették /Biochemistry > 23· 4628 - «837 /1984/ /#
5» GCGSG^AGGGGAAACTAŰAGGACCÍBGGT m*
5· GOCIXiATGAÍKXJGAMCTWAGOAűCTGGA
5»
3* GAAGGAOGGAÖTACTCXXXSTmAaJGTOGl’GGACCt
7642 mi.
-75 5*
TTT®ACOTGAGTGGGTCC’BA.TAG*eAG<DGOT 5*
Al^ACTTGAűTGGCZDGCTATAQTAGTGGIJ 5*
XXXV, .
V£&3B&WUM&SG^ 5# | . .
7811
TTGGAíUATCGGTAíU^ 5#
Ag (Al .infritrin^ln Z loknnaának Za^an V/ saatamtyAÁ^
A kisbetűvel irt bázisok az egyes lokuszok normál szekvenciáját jelölik, A primőrökben as aláhúzott bázisok mutatják a szándékosan hibás párosítást, a primerek destabüizálása érdekében.
| 5» | CCG^A£MQGCT«KKXKlACOg?XXU^ | xn, |
| 5· | XV. | |
| ✓ | ||
| & | C(Xm0A£Aá&&l^ | X· |
| ix· | ||
| 59 | nx. | |
| 5f | CC^CATAAGGGTGaXXJO^ACOATCGgpG | n. |
| 5· | <X^^A£AASOCSSm<m!C(US(mCUL | mi. |
Vll.
5’
TCCAGGCCG2
XJCAIMGGCTGTGCTGACOATCGAŰg 5. ^B^OÍXŰÍUŰeluiasxloűuíiüluowű&tsMIia
995* 1OOJO
I β*αΑΑ&0β(Μ0ΦβΑΑα0Τ6^^ 3* cTOTTT(X)CTClCTTCGACOrjUX>pO<XjTAOMAMTCTCCGG 5·
CTOTTTCXJCTGACTTCGAOGAOCCCGGTAO 3· raCTT2OCCTGACT‘2GGAűGACCCCGGTáC 5·
Χ7ΣΧ.
xrax·
QSQ&mQQ®^ 5*
'ZEQgMQGQM^ 5*
A következő példákkal részletesebben ismertetjük találmányunkat anélkül» hogy a példákra korlátozni kívánnánk· A példák szerint - ellenkező értelmű utalás hiányában - alkalmazott anyagok mennyisége és koncentrációja a következőt
- DOS-szubsztrátumt 1 sikrogroBna humán genom DNS*
- Oligonukleotidoki minden egyes megfelelő cligonukleo- tidból 100 pikoeol
- Dezoxt-imkleozM-trifoszfátokt mindegyiket 1»5 mM vég- konccntrációbsn alkalmazzuki
- Puffer /végkoncontrádók a reokcióGlegyben/t mM tris /pH = 8,8 sósavval/ »6 mM omódum-szulíát
6,7 mM magnézium-klarid
- 77 10 βΛ béta-taertoapto-etanol
8,7 /* 1»
Terhe lőpuff ért
35t'S Slcoll 7° /szintetikus polimer > ©melyet szűkre z és epiklórhidrin kopoldmerizálásával állitanak elől a kopoliiasrisált terméknek az átlagos molekula tömege körfUbeUH 70 000 « a Pfaarmaoia terméke/
200 mM trisz-aoetát
100 mM nátrium-acetát mM 3IB
0,2^ brómfonolkék
Tor jedelejwnarkereki
Hae XXXoal hasított Bakteriofág ^X174 D«S| a sávok terjedelme bázispár okban t 1553» 1θ78, 872, 605, 310, 281, 271, 254, 194, 118 és 72«
1^ néldai
Sgy 1,5 al-os, csavaros tetejű centrifugacsőben összekevertünk 1 yug humán genom DNS-t, 100 pmol-t minden egyes öligonukleotidból a korábban definiált, X«, XX«, XXX* és XV« jel*· séöüek közül, a négy dezoxi-nukleozid-txifoszfátból annyit, hogy a végkonoentrádójdí 1,5 mM legyen, valamint puffért olyan mennyiségben, hogy végkoncentrádója az előbb megadott legyen, majd a térfogatot 100 /il-re egészítettük ki steril desztllr» Iáit viszel, A csövet ezt követően lezártuk és forzóvizes fürdőbe helyeztük 5 per őre· Areakdót moginditottuk egy egység
- 78· endmet tartalmazó, 1 yUl Tag. polimeráz adagolásával /Angiié® Biotech batch 3, 1 egyság/^ul-re hígítva az előbb ismertotott pufferre!/· A csövet 53°C-on inkubáltuk 4 percig, majd 91°C-on 2 percig. Ezt az 56°C/91°0-os felmelegitésl/hütési ciklust föl» tattfk öt további cikluson keresztül, majd mint az előbb, beadagolttak még egy enzimegycéget· Az 5θ°0/91°$-03 felmelegitésl/hütési ciklust további hat cikluson keresztül folytattuk· majd ezt követően egy további enzimegységat adagoltunk be aa előbbiek szerint· Az említett melegitésl/hütési ciklust további
VaAjíA f hat alkalommal megismételtük, majd az előbbiek szerint további egy enzimegységet adagoltunk be· Az említett melegitési/hütéei ciklust további két alkalaomal megismételtük, majd az előbbiek szerint további egy enzimegységet adagoltunk be· Ezt követően 20 percen keresztül inkubáltunk 58°O~on.
Az amplifikációs termékeknek a detektálását úgy hajtottuk végre, hogy a reakcióelegyből 15 ^ul-t 5 ^ul gélterhelő puff őrrel elegyítettünk, majd elektroforézis következett olyan aga— réz gélen /3^ NuSiove”/» amely 2 yüg/ml mennyiségben etidiu» bromldot tartalmazott· Az elaktroforézisnél térjedeleaMoarkereket alkalmaztunk, hogy megbizonyosodhassunk a láncnövekedéssel keletkezett termékek méretének helyességéről, A gélt 3°0 na*es hullámhosszúságon agy transzilluminátoron megjelenítettük és polaroidfelvételt készítettünk· A 7· ábrán levő 3* nyomvonal ennek a megjelenítésnek az eredményét mutatja· Ennek eredményeként a 3· nyomvonal mutatja az azon III. láncnövelését a korábban leírtak szerint az X« és a XX, primőrrel, amelynek^ eredménye agy 360 bázispárból álló termék, továbbá az azon V, láacnövalését a korábban leírtak szerint a XXX# és a XV« primőrrel, amelynek az eredménye egy 220 bázispárból álló termék*
- 79 Megismételtük as 1« példát ássál a különbséggel, hogy a 11« primőrt a korábban már definiált Ha» primőrrel helyettesítettük· A 7* ábra 4« nyomvonala mutatja as igy előállított gél megjelenítésének aa eredményét· látható· hogy aa erőn XXX-ból aa X· és a XXa· primerek alkalmazása esetén nőm képződött smplifikációs termék· Az exon V-nek a láncnövekéso a korábban már definiált III· és IV, primőrökkel viszont megtörtént, és ilyen módon ugyanaz a 220 bázispáros termék keletkezett mint az 1© példában·
Az 2, példa igy bizonyítja, hogy valamely oligonuklootid primer 3#-véghelyzetében egy hibás búsispáTosodáa megakadályozza wgy legalábbis lényegesen gátolja a polimeráa aktiválásának aa iniciálását·
XJaatáta.....
Sgy 1,5 ml-es, csavaros tetejű contrifugecsöban összekever# tünk 1 /Ug humán genom ®-t, 100 jsaol-t az alábbiakban ismerte toéóere kerülő oligonukleotidok mindegyikéből, a négy dezosdbnuklcozid-trífoszfát mindegyikéből annyit, hogy a végkoneentrációjuk 1,5 mM legyen, valaMnt puffért olyan mennyiségben, hogy végkoncentrációja a korábban magadott legyen, majd a térfogatot kiegészítettük 100 yUb-ro steril desztillált vízzel· A csövet ezt követően lezártuk és forróvizes fürdőbe helyeztük 5 perars· A reakciót megindítottuk egy egység enzimet tartalmazó, < 1 χΠ1 Taq polimer áz adagolásával /Anglián Biotech batch 3, 1 egység/ yUl-re hígítva az előbb ismertetett pufferről/· A csövet 56°0-on inkubóltuk 4 percig, majd 9i00-on 2 percig· Szt as 5600/91°0-os melegitési/hütési ciklust folytattuk további öt cikluson keresztül, majd beadagoltunk ség egy, előbbiek szeri!*· ti enzimegységet. Az 36®C/91®C-O0 melegítésl/hütésl ciklusokat hat további cikluson keresztül folytattuk, majd ezt követően még «gy» előbbiek szerinti ensimegységet adagoltunk be· As említett mélegiiésl/hütésl ciklust hat további alkalommal megismételtük, majd még egy, előbbiek szerinti enzlmegységet adagolttmfc be· As említőtt molegitési/hütésl ciklusé öt további alkalommal megismételtük, majd még egy» előbbieknek megfelelő enaJto•gységet adagoltuWE be· Az említett mologitéal/hütési ciklust két további alkalommal megismételtük, majd még egy» előbbiéi szerinti enzimegységet adagoltunk be« Bzt követően 20 percen keresztül inkubáltunk 5ö°G-on.
A következő vizsgálatokat az előbbi eljárási szabályok szerint hajtottuk végret a/ A korábban már definiált X· oligonuklaotidot, valamint a
5« v« képletű oligonukleotidot alkalmaztuk# A fölhasznált humán genom MNS egy olyan normál homozigótából származott, amely nem volt érintve a humánul antitrlpszines genetikai rendellenesség általi és b/ A korábban már definiált I. óligcnukleotidőt, valamint a
VX« képlett! oligonukleotldot alkalinaztuk. A felhasznált humán genom PKS ogy olyan normál homozigótából származott· amely nem volt érintve a humán ^A1 antitripsziaes genetikai rendellenesség által· • — 81 —
Az aa^lifikációs termékeknek a detektálását úgy hajtottuk végre, hogy 1$ ^ul reakción legyet 5 /»1 í’élterhnlő puff erről elegyítettünk, majd elektroforézis következett olyan agarós gélen /w3& HuSiove”/, amely etidiumbromidot tartalmazott 2 yUg/al mennyiségben· Az oloktroforézisnél tér jedelem-markerekot alkalmaztunk /8» ábra, % nyomvonal/» hogy megerősítést kapjunk a láncnöveléssel keletkezett termékek méretének pontosságát illetően# A gélt 300 nm-es hullámhossuságon egy transzilluminátöron megjelenítettük és polaxoid fölvételt készítettünk róla· A 8# ábra 1# és 2« nyomvonala ennek a ragja lőni tésnek az eredményét mutatja» Így az 1· nyomvonalból kitűnik, hogy láncnövekodés ment végbe abban az esetben, amikor V. képletű nukleotid saeb· vonóiét alkalmaztunk, amelynek 3*-helyzetü terminális nukleotidja komplementere a minta DWö-ben levő potenciális S mutációs ponton levő megfelelő nukleotidnakt és ennek eredményeképpen ogy 267 bázispúroe amplifikációs termék keletkezett· A második nyomvonal azonban azt tanúsítja, hogy nem megy végbe lánenövekodés abban az esetben, ha a diagnosztikai primer 3*-végholyzeténél hibás a bázispárosodási az alkalmazott diagnosztikai primőrnek a 3^-véghelyzetü nukleotidja /A/ hibásan párosodik az agy normál homozigótából származó DIB minta potenciális mutációs pontjánál levő nukleotiddal /A/· '£$3 1*5 ml-es, csavaros tetejű centrifugacsőben összekever-
Claims (5)
ÁZ. íbr^
KÖZZÉTÉTELI
PÉLDÁNY ·· ···
8/8
G. ábra.
ZZÉTÉTELI ÉLDÁNY ι--------N—I l-----------------N1 1 S1— N ιι ιι (3.). itra.
C ND
N Μ N Μ N M
PCR
DG .
DG 3DG (c).
5'— N— 31
1· Eljárás loj.alaoű egy variáruMU&ieotid jelenlétének vagy hiányának a
Ilfc^JiiatüXOZaíSai'a V'kjE tUOü í.lUkAts-liiSiiVélt ta*'taliíiaZ<..' ihlí!taütiílf iiZZíÁÍ jell.et.:w*j— ve, nogy a mintát — együtteseit va«y epyjutst Követően — tf&gielelo nukieozia*tri— íősziétákkal, a auxleozid tri í'oszfátok polimerizalaeara alkalmas szírrel és a céibázis-szekvencia egy diagnosztikai szakaszához való dia^rosztikai primerrel kezeljük Hibridizációs tóraltJényeK kuzöty^zzal a kikötéssel, hogy az említett dia-ynosztikai primer nukleotid szekvenciájának lényegében az emlitótt szakasz koi2ple«föntérének kell lennie, hOíjy a diagnosztikai primer egyik terminális nukleotlajónak akar a felteudezett variáns-nukleotid, akár· a teegí előle nonaál nukleotid líomplebíenterenek kell fennie ahhoz, hogy a diagnosztikai prímen tek 6fe.y extenziós termete Jöjjön létre szintézissel, amcmnyibeii a oiagnosztikai primer aolitect teniunalís nukleotidja koapleuentere a célbázis szekvenciában.
levő u^l'eielo ntücieotiduák, illetve ne jöjjön letre seanilyen extenziós ten-
ezt követően következtetünk a feltételezett variaiiS-nukleotid· jekenlétéi'e vagy hiányára et.y extenziós terűtek jelenlétéből vagy hiányából.
1/ A korábban már definiált, XXX· és XV· képletű oligOMitoleotidokat alkalmas tok· A felhasznált humán genom D8S egy olyan homozigótából /ZZ/ ssámasott, amelyet érintett as /1 anti· tripszines genetikai rendellenesség·
Minden egyes előbbi kísérlet során a XXXI· és XXV· képletű nukleotid szekvenciákat alkalmaztuk amplifikáoiós kontrollként·
As aaplifikáoiós termékeknek a detektálását úgy hajtottuk végre, hogy 19 /U1 reakcióelegyet 5 /11 gélterhelő puffarrel elegyítettünk, majd elektroforésis következett 0,9 /ig/tal étidiumbrooidot tartalmasó l,4#~oe agarósgélen· As elektroforésis· nél tor jedelenwoarkerakat alkalmastunk, hogy megerősítést kapjunk a lánonövekedéasel keletjlkasett termékek méretének pontosságát illetően· A gélt 900 nm-es hullámhoassuságon egy transsilluminátoron megjelenítettük és polaroid felvételt készítettünk róla·
A 9· ábra 2-19· nyomvonalai ennek a megjelenítésnek as eredményét mutatják· As 1., valamint a 14· nyomvonal a terjedt* lam-markereket reprezentálják a sávokkal· így a 2-7· nyomvonalak azt mutatják, hogy nem teljesen hatásos a diagnosztikai primőrnek a dsstabilisálása azáltal, hogy a 9*-véghelyBettM számított ötödik nuklootidnái változtattunk! nem teszi lehetővé, hogy a primer különbséget tegyen as adott reakciókörülmények között a normál és a mutáns DS3 minták között· Basel szemben a 8*19· nyomvonalak tanúsága szerint amennyiben a diagnosztikai primeroknek a 3*-véghoiy séftől számított harmadik nnkleotldját megváltoztatjuk, a változtatás elég hatásos ahhoz, hogy a prí» sereket képessé tegye a normál és a amtána DHS minták közötti különbségi ételre, és ennél fogva alkalmas lehet a humán /1 antitMpezines genetikai rendellenesség által érintett nősnél homozigóták, heterozigóták /hordozók/, illetve ZZ homozigóták diagnosztizálására·
Ennek a példának as előzőekben Ismertetett kísérleteit úgy is végrehajtottuk, hogy olyan diagnosztikai prímért alkaí· maitunk, amelyben nem változtattuk meg kiegészítés képpen, destabilizáláa céljából egyik nuklootldot sémi továbbá olyan diagnoestikai prímért is alkalmaztunk egyes kísérletekben, amelynek a 5*-végheIysettől számított hetedik nukleotidját A-ról C-re váltostattuk* destabilizáló hatás elérése céljából· A diagnoestikai primer egyik esetben sem tudta teljes mértékben megkülönböztetni a normál és a mutáns űkS~mintákat. Ez a tény olvasható le a 8« ábráról· As 5-8· nyomvonalak ássál a diagnoestikai primőrrel vannak öisiefüggésbon, amelyeknél nem volt ráadásként semalféle doatabllisáló mkleotKváltostatáa·
A XXII. /normál/ és a XXX· /variáns/ oligonukleotidokat alkalmaztuk primer ként· Ebben a példában A, G éa Ϊ dM!P elegye egy hét bázissal extendált primőrt fog adni a templátoa, mielőtt a 0 auklootid-trifossfátra szükség lenne· Esőkre az olígonnkleotidokra 94°0-ot számítottunk ki olvadáspontra ZW a » 4 /0+0/ és 2 /AvT/ képlet alkalmazásával, de azt gondola juk, hogy os az érték csak legfeljebb merez oligonukleotidokra releváns· így célszerűség okából 75°C-ot választottunk
99
999
-66 Tm-értéknek· pmol mennyiségben minden egyes ollgtrmMnotidot megjelöltünk as 5**helysétü terminális hidrcxilGsoportján olyan módon# hogy 5 mM trisz 01-t /pH«7t6/» 10 mM MgOlg-t# 5 mM MM, 100* ^uM spermldlnt és 100 ^urnol EöTA-t tartalmasó 80 yUl mennyiségű reekolóelogyben d^P AXP—t /Amersham 2/U01/ és 4 egységnyi pollnukleotld kinázt alkalmazunk· A kinézze reakciót lejátszatjuk 57°0-on 20 perc alatt, majd a jelzett ollgonukleotidokat elektroforézissel ellenőriztük /15^ poliakrllamid denaturáló gél/8M karbamid - dlőciklnei 1 óra# 5O0V# főciklust 4 óra# 800T /·
Két plazmidot alkalmaztunk· Az egyik a humán 1 antitripszin gén ezen UX s lokusaának a normál szekvenciáját /W/ tartalmazta# -a másik pedig a variáns homozigótának /SS/ megfő-·! lelő variáns szekvenciát· Hat csövet készítettünk el# minden egyes lehetséges SMS típusnak kettőt# A homozigótákhos 1 fteolt alkalmaztunk a megfelelő plazmldból# a hoterozigótákat azonban szimuláltuk olyan módon hogy mindkét plazmádból 0#5 fmolt alkalmaztunk· A jelzett oligcnukleotidból 200-szoroe felesleget hoztunk létre minden egyes csőben olyan sódon# hagy beadagoltunk 200 fmolt / 2 /Ul~t a jelzett oldatból / akár a normál /XXXI/# akár a variáns /XXX/ oligonukleotidból minden egyes 2MSS típushoz* Mndegylk cső tartalmazta a 5 dMSMi /az A-4# a 0-t és a SM/ /Pharmaola/ olyan mennyiségben, hogy mindegyiknek 5 »M lágyon a végkonoentrációja a 6,7 mM MgClg-t, 6? mM trlsm*MSli»t /p&£#8/# 10 mii smrkapto-etanalt és 16«6 mM eaumóalom-szulfátot tartalmazó# 20 ^uX mennyiségű reakdóelogyben# A reakdótérfogatokat magháraaszorohtiuki vagyis 60 ^ul-t alkalmaztunk minden esetben# hogy csökkentsük a párolgás hatását· • 8? A csöveket 5 prcig forraltuk, majd Jégen tartottuk, mielőtt 5 egységnyi Taq polimeréit /Oetus 1 őtsBőrösére higitea 1,5 aM Sgölg, 50 mM teles és 0,01¾ zselatin elogyével, hogy 1 ^ul-ben 1 egység legyen/ adtunk minden egyes csőben levő anyaghoz, A csöveket est követően 15 000 fordulat/pero sebességgel két percig centrifugáltuk, majd 2 yul aliqnot részt hozzáadtunk 5 ^ul forraamidos brómfenolkékoldatbos, A csöveket osután vízfürdőn 75°C-oö tartottuk négy óra hosszat, majd égy percen át 15 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk a bennük levő anyagot· Ezután kivettünk mégegyszer 2 /U1 oldatot és hozzáadtuk 5 /ül szinezékoldathos· A csöveket ezután 6 óra hosszára visszatettük a 75°°-οβ vízfürdőre· A vízfürdőről való levétel után további 5 egységnyi Saq. polimer őzt adagoltunk be minden csőbe, majd egy percen keresztül centrifugáltunk 15 000 fordolat/pero sebességgel· Ezután a párolgás csökkentése céljából egy-egy csepp könnyű ásványolajat adagoltunk be /Sigma/ a csövekbe, amelyekből most nem vettünk ki folyadékot· A csöveket egy éjszakán keresztül 75®O-cn tartottuk· As első oenteifugá» lás végétől számított at óra elteltével a csöveket kivetttfc a vízfürdőből, 1 percig centrifugáltuk a bennük levő anyagot, amelyből végül még két yul-nyit kivettünk és 5 /Ul-nyl szineaékoldathoz adtunk·
Az összes aliquot részt elekteoforéslsnek vetettük alá egy elődklusban / 1 óra, 500 V/,15^ denaturáló poliakrilamid gél/ 8M karbamid m pufferben /0,085 M teisz-borút, 0,089 M bórsav, 0,002 M EŰTA/ tartottuk öt és fél órán keresetül /880 V/. A géleket ezután autoradiografáltuk egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten, Hem masskoltuk a nem érzékeny fotográfiai filmet· Az eredményeket a 12« ábra matatja· • ·· · ···· ·· ····.·· · ♦ • ♦ ·· · · ·♦ ·· • · · · ♦ · • · · · · ····*-· · ·
- 86 te 1« és 2, nyomvonal egy normál homoslgóta /W/ MS-ének, a és a 4« nyomvonal egy heterozigóta /MS/ sas-ének, an 5· te a 6. nyomvonal egy variáns homozigóta /SS/ DNS-énok felel meg· te 1·,5„ valamint 5· nyomvonal esetében a XXXX· /normál/ oligomkleotidot, a 2«,4», valamint 6. nyomvonal esetében a XXXI» /variáns/ oligonukleotidot alkalmaztuk· Amint as előre látható volt, a 2« te as 5« nyomvonalakkal összefüggésben nem növekedett az oligonukleotid lánoa· A detektált terméksávokat as ábrán megjelöltük.
6· Példát
Bgy 1»5 ml^es, csavaros sapkával ellátott mikrocentrifugaoaőben összekevertünk 1,5 nM végkonoentráoiónak megfelelő meny*» nyiséget a négy desoad^oukloozid-trifoozfátból, valamint a korábban ismertetett végkonoentr telének megfelelő mennyiségű puffért·, majd a térfogatot 100 ^ul-re állítottuk be steril, ion* montesltett vízzel /Milll-M/· A csövet ezután lezártuk és forrásban levő viszel telt fürdőbe helyettük 5 percre. A reakciót beindítottuk 2 egységnyi Tag polimeráz /Getus/ beadagolásával, majd aa elegyhoz könnyű sstehidrogteolajat /Slgma/ tettünk, a párolgás megakadályozására. A csövet 60°0-on inkubáltuk 4 percig, majd 90°0-on két percig· üst as eljárást addig ismételtük, amíg a ciklusok száma el nem érte a harmincat.
A roakcióelegyből est követen kivettünk 60 yttl-t, amihez hozzáadtunk 60 pmol mennyiségben vagy XXX» és XX, /normál/ primőröket vagy XXI, és XX ./variáns/ primőröket. Bzután beadagoltunk •
egység Tag polimerázt /Gotus/ a további roakoió beindítására· A reakdóelegyet 92°C-on inkubáltuk két porcai keresztül·, majd 60®C-cn négy percen keresztül· Bst as eljárást addig iamétsltük^
- Ö9 aaig a ciklusok száma el nem érte a négyet.
As amplifikációs termékeknek a detektálását úgy hajtottuk végre, hogy a reakclóelegyből 10 ^ul ali^uot részt gélöeshclő*’ puffarrrel elegyítettünk, majd elektroforésis következett 0*5 yUg/ml etidiumbromidot tartalmasé, 3&-o« agarés gélen /Wu Sieve, MiO BioproduotaZ, A gélt est követően 300 mwa hullámhosssiságon megjelenitettük egy transaillumlnátorai, majd polaroid fényképet készítettünk róla, As eredményeket a 13, ábrán mutatjuk be, A balszélső nyomvonal a terjedelam-markereké, amelyeket annak érdekében alkalmaztunk, hogy biztosak legyünk a kapott termékek méretét illetően·
As 1, és a 2, nyomvonal egy normál homozigótából /W szármasó MB-nek, a 3, és a 4, nyomvonal egy heteroaigótából /W származó DBB-nek, aa 5, és a 6, nyomvonal pedig egy variáns homozigótából /22/ származó DHS-nek felel meg. Az 1,,3,, valamint 5, nyomvonalakkal összefüggésben a XXX, és a XX· képletű priamreket alkalmaztuk· A 2,,4., valamint 6. nyomvonalakkal összefüggésben a XXX, és a XX. képlett primőröket alkalmaztuk. Amint as előre várható volt, a 2. és as 5, nyomvonal vonatkozásában nőm következett be a primer lánontvokodéso. A detektált termékéé· vokat az ábrán bejelöltük* • · · özaoauaiüú i&enypontoKt
2 3 4 5 6 7 8 91011121314
2 3 C 5
7. lka.
2(b) ® ® ® ______N_______________N____________N
31---N-^5' 3'—
2, Az 1, igénypont szerinti eljárás, & z z & 1 j e 1 1 e ut e z v e, hogy a/ a mintát - együttesen vagy egymást követően - negí'eleló nukleozia-orifoszfátokkal, & nukleozid-trifoszfátok (x»lií.ferizalásara alkalmas szerrel, egy célbázis-szekvencia diagnosztikai szakaszaiioz való diagnosztikai primőrrel és egy megfelelő aiupliíikaciós primerrel kezeljük hibridizációs körülményen kozott,azzal a kikötéssel, ítogy az ewtlitett diagnosztikai primer nukleotid szekvenciája -az említett diagnosztikai szakasznak lényegétan komplementere kell hogy legyen, ho^y a oiagnosztikai primer egyik terminális nuxleotiuja komplementere legyen vagy a feltételezett variána-nukleotidnak vagy a iöe;-.íelelo norfiul nukleotianalí) itogy a diagnosztikai primernek egy extenziós terméke keletkezzék szintézis utján abban az esetben, h& a diagnosztikai priWjcr említett terminális nukleotidja komplementere a celbazis-szekvenciában ♦ · ·
- 91 levő negfelelő nukleotidnak, illetve ne Jöjjön létre szintézissel extenziós tennék abban az esetben, ha a diagnosztikai prii&ernek az említett terminális XiUkleotidJa nem Kompleíiientere a celöázis-szeKvenciáoan levő üsegí'elelő nukleotidnak} a diagnosztikai pritierbol Keletkezett bármelyik extenziós termák kcpes arra, hegy a taaplemeuterétoi való elválasztást követően tárlatként szolgál jen az említett a<rlifUAcios primer egy in extenziós tériekének a szintíiziséíiez;
b/ & mintát denaturáló KörüiEiónyek között tartjuk, liűgy elválasszuk a primer extenziós terméket a templátjától, amennyiben ilyen extenziós temek létrejött} c/ a b/ művelet során létrejött egyszeres szálakat érintkeztetjük
- együttesen vagy egymást követően *· a rjegfelelő nukleozid-trifoszfátokkal, a ruixleozid-trifoszfátok polimerizálására alkalmas szerrel, egy-ogy, i3®r definiált diagnosztikai primenrel és aiiiplit?ikációs primerrel, itógy a b/ iaüvelet során keletkezett egyszeres szálakat teaplátkent alkalmazva · aweny·nyiben lehetséges - további extenziós terméket állítsuk elé;
ó/ a b/ és a c/ műveleteket elégszer is»)étölJüK meg ahhoz, hogy a y»gfelelő nukleotid szekvenciánál aetektálhato legyen a lá-icrx-ve/cedés; és eZ következtetünk a feltételezett variáns^iUiUeotici jelenlétére vagy hiányára egy, a ·!/ lépésben létrejöhető aíriiiiiíációs térnék jelenlétéből va^y hiányából»
3. íbri.
·· · > ÖZZÉTÉTELI í'ÉLDÁNY
8/6
Eco Rl
A ΜΚΓΠ.Η0 fEJTTK ATALAKITAJA
A^PLAZMID ELKÜLÖNITt’J'Í’
3'— N— 5'
KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY
3'
3Ζ
5Ζ ía). ábra.
PCR
DG
V
3. £brí • ·
KÖZZÉTETT,
PÉLDÁNV
8/3
5Ζ
3'~-------*-------------Τ '5'
Ρ (ő). ábra.
Ί (b), ábra.
C Ν D (c). íbra.
KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY
8/2
5'
3. Az 1, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hoo g y a mintát együttesen vagy egymást keivé tőén kezelj ük akár aZ egy olyan, elsőnek nevezett diagnosztikai primőrrel, amelynek az egyik szekvenciája lényegében kompleaentere az első nukleinsav-ezekvencia • ·· · ···· ·· «·*···* * · » ··· · ··· ·· • · 4 · · * ··· ·· »»«·«» · · diagnosztikai szakaszának - az első diagnosztikai primernek van egy olyan terminális nukleotidja, amely Kompl^tientere az említett, feltételezett varians-nukleotidnak -, valamint egy másodiknak nevezett diagnosztikai primőrrel, amelynek az egyik szekvenciája lényegében komplementere a második nukleinsav szekvencia egyik diagnosztikai szakaszának - a második diagnosz tikai priruemek van egy olyan teminális nukleotidja, amely komplementere a komplementernek feltételezett variáns-nukleoticina b/ egy elsőnek nevezett diagnosztikai priiaerrel, amelynek az egyik szekvenciája lényegében ko-iplanentere az első nukieinsev-szekvencia egyik diagnosztikai szakaszának - az első diagnosztikai prinernek van egy olyan terminális nukleotidja, aiaely komplementere annak a normál nukleotidnak, amely roegfeiel az esalitett feltételezett variáns-nukleotidnak - valamint egy inásoaiknak nevezett diagnosztikai primőrrel, amelynek az egyik szekvenciája lényeiében kafipleaeutere a eÁsodik nukleinsav-szekvencia egyik diagnosztikai szakaszának - a ’ώεοαίκ diagnosztikai pri^ernel^an egy olyan terminális nukleotidja, amely komplementere annak a noruál nukleotidnak, amely megteltei az említett feltételezett variáns rit^leotidnakj az első diagnosztikai primer emlitett terminális nukleotidjának, valamint a második diagnosztikai primer emlitett terminális nukieotidjanak egyaránt a megfelelő pr litereknek vaj^y az S’-vé^lyzeteiben vagy a S’-vóghelyzeteiben kell lenniük, és az első nukleinsav-szekvei iciának a Második nukleinsav-székvenciával ellentétes irányban kell elhelyezlcednie»
4« Az 1· igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, h o g y a feltételezett variáns-nukleotidot tartaliaazó minta nukleinsavi^k először legalább egy részét anspliiináljuk és az igy előállított aíoplifi— kaciós temeket kezelendő hintaként alkalmazzuk.
• ···· ·· · • ··· * · »·· ···
5* A 3, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a feltételezett variáns-nuKleotidot tartalmazó minta nukleinsavnak először lei-,alább egy részét araplifikáljuk és az igy kapott íuiplifikációs terméket kezelőnőé mintaként alKaLaazzuk,
6· Az 1. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy a minta nukleinsavnak a kezelését megismételjük a tovabfeiakban legalább egyszer és ennek ereoiaényeként -ugyanazt a célbázis-szekvenciát templátként alkaL-iazva - egy extenziós terméket lineárisan aiuplifikálunk»
7, Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal J e 1 · 1 e ta e z v e , b o g y a diagnosztikai príuer terminális nukleotidja komplementere akár a feltételezett vai’dátis-nukleotidrtök, akár a diagnosztikai priirer S’-véghelyzetében levő megfelelő normál oukleotidnak.
6* A 6« igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a «Mintát 1, 2 vagy 3 nukleozid-trifOszfáttal kezeljük, aminek eredményeként olyan extenziós termek keletkezik, amely csak olyan írtért ékben képes növekedni, araennyire a jelenlévő 1,2 vagy 3 nukleozid-trifoszfát megengedi*
9. A b» igénypont szerinti eljárás, azzal Jellemezve, hogy a mintát három nukleozid-trifcszfúttal kezeljük,
10* Mintegy 5-50 bázispárbcl álló nukleotid szekvencia a találmányunk szerinti eljáráshoz, azzal jellé n esve, hogy az etalitett szekvencia egyik terminális nukleotio ja kompl&oeutere vagy az ogy ismert genetikai rendellenességgel összefüggésben lévé feltételezett variáns-nukleotidnak va,;y a megfelelő normál nuteleotidnakj az emlifcett szekvencia maradéka lényedében komplementere a feltételezett .varláás-nukleotidtxjz csatlakozó ·· : ··:
··« ·· ···
F” ►”· ···. .··.
··· ·· — 94 —
Λ
I megíéleié céibázis-szexvenciáíiak vagy ifl&gfeleló <»n,ál uukleotidnakj az stnIXtett nukleotid szekvenciának olyannak kell lennie, nagy amikör diagnosztikai primurként kerül felhaszMalásra a találmányunk szerinti eljárás megváló altosakor, a diagnosztikai primőrnek egy extenzlós teiw&e jöjjön létre abban az esetben, na a aiai^iűsztikai priiaer esulitett ter-uinális nukleotidja koííipletjentere a célbázis-szekvenciáöan lövő ;úegfeleié nuicieotionak, illetve ne jöjjön létre szintézissel extenziós termék abban az esetben, ha a diagnosztikai priuer említett terminális nukleotidja nem koj^lecsentere a célbázis-szekvenciában levő uegí'elelő nvkleotionak.
11. A 10. iíényjxjnt szerinti nukleotid szekvencia, azzal j e 1 1 e tu e s v e , i'i o g y a tensinális nukleotic. a nukleotid szekvencia 3’vegüelysetében van.
12. A 10. vay a 11* igénypont szerinti nukleotid szekvencia, a z z a*l jelleíiezve , h ο g y a feltételezett variáns-uukleotid a megfelelő noruál szekvencia pontmutációjának az' erednsenye,
13. A 10-12, igénypontok bármelyike szerinti két nukleotid szekvenciából álló készlet, azzal jelleraezve,hogy az egyik szekvencia egyik terminális nukleotidja egy islert genetikai rendellenességgel összefüggésben levő, feltételezett variáns nukleotidnak a komplementere, és a másik szekvencia egyik terminális nukleotidja komplementere a megfelelő nori'él nukleotidnak.
14. Diagnosztikai készlet egy ’únta egy va,-y több nukleirisavában levő legalább egy variáns nukleotid jelenlétének vagy hiányának a kimutatására, azzal j e 1 i e >λ e zve , h o g y a következőket tartá$iiazzai íí/ ety dia^nosztiicai priort a celbázis-szekvencia iuinden egyes diagnosztikai szakaszához; minden egyes diagnosztikai primrben a nuidleotid ·· · • ··· ·«· ··· *
A . í szekvenciának olyannak kell lennie, hogy gyakorlatilag kiegészítse az eialitett diagnosztikai szakaszt; a diagnosztiicai printer egyik tenoinális nukleotid jának olyannak kell lennie, hogy komplementere legyen akár a feltételezett variáijs-nukleotidnak, akár a megfelelő normál nukleotidnak, hogy ilyen módon a diagnosztikai printernek egy extenzics teraeke jöjjön létre szintézissel abban az esetben, ha a diagnosztikai primemek az ealitett terminális nukleotidja koaplofijentere a célbázis-szekvenciában levő megfelelő nukleotidnak, illetve ne jöjjön létre szintézissel extenziós termék abban az esetben, ha a diagnosztikai primer eidlitett terminális nukleotidja rém konipleffientere a célbázis-szekvericiában levő megfelelő nuklaotidnasj h/ a négy Idilóníkiző uukleozid-trifoszfát Mindegyikét; valawint c/ egy olyan szert, anely alkahcas a b/ pontban említett nukleozid-trifoszíátok pojJLmerizálására,
15· A 14. igénypont szerinti diagnosztikai készlet, azzal jelle m e z v e , h o g y két diagnosztikai primerbol álló készletet tartalmaz egy celbázis-szelívencia mindegyik dia^osztikai szakaszához; az egyik diagnosztikai primer egyik terminális nukleotidjánsk olyannak kell lennie, hogy kiegészítse az egy ismert genetikai rendellenessé^·®! összefüggő, feltételezett varians-nukleotidót, a uásik diagnosztikai primer egyik terminális nukleotidja pedig komplementere kell hogy legyen a megfelelő normál nukleocíonak.
14.
1370 Budapxí Q , L·:.' t<;r 2.
Telefon, 172-/199. 172-·Í93 /W ..
Dr. JALSOyerkY GYÖRGYI·;í;
/ ügy'.M
8/1
5,3/ 5'3'
5/----------------------N *-------N5
M5
M (a). ábra.
ΕΎΤΤΝΖΙ0 PRIMER
I
I
A d NTP - SZŰKIGL£T
KORLA'TOZA'JA
Ή (.c). ibra.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB888805692A GB8805692D0 (en) | 1988-03-10 | 1988-03-10 | Method of detecting nucleotide sequences |
| GB888814170A GB8814170D0 (en) | 1988-06-15 | 1988-06-15 | Method of detecting nucleotide sequences |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT52565A true HUT52565A (en) | 1990-07-28 |
Family
ID=26293607
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU891126A HUT52565A (en) | 1988-03-10 | 1989-03-08 | Process and diagnostical set for detecting of nucleotid sections |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5595890A (hu) |
| EP (1) | EP0332435B2 (hu) |
| JP (1) | JP2853864B2 (hu) |
| KR (1) | KR970003151B1 (hu) |
| CN (1) | CN1034673C (hu) |
| AT (1) | ATE75262T1 (hu) |
| AU (1) | AU614584B2 (hu) |
| BG (1) | BG87585A (hu) |
| BR (1) | BR8901136A (hu) |
| CA (1) | CA1323592C (hu) |
| DE (1) | DE68901285D1 (hu) |
| DK (1) | DK175527B1 (hu) |
| ES (1) | ES2039294T5 (hu) |
| FI (1) | FI891126A (hu) |
| GR (2) | GR3004442T3 (hu) |
| HU (1) | HUT52565A (hu) |
| IE (1) | IE61148B1 (hu) |
| IL (1) | IL89545A (hu) |
| MY (1) | MY104957A (hu) |
| NO (1) | NO174825B (hu) |
| NZ (1) | NZ228266A (hu) |
| PL (1) | PL162338B1 (hu) |
| PT (1) | PT89980B (hu) |
| TN (1) | TNSN89026A1 (hu) |
| YU (1) | YU49789A (hu) |
| ZW (1) | ZW3388A1 (hu) |
Families Citing this family (260)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4038804A1 (de) | 1990-10-09 | 1992-04-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur genus- oder/und spezies-spezifischen detektion von bakterien in einer probenfluessigkeit |
| ATE108491T1 (de) * | 1988-03-18 | 1994-07-15 | Baylor College Medicine | Mutationsnachweis durch kompetitiven oligonukleotid-priming. |
| FR2650840B1 (fr) * | 1989-08-11 | 1991-11-29 | Bertin & Cie | Procede rapide de detection et/ou d'identification d'une seule base sur une sequence d'acide nucleique, et ses applications |
| GB8920097D0 (en) * | 1989-09-06 | 1989-10-18 | Ici Plc | Amplification processes |
| JPH03123500A (ja) * | 1989-10-06 | 1991-05-27 | Canon Inc | 核酸の分別方法 |
| GB9001181D0 (en) * | 1990-01-18 | 1990-03-21 | Imp Cancer Res Tech | Genetic assay |
| IL97222A (en) * | 1990-02-16 | 1995-08-31 | Orion Yhtymae Oy | Method and Responder for Determining Special Changes to Nucleotide |
| US6013431A (en) | 1990-02-16 | 2000-01-11 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators |
| GB9006924D0 (en) * | 1990-03-28 | 1990-05-23 | Imperial College | Prognosis of hepatitis infection |
| US5844108A (en) * | 1990-06-22 | 1998-12-01 | Roche Molecular Systems, Inc. | Primers targeted to NAT2 gene for detection of poor metabolizers of drugs |
| ES2103756T3 (es) * | 1990-06-22 | 1997-10-01 | Hoffmann La Roche | Deteccion de metabolizadores ineficaces de farmacos. |
| GB9019512D0 (en) * | 1990-09-06 | 1990-10-24 | Ici Plc | Assay method |
| FR2668162B1 (fr) * | 1990-10-17 | 1993-01-22 | Eurobio Lab | Fragments d'adn, procede et coffret de diagnostic pour la detection des porteurs de la mutation delta-f-508 responsable de la mucoviscidose. |
| IE66125B1 (en) * | 1991-01-31 | 1995-12-13 | Zeneca Ltd | Detection method for variant nucleotides |
| US6004744A (en) | 1991-03-05 | 1999-12-21 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer |
| EP0530009B1 (en) * | 1991-08-27 | 1999-01-13 | Zeneca Limited | Method of characterising genomic DNA |
| US5853989A (en) * | 1991-08-27 | 1998-12-29 | Zeneca Limited | Method of characterisation of genomic DNA |
| DE4129653A1 (de) * | 1991-09-06 | 1993-03-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis aehnlicher nukleinsaeuren |
| IL103935A0 (en) * | 1991-12-04 | 1993-05-13 | Du Pont | Method for the identification of microorganisms by the utilization of directed and arbitrary dna amplification |
| US5541060A (en) * | 1992-04-22 | 1996-07-30 | Arch Development Corporation | Detection of glucokinase-linked early-onset non-insulin-dependent diabetes mellitus |
| US6207368B1 (en) | 1992-08-04 | 2001-03-27 | Beckman Coulter, Inc. | Methods and reagents for controlling chain extension and ligation chain reactions |
| US6180338B1 (en) | 1992-08-04 | 2001-01-30 | Beckman Coulter, Inc. | Method, reagent and kit for the detection and amplification of nucleic acid sequences |
| AU4848393A (en) * | 1992-09-25 | 1994-04-26 | Abbott Laboratories | Ligase chain reaction method for detecting small mutations |
| EP0710296A4 (en) * | 1993-07-23 | 1999-05-26 | Bio Rad Laboratories | LINEAR AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACIDS |
| US6335184B1 (en) | 1993-07-23 | 2002-01-01 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Linked linear amplification of nucleic acids |
| WO1995021270A2 (en) * | 1994-02-04 | 1995-08-10 | Beckman Instruments, Inc. | Method, reagent and kit for the detection and amplification of nucleic acid sequences |
| CA2196795C (en) | 1994-08-12 | 2001-04-03 | Mark H. Skolnick | Method for diagnosing a predisposition for breast and ovarian cancer |
| MX9701075A (es) | 1994-08-12 | 1998-03-31 | Myriad Genetics Inc | Mutaciones en vivo y polimorfismos en el gen de susceptibilidad al cancer de pecho y ovario enlazado con 17q. |
| FR2737732B1 (fr) * | 1995-08-07 | 1997-10-10 | Ass Francaise Contre La Myopat | Test co-dominant de diagnostic genetique |
| US5837492A (en) | 1995-12-18 | 1998-11-17 | Myriad Genetics, Inc. | Chromosome 13-linked breast cancer susceptibility gene |
| IL124620A0 (en) | 1995-12-18 | 1998-12-06 | Myriad Genetics Inc | Chromosome 13-linked breast cancer susceptibility gene |
| CA2240737C (en) | 1995-12-22 | 2009-09-29 | University Of Utah Research Foundation | A long qt syndrome gene which encodes kvlqt1 and its association with mink |
| NO960163D0 (no) * | 1996-01-15 | 1996-01-15 | Thomas Berg | Mutasjonsdeteksjon av bovin |
| US5612473A (en) * | 1996-01-16 | 1997-03-18 | Gull Laboratories | Methods, kits and solutions for preparing sample material for nucleic acid amplification |
| WO1997035033A1 (en) | 1996-03-19 | 1997-09-25 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide |
| GB9609441D0 (en) * | 1996-05-04 | 1996-07-10 | Zeneca Ltd | Process |
| US6361940B1 (en) | 1996-09-24 | 2002-03-26 | Qiagen Genomics, Inc. | Compositions and methods for enhancing hybridization and priming specificity |
| IL119342A0 (en) * | 1996-10-02 | 1997-01-10 | Yeda Research And Development C | Methods for priming and DNA sequencing |
| US6566101B1 (en) | 1997-06-16 | 2003-05-20 | Anthony P. Shuber | Primer extension methods for detecting nucleic acids |
| US5888778A (en) * | 1997-06-16 | 1999-03-30 | Exact Laboratories, Inc. | High-throughput screening method for identification of genetic mutations or disease-causing microorganisms using segmented primers |
| GB9721240D0 (en) * | 1997-10-08 | 1997-12-03 | Zeneca Ltd | Assay |
| US6794133B1 (en) | 1997-12-11 | 2004-09-21 | The General Hospital Corporation | Broad range PCR amplification techniques |
| WO1999044045A1 (en) * | 1998-02-27 | 1999-09-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Single molecule detection with surface-enhanced raman scattering and applications in dna or rna sequencing |
| GB9812768D0 (en) | 1998-06-13 | 1998-08-12 | Zeneca Ltd | Methods |
| US6207379B1 (en) | 1998-09-11 | 2001-03-27 | One Lambda | Method for amplification of DNA |
| CA2352534A1 (en) | 1998-12-08 | 2000-06-15 | Children's Hospital And Regional Medical Center | Polymorphic loci that differentiate escherichia coli 0157:h7 from other strains |
| US6503718B2 (en) | 1999-01-10 | 2003-01-07 | Exact Sciences Corporation | Methods for detecting mutations using primer extension for detecting disease |
| US6280947B1 (en) | 1999-08-11 | 2001-08-28 | Exact Sciences Corporation | Methods for detecting nucleotide insertion or deletion using primer extension |
| ATE501269T1 (de) | 1999-03-18 | 2011-03-15 | Exiqon As | Detektion von genmutationen mittels lna primer |
| US20060275782A1 (en) * | 1999-04-20 | 2006-12-07 | Illumina, Inc. | Detection of nucleic acid reactions on bead arrays |
| US20030207295A1 (en) * | 1999-04-20 | 2003-11-06 | Kevin Gunderson | Detection of nucleic acid reactions on bead arrays |
| US20020025519A1 (en) * | 1999-06-17 | 2002-02-28 | David J. Wright | Methods and oligonucleotides for detecting nucleic acid sequence variations |
| US20030165913A1 (en) * | 1999-06-17 | 2003-09-04 | Sha-Sha Wang | Methods for detecting nucleic acid sequence variations |
| EP1061134A3 (en) * | 1999-06-17 | 2003-01-08 | Becton Dickinson and Company | Oligonucleotides for amplification and detection of hemochromatosis genes |
| WO2000079009A2 (en) | 1999-06-22 | 2000-12-28 | Invitrogen Corporation | Improved primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids |
| US6830902B1 (en) | 1999-07-02 | 2004-12-14 | Invitrogen Corporation | Compositions and methods for enhanced sensitivity and specificity of nucleic acid synthesis |
| EP1072679A3 (en) * | 1999-07-20 | 2002-07-31 | Agilent Technologies, Inc. (a Delaware corporation) | Method of producing nucleic acid molecules with reduced secondary structure |
| DE10038229B4 (de) | 1999-08-24 | 2011-06-09 | LG Electronics Inc., Kangnam-gu | Verfahren und Vorrichtung zur Ratenanpassung in einem Mobilkommunikationssystem |
| US6528066B1 (en) | 1999-09-14 | 2003-03-04 | University Of Iowa Research Foundation | Variant varicella-zoster viruses and methods of use |
| WO2001023410A2 (en) * | 1999-09-28 | 2001-04-05 | Genaissance Pharmaceuticals, Inc. | Drug target isogenes: polymorphisms in the interleukin 13 gene |
| US20030148301A1 (en) * | 1999-12-10 | 2003-08-07 | Toshiya Aono | Method of detecting nucleotide polymorphism |
| WO2003074738A1 (en) * | 2000-01-18 | 2003-09-12 | Quantom Dot Corporation | Oligonucleotide-tagged semiconductor nanocrystals for microarray and fluorescence in situ hybridization |
| US7582420B2 (en) * | 2001-07-12 | 2009-09-01 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| US8076063B2 (en) * | 2000-02-07 | 2011-12-13 | Illumina, Inc. | Multiplexed methylation detection methods |
| US7955794B2 (en) | 2000-09-21 | 2011-06-07 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| US20050214825A1 (en) * | 2000-02-07 | 2005-09-29 | John Stuelpnagel | Multiplex sample analysis on universal arrays |
| US7659054B1 (en) * | 2000-05-23 | 2010-02-09 | Nuvelo, Inc. | Methods for genetic analysis of DNA to detect sequence variances |
| US7435541B2 (en) * | 2000-05-23 | 2008-10-14 | Sequenom, Inc. | Restriction enzyme genotyping |
| AU2000257122A1 (en) * | 2000-07-12 | 2002-01-21 | Bionex, Inc. | Method for detecting sequence variation of nucleic acid |
| JP3638516B2 (ja) * | 2000-09-28 | 2005-04-13 | 株式会社日立製作所 | 核酸検出方法および核酸検出キット |
| US6428964B1 (en) | 2001-03-15 | 2002-08-06 | Exact Sciences Corporation | Method for alteration detection |
| WO2002083839A2 (en) * | 2001-03-30 | 2002-10-24 | Amersham Biosciences Ab | P450 single nucleotide polymorphism biochip analysis |
| CN1186456C (zh) * | 2001-04-30 | 2005-01-26 | 曹卫 | 通用模板核酸检测方法和试剂盒 |
| US7407943B2 (en) | 2001-08-01 | 2008-08-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of apolipoprotein B expression |
| US7888324B2 (en) | 2001-08-01 | 2011-02-15 | Genzyme Corporation | Antisense modulation of apolipoprotein B expression |
| EP2980222A1 (en) | 2001-09-24 | 2016-02-03 | One Lambda, Inc. | Diagnostic probe detection system |
| US20030165859A1 (en) | 2001-10-23 | 2003-09-04 | Invitrogen Corporation | Primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids |
| DK1474529T3 (da) * | 2002-02-08 | 2009-02-23 | Olympus Corp | Specifik multipleksanalyse af nucleinsyrer |
| WO2003071252A2 (en) | 2002-02-15 | 2003-08-28 | Exact Sciences Corporation | Methods for analysis of molecular events |
| JP3752466B2 (ja) * | 2002-04-24 | 2006-03-08 | 株式会社日立製作所 | 遺伝子検査方法 |
| EP1576174A4 (en) | 2002-08-02 | 2007-07-25 | Orchid Cellmark Inc | METHOD AND COMPOSITIONS FOR GENOTYPING |
| US7192700B2 (en) | 2002-12-20 | 2007-03-20 | Orchid Cellmark Inc. | Methods and compositions for conducting primer extension and polymorphism detection reactions |
| US9394332B2 (en) | 2002-08-29 | 2016-07-19 | Epigenomics Ag | Method for bisulfite treatment |
| US20040121374A1 (en) * | 2002-10-02 | 2004-06-24 | Yoshihide Iwaki | Method for detecting single nucleotide polymorphisms |
| US20040259105A1 (en) * | 2002-10-03 | 2004-12-23 | Jian-Bing Fan | Multiplex nucleic acid analysis using archived or fixed samples |
| KR101078977B1 (ko) * | 2002-11-07 | 2011-11-01 | 세키스이 메디칼 가부시키가이샤 | 유전자 변이 검출법 |
| US7511131B2 (en) | 2002-11-13 | 2009-03-31 | Genzyme Corporation | Antisense modulation of apolipoprotein B expression |
| CN1774511B (zh) | 2002-11-27 | 2013-08-21 | 斯昆诺有限公司 | 用于序列变异检测和发现的基于断裂的方法和系统 |
| JP2006516391A (ja) * | 2003-01-29 | 2006-07-06 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 重亜硫酸塩処理の改良された方法 |
| US20040224336A1 (en) * | 2003-03-11 | 2004-11-11 | Gene Check, Inc. | RecA-assisted specific oligonucleotide extension method for detecting mutations, SNPs and specific sequences |
| KR100890885B1 (ko) | 2003-03-31 | 2009-03-31 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 일본 뇌염 바이러스 혈청군의 구성원을 포함하는, 특정플라비바이러스 검출용 조성물 및 방법 |
| US20040219532A1 (en) * | 2003-04-30 | 2004-11-04 | Sampson Jeffrey R. | Internal references measurements |
| US20050053980A1 (en) | 2003-06-20 | 2005-03-10 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping |
| US20050181394A1 (en) * | 2003-06-20 | 2005-08-18 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping |
| US20040259100A1 (en) * | 2003-06-20 | 2004-12-23 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping |
| GB0317592D0 (en) | 2003-07-26 | 2003-08-27 | Astrazeneca Ab | Method |
| WO2005020673A1 (en) * | 2003-08-29 | 2005-03-10 | Instituto Nacional De Technologia Agropecuaria | Rice plants having increased tolerance to imidazolinone herbicides |
| US9394565B2 (en) | 2003-09-05 | 2016-07-19 | Agena Bioscience, Inc. | Allele-specific sequence variation analysis |
| US7501240B2 (en) | 2003-12-02 | 2009-03-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | Method for bisulfite treatment |
| US7129049B2 (en) | 2003-12-22 | 2006-10-31 | Regents Of The University Of Minnesota | Method of detecting equine glycogen storage disease IV |
| US7432082B2 (en) * | 2004-03-22 | 2008-10-07 | Basf Ag | Methods and compositions for analyzing AHASL genes |
| US9249456B2 (en) | 2004-03-26 | 2016-02-02 | Agena Bioscience, Inc. | Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis |
| US20050287558A1 (en) | 2004-05-05 | 2005-12-29 | Crooke Rosanne M | SNPs of apolipoprotein B and modulation of their expression |
| US7939251B2 (en) | 2004-05-06 | 2011-05-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | SENP1 as a marker for cancer |
| WO2005118876A2 (en) | 2004-06-04 | 2005-12-15 | Genentech, Inc. | Egfr mutations |
| WO2006005081A2 (en) * | 2004-06-30 | 2006-01-12 | Applera Corporation | Compositions and methods for identifying nucleotides in polynucleotide sequences |
| US20130055466A1 (en) | 2011-08-31 | 2013-02-28 | Monsanto Technology, Llc | Methods and Compositions for Watermelon Firmness |
| UA97344C2 (uk) * | 2004-07-30 | 2012-02-10 | Басф Агрокемікел Продактс Б.В. | Резистентні до імідазолінонових гербіцидів рослини соняшнику , полінуклеотиди, що кодують резистентні до гербіцидів великі субодиниці білків ацетогідроксикислотної синтази |
| US7981607B2 (en) | 2004-08-27 | 2011-07-19 | Esoterix Genetic Laboratories LLC | Method for detecting recombinant event |
| EP1632578A1 (en) | 2004-09-03 | 2006-03-08 | Roche Diagnostics GmbH | DNA decontamination method |
| WO2006047787A2 (en) | 2004-10-27 | 2006-05-04 | Exact Sciences Corporation | Method for monitoring disease progression or recurrence |
| JP2006129811A (ja) * | 2004-11-08 | 2006-05-25 | Hitachi Ltd | 試料核酸の分析方法、分析装置および分析キット |
| US20060105348A1 (en) * | 2004-11-15 | 2006-05-18 | Lee Jun E | Compositions and methods for the detection and discrimination of nucleic acids |
| US20060275792A1 (en) * | 2004-11-15 | 2006-12-07 | Lee Jun E | Enhancement of nucleic acid amplification using double-stranded DNA binding proteins |
| GB0428255D0 (en) | 2004-12-23 | 2005-01-26 | Health Prot Agency | Detection of nucleic acid mutations |
| EP3581024A1 (en) * | 2005-03-02 | 2019-12-18 | Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria | Herbicide-resistant rice plants, polynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use |
| GB2424886A (en) | 2005-04-04 | 2006-10-11 | Dxs Ltd | Polynucleotide primers against epidermal growth factor receptor and method of detecting gene mutations |
| EP1871796A4 (en) | 2005-04-20 | 2009-01-14 | Auckland Uniservices Ltd | VESICULINE |
| US9777314B2 (en) | 2005-04-21 | 2017-10-03 | Esoterix Genetic Laboratories, Llc | Analysis of heterogeneous nucleic acid samples |
| HUE029181T2 (hu) * | 2005-07-01 | 2017-02-28 | Basf Se | Herbicid-rezisztens napraforgó növények, herbicid-rezisztens acetohidroxisav szintetáz nagy alegység fehérjét kódoló polinukleotidok, és alkalmazási eljárásaik |
| GB0514913D0 (en) * | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Univ Birmingham | Polymorphism |
| US11111544B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| JP2009536222A (ja) | 2006-05-05 | 2009-10-08 | アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド | Ｐｃｓｋ９の発現を調節するための化合物および方法 |
| US7759062B2 (en) | 2006-06-09 | 2010-07-20 | Third Wave Technologies, Inc. | T-structure invasive cleavage assays, consistent nucleic acid dispensing, and low level target nucleic acid detection |
| KR100812259B1 (ko) * | 2006-06-12 | 2008-03-10 | 주식회사 씨젠 | 기지의 서열에 인접한 미지의 ｄｎａ 서열을 증폭하는 방법 |
| EP2377953A1 (en) | 2006-06-23 | 2011-10-19 | Myriad Genetics, Inc. | DPYD gene variants and use thereof |
| CA2662591A1 (en) | 2006-09-07 | 2008-03-13 | Astrazenca Ab | Method for evaluating patients for treatment with drugs targeting ret receptor tyrosine kinase |
| CN102016035A (zh) * | 2006-11-02 | 2011-04-13 | 犹他大学研究基金会 | 可用于等位基因特异pcr的寡聚核苷酸 |
| UA108733C2 (uk) | 2006-12-12 | 2015-06-10 | Толерантна до гербіциду рослина соняшника | |
| US9938641B2 (en) * | 2006-12-18 | 2018-04-10 | Fluidigm Corporation | Selection of aptamers based on geometry |
| WO2008094370A2 (en) | 2006-12-22 | 2008-08-07 | University Of Utah Research Foundation | Method of detecting ocular diseases and pathologic conditions and treatment of same |
| US8314220B2 (en) * | 2007-01-26 | 2012-11-20 | Agilent Technologies, Inc. | Methods compositions, and kits for detection of microRNA |
| CN101679979A (zh) | 2007-03-24 | 2010-03-24 | 基酶有限公司 | 施用与人载脂蛋白b互补的反义寡核苷酸 |
| US10017827B2 (en) | 2007-04-04 | 2018-07-10 | Nidera S.A. | Herbicide-resistant sunflower plants with multiple herbicide resistant alleles of AHASL1 and methods of use |
| US8715665B2 (en) | 2007-04-13 | 2014-05-06 | The General Hospital Corporation | Methods for treating cancer resistant to ErbB therapeutics |
| EP2152908B1 (en) | 2007-05-03 | 2017-03-15 | One Lambda, Inc. | Methods of screening for binding interaction using sets of microparticles and unique probes |
| ES2661249T3 (es) | 2007-05-21 | 2018-03-28 | Genentech, Inc. | Métodos y composiciones para identificar y tratar el lupus |
| US20100203051A1 (en) | 2007-05-31 | 2010-08-12 | The University Of Queensland | Diagnostic markers for ankylosing spondylitis and uses thereof |
| BRPI0811271A2 (pt) * | 2007-05-31 | 2015-01-20 | Monsanto Technology Llc | Polimorfismos da soja e processos de genotipagem |
| EP2700723B1 (en) | 2007-08-06 | 2015-07-15 | Orion Genomics, LLC | Novel single nucleotide polymorphisms and combinations of novel and known polymorphisms for determining the allele-specific expression of the IGF2 gene |
| WO2009029771A2 (en) | 2007-08-29 | 2009-03-05 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for breeding for preferred traits |
| CA2639416C (en) | 2007-09-11 | 2019-12-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Diagnostic test for susceptibility to b-raf kinase inhibitors |
| GB2453173A (en) | 2007-09-28 | 2009-04-01 | Dxs Ltd | Polynucleotide primers |
| US20100324154A1 (en) | 2007-11-01 | 2010-12-23 | Hageman Gregory S | Assessing susceptibility to vascular disorders |
| EP2218019A4 (en) * | 2007-11-02 | 2012-04-18 | Hunch Inc | INTERACTIVE AUTOMATIC LEARNING ADVICE INSTALLATION |
| WO2009074882A2 (en) * | 2007-11-02 | 2009-06-18 | Luminex Molecular Diagnostics, Inc. | One-step target detection assay |
| JP5188789B2 (ja) * | 2007-11-29 | 2013-04-24 | 株式会社日立製作所 | 核酸の定量方法 |
| JP5530185B2 (ja) | 2008-02-05 | 2014-06-25 | オリンパス株式会社 | 核酸検出方法及び核酸検出用キット |
| BRPI0911551B8 (pt) | 2008-04-24 | 2023-10-03 | Monsanto Technology Llc | Método para produzir planta de soja resistente a ferrugem asiática da soja (asr) |
| EP2113574A1 (en) | 2008-04-28 | 2009-11-04 | Biotype AG | Substances and methods for a DNA based profiling assay |
| JP5539325B2 (ja) | 2008-04-30 | 2014-07-02 | インテグレイテツド・デイー・エヌ・エイ・テクノロジーズ・インコーポレイテツド | 修飾されたｒｎａ単量体を用いるｒｎアーゼｈを基礎とするアッセイ |
| US8911948B2 (en) * | 2008-04-30 | 2014-12-16 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| US9115391B2 (en) | 2008-07-02 | 2015-08-25 | Arkray, Inc. | Method of detecting a polymorphism at a polymorphism site |
| JP5590781B2 (ja) | 2008-07-10 | 2014-09-17 | オリンパス株式会社 | 標的核酸比率推定方法 |
| CN105200097A (zh) | 2008-10-20 | 2015-12-30 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 改进的等位基因特异性扩增 |
| EP2186907A1 (en) | 2008-11-11 | 2010-05-19 | Deutsches Primatenzentrum GmbH | X-chromosomal variation as a diagnostic and therapeutic marker for the progression to AIDS |
| CA2751758A1 (en) | 2009-02-11 | 2010-08-19 | Orion Genomics Llc | Combinations of polymorphisms for determining allele-specific expression of igf2 |
| WO2010093465A1 (en) | 2009-02-11 | 2010-08-19 | Caris Mpi, Inc. | Molecular profiling of tumors |
| JP5457222B2 (ja) * | 2009-02-25 | 2014-04-02 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 小型化ハイスループット核酸分析 |
| US9347092B2 (en) * | 2009-02-25 | 2016-05-24 | Roche Molecular System, Inc. | Solid support for high-throughput nucleic acid analysis |
| US9107933B2 (en) | 2009-03-16 | 2015-08-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods of targeting apolipoprotein B for the reduction of apolipoprotein C-III |
| HUE025726T2 (hu) | 2009-03-25 | 2016-04-28 | Genentech Inc | Anti-FGFR3 ellenanyagok és alkalmazásuk |
| WO2010112033A2 (en) | 2009-03-31 | 2010-10-07 | Østjysk Innovation A/S | Method for estimating the risk of having or developing multiple sclerosis using sequence polymorphisms in a specific region of chromosome x |
| US20100299773A1 (en) * | 2009-05-20 | 2010-11-25 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for selecting an improved plant |
| CA2766351C (en) | 2009-06-29 | 2018-02-27 | Luminex Corporation | Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same |
| CN113025703A (zh) | 2009-10-07 | 2021-06-25 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 用于治疗、诊断和监控狼疮的方法 |
| CA2778532A1 (en) | 2009-10-27 | 2011-05-12 | Swift Biosciences, Inc. | Polynucleotide primers and probes |
| CA2779223A1 (en) | 2009-10-27 | 2011-05-12 | Caris Mpi, Inc. | Molecular profiling for personalized medicine |
| US8614071B2 (en) | 2009-12-11 | 2013-12-24 | Roche Molecular Systems, Inc. | Preferential amplification of mRNA over DNA using chemically modified primers |
| US9238832B2 (en) | 2009-12-11 | 2016-01-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids |
| WO2011090154A1 (ja) | 2010-01-21 | 2011-07-28 | アークレイ株式会社 | 標的配列の増幅方法、多型検出方法およびそれに用いる試薬 |
| WO2011128096A1 (en) | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Roche Diagnostics Gmbh | Polymorphism markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment |
| EP2383348B1 (en) | 2010-04-30 | 2015-03-04 | ARKRAY, Inc. | Method for adjusting amplification efficiency of target polynucleotide |
| US9340833B2 (en) | 2010-04-30 | 2016-05-17 | Arkray, Inc. | Method for adjusting amplification efficiency of target polynucleotide |
| GB201008125D0 (en) | 2010-05-14 | 2010-06-30 | Biofortuna Ltd | Tissue typing assays and kits |
| US20190010543A1 (en) | 2010-05-18 | 2019-01-10 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11939634B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-03-26 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| WO2012071096A2 (en) | 2010-09-03 | 2012-05-31 | The Johns Hopkins University | Arid1a and ppp2r1a mutations in cancer |
| WO2012052758A1 (en) | 2010-10-22 | 2012-04-26 | Astrazeneca Ab | Response biomarkers for iap antagonists in human cancers |
| GB2506760B (en) | 2011-01-14 | 2015-07-22 | Genefirst Ltd | Allele specific primers for EGFR exon 21 specific mutations |
| GB201101200D0 (en) | 2011-01-24 | 2011-03-09 | King S College | Method |
| JP6153874B2 (ja) | 2011-02-09 | 2017-06-28 | ナテラ， インコーポレイテッド | 非侵襲的出生前倍数性呼び出しのための方法 |
| AU2012236896A1 (en) | 2011-03-25 | 2013-05-16 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| EP2694959B8 (en) | 2011-04-01 | 2019-12-25 | Genentech, Inc. | Biomarkers for predicting sensitivity to cancer treatments |
| WO2012149193A2 (en) | 2011-04-29 | 2012-11-01 | Monsanto Technology Llc | Diagnostic molecular markers for seed lot purity traits in soybeans |
| US9476040B2 (en) | 2011-05-02 | 2016-10-25 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Plants with useful traits and related methods |
| WO2013030168A1 (en) | 2011-08-31 | 2013-03-07 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for predicting risk of hypertension associated with anti-angiogenesis therapy |
| MX2014002311A (es) | 2011-08-31 | 2014-08-26 | Hoffmann La Roche | Capacidad de respuesta a inhibidores de angiogenesis. |
| AU2012312515A1 (en) | 2011-09-19 | 2014-03-13 | Genentech, Inc. | Combination treatments comprising c-met antagonists and B-raf antagonists |
| TW201321414A (zh) | 2011-10-14 | 2013-06-01 | Genentech Inc | 抗－ＨｔｒＡ１抗體及其使用方法 |
| CN106011243A (zh) | 2011-11-10 | 2016-10-12 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于治疗、诊断和监测阿尔茨海默病的方法 |
| EP2783015A1 (en) | 2011-11-23 | 2014-10-01 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Responsiveness to angiogenesis inhibitors |
| KR20140098834A (ko) | 2011-11-30 | 2014-08-08 | 제넨테크, 인크. | 암에서의 erbb3 돌연변이 |
| JP2015501652A (ja) | 2011-12-14 | 2015-01-19 | アストラゼネカ・アクチエボラーグＡｓｔｒａｚｅｎｅｃａ Ａｋｔｉｅｂｏｌａｇ | Ｇａｂｒ−ａ２診断 |
| EP2607495A1 (en) | 2011-12-23 | 2013-06-26 | Genomica S.A.U. | Method for detection of KRAS mutations |
| US10633707B2 (en) | 2012-04-10 | 2020-04-28 | Vib Vzw | Markers for detecting microsatellite instability in cancer and determining synthetic lethality with inhibition of the DNA base excision repair pathway |
| US10294529B2 (en) | 2012-04-10 | 2019-05-21 | Life Sciences Research Partners Vzw | Microsatellite instability markers in detection of cancer |
| CA3209140A1 (en) | 2012-04-19 | 2013-10-24 | The Medical College Of Wisconsin, Inc. | Highly sensitive surveillance using detection of cell free dna |
| US10077474B2 (en) | 2012-05-29 | 2018-09-18 | Abbott Molecular, Inc. | Method of designing primers, method of detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs), method of distinguishing SNPs, and related primers, detectable oligonucleotides, and kits |
| US20140100126A1 (en) | 2012-08-17 | 2014-04-10 | Natera, Inc. | Method for Non-Invasive Prenatal Testing Using Parental Mosaicism Data |
| EP2711432A1 (en) | 2012-09-21 | 2014-03-26 | Genomica S.A.U. | Method for detection of BRAF and PI3K mutations |
| US10314253B2 (en) | 2012-12-04 | 2019-06-11 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | Methods and compositions for watermelon sex expression |
| EP2959014B1 (en) | 2013-02-25 | 2019-11-13 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for detecting and treating drug resistant akt mutant |
| US20140272956A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Abbott Molecular Inc. | Method for amplification and assay of rna fusion gene variants, method of distinguishing same and related primers, probes, and kits |
| US9365902B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-06-14 | Abbott Molecular Inc. | Detection of bisulfite converted nucleotide sequences |
| US10294489B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-05-21 | Board Of Trustees Of Southern Illinois University | Soybean resistant to cyst nematodes |
| WO2014148557A1 (ja) | 2013-03-19 | 2014-09-25 | 凸版印刷株式会社 | Ｅｇｆｒ阻害剤感受性予測方法 |
| US10059999B2 (en) | 2013-06-10 | 2018-08-28 | Monsanto Technology Llc | Molecular markers associated with soybean tolerance to low iron growth conditions |
| US10767188B2 (en) | 2013-09-25 | 2020-09-08 | Nutech Ventures | Methods and compositions for obtaining useful plant traits |
| NZ630628A (en) | 2013-10-08 | 2015-04-24 | Seminis Vegetable Seeds Inc | Methods and compositions for peronospora resistance in spinach |
| JP2015096049A (ja) | 2013-11-15 | 2015-05-21 | 凸版印刷株式会社 | Ｖｅｇｆ阻害剤長期奏功性予測方法 |
| NZ728726A (en) | 2013-11-27 | 2018-09-28 | Seminis Vegetable Seeds Inc | Disease resistance loci in onion |
| CA3080638C (en) | 2014-02-21 | 2023-07-11 | Syngenta Participations Ag | Genetic loci associated with increased fertility in maize |
| NZ630710A (en) | 2014-02-27 | 2016-03-31 | Seminis Vegetable Seeds Inc | Compositions and methods for peronospora resistance in spinach |
| SG11201607772WA (en) | 2014-03-31 | 2016-10-28 | Debiopharm Int Sa | Fgfr fusions |
| TW201620526A (zh) * | 2014-06-17 | 2016-06-16 | 愛羅海德研究公司 | 用於抑制α－１抗胰蛋白酶基因表現之組合物及方法 |
| US10316369B2 (en) | 2014-06-27 | 2019-06-11 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | Methods and assays for male sterile watermelon |
| WO2016049531A1 (en) | 2014-09-26 | 2016-03-31 | Purecircle Usa Inc. | Single nucleotide polymorphism (snp) markers for stevia |
| EP3005862A1 (en) | 2014-10-10 | 2016-04-13 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | Melon plants with improved disease tolerance |
| CA2961439A1 (en) | 2014-11-05 | 2016-05-12 | Genentech, Inc. | Anti-fgfr2/3 antibodies and methods using same |
| JP7231326B2 (ja) | 2014-11-10 | 2023-03-01 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | Ｉｌ－３３媒介性障害のための治療及び診断方法 |
| US9909169B2 (en) | 2014-12-17 | 2018-03-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids using blocking oligonucleotides for wild type suppression |
| PL3289087T3 (pl) | 2015-04-28 | 2021-11-02 | Monsanto Technology Llc | Sposoby i kompozycje dla wytwarzania brachitycznych roślin kukurydzy |
| US10415101B2 (en) | 2015-04-30 | 2019-09-17 | Monsanto Technology Llc | Methods for producing canola plants with clubroot resistance and compositions thereof |
| EP4428863A2 (en) | 2015-05-11 | 2024-09-11 | Natera, Inc. | Methods and compositions for determining ploidy |
| US10767189B2 (en) | 2015-08-18 | 2020-09-08 | Monsanto Technology Llc | Methods for producing cotton plants with enhanced drought tolerance and compositions thereof |
| US10448595B2 (en) | 2015-09-03 | 2019-10-22 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | Downy mildew resistant lettuce plants |
| US10858709B2 (en) | 2015-09-10 | 2020-12-08 | Monsanto Technology Llc | Methods for producing corn plants with downy mildew resistance and compositions thereof |
| CA3001362C (en) | 2015-10-30 | 2020-10-13 | Genentech, Inc. | Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof |
| WO2017106731A1 (en) | 2015-12-18 | 2017-06-22 | Monsanto Technology Llc | Methods for producing corn plants with northern leaf blight resistance and compositions thereof |
| EP3496528A4 (en) | 2016-08-11 | 2020-03-18 | Monsanto Technology LLC | METHODS AND COMPOSITIONS FOR PRODUCING CORN PLANTS HAVING LATE WITHERING RESISTANCE |
| CN116115629A (zh) * | 2016-08-17 | 2023-05-16 | 菲克特生物科学股份有限公司 | 核酸产品及其施用方法 |
| AU2017232187B2 (en) | 2016-09-30 | 2023-11-09 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | Xanthomonas resistant brassica oleracea plants |
| US20190360033A1 (en) * | 2016-11-02 | 2019-11-28 | The Medical College Of Wisconsin, Inc. | Methods for assessing risk using mismatch amplification and statistical methods |
| US11031099B2 (en) | 2016-11-09 | 2021-06-08 | Roche Molecular Systems, Inc. | Detection of sequence variants |
| WO2018118808A1 (en) | 2016-12-19 | 2018-06-28 | The Broad Institute, Inc. | Methods of treating autism spectrum disorders |
| WO2018170436A1 (en) | 2017-03-16 | 2018-09-20 | Jacobs Farm Del Cabo | Basil with high tolerance to downy mildew |
| EP3615695A1 (en) | 2017-04-24 | 2020-03-04 | Genentech, Inc. | Erbb2/her2 mutations in the transmebrane or juxtamembrane domain |
| CA3063283A1 (en) | 2017-05-17 | 2018-11-22 | Microbio Pty Ltd | Methods and agents for identifying or classifying microbes based on polymorphisms within ribosomal rna genes |
| US11773434B2 (en) | 2017-06-20 | 2023-10-03 | The Medical College Of Wisconsin, Inc. | Assessing transplant complication risk with total cell-free DNA |
| WO2019013451A1 (ko) | 2017-07-12 | 2019-01-17 | 주식회사 진캐스트 | 유전자 변이 특이성이 증가된 dna 중합효소 및 이의 활성 증가용 pcr 버퍼 조성물 |
| US11648551B2 (en) | 2017-12-12 | 2023-05-16 | Essenlix Corporation | Sample manipulation and assay with rapid temperature change |
| US12084720B2 (en) | 2017-12-14 | 2024-09-10 | Natera, Inc. | Assessing graft suitability for transplantation |
| JP7418337B2 (ja) | 2018-02-09 | 2024-01-19 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | マスト細胞媒介性炎症性疾患の治療法及び診断法 |
| CA3090426A1 (en) | 2018-04-14 | 2019-10-17 | Natera, Inc. | Methods for cancer detection and monitoring by means of personalized detection of circulating tumor dna |
| US11268102B2 (en) | 2018-05-16 | 2022-03-08 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Compositions and methods for identifying and selecting brachytic locus in solanaceae |
| EP3888021B1 (en) | 2018-11-30 | 2024-02-21 | Caris MPI, Inc. | Next-generation molecular profiling |
| MX2021008494A (es) | 2019-01-15 | 2021-08-19 | Seminis Vegetable Seeds Inc | Plantas de frijol verde con mejorada resistencia a enfermedades. |
| US11931674B2 (en) | 2019-04-04 | 2024-03-19 | Natera, Inc. | Materials and methods for processing blood samples |
| US20220267452A1 (en) | 2019-07-12 | 2022-08-25 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-mutation type fgfr3 antibody and use therefor |
| US11542513B2 (en) | 2019-09-26 | 2023-01-03 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | Lettuce plants having resistance to Nasonovia ribisnigri biotype Nr:1 |
| CA3163319A1 (en) | 2019-12-02 | 2021-06-10 | Caris Mpi, Inc. | Pan-cancer platinum response predictor |
| IL296227A (en) | 2020-03-11 | 2022-11-01 | Seagen Inc | Methods for treating her2 mutant cancer with toctinib |
| US20230110203A1 (en) | 2020-03-13 | 2023-04-13 | Medimmune Limited | Therapeutic methods for the treatment of subjects with risk alelles in il33 |
| AU2021204717A1 (en) | 2020-07-15 | 2022-02-03 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | Green Bean Plants with Improved Disease Resistance |
| AU2021349384A1 (en) | 2020-09-28 | 2023-05-25 | Seagen Inc. | Methods of treating solid tumors driven by her2 alterations with tucatinib in combination with an anti-her2 antibody |
| US20240024320A1 (en) | 2020-11-17 | 2024-01-25 | Seagen Inc. | Methods of treating cancer with a combination of tucatinib and an anti-pd-1/anti-pd-l1 antibody |
| US20230193310A1 (en) | 2021-12-10 | 2023-06-22 | Seminis Vegetabe Seeds, Inc. | Lettuce plants having resistance to downy mildew |
| US20230404003A1 (en) | 2022-06-21 | 2023-12-21 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | Novel qtls conferring resistance to cucumber mosaic virus |
| EP4445723A1 (en) | 2023-04-14 | 2024-10-16 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | Methods and compositions for peronospora resistance in spinach |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8311018D0 (en) * | 1983-04-22 | 1983-05-25 | Amersham Int Plc | Detecting mutations in dna |
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| CA1284931C (en) * | 1986-03-13 | 1991-06-18 | Henry A. Erlich | Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids |
| US4851331A (en) * | 1986-05-16 | 1989-07-25 | Allied Corporation | Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase |
| GB8612087D0 (en) * | 1986-05-19 | 1986-06-25 | Ici Plc | Hybridisation probes |
| GB8709652D0 (en) * | 1987-04-23 | 1987-05-28 | Williamson R | Diagnosis of cystic fibrosis |
| US4994368A (en) * | 1987-07-23 | 1991-02-19 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Amplification method for polynucleotide assays |
| JP2634208B2 (ja) * | 1987-11-13 | 1997-07-23 | パイオニア・ハイ―ブレツド・インターナシヨナル・インコーポレイテツド | 制限断片長多型性分析方法及びその装置 |
| AU613989B2 (en) * | 1987-11-24 | 1991-08-15 | Gen-Probe Incorporated | Means and method for enhancing nucleic acid hybridization |
| AU2735988A (en) * | 1987-12-21 | 1989-07-13 | Amoco Corporation | Target and background capture methods with amplification for affinity assays |
| US4999290A (en) * | 1988-03-31 | 1991-03-12 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | Detection of genomic abnormalities with unique aberrant gene transcripts |
| WO1989010414A1 (en) * | 1988-04-28 | 1989-11-02 | Robert Bruce Wallace | AMPLIFIED SEQUENCE POLYMORPHISMS (ASPs) |
| AU629845B2 (en) * | 1988-08-30 | 1992-10-15 | Abbott Laboratories | Detection and amplification of target nucleic acid sequences |
| CA1339731C (en) * | 1988-10-12 | 1998-03-17 | Charles T. Caskey | Multiplex genomic dna amplification for deletion detection |
| CA2011818A1 (en) * | 1989-03-17 | 1990-09-17 | Fred T. Oakes | Methods for purification, amplification and detection of a nucleic acid |
| AU5358990A (en) * | 1989-03-21 | 1990-10-22 | Collaborative Research Inc. | Multiplex dna diagnostic test |
| CA2013317A1 (en) * | 1989-04-17 | 1990-10-17 | Fred T. Oakes | Diagnostic kit, primer composition and their use for replication or detection of nucleic acids |
| US5137806A (en) * | 1989-12-11 | 1992-08-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for the detection of sequences in selected DNA molecules |
| US6004744A (en) * | 1991-03-05 | 1999-12-21 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer |
-
1989
- 1989-03-07 IE IE73989A patent/IE61148B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-03-08 IL IL8954589A patent/IL89545A/en unknown
- 1989-03-08 HU HU891126A patent/HUT52565A/hu unknown
- 1989-03-08 NZ NZ228266A patent/NZ228266A/en unknown
- 1989-03-09 MY MYPI89000284A patent/MY104957A/en unknown
- 1989-03-09 CA CA000593183A patent/CA1323592C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-09 BG BG087585A patent/BG87585A/bg unknown
- 1989-03-09 EP EP89302331A patent/EP0332435B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-09 AT AT89302331T patent/ATE75262T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-03-09 CN CN89102694A patent/CN1034673C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-09 YU YU49789A patent/YU49789A/sh unknown
- 1989-03-09 ES ES89302331T patent/ES2039294T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-09 FI FI891126A patent/FI891126A/fi not_active Application Discontinuation
- 1989-03-09 DE DE8989302331T patent/DE68901285D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-09 TN TNTNSN89026A patent/TNSN89026A1/fr unknown
- 1989-03-09 NO NO891012A patent/NO174825B/no not_active IP Right Cessation
- 1989-03-10 ZW ZW33/89A patent/ZW3388A1/xx unknown
- 1989-03-10 BR BR898901136A patent/BR8901136A/pt not_active Application Discontinuation
- 1989-03-10 AU AU31246/89A patent/AU614584B2/en not_active Expired
- 1989-03-10 DK DK198901180A patent/DK175527B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-03-10 PT PT89980A patent/PT89980B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-03-10 JP JP1059492A patent/JP2853864B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-10 KR KR1019890003001A patent/KR970003151B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-03-10 PL PL27817689A patent/PL162338B1/pl unknown
-
1992
- 1992-04-23 GR GR910401845T patent/GR3004442T3/el unknown
-
1995
- 1995-02-17 US US08/390,939 patent/US5595890A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-10-14 GR GR990402594T patent/GR3031532T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT52565A (en) | Process and diagnostical set for detecting of nucleotid sections | |
| Habano et al. | Microsatellite instability in the mitochondrial DNA of colorectal carcinomas: evidence for mismatch repair systems in mitochondrial genome | |
| AU635212B2 (en) | A method for the amplification of nucleotide sequences | |
| JP5095888B2 (ja) | 特異的ｌｎａプライマによる遺伝子内における突然変異の検出 | |
| JP3030417B2 (ja) | インビトロでのｄｎａの増幅、ゲノムクローニングおよびマッピングの、改良された方法 | |
| Yang et al. | Human ceruloplasmin. Tissue-specific expression of transcripts produced by alternative splicing. | |
| JPH05130871A (ja) | 大腸菌中でのサーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼの増加生産 | |
| CN107012221A (zh) | 基于阻断物的富集系统及其应用 | |
| WO2008070370A2 (en) | Oligonucleotides for use in allele-specific pcr | |
| EP3485034B1 (en) | System and method for transposase-mediated amplicon sequencing | |
| TW200532025A (en) | Method of amplifying nucleic acid | |
| AU647806B2 (en) | Genomic mapping method by direct haplotyping using intron sequence analysis | |
| JP2010068797A (ja) | タバココナジラミのバイオタイプの判別方法 | |
| KR20160125155A (ko) | 신규한 황반변성 진단용 마커 및 황반변성 진단방법 | |
| CN102051366B (zh) | 鸡脂肪候选基因lpin1基因及功能突变检测方法 | |
| CA3218042A1 (en) | Treatment of cerebrovascular disease with neurogenic locus notch homolog protein 3 (notch3) agents | |
| CN101260435A (zh) | 与猪生产性状相关的分子标记tiaf1及应用 | |
| WO1995030772A1 (fr) | Procede de detection d'un polymorphisme de gene p4502d6 de cytochrome humain | |
| Nakamura | Application of DNA markers to clinical genetics | |
| KR101099624B1 (ko) | 웅성 불임성 감귤나무의 판별에 특이적인 프라이머 및 이의 용도 | |
| US20040191774A1 (en) | Endothelin-1 promoter polymorphism | |
| JP2006129807A (ja) | 高ｇｃ含量反復配列増幅用長鎖ポリメラーゼチェインリアクション法およびそれを用いた顔面肩甲上腕型筋ジストロフィ診断法 | |
| KR102115938B1 (ko) | 대사증후군의 위험인자 예측용 단일염기다형성 및 이의 용도 | |
| Peres et al. | Absence of Association Between Transforming Growth Factor–β1 Promoter Polymorphisms and Hypodontia | |
| KR20240058125A (ko) | CAMP 반응 요소 결합 단백질 3 유사 3[CAMP Responsive Element Binding Protein 3 Like 3, CREB3L3] 억제제를 사용한 간 질환의 치료 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |