JP2005176601A - Ｃｙｐ２ｄ６変異遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【課題】CYP2D6変異遺伝子の多型を同定し、同定した遺伝子多型と、薬物反応性（薬物代謝能）や薬剤代謝活性との関係を解明すること。
【解決手段】ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の塩基配列における少なくとも１０個の連続するヌクレオチドであって、該塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位を含む上記ヌクレオチドを含む１０〜１００塩基の核酸。
【選択図】 なし
【解決手段】ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の塩基配列における少なくとも１０個の連続するヌクレオチドであって、該塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位を含む上記ヌクレオチドを含む１０〜１００塩基の核酸。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、薬剤代謝酵素をコードするCYP2D6遺伝子の新規な多型に関するものである。さらに本発明は、CYP2D6遺伝子の多型変異を利用して薬剤代謝活性を判定する方法にも関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
CYP2D6は9つのエクソンからなる約4.5 kbpの遺伝子で、遺伝的多型が数多く報告されている分子種である（Nelson,D.R.,他、Pharmacogenetics, 6, 1-42, 1996；及びDaly,A.K.,他、Pharmacogenetics, 6, 193-201, 1996）。白色人種では約7 %、日本人では約0.5 %の酵素欠損者（poor metabolizer : PM）が存在し、また、白色人種においてハプロイドゲノム（片側染色体；nのこと。通常の体染色体は2nである。）あたり13コピーのCYP2D6を有した多酵素所持者（またはsuper metabolizer : SM）の報告もあり（Dahl,M.L.,他、J.Pharmacol.Exp.Ther., 2 74, 516-520, 1995）、個人遺伝子情報の多様性に依存したと考えられる代謝の個体差が認められている。しかしながら、薬物代謝とCYP2D6遺伝子の多型との詳細な関係は不明であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、CYP2D6変異遺伝子の多型を同定し、同定した遺伝子多型と、薬物反応性（薬物代謝能）や薬剤代謝活性との関係を解明することを解決すべき課題とした。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために、先ず、CYP2D6遺伝子の多型を検査することにした。本発明者らは今回の検査に際して、結果精度を最重要視し、ゲノム−PCRダイレクトシークエンス法を採用した。また、遺伝子完全欠損型であるCYP2D6*5に関しては原則としてLong-PCR法により検出し、陽性サンプルに関してサザンハイブリダイゼーション法を用いて検出した。その結果、本発明者らは、CYP2D6遺伝子について新規の複数の変異遺伝子を同定することに成功した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
【０００５】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１） 配列番号１に記載の塩基配列における少なくとも１０個の連続するヌクレオチドであって、該塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位を含む上記ヌクレオチドを含む１０〜１００塩基の核酸。
（２） ＤＮＡである、（１）に記載の核酸。
（３） ＲＮＡである、（１）に記載の核酸。
【０００６】
（４） 配列番号１に記載の塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位を含む配列またはその相補体にハイブリダイズする、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド。
（５） プローブまたはプライマーとして使用する、（４）に記載の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド。
【０００７】
（６） （１）個体から核酸を調製する工程；および、
（２）工程（１）で調製した核酸について、配列番号１に記載の塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位の塩基を決定する工程；
を含む、個体における遺伝子多型の分析方法。
【０００８】
（７） （１）個体から核酸を調製する工程；
（２）工程（１）で調製した核酸について、配列番号１に記載の塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位の塩基を決定する工程；及び
（３）工程（２）で決定した塩基の情報に基づき、該個体の薬剤代謝活性を予測する工程；
を含む、薬剤代謝活性の判定方法。
【０００９】
（８） 配列番号２から５の何れかに記載の塩基配列を有する遺伝子。
（９） 配列番号２から５の何れかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（１０） 個体から調製した核酸について、配列番号１に記載の塩基配列において１００番目の塩基がＣからＴに置換する変異、２８５０番目の塩基がＣからＴに置換する変異、及び４１８０番目の塩基がＧからＣに置換する変異の有無を検出する工程を含む、配列番号２または配列番号５に記載の塩基配列を有する遺伝子の検出方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
（Ｉ）本発明の核酸
本発明は、配列番号１に記載の塩基配列における少なくとも１０個の連続するヌクレオチドであって、該塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位を含む上記ヌクレオチドを含む１０〜１００塩基の核酸を提供する。
【００１１】
このような核酸において、多型部位を占める塩基は、配列番号１に記載の塩基配列において、１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される。上記した多型部位は、薬剤代謝活性と相関する塩基を含むものである。
【００１２】
本発明によればさらに、配列番号１に記載の塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位を含む配列またはその相補体にハイブリダイズする、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドが提供される。このようなオリゴヌクレオチドは、プローブまたはプライマーとして有用である。
【００１３】
本明細書で言う核酸とはＤＮＡでもＲＮＡでもよく、一本鎖でも二本鎖でもよい。オリゴヌクレオチドは天然に存在するものでも、合成したものでもよいが、一般的には合成したものである。
【００１４】
本発明の好ましい核酸は、本明細書に定義した多型部位のいずれか１以上を含むＤＮＡ断片またはその相補体であり、その長さは通常、１０〜１００個の連続する塩基である。多型部位はこの断片内の任意の位置に存在することができる。なお、配列番号１においては、記号Ｔを、ＤＮＡにおけるチミジンおよびＲＮＡにおけるウラシルの両方を示すために使用する。したがって、ＲＮＡオリゴヌクレオチドにおいて、記号Ｔは、ウラシル残基を示すと解釈される。
【００１５】
ハイブリダイゼーションプローブは、塩基特異的に核酸の相補鎖に結合することができる。このようなプローブとしては、核酸、ペプチド核酸が挙げられる。
【００１６】
プライマーとは、適切な緩衝液および適切な温度において、４種の異なるヌクレオシド三リン酸および核酸重合酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素など）の存在下において、テンプレートに特異的なＤＮＡ合成の開始位置として作用することができる、一本鎖オリゴヌクレオチドのことを言う。プライマーの適切な長さは使用目的に依存するが、通常は１０〜５０ヌクレオチドの範囲である。
【００１７】
多型とは、１つの集団における２つ以上の遺伝的に決定された代替配列または対立遺伝子の存在をいう。多型マーカーまたは部位は、多様性が生じる遺伝子座である。好ましいマーカーは、少なくとも２つの対立遺伝子を有し、各々が、選択された集団の１％より大きな頻度、およびより好ましくは１０％または２０％より大きな頻度で存在する。多型遺伝子座は、１塩基対の場合もある。
【００１８】
上記したような本発明の核酸は、本明細書に開示した配列番号１に記載の塩基配列の情報に基づいて当業者に公知の核酸合成手段により容易に合成することができる。
【００１９】
本発明はさらに、上記のような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含むキットを提供する。キットは、多型性の異なる形態にハイブリダイズする、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの１つ以上の対を含む。いくつかのキットにおいて、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、支持体に固定化された状態で提供することができる。
【００２０】
キットに含めることができる任意の成分としては、例えば、制限酵素、逆転写酵素またはポリメラーゼ、基質ヌクレオシド三リン酸、標識するために使用される手段(例えば、アビジン−酵素結合体および酵素基質、ならびに標識がビオチンである場合の色素体)、および逆転写、ＰＣＲ、またはハイブリダイゼーション反応に適切な緩衝液などが挙げられる。キットにはまた、この方法を行うための説明書を含めることができる。
【００２１】
（ＩＩ）本発明の遺伝子多型の分析方法
本発明は、（１）個体から核酸を調製する工程；および、
（２）工程（１）で調製した核酸について、配列番号１に記載の塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位の塩基を決定する工程；
を含む、個体における遺伝子多型の分析方法を提供する。
【００２２】
以下、本発明の分析方法の具体的態様を説明する。
（Ａ）核酸の調製
本発明では、多型性は、分析される個体から調製した標的核酸において検出される。ゲノムＤＮＡのアッセイのためには、任意の生物学的サンプル（純粋な赤血球以外）が適切である。例えば、組織サンプルとしては、全血、精液、唾液、涙液、尿、糞便、汗、口腔粘膜（buccal）、皮膚、および頭髪などを使用することができる。ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのアッセイのためには、組織サンプルは、標的核酸が発現される器官から得ることが必要である。
【００２３】
本発明の方法の実施に際しては、標的サンプルからのＤＮＡの増幅を必要とする場合があるが、これは、例えば、ＰＣＲによって行うことができる。ＰＣＲに関する文献としては、Principles and Applications for DNA Amplification(H.A.Erlich編、Freeman Press,NY,NY,1992);PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innisら編、Academic Press,San Diego,CA,1990);Mattilaら、Nucleic Acids Res.19,4967(1991);Eckertら、PCR Methods and Applications 1,17(1991);PCR(McPhersonら編、IRL Press,Oxford)；および米国特許第４,６８３,２０２号などを参照することができる。
【００２４】
他の増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４，５６０（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１，１０７７（１９８８）を参照）、転写増幅（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１１７３（１９８９））、および自己持続性配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４（１９９０））、および核酸に基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ）などが挙げられる。
【００２５】
（Ｂ）標的ＤＮＡにおける多型性の検出
配列番号１に記載の塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位は、個体（例えば、分析される患者）において、例えば、以下の（ｉ）から（ｖｉ）の何れかの方法によって決定することができる。
【００２６】
（ｉ）対立遺伝子特異的プローブ
本発明の多型性を分析するための対立遺伝子特異的プローブの設計および使用は、例えば、Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３２４，１６３−１６６（１９８６）；Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ、ＥＰ ２３５,７２６；Ｓａｉｋｉ、ＷＯ ８９/１１５４８によって記載されている。ある個体からの標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズするが、別の個体からの対応する断片にはハイブリダイズしない（その２つの個体からのそれぞれの断片における異なる多型形態の存在に起因する）対立遺伝子特異的プローブを設計することができる。
【００２７】
ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子間のハイブリダイゼーション強度における有意な差が存在し、このことによりプローブが、対立遺伝子の１つのみにハイブリダイズするように十分にストリンジェントとする必要がある。いくつかのプローブを、標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズし、その結果、多型部位が、プローブの中心位置（例えば、１５マーでは７番目の位置；１６マーでは８または９番目の位置のいずれか）に整列するように設計する。プローブを好適に設計することにより、異なる対立遺伝子型の間でのハイブリダイゼーションにおいて良好に判別することが可能になる。
【００２８】
対立遺伝子特異的プローブは対で使用することもできる。対のうちの片方は標的配列の対照型への完全なマッチを示し、他方は、改変型への完全なマッチを示す。プローブの複数の対を、同じ標的配列内の複数の多型性の同時分析のために同じ支持体に固相化してもよい。
【００２９】
（ｉｉ）タイル状アレイ
本発明の多型性は、核酸アレイへのハイブリダイゼーションによって同定することもできる。具体例としては、国際公開ＷＯ９５/１１９９５に記載の方法が挙げられる。国際公開ＷＯ９５/１１９９５には、多型性の改変型の検出に至適化されているサブアレイも記載されており、このようなサブアレイを用いることも可能である。
【００３０】
（ｉｉｉ）対立遺伝子特異的プライマー
対立遺伝子特異的プライマーは、多型性に重複する標的ＤＮＡの部位にハイブリダイズし、そして対立遺伝子型（これに対してプライマーは完全な相補性を示す）の増幅をプライムする（Ｇｉｂｂｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７，２４２７−２４４８（１９８９）を参照）。このプライマーを、遠位部位にハイブリダイズする第２プライマーと組み合わせて使用することができる。増幅は、特定の対立遺伝子型が存在することを意味する検出可能な産物を導く、２つのプライマーから始まる。通常、第２のプライマー対を用いて制御する。この対の片方は、多型部位での１塩基のミスマッチを示し、そして他方は、遠位部位との完全な相補性を示す。１塩基のミスマッチは増幅を妨げ、そして検出可能な産物が形成されない。この方法は、ミスマッチが、多型性と整列されたオリゴヌクレオチドの最も３’側の位置に含まれる場合、最良に作用する。例えば、国際公開ＷＯ９３/２２４５６を参照。
【００３１】
（ｉｖ）直接配列決定
本発明の多型性は、ジデオキシチェーンターミネーション法またはＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法などの公知の配列決定手法を用いて、直接配列決定を行なうことにより検出することができる。
【００３２】
（ｖ）変性勾配ゲル電気泳動
ポリメラーゼ連鎖反応を用いて作製される増幅産物を、変性勾配ゲル電気泳動によって分析することができる。この場合、異なる対立遺伝子を、溶液における異なる配列依存性溶融特性およびＤＮＡの電気泳動移動度に基づいて同定することができる。Ｅｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）、第７章。
【００３３】
（ｖｉ）一本鎖コンホメーション多型性分析
標的配列の対立遺伝子を、一本鎖コンホメーション多型性分析を用いて分類することができる。この方法は、Ｏｒｉｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，２７６６−２７７０（１９８９）に記載されるように、一本鎖ＰＣＲ産物の電気泳動移動度における変化によって塩基差異を同定する。増幅したＰＣＲ産物を、上記のように作製し、そして、加熱または変性させて、一本鎖増幅産物を形成させる。一本鎖核酸は、再び折り畳み得るか、または塩基配列に部分的に依存する二次構造を形成する。一本鎖増幅産物の異なる電気泳動移動度は、標的配列の対立遺伝子間の塩基配列の差を反映している。
【００３４】
（ＩＩＩ）本発明の遺伝子多型の分析方法の利用
本発明は、薬剤代謝酵素をコードするCYP2D6遺伝子の新規な多型に関するものである。このようなCYP2D6遺伝子における多型性の検出は、薬剤代謝活性を判定するのに有用である。即ち、本発明によれば、上記した本発明により遺伝子多型の分析方法において、工程（２）で決定した塩基の情報に基づき、該個体の薬剤代謝活性を予測する工程をさらに含む、薬剤代謝活性の判定方法が提供される。本発明の多型性はさらに、より一般的な応用（例えば、法医学、父子鑑定、連鎖解析、およびポジショナルクローニング）に適用することもできる。
以下、本発明の遺伝子多型の分析方法の利用について具体的に説明する。
【００３５】
（ｉ）薬剤代謝活性との関連
本発明は、薬剤代謝活性に影響を及ぼすことが予測されるCYP2D6遺伝子の新規な多型部位を提供する。本発明の多型により代謝活性を予測することが可能であるCYP2D6の基質となる薬剤の具体例としては下記のものが挙げられる。本発明の多型を被験者において分析することにより、下記薬剤についての代謝活性を判定することができる。
【００３６】
不整脈治療・Ｎａチャンネル遮断薬（例えば、塩酸プロパフェノン）
頻脈性不整脈治療剤（例えば、酢酸フレカイニド）
不整脈治療剤（例えば、アジマリン、塩酸メキシレチン、コハク酸シベンゾリン）
β−受容体遮断薬（例えば、マレイン酸チモロール、塩酸プロプラノロール、硫酸ペンブトロール、塩酸ブプラノロール、塩酸アルプレノロール）
心選択性β１−遮断剤（例えば、酒石酸メトプロロール）
持続性β−遮断薬（例えば、マロン酸ポピンドロール）
α，β−遮断剤（例えば、カルベジロール）
排尿障害改善・降圧剤（例えば、ウラピジル）
フェノチアジン系精神神経安定剤（例えば、ペルフェナジン）
フェノチアジン系精神神経用剤（例えば、フルフェナジン、塩酸チオリダジン）
ブロチフェノン系抗精神病剤（例えば、ハロペリドール）
三環系情動調整剤（例えば、塩酸ノルトリプチリン）
三環系抗うつ剤（例えば、塩酸アミトリプチリン、塩酸デシプラミン）
うつ病・遺尿症治療剤（例えば、塩酸クロミプラミン、塩酸イミプラミン）
うつ病治療薬（例えば、塩酸ミアンセリン）
麻薬性鎮咳剤（例えば、リン酸コデイン）
中枢性鎮咳剤（例えば、臭化水素酸デキストロメトルファン）
脳循環・代謝改善剤（例えば、ニセルゴリン）
選択的セロトニン再取り込み阻害剤（例えば、マレイン酸フルボキサミン）
緑内障・高眼圧症治療剤（例えば、マレイン酸チモロール）
抗ヒスタミン薬（例えば、塩酸プロメタジン）
【００３７】
（ｉｉ）各種疾患との関連
本発明の多型性はまた、遺伝子マップが未同定の各種疾患(たとえば、無ガンマグロブリン血症、尿崩症、レッシュ−ナイハン症候群、筋ジストロフィー、Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、ファブリ病、家族性高コレステロール症、多胞性腎臓疾患、遺伝性球状血球症、ウィルブランド病、管生硬化症、遺伝性出血性末梢血管拡張症、家族性大腸ポリープ症、エーラー−ダンロス症候群、骨形成不完全症(osteogenesis imperfecta)、および急性断続性ポルフィリン症)との関連について試験することもできる。
【００３８】
表現型形質としては、遺伝的である可能性がある多機能疾患(例えば、自己免疫疾患、炎症、ガン、神経系の疾患、および病原体微生物による感染)の症状またはそれに対する感受性などが挙げられる。自己免疫疾患の例としては、慢性関節炎リューマチ、多発性硬化症、糖尿病(インシュリン依存性および非依存性)全身性エリテマトーデス、およびグレーブス病が挙げられる。ガンの例としては、膀胱、脳、乳房、大腸、食道、腎臓、白血病、肝臓、肺、口腔、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、および子宮のガンが挙げられる。表現型形質はまた、寿命、外観(例えば、禿頭、肥満症)、強度、敏速さ、耐久力、生殖能のような特徴などが挙げられる。
【００３９】
（ｉｉｉ）法医学
個体における多型部位のセットを占める多型形態の決定は、個体を区別する多型形態のセットを同定する。一般的には、Ｎａｔｉｏｎａｌ ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｕｎｃｉｌ，Ｔｈｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＦｏｒｅｎｓｉｃＤＮＡ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ(Ｐｏｌｌａｒｄら編、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ，ＤＣ，１９９６)を参照。より多くの部位を分析するほど、ある個体における多型のセットが、関連のない個体におけるものと同じである確率はより低い。好ましくは、複数の部位を分析する場合、その部位は関連がない。従って、本発明の多型性を、しばしば、遠位遺伝子における多型性と組み合わせて使用することができる。法医学に使用するための好ましい多型性は、二重対立遺伝子である。なぜなら、２つの多型形態の集団頻度を、通常、複数対立遺伝子座での複数の多型形態のものよりも大きな正確さで決定し得るからである。
【００４０】
個体における法医学用マーカーのセットを同定する能力は、法医学分析に有用である。例えば、容疑者からの血液サンプルが、犯罪現場からの血液または他の組織サンプルと一致するかどうかは、選択された多型部位を占める多型のセットが、容疑者とサンプルとにおいて同じであるかどうかを決定することによって、決定することができる。多型マーカーのセットが、容疑者とサンプルとの間で一致しない場合、容疑者はサンプルの供給源ではなかったと結論付けることができる。マーカーのセットが一致する場合、容疑者からのDNAが、犯罪現場で見いだされたものと一致すると結論付けられる。試験した遺伝子座での多型形態の頻度が、決定されている場合(例えば、個体の適切な集団の分析によって)、統計学的分析を行って、容疑者と犯罪現場のサンプルの一致が偶然に生じる確率を決定することができる。
【００４１】
（ｉｖ）父性試験
父性試験の目的は、通常、男性が子供の父親であるかどうかを決定することである。ほとんどの場合、子供の母親は既知であり、従って、子供の遺伝子型への母親の寄与を、追跡することができる。父性試験は、母親に起因しない子供の遺伝子型の部分が、推定の父親のものから構成されるかどうかを調査する。父性試験を、推定の父親および子供における多型性のセットを分析することによって実施することができる。
【００４２】
父親に起因する子供における多型性のセットが、推定の父親に一致しない場合、実験的誤差がなければ、推定の父親は本当の父親ではないと結論付けられる。父親に起因する子供における多型性のセットが、推定の父親の多型性のセットに一致した場合、統計学的計算を行って、偶然一致の確率を決定することができる。
【００４３】
いくつかの多型遺伝子座が、分析に含まれる場合、ランダムに選ばれた男性の排除の累積確率は、非常に高い。この確率が、子供の父親に起因する子供の多型マーカーセットに一致する多型マーカーセットを有する推定父親の責任を評価することにおいて考慮することができる。
【００４４】
（ｖ）表現型形質の遺伝子マッピング
本発明の多型性を使用して、目的の形質と関連する遺伝子座多型マーカー(これは形質に関連しないが、その形質を担いそしてそれと同時分離する物理的に遺伝子座と隣接する)との間の物理的関係を確立することができる。このような分析は、染色体位置に対して表現形形質と関連する遺伝子座をマッピングするのに有用であり、それにより形質を担う遺伝子をクローニングすることができる。Ｌａｎｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．(ＵＳＡ)８３，７３５３−７３５７(１９８６)；Ｌａｎｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．(ＵＳＡ)８４，２３６３−２３６７(１９８７)；Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒら、Ｃｅｌｌ ５１，３１９−３３７(１９８７)；Ｌａｎｄｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２１，１８５−１９９(１９８９)を参照。関係によって配置された遺伝子を、directional cloningによってクローニングすることができる。Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ，Ｍｅｄ．Ｊ．Ａｕｓｔｒａｌｉａ １５９，１７０−１７４(１９９３)；Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １，３−６(１９９２)を参照。
【００４５】
連鎖研究は、例えば、家族において行うことができる。家族の構成員を表現型形質の有無について、そして多型マーカーのセットについて調べる。次いで、減数分裂における多型マーカーの分布を分析して、どの多型マーカーが表現型形質と共分離するかを決定することができる。例えば、Ｋｅｒｅｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５，１０７３−１０８０(１９８９)；Ｍｏｎａｃｏら、Ｎａｔｕｒｅ ３１６，８４２(１９８５)；Ｙａｍｏｋａら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４０，２２２−２２６(１９９０)；Ｒｏｓｓｉｔｅｒら、ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ ５，２１−２７(１９９１)を参照。
【００４６】
ＩＶ．本発明の遺伝子及びタンパク質
本発明はさらに、配列番号２から５の何れかに記載の塩基配列を有する遺伝子を提供する。また、本発明の遺伝子を天然または他のプロモーターに作動可能に連結した組み換え発現ベクターにおいて発現させることができる。通常、このプロモーターは、哺乳動物細胞における発現のための真核生物プロモーターである。転写調節配列としては、異種プロモーター、および必要に応じて、宿主によって認識されるエンハンサーなどを使用することができる。選択した宿主に依存して、適切なプロモーター(例えば、ｔｒｐ、ｌａｃ、ファージプロモーター、解糖酵素プロモーター、およびｔＲＮＡプロモーター)を選択することができる。市販の発現ベクターを使用してもよい。発現ベクターには、宿主に認識される複製系、増幅可能な遺伝子、選択マーカー、宿主ゲノムへの挿入に有用な宿主配列などを含めることができる。
【００４７】
組み換え発現ベクターを宿主細胞に導入する手段は、発現ベクターおよび宿主の種類に応じて適宜選択することができる。導入手段の具体例としては、融合法、結合法(conjugation)、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、または注入などが挙げられる。
【００４８】
種々の宿主細胞を、本発明の遺伝子の発現のために使用することができる。適切な宿主細胞としては、大腸菌などの細菌、酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞(代表的には、不死化された、例えば、マウス、ＣＨＯ、ヒトおよびサルの細胞株)、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。
【００４９】
本発明の遺伝子を含む組み換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞を適当な条件下で培養した後、生成したタンパク質を、当業者に公知の方法によって単離することができ、これにより実質的に純粋な産物を入手することができる。タンパク質が細胞外に分泌させる場合には、宿主細胞を培養した培養上清からタンパク質を単離することができる。タンパク質が細胞外に分泌されない場合は、タンパク質を宿主細胞の溶解産物から単離することができる。
【００５０】
Ｖ．配列番号２または配列番号５に記載の塩基配列を有する遺伝子の検出方法
本発明によれば、個体から調製した核酸について、配列番号１に記載の塩基配列において１００番目の塩基がＣからＴに置換する変異、２８５０番目の塩基がＣからＴに置換する変異、及び４１８０番目の塩基がＧからＣに置換する変異の有無を検出することによって、配列番号２または配列番号５に記載の塩基配列を有する遺伝子を検出することができる。
【００５１】
配列番号１に記載の塩基配列において１００番目の塩基がＣからＴに置換する変異、２８５０番目の塩基がＣからＴに置換する変異、及び４１８０番目の塩基がＧからＣに置換する変異の有無の検出は、適当なプライマーを設計し、該プライマーを用いたＰＣＲにより行なうことができる。プライマーの設計は、以下の通り行うことができる。
【００５２】
CYP2D6遺伝子のイントロンを含む遺伝子の翻訳開始部位を1位とし、翻訳終了部位に向かって塩基数を数えた場合の100位が3'末端になるように翻訳終了部位に向かって設計した20〜30塩基からなるプライマーを上流側プライマーとして2種類作製する。ひとつは3'末端を野生型配列とし(100ｆｗ)、もうひとつは変異型配列(100ｆｍ)とする。
【００５３】
2850位が3'末端になるように翻訳開始部位に向かって設計した20〜30塩基からなるプライマーを下流側プライマーとして2種類作製する。ひとつは3'末端を野生型とし(2850ｒｗ)、もうひとつは変異型配列(2850ｒｍ)とする。
【００５４】
2850位が3'末端になるように翻訳終了部位に向かって設計した20〜30塩基からなるプライマーを上流側プライマーとして2種類作製する。ひとつは3'末端を野生型とし(2850ｆｗ)、もうひとつは変異型配列(2850ｆｍ)とする。
【００５５】
4180位が3'末端になるように翻訳開始部位に向かって設計した20〜30塩基からなるプライマーを下流側プライマーとして2種類作製する。ひとつは3'末端を野生型とし(4180ｒｗ)、もうひとつは変異型配列(4180ｒｍ)とする。
【００５６】
上記したプライマーの一例を以下に示す。
100fw 5' acgctgggctgcacgctacc 3'（配列番号４５）
100fm 5' acgctgggctgcacgctact 3'（配列番号４６）
2850fw 5' agcttcaatgatgagaacctgc 3'（配列番号４７）
2850fm 5' agcttcaatgatgagaacctgt 3'（配列番号４８）
2850rw 5' aggtcagccaccactatgcg 3'（配列番号４９）
2850rm 5' aggtcagccaccactatgca 3'（配列番号５０）
4180rw 5' aagctcatagggggatgggc 3'（配列番号５１）
4180rm 5' aagctcatagggggatgggg 3'（配列番号５２）
【００５７】
ゲノムＤＮＡを鋳型として、上記のプライマーを組み合わせてＰＣＲ反応を実施する。組み合わせは以下の通りである。
▲１▼100ｆｗ および 2850ｒｗ
▲２▼100ｆｗ および 2850ｒｍ
▲３▼100ｆｍ および 2850ｒｗ
▲４▼100ｆｍ および 2850ｒｍ
▲５▼2850ｆｗ および4180ｒｗ
▲６▼2850ｆｗ および 4180ｒｍ
▲７▼2850ｆｍ および 4180ｒｗ
▲８▼2850ｆｍ および 4180ｒｍ
【００５８】
ゲノムＤＮＡ中の少なくとも一方が、配列番号２に記載の塩基配列を有する遺伝子（以下の実施例のunknown3）である場合、組み合わせ▲４▼と▲８▼で同時に増幅する。ゲノムＤＮＡ中の少なくとも一方が配列番号５に記載の塩基配列を有する遺伝子(以下の実施例のunknown6)である場合、組み合わせ▲３▼と▲５▼で同時に増幅する。従って、増幅産物を電気泳動などで分析することにより、本発明の新規遺伝子を検出することが可能である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００５９】
【実施例】
実施例１：
（Ｉ）材料および方法
（１）試験材料
試験サンプルとしては、凍結血液を用いた。
【００６０】
（２）使用した主な材料・試薬
Taq DNAポリメラーゼ （プロメガ社）
デオキシATP、GTP、TTP、CTP（アマシャムファルマシア社）
アガロース（宝酒造）
エチジウムブロマイド染色液（和光純薬工業）
サイクルシークエンシングキット（アマシャムファルマシア社）
【００６１】
（３）使用した主な機器
電気泳動装置（コスモバイオ社）
サーマルサイクラー（PEアプライドバイオシステムズ社）
ABIオートシークエンサー 373（PEアプライドバイオシステムズ社）
冷却遠心機（佐久間製作所）
【００６２】
（４）プライマー
合成プライマー：CYP2D6遺伝子情報を基に、プライマー配列を設計し、公開データベースを用いたホモロジー検索を行った後、(株)サイメディアにて合成を行ったものを使用した。
【００６３】
primer sequence(5'→3')
CYP2D6e1f gcaaaggccatcatcagctcc（配列番号６）
CYP2D6e1r tctggtaggggagcctcagc （配列番号７）
CYP2D6e2f taggacctgtagtctggggt（配列番号８）
CYP2D6e2r gctcggactacggtcatcac （配列番号９）
CYP2D6e3f cgggagaccagggggagcat （配列番号１０）
CYP2D6e3r ggtgggagatgcgggtaagg （配列番号１１）
CYP2D6e4f aaagcgggaactgggaaggc （配列番号１２）
CYP2D6e4r tgctcttccgaggccccagt （配列番号１３）
CYP2D6e5f gagatggctggggcctgaga （配列番号１４）
CYP2D6e5r ccaaccttttgcccagcctc （配列番号１５）
CYP2D6e6f cccgttctgtcccgagtatg （配列番号１６）
CYP2D6e6r ggtgtcccagcaaagttcat （配列番号１７）
CYP2D6e7f taagcctgacctcctccaacat（配列番号１８）
CYP2D6e7r agtgggcccacctggcagta （配列番号１９）
CYP2D6e8f ccccgtgtgtttggtggcag （配列番号２０）
CYP2D6e8r cgtcagtgagcctggctcct （配列番号２１）
CYP2D6e9f tcttgcaggggtatcaccca （配列番号２２）
CYP2D6e9r-1 ttgccctgaggaggatgatc （配列番号２３）
CYP2D6e9r-2 ctcagcctcaacgtacccct （配列番号２４）
CYP2D6e1f-2 catttggtagtgaggcaggt（配列番号２５）
CYP2D6e1r-2 ctccaggacctcctccctc（配列番号２６）
CYP2D6e2f-2 ggccctgaccctccctctgc（配列番号２７）
CYP2D6e2r-2 ctctgtccccaccgctgctt（配列番号２８）
CYP2D6e3f-2 tgcccgtcccaccccc（配列番号２９）
CYP2D6e3r-2 gcccttctgcccatcaccc（配列番号３０）
CYP2D6e4f-2 cccgcatctcccaccccc（配列番号３１）
CYP2D6e4r-2 cctcggtctctcgctccgc（配列番号３２）
CYP2D6e5f-2 gaccccgttctgtctggtgt（配列番号３３）
CYP2D6e5r-2 ccgtggcagccactctc（配列番号３４）
CYP2D6e6f-2 gtatgctctcggccctgctc（配列番号３５）
CYP2D6e6r-2 actgtttcccagatgggctc（配列番号３６）
CYP2D6e7f-2 gtggggacgcatgtctgtcc（配列番号３７）
CYP2D6e7r-2 ggagggcgccaggcct（配列番号３８）
CYP2D6e8f-2 tcaccctgcatctcctgccc（配列番号３９）
CYP2D6e8r-2 ccgggctccccacaggc（配列番号４０）
CYP2D6e9f-3 ccctcccctccccac（配列番号４１）
CYP2D6e9r-3 tggggactaggtaccccatt（配列番号４２）
CYP2D6*5f gcgacaattcaagtgtggtga（配列番号４３）
CYP2D6*5r gcatgagctaaggcacccaga（配列番号４４）
【００６４】
（II）方法
（１）ゲノムDNAの調製
サンプル5 mLを速やかに溶解し、適切な容量のチューブに200μLおよび4 mLを分注した。200μL分注サンプルについては3倍量のPBNDバッファー（PCR buffer with Nonionic Detergents : 50 mmol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3),2.5 mmol/L MgCl2, 0.1 mg/mL gelatin, 0.45 % NP40, 0.45 % Tween20 ）を添加後、約10 mg/mL Proteinase K 8μLを添加し、50〜60 ℃で完全溶解するまで加温した。等量のTE飽和フェノールを添加し、混和、遠心分離後、水層を回収した。回収したサンプルに1/10倍量の3 mol/L酢酸ナトリウム（pH 5.3）および等量のイソプロパノールを加え、遠心分離し、DNAを回収した。70 %エタノールで洗浄し、乾燥後、50μLのTE（0.1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）、1 mmol/L EDTA（pH 8.0））に溶解し、2.5μLをPCR用テンプレートに用いた。反応未使用分については、4 ℃で保存した。4 mL分注サンプルについては、3倍量のDNA調製用SDSバッファー(150 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、10 mmol/L EDTA （pH 8.0）、1 % SDS) を添加後、約10 mg/mL Proteinase K 160 μLを添加し、50〜60 ℃で完全溶解するまで加温した。反応後、等量のTE飽和フェノールを加え除蛋白の後、遠心分離を行って水層を回収した。回収したサンプルの1/10量の3 mol/L酢酸ナトリウム(pH5.3)および等量のイソプロパノールを加え、DNAを沈殿として回収した。70 %エタノールで洗浄し、乾燥後、800μLのTEに溶解し、DNAサンプルとした。得られたサンプルを400μL×2本に分け、40 μL 3 mol/L酢酸ナトリウム（pH 5.3）および1 mLエタノールを添加し混和後、4 ℃で保存した。DNA調製用SDSバッファーにより調製したDNAサンプルは、PCR反応の予備サンプルおよびサザンハイブリダイゼーション用サンプル（必要が生じた場合に実施する）として保存した。
【００６５】
（２）CYP2D6遺伝子の増幅
DNAサンプル2.5μLずつを200μLチューブに添加し、表１の組み合わせにしたがってプライマーを加え、PCR法によりCYP2D6全エクソンを増幅した(Long PCR)。CYP2D6*5fおよびCYP2D6*5rのプライマーの組み合わせに関しては、CYP2D6*5由来の約1.8 kbpフラグメントの検出を目的とした。CYP2D6e1f-2およびCYP2D6e6rの組み合わせはCYP2D6エクソン1〜6領域の増幅を目的とし、一部をテンプレートとしてエクソン1〜5を独立して増幅した。CYP2D6e6fおよびCYP2D9e9r-2の組み合わせはCYP2D6エクソン6〜9領域の増幅を目的とし、一部をテンプレートとしてエクソン6〜9を独立して増幅した(2nd PCR)。各エクソンの増幅は、表２に示す通りfirst choice primerの組み合わせで行い、増幅が認められなかったエクソンについては、second choice primerで増幅を行った。
【００６６】
【表１】
【００６７】
【表２】
【００６８】
（３）遺伝多型解析法
PCRによって増幅した各エクソンフラグメントを精製し、サイクルシークエンシングキットを用いてシークエンス反応を行った。反応終了後、ABI373シークエンサー（PEアプライドバイオシステムズ社製）を用いて、塩基配列を分析した。得られた塩基配列データを、ピーク波形データを基に確認・修正した。データの解析はGeneWorks（Intelligenetics, Inc.）および公開遺伝子データベースを用いて行った。ヘテロ接合体の決定は、ABI373より得られるピークの重合をセンス側およびアンチセンス側の両方で確認した。
【００６９】
サザンハイブリダイゼーションが必要と判断されたサンプルについては株式会社三菱化学ビーシーエルに試験を委託した。
サンプル判断基準：以下のいずれかの条件に当てはまる場合にサザンハイブリダイゼーションを行った。
【００７０】
CYP2D6*5fおよびCYP2D6*5rのプライマーを用いたLong PCRで、CYP2D6*5由来の約1.8 kbpフラグメントが検出された場合；
活性クラス3に分類される遺伝子型のうち、構成AlleleにCYP2D6*2が含まれる場合；及び
新規遺伝子型と判断された場合
【００７１】
（III）結果及び考察
各サンプルにおける遺伝子診断結果を表３に示した。
【００７２】
【表３】
【００７３】
診断を行った142 alleleにおいて、検出された変異部位は１３(うち新規変異部位は４)、allelic valiantは１４(うち新規allele は６)であり、遺伝子型は17種であった。
【００７４】
Alleleより翻訳されるアミノ酸型を予測し、文献情報（Kubota,T.,他、British J. Clin. Pharmacol., 50, 31-34, 2000；Marez, D.,他、Pharmacogenetics, 7, 193-202, 1997；Johansson, I.,他、Mol.Pharmacol., 46, 452-459, 1994；Sachse, C.他、Am.J.Hum.Genet., 60, 284-295, 1997；福田剛史ら、Xenobio.Metabol.And Dispos., 15, 165-170, 2000；およびWang,S.L.,他、Drug Metabol.Disp., 27, 385-388, 1998）より各アミノ酸型の酵素活性を推定した。その後、各alleleの発現量は等しいものとして、個々の遺伝子型の酵素活性を推定した。CYP2D6*1A/*1A（野生型ホモ）の活性を指標とした活性クラス分類では酵素活性の強いと推定されるサンプル（Class1; *1A/*1A活性と同程度）が24例（33.8 %）、活性が若干弱いが問題のないと推定されるサンプル（Class2; *1A/*1A活性の50 %以上）が25例（35.2 %）、活性が弱いと推定されるサンプル（Class3; *1A/*1A活性の50 %未満）が22例（30.9 %）であった。活性の全く認められないと推定されるサンプル(Class4)は検出されなかった。
【００７５】
Allele出現頻度を表３および図１に示した。進化学的には、CYP2D6は生命を維持するために必須な遺伝子ではなく、環境による選択圧が余り働かなかったと考えられる。その結果、現在までに７１種の遺伝的多型が報告されており（Cytochrome 450(P450) Nomenclature Committee, HYPERLINK "http://www.imm.ki.se/CYP" http://www.imm.ki.se/CYP alleles/cyp2d6.htm）、各alleleの出現頻度には人種間差が認められている。今回のサンプルにおけるallele出現頻度は、健常日本人における報告（Kubota,T.,他、British J. Clin. Pharmacol., 50, 31-34, 2000）と類似しており、黄色人種において多く検出されるCYP2D6*10が38.03 %(健常日本人38.6 %、白色人種1.4 %)認められ、また白色人種に多く認められる酵素活性の欠損型であるCYP2D6*4(白色人種17.1 %)は健常日本人結果と同様検出されなかった。遺伝子完全欠損型であるCYP2D6*5の出現頻度は2.82 %で、健常日本人6.2 %、白色人種6.9 %と比べて低い傾向が認められたが、これは被検サンプル数が他の試験に比べ少ないためであると判断した。
【００７６】
変異検出部位ごとの出現頻度を図１に示した。最も多く認められた部位は1661G>C(49.30 %)（1661G>Cという表示は、1661番目の塩基であるＧがＣに置換することを示す。以下も同様）であった。この部位はアミノ酸置換を伴わない変異(silent mutation)であり、白色人種における出現頻度(52.6 %)と同等の結果であった。これは、恐らく1661G>C変異は黄色人種と白色人種の分岐以前に発生したことを示しているものと思われる。100C>T（アミノ酸がプロリン(P)からセリン(S)に置換）および4180G>C(セリン(S)からスレオニン(T)に置換)変異はそれぞれ44.37 %、48.59 %であり、本結果は該当領域を構成要素として含むCYP2D6*10が多く検出された結果を反映している(表３)。白色人種における100C>Tおよび4180G>C変異出現頻度はそれぞれ18.4 %、52.9 %であり、特に100C>Tにおいて出現頻度に大きな差が認められた。100C>T変異の発生時期については詳細な検討が必要であると思われるが、少なくとも100C>Tおよび4180G>Cを構成要素として保有するCYP2D6*10は人種の分岐以降、黄色人種において発生したalleleであると思われる。
【００７７】
CYP2D6*10は、metabolic ratio (MR) において*1/*1、*1/*10および*10/*10には有意差が認められたという報告もあり（Johansson, I.,他、Mol.Pharmacol., 46, 452-459, 1994）、また基質特異性の変化を示唆する様な報告もなされている（福田剛史ら、Xenobio.Metabol.And Dispos., 15, 165-170, 2000）。従来、CYP2D6を主代謝酵素とする薬物の代謝能には通常の代謝能を持つextensive metabolizer（EM）およびPMに由来する明確な2峰性を示さず、EMとPMの中間程度の代謝能を持つintermediate metabolizer (IM) やEMの数倍〜数十倍の代謝能を持つsuper metabolizer (SM) の存在が確認されている。今回の試験結果からもIMであると推定されるClass3に分類されるサンプルが30.9 %検出されており、その構成alleleの90 %以上は*10であった。以上より、CYP2D6を介して代謝を受ける薬物を投与する場合、CYP2D6*10を考慮することが重要であり、活性クラスを考慮する事によりデータ解析・適切な投与量の設定が可能となる。
【００７８】
今回の71サンプル142 alleleの診断において、新規変異部位を有する3 allele(unknown1,2および4)および既存変異部位により構成される新規3 alleleを検出した。
【００７９】
unknown1および2は同一サンプルより検出したallele帰属未決定の遺伝子型を示している。すなわち一サンプルにおいて100C>T, 125G>A, 1039C>T, 1661G>C, 1858C>T, 4180G>C(そのうち125G>Aおよび1858C>Tが新規変異部位である。同時にこの新規変異部位はそれぞれG42EおよびR173Cのアミノ酸置換を伴う)を全てヘテロ型として検出した。
【００８０】
Unknown4の変異部位は100C>T, 1039C>T, 1661G>C, 2874TC>CT, 4180G>C(そのうち2874TC>CTが新規)でありアミノ酸変異としてはP34S、S304LおよびS486T(そのうちS304Lが新規)であった。
【００８１】
その他に新規alleleとしてunknown3(100C>T, 1661G>C, 2850C>T, 3790C>T, 4180C>T アミノ酸変異はP34S、R296CおよびS486T)を6サンプル、６allele検出し、その出現頻度は4.23 %であった。また、unknown5(1661G>C silent)を1サンプル、１allele検出し、その出現頻度は0.7 %であった。また、unknown6(100C>T アミノ酸変異はP34S)を1サンプル、１allele検出し、その出現頻度は0.7 %であった。
【００８２】
unknown3、unknown4、unknown5及びunknown6のcDNAの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号２、３、４及び５にそれぞれ記載する。
【００８３】
リコンビナントCYP2D6を用いたin vitroの試験において、100C>T変異を導入した変異体はCYP2D6*1Aの酵素活性の約1/20程度に活性が低下することが報告されており（Wang,S.L.,他、Drug Metabol.Disp., 27, 385-388, 1998）、unknown3および6についてはCYP2D6*10と同程度ないしはそれよりも低い活性が予想される。特に、unknown3の出現頻度は4.23 %と比較的高く、検出項目としては必須になると考えられる。
【００８４】
【発明の効果】
本発明により、CYP2D6遺伝子の新規な多型が同定された。本発明より同定された多型遺伝子の情報を利用することにより、薬物を投与する被験者における薬物代謝活性を判定したり、新規な薬物を検索することが可能になる。
【００８５】
【配列表】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【００９２】
【００９３】
【００９４】
【００９５】
【００９６】
【００９７】
【００９８】
【００９９】
【０１００】
【０１０１】
【０１０２】
【０１０３】
【０１０４】
【０１０５】
【０１０６】
【０１０７】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【０１１１】
【０１１２】
【０１１３】
【０１１４】
【０１１５】
【０１１６】
【０１１７】
【０１１８】
【０１１９】
【０１２０】
【０１２１】
【０１２２】
【０１２３】
【０１２４】
【０１２５】
【０１２６】
【０１２７】
【０１２８】
【０１２９】
【０１３０】
【０１３１】
【０１３２】
【０１３３】
【０１３４】
【０１３５】
【０１３６】
【０１３７】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、検出されたＣＹＰ２Ｄ６変異部位と出現頻度を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、薬剤代謝酵素をコードするCYP2D6遺伝子の新規な多型に関するものである。さらに本発明は、CYP2D6遺伝子の多型変異を利用して薬剤代謝活性を判定する方法にも関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
CYP2D6は9つのエクソンからなる約4.5 kbpの遺伝子で、遺伝的多型が数多く報告されている分子種である（Nelson,D.R.,他、Pharmacogenetics, 6, 1-42, 1996；及びDaly,A.K.,他、Pharmacogenetics, 6, 193-201, 1996）。白色人種では約7 %、日本人では約0.5 %の酵素欠損者（poor metabolizer : PM）が存在し、また、白色人種においてハプロイドゲノム（片側染色体；nのこと。通常の体染色体は2nである。）あたり13コピーのCYP2D6を有した多酵素所持者（またはsuper metabolizer : SM）の報告もあり（Dahl,M.L.,他、J.Pharmacol.Exp.Ther., 2 74, 516-520, 1995）、個人遺伝子情報の多様性に依存したと考えられる代謝の個体差が認められている。しかしながら、薬物代謝とCYP2D6遺伝子の多型との詳細な関係は不明であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、CYP2D6変異遺伝子の多型を同定し、同定した遺伝子多型と、薬物反応性（薬物代謝能）や薬剤代謝活性との関係を解明することを解決すべき課題とした。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために、先ず、CYP2D6遺伝子の多型を検査することにした。本発明者らは今回の検査に際して、結果精度を最重要視し、ゲノム−PCRダイレクトシークエンス法を採用した。また、遺伝子完全欠損型であるCYP2D6*5に関しては原則としてLong-PCR法により検出し、陽性サンプルに関してサザンハイブリダイゼーション法を用いて検出した。その結果、本発明者らは、CYP2D6遺伝子について新規の複数の変異遺伝子を同定することに成功した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
【０００５】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１） 配列番号１に記載の塩基配列における少なくとも１０個の連続するヌクレオチドであって、該塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位を含む上記ヌクレオチドを含む１０〜１００塩基の核酸。
（２） ＤＮＡである、（１）に記載の核酸。
（３） ＲＮＡである、（１）に記載の核酸。
【０００６】
（４） 配列番号１に記載の塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位を含む配列またはその相補体にハイブリダイズする、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド。
（５） プローブまたはプライマーとして使用する、（４）に記載の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド。
【０００７】
（６） （１）個体から核酸を調製する工程；および、
（２）工程（１）で調製した核酸について、配列番号１に記載の塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位の塩基を決定する工程；
を含む、個体における遺伝子多型の分析方法。
【０００８】
（７） （１）個体から核酸を調製する工程；
（２）工程（１）で調製した核酸について、配列番号１に記載の塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位の塩基を決定する工程；及び
（３）工程（２）で決定した塩基の情報に基づき、該個体の薬剤代謝活性を予測する工程；
を含む、薬剤代謝活性の判定方法。
【０００９】
（８） 配列番号２から５の何れかに記載の塩基配列を有する遺伝子。
（９） 配列番号２から５の何れかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（１０） 個体から調製した核酸について、配列番号１に記載の塩基配列において１００番目の塩基がＣからＴに置換する変異、２８５０番目の塩基がＣからＴに置換する変異、及び４１８０番目の塩基がＧからＣに置換する変異の有無を検出する工程を含む、配列番号２または配列番号５に記載の塩基配列を有する遺伝子の検出方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
（Ｉ）本発明の核酸
本発明は、配列番号１に記載の塩基配列における少なくとも１０個の連続するヌクレオチドであって、該塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位を含む上記ヌクレオチドを含む１０〜１００塩基の核酸を提供する。
【００１１】
このような核酸において、多型部位を占める塩基は、配列番号１に記載の塩基配列において、１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される。上記した多型部位は、薬剤代謝活性と相関する塩基を含むものである。
【００１２】
本発明によればさらに、配列番号１に記載の塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位を含む配列またはその相補体にハイブリダイズする、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドが提供される。このようなオリゴヌクレオチドは、プローブまたはプライマーとして有用である。
【００１３】
本明細書で言う核酸とはＤＮＡでもＲＮＡでもよく、一本鎖でも二本鎖でもよい。オリゴヌクレオチドは天然に存在するものでも、合成したものでもよいが、一般的には合成したものである。
【００１４】
本発明の好ましい核酸は、本明細書に定義した多型部位のいずれか１以上を含むＤＮＡ断片またはその相補体であり、その長さは通常、１０〜１００個の連続する塩基である。多型部位はこの断片内の任意の位置に存在することができる。なお、配列番号１においては、記号Ｔを、ＤＮＡにおけるチミジンおよびＲＮＡにおけるウラシルの両方を示すために使用する。したがって、ＲＮＡオリゴヌクレオチドにおいて、記号Ｔは、ウラシル残基を示すと解釈される。
【００１５】
ハイブリダイゼーションプローブは、塩基特異的に核酸の相補鎖に結合することができる。このようなプローブとしては、核酸、ペプチド核酸が挙げられる。
【００１６】
プライマーとは、適切な緩衝液および適切な温度において、４種の異なるヌクレオシド三リン酸および核酸重合酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素など）の存在下において、テンプレートに特異的なＤＮＡ合成の開始位置として作用することができる、一本鎖オリゴヌクレオチドのことを言う。プライマーの適切な長さは使用目的に依存するが、通常は１０〜５０ヌクレオチドの範囲である。
【００１７】
多型とは、１つの集団における２つ以上の遺伝的に決定された代替配列または対立遺伝子の存在をいう。多型マーカーまたは部位は、多様性が生じる遺伝子座である。好ましいマーカーは、少なくとも２つの対立遺伝子を有し、各々が、選択された集団の１％より大きな頻度、およびより好ましくは１０％または２０％より大きな頻度で存在する。多型遺伝子座は、１塩基対の場合もある。
【００１８】
上記したような本発明の核酸は、本明細書に開示した配列番号１に記載の塩基配列の情報に基づいて当業者に公知の核酸合成手段により容易に合成することができる。
【００１９】
本発明はさらに、上記のような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含むキットを提供する。キットは、多型性の異なる形態にハイブリダイズする、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの１つ以上の対を含む。いくつかのキットにおいて、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、支持体に固定化された状態で提供することができる。
【００２０】
キットに含めることができる任意の成分としては、例えば、制限酵素、逆転写酵素またはポリメラーゼ、基質ヌクレオシド三リン酸、標識するために使用される手段(例えば、アビジン−酵素結合体および酵素基質、ならびに標識がビオチンである場合の色素体)、および逆転写、ＰＣＲ、またはハイブリダイゼーション反応に適切な緩衝液などが挙げられる。キットにはまた、この方法を行うための説明書を含めることができる。
【００２１】
（ＩＩ）本発明の遺伝子多型の分析方法
本発明は、（１）個体から核酸を調製する工程；および、
（２）工程（１）で調製した核酸について、配列番号１に記載の塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位の塩基を決定する工程；
を含む、個体における遺伝子多型の分析方法を提供する。
【００２２】
以下、本発明の分析方法の具体的態様を説明する。
（Ａ）核酸の調製
本発明では、多型性は、分析される個体から調製した標的核酸において検出される。ゲノムＤＮＡのアッセイのためには、任意の生物学的サンプル（純粋な赤血球以外）が適切である。例えば、組織サンプルとしては、全血、精液、唾液、涙液、尿、糞便、汗、口腔粘膜（buccal）、皮膚、および頭髪などを使用することができる。ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのアッセイのためには、組織サンプルは、標的核酸が発現される器官から得ることが必要である。
【００２３】
本発明の方法の実施に際しては、標的サンプルからのＤＮＡの増幅を必要とする場合があるが、これは、例えば、ＰＣＲによって行うことができる。ＰＣＲに関する文献としては、Principles and Applications for DNA Amplification(H.A.Erlich編、Freeman Press,NY,NY,1992);PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innisら編、Academic Press,San Diego,CA,1990);Mattilaら、Nucleic Acids Res.19,4967(1991);Eckertら、PCR Methods and Applications 1,17(1991);PCR(McPhersonら編、IRL Press,Oxford)；および米国特許第４,６８３,２０２号などを参照することができる。
【００２４】
他の増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４，５６０（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１，１０７７（１９８８）を参照）、転写増幅（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１１７３（１９８９））、および自己持続性配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４（１９９０））、および核酸に基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ）などが挙げられる。
【００２５】
（Ｂ）標的ＤＮＡにおける多型性の検出
配列番号１に記載の塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位は、個体（例えば、分析される患者）において、例えば、以下の（ｉ）から（ｖｉ）の何れかの方法によって決定することができる。
【００２６】
（ｉ）対立遺伝子特異的プローブ
本発明の多型性を分析するための対立遺伝子特異的プローブの設計および使用は、例えば、Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３２４，１６３−１６６（１９８６）；Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ、ＥＰ ２３５,７２６；Ｓａｉｋｉ、ＷＯ ８９/１１５４８によって記載されている。ある個体からの標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズするが、別の個体からの対応する断片にはハイブリダイズしない（その２つの個体からのそれぞれの断片における異なる多型形態の存在に起因する）対立遺伝子特異的プローブを設計することができる。
【００２７】
ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子間のハイブリダイゼーション強度における有意な差が存在し、このことによりプローブが、対立遺伝子の１つのみにハイブリダイズするように十分にストリンジェントとする必要がある。いくつかのプローブを、標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズし、その結果、多型部位が、プローブの中心位置（例えば、１５マーでは７番目の位置；１６マーでは８または９番目の位置のいずれか）に整列するように設計する。プローブを好適に設計することにより、異なる対立遺伝子型の間でのハイブリダイゼーションにおいて良好に判別することが可能になる。
【００２８】
対立遺伝子特異的プローブは対で使用することもできる。対のうちの片方は標的配列の対照型への完全なマッチを示し、他方は、改変型への完全なマッチを示す。プローブの複数の対を、同じ標的配列内の複数の多型性の同時分析のために同じ支持体に固相化してもよい。
【００２９】
（ｉｉ）タイル状アレイ
本発明の多型性は、核酸アレイへのハイブリダイゼーションによって同定することもできる。具体例としては、国際公開ＷＯ９５/１１９９５に記載の方法が挙げられる。国際公開ＷＯ９５/１１９９５には、多型性の改変型の検出に至適化されているサブアレイも記載されており、このようなサブアレイを用いることも可能である。
【００３０】
（ｉｉｉ）対立遺伝子特異的プライマー
対立遺伝子特異的プライマーは、多型性に重複する標的ＤＮＡの部位にハイブリダイズし、そして対立遺伝子型（これに対してプライマーは完全な相補性を示す）の増幅をプライムする（Ｇｉｂｂｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７，２４２７−２４４８（１９８９）を参照）。このプライマーを、遠位部位にハイブリダイズする第２プライマーと組み合わせて使用することができる。増幅は、特定の対立遺伝子型が存在することを意味する検出可能な産物を導く、２つのプライマーから始まる。通常、第２のプライマー対を用いて制御する。この対の片方は、多型部位での１塩基のミスマッチを示し、そして他方は、遠位部位との完全な相補性を示す。１塩基のミスマッチは増幅を妨げ、そして検出可能な産物が形成されない。この方法は、ミスマッチが、多型性と整列されたオリゴヌクレオチドの最も３’側の位置に含まれる場合、最良に作用する。例えば、国際公開ＷＯ９３/２２４５６を参照。
【００３１】
（ｉｖ）直接配列決定
本発明の多型性は、ジデオキシチェーンターミネーション法またはＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法などの公知の配列決定手法を用いて、直接配列決定を行なうことにより検出することができる。
【００３２】
（ｖ）変性勾配ゲル電気泳動
ポリメラーゼ連鎖反応を用いて作製される増幅産物を、変性勾配ゲル電気泳動によって分析することができる。この場合、異なる対立遺伝子を、溶液における異なる配列依存性溶融特性およびＤＮＡの電気泳動移動度に基づいて同定することができる。Ｅｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）、第７章。
【００３３】
（ｖｉ）一本鎖コンホメーション多型性分析
標的配列の対立遺伝子を、一本鎖コンホメーション多型性分析を用いて分類することができる。この方法は、Ｏｒｉｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，２７６６−２７７０（１９８９）に記載されるように、一本鎖ＰＣＲ産物の電気泳動移動度における変化によって塩基差異を同定する。増幅したＰＣＲ産物を、上記のように作製し、そして、加熱または変性させて、一本鎖増幅産物を形成させる。一本鎖核酸は、再び折り畳み得るか、または塩基配列に部分的に依存する二次構造を形成する。一本鎖増幅産物の異なる電気泳動移動度は、標的配列の対立遺伝子間の塩基配列の差を反映している。
【００３４】
（ＩＩＩ）本発明の遺伝子多型の分析方法の利用
本発明は、薬剤代謝酵素をコードするCYP2D6遺伝子の新規な多型に関するものである。このようなCYP2D6遺伝子における多型性の検出は、薬剤代謝活性を判定するのに有用である。即ち、本発明によれば、上記した本発明により遺伝子多型の分析方法において、工程（２）で決定した塩基の情報に基づき、該個体の薬剤代謝活性を予測する工程をさらに含む、薬剤代謝活性の判定方法が提供される。本発明の多型性はさらに、より一般的な応用（例えば、法医学、父子鑑定、連鎖解析、およびポジショナルクローニング）に適用することもできる。
以下、本発明の遺伝子多型の分析方法の利用について具体的に説明する。
【００３５】
（ｉ）薬剤代謝活性との関連
本発明は、薬剤代謝活性に影響を及ぼすことが予測されるCYP2D6遺伝子の新規な多型部位を提供する。本発明の多型により代謝活性を予測することが可能であるCYP2D6の基質となる薬剤の具体例としては下記のものが挙げられる。本発明の多型を被験者において分析することにより、下記薬剤についての代謝活性を判定することができる。
【００３６】
不整脈治療・Ｎａチャンネル遮断薬（例えば、塩酸プロパフェノン）
頻脈性不整脈治療剤（例えば、酢酸フレカイニド）
不整脈治療剤（例えば、アジマリン、塩酸メキシレチン、コハク酸シベンゾリン）
β−受容体遮断薬（例えば、マレイン酸チモロール、塩酸プロプラノロール、硫酸ペンブトロール、塩酸ブプラノロール、塩酸アルプレノロール）
心選択性β１−遮断剤（例えば、酒石酸メトプロロール）
持続性β−遮断薬（例えば、マロン酸ポピンドロール）
α，β−遮断剤（例えば、カルベジロール）
排尿障害改善・降圧剤（例えば、ウラピジル）
フェノチアジン系精神神経安定剤（例えば、ペルフェナジン）
フェノチアジン系精神神経用剤（例えば、フルフェナジン、塩酸チオリダジン）
ブロチフェノン系抗精神病剤（例えば、ハロペリドール）
三環系情動調整剤（例えば、塩酸ノルトリプチリン）
三環系抗うつ剤（例えば、塩酸アミトリプチリン、塩酸デシプラミン）
うつ病・遺尿症治療剤（例えば、塩酸クロミプラミン、塩酸イミプラミン）
うつ病治療薬（例えば、塩酸ミアンセリン）
麻薬性鎮咳剤（例えば、リン酸コデイン）
中枢性鎮咳剤（例えば、臭化水素酸デキストロメトルファン）
脳循環・代謝改善剤（例えば、ニセルゴリン）
選択的セロトニン再取り込み阻害剤（例えば、マレイン酸フルボキサミン）
緑内障・高眼圧症治療剤（例えば、マレイン酸チモロール）
抗ヒスタミン薬（例えば、塩酸プロメタジン）
【００３７】
（ｉｉ）各種疾患との関連
本発明の多型性はまた、遺伝子マップが未同定の各種疾患(たとえば、無ガンマグロブリン血症、尿崩症、レッシュ−ナイハン症候群、筋ジストロフィー、Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、ファブリ病、家族性高コレステロール症、多胞性腎臓疾患、遺伝性球状血球症、ウィルブランド病、管生硬化症、遺伝性出血性末梢血管拡張症、家族性大腸ポリープ症、エーラー−ダンロス症候群、骨形成不完全症(osteogenesis imperfecta)、および急性断続性ポルフィリン症)との関連について試験することもできる。
【００３８】
表現型形質としては、遺伝的である可能性がある多機能疾患(例えば、自己免疫疾患、炎症、ガン、神経系の疾患、および病原体微生物による感染)の症状またはそれに対する感受性などが挙げられる。自己免疫疾患の例としては、慢性関節炎リューマチ、多発性硬化症、糖尿病(インシュリン依存性および非依存性)全身性エリテマトーデス、およびグレーブス病が挙げられる。ガンの例としては、膀胱、脳、乳房、大腸、食道、腎臓、白血病、肝臓、肺、口腔、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、および子宮のガンが挙げられる。表現型形質はまた、寿命、外観(例えば、禿頭、肥満症)、強度、敏速さ、耐久力、生殖能のような特徴などが挙げられる。
【００３９】
（ｉｉｉ）法医学
個体における多型部位のセットを占める多型形態の決定は、個体を区別する多型形態のセットを同定する。一般的には、Ｎａｔｉｏｎａｌ ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｕｎｃｉｌ，Ｔｈｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＦｏｒｅｎｓｉｃＤＮＡ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ(Ｐｏｌｌａｒｄら編、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ，ＤＣ，１９９６)を参照。より多くの部位を分析するほど、ある個体における多型のセットが、関連のない個体におけるものと同じである確率はより低い。好ましくは、複数の部位を分析する場合、その部位は関連がない。従って、本発明の多型性を、しばしば、遠位遺伝子における多型性と組み合わせて使用することができる。法医学に使用するための好ましい多型性は、二重対立遺伝子である。なぜなら、２つの多型形態の集団頻度を、通常、複数対立遺伝子座での複数の多型形態のものよりも大きな正確さで決定し得るからである。
【００４０】
個体における法医学用マーカーのセットを同定する能力は、法医学分析に有用である。例えば、容疑者からの血液サンプルが、犯罪現場からの血液または他の組織サンプルと一致するかどうかは、選択された多型部位を占める多型のセットが、容疑者とサンプルとにおいて同じであるかどうかを決定することによって、決定することができる。多型マーカーのセットが、容疑者とサンプルとの間で一致しない場合、容疑者はサンプルの供給源ではなかったと結論付けることができる。マーカーのセットが一致する場合、容疑者からのDNAが、犯罪現場で見いだされたものと一致すると結論付けられる。試験した遺伝子座での多型形態の頻度が、決定されている場合(例えば、個体の適切な集団の分析によって)、統計学的分析を行って、容疑者と犯罪現場のサンプルの一致が偶然に生じる確率を決定することができる。
【００４１】
（ｉｖ）父性試験
父性試験の目的は、通常、男性が子供の父親であるかどうかを決定することである。ほとんどの場合、子供の母親は既知であり、従って、子供の遺伝子型への母親の寄与を、追跡することができる。父性試験は、母親に起因しない子供の遺伝子型の部分が、推定の父親のものから構成されるかどうかを調査する。父性試験を、推定の父親および子供における多型性のセットを分析することによって実施することができる。
【００４２】
父親に起因する子供における多型性のセットが、推定の父親に一致しない場合、実験的誤差がなければ、推定の父親は本当の父親ではないと結論付けられる。父親に起因する子供における多型性のセットが、推定の父親の多型性のセットに一致した場合、統計学的計算を行って、偶然一致の確率を決定することができる。
【００４３】
いくつかの多型遺伝子座が、分析に含まれる場合、ランダムに選ばれた男性の排除の累積確率は、非常に高い。この確率が、子供の父親に起因する子供の多型マーカーセットに一致する多型マーカーセットを有する推定父親の責任を評価することにおいて考慮することができる。
【００４４】
（ｖ）表現型形質の遺伝子マッピング
本発明の多型性を使用して、目的の形質と関連する遺伝子座多型マーカー(これは形質に関連しないが、その形質を担いそしてそれと同時分離する物理的に遺伝子座と隣接する)との間の物理的関係を確立することができる。このような分析は、染色体位置に対して表現形形質と関連する遺伝子座をマッピングするのに有用であり、それにより形質を担う遺伝子をクローニングすることができる。Ｌａｎｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．(ＵＳＡ)８３，７３５３−７３５７(１９８６)；Ｌａｎｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．(ＵＳＡ)８４，２３６３−２３６７(１９８７)；Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒら、Ｃｅｌｌ ５１，３１９−３３７(１９８７)；Ｌａｎｄｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２１，１８５−１９９(１９８９)を参照。関係によって配置された遺伝子を、directional cloningによってクローニングすることができる。Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ，Ｍｅｄ．Ｊ．Ａｕｓｔｒａｌｉａ １５９，１７０−１７４(１９９３)；Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １，３−６(１９９２)を参照。
【００４５】
連鎖研究は、例えば、家族において行うことができる。家族の構成員を表現型形質の有無について、そして多型マーカーのセットについて調べる。次いで、減数分裂における多型マーカーの分布を分析して、どの多型マーカーが表現型形質と共分離するかを決定することができる。例えば、Ｋｅｒｅｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５，１０７３−１０８０(１９８９)；Ｍｏｎａｃｏら、Ｎａｔｕｒｅ ３１６，８４２(１９８５)；Ｙａｍｏｋａら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４０，２２２−２２６(１９９０)；Ｒｏｓｓｉｔｅｒら、ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ ５，２１−２７(１９９１)を参照。
【００４６】
ＩＶ．本発明の遺伝子及びタンパク質
本発明はさらに、配列番号２から５の何れかに記載の塩基配列を有する遺伝子を提供する。また、本発明の遺伝子を天然または他のプロモーターに作動可能に連結した組み換え発現ベクターにおいて発現させることができる。通常、このプロモーターは、哺乳動物細胞における発現のための真核生物プロモーターである。転写調節配列としては、異種プロモーター、および必要に応じて、宿主によって認識されるエンハンサーなどを使用することができる。選択した宿主に依存して、適切なプロモーター(例えば、ｔｒｐ、ｌａｃ、ファージプロモーター、解糖酵素プロモーター、およびｔＲＮＡプロモーター)を選択することができる。市販の発現ベクターを使用してもよい。発現ベクターには、宿主に認識される複製系、増幅可能な遺伝子、選択マーカー、宿主ゲノムへの挿入に有用な宿主配列などを含めることができる。
【００４７】
組み換え発現ベクターを宿主細胞に導入する手段は、発現ベクターおよび宿主の種類に応じて適宜選択することができる。導入手段の具体例としては、融合法、結合法(conjugation)、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、または注入などが挙げられる。
【００４８】
種々の宿主細胞を、本発明の遺伝子の発現のために使用することができる。適切な宿主細胞としては、大腸菌などの細菌、酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞(代表的には、不死化された、例えば、マウス、ＣＨＯ、ヒトおよびサルの細胞株)、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。
【００４９】
本発明の遺伝子を含む組み換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞を適当な条件下で培養した後、生成したタンパク質を、当業者に公知の方法によって単離することができ、これにより実質的に純粋な産物を入手することができる。タンパク質が細胞外に分泌させる場合には、宿主細胞を培養した培養上清からタンパク質を単離することができる。タンパク質が細胞外に分泌されない場合は、タンパク質を宿主細胞の溶解産物から単離することができる。
【００５０】
Ｖ．配列番号２または配列番号５に記載の塩基配列を有する遺伝子の検出方法
本発明によれば、個体から調製した核酸について、配列番号１に記載の塩基配列において１００番目の塩基がＣからＴに置換する変異、２８５０番目の塩基がＣからＴに置換する変異、及び４１８０番目の塩基がＧからＣに置換する変異の有無を検出することによって、配列番号２または配列番号５に記載の塩基配列を有する遺伝子を検出することができる。
【００５１】
配列番号１に記載の塩基配列において１００番目の塩基がＣからＴに置換する変異、２８５０番目の塩基がＣからＴに置換する変異、及び４１８０番目の塩基がＧからＣに置換する変異の有無の検出は、適当なプライマーを設計し、該プライマーを用いたＰＣＲにより行なうことができる。プライマーの設計は、以下の通り行うことができる。
【００５２】
CYP2D6遺伝子のイントロンを含む遺伝子の翻訳開始部位を1位とし、翻訳終了部位に向かって塩基数を数えた場合の100位が3'末端になるように翻訳終了部位に向かって設計した20〜30塩基からなるプライマーを上流側プライマーとして2種類作製する。ひとつは3'末端を野生型配列とし(100ｆｗ)、もうひとつは変異型配列(100ｆｍ)とする。
【００５３】
2850位が3'末端になるように翻訳開始部位に向かって設計した20〜30塩基からなるプライマーを下流側プライマーとして2種類作製する。ひとつは3'末端を野生型とし(2850ｒｗ)、もうひとつは変異型配列(2850ｒｍ)とする。
【００５４】
2850位が3'末端になるように翻訳終了部位に向かって設計した20〜30塩基からなるプライマーを上流側プライマーとして2種類作製する。ひとつは3'末端を野生型とし(2850ｆｗ)、もうひとつは変異型配列(2850ｆｍ)とする。
【００５５】
4180位が3'末端になるように翻訳開始部位に向かって設計した20〜30塩基からなるプライマーを下流側プライマーとして2種類作製する。ひとつは3'末端を野生型とし(4180ｒｗ)、もうひとつは変異型配列(4180ｒｍ)とする。
【００５６】
上記したプライマーの一例を以下に示す。
100fw 5' acgctgggctgcacgctacc 3'（配列番号４５）
100fm 5' acgctgggctgcacgctact 3'（配列番号４６）
2850fw 5' agcttcaatgatgagaacctgc 3'（配列番号４７）
2850fm 5' agcttcaatgatgagaacctgt 3'（配列番号４８）
2850rw 5' aggtcagccaccactatgcg 3'（配列番号４９）
2850rm 5' aggtcagccaccactatgca 3'（配列番号５０）
4180rw 5' aagctcatagggggatgggc 3'（配列番号５１）
4180rm 5' aagctcatagggggatgggg 3'（配列番号５２）
【００５７】
ゲノムＤＮＡを鋳型として、上記のプライマーを組み合わせてＰＣＲ反応を実施する。組み合わせは以下の通りである。
▲１▼100ｆｗ および 2850ｒｗ
▲２▼100ｆｗ および 2850ｒｍ
▲３▼100ｆｍ および 2850ｒｗ
▲４▼100ｆｍ および 2850ｒｍ
▲５▼2850ｆｗ および4180ｒｗ
▲６▼2850ｆｗ および 4180ｒｍ
▲７▼2850ｆｍ および 4180ｒｗ
▲８▼2850ｆｍ および 4180ｒｍ
【００５８】
ゲノムＤＮＡ中の少なくとも一方が、配列番号２に記載の塩基配列を有する遺伝子（以下の実施例のunknown3）である場合、組み合わせ▲４▼と▲８▼で同時に増幅する。ゲノムＤＮＡ中の少なくとも一方が配列番号５に記載の塩基配列を有する遺伝子(以下の実施例のunknown6)である場合、組み合わせ▲３▼と▲５▼で同時に増幅する。従って、増幅産物を電気泳動などで分析することにより、本発明の新規遺伝子を検出することが可能である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００５９】
【実施例】
実施例１：
（Ｉ）材料および方法
（１）試験材料
試験サンプルとしては、凍結血液を用いた。
【００６０】
（２）使用した主な材料・試薬
Taq DNAポリメラーゼ （プロメガ社）
デオキシATP、GTP、TTP、CTP（アマシャムファルマシア社）
アガロース（宝酒造）
エチジウムブロマイド染色液（和光純薬工業）
サイクルシークエンシングキット（アマシャムファルマシア社）
【００６１】
（３）使用した主な機器
電気泳動装置（コスモバイオ社）
サーマルサイクラー（PEアプライドバイオシステムズ社）
ABIオートシークエンサー 373（PEアプライドバイオシステムズ社）
冷却遠心機（佐久間製作所）
【００６２】
（４）プライマー
合成プライマー：CYP2D6遺伝子情報を基に、プライマー配列を設計し、公開データベースを用いたホモロジー検索を行った後、(株)サイメディアにて合成を行ったものを使用した。
【００６３】
primer sequence(5'→3')
CYP2D6e1f gcaaaggccatcatcagctcc（配列番号６）
CYP2D6e1r tctggtaggggagcctcagc （配列番号７）
CYP2D6e2f taggacctgtagtctggggt（配列番号８）
CYP2D6e2r gctcggactacggtcatcac （配列番号９）
CYP2D6e3f cgggagaccagggggagcat （配列番号１０）
CYP2D6e3r ggtgggagatgcgggtaagg （配列番号１１）
CYP2D6e4f aaagcgggaactgggaaggc （配列番号１２）
CYP2D6e4r tgctcttccgaggccccagt （配列番号１３）
CYP2D6e5f gagatggctggggcctgaga （配列番号１４）
CYP2D6e5r ccaaccttttgcccagcctc （配列番号１５）
CYP2D6e6f cccgttctgtcccgagtatg （配列番号１６）
CYP2D6e6r ggtgtcccagcaaagttcat （配列番号１７）
CYP2D6e7f taagcctgacctcctccaacat（配列番号１８）
CYP2D6e7r agtgggcccacctggcagta （配列番号１９）
CYP2D6e8f ccccgtgtgtttggtggcag （配列番号２０）
CYP2D6e8r cgtcagtgagcctggctcct （配列番号２１）
CYP2D6e9f tcttgcaggggtatcaccca （配列番号２２）
CYP2D6e9r-1 ttgccctgaggaggatgatc （配列番号２３）
CYP2D6e9r-2 ctcagcctcaacgtacccct （配列番号２４）
CYP2D6e1f-2 catttggtagtgaggcaggt（配列番号２５）
CYP2D6e1r-2 ctccaggacctcctccctc（配列番号２６）
CYP2D6e2f-2 ggccctgaccctccctctgc（配列番号２７）
CYP2D6e2r-2 ctctgtccccaccgctgctt（配列番号２８）
CYP2D6e3f-2 tgcccgtcccaccccc（配列番号２９）
CYP2D6e3r-2 gcccttctgcccatcaccc（配列番号３０）
CYP2D6e4f-2 cccgcatctcccaccccc（配列番号３１）
CYP2D6e4r-2 cctcggtctctcgctccgc（配列番号３２）
CYP2D6e5f-2 gaccccgttctgtctggtgt（配列番号３３）
CYP2D6e5r-2 ccgtggcagccactctc（配列番号３４）
CYP2D6e6f-2 gtatgctctcggccctgctc（配列番号３５）
CYP2D6e6r-2 actgtttcccagatgggctc（配列番号３６）
CYP2D6e7f-2 gtggggacgcatgtctgtcc（配列番号３７）
CYP2D6e7r-2 ggagggcgccaggcct（配列番号３８）
CYP2D6e8f-2 tcaccctgcatctcctgccc（配列番号３９）
CYP2D6e8r-2 ccgggctccccacaggc（配列番号４０）
CYP2D6e9f-3 ccctcccctccccac（配列番号４１）
CYP2D6e9r-3 tggggactaggtaccccatt（配列番号４２）
CYP2D6*5f gcgacaattcaagtgtggtga（配列番号４３）
CYP2D6*5r gcatgagctaaggcacccaga（配列番号４４）
【００６４】
（II）方法
（１）ゲノムDNAの調製
サンプル5 mLを速やかに溶解し、適切な容量のチューブに200μLおよび4 mLを分注した。200μL分注サンプルについては3倍量のPBNDバッファー（PCR buffer with Nonionic Detergents : 50 mmol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3),2.5 mmol/L MgCl2, 0.1 mg/mL gelatin, 0.45 % NP40, 0.45 % Tween20 ）を添加後、約10 mg/mL Proteinase K 8μLを添加し、50〜60 ℃で完全溶解するまで加温した。等量のTE飽和フェノールを添加し、混和、遠心分離後、水層を回収した。回収したサンプルに1/10倍量の3 mol/L酢酸ナトリウム（pH 5.3）および等量のイソプロパノールを加え、遠心分離し、DNAを回収した。70 %エタノールで洗浄し、乾燥後、50μLのTE（0.1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）、1 mmol/L EDTA（pH 8.0））に溶解し、2.5μLをPCR用テンプレートに用いた。反応未使用分については、4 ℃で保存した。4 mL分注サンプルについては、3倍量のDNA調製用SDSバッファー(150 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、10 mmol/L EDTA （pH 8.0）、1 % SDS) を添加後、約10 mg/mL Proteinase K 160 μLを添加し、50〜60 ℃で完全溶解するまで加温した。反応後、等量のTE飽和フェノールを加え除蛋白の後、遠心分離を行って水層を回収した。回収したサンプルの1/10量の3 mol/L酢酸ナトリウム(pH5.3)および等量のイソプロパノールを加え、DNAを沈殿として回収した。70 %エタノールで洗浄し、乾燥後、800μLのTEに溶解し、DNAサンプルとした。得られたサンプルを400μL×2本に分け、40 μL 3 mol/L酢酸ナトリウム（pH 5.3）および1 mLエタノールを添加し混和後、4 ℃で保存した。DNA調製用SDSバッファーにより調製したDNAサンプルは、PCR反応の予備サンプルおよびサザンハイブリダイゼーション用サンプル（必要が生じた場合に実施する）として保存した。
【００６５】
（２）CYP2D6遺伝子の増幅
DNAサンプル2.5μLずつを200μLチューブに添加し、表１の組み合わせにしたがってプライマーを加え、PCR法によりCYP2D6全エクソンを増幅した(Long PCR)。CYP2D6*5fおよびCYP2D6*5rのプライマーの組み合わせに関しては、CYP2D6*5由来の約1.8 kbpフラグメントの検出を目的とした。CYP2D6e1f-2およびCYP2D6e6rの組み合わせはCYP2D6エクソン1〜6領域の増幅を目的とし、一部をテンプレートとしてエクソン1〜5を独立して増幅した。CYP2D6e6fおよびCYP2D9e9r-2の組み合わせはCYP2D6エクソン6〜9領域の増幅を目的とし、一部をテンプレートとしてエクソン6〜9を独立して増幅した(2nd PCR)。各エクソンの増幅は、表２に示す通りfirst choice primerの組み合わせで行い、増幅が認められなかったエクソンについては、second choice primerで増幅を行った。
【００６６】
【表１】
【表２】
（３）遺伝多型解析法
PCRによって増幅した各エクソンフラグメントを精製し、サイクルシークエンシングキットを用いてシークエンス反応を行った。反応終了後、ABI373シークエンサー（PEアプライドバイオシステムズ社製）を用いて、塩基配列を分析した。得られた塩基配列データを、ピーク波形データを基に確認・修正した。データの解析はGeneWorks（Intelligenetics, Inc.）および公開遺伝子データベースを用いて行った。ヘテロ接合体の決定は、ABI373より得られるピークの重合をセンス側およびアンチセンス側の両方で確認した。
【００６９】
サザンハイブリダイゼーションが必要と判断されたサンプルについては株式会社三菱化学ビーシーエルに試験を委託した。
サンプル判断基準：以下のいずれかの条件に当てはまる場合にサザンハイブリダイゼーションを行った。
【００７０】
CYP2D6*5fおよびCYP2D6*5rのプライマーを用いたLong PCRで、CYP2D6*5由来の約1.8 kbpフラグメントが検出された場合；
活性クラス3に分類される遺伝子型のうち、構成AlleleにCYP2D6*2が含まれる場合；及び
新規遺伝子型と判断された場合
【００７１】
（III）結果及び考察
各サンプルにおける遺伝子診断結果を表３に示した。
【００７２】
【表３】
診断を行った142 alleleにおいて、検出された変異部位は１３(うち新規変異部位は４)、allelic valiantは１４(うち新規allele は６)であり、遺伝子型は17種であった。
【００７４】
Alleleより翻訳されるアミノ酸型を予測し、文献情報（Kubota,T.,他、British J. Clin. Pharmacol., 50, 31-34, 2000；Marez, D.,他、Pharmacogenetics, 7, 193-202, 1997；Johansson, I.,他、Mol.Pharmacol., 46, 452-459, 1994；Sachse, C.他、Am.J.Hum.Genet., 60, 284-295, 1997；福田剛史ら、Xenobio.Metabol.And Dispos., 15, 165-170, 2000；およびWang,S.L.,他、Drug Metabol.Disp., 27, 385-388, 1998）より各アミノ酸型の酵素活性を推定した。その後、各alleleの発現量は等しいものとして、個々の遺伝子型の酵素活性を推定した。CYP2D6*1A/*1A（野生型ホモ）の活性を指標とした活性クラス分類では酵素活性の強いと推定されるサンプル（Class1; *1A/*1A活性と同程度）が24例（33.8 %）、活性が若干弱いが問題のないと推定されるサンプル（Class2; *1A/*1A活性の50 %以上）が25例（35.2 %）、活性が弱いと推定されるサンプル（Class3; *1A/*1A活性の50 %未満）が22例（30.9 %）であった。活性の全く認められないと推定されるサンプル(Class4)は検出されなかった。
【００７５】
Allele出現頻度を表３および図１に示した。進化学的には、CYP2D6は生命を維持するために必須な遺伝子ではなく、環境による選択圧が余り働かなかったと考えられる。その結果、現在までに７１種の遺伝的多型が報告されており（Cytochrome 450(P450) Nomenclature Committee, HYPERLINK "http://www.imm.ki.se/CYP" http://www.imm.ki.se/CYP alleles/cyp2d6.htm）、各alleleの出現頻度には人種間差が認められている。今回のサンプルにおけるallele出現頻度は、健常日本人における報告（Kubota,T.,他、British J. Clin. Pharmacol., 50, 31-34, 2000）と類似しており、黄色人種において多く検出されるCYP2D6*10が38.03 %(健常日本人38.6 %、白色人種1.4 %)認められ、また白色人種に多く認められる酵素活性の欠損型であるCYP2D6*4(白色人種17.1 %)は健常日本人結果と同様検出されなかった。遺伝子完全欠損型であるCYP2D6*5の出現頻度は2.82 %で、健常日本人6.2 %、白色人種6.9 %と比べて低い傾向が認められたが、これは被検サンプル数が他の試験に比べ少ないためであると判断した。
【００７６】
変異検出部位ごとの出現頻度を図１に示した。最も多く認められた部位は1661G>C(49.30 %)（1661G>Cという表示は、1661番目の塩基であるＧがＣに置換することを示す。以下も同様）であった。この部位はアミノ酸置換を伴わない変異(silent mutation)であり、白色人種における出現頻度(52.6 %)と同等の結果であった。これは、恐らく1661G>C変異は黄色人種と白色人種の分岐以前に発生したことを示しているものと思われる。100C>T（アミノ酸がプロリン(P)からセリン(S)に置換）および4180G>C(セリン(S)からスレオニン(T)に置換)変異はそれぞれ44.37 %、48.59 %であり、本結果は該当領域を構成要素として含むCYP2D6*10が多く検出された結果を反映している(表３)。白色人種における100C>Tおよび4180G>C変異出現頻度はそれぞれ18.4 %、52.9 %であり、特に100C>Tにおいて出現頻度に大きな差が認められた。100C>T変異の発生時期については詳細な検討が必要であると思われるが、少なくとも100C>Tおよび4180G>Cを構成要素として保有するCYP2D6*10は人種の分岐以降、黄色人種において発生したalleleであると思われる。
【００７７】
CYP2D6*10は、metabolic ratio (MR) において*1/*1、*1/*10および*10/*10には有意差が認められたという報告もあり（Johansson, I.,他、Mol.Pharmacol., 46, 452-459, 1994）、また基質特異性の変化を示唆する様な報告もなされている（福田剛史ら、Xenobio.Metabol.And Dispos., 15, 165-170, 2000）。従来、CYP2D6を主代謝酵素とする薬物の代謝能には通常の代謝能を持つextensive metabolizer（EM）およびPMに由来する明確な2峰性を示さず、EMとPMの中間程度の代謝能を持つintermediate metabolizer (IM) やEMの数倍〜数十倍の代謝能を持つsuper metabolizer (SM) の存在が確認されている。今回の試験結果からもIMであると推定されるClass3に分類されるサンプルが30.9 %検出されており、その構成alleleの90 %以上は*10であった。以上より、CYP2D6を介して代謝を受ける薬物を投与する場合、CYP2D6*10を考慮することが重要であり、活性クラスを考慮する事によりデータ解析・適切な投与量の設定が可能となる。
【００７８】
今回の71サンプル142 alleleの診断において、新規変異部位を有する3 allele(unknown1,2および4)および既存変異部位により構成される新規3 alleleを検出した。
【００７９】
unknown1および2は同一サンプルより検出したallele帰属未決定の遺伝子型を示している。すなわち一サンプルにおいて100C>T, 125G>A, 1039C>T, 1661G>C, 1858C>T, 4180G>C(そのうち125G>Aおよび1858C>Tが新規変異部位である。同時にこの新規変異部位はそれぞれG42EおよびR173Cのアミノ酸置換を伴う)を全てヘテロ型として検出した。
【００８０】
Unknown4の変異部位は100C>T, 1039C>T, 1661G>C, 2874TC>CT, 4180G>C(そのうち2874TC>CTが新規)でありアミノ酸変異としてはP34S、S304LおよびS486T(そのうちS304Lが新規)であった。
【００８１】
その他に新規alleleとしてunknown3(100C>T, 1661G>C, 2850C>T, 3790C>T, 4180C>T アミノ酸変異はP34S、R296CおよびS486T)を6サンプル、６allele検出し、その出現頻度は4.23 %であった。また、unknown5(1661G>C silent)を1サンプル、１allele検出し、その出現頻度は0.7 %であった。また、unknown6(100C>T アミノ酸変異はP34S)を1サンプル、１allele検出し、その出現頻度は0.7 %であった。
【００８２】
unknown3、unknown4、unknown5及びunknown6のcDNAの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号２、３、４及び５にそれぞれ記載する。
【００８３】
リコンビナントCYP2D6を用いたin vitroの試験において、100C>T変異を導入した変異体はCYP2D6*1Aの酵素活性の約1/20程度に活性が低下することが報告されており（Wang,S.L.,他、Drug Metabol.Disp., 27, 385-388, 1998）、unknown3および6についてはCYP2D6*10と同程度ないしはそれよりも低い活性が予想される。特に、unknown3の出現頻度は4.23 %と比較的高く、検出項目としては必須になると考えられる。
【００８４】
【発明の効果】
本発明により、CYP2D6遺伝子の新規な多型が同定された。本発明より同定された多型遺伝子の情報を利用することにより、薬物を投与する被験者における薬物代謝活性を判定したり、新規な薬物を検索することが可能になる。
【００８５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、検出されたＣＹＰ２Ｄ６変異部位と出現頻度を示す。
Claims (10)
- 配列番号１に記載の塩基配列における少なくとも１０個の連続するヌクレオチドであって、該塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位を含む上記ヌクレオチドを含む１０〜１００塩基の核酸。
- ＤＮＡである、請求項１に記載の核酸。
- ＲＮＡである、請求項１に記載の核酸。
- 配列番号１に記載の塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位を含む配列またはその相補体にハイブリダイズする、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド。
- プローブまたはプライマーとして使用する、請求項４に記載の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド。
- （１）個体から核酸を調製する工程；および、
（２）工程（１）で調製した核酸について、配列番号１に記載の塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位の塩基を決定する工程；
を含む、個体における遺伝子多型の分析方法。 - （１）個体から核酸を調製する工程；
（２）工程（１）で調製した核酸について、配列番号１に記載の塩基配列における１２５番目の塩基であるＧがＡに置換する変異、１８５８番目の塩基であるＣがＴに置換する変異、２８７４番目の塩基であるＴがＣに置換する変異、又は２８７５番目の塩基であるＣがＴに置換する変異から選択される何れかの多型部位の塩基を決定する工程；及び
（３）工程（２）で決定した塩基の情報に基づき、該個体の薬剤代謝活性を予測する工程；
を含む、薬剤代謝活性の判定方法。 - 配列番号２から５の何れかに記載の塩基配列を有する遺伝子。
- 配列番号２から５の何れかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
- 個体から調製した核酸について、配列番号１に記載の塩基配列において１００番目の塩基がＣからＴに置換する変異、２８５０番目の塩基がＣからＴに置換する変異、及び４１８０番目の塩基がＧからＣに置換する変異の有無を検出する工程を含む、配列番号２または配列番号５に記載の塩基配列を有する遺伝子の検出方法。
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