JP2015501652A - Gabr−a2診断 - Google Patents
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Abstract
本発明は、(S)−1−フェニル−2−(ピリジン−2−イル)エタンアミンまたはケタミンのようなNMDAアンタゴニスト薬での治療の候補である患者を選択し、それによってNMDAアンタゴニストに対する応答可能性の増加または減少を予測する方法を提供する。本発明は、rs3756007、rs11503016、rs17537359またはrs1372472として知られている4つの一塩基多型(SNP)部位のいずれかにおけるGABR−A2の配列を決定する方法を提供する。この方法は、これらのGABR−A2のSNPにおける配列を決定するために最適化されたARMSプライマー、および特定のSNPを決定するのに好適なプライマーまたはプローブを含む診断キットも提供する。
Description
本発明は、[(S)−1−フェニル−2−(ピリジン−2−イル)エタンアミン]のようなNMDAアンタゴニスト薬での治療の候補である患者を選択し、それによってNMDAアンタゴニスト薬に対する応答可能性の増加または減少を予測する方法、およびこのような患者を治療する方法に関する。本発明の一部は、GABR−A2(GABA受容体のアルファ−2サブユニット)核酸配列内の様々な部位に存在する特定の多型(複数可)を決定することに関与する。また、NMDAアンタゴニスト薬での治療に対して起こり得る応答を予測するために、これらのSNPを検出することができるプライマー、プローブ、およびキットの使用も本発明の一部である。
大うつ病性障害(MDD)は、1つまたはそれ以上のうつ病エピソードの存在を特徴とし、躁病、混合または軽躁病エピソードの既往がない精神医学的状態である。MDD発症には遺伝学的要素が関連するという証拠があるが、明確な遺伝のパターンは未だ解明されていない。
現在のところ、米国では、MDD治療のために25種より多くの薬剤が承認されている。多様な抗うつ薬が利用可能性であるが、臨床試験では、十分な投与量、持続時間、およびコンプライアンスにもかかわらず、大うつ病患者の30%から40%が、第一選択の抗うつ薬治療に応答しないことが示されている。さらに、現在の治療では、抗うつ作用の開始においてかなりのラグタイムがある。新規の改良されたMDD治療剤を開発する必要があるのは明らかである。現行の療法よりも作用の開始が早く、現行の療法に等しいかまたはそれより優れた忍容性プロファイルを有するうつ病療法は、患者が症状に苦しむ時間と自殺行為に関連するリスクの両方を低減させることができるより優れた代替治療をもたらすであろう(非特許文献1)。
NMDA受容体アンタゴニストのケタミンは、MDD患者において急速な抗うつ作用を有することが研究から示されている(非特許文献2および非特許文献3)。
(S)−1−フェニル−2−(ピリジン−2−イル)エタンアミン(化合物A)は、低親和性のグルタミン酸アンタゴニスト(NMDA受容体のNR1A/2Aサブタイプで350nMのIC50)であり、500人より多くのヒト志願者および患者において極めて良好な忍容性を有し、ケタミン曝露でみられる精神異常作用に相当する精神異常作用を引き起こす性質がほとんどないことが示されている(非特許文献4;非特許文献5;および非特許文献6)。化合物Aは特許文献1に開示されており、そのうつ病治療における使用は特許文献2に開示されている。
Thase、Journal of Clinical Psychiatry、63:95〜103、2002
Bermanら、Biological Psychiatry、47(4):351〜354、2000
Zarateら、Archives of General Psychiatry、63(8):856〜864、2006
Torvaldssonら、Sleep Research.14:149〜155、2005
Leesら、Stroke 322:466〜472、2001
Dienerら、Journal of Neurology 249:561〜568、2002
個別化医療の目的は、どの治療が個体にとって最良の結果をもたらすのかを予測することである。現在のところ、抗うつ薬の起こり得る利点を個々の患者ごとに判断することは不可能である。
本明細書に記載の発明において、NMDAアンタゴニスト薬の化合物Aに対する例えばMDDなどのうつ病または不安を有する患者の応答の程度に影響を与える、GABR−A2遺伝子中の特定の一塩基多型(SNP)が同定された。NMDAアンタゴニスト薬の化合物Aで治療されたものにおいて、SNPのrs3756007、rs1372472、rs11503016、およびrs17537359のそれぞれのマイナーアレルが、改良された結果に関連することが見出された。SNPのrs3756007が、特に強い関連を有することが見出された。実際に、この遺伝学的関連は、複数のテストに合わせて調整が適用されたとしても有意性を保つ(16の独立したマーカー遺伝子座ごとに調整した後、P=0.0336)。例えば化合物AなどのNMDAアンタゴニスト薬で治療する前の、これらの列挙されたSNP位置(例えばSNPのrs3756007)に関するMDD患者の遺伝学的試験は、例えば化合物AなどのNMDAアンタゴニスト薬での治療によって優れた利益を受ける可能性がより高い患者または患者群の同定を補助すると予想される。
GABA受容体は、哺乳動物の中枢神経系のGABA系神経伝達(GABAergic neurotransmission)に関与するタンパク質のファミリーである。GABR−A2は、ヘテロ五量体のリガンド依存性イオンチャンネルのGABA−A受容体遺伝子ファミリーのメンバーであり、これを介して哺乳動物の脳における主要な抑制性神経伝達物質であるGABAが作用する。GABA−A受容体は、バルビツール酸誘導体、ベンゾジアゼピン、およびエタノールなどの多数の重要な薬理学的物質の作用部位である。その遺伝子であるGABR−A2は第4染色体にあり、ガンマ−アミノ酪酸(GABA)受容体のサブユニット(アルファ2)をコードする。
化合物Aに対する応答の強化との関連を示すSNPのrs3756007のマイナーアレルは、C(シトシン)である。配列番号1は、rs3756007のSNPを含むGABR−A2遺伝子の一部を表す。配列番号1として示された配列に関して、rs3756007のSNPは、そのなかの401位にある。
配列番号2は、rs11503016のSNPを含むGABR−A2遺伝子の一部を表す。配列番号2として示された配列に関して、rs11503016のSNPは、そのなかの401位にある。
配列番号3は、rs17537359のSNPを含むGABR−A2遺伝子の一部を表す。配列番号3として示された配列に関して、rs17537359のSNPは、そのなかの401位にある。
配列番号4は、rs1372472のSNPを含むGABR−A2遺伝子の一部を表す。配列番号4として示された配列に関して、rs1372472のSNPは、そのなかの401位にある。
配列番号1〜4の配列には、SNP位置におけるマイナーアレル塩基が記載されている。
本発明の様々な態様は、以下のNMDAアンタゴニスト化合物:(S)−1−フェニル−2−(ピリジン−2−イル)エタンアミン(WO93/20052で開示されている)との併用において特に有用である。
本発明によれば、NMDAアンタゴニスト薬に対する応答可能性の増加または減少を予測するために、NMDAアンタゴニスト薬での治療の候補である患者を選択することが可能になる。特に、前記患者が、うつ病の影響を受けている/うつ病に罹っている場合、NMDAアンタゴニスト薬は、前記うつ病の治療のためのものである。
本発明の一態様によれば、NMDAアンタゴニストでの治療に関する個体の適性を評価する方法であって、a)個体から採取した核酸含有試料中で、それぞれGABR−A2遺伝子配列の一部であるrs3756007、rs11503016、rs17537359、およびrs1372472から選択される1つまたはそれ以上の単一ポリヌクレオチド多型の部位におけるヌクレオチドを決定する工程、およびNMDAアンタゴニストでの治療に関する個体の適性を、該ヌクレオチドの存在に基づいて評価する工程を含む、上記方法が提供される。一実施形態において、(配列番号1に従って)401位またはSNPのrs3756007におけるシトシンの存在は、NMDAアンタゴニスト化合物での治療に対する個体の適性の指標である。一実施形態において、(配列番号2に従って)401位またはSNPのrs11503016におけるチミンの存在は、NMDAアンタゴニスト化合物での治療に対する個体の適性の指標である。一実施形態において、(配列番号3に従って)401位またはSNPのrs17537359におけるシトシンの存在は、NMDAアンタゴニスト化合物での治療に対する個体の適性の指標である。一実施形態において、(配列番号4に従って)401位またはSNPのrs1372472におけるチミンの存在は、NMDAアンタゴニスト化合物での治療に対する個体の適性の指標である。
本発明の一態様によれば、NMDAアンタゴニストでの治療に関する個体の適性を評価する方法であって、a)個体から採取した核酸含有試料中で、それぞれGABR−A2遺伝子配列の一部である配列番号1〜4のいずれか1つにおける位置に従って401位におけるヌクレオチドを決定する工程、およびNMDAアンタゴニストでの治療に関する個体の適性を、該ヌクレオチドの存在に基づいて評価する工程を含む、上記方法が提供される。一実施形態において、(配列番号1に従って)401位またはSNPのrs3756007におけるシトシンの存在は、NMDAアンタゴニスト化合物での治療に対する個体の適性の指標である。一実施形態において、(配列番号2に従って)401位またはSNPのrs11503016におけるチミンの存在は、NMDAアンタゴニスト化合物での治療に対する個体の適性の指標である。一実施形態において、(配列番号3に従って)401位またはSNPのrs17537359におけるシトシンの存在は、NMDAアンタゴニスト化合物での治療に対する個体の適性の指標である。一実施形態において、(配列番号4に従って)401位またはSNPのrs1372472におけるチミンの存在は、NMDAアンタゴニスト化合物での治療に対する個体の適性の指標である。
本発明の他の態様によれば、NMDAアンタゴニストでの治療のために患者を選択する方法であって、患者から得られた核酸含有試料中で、それぞれGABR−A2遺伝子配列の一部である配列番号1〜4のいずれか1つにおける位置に従って401位におけるヌクレオチドを決定する工程、および該核酸が前記位置にマイナーアレルを持つ場合、NMDAアンタゴニスト治療のために患者を選択する工程を含む、上記方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、NMDAアンタゴニストでの治療のために患者を選択する方法であって、(i)患者からの核酸含有試料を用意する工程;(ii)患者の核酸において、それぞれGABR−A2遺伝子配列の一部である配列番号1〜4のいずれか1つにおける位置に従って401位におけるヌクレオチドを決定する工程;およびその決定に基づきNMDAアンタゴニスト治療のために患者を選択する工程を含む、上記方法が提供される。特に、患者の核酸が、(配列番号1に従って)401位にシトシンおよび/または(配列番号2に従って)401位にチミンおよび/または(配列番号3に従って)401位にシトシンおよび/または(配列番号4に従って)401位にチミンを有する場合、その患者が、NMDAアンタゴニスト治療のために選択される。すなわち、患者が、両方の対立遺伝子の401位にシトシンまたはチミンを有するホモ接合型であるか、または一方の対立遺伝子の401位にのみシトシンまたはチミンを有するヘテロ接合型である場合である。
上記の本発明の態様の特定の実施形態において、患者が、NMDAアンタゴニストでの治療に好適であると決定されるか、またはこのような治療のために選択された場合、その患者は、NMDAアンタゴニストで治療される。
本発明の他の態様によれば、(a)うつ病治療が必要な患者を選択する工程であって、該患者のゲノムが、GABR−A2遺伝子中の一塩基多型の位置rs3756007にシトシン、および/またはGABR−A2遺伝子中のSNPのrs11503016にチミン、および/またはGABR−A2遺伝子中のSNPのrs17537359にシトシン、および/またはGABR−A2遺伝子中のSNPのrs1372472にチミンを保持すると同定されている、上記工程;および(b)該患者をNMDAアンタゴニストで治療することを推奨する工程を含む、治療を推奨する方法が提供される。一実施形態において、GABR−A2遺伝子の特定の遺伝子型(上述のSNPのうち1つまたはそれ以上に特定の塩基が存在する)を有する患者が、新規に診断される。他の実施形態において、患者または患者の医師は、患者のGABR−A2遺伝子型について認識しており、例えば、患者が、既往の決定からGABR−A2遺伝子中の一塩基多型の位置rs3756007にシトシンを持つことを認識している。
本発明の他の態様によれば、うつ病に罹った患者に治療を指示する方法であって、(a)患者のゲノムが、GABR−A2遺伝子中の一塩基多型の位置rs3756007にシトシン、および/またはGABR−A2遺伝子中のSNPのrs11503016にチミン、および/またはGABR−A2遺伝子中のSNPのrs17537359にシトシン、および/またはGABR−A2遺伝子中のSNPのrs1372472にチミンを保持すると同定されるかどうかを決定する工程;および(b)患者のゲノムが、GABR−A2遺伝子中の一塩基多型の位置rs3756007にシトシン、および/またはGABR−A2遺伝子中のSNPのrs11503016にチミン、および/またはGABR−A2遺伝子中のSNPのrs17537359にシトシン、および/またはGABR−A2遺伝子中のSNPのrs1372472にチミンを保持すると同定された場合、患者にNMDAアンタゴニストで治療することを指示する工程を含む、上記方法が提供される。
本発明の他の態様によれば、うつ病に罹った患者がNMDAアンタゴニスト薬での治療によって利益を得るのか、または利益を得ないのかを予測する方法であって、前記患者からの核酸含有試料中で、GABR−A2遺伝子中のSNP位置のrs3756007、および/またはrs11503016、および/またはrs17537359、および/またはrs1372472におけるヌクレオチドを決定する工程を含み、これらのSNP位置のいずれかにマイナーアレルが存在するということは、その個体において、NMDAアンタゴニスト薬での治療が、前記SNP位置(複数可)においてメジャーアレルのホモ接合体を有する個体と比較して有効である可能性がより高いと予想されることの指標である、上記方法が提供される。一実施形態において、SNP位置rs3756007におけるシトシンの存在は、前記患者において、NMDAアンタゴニスト薬での治療が、前記位置にチミンを持つ患者と比較して有効である可能性がより高いと予想されることの指標である。
本発明の他の態様によれば、うつ病の影響を受けている患者のうつ病治療において、NMDAアンタゴニスト薬の有効可能性を決定する方法であって、前記患者のGABR−A2遺伝子が、一塩基多型の位置rs3756007、rs11503016、rs17537359またはrs1372472のいずれか1つにマイナーアレルを含むかどうかを決定する工程を含み、ここで、前記SNP位置のいずれかにマイナーアレルが存在することは、うつ病治療において、NMDAアンタゴニスト薬が、患者のGABR−A2遺伝子が前記位置にメジャーアレルのホモ接合体を有する場合よりも有効である可能性がより高いことの指標である、上記方法が提供される。
上記の本発明の態様の特定の実施形態において、GABR−A2遺伝子が、rs3756007にシトシンを持つ場合、その患者は、NMDAアンタゴニスト治療のために選択されるか、またはNMDAアンタゴニストで治療される。本発明の上記態様の他の特定の実施形態において、GABR−A2遺伝子が、rs3756007にチミンを持つ場合、その患者は、NMDAアンタゴニスト治療のために選択されないか、またはNMDAアンタゴニストでの治療に関して除外される。
一実施形態において、本発明の方法は、患者から得られた試料において、GABR−A2遺伝子中の配列番号1で定義された場合に401位に相当する位置の配列を決定する工程を含む。一実施形態において、該方法は、患者から得られた試料において、GABR−A2遺伝子中の配列番号1で定義された場合に401位に相当する位置の配列がシトシンであるかどうかを決定することを含み、それによってNMDAアンタゴニストに対する応答可能性の増加を予測することができる。一実施形態において、該方法は、患者から得られた試料において、GABR−A2遺伝子中の配列番号1で定義された場合に401位に相当する位置の配列がチミンであるかどうかを決定する工程を含む。
本発明の方法は、うつ病および/または不安を有する患者、特に大うつ病性障害(MDD)に罹った患者、単一または再発性のうつ病エピソードを有する患者、治療抵抗性うつ病を有する患者(すなわち他のうつ病治療に応答しないことが見出されている患者;TRD)、双極性うつ病を有する患者、全般性不安障害(GAD)を有する患者、強迫性障害(OCD)を有する患者、パニック障害を有する患者、心的外傷後ストレス障害(PTSD)を有する患者、ならびに社会不安障害を有する患者に使用することが好適である。したがって、本発明の方法は、MDD、TRD、GAD、OCD、PTSD、双極性うつ病、パニック障害または社会不安障害に罹った患者に使用することが好適である。
多数の科学論文および特許出願で、新規のNMDAアンタゴニスト化合物が説明されている。当業者は、本発明で使用するのに適したNMDAアンタゴニストを確認することが可能である。
特に好適な具体的なNMDAアンタゴニスト化合物は、ケタミン、および(S)−1−フェニル−2−(ピリジン−2−イル)エタンアミン(WO93/20052で開示されている)から選択される。
患者から得られた試料は、細胞核酸を含むあらゆる組織またはあらゆる生体試料、例えば循環細胞またはDNAを含む血液試料であってもよい。一実施形態において、血液試料は、全血、血漿、血清またはペレット化した血液であってもよい。一実施形態において、試料は、組織試料である。組織試料は、新鮮な組織試料、凍結試料、固定試料または固定していない試料であってもよい。他の実施形態において、生体試料は、例えば痰、全血などの生物学的流体、または例えば血清もしくは血漿などの血液画分である。他の実施形態において、生体試料は、細胞試料を得るための侵襲を最小限にした技術を使用して得られたものと予想され、このような細胞試料から、GABR−A2遺伝子配列中の1つまたはそれ以上の列挙されたSNP(複数可)が決定される。一実施形態において、生体試料は、患者のゲノムに典型的な核酸を、検出しようとするSNPを同定するのに十分な量で含んでいなければならない。
試料からの分析用核酸の生成は、一般的に、核酸の増幅を必要とする。多くの増幅方法は、酵素による鎖延長によるものである(例えばポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、または自家持続配列複製法)。好ましくは、本発明に係る増幅は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの指数関数的増幅であるか、またはそれを含むものである。
GABR−A2遺伝子の(配列番号1〜4のいずれか1つに従って)401位における特定のヌクレオチド(これは、それぞれrs3756007、rs11503016、rs17537359、およびrs1372472のSNPに相当する)は、当業界における様々な方法によって決定することができる。特定の方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、対立遺伝子特異的プローブもしくはプライマーを用いたハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的増幅(例えば、増幅抵抗突然変異系(amplification refractory mutation system)−ARMS)、酵素による突然変異検出、質量分析、一本鎖高次構造多型、制限酵素断片長多型(RFLP)、WAVE分析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動、高解像度融解もしくは温度勾配ゲル電気泳動または核酸の配列決定が挙げられる。
一実施形態において、GABR−A2遺伝子中のSNP位置のヌクレオチドは、配列決定によって決定される。他の実施形態において、GABR−A2遺伝子中のSNP位置のヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む技術を使用して決定される。さらなる実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応は、配列番号1、2、3または4で定義された場合に401位における塩基を検出する対立遺伝子特異的プライマーを使用する。上述したように、(配列番号1に従って)401位は、rs3756007として知られているSNPである。
本発明の一実施形態において、特定のGABR−A2のSNP(rs3756007、rs11503016、rs17537359またはrs1372472)/GABR−A2遺伝子中の配列番号1〜4の401位を決定する方法は、配列決定、WAVE分析、制限酵素断片長多型(RFLP)、および増幅反応、例えば増幅抵抗突然変異系(ARMS)から選択される、上記方法が提供される。ARMSは、その内容が参照により組み入れられる欧州特許公報第0332435号で説明されており、そこでは、少なくとも1つの塩基が異なるテンプレート配列を選択的に増幅する方法が開示され、特許請求されており、この方法は、現在一般的にARMSと称されている。RFLPは、Zhong(Zhongら、2006、Clinica Chimica Acta:364、205〜208)によって説明されている。本発明の一実施形態において、患者から得られた試料において、GABR−A2遺伝子中のSNPのrs3756007、rs11503016、rs17537359またはrs1372472における特定の塩基を決定する方法は、増幅抵抗突然変異系である、上記方法が提供される。一実施形態において、ARMSは、アガロースゲル、配列決定用ゲルまたはリアルタイムPCRの使用を含んでいてもよい。一実施形態において、ARMSは、リアルタイムPCRの使用を含む。ARMSアッセイは、反応液中のDNAの存在を検出することでPCRの成功を提示する第二のPCR反応と組み合わせてもよい。TaqMan(商標)技術を使用して、異なる蛍光タグで標識したTaqMan(商標)プローブを使用して両方の反応のPCR産物を検出することができる。突然変異を検出するために、配列決定またはRFLPではなくARMSを使用する利点は、ARMSは、プロセシングおよびデータ分析を要しないより迅速な一工程のアッセイであり、ARMSは、野生型ポリヌクレオチドのバックグラウンドと比較して試料における突然変異を検出することができる点である。増幅反応とは、非標的核酸に対して、標的核酸の特異的な増幅が起こる核酸反応のことである。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、周知の増幅反応である。
プローブという用語は、検出しようとする対立遺伝子の標的配列にハイブリダイズ可能な配列を有する、一本鎖配列に特異的なオリゴヌクレオチドを指す。
プライマーという用語は、コピーしようとする核酸の鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成開始地点として作用することができる、一本鎖DNAオリゴヌクレオチド配列または特異的なプライマーを指す。プライマーの長さおよび配列は、プライマーが伸長産物の合成を開始させることができるような長さおよび配列でなければならない。
核酸という用語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記で同定された天然に存在する核酸、またはそれらの相補物にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを包含する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、50%ホルムアミド、5×SSC(750mMのNaCl、75mMクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハルト溶液、10%硫酸デキストラン、および20pg/mlの変性断片化サケ精子DNAを含む溶液中で42℃で一晩インキュベートすること、それに続いてフィルターを、0.1×SSC中で、約65℃で、少なくとも30分洗浄すること、例えばそれぞれ30分で2回洗浄することを指す。
多くの標的およびシグナル増幅方法が文献で説明されており、例えば、これらの方法の一般論は、Landegren,U.ら、Science 242:229〜237(1988)およびLewis,R.、Genetic Engineering News 10:1、54〜55(1990)で説明されている。これらの増幅方法は、本発明者らの発明の方法で使用することができ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、in situのPCR、リガーゼ増幅反応(LAR)、リガーゼハイブリダイゼーション、Qβバクテリオファージレプリカーゼ、転写に基づく増幅システム(TAS)、転写産物配列決定を伴うゲノム増幅(GAWTS)、核酸配列に基づく増幅(NASBA)、およびin situハイブリダイゼーションが挙げられる。様々な増幅技術での使用に好適なプライマーは、当業界公知の方法に従って製造することができる。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、特に米国特許第4,683,195号および4,683,202号で説明されている核酸の増幅方法である。PCRは、DNAポリメラーゼが引き起こすプライマー伸長反応の繰り返しサイクルからなる。標的DNAを熱変性させ、増幅しようとするDNAの逆鎖の標的配列を挟む2つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。これらのオリゴヌクレオチドが、DNAポリメラーゼと共に使用するためのプライマーになる。プライマー伸長によりDNAがコピーされて、両方の鎖の第二のコピーが作られる。熱変性、プライマーのハイブリダイゼーション、および伸長のサイクルを繰り返すことにより、標的DNAを、約2〜4時間で100万倍またはそれよりも多く増幅することができる。PCRは、増幅結果を確認する検出技術と共に使用しなければならない分子生物学的ツールである。PCRの利点は、PCRは、およそ4時間で標的DNAの量を100万から10億倍に増幅することにより感度を向上させる点である。PCRは、診断の状況であらゆる公知の核酸を増幅するのに使用することができる(Mokら、(1994)、Gynaecologic Oncology、52:247〜252)。
自家持続配列複製法(3SR)は、酵素カクテルおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーが介在する逆転写酵素(RT)活性、ポリメラーゼ活性、およびヌクレアーゼ活性の逐次的な繰り返しによる核酸テンプレートの等温増幅を含むTASの改変法である(Guatelliら(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874)。熱変性の代わりに、RNA/DNAヘテロ二本鎖のRNAの酵素分解が使用される。この反応液にRNアーゼH(RNase H)およびその他の全ての酵素を添加し、全ての工程を、さらなる試薬の添加はせずに同じ温度で行う。このプロセスの後、42℃で1時間で106〜109の増幅を達成することができる。
ライゲーション増幅反応またはライゲーション増幅系(LAR/LAS)は、DNAリガーゼおよび4つのオリゴヌクレオチド(標的の鎖あたり2つ)を使用する。この技術は、Wu,D.Y.およびWallace,R.B.(1989)Genomics 4:560によって説明されている。オリゴヌクレオチドは、標的DNA上の隣接する配列にハイブリダイズし、リガーゼによって連結される。この反応液を熱変性させて、サイクルを繰り返す。
Qβレプリカーゼ。この技術では、Lizardiら(1988)Bio/Technology 6:1197で説明されているように、一本鎖RNAを複製するバクテリオファージQβ用のRNAレプリカーゼを使用して、標的DNAを増幅する。まず、標的DNAを、T7プロモーターおよびQβ5’配列領域を包含するプライマーにハイブリダイズさせる。このプライマーを使用して、このプロセスでその5’末端にプライマーが連結されたcDNAが逆転写酵素により生成する。これらの2工程は、TASプロトコールに類似している。得られたヘテロ二本鎖を熱変性させる。次いで、Qβ3’配列領域を含む第二のプライマーを使用して、2周目のcDNA合成を開始させる。それにより、Qβバクテリオファージの5’および3’末端の両方、加えて活性T7RNAポリメラーゼ結合部位を含む二本鎖DNAが生じる。次いでT7RNAポリメラーゼは、二本鎖DNAを転写してQβを模擬する新しいRNAを形成する。十分に洗浄してハイブリダイズしなかった全てのプローブを除去した後、新しいRNAを標的から溶出させ、Qβレプリカーゼで複製する。後者の反応により、およそ20分で107倍の増幅を起こすことができる。
核酸が増幅されれば、単一塩基対突然変異または多型を検出するための多数の技術を利用することができる。このような技術の1つは、一本鎖高次構造多型(SSCP)である。SCCP検出は、電気泳動中の、参照DNAと比較した一本鎖突然変異DNAの異常な移動に基づく。突然変異は、一本鎖DNAのコンフォメーション変化をもたらし、その結果として移動度のシフトが生じる。蛍光SCCPは、検出を補助するために蛍光標識プライマーを使用する。したがって、参照および突然変異体DNAは、蛍光標識プライマーを使用して増幅される。増幅したDNAを変性させて、素早く冷却して、一本鎖DNA分子を生産し、これを非変性ゲル電気泳動によって試験する。
化学的ミスマッチ切断(CMC)は、ヒドロキシルアミン、四酸化オスミウム、およびピペリジンの組み合わせによるDNAミスマッチ塩基対の認識および切断に基づく。したがって、参照DNAおよび突然変異体DNAの両方が蛍光標識プライマーで増幅される。アンプリコンをハイブリダイズさせ、次いでミスマッチしたT塩基に結合する四酸化オスミウム、またはミスマッチしたC塩基に結合するヒドロキシルアミンを使用して切断し、続いてピペリジンにより修飾塩基の部位で切断する。次いで電気泳動により切断したフラグメントを検出する。
また制限断片長多型(RFLP)に基づく技術も使用することができる。
さらに、WAVE分析に基づく技術を使用することができる(Methods Mol.Med.2004;108:173〜88)。このDNA断片分析システムを使用して、一塩基多型を検出することができ、このシステムは、温度変調型液体クロマトグラフィーおよび高分解能マトリックスに基づく(Genet Test.1997〜98;1(3):201〜6)。
リアルタイムPCR(定量PCR、リアルタイム定量PCR、またはRTQ−PCRとして知られている)は、同時にDNAを定量および増幅する方法である(Expert Rev.Mol.Diagn.2005(2):209〜19)。DNAは、ポリメラーゼ連鎖反応により特異的に増幅される。各周の増幅の後、DNAを定量する。一般的な定量方法は、二本鎖DNAに挿入される蛍光色素、および相補的DNAとハイブリダイズすると蛍光を発する修飾DNAオリゴヌクレオチド(プローブと呼ばれる)の使用を包含する。
高感度で迅速なDNA増幅系に、Scorpion(商標)プライマーとして知られている特異的プライマーを使用することができる。このようなプライマーと、単一分子中の特異的な標的配列を有するプローブとを併用することにより、結果として単分子反応速度論による蛍光検出系が得られる(Nucl.Acids Res.2000、28:3752〜3761)。これは、増幅した標的に結合する別々のプローブを必要としない、より速く且つより効率的な検出をもたらすという点で、例えば分子ビーコンおよびTaqMan(登録商標)などの他の蛍光プローブ系よりも優れた利点がある。これら3つの検出方法の直接比較(Nucl.Acids Res 2000、28:3752〜3761)から、Scorpions(登録商標)が、特に迅速なサイクル条件下で、分子間プロービング系よりも優れた性能を発揮することが示されている。Scorpion(商標)プライマーのある改変型の構造は、対象の標的に特異的なプローブ配列を端部に有する約6塩基の相補的なステム配列によりヘアピンループコンフォメーションに保持されている構造である(Nat.Biotechnol.1999、17:804〜807)。またこのステムは、(5’末端に取り付けられた)蛍光レポーター色素をクエンチャー分子と近接させて一緒に配置させるのにも役立つ。このコンフォメーションでは、シグナルは生産されない。PCR−ブロッカーは、プライマー配列からヘアピンループを分離して、Scorpion(登録商標)の3’末端を形成する。このブロッカーは、特異的な標的の非存在下でのヘアピンループのアンフォールディングを引き起こすと予想されるリードスルーを防ぐ。PCR中、通常通りにプライマーから伸長が起こる。それに続く変性およびアニーリング工程の後、ヘアピンループがほどけ、正しい産物が増幅された場合、プローブ配列は、新たに合成された鎖のプライマー下流にある特異的な標的配列に結合する。この新しい構造は、元のヘアピンループよりも熱力学的に安定である。蛍光色素はもはやクエンチャーにごく近接したところにないため、この時点で蛍光シグナルが生成する。蛍光シグナルは、標的DNAの量に正比例する。
代替のScorpion(商標)プライマーは、2つの相補的な標識オリゴヌクレオチドの二重鎖を含む。二重鎖のうち1つのオリゴヌクレオチドは、5’末端レポーター色素で標識され、ブロッカー非コードヌクレオチドとPCRプライマー要素の両方を有し、他方のオリゴヌクレオチドは、3’末端クエンチャー色素で標識される。この場合、作用機序は、実質的に上述のScorpion(商標)ヘアピンプライマーと同じであり:リアルタイム定量PCR中、5’末端レポーターと3’末端クエンチャー色素とが互いに分離して、蛍光発光の有意な増加をもたらす。
Scorpions(商標)と増幅抵抗突然変異系(ARMS)とを併用することができ(Nucl.Acids Res.1989、17:2503〜2516、Nat.Biotechnol.1999、17:804〜807)、それにより単一塩基突然変異の検出が可能になる。適切なPCR条件下で、プライマーの3’末端に位置する単一塩基ミスマッチは、完全にマッチする対立遺伝子を優先的に増幅させるのに十分であることにより(Newtonら、Nucl.Acids Res.17:2503〜2516、1989)、密接に関連した種の識別が可能になる。上述のプライマーを使用する増幅系の基礎は、ミスマッチ3’−残基を有するオリゴヌクレオチドは、適切な条件下のPCRにおいてプライマーとして機能しないということである。この増幅系は、アガロースゲル電気泳動後に反応混合物を検査するだけで遺伝子型解析を可能にする。この増幅系は簡単で信頼でき、いずれの対立遺伝子についても、遺伝子座でヘテロ接合体とホモ接合体とを明確に区別すると予想される。ARMSは、制限酵素消化、従来通りに適用されるような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、またはPCR産物の配列分析を必要としない。
一実施形態において、ヌクレオチドの決定方法は、単一塩基突然変異または多型を検出する対立遺伝子特異的(ARMS)プライマーを用いたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(リアルタイム−PCR)の使用を含む。
GABR−A2遺伝子のrs3756007/(配列番号1の位置に従って)401位における塩基/ヌクレオチドに関して、シトシンは、本明細書では、マイナーアレルと称され、チミンは、メジャーアレルと称される。驚くべきことに、マイナーアレルを持つうつ病に罹った患者は、GABR−A2遺伝子中のrs3756007にメジャーアレルを持つ患者(ホモ接合体)よりも、NMDAアンタゴニストでのうつ病治療に対して有利に応答する可能性が高いことが見出された。
本発明の一実施形態において、上述したようなARMS法であって、第一のプライマー対は、マイナーアレルを検出するのに使用され、第二のプライマー対は、メジャーアレルを検出するのに使用され;ここで、各対の1つのプライマーは:−
(a)特定の対立遺伝子に特異的な3’末端のヌクレオチドを有するプライマー;および
(b)プライマーの3’末端における、可能性のある追加のミスマッチ
を含む、上記方法が提供される。
(a)特定の対立遺伝子に特異的な3’末端のヌクレオチドを有するプライマー;および
(b)プライマーの3’末端における、可能性のある追加のミスマッチ
を含む、上記方法が提供される。
1つの筋書きにおいて、各対の1つのプライマーは:−
(a)プライマー配列と標的配列に特異的なさらなる配列との両方を含む、単一の分子または核酸二重鎖プローブ;
(b)前記単一分子または核酸二重鎖内に、クエンチャー分子と近接してプローブの5’末端に取り付けられた蛍光レポーター色素;
(c)前記プローブの一方の末端における1つまたはそれ以上の非コードヌクレオチド残基;
を含み、
(d)前記レポーター色素およびクエンチャー分子は、標的配列の増幅中に別々になる。
(a)プライマー配列と標的配列に特異的なさらなる配列との両方を含む、単一の分子または核酸二重鎖プローブ;
(b)前記単一分子または核酸二重鎖内に、クエンチャー分子と近接してプローブの5’末端に取り付けられた蛍光レポーター色素;
(c)前記プローブの一方の末端における1つまたはそれ以上の非コードヌクレオチド残基;
を含み、
(d)前記レポーター色素およびクエンチャー分子は、標的配列の増幅中に別々になる。
一実施形態において、プローブは、Scorpion(商標)プローブである。
本発明の一実施形態において、患者から得られた核酸含有試料中で、SNPのrs3756007、rs11503016、rs17537359またはrs1372472におけるGABR−A2遺伝子の配列を決定する方法であって、それぞれ配列番号1〜4に従って401位に相当するGABR−A2遺伝子の配列を認識することができるARMSプライマーの使用を含む、上記方法が提供される。本発明の一実施形態において、患者から得られた試料において、SNPのrs3756007におけるGABR−A2遺伝子の配列を決定する方法であって、配列番号1に従って401位に相当する塩基を含むGABR−A2遺伝子配列の領域が増幅されるように最適化された、ARMSプライマーおよびコンパニオンプライマー(companion primer)の使用を含む、上記方法が提供される。当業者であれば、「増幅されるように最適化された」は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの最適な長さおよび位置を決定することを含むことを理解しているであろう。一実施形態において、特定のSNP塩基の認識が可能なARMSプライマーは、フォワードまたはリバースプライマーのどちらであってもよい。ARMSアッセイで使用するためのフォワードまたはリバースプライマーは、500塩基未満の領域が増幅されるように最適化される。一実施形態において、プライマーは、250塩基未満の領域が増幅されるように最適化される。一実施形態において、プライマーは、200塩基未満の領域が増幅されるように最適化される。一実施形態において、プライマーは、100塩基より大きい領域が増幅されるように最適化される。
一実施形態において、ARMSフォワードプライマーは、配列番号1、2、3または4のいずれかで定義されたような401位に相当する位置におけるGABR−A2遺伝子の配列を認識することができる。一実施形態において、ARMSリバースプライマーは、配列番号1、2、3または4のいずれかで定義されたような401位に相当する位置におけるGABR−A2遺伝子の配列を認識することができる。「認識する」とは、本内容において、プライマーに特異的にハイブリダイズして、および/またはそこからプライマーを容易に伸長させることを意味する。ARMSアッセイで使用されたプライマーはいずれも、基質核酸へのハイブリダイゼーションを強化または容易にするためにロックト核酸を包含していてもよい。ロックト核酸(LNA)オリゴヌクレオチドは、リボースの2’−酸素と4’−炭素とを連結するメチレン架橋を含む。この架橋により、ロックされた3’末端コンフォメーションが生じ、リボースの立体配座のフレキシビリティーを低下させ、リン酸主鎖の局所的な組織化を高める。BraaschおよびCoreyは、LNA/DNAハイブリッドの特性を再調査している(BraaschおよびCorey、2001、Chemistry&Biology 8:1〜7)。
数々の研究から、LNAを含むプライマーは、相補的DNA配列に対する親和性を改善することが示されている。単一のLNA塩基を取り込むことにより、同じ長さおよび配列のDNA:DNA複合体と比較した場合、融解温度(Tm)を41℃まで高めることができ、さらにTm値を9.6℃も高めることもできる。BraaschおよびCoreyは、LNA塩基の包含は、10塩基よりも短いオリゴヌクレオチドに最大の作用を与えると提唱している。
PCRプライマー設計にLNAを使用する意味が概説されている(Latorra、ArarおよびHurley、2003、Molecular and Cellular Probes 17、253〜259)。確実なプライマー設計のルールは確立されていないが、PCRプライマーにおけるLNA置換の最適化は複雑であり、数、位置、および配列の内容に依存すると述べられている。Ugozolliら(Ugozolli、Latorra、Pucket、Arar、およびHamby、2004、Analytical Biochemistry 324、143〜152)は、5’ヌクレアーゼアッセイを使用してリアルタイムPCRでSNPを検出するためのLNAプローブの使用を説明している。Latorraら(Latorra、Campbell、Wolter、およびHurley、2003、Human Mutation 22、79〜85)は、対立遺伝子特異的プライマーとして使用するための、3’末端および3’末端に隣接する位置にLNA塩基を含む一連のプライマーを合成した。ミスマッチLNA配列からのプライミングはDNAプライマーと比べて減少したが、個々の反応の最適化を要した。
一実施形態において、ARMSフォワードおよび/またはリバースプライマーは、標準のDNA塩基のうち1つまたは複数がLNA塩基で置換された配列を含む。
一実施形態において、ARMSアッセイについて上述したようなARMSプライマー対の使用の結果生じる増幅産物に結合することができるARMSプローブが提供される。一実施形態において、ARMSプローブは、標準のDNA塩基のうち1つまたは複数がLNA塩基で置換された配列を含む。一実施形態において、ARMSプローブは、5’末端にYakima Yellow(商標)蛍光タグを含む。一実施形態において、ARMSプローブは、3’末端にBHQ(商標)クエンチャーを含む。当業者であれば、増幅産物においてプローブが結合する(したがってプローブの配列が相補的な)位置は、増幅産物を決定するフォワードおよびリバースプライマーで定められた境界によってのみ制限されることを認識しているであろう。
対照プローブを使用して、ARMSアッセイが目的通りに稼働していることを確認して、ARMSアッセイに使用された試料にDNAが存在することを確認することができる。当業者であれば、対照プローブは、どのような選ばれた遺伝子でも標的にすることができることを理解しているであろう。
本発明の他の態様において、SNPのrs3756007におけるGABR−A2遺伝子の配列を決定する方法であって、患者の生体試料から抽出されたGABR−A2遺伝子のmRNAの逆転写によって生成したcDNAの配列を決定する工程を含む、上記方法が提供される。このような試料は、新鮮な試料、保存試料または他の臨床材料であってもよい。ホルマリン固定した組織からのRNAの抽出は、Bockら、2001 Analytical Biochemistry:295 116〜117で説明されており、固定されていない組織からのRNAの抽出手順、ならびに逆転写によるcDNAの生成プロトコール、PCR増幅、および配列決定は、Sambrook,J.およびRussell,D.W.、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、2001で説明されている。
本発明のさらなる態様は、rs3756007、rs11503016、rs17537359、およびrs1372472からなる群より選択されるGABR−A2のSNPのうち1つの、マイナーアレルを同定することができるハイブリダイゼーションまたは増幅プライマー、ならびにメジャーアレルを同定することができるハイブリダイゼーションまたは増幅プライマー、ならびに場合により使用説明書を含む診断キットを提供する。
本発明のさらなる態様は、GABR−A2における(配列番号1で定義された場合に401位に相当する)rs3756007SNPを検出することができるARMSフォワードまたはリバースプライマー、および場合によりARMSコンパニオンプライマー、ならびに場合により使用説明書を含む診断キットを提供する。検出しようとする対立遺伝子の位置にどちらのプライマー(フォワードまたはリバース)が結合するかによって、他方のプライマーが「コンパニオン」プライマーと称される。本発明の一実施形態において、1つまたはそれ以上のLNA塩基を含み、GABR−A2における配列番号1で定義された場合に401位に相当する位置の配列の認識が可能なARMS突然変異体プライマー、および場合によりARMSコンパニオンプライマー、ならびに場合により使用説明書を含む診断キットが提供される。一実施形態において、診断キットは、NMDAアンタゴニスト治療の候補である患者が前記治療に応答する可能性を予測する方法で使用することができる。代替の実施形態において、診断キットは、NMDAアンタゴニストを用いたうつ病治療の候補である患者を、前記治療のために選択することにおいて使用することができる。
本発明のさらなる態様において、NMDAアンタゴニストを用いたうつ病治療に対する患者の応答を予測するための、配列番号1に従って401位に相当する位置におけるチミンまたはシトシンの認識が可能なプライマーまたはプローブの使用が提供される。
本発明のさらなる態様において、NMDAアンタゴニストを用いたうつ病治療に対する患者の応答を予測するための、配列番号2に従って401位に相当する位置におけるチミンまたはアデニンの認識が可能なプライマーまたはプローブの使用が提供される。
本発明のさらなる態様において、NMDAアンタゴニストを用いたうつ病治療に対する患者の応答を予測するための、配列番号3に従って401位に相当する位置におけるチミンまたはシトシンの認識が可能なプライマーまたはプローブの使用が提供される。
本発明のさらなる態様において、NMDAアンタゴニストを用いたうつ病治療に対する患者の応答を予測するための、配列番号4に従って401位に相当する位置におけるチミンまたはアデニンの認識が可能なプライマーまたはプローブの使用が提供される。
さらなる態様において、NMDAアンタゴニストに対するうつ病に罹った患者の応答を予測するための組成物またはキットの製造における、GABR−A2遺伝子の配列番号1に従って401位、またはGABR−A2遺伝子の配列番号2に従って401位、またはGABR−A2遺伝子の配列番号3に従って401位、またはGABR−A2遺伝子の配列番号4に従って401位に特異的なプライマーまたはプローブの使用が提供される。
本発明のさらなる態様において、配列番号1〜4のいずれかに従って401位に相当する位置における塩基を包含する配列と同一な、または部分的に相補的な、少なくとも12の核酸塩基、例えば少なくとも12、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100個またはそれより多い核酸塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドが提供される。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、50未満の核酸塩基である。該配列が標的配列に部分的に相補的である場合、該配列は、検出および/またはそれからの鎖の伸長が可能になるように前記配列にハイブリダイズできるはずである。
具体的な実施形態において、上述したような方法を使用して、NMDAアンタゴニストの遺伝薬理学を評価することができる。遺伝薬理学とは、薬物に対して異なる応答を引き起こす遺伝学的変異の研究である。患者から得られた試料において、SNPのrs3756007におけるGABR−A2遺伝子の配列、またはそれ以外のいずれか3種の列挙されたGABR−A2遺伝子のSNPを決定して、NMDAアンタゴニストに対する患者の応答を分析することにより、NMDAアンタゴニストの遺伝薬理学を解明することができる。
一実施形態において、NMDAアンタゴニスト治療の候補である患者が、前記治療に対して応答する可能性を予測する方法を使用して、うつ病を有する患者または患者群を、NMDAアンタゴニスト治療のために選択することができる。
一実施形態において、NMDAアンタゴニストで治療するための候補であるうつ病または不安に罹った患者が、前記治療に対して応答する可能性を予測する方法を使用して、うつ病を有する患者または患者群のNMDAアンタゴニストでの治療に対する反応性を予測することができる。
NMDAアンタゴニストは、例えば、1種またはそれ以上の薬学的に許容される担体、添加剤、緩衝剤、アジュバント、安定剤、または本明細書において説明されているような他の材料とその化合物を混合することによって、それを必要とする対象に医薬投与するのに好適な組成物または製剤に取り入れられると予想される。
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で使用される場合、適度なベネフィット・リスク比に見合った、過剰な毒性、炎症、アレルギー性応答、または他の問題もしくは合併症のない、対象(例えばヒト)の組織と接触して使用するのに好適な、確かな医学的判断の範囲内の化合物、材料、組成物、および/または投与形態に関する。また各担体、添加剤なども、製剤の他の成分に適合するという観点で「許容できる」ものでなければならない。
好適な担体、希釈剤、添加剤などは、標準的な医薬の教本で見出すことができる。例えば、Handbook of Pharmaceutical Additives、第2版(M.AshおよびI.Ash編)、2001(Synapse Information Resources,Inc.、Endicott、New York、USA);Remington’s Pharmaceutical Sciences、第20版、Lippincott,Williams&Wilkins出版、2000、またはHandbook of Pharmaceutical Excipients、第2版、1994を参照されたい。
製剤は、単位投与形態で提供することが都合がよい場合があり、薬学分野において周知のあらゆる方法によって製造することができる。このような方法は、活性化合物と、1種またはそれ以上のアクセサリー成分を構成する担体とを接触させる工程を包含する。一般的に、製剤は、活性化合物と、液体担体もしくは微粉化した固形担体またはその両方とを均一かつ緊密に接触させ、次いで必要に応じて生成物を成形することによって製造される。
製剤は、液体、溶液、懸濁液、エマルジョン、エリキシル、シロップ、錠剤、ロゼンジ、顆粒、粉末、カプセル、カシェ剤、丸剤、アンプル、坐剤、ペッサリー、軟膏、ゲル、ペースト、クリーム、スプレー、ミスト、発泡体、ローション、オイル、ボーラス、舐剤、またはエアロゾルの形態であってもよい。
経口投与(例えば、摂取による)に好適な製剤は、それぞれ予め決められた量の活性化合物を含む、例えばカプセル、カシェ剤もしくは錠剤などの別々の単位として;粉末もしくは顆粒として;水性もしくは非水性液体中の溶液または懸濁液として;または水中油型液体エマルジョンもしくは油中水型液体エマルジョンとして;ボーラスとして;舐剤として;またはペーストとして提供されてもよい。
錠剤は、従来の手段により、例えば場合により1種またはそれ以上のアクセサリー成分と共に圧縮または成形することにより作製することができる。圧縮錠剤は、好適な装置で活性化合物を、例えば粉末または顆粒などの流動しやすい状態で、場合により、結合剤(例えばポビドン、ゼラチン、アカシア、ソルビトール、トラガカント、ヒドロキシプロピルメチルセルロース);充填剤または希釈剤(例えばラクトース、微結晶性セルロース、リン酸水素カルシウム);潤滑剤(例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ);崩壊剤(例えばデンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム);表面活性剤または分散剤または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム);および保存剤(例えば、p−ヒドロキシ安息香酸メチル、p−ヒドロキシ安息香酸プロピル、ソルビン酸)のうち1種または複数と混合して圧縮することにより製造することができる。成形錠剤は、好適な装置で、不活性な液体希釈剤で湿潤させた粉末化合物の混合物を成形することにより作製することができる。錠剤は、場合によりコーティングしたり、または刻み目を付けたりしてもよく、さらに、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを、望ましい放出プロファイルになるように様々な比率で使用して、中に含まれる活性化合物の持続放出または制御放出が達成されるように製剤化してもよい。錠剤は、場合により、胃ではなく消化管の部位での放出が達成されるように、腸溶コーティングと共に提供されてもよい。
担体が固体の経鼻投与に好適な製剤としては、鼻で吸い込む方式で、すなわち鼻に近づけて固定した粉末の容器から鼻腔を介して急速に吸入することにより投与される、例えば約20〜約500ミクロンの範囲の粒度を有する粗粉末が挙げられる。例えば鼻内噴霧、点鼻剤として投与するための、またはネブライザーでのエアロゾル投与による、担体が液体の好適な製剤としては、活性化合物の水性または油性溶液が挙げられる。
吸入による投与に好適な製剤としては、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガスなどの好適な噴射剤の使用により、加圧されたパックからエアロゾルスプレーとして提供されるものが挙げられる。
直腸内投与に好適な製剤は、例えば、カカオバターまたはサリチレートを含む好適なベースと共に坐剤として提供されてもよい。
非経口投与(例えば、皮膚注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、および皮内注射などの注射による)に好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定剤、静菌薬、および製剤を対象の受容者の血液と等張にする溶質を含み得る、水性および非水性の、等張の、パイロジェンフリーの滅菌注射液;ならびに懸濁化剤および増粘剤、ならびに化合物が血液成分または1つまたはそれ以上の臓器を標的とするように設計されたリポソームまたは他のマイクロ微粒子系を包含し得る、水性および非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。このような製剤で使用するのに好適な等張のビヒクルの例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、または乳酸加リンゲル注射液が挙げられる。典型的には、溶液中の活性化合物の濃度は、約1ng/ml〜約10μg/ml、例えば約10ng/ml〜約1μg/mlである。製剤は、単回投与または複数回投与用の密封容器、例えばアンプルおよびバイアル中に提供されてもよく、さらに使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水を加えるだけのフリーズドライ(凍結乾燥)した状態で保存してもよい。即時調整用の注射液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、および錠剤から製造してもよい。製剤は、活性化合物が血液成分または1つまたはそれ以上の臓器を標的とするように設計されたリポソームまたは他のマイクロ微粒子系の形態であってもよい。
特定の病状の療法的または予防的治療に必要な各療法における用量の規模は、必然的に、治療される宿主、投与経路、および治療されている疾患の重症度に応じて様々であると予想される。
したがって、最適な投与量は、いずれか特定の患者を治療する医師によって、例えば疾患の重症度およびタイプ、体重、性別、食事、投与の時間および経路、他の薬物療法、ならびに他の関連する臨床的な要因などの、薬物の作用を改変することが公知の様々な要因を考慮することにより決定してもよい。また、毒性を軽減するために、併用治療の要素の上述した用量を減少させることも必要であるかまたは望ましい場合がある。治療的に有効な投与量は、インビトロまたはインビボのどちらの方法で決定してもよい。
本明細書に記載の組成物は、例えば錠剤またはカプセルのような経口投与に好適な形態、例えば粉末または溶液などの経鼻投与または吸入による投与に好適な形態、例えば滅菌溶液、懸濁液またはエマルジョンなどの非経口の注射(静脈内、皮下、筋肉内、血管内または点滴などを含む)に好適な形態、例えば軟膏またはクリームなどの局所投与に好適な形態、例えば坐剤などの直腸内投与に好適な形態であってもよく、または投与経路は、腫瘍への直接注射、もしくは領域への送達、もしくは局所送達によってなされてもよい。
治療的に有効な投与量は、インビトロまたはインビボのどちらの方法で決定してもよい。治療薬物の用量の計算は、医学、薬物動態学、および遺伝薬理学の考察を必要とする複雑な作業である。所定の患者の治療薬物の用量は、例えば疾患の重症度およびタイプ、体重、性別、食物、投与の時間および経路、他の薬物療法、ならびに他の関連する臨床的な要因などの、薬物の作用を改変することが公知の様々な要因を考慮して、主治医によって決定されると予想される。しかしながら、NMDAアンタゴニストは通常、温血動物に、必要であれば分割用量と仮定して、例えば、0.01mg/kg〜75mg/kg体重の範囲の1日用量が与えられるように投与されると予想される。NMDAアンタゴニストは、例えば錠剤、カシェ剤またはカプセルなどで経口投与してもよい。またNMDAアンタゴニストは、非経口投与してもよい。このようなケースでは、より低い用量が使用されると予想される。したがって、例えば、静脈内投与の場合、一般的には0.01mg/kg〜30mg/kg体重の範囲の用量が使用されると予想される。
一実施形態において、NMDAアンタゴニストは、(S)−1−フェニル−2−(ピリジン−2−イル)エタンアミンおよびケタミンからなる群より選択される。
NMDAアンタゴニストの有効量は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の状態によって決まると予想される。したがって、治療専門家により、最適な治療効果を得るために必要に応じて投与量を決めて投与経路を改変する可能性がある。典型的な1日投与量または例えば毎週、2週間ごともしくは毎月などの間欠的な投与量は、上述の要因に応じて、約0.5mgから、300mg、500mg、1000mgもしくは1200mgまでの範囲、またはそれより多くであってもよい。
本発明者らは、NMDAアンタゴニストは、単剤療法として、または他の薬物と組み合わせて使用され得ることを考慮する。また本発明は、アジュバント中でも、または第一選択の療法としても有用である。
一実施形態において、本発明の方法はさらに、上記で説明した方法に係るNMDAアンタゴニストでの治療のために選択された、またはそのような治療に対する応答に関して予測された患者への、NMDAアンタゴニストの投与を含む。
一実施形態において、GABR−A2遺伝子中の(配列番号1〜4のうちいずれか1つに従って)401位に相当する位置における対立遺伝子を決定するために患者の生体試料になされる方法は、この薬物での治療に好適であると同定された患者に、所定量のNMDAアンタゴニストを投与することをさらに含む。特定の実施形態において、決定工程の後、NMDAアンタゴニストが患者に投与される。
本発明のさらなる態様において、上記で説明した方法に係るNMDAアンタゴニストでの治療のために選択された、またはそのような治療に対する応答が予測される、またはより好適な、患者または患者群を治療するための医薬品の製造における、NMDAアンタゴニストの使用が提供される。
本発明のさらなる態様において、本明細書において説明されているような方法に従ってNMDAアンタゴニストに対する応答可能性の増加に関して選択された、または該可能性が増加していると予測された患者または患者群の治療方法であって、前記患者(複数可)にNMDAアンタゴニストを投与する工程を含む、上記方法が提供される。
本発明のさらなる態様において、うつ病または不安に罹った患者の治療方法であって、患者が、上述した本発明の方法に従ってNMDAアンタゴニストに有利に応答するかどうかを決定する工程、および患者がNMDAアンタゴニスト治療に応答する可能性が高いと同定された場合、前記患者にNMDAアンタゴニストの有効量を投与する工程を含む、上記方法が提供される。
本発明のさらなる態様において、うつ病または不安に罹った患者の治療方法であって、
(i)患者からの核酸含有試料を用意する工程、
(ii)GABR−A2遺伝子中のSNPのrs3756007、rs11503016、rs17537359またはrs1372472のうちいずれか1つにおける対立遺伝子を決定する工程;および
(iii)患者の細胞性DNAが前記位置にマイナーアレルを持つ場合、患者に、有効量のNMDAアンタゴニストを投与する工程
を含む、上記方法が提供される。
(i)患者からの核酸含有試料を用意する工程、
(ii)GABR−A2遺伝子中のSNPのrs3756007、rs11503016、rs17537359またはrs1372472のうちいずれか1つにおける対立遺伝子を決定する工程;および
(iii)患者の細胞性DNAが前記位置にマイナーアレルを持つ場合、患者に、有効量のNMDAアンタゴニストを投与する工程
を含む、上記方法が提供される。
本発明のさらなる態様において、うつ病または不安に罹った患者の治療方法であって、
(iv)患者からの核酸含有試料を用意する工程
(v)GABR−A2遺伝子中のSNP位置rs3756007における対立遺伝子を決定する工程;および
(vi)患者の細胞性DNAが前記位置にシトシンを持つ場合、患者に、有効量のNMDAアンタゴニストを投与する工程
を含む、上記方法が提供される。
(iv)患者からの核酸含有試料を用意する工程
(v)GABR−A2遺伝子中のSNP位置rs3756007における対立遺伝子を決定する工程;および
(vi)患者の細胞性DNAが前記位置にシトシンを持つ場合、患者に、有効量のNMDAアンタゴニストを投与する工程
を含む、上記方法が提供される。
本発明のさらなる態様において、NMDAアンタゴニスト治療の候補である患者の治療方法であって、
(i)患者から得られた試料において、以下に示す配列番号1で定義された位置401位におけるGABR−A2の塩基がシトシンであるかどうかを決定する工程;および
(ii)工程(i)で決定された塩基がシトシンである場合、前記患者にNMDAアンタゴニストの有効量を投与する工程
を含む、上記方法が提供される。
(i)患者から得られた試料において、以下に示す配列番号1で定義された位置401位におけるGABR−A2の塩基がシトシンであるかどうかを決定する工程;および
(ii)工程(i)で決定された塩基がシトシンである場合、前記患者にNMDAアンタゴニストの有効量を投与する工程
を含む、上記方法が提供される。
本発明のさらなる態様において、NMDAアンタゴニスト治療の候補である患者の治療方法であって、
(i)患者から得られた試料において、配列番号1〜4のいずれかに従って401位におけるGABR−A2の配列がマイナーアレルであるかどうかを決定する工程;および
(ii)工程(i)の答えがイエスである場合、前記患者に、NMDAアンタゴニストの有効量を投与する工程
を含む、上記方法が提供される。
(i)患者から得られた試料において、配列番号1〜4のいずれかに従って401位におけるGABR−A2の配列がマイナーアレルであるかどうかを決定する工程;および
(ii)工程(i)の答えがイエスである場合、前記患者に、NMDAアンタゴニストの有効量を投与する工程
を含む、上記方法が提供される。
本発明のさらなる態様において、
(a)うつ病または不安の治療が必要な患者を選択する工程であって、該患者のゲノムが、GABR−A2遺伝子中の一塩基多型の位置rs3756007にシトシンを保持すると同定されている、上記工程;および
(b)患者をNMDAアンタゴニストで治療する工程
を含む、治療方法が提供される。
(a)うつ病または不安の治療が必要な患者を選択する工程であって、該患者のゲノムが、GABR−A2遺伝子中の一塩基多型の位置rs3756007にシトシンを保持すると同定されている、上記工程;および
(b)患者をNMDAアンタゴニストで治療する工程
を含む、治療方法が提供される。
本発明のさらなる態様において、
(a)NMDAアンタゴニストを含有するパッケージを製造する工程;および
患者のうつ病または不安を治療するためにNMDAアンタゴニストの使用を推奨するラベルまたは挿入印刷物(printed inset)をパッケージに入れる工程であって、該患者のゲノムが、GABR−A2遺伝子中の一塩基多型の位置rs3756007にシトシン、および/またはGABR−A2遺伝子中の一塩基多型の位置rs11503016にチミン、および/またはGABR−A2遺伝子中の一塩基多型の位置rs17537359にシトシン、および/またはGABR−A2遺伝子中の一塩基多型の位置rs1372472にチミンを含む、上記工程
を含む、市販薬の製造方法が提供される。
(a)NMDAアンタゴニストを含有するパッケージを製造する工程;および
患者のうつ病または不安を治療するためにNMDAアンタゴニストの使用を推奨するラベルまたは挿入印刷物(printed inset)をパッケージに入れる工程であって、該患者のゲノムが、GABR−A2遺伝子中の一塩基多型の位置rs3756007にシトシン、および/またはGABR−A2遺伝子中の一塩基多型の位置rs11503016にチミン、および/またはGABR−A2遺伝子中の一塩基多型の位置rs17537359にシトシン、および/またはGABR−A2遺伝子中の一塩基多型の位置rs1372472にチミンを含む、上記工程
を含む、市販薬の製造方法が提供される。
本発明のさらなる態様において、上述の方法に従ってNMDAアンタゴニスト治療に応答する可能性が高いと同定された患者を治療するための医薬品の製造における、NMDAアンタゴニストの使用が提供される。
本発明のさらなる態様において、うつ病または不安を有する患者を治療するための医薬品の製造におけるNMDAアンタゴニストの使用であって、該患者の細胞性DNAが、本明細書において説明された方法のいずれかに従って、GABR−A2遺伝子中の配列番号1に従って401位に相当する位置にシトシンを持つことが決定されている、上記使用が提供される。
本発明のさらなる態様において、うつ病または不安に罹った患者の治療で使用するためのNMDAアンタゴニストであって、該患者の細胞性DNAが、(配列番号1に従って)401位に相当するGABR−A2遺伝子中にシトシンを持つことが決定されている、上記NMDAアンタゴニストが提供される。
本発明のさらなる態様において、うつ病または不安に罹った患者の治療で使用するためのNMDAアンタゴニストであって、該患者の細胞性DNAが、GABR−A2遺伝子中のrs3756007、rs11503016、rs17537359またはrs1372472のSNPのうちいずれか1つにおいてマイナーアレルを持つと同定されている、上記NMDAアンタゴニストが提供される。
本発明のさらなる態様において、患者の細胞性DNAが、GABR−A2遺伝子中の、一塩基多型の位置rs3756007にシトシン、および/または一塩基多型の位置rs11503016にチミン、および/または一塩基多型の位置rs17537359にシトシン、および/または一塩基多型の位置rs1372472にチミンを持つと予め同定されている1人またはそれ以上の患者におけるうつ病または不安の治療で使用するためのNMDAアンタゴニスト薬が提供される。
上述したように、本発明の様々な態様は、大うつ病性障害(MDD)に罹った患者、単一または再発性のうつ病エピソードを有する患者、治療抵抗性うつ病を有する患者(すなわち他のうつ病治療に応答しないことが見出されている患者;TRD)、双極性うつ病を有する患者、全般性不安障害(GAD)を有する患者、強迫性障害(OCD)を有する患者、パニック障害を有する患者、心的外傷後ストレス障害(PTSD)を有する患者、ならびに社会不安障害を有する患者に使用することが好適である。
上述したように、以下のNMDAアンタゴニスト化合物:(S)−1−フェニル−2−(ピリジン−2−イル)エタンアミン(WO93/20052で開示されている)およびケタミンが、本発明の様々な態様で使用するのに特に好適である。
以下の非限定的な実施例によって本発明を例示する。
実施例1−ゲノムDNA試料を、化合物Aの第II相試験に登録した個体から収集した(この試験における患者総数は152であった)。第II相試験を、うつ病治療における化合物Aの効能が測定されるように設計した。うつ病治療で使用された薬物療法に対して低い応答を示すものと定義された患者の治療歴に基づき、上述の第II相試験に登録するための患者を選択した。脳由来神経栄養因子(BDNF)およびGABAA受容体(GABR−A2)のアルファ−2サブユニットをコードする遺伝子における共通の遺伝学的変異(一塩基多型、SNP)をTaqMan(登録商標)アッセイを使用して試験し、化合物A(N−メチル−D−アスパルテート(NMDA)アンタゴニスト)でのうつ病治療に対する応答へのそれらの影響を測定した。治療への応答の測定法として、モンゴメリー−アスバーグ(Montgomery−Åsberg)うつ病評価尺度(MADRS;Montgomery SA、Asberg M(1979年4月).「A new depression scale designed to be sensitive to change」.British Journal of Psychiatry 134(4):382〜89)を使用した。GABR−A2およびBDNFにおける6つのSNPの遺伝子型解析のために、32種のSNPを選択した。
BDNFの遺伝学的分析の結果からは、治療への応答における変化への寄与は実証されなかった。しかしながら、GABR−A2遺伝子の結果からは、多数のSNPに関してMADRSにおける基準からの変化への影響が示され、なかでもrs3756007SNPは最も強い関連を示した。表1に、化合物Aでの治療後にマイナーアレルがMADRSの変化に平均して正の影響を与えた、テストされた遺伝学的変異を列挙する。薬物で治療された患者(治療群)からのP値も示す(治療的p値)。
したがって、テストされたGABR−A2のSNPのなかでも、化合物Aで治療され、rs3756007、rs11503016、rs17537359、およびrs1372472にマイナーアレルを有する患者は、メジャーアレルのホモ接合体の保因者よりも平均して大きい改善を達成した。
SNP検出
TaqMan(登録商標)アッセイを使用して、標的遺伝子内の特定のSNPを検出した。各TaqMan(登録商標)アッセイは、所定の突然変異または対立遺伝子に特異的であり、すなわち所定の位置において他の塩基に対して代替の塩基が検出されるように設計された。各TaqMan(登録商標)アッセイは、標的塩基(SNP)を同定するために様々な蛍光タグで標識したTaqMan(登録商標)プローブと共に標的遺伝子中の対象の多型配列を増幅する配列特異的なフォワードおよびリバースプライマーを含んでいた。TaqMan(登録商標)アッセイをApplied Biosystems(登録商標)に注文し、可能な場合、プレ−デザインドSNPジェノタイピング・アッセイ(Pre−Designed SNP Genotyping Assays)を使用した。市販のプレ−デザインドSNPジェノタイピング・アッセイを使用して、化合物Aでのうつ病治療に対する応答への影響との関連を示すGABR−A2のSNPそれぞれを検出した。表1にSNPそれぞれのカタログ番号を列挙した。
TaqMan(登録商標)アッセイを使用して、標的遺伝子内の特定のSNPを検出した。各TaqMan(登録商標)アッセイは、所定の突然変異または対立遺伝子に特異的であり、すなわち所定の位置において他の塩基に対して代替の塩基が検出されるように設計された。各TaqMan(登録商標)アッセイは、標的塩基(SNP)を同定するために様々な蛍光タグで標識したTaqMan(登録商標)プローブと共に標的遺伝子中の対象の多型配列を増幅する配列特異的なフォワードおよびリバースプライマーを含んでいた。TaqMan(登録商標)アッセイをApplied Biosystems(登録商標)に注文し、可能な場合、プレ−デザインドSNPジェノタイピング・アッセイ(Pre−Designed SNP Genotyping Assays)を使用した。市販のプレ−デザインドSNPジェノタイピング・アッセイを使用して、化合物Aでのうつ病治療に対する応答への影響との関連を示すGABR−A2のSNPそれぞれを検出した。表1にSNPそれぞれのカタログ番号を列挙した。
プレ−デザインドアッセイが利用できないSNPには、カスタムTaqMan(登録商標)SNPジェノタイピング・アッセイを使用した。表2に、rs490434に対して特注設計された代表的なSNPアッセイで使用されたプライマーおよびプローブ配列ならびに標識を示す。
各SNPアッセイについて、ゲノムDNAを臨床試料から抽出し、TaqMan(登録商標)アッセイを表2に記載のプライマーを使用して行った。TaqMan(登録商標)反応には、総反応体積2μlでゲノムDNAをおよそ10ng使用した。この反応には、TaqMan(登録商標)ジェノタイピング・マスター・ミックス(Genotyping Master Mix)(Applied Biosystems(登録商標)、品番4381657)を使用した。TaqMan(登録商標)ジェノタイピング・マスター・ミックスを脱イオン水で1:1に希釈し、TaqMan(登録商標)アッセイを80倍濃度で使用した。次いでこの反応液を、熱サイクルの前にしっかりと密封した。サイクル条件は:サーマルサイクラー装置(KBiosystemsのDT−108サーマルサイクラー)中で、95℃で10分、続いて92℃で15秒、60℃で60秒を40サイクルであった。次いで、Applied Biosystems(登録商標)7900HTシークエンス・デテクション・システム(Sequence Detection System)で、Applied Biosystems(登録商標)SDS v2.4ソフトウェア中の予めプログラム化された「アレリック・ディスクリミネーション(Allelic Discrimination)」分析を使用してプレートを解析した。
Claims (15)
- NMDAアンタゴニスト薬での治療のために患者を選択する方法であって、前記患者からの核酸含有試料中で、GABR−A2遺伝子中の一塩基多型(SNP)の位置rs3756007、および/またはrs11503016、および/またはrs17537359、および/またはrs1372472におけるヌクレオチドを決定することを含み、ここで、rs3756007にシトシン、またはrs11503016にチミン、またはrs11503016にチミン、またはrs1372472にチミンがある場合、前記患者は、NMDAアンタゴニスト薬での治療のために選択される、上記方法。
- (a)うつ病および/または不安の治療が必要な患者を選択する工程であって、該患者のゲノムが、GABR−A2遺伝子中のrs3756007、rs11503016、rs17537359またはrs1372472のいずれか1つにマイナーアレルを保持すると同定されている、上記工程;および
(b)該患者をNMDAアンタゴニストで治療することを推奨する工程
を含む、治療を推奨する方法。 - NMDAアンタゴニスト薬は、(S)−1−フェニル−2−(ピリジン−2−イル)エタンアミンおよびケタミンからなる群より選択される、請求項1または2に記載の方法。
- NMDAアンタゴニスト薬は、(S)−1−フェニル−2−(ピリジン−2−イル)エタンアミンである、請求項1または2に記載の方法。
- うつ病および/または不安は、大うつ病性障害(MDD)、単一または再発性のうつ病エピソード、治療抵抗性うつ病(TRD)、双極性うつ病、全般性不安障害(GAD)、強迫性障害(OCD)、パニック障害、心的外傷後ストレス障害(PTSD)、および社会不安障害から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 核酸含有試料は、固形組織試料または生物学的流体試料である、請求項1に記載の方法。
- GABR−A2遺伝子中の位置rs3756007、rs11503016、rs17537359またはrs1372472におけるヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、対立遺伝子特異的プローブもしくはプライマーを用いたハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的増幅(増幅抵抗突然変異系−ARMSのような)、酵素による突然変異検出、質量分析、一本鎖高次構造多型、制限酵素断片長多型(RFLP)、WAVE分析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動、高解像度融解もしくは温度勾配ゲル電気泳動または核酸の配列決定によって決定される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- GABR−A2遺伝子中の位置rs3756007、rs11503016、rs17537359またはrs1372472におけるヌクレオチドは、配列決定または対立遺伝子特異的増幅によって決定される、請求項7に記載の方法。
- うつ病に罹った患者が、NMDAアンタゴニスト薬での治療に有利に応答する可能性があるかどうかを予測するための、GABR−A2遺伝子中のrs3756007、rs11503016、rs17537359またはrs1372472のSNPのいずれか1つにおけるヌクレオチドを決定することができるオリゴヌクレオチドプライマーの使用。
- (a)うつ病治療が必要な患者を選択する工程であって、該患者のゲノムが、GABR−A2遺伝子中の一塩基多型の位置rs3756007にシトシンを保持すると同定されている、上記工程;および
(b)該患者をNMDAアンタゴニストで治療する工程
を含む、治療方法。 - うつ病または不安に罹った患者に、有効量のNMDAアンタゴニスト薬を投与する工程であって、該患者の細胞性DNAが、GABR−A2遺伝子中のrs3756007、rs11503016、rs17537359またはrs1372472のいずれかにマイナーアレルを含むことが決定されている、上記工程を含む、うつ病または不安に罹った患者の治療方法。
- (a)NMDAアンタゴニストを含有するパッケージを製造する工程;および
(b)患者のうつ病を治療するためにNMDAアンタゴニストの使用を推奨するラベルまたは挿入印刷物をパッケージに入れる工程であって、該患者のゲノムが、GABR−A2遺伝子中の一塩基多型の位置rs3756007にシトシンを含む、上記工程
を含む、市販薬の製造方法。 - NMDAアンタゴニストは、(S)−1−フェニル−2−(ピリジン−2−イル)エタンアミンおよびケタミンから選択される、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 1人またはそれ以上の患者におけるうつ病または不安の治療で使用するためのNMDAアンタゴニストであって、該患者の細胞性DNAが、GABR−A2遺伝子中のrs3756007として知られている一塩基多型にシトシンを持つと決定されている、上記NMDAアンタゴニスト。
- (S)−1−フェニル−2−(ピリジン−2−イル)エタンアミンおよびケタミンから選択される、請求項14に記載のNMDAアンタゴニスト。
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