KR101381227B1 - 항암 표적치료제제 감수성 예측용 ｓｎｐ - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항암 표적치료제제 감수성 예측용 단염기 다형성 표식자 (SNP), 이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 항암 표적치료제제의 감수성을 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 환자의 소량 시료를 이용하여 항암 표적치료제제에 대한 개인별 감수성을 미리 예측하게 하며 환자의 치료 경과 전체에 걸쳐서 가장 적합한 표적치료제제 선택을 가능하게 해준다.

Description

항암 표적치료제제 감수성 예측용 ＳＮＰ {SNP for predicting sensitivity to an anti-cancer targeted agent}
본 발명은 항암 표적치료제제 감수성 예측용 단염기 다형성 표식자 (SNP), 이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 특정 항암 표적치료제제에 대한 감수성을 예측할 수 있는 방법에 관한 것이다.
개인의 다양한 유전체적 차이는 대부분 단염기 다형성(SNP)으로 구성되는데 일부의 유전자형에서는 해당 단백질과 그 대사에서 기능적인 차이를 보이며 이는 약리유전체적 대인적 감수성에 민감하게 작용하는 것으로 알려져 있다 (Huang and Ratain, CA Cancer J Clin 2009;59:42-55).
한편, 많은 항암제들이 효과적인 치료제로 사용되고 있지만 새롭게 대두되고 있는 문제점은 항암제에 대한 암세포의 내성 (resistance)이다 (Tsuruo et al., 1984). 항암제에 대한 내성은 장기적인 항암제 사용으로 약물에 노출된 세포들이 약물의 세포 내 축적을 감소시키거나 (Shen et al., 1986; Shen et al., 2000; Gottesman et al.,2002), 해독 작용 또는 배출을 활성화하거나 (Schuetz et al., 1996; Goto et al., 2002), 표적이 되는 단백질을 변형 (Urasaki et al., 2001) 시키는 등의 여러 가지 기전을 통하여 일어나게 된다. 이러한 과정은 암 치료에 가장 큰 장애 요소일 뿐만 아니라 치료의 실패와도 깊은 관련이 있다 (강, 1996). 약물에 대한 내성에 관여하는 다양한 기전 중에서도 다약물 내성 (MDR; Multi-Drug Resistance)이 중요한 부분을 차지하고 있다 (Brooks et al., 2003). 다약물 내성은 사용 중인 항암제뿐만 아니라 구조나 기능이 전혀 다른 다양한 항암제에도 내성을 보이는 현상을 말한다 (Biedler et al., 1975;Gottesman, 2002). 실제 암 환자에 화학요법을 시도할 때 어떤 항암제가 효력을 발휘하지 못하는 경우에 이후 다른 항암제에 대해서도 내성을 보이는 사례가 빈번하며, 초기 치료 시 작용기전이 다른 여러 종류의 항암제를 동시에 투여하는 복합화학요법을 시도했음에도 불구하고 치료효과가 없는 현상을 자주 관찰할 수 있다. 이로 인하여 사용가능한 항암제의 범위가 매우 제한되는 것은 암의 화학요법에 있어서 중요한 문제점으로 지적되고 있다. 따라서 적합한 치료 반응성 표식자를 이용한 선별은 항암제 치료의 획기적인 진보를 초래할 수 있다. 이에, SNP 유전자형에 따른 개별 항암제의 치료반응성에 관한 연구가 최근 지속적으로 활발하게 전개되고 있다.
그러나 특정약제에 대한 생체반응 관련요소의 복합적 작용, 치료제 및 투여방식의 다양성과 방대한 시료확보의 어려움으로 아직 괄목할 만한 성과가 미약한 현실이다.
본 발명자는 이러한 약점을 보완하고자, 종양의 약제반응성을 체외종양반응성분석을 통해 확인하여 그 결과를 동일한 대상환자의 림프구 DNA에서 연관 분석하여 선별하고, 이를 현재까지 확인된 인간유전체 정보 및 인구유전학적 검정 (출원번호, 10-2009-0130540)을 통해서 항암 표적치료제제 감수성 예측용 SNP 마커를 발굴함으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서 본 발명의 목적은 항암 표적치료제제 감수성 예측용 단염기 다형성 표식자 (SNP)를 제공하는데 있다.
또한 본 발명의 목적은 특정 항암 표적치료제제에 대한 감수성 예측방법을 제공하는데 있다.
상기의 목적을 달성하고자, 본원 발명은 하기 서열번호 1 내지 11번의 특정위치의 각 뉴클레오티드를 포함하는 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들로부터 선택되는, 1 이상의 항암 표적치료제제 감수성 예측용 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 특정 위치의 뉴클레오티드는 각 서열번호 1,7,10의 201번째 뉴클레오티드, 서열번호 3의 251번째 뉴클레오티드, 서열번호 5,11의 301번째 뉴클레오티드, 서열번호 4,6,8,9의 401번째 뉴클레오티드 및 서열번호 2의 406번째 뉴클레오티드가 바람직하다.
상기 8개 이상의 연속 염기는 8 내지 100개의 연속 염기인 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 상기의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진 항암 표적치료제제 감수성 예측용 프라이머 또는 프로브를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA 를 포함하는 항암 표적치료제제 감수성 예측용 마이크로어레이를 제공한다.
또한 상기 마이크로어레이를 포함하는 항암 표적치료제제 감수성 예측용 키트를 제공한다.
또한 (1) 사람으로부터 핵산 시료를 분리하는 단계; 및 (2)서열번호 1 내지 11로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP 위치의 염기 타입을 상기 분리된 핵산분자에서 확인하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암 표적치료제제 감수성 예측방법을 제공한다.
상기 예측방법의 단계 (2)에서, 서열번호 1의 201번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 A로 확인되면 항암 표적치료제 베바시주맙에 대한 감수성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
상기 예측방법의 단계 (2)에서, 서열번호 2의 406번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 T, 서열번호 3의 251번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 C 또는 서열번호 4의 401번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 T로 확인되면 항암 표적치료제제 베바시주맙 및 FOLFIRI (5-FU +류코보린 + 이리노테칸) 중 적어도 하나의 제제에 대한 감수성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
상기 예측방법의 단계 (2)에서, 서열번호 5의 301번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 G로 확인되면 항암 표적치료제제 베바시주맙 및 FOLFOX (5-FU +류코보린 + 옥살리플라틴) 중 적어도 하나의 제제에 대한 감수성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
상기 예측방법의 단계 (2)에서, 서열번호 6의 401번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 G로 확인되면 항암 표적치료제 세툭시맙에 대한 감수성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
상기 예측방법의 단계 (2)에서, 서열번호 7의 201번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 A, 서열번호 8의 401번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 G 또는 서열번호 9의 401번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 C로 확인되면 항암 표적치료제제 세툭시맙 및 FOLFIRI (5-FU +류코보린 + 이리노테칸) 중 적어도 하나의 제제에 대한 감수성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
상기 예측방법의 단계 (2)에서, 서열번호 10의 201번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 G 또는 서열번호 11의 301번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 T로 확인되면 항암 표적치료제제 세툭시맙 및 FOLFOX (5-FU +류코보린 + 옥살리플라틴) 중 적어도 하나의 제제에 대한 감수성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
본 발명은 환자의 소량 혈액시료를 이용하여 약제에 내성을 보이는 종양에 대해서도 유용한 제제를 미리 예측하게 하며, 전이 혹은 재발암 환자의 치료경과 전체에 걸쳐서 가장 적합한 항암 표적치료제제 선택을 가능하게 하며, 적절한 유전자적 진단도구를 개발하게 되었다.
또한, 본 발명은 향후 지속적으로 신약을 포함한 약제를 이용하여 항암제 및 일반 치료제의 반응성을 예측할 수 있는 SNP 표식자를 새로이 발굴할 수 있는 기술로 적용범위를 넓힐 수 있다.
도 1은 6종의 항암 표적치료제제에 감수성을 보이는 선별된 15종 유전자의 15개 SNP 후보를 나타낸 것이다. 이들 중 TCF19 rs2073721 및 MLPH rs3817362는 정상인구군에서 하디-와인버그의 평형을 이탈하므로 후보 SNP에서 제외되었다.
도 2는 베바시주맙 반응성 SNP 유전자형을 임상에서 이미 해당 제제에 의한 치료가 종결된 대장암 환자에서 연관분석을 시행한 결과를 나타낸 것이다. 항암 표적치료제제 베바시주맙으로 치료받는 전이암 및 재발암 환자에서 ITGA3 rs2230392 SNP의 동형 혹은 이형 대체 대립유전자형을 갖는 경우 동형 참고 대립유전자형을 갖는 환자에 비해서 감수성이 높으며 무진행 생존 및 전체 생존이 연장 되는 것을 보이고 있다.
도 3은 세툭시맙 반응성 SNP 유전자형을 임상에서 이미 해당 제제에 의한 치료가 종결된 대장암 환자에서 연관분석을 시행한 결과를 나타낸 것이다. 항암 표적치료제제 세툭시맙으로 치료받는 전이암 및 재발암 환자에서 ISX rs361863 형 참고 대립유전자형을 갖는 경우 동형 혹은 이형 대체 대립유전자형을 갖는 환자에 비해서 감수성이 높으며 무진행 생존이 연장 되는 것을 보이고 있다.
본 발명은 항암 표적치료제제 감수성 예측용 단염기 다형성 표식자 (SNP, Single Nucleotide Polymorphism) 에 관한 것이다.
상기 SNP는 한국 출원 10-2009-0130540에 개시된 방법으로 스크리닝할 수 있다. 보다 구체적으로,
(1) 환자의 종양조직을 이용한 체외 종양 반응성 검사 결과와 동일 환자의 SNP 분석 결과를 연관 분석하여 항암 표적치료제제 감수성 예측용 후보 SNP 유전자형을 선별하는 단계; 및
(2) 상기 선별된 유전자형 중 명목 P-값이 1% 이하이고, 동양인 유전자형에서 대립유전자의 빈도, 교차불평형 블록 (linkage disequilibrium block)에 위치하는 유전자형, htSNP(haplotype tagging SNP), 기능성 SNP 및 정상 인구군에서 하디-와인버그 평형 P 값을 고려하여 SNP 유전자형을 선별하는 단계;
를 포함하여 항암 표적치료제제 감수성 예측용 SNP를 스크리닝할 수 있다.
상기 방법 중 (1) 단계의 체외 종양 반응성 검사는 출원번호 10-2008-0115296 의 기재된 방법으로 시행될 수 있다. 체외 종양 반응성 검사는,
(i) 1차 항암제 반응판 및 2차 항암제 반응판을 준비하는 단계;
(ⅱ) 피검체로부터 준비한 종양조직 시료를 상기 항암제 반응판의 1차 항암제 반응정 및 2차 항암제 반응정에 분주하고 배양하는 단계;
(ⅲ) 1차 항암제 반응판의 반응정 및 2차 항암제 반응판의 반응정에 1차 항암제 후보들을 처리하고 반응시키는 단계;
(iv) 1차 항암제 반응판의 반응정에 처리된 1차 항암제 후보들의 감수성을 측정 및 분석하고, 2차 항암제 반응판의 반응정에는 1차 항암제와 상이한 조합의 2차 항암제 후보들을 처리하여 반응시키는 단계; 및
(v) 2차 항암제 반응판의 반응정에 처리된 2차 항암제 후보들의 감수성을 측정 및 분석하는 단계;를 포함할 수 있으며, 수년에 걸친 임상경과에 대한 분석이 필요하지 않고 신약에 대한 감수성까지도 스크리닝 할 수 있는 장점이 있다.
상기 (2) 단계 검증에서는 우선 고집적고속 SNP(Affymetrix SNP Array 6.0 사용)선별과 체외종양반응성 연관분석 결과, 군소 대립유전자의 빈도가 이미 알려진 한국인과 유사한 일본인과 중국인 데이트베이스 (5%이상이며, 일본인 데이트베이스상 교차 불평형 블록(linkage disequilibrium, LD; WGAViewer, Ge D, Zhang K, Need AC, et al. GenomeRes 2008;18:640-643)에서 재조합이 없는 경우, 일배체형 표지 SNP(haplotype tagging SNP, htSNP), 기능성 SNP 이며, 하디-와인버그 평형 P값이 0.01이상인 SNP를 대상으로 한다. 군소 대립유전자의 빈도가 5%로 정한 것은 희귀한 변이를 놓치지 않고 표본 대상의 숫자를 줄일 수 있는 통계적 유의성이 있는 최소값으로써 산출한다.
상기 교차 불평형 블록 (linkage disequilibrium block, LD block) 부위는 특정 게놈 상의 구간이 세대를 거치며 cross-over가 거의 일어나지 않을 정도로 짧거나 유전자가 밀집되어 있어서 생기는 부분이다. 따라서 이 구간에 존재하는 유전적 정보 (genomic information)는 거의 동일하고 세대를 거쳐도 거의 보존되며, 이와 유사하게 htSNP (haplotype tagging SNP) 이란, 전체 일배체형(haplotype) 중에서 특정 haplotype을 구분할 수 있는 최소한의 SNP 세트를 칭하며 인접 SNP을 대표하는 특징을 보인다. 그러므로 LD block SNP와 htSNP은 유사한 성질의 SNP을 반복해서 검증하는 노력을 소멸하여 시간과 경비를 줄일 수 있다.
하디-와인버그 평형은 특정 인구군에서 무작위 결합될때 유전체적으로 평형된 상태를 말하며 일반적으로 P값으로 나타내며 이 값이 0.01이하 일때는 평형상태를 벗어난 경우로써 혈족결혼, 유전자표류, 돌연변이, 선택, 유전자분석 혹은 인구군선정상의 오류를 나타내므로 이러한 결과로부터 생기는 위양성 SNP를 제외할 수 있다.
상기 2단계 검증까지 발굴된 11종 유전자의 11개의 항암 표적치료제제 반응성 후보 SNP 표식자는 실시예 2의 표 1과 같다.
상기 스크리닝 방법은 (2) 단계에서 선별된 SNP 유전자형을 기존 임상 경과와 연관 분석하는 단계를 추가로 더 포함하는 것이 바람직하다. 항암 표적치료제제를 사용하여 치료 경과가 확인된 사용군을 대상으로 임상적 연관성을 검증할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 해당 환자의 임상경과 추적은 NCCN surveillance guideline(www.nccn.org)에 의거할수 있으며, 항암제의 종양 반응성 판정은 RECIST criteria(Therasse et al., J Natl Cancer Inst 2000;92:205-16)에 의거할 수 있다. 해당 환자의 추적 관찰기간은 평균 13개월 (범위 1-39개월)이며, 본 제제의 사용적응이 모두 재발암 혹은 전이암 환자를 대상인 점을 감안하면 결과 판정에 충분한 기간으로 판단된다. 본 단계를 통해서 체외 종양 반응성 검사의 체내 약물대사 환경과의 상이성을 배제하게 되며, 직접 임상시험에 진입할 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 세포생물학적 검증을 추가로 포함할 수도 있으며 임상연관 분석결과와 동일한 경우 해당 SNP의 표적치료제제 감수성이 보다 확실하게 입증되지만 불일치하는 경우에도 해당 SNP의 감수성이 없다고는 할 수 없다. 이는 모든 감수성 SNP가 100%의 민감도를 보이지는 않기 때문이다. 여기에는 유전자 형질전환, 세포 생존 및 세포독성분석, 카스파제-3 웨스턴 블롯 및 유세포분석에 의한 세포사멸검증을 포함한다. 이를 통해서 본 발명의 SNP 유전자형의 생물학적 기전을 제시할 수 있으며, 신약개발의 표적 후보물질로 적용이 가능하다.
한 양태로서, 상기 세포생물학적 검증은 야생형 유전자 또는 돌연변이 유전자로 종양세포를 형질전환시키는 단계; 상기 종양세포에 특정 항암제를 처리하는 단계; 상기 종양세포의 세포 생존율을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 SNP는 구체적으로 다음과 같다.
항암 표적치료제인 베바시주맙에 대한 감수성 예측용 SNP는 ITGA3 (integrin alpha 3) 유전자의 일부를 구성하는 rs2230392 (SNP id) 폴리뉴클레오티드 (서열번호 1, 17번 염색체)에 있어서, 201번째 염기를 포함하고 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 대체 대립유전자형을 갖는 경우, 참고 대립유전자형을 갖는 경우에 비해 항암 표적치료제인 베바시주맙에 대한 반응성이 높다.
베바시주맙 (Bevacizumab)은 VEGF에 대한 항체이다.
항암 표적치료제제인 베바시주맙 및 FOLFIRI (5-FU + 류코보린 (leucovorin) + 이리노테칸 (irinotecan): 항암제 5-FU 와 이리노테칸의 복합제제이며, 류코보린은 5-FU의 작용 상승제임)에 대한 감수성 예측용 SNP는 UTRN (utrophin) 유전자의 일부를 구성하는 rs1534443 폴리뉴클레오티드 (서열번호 2, 6번 염색체)에 있어서, 406번째 염기를 포함하고 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 대체 대립유전자형을 갖는 경우, 참고 대립유전자형을 갖는 경우에 비해 항암 표적치료제 베바시주맙 및 FOLFIRI 중 적어도 하나의 제제에 대한 반응성이 높다.
항암 표적치료제제인 베바시주맙 및 FOLFIRI에 대한 또 다른 감수성 예측용 SNP는 TNC (tenascin C) 유전자의 일부를 구성하는 rs13321 폴리뉴클레오티드 (서열번호 3, 9번 염색체)에 있어서, 251번째 염기를 포함하고 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 참고 대립유전자형을 갖는 경우, 대체 대립유전자형을 갖는 경우에 비해 항암 표적치료제 베바시주맙 및 FOLFIR 중 적어도 하나의 제제에 대한 반응성이 높다.
항암 표적치료제제인 베바시주맙 및 FOLFIRI에 대한 또 다른 감수성 예측용 SNP는 ANXA11 (annexin A11) 유전자의 일부를 구성하는 rs1049550 폴리뉴클레오티드 (서열번호 4, 10번 염색체)에 있어서, 401번째 염기를 포함하고 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 대체 대립유전자형을 갖는 경우, 참고 대립유전자형을 갖는 경우에 비해 항암 표적치료제인 베바시주맙 및 FOLFIRI 중 적어도 하나의 제제에 대한 반응성이 높다.
항암 표적치료제제인 베바시주맙 및 FOLFOX (5-FU + 류코보린 (leucovorin) + 옥살리플라틴 (oxaliplatin): 항암제 5-FU 와 옥살리플라틴의 복합제제이며, 류코보린은 5-FU의 작용 상승제임)에 대한 감수성 예측용 SNP는 LINS1 (lines homolog 1) 유전자의 일부를 구성하는 rs11247226 폴리뉴클레오티드 (서열번호: 5, 15번 염색체) 에 있어서, 301번째 염기를 포함하고 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 대체 대립유전자형을 갖는 경우, 참고 대립유전자형을 갖는 경우에 비해 항암 표적치료제인 베바시주맙 및 FOLFOX 중 적어도 하나의 제제에 대한 반응성이 높다.
항암 표적치료제인 세툭시맙에 대한 감수성 예측용 SNP는 ZKSCAN3 (zinc finger with KRAB and SCAN domains 3) 유전자의 일부를 구성하는 rs2278107 (서열번호: 6, 6번 염색체) 폴리뉴클레오티드에 있어서, 401번째 염기를 포함하고 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 대체 대립유전자형을 갖는 경우, 참고 대립유전자형을 갖는 경우에 비해 항암 표적치료제 세툭시맙에 대한 반응성이 높다.
항암 표적치료제제 세툭시맙 및 FOLFIRI (5-FU + 류코보린 (leucovorin) + 이리노테칸 (irinotecan): 항암제 5-FU 와 이리노테칸의 복합제제이며, 류코보린은 5-FU의 작용 상승제임)에 대한 감수성 예측용 SNP는 SEMA4B (semaphorin 4B) 유전자의 일부를 구성하는 rs4932305 폴리뉴클레오티드 (서열번호: 7, 15번 염색체)에 있어서, 201번째 염기를 포함하고 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 대체 대립유전자형을 갖는 경우, 참고 대립유전자형을 갖는 경우에 비해 항암 표적치료제인 세툭시맙 및 FOLFIRI 중 적어도 하나의 제제에 대한 반응성이 높다.
항암 표적치료제제 세툭시맙 및 FOLFIRI에 대한 다른 감수성 예측용 SNP는 DFNB31 (deafness, autosomal recessive 31) 유전자의 일부를 구성하는 rs2274159 폴리뉴클레오티드 (서열번호: 8, 9번 염색체)에 있어서, 401번째 염기를 포함하고 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 참고 대립유전자형을 갖는 경우, 대체 대립유전자형을 갖는 경우에 비해 항암 표적치료제인 세툭시맙 및 FOLFIRI 중 적어도 하나의 제제에 대한 반응성이 높다.
항암 표적치료제제 세툭시맙 및 FOLFIRI에 대한 또 다른 다른 감수성 예측용 SNP는 ISX (intestine-specific homeobox) 유전자의 일부를 구성하는 rs361863 폴리뉴클레오티드(서열번호:9, 22번 염색체)에 있어서, 401번째 염기를 포함하고 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나를 포함한다. 참고 대립유전자형을 갖는 경우, 대체 대립유전자형을 갖는 경우에 비해 항암 표적치료제제인 세툭시맙 및 FOLFIRI 중 적어도 하나의 제제에 대한 반응성이 높다.
항암 표적치료제제 세툭시맙 및 FOLFOX (5-FU + 류코보린 (leucovorin) + 옥살리플라틴 (oxaliplatin): 항암제 5-FU 와 옥살리플라틴의 복합제제이며, 류코보린은 5-FU의 작용 상승제임)에 대한 감수성 예측용 SNP는 LIFR (leukemia inhibitory factor receptor alpha) 유전자의 일부를 구성하는 rs3729740 폴리뉴클레오티드(서열번호: 10, 5번 염색체)에 있어서, 201번째 염기를 포함하고 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 참고 대립유전자형을 갖는 경우, 대체 대립유전자형을 갖는 경우에 비해 항암 표적치료제인 세툭시맙 및 FOLFOX 중 적어도 하나의 제제에 대한 반응성이 높다.
항암 표적치료제제 세툭시맙 및 FOLFOX 에 대한 또 다른 감수성 예측용 SNP는 MDM1 (Mdm1 nuclear protein homolog) 유전자의 일부를 구성하는 rs2306393 폴리뉴클레오티드(서열번호: 11, 12번 염색체)에 있어서, 301번째 염기를 포함하고 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 참고 대립유전자형을 갖는 경우, 대체 대립유전자형을 갖는 경우에 비해 항암 표적치료제인 세툭시맙 및 FOLFOX 중 적어도 하나의 제제에 대한 반응성이 높다.
상기 SNP는 단일염기다형을 나타내는 것으로, 여기서 rs란 reference sequence의 약자이며, 뒤의 숫자는 dbSNP라는 데이터베이스에서 제공하는 각각의 단일염기다형을 구분 짓는 고유 숫자(accession number)이다.
즉, 하기 서열번호 1 내지 11번의 특정위치의 각 뉴클레오티드를 포함하는 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들로부터 선택되는, 1 이상의 항암 표적치료제제 감수성 예측용 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드.
1. 서열번호 1, 7, 10의 201번째 뉴클레오티드
2. 서열번호 3의 251 번째 뉴클레오티드
3. 서열번호 5, 11의 301번째 뉴클레오티드
4. 서열번호 4, 6, 8, 9의 401번째 뉴클레오티드
5. 서열번호 2의 406번째 뉴클레오티드
상기 8개 이상의 연속 염기는 8 내지 100개의 연속 염기인 것이 바람직하다.
본 발명에서, 항암 표적치료제제에 대한 감수성 예측이란, 환자에게 해당 항암제를 처리하였을 때 치료 효과가 어느 정도인지를 예측하는 것을 말한다. 해당 항암 표적치료제제에 대한 감수성이 높은 경우는 우수한 치료 효과를 기대할 수 있는 반면, 해당 항암 표적치료제제에 대한 감수성이 낮은 경우는 저조한 치료 효과가 예상된다.
본 발명에서, SNP (Single Nucleotide Polymorphism)는 개인과 개인간의 DNA에 존재하는 한 염기쌍(single base-pair variation)의 차이로, DNA 서열 다형성(polymorphism) 중에서 가장 많이 존재하는 형태이다.
전술된 서열번호 1 내지 11의 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열 (polymorphic sequence)이다. 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에서 SNP를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.
또한, 전술된 서열번호 1 내지 11의 폴리뉴클레오티드는 대립형질 특이적 (allelic-specific)이다. 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것을 의미한다. 즉, 서열번호 1 내지 11의 각 다형성 서열 중의 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화하는 것을 말한다. 여기서, 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도 하에서 보통 수행된다. 예를 들면, 5 x SSPE (750mM NaCl, 50mM Na Phosphate, 5mM EDTA, pH7.4) 및 25~30℃의 조건이 대립형질 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 대립형질 특이적인 폴리뉴클레오티드는 프라이머 (primer)일 수 있다. 여기서, 프라이머란 적절한 완충용액 중의 적절한 조건 (예, dNTP 또는 dUTP, DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 일반적으로 짧은 프라이머 분자는 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머는 그의 3' 말단이 서열번호 1 내지 11의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화되는 제 2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 프로브(probe)일 수 있다. 본 발명에서 프로브란 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙부위(예, 15개의 뉴클레오티드로 된 프로브이면 7번 위치가, 16개의 뉴클레오티드로 된 프로브이면 8번 또는 9번 위치)가 상기 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이렇게 함으로써 다른 대립형질성 형태간에 좋은 형성화 차이를 유발할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 항암제 감수성 예측용 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 마이크로어레이에 관한 것이다. 본 발명에 따른 마이크로어레이는 항암제 감수성 예측용 SNP를 이용하여 당분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
예컨대, 상기 뉴클레오티드는 아미노 실란(amino-silane), 폴리-L-리신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법은 파이조 일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅법(micropipetting), 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 마이크로어레이를 포함하는 항암 표적치료제제 감수성 예측용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 키트는 본 발명의 마이크로어레이 이외에 피검체로부터 해당 SNP를 포함하는 DNA를 분리 및 증폭하는데 사용되는 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 적절한 프라이머 세트는 본 발명의 서열을 참조하여 당업자는 용이하게 설계할 수 있을 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 항암제 감수성 예측용 SNP를 이용하여 항암제 감수성을 예측하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법은,
(1) 사람으로부터 핵산 시료를 분리하는 단계; 및
(2)서열번호 1내지 11로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP의 위치의 염기 타입을 상기 분리된 핵산분자에서 확인하는 단계;를 포함한다.
예를 들어 대상자의 조직, 체액 또는 세포로부터 DNA를 분리해낸 후 PCR을 통해 DNA를 증폭시킨 후 SNP 분석을 실시한다. SNP 분석은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, Real time PCR System을 이용하여 SNP 분석을 수행하거나, 디데옥시법에 의해 직접적인 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통해 수행할 수 있으며, 또는 SNP 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하거나, 대립형질 특이적 프로브 혼성화 방법(allele-specific probe hybridization), 대립형질 특이적 증폭 방법(allele-specific amplification), 서열분석법(sequencing), 5' 뉴클레아제 분해법(5' nuclease digestion), 분자 비콘 에세이법(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 결합 에세이법(oligonucleotide ligation assay), 크기 분석법(size analysis) 및 단일 가닥 배좌 다형성법(single-stranded conformation polymorphism) 등을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 예측 방법에 있어서, 단계 (2)에서 서열번호 1의 201번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 A로 확인 (A/A 혹은 G/A 이형유전자형으로 확인) 되면 항암 표적치료제인 베바시주맙에 감수성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
서열번호 2의 406번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 T (T/T 혹은 C/T 이형유전자형으로 확인)로 확인되면 항암 표적치료제제인 베바시주맙 및 FOLFIRI (5-FU +류코보린 + 이리노테칸) 중 적어도 하나의 제제에 대한 감수성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
서열번호 3의 251번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 C(C/C)로 확인되면 항암 표적치료제제 베바시주맙 + FOLFIRI (5-FU +류코보린 + 이리노테칸)에 대한 감수성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
서열번호 4의 401번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 T(T/T)로 확인되면 항암 표적치료제제 베바시주맙 및 FOLFIRI (5-FU +류코보린 + 이리노테칸) 중 적어도 하나의 제제에 대한 감수성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
서열번호 5의 301번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 G (G/G 혹은 A/G 이형유전자형으로 확인)로 확인되면 항암 표적치료제제 베바시주맙 및 FOLFOX (5-FU +류코보린 + 이옥살리플라틴) 중 적어도 하나의 제제에 대한 감수성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
서열번호 6의 401번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 G (G/G 혹은 C/G 이형유전자형으로 확인)로 확인되면 항암 표적치료제 세툭시맙에 대한 감수성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
서열번호 7의 201번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 A(A/A 혹은 G/A 이형유전자형으로 확인)로 확인되면 항암 표적치료제제 세툭시맙 및 FOLFIRI (5-FU +류코보린 + 이리노테칸) 중 적어도 하나의 제제에 대한 감수성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
서열번호 8의 401번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 G(G/G)로 확인되면 항암 표적치료제제 세툭시맙 및 FOLFIRI (5-FU +류코보린 + 이리노테칸) 중 적어도 하나의 제제에 대한 감수성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
서열번호 9의 401번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 C(C/C)로 확인되면 항암 표적치료제제 세툭시맙 및 FOLFIRI (5-FU +류코보린 + 이리노테칸) 중 적어도 하나의 제제에 대한 감수성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
서열번호 10의 201번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 G(G/G)로 확인되면 항암 표적치료제제 세툭시맙 및 FOLFOX (5-FU +류코보린 + 옥살리플라틴) 중 적어도 하나의 제제에 대한 감수성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
서열번호 11의 301번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 T(T/T 혹은 T/C 이형유전자형으로 확인)로 확인되면 항암 표적치료제제 세툭시맙 및 FOLFOX (5-FU +류코보린 + 옥살리플라틴) 중 적어도 하나의 제제에 대한 감수성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 베바시주맙 또는 세툭시맙 제제 사용군을 대상으로 임상연관 분석을 실시한 결과, DFNB31 rs2274159, LIFR rs3729740, ISX rs361863의 참고 대립유전자형 및 ANXA11 rs1049550, ITGA3 rs2230392, LINS1 rs11247226의 대체 대립유전자형을 가지는 경우 현저하게 항암제 반응성이 높은 결과 또는 무진행 생존기간의 연장을 보였다. (실시예 3).
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1> SNP 유전자형 선별 제 1단계
118명의 대장암 환자에서 고집적고속 SNP (Affymetrix SNP Array 6.0 사용)분석과 체외종양반응성분석 결과를 연관 분석하여 -Log(P) 값이 3이상인 총 4,163개의 SNP 중 교차불일치도 (R2) 값이 0.8이상인 56개의 SNP를 선별함으로써 항암 표적치료제제 감수성 SNP 유전자형의 기본 자료를 획득하였다.
< 실시예 2> SNP 유전자형 선별 제 2단계
상기 제 1단계에서 선별된 SNP 유전자형 중, 기존 일본인 및 중국인의 분석자료에서 10% 이상의 빈도를 보이고 (www.hanpmap.org), 교차 불평형 (Linkage disequilibrium)을 보이는 SNP 유전자형 후보를 선별하였으며, 추가로 non-synonymous, haplotype-tagging 및 기능성 SNP 선별을 통해서 15종의 후보 SNP를 발굴하였다 (도 1).
이어서, 480명의 정상 인구군 림프구 DNA 시료를 이용한 동일 SNP 유전자형 검증에서 하디-와인버그 평형이탈이 현저하지 않은 (P>0.01) 11종의 SNP를 제 3 단계의 실시예를 통한 최종 검증을 위한 임상 연관분석 검증 후보로 선별하였다 (표 1).
2단계 검증까지 발굴된 11종 유전자의 11개의 항암제 반응성 후보 SNP 표식자
regimens 유전자 SNP ID 대립유전자형 결과
참고 대체
베바시주맙 ITGA3 rs2230392 G A A>T
베바시주맙+
FOLFIRI*		 UTRN rs1534443 C T S>N
베바시주맙+
FOLFIRI*		 TNC rs13321 C G E>Q
베바시주맙+
FOLFIRI*		 ANXA11 rs1049550 C T R>C
베바시주맙+
FOLFOX*		 LINS1 rs11247226 A G I>V
세툭시맙 ZKSCAN3 rs733743 C G R>T
세툭시맙+
FOLFIRI*		 SEMA4B rs4932305 G A I>M
세툭시맙+
FOLFIRI*		 DFNB31 rs2274159 G A A>V
세툭시맙+
FOLFIRI*		 ISX rs361863 C T S>G
세툭시맙+
FOLFOX*		 LIFR rs3729740 G A D>N
세툭시맙+
FOLFOX*		 MDM1 rs2306393 T C H>R
*FOLFIRI, FL (5-FU/leucovorin) + irinotecan; FOLFOX, FL (5-FU/leucovorin) + oxaliplatin
< 실시예 3> SNP 유전자형과 기존 임상경과의 연관 분석 단계
임상연관분석에서는 해당 항암제를 사용하여 치료 경과가 확인된 69 예의 베바시주맙 제제 사용군, 67예의 세툭시맙 제제 사용군을 대상으로 임상적 연관성을 검증하였다. 해당 환자의 임상경과 추적은 NCCN surveillance guideline(www.nccn.org)에 의거하였으며, 항암제의 종양 반응성 판정은 RECIST criteria (Therasse et al., J Natl Cancer Inst 2000;92:205-16)에 의거하였다. 해당 환자의 추적 관찰기간은 평균 13개월 (범위 1-39개월)이었으며, 본 제제의 사용적응이 모두 재발암 혹은 전이암 환자를 대상인 점을 감안하면 결과 판정에 충분한 기간으로 판단되었다.
3-1. 항암 표적치료제제 사용군을 대상으로 생존관련 임상연관분석
제 1~2 단계까지 도출된 개별 항암 제제별 반응성 SNP 유전자형을 임상에서 이미 해당 제제에 의한 치료가 종결된 대장암 환자에서 연관분석을 시행하였다. 우선 98명의 재발암 및 전이암 환자에서 교차치료를 시행한 경우를 포함해서 69명의 베바시주맙 제제 사용군과 67명의 세툭시맙 사용군에서 각각의 약물반응성 후보 SNP의 유전자형을 연관 분석하였다. 항암 표적치료제제 베바시주맙은 약물반응성 후보 SNP의 유전자형인 ITGA3 rs2230392에서 동형 혹은 이형 대체 대립유전자형(homozygous or heterozygous substitution allele)을 보이는 경우 동형 참고 대립 유전자형(homozygous reference allele)을 가지는 경우에 비해 평균 무진행 생존기간 (progression-free survival, PFS)과 전체 생존기간 (overall survival, OS)이 현저히 연장되었다 (PFS, 8.7 ± 0.7 months vs. 5.7 ± 0.7 months, P = 0.018; OS, 22.5 ± 2.1 months vs. 13.4 ± 1.9 months, P = 0.006) (도 2). 반면 항암 표적치료제제 세툭시맙은 약물반응성 후보 SNP의 유전자형인 ISX rs361863에서 동형 참고 대립유전자형(homozygous reference allele)을 보이는 경우 동형 혹은 이형 대체 대립 유전자형(homozygous or heterozygous substitution allele)을 가지는 경우에 비해 평균 무진행 생존기간 (progression-free survival, PFS)이 현저히 연장되었다 (PFS, 8.5 ± 1.2 months vs. 4.4 ± 0.5 months, P = 0.046) (도 3).
3-2. 항암 표적치료제제 사용군을 대상으로 한 약물반응성 임상연관분석 (표 2)
항암 표적치료제제 제제 베바시주맙 치료군 69명 및 세툭시맙 제제 치료군 67명에서 각각 제 1~2단계에서 선별된 SNP 유전자형을 약물반응성과 관련해서 연관분석 결과 베바시주맙 제제의 경우 ANXA11 rs1049550의 동형 대체 대립유전자를 갖는 경우와 LINS1 rs11247226의 동형 혹은 이형 대체 대립 유전자형(homozygous or heterozygous substitution allele)을 가지는 경우 현저하게 질병조절 반응률 (disease-control response rate = stable disease + partial response + complete response)이 높은 결과를 보였다 (P = 0.025, 0.019). 한편, 세툭시맙 제제의 경우 DFNB31 rs2274159과 LIFR rs3729740의 동형 참고 대립유전자를 갖는 경우에서 현저하게 객관적 반응률 (objective response rate = partial response + complete response)과 질병조절 반응률이 각각 높은 결과를 보였다 (P = 0.023, 0.049).
전이암 환자에서 항암 표적치료제제에 대한 후보 SNP 유전자형에 따른 감수성
유전자 (Genes) SNP ID 유전형 (Genotypes) 처방 (Regimen) No. with disease-control response (DCR) or objective response (OR)/ total patients (%)
Type Response P-value
ANXA11 rs1049550 CC+CT bevacizumab DCR 16/32(50) 0.025
TT 28/37(76)
LINS1 rs11247226 AA bevacizumab DCR 25/46(54) 0.019
AG+GG 19/23(83)
DFNB31 rs2274159 GG cetuximab OR 8/17(47) 0.023
GA+AA 9/50(18)
LIFR RS3729740 GG cetuximab DCR 30/42(71) 0.049
GA+AA 12/25(48)
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Claims (14)

  1. ANXA11 (annexine A11) 유전자의 일부를 구성하는, 서열번호 4의 rs1049550 폴리뉴클레오티드의 401번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항암 표적 치료제제 감수성 예측용 SNP 마커 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 연속 염기는 8 내지 100 개의 연속 염기인 것을 특징으로 하는 항암 표적 치료 제제 감수성 예측용 SNP 마커 조성물.
  3. 삭제
  4. ANXA11 (annexine A11) 유전자의 일부를 구성하는 서열번호 4의 rs1049550 폴리뉴클레오티드의 401번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항암 표적 치료제제 감수성 예측용 프라이머.
  5. ANXA11 (annexine A11) 유전자의 일부를 구성하는 서열번호 4의 rs1049550 폴리뉴클레오티드의 401번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항암 표적 치료제제 감수성 예측용 프로브.
  6. ANXA11 (annexine A11) 유전자의 일부를 구성하는 서열번호 4의 rs1049550 폴리뉴클레오티드의 401번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 항암 표적 치료제제 감수성 예측용 마이크로어레이.
  7. 제 6항의 마이크로어레이를 포함하는 항암 표적치료제제 감수성 예측용 키트.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 암은 대장암인 것을 특징으로 하는 항암 표적치료제제 감수성 예측용 키트.
  9. (1) 분리된 동물의 조직, 체액 또는 세포로부터 핵산 시료를 분리하는 단계; 및
    (2) 서열번호 4로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 SNP 위치의 염기 타입을 상기 분리된 핵산분자에서 확인하는 단계;를 포함하는 항암 표적치료제제 감수성 예측방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 (2)단계에서, 서열번호 4의 401번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치의 염기가 T로 확인되면 항암 표적치료제제인 베바시주맙 및 FOLFIRI (5-FU+류코보린+이리노테칸) 중 적어도 하나의 제제에 대한 감수성이 높은 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는 방법.
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