JPH05130871A - 大腸菌中でのサーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼの増加生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Taq Pol)をコ
ードするサーマス・アクアチクス（Thermus aquaticu
s）遺伝子をＮ末端コード領域において変更する。 【効果】 本発明の変異遺伝子は大腸菌において改善さ
れた発現を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は遺伝子工学の分野に関す
る。より詳しくは、本発明は大腸菌（E. coli）中での
改善された発現を有する変異形を提供するための生来の
遺伝子の変更に関する。

【０００２】

【従来の技術】組換え技術における主な業績の１つは大
腸菌エシェリキア・コリ〔Escherichia coli（E. co
li）〕のような原核細胞中での外来遺伝子の高レベル発
現（大量生産）である。近年、この技術は医学的および
化学的に重要なタンパク質の入手可能性を向上させ、そ
の幾つかは既に診断療法および科学的研究に適用されて
いる。原核細胞中でのタンパク質の大量生産は、適当な
基質を用いて酵素の活性を直接測定することにより、ま
たは生産された特定のタンパク質の物理量を測定するこ
とにより、証明される。高レベルのタンパク質生産は、
タンパク質をコードする遺伝子の発現を改良することに
より獲得することができる。遺伝子発現の重要な点は、
タンパク質をコードするヌクレオチド配列を翻訳する際
の効率である。それ自体核酸生化学において有用な試薬
である細菌性酵素、例えばＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリ
メラーゼ等の生産を増加させることに多大な関心があ
る。

【０００３】不運にも、この技術は常に高いタンパク質
収量を提供するわけではない。低タンパク質収量をもた
らす１つの原因は、外来タンパク質をコードするヌクレ
オチド配列の非効率的な翻訳である。タンパク質収量の
増加は、特に、効率的な翻訳を保証することに依存す
る。

【０００４】幾つかの研究室での広範囲に渡る研究か
ら、遺伝子のＮ末端コード領域のヌクレオチド配列が、
翻訳の効率に強く影響を及ぼす因子の１つであるという
ことは認識されている。該遺伝子の始まりのコドンの変
更が貧弱な翻訳を克服できることもわかる。１つの方策
は、コドン選択を変えるのに遺伝暗号の既知の縮重を利
用して、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変え
ることなくコード配列の最初の部分を再設計することで
ある。

【０００５】しかしながら、それらの研究は、どの塩基
が重要であるかまたは特定のタンパク質についてどの配
列を変えるべきであるかに関して断定、教示または指示
していない。よって、研究者は、それらの組換え技術を
用いることによりタンパク質生産を最適化しようと試み
る時に、本質的に経験的なアプローチを取り入れなけれ
ばならない。

【０００６】経験的アプローチは面倒である。一般に、
正しいアミノ酸配列についてあらゆる考えられ得るコド
ンを含む様々な合成オリゴヌクレオチドによりＮ末端コ
ード領域のところを置換する。次いで、様々な方法を使
って、高い発現レベルを与える１つのオリゴヌクレオチ
ドについてスクリーニングするかまたは選択することが
できる。別のアプローチは、もとの配列のランダム突然
変異誘発により一系列の誘導体を得ることである。うま
くいけば広範なスクリーニング操作が高発現レベルを有
するクローンを与えるだろう。次いでこの候補を分析し
て「最適な」配列を決定し、その配列を使ってもとの遺
伝子中の対応断片を置換する。このショットガンアプロ
ーチは敬遠されがちである。

【０００７】それらの長い方策を使って、未変更の（生
来の）遺伝子により少量のみにおいて生産される所望の
タンパク質の合成を増大させる。サーマス・アクアチク
ス（Thermus aquatics）由来の熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼ（Taq Pol)はそのような生産物である。

【０００８】Taq Pol は、核酸鋳型鎖に相補的な核酸鎖
を形成するヌクレオチド三リン酸の結合を触媒する。ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸の増幅への熱
安定性Taq Pol の適用は、分子生物学における新しい支
配的位置へのＰＣＲの発展の重要段階であった。Taq Po
l をコードする遺伝子はクローニングされ、配列決定さ
れ、そして大腸菌中で発現され、あまり多くない量での
みTaq Pol が得られている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】Taq Pol は幾つかの源
から商業的に入手可能であるけれども、現在利用可能な
方法を使って回収される量が少ないこともあって高価で
あることが課題である。需要の増加を満たしそして生産
を一層経済的にするTaq Pol の生産の増加は明らかに望
ましい。

【００１０】

【課題を解決するための手段】

本発明は、Ａ）配列番号２：

【化１】 、配列番号３：

【化２】 および配列番号４：

【化３】 から成る群から選択された変更ヌクレオチド配列と置換
することにより、または Ｂ）生来の成熟タンパク質の最初のアミノ酸の開始コド
ン（ＡＴＧ）と生来の成熟タンパク質の２番目のアミノ
酸のコドン（ＡＧＧ）との間に、配列番号８：

【化４】 の配列を挿入することにより、成熟の生来のタンパク質
中の最初の10アミノ酸をコードする生来の遺伝子中の最
初の30ヌクレオチド塩基の配列が変更されている、Taq
ポリメラーゼ遺伝子を提供する。

【００１１】本発明は、上記の変更された遺伝子を使う
ことによるTaq Pol の生産を増加する方法も提供する。

【００１２】

【実施例】

１．序論 本発明の目的は、Taq ポリメラーゼのＮ末端をコードす
る遺伝子の５′領域において選択されたヌクレオチド配
列を変更することによって、大腸菌（E. coli）中でのT
aq ポリメラーゼの生産を増加させることである。本発
明は、１個〜数個のヌクレオチドが生来のサーマス・ア
クアチクス（Thermus aquaticus）ポリメラーゼ(Taq P
ol) 遺伝子と異なっている４つのヌクレオチド配列を提
供する。生来の遺伝子中に導入しそして大腸菌中にトラ
ンスフェクトせしめた時に、該酵素の活性の増加により
証明されるように、それらのＤＮＡ配列は該遺伝子の改
良発現を提供する。増加量は、行われるヌクレオチド変
更および更に他の要因、例えばIPTGでの誘導、大腸菌の
インキュベーション期間等に依存して広範に異なる。

【００１３】本発明により提供される遺伝子は、本発明
に従って行われる生来の配列の変更以外は、生来のTaq
Pol 遺伝子と同じである。それらの変更が行われる場
合、それらは実施例または配列表において詳しく記載さ
れる。変更はタンパク質のＮ末端をコードする領域のみ
である。より詳しくは、変更は生来の成熟タンパク質の
第11位のアミノ酸（リジン）をコードする11番目のコド
ン（ＡＧＧ）より上流の領域においてのみ行われる。11
番目のコドンは変更されないが、一群または点として配
列表に示され、その上流で本発明のプラクチスにおいて
変更が行われる。同定されたそれらの変更以外のTaq Po
l 遺伝子の残りの配列は未変更のままである。

【００１４】本明細書中で使用する「Taq Pol 遺伝子」
なる用語は、サーマス・アクアチクス（Thermus aquat
icus）の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードするヌク
レオチド配列を指し、そして突然変異が生来のポリメラ
ーゼの本質的な活性の実質的変化を付与しない限りにお
いて、生来の遺伝子の自然のまたは誘発された突然変異
形を包含する。本明細書中で使用する「Taq Pol 」なる
用語は、Taq Pol 遺伝子によりコードされるポリメラー
ゼを言う。

【００１５】本明細書中で使用する「生来の」なる用語
は、Ｔ．アクアチクス（T. aquaticus）中に天然に存在
する遺伝子または酵素と同じ未変更のTaq Pol 遺伝子の
ヌクレオチド配列または未変更のTaq ポリメラーゼ遺伝
子のアミノ酸配列を指す。配列番号１を参照のこと。

【００１６】一般的見地において、本発明は、次の段
階： Ａ）本発明のTaq Pol 遺伝子を有するベクターを提供
し； Ｂ）Ａ）のベクターを用いて適合性大腸菌（E. coli）
宿主をトランスフェクトせしめ、それにより形質転換さ
れた大腸菌宿主細胞を得；そして Ｃ）Ｂ）の形質転換細胞を増殖条件下で培養し、それに
よって形質転換宿主細胞により合成されるTaq ポリメラ
ーゼを生産させる、 を含んで成る。本発明において次の菌株、プラスミド、
ファージおよび試薬を使用した。

【００１７】２．菌株 サーマス・アクアチクス（Thermus aquaticus）YT-I
(ATCC No. 25104) を生来のＤＮＡの単離に使用した。
全てのクローニングおよびプラスミド操作用に、宿主大
腸菌（E. coli）株 DH5α F^- Θ80dlacZΔM15 Δ(lacZ
YA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(r_K ^- ,m_K ⁺ ) supE4
4 thil gyrA relA1 をBRL から入手した。

【００１８】株JM103 thi^- ,strA, supE, endA, sbcB,
hsdR ^- , D(lac-pro), F'traD36,proAB, lacI^q , lac
ZDM15 (Yanisch-Perron 他, "Improved M13 Phage Clo
ning Vectors and Host Strains: Nucleotide Sequence
s of M13mp18 and pUC19 Vectors", Gene 33 : 103-11
9 (1985) ) もタンパク質発現実験に使用した。突然変
異誘発において使用する一本鎖ＤＮＡの調製のための宿
主株は CJ236 (pCJ105, dut ung thi relA) Kunkel
他, "Rapid and Efficient Site-specificMutagenesis
without Phenotypic Selection", Methods Enzymol. 1
54 : 367-382 (1987) であった。

【００１９】突然変異誘発用の一本鎖プラスミドＤＮＡ
を得るためのヘルパーファージとしてf1ファージR408
Russel他, "An Improved Filamentous Helper Phage fo
r Generating Single-stranded DNA", Gene 45:333-3
38 (1986) を使用した。全てのクローニングおよび発現
操作に使用したプラスミドはpSCW562 またはその誘導体
pTaq1 であった。pSCW562 の地図を図１に示す。生来の
Taq Pol 遺伝子をpSCW562 中に挿入した時、生じたプラ
スミドはpTaq1 と命名される。生来のTaq Pol遺伝子が
突然変異誘発により変更される時、突然変異誘発に使用
するヌクレオチド配列に応じて、変異プラスミドはそれ
ぞれpTaq3, pTaq4, pTaq5 またはpTaq6と命名される。

【００２０】３．試薬 化学物質はSigma,International Biotechnologies,Inc.
またはEastman Kodakから購入した。LB培地はGibco か
ら入手した。酵素はNew England Biolabs, IBI, BRL, B
oehringer-MannheimまたはU.S.Biochemicalsから購入
し、そして供給元により勧められた通りに使用した。Ｄ
ＮＡ配列決定用の Sequenase^TMキットはU.S.Biochemica
lsから入手した。放射性同位体はAmershamから購入し
た。Taq ポリメラーゼはCetus から購入した。

【００２１】４．Taq Pol の生産を増加させる方法 段階Ａ ──本発明のTaq Pol 遺伝子を有するベクターの
提供 本発明のTaq Pol 遺伝子を有するベクターを提供する１
つの方法は、 ─サーマス・アクアチクス（Thermus aquaticus）から
生来のＤＮＡを用意し、 ─生来のTaq Pol ＤＮＡを増幅させそして該ＤＮＡ断片
の両端に制限部位を組み込み、 ─ii) のＤＮＡ断片を適当なベクター中に連結せしめ、 ─部位特異的突然変異誘発を用いて生来のＤＮＡのヌク
レオチド配列を変更し、そして ─本発明の変更ヌクレオチド配列を有するベクターにつ
いてスクリーニングする、ことである。

【００２２】i. T.アクアチクス（T. aquaticus）から
の生来の遺伝子の提供 全てのＤＮＡ操作は標準法（Maniatis他, MolecularClo
ning : A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Labo
ratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982およびAu
sebel 他, Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley and Sons, New York, 1987)を使って実施し
た。T.アクアチクス（T. aquaticus）(YT-1 株 ATCC N
o.25104 ) の全ＤＮＡを、ATCC No.461 培地中で70℃に
て一晩増殖させた40 ml 培養物から単離した。細胞を遠
心によりペレット化し、10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM エ
チレンジアミン四酢酸(EDTA)（ＴＥ）で１回洗浄し、そ
して5 mlのＴＥ中に再懸濁した。リゾチームを1 mg/ml
の濃度に添加し、溶液を37℃で30分間インキュベートし
た。EDTA、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) およびプロテ
イナーゼＫをそれぞれ50mM, 0.5 ％および100 μg/mlの
濃度に添加し、そして溶液を50℃で4 時間インキュベー
トした。試料をフェノール−クロロホルムで３回そして
クロロホルムで１回抽出し、0.3Mへの酢酸ナトリウムの
添加および２容のエタノールの添加によってＤＮＡを沈
澱させた。ガラス棒に巻き取ることによりＤＮＡを回収
し、70％エタノール中で洗浄し、そしてＴＥ中に溶解さ
せた。

【００２３】ii. 生来のTaq Pol 遺伝子の増幅および制
限部位の組み込み 多量のTaq Pol 遺伝子を生産する最も迅速な方法は、発
表された該遺伝子の核酸配列（Lawyer他, "Isolation,
Characterization and Expression in Escherichia co
li of the DNA Polymerase from Thermus aquaticus,
Journal of Biological Chemistry, 264:6427-6437, 19
89）を使用して、ゲノムＤＮＡを増幅させるＰＣＲにお
いて使用できるオリゴヌクレオチドプライマーを設計す
ることである。全遺伝子配列については配列表の配列番
号１を参照のこと。

【００２４】PCR は当業者に公知の増幅技術であり〔Sa
iki 他, "Primer-directed Enzymatic Amplification o
f DNA with a Thermostable DNA Polymerase", Scienc
e 239:487-491 (1988)〕、特定の既知の核酸配列を大
量に生産する連鎖反応を伴う。PCR は、所望の核酸配列
とハイブリダイズし伸長生成物を合成するように十分に
相補的であるオリゴヌクレオチドプライマーを調製でき
るように、増幅すべき核酸配列が十分に詳細に知られて
いなければならない。

【００２５】プライマーは、核酸鎖に相補的であるプラ
イマー伸長生成物の合成が誘導されるような条件下に置
いた時、即ち４つの異なるヌクレオチド三リン酸と熱安
定性酵素の存在下で適当な緩衝液中にそして適当な温度
に置いた時、ＤＮＡ合成の開始点として作用することが
できる天然または合成のオリゴヌクレオチドである。

【００２６】PCR 増幅は、本質的にはSaiki 他により記
載されたようにして、Ericomp 熱循環器中でi)のTaq Po
l DNA 上で行った。発表されたTaq Pol 遺伝子の配列(L
awer他) に基づいてプライマーを設計した。増幅混合物
は約100 ngのT.アクアチクス（T. aquaticus）ＤＮＡ、
２つのプライマー各１μM 、dATP, dGTP, dCTPおよびdT
TP各 200μM 、並びに２単位のTaqPol を0.05mlの容量
中に含んだ。５サイクルにおいてこの混合物を97℃で10
秒間加熱し、40℃で30秒間アニーリングし、そして72℃
で５分間伸長させた。次の20サイクルではアニーリング
温度を55℃に上げ、そして伸長時間を３分に短縮した。
最後に、完全な二本鎖生成物の量を最大にするために混
合物を72℃で15分間インキュベートした。PCR 反応混合
物全体を1.0 ％アガロースゲル上で分画し、2.5 kbのTa
q ポリメラーゼ遺伝子を切り取り、そして抽出した。
「凍結−圧搾技術」を使ってアガロースゲルからＤＮＡ
断片を単離した。アガロース切片を細かく砕き、ドライ
アイス上で凍結させ、そして37℃で５分間迅速に解凍し
た。スラリーをMillipore の0.45mm Durapore 膜を通し
た遠心により濾過した。濾液を水飽和フェノールで１
回、フェノール−クロロホルム（１：１）で１回および
クロロホルムで１回抽出した。エタノール沈澱によりＤ
ＮＡを回収した。

【００２７】制限部位の組み込み：PCR 中にTaq Pol 遺
伝子の切除および回収を可能にするためにそして発現ベ
クター中へのTaq Pol 遺伝子の便利なクローニングを与
えるために、該遺伝子の両鎖の５′末端に２つの制限部
位を導入した。更に詳しくは、１つの制限部位を開始コ
ドン（ＡＴＧ）の近くであって且つその上流に導入し、
もう１つの制限部位を終結コドン（ＴＧＡ）の近くであ
って且つその下流に導入した（配列番号６および７）。
制限部位を形成するヌクレオチドをPCR に使用する合成
プライマーに含めた。本明細書中に開示される実施例に
おいては、EcoRI 制限部位を形成するヌクレオチド配列
GAATTCをプライマーに含めた。

【００２８】1)発現ベクターが、Taq Pol 遺伝子を連結
しようとする所に対応部位を有し、 2)制限部位がTaq Pol 遺伝子中に存在しないならば、他
の制限部位を本発明のプラクチスにおいて使用すること
ができる。図１に示されるように、EcoRI はpSCW562 の
幾つかの制限部位のうちの１つである。他の制限部位の
例はXbaIとSphIである。もちろん、他の制限部位を有す
る発現ベクターもまた、本発明のプラクチスにおいて有
用であろう更なる可能な制限部位を提供するだろう。適
当な酵素で消化した時、それらの制限部位は粘着末端を
形成し、対応して消化された発現ベクター上の制限部位
に便利に連結せしめることができる。該制限部位はTaq
Polのアミノ酸配列に影響を及ぼさない。

【００２９】別法：あるいは、上述したPCR 技術の代わ
りに、生来のTaq Pol 遺伝子を従来的にクローニングす
ることにより、生来のTaq Pol 遺伝子を提供することが
できる。この場合、制限部位は部位特異的突然誘発によ
り導入することができる。いずれの方法でも最終結果は
区別できない。

【００３０】iii.ベクター中へのＤＮＡ断片の連結 段階ii) からのＤＮＡを適当な発現ベクター中に連結す
る。クローニング用に選択されるベクターは、リボソー
ム結合部位の11塩基対下流のEcoRI 部位と強力なtac (t
rp-lacハイブリッド) プロモーターを含むpSCW562 であ
った（図１）。Taq Pol 遺伝子はEcoRI 部位を１つも含
まないので、pSCW562 のEcoRI 部位中への直接クローニ
ングを可能にするためにそれらの５′末端近くにEcoRI
部位を有するPCR プライマーをデザインした（段階 ii
）。

【００３１】EcoRI 部位に加えて、ベクターpSCW562 は
1)ファージ複製開始点(F₁)、2)プラスミド複製開始点(O
RI) 、3)抗生物質耐性マーカー(AMP) 、および4)制限部
位の下流の転写終結配列を含む。このプラスミドは、Ma
niatis他, Molecular Cloning : A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor, New York,(1982)において教示さ
れるような組換えＤＮＡの分野において公知の技術を使
って作製した。しかしながらこの特定プラスミドは本発
明にとって重要でない。適当なプロモーターと制限部位
を含む任意のベクターが本発明の方法において有用であ
ろう。

【００３２】段階ii) からのEcoRI 部位で消化されたPC
R 生成物を１％アガロースゲル上で分別しそして溶出さ
せた。ベクターpSCW562 をEcoRI (10 単位／μg ）で一
晩消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼ（１単位／
μg ）で処理し、フェノール／クロロホルムで抽出し、
エタノール沈澱させ、そしてＴＥ中に再懸濁した。約20
0 ngの調製ベクターを500 ngの精製PCR 生成物と混合
し、そして0.5 Weiss 単位のT4 DNAリガーゼを用いて50
mM Tris-HCl, pH7.8, 10mM MgCl₂, 20mMジチオトレイト
ール, 1mM ATP 中で20μl の容量中で連結せしめた。

【００３３】iv. 部位特異的突然変異誘発を使った生来
のTaq Pol 遺伝子のヌクレオチド配列の変更 部位特異的突然変異誘発は、変更しようとする配列内の
特定のヌクレオチドを特異的に置換、挿入または除去す
ることにより、ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を変更す
る方法である。この方法は、鋳型の配列とのヌクレオチ
ドミスマッチを有する化学的に合成されたヌクレオチド
を用いて試験管内でＤＮＡ合成を開始させることを伴
う。合成オリゴヌクレオチドはＤＮＡ合成を開始させ、
そしてそれ自体生じたヘテロ二本鎖分子中に組み込まれ
る。宿主細胞の形質転換後、このヘテロ二本鎖はその配
列が変異原性ヌクレオチドを含むホモ二本鎖を生成す
る。当業界で公知のスクリーニング方法、例えば標識Ｄ
ＮＡとの核酸ハイブリダイゼーションとＤＮＡ配列決定
により、変異体クローンを選択する。

【００３４】部位特異的突然変異誘発を使って、 Ａ）例１─配列番号２：

【化５】 例２─配列番号３：

【化６】 および 例３─配列番号４：

【化７】 から成る群から選択された変更ヌクレオチド配列と置換
することにより、または 例４ Ｂ）生来の成熟タンパク質の最初のアミノ酸の開始コド
ン（ＡＴＧ）と生来の成熟タンパク質の２番目のアミノ
酸のコドン（ＡＧＧ）との間に、配列番号８の配列：

【化８】 を挿入することにより、生来の成熟タンパク質中の最初
の10アミノ酸をコードする生来の遺伝子中の最初の30ヌ
クレオチド塩基の配列が変更されている、Taq ポリメラ
ーゼ変異体遺伝子を作製した。

【００３５】上記例において、変更されている塩基はボ
ールド字体で強調されている。それらの変更がポリメラ
ーゼ活性に与える効果を表１に示す。上記の例は単に例
示のためであり、特許請求の範囲を限定するためではな
い。それらの例において、全ての遺伝子操作は部位特異
的突然変異誘発によって行った。しかしながら、同じ結
果を与えるであろう別法が当業界において知られてい
る。例えば、上記のTaq Pol 遺伝子への変更は、本発明
のヌクレオチド配列を含む上流オリゴヌクレオチドプラ
イマーを適当に設計することにより、増幅(PCR) 中に該
遺伝子中に直接組み込むことができた。

【００３６】もう１つの別法は、該遺伝子の最初の10コ
ドンをひとまとめに扱うユニーク制限部位を組み込むこ
とであろう。これは、制限エンドヌクレアーゼ開裂によ
るアミノ末端をコードする配列の削除および二本鎖合成
断片を使った置換を可能にするであろう。それらの方法
のいずれを用いても、上述のヌクレオチド変更を達成す
ることができる。

【００３７】本質的にはKunkel他, "Rapid and Efficie
nt Site-specific Mutagenesis without Phenotypic Se
lection", Methods Enzymol., 154:367-382 (1987)に記
載されたようにして、Bio Rad 社から入手したキットを
使って、部位特異的突然変異誘発を行った。一本鎖プラ
スミドＤＮＡは、CJ236 (pTaq1を担持) の初期指数増殖
期培養物に約10〜20の感染多重度でR408を感染させるこ
とにより調製した。37℃で一晩増殖させた後、遠心によ
り細胞を除去し、そしてポリエチレングリコールを5%
に、NaClを0.5Mに添加することにより、ファージを沈降
させた。遠心によりファージをペレット化し、フェノー
ル／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱によりＤＮ
Ａを単離した。変異原性オリゴヌクレオチドをＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼによりリン酸化し、そして各９ピ
コモルを約３ピコモルの一本鎖プラスミドＤＮＡにアニ
ールさせた。アニールした混合物をＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼにより伸長し、連結し、そして DH5αまたはJM103
中に形質転換せしめた。迅速煮沸（HolmesおよびQuigle
y, "A Rapid Boiling Method for the Preparation of
Bacterial Plasmids", Anal. Biochem. 114:193-199,
1981)により形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離
し、EcoRI で消化して突然変異が起こっているクローン
を同定した。

【００３８】v. Taq Pol遺伝子を有するベクターについ
てのスクリーニング iv) のクローンが所望のTaq Pol 遺伝子を担持している
ことを確かめるために、クローンをニトロセルロースフ
ィルター上に載せ、コロニーハイブリダイゼーションに
よりTaq Pol 形質転換体として同定した。

【００３９】コロニーハイブリダイゼーション：この技
術は、一本鎖の特定の核酸配列が相補的な放射性一本鎖
核酸断片（プローブ）と塩基対を形成する（ハイブリダ
イズする）条件を作ることにより特定の核酸配列を同定
する。２つの型のＤＮＡが相補的ヌクレオチド配列を有
する二本鎖領域が形成し、それらの放射能により検出す
る。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって５′末端が
³²Ｐで標識された配列番号１０を有する次の内部オリゴ
ヌクレオチド：

【化９】 とのハイブリダイゼーションにより、Taq Pol 断片を含
むコロニーを同定した。コロニーハイブリダイゼーショ
ンは、 5 ng/mlの³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドを含む 5
×SSPE 1×SSPE : 10mM リン酸ナトリウム(pH 7.0),
0.18M NaCl, 1mMEDTA 、0.1%ラウロイルサルコシンナ
トリウム、0.02% SDS 、0.5%ブロッキング剤(Boehringe
r-Mannheim) 中で、Maniatis他, 前掲に記載された通り
に実施した。42℃で4 〜18時間ハイブリダイゼーション
を行った。フィルターを 2×SSPE,0.1% SDS中で室温に
て３回洗浄し、次いで同溶液中で42℃にて緊縮洗浄し
た。オートラジオグラフィーにより陽性コロニーを同定
した。

【００４０】配列分析：Taq Pol DNA が正しい方向で組
み込まれたかどうかを確認するために、U.S. Biochemic
als 社からの Sequenase^TMキットと(³⁵S)dATP を使っ
て、Zhang 他, "Double Stranded DNA Sequencing as a
Choice for DNA Sequencing",Nucleic Acids Research
16:1220 (1988)に記載されたようにして、アルカリ変
性されたスーパーコイルＤＮＡにおいてＤＮＡ配列分析
を行った。典型的には、CsClでバンド沈降させたスーパ
ーコイルＤＮＡ1.0μl を、20μl の0.2M NaOH,0.2mM E
DTA 中で５分間変性させた。その溶液を 2μl の2M酢酸
アンモニウム(pH 4.6)で中和し、そして60mlのエタノー
ルで沈澱させた。混合物を10分間遠心し、80％エタノー
ルで１回洗浄し、7ml のH₂O 中に再懸濁した。5ng のプ
ライマーと2 μl の 5×緩衝液を添加した後、試料を65
℃に加熱し、そして30〜45分間に渡り＜37℃に冷却し
た。次いで供給者により指示された通りに配列決定反応
を実施した。所望によりゲルの底近くの分離を改善する
ために酢酸ナトリウム塩勾配を使って(Sheen他, "Elect
rolyte Gradient Gelsfor DNA Sequencing", Bio Techn
iques 6:942-944, 1989) 、反応液を6%配列決定用ゲ
ル上で電気泳動した。あるいは、幾分信頼度が減少する
けれども、迅速煮沸またはアルカリ微量調製(miniprep)
法により調製したプラスミドＤＮＡをフェノール−クロ
ロホルムでの抽出およびエタノール沈澱後に配列決定に
使用した。

【００４１】段階Ｂ─Ａ）のベクターを用いた宿主細胞
のトランスフェクション 段階Ａ）のベクターを用いて適当な宿主をトランスフェ
クトせしめ、そして形質転換宿主を適切な増殖条件下で
培養する。原核生物宿主は遺伝子操作技術において一般
に最も有効で且つ便利であり、従ってTaq ポリメラーゼ
の発現に好ましい。原核生物は、最も頻繁には種々の大
腸菌（E.coli）株、例えば下記の実施例において使用す
る DH5αおよびJM103 により代表される。しかしなが
ら、宿主として選択された株が、該株を形質転換せしめ
るプラスミドベクターと適合性である限り、他の微生物
株も使用することができる。宿主とプラスミド／ベクタ
ーとの適合性とは、宿主がプラスミド／ベクターＤＮＡ
を忠実に複製し、そして上記の調節要素が正しく機能す
るのを許容することを意味する。本発明者らの系では、
DH5αおよびJM103がpSCW562 と適合性である。

【００４２】段階Ｂの連結混合物 5mlを、Cohen 他, Pr
oc. National Academy of Science,USA, 69:2110 (197
2)に記載されたようなCaCl₂ 処理によりコンピテントに
された DH5αおよびJM103 細胞 0.1μl と混合した。氷
上で15〜30分間インキュベートした後、42℃で90秒間混
合物をインキュベートした。熱ショック後、1 mlのＬＢ
培地を添加し、37℃で１時間細胞をインキュベートし
た。

【００４３】形質転換体の選択：１時間のインキュベー
ション後、インキュベーション混合物のアリコートを、
50μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上に塗
布し、37℃で18時間インキュベートした。AMP（マーカ
ー) 遺伝子を含む形質転換された大腸菌のみがこの培地
上で増殖することができる。更に正しい方向でTaq Pol
遺伝子を含む形質転換体を選択するために、上述した技
術を用いてコロニーハイブリダイゼーションと配列分析
を行った。

【００４４】段階Ｃ─形質転換宿主の培養 正しい方向でTaq Pol 遺伝子を含むことが確認された大
腸菌形質転換体を40mlのＬＢブロス中で37℃にて中−対
数増殖期まで培養し、そして適当ならば、１mMイソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）で誘導した。
細胞を更に２時間または一晩増殖させ、そして遠心によ
り収得した。細胞を0.25mlの50mM Tris-HCl, pH7.5, 1m
M EDTA, 0.5 μg/mlロイペプチン, 2.4mM フェニルメチ
ルスルホニルフルオリド中に再懸濁し、超音波処理し
た。溶解物を0.25mlの10mM Tris-HCl,pH8.0, 50mM KCl,
0.5% Tween 20, 0.5%NP-40で希釈し、そして74℃に20
分間加熱した。氷上で15分間冷却した後、4 ℃で10分間
の遠心により細胞破片を除去した。基質として活性化さ
れたサケ精子ＤＮＡを使って、上清分画のアリコートを
ＤＮＡポリメラーゼ活性についてアッセイした。

【００４５】ＤＮＡポリメラーゼアッセイ：このアッセ
イは、二本鎖ＤＮＡ中に作られた一本鎖ギャップをフィ
ルインするＤＮＡポリメラーゼの能力に基づく。鋳型と
して一本鎖ギャップを使用し、そしてプライマーとして
一本鎖ギャップの縁の３′遊離ヒドロキシル基を使い、
そこで合成が始まる。詳しくは、 5μl の酵素調製物を
全体で50μl 中で74℃で10分間次のものと共にインキュ
ベートした：25mMトリス（ヒドロキシメチル）メチル−
３−アミノプロパンスルホン酸（TAPS) (22 ℃でpH9.
8)、50mM KCl、1mM ２−メルカプトエタノール、2mM Mg
Cl₂ 、0.30mg/ml活性化されたサケ精巣ＤＮＡ、dCTP,dG
TP,dTTP各0.2mM および0.1mM (200nCi/ナノモル) 8-³H
dATP 。100 μl の0.15M ピロリン酸ナトリウム、0.105
M EDTA ナトリウム (pH 8.0) の添加についで10% 氷冷
トリクロロ酢酸(TCA) の添加により反応を停止させた。
それを氷上に15〜30分間維持した後、予め湿らせた25mm
Whatmanグラスファイバーフィルター(GFC) 濾過ディス
ク上で吸引濾過した。沈澱した反応生成物を全部で12ml
の氷冷10%TCA および次に全部で12mlの氷冷95% エタノ
ールで洗浄し、フィルター上の取り込まれなかった ³Ｈ
を除去した。フィルターを真空乾燥し、風乾し、そして
シンチレーション液体中で直接カウントした。希釈を必
要とする酵素調製物は、10mM Tris, 50mM KCl,10mM MgC
l₂, 1.0mg/mlゼラチン, 0.5% Nonidet P40, 0.5% Tween
20, 1 mM ２−メルカプトエタノール, pH8.0 で希釈し
た。活性１単位は、74℃にて30分間で10ナノモルの全ヌ
クレオチドを取り込むのに必要とされる酵素の量であ
る。アデニンはサケ精子ＤＮＡの全塩基の約29.7% を占
める。

【００４６】サケ精巣ＤＮＡ（Sigma III 型；商品番号
D1626)をＴＭ緩衝液（10mM Tris, 5mM MgCl₂, pH7.2)中
に1.3 mg/ml の濃度に溶解し、そして4 ℃で24時間ゆっ
くりと攪拌した。次いでそれをＴＭ緩衝液で2.5 倍希釈
し、0.3M NaCl に調整した後、同容量のフェノール／ク
ロロホルム（１：１；ｖ／ｖ；フェノールはＴＭ緩衝液
で飽和させたもの）で抽出した。混合物を2700×g で室
温にて５分間遠心して相分離を助け、水相を収得し、同
容量のクロロホルムで抽出した。混合物を上記と同様に
遠心し、再び水相を回収した。水相中の活性化ＤＮＡを
２容の95％エタノールで−20℃で沈澱させた。沈澱した
混合物を−20℃で12〜18時間維持した。沈澱したＤＮＡ
を２℃にて13,700×gで30分間遠心することにより回収
した。窒素ガス流を用いてペレットを乾燥し、室温で12
〜18時間ゆっくりと振盪しながらＴＥ（10mM Tris, 1mM
EDTA, pH7.5) 中に3 〜6 mg/ml に再溶解た。溶液をＴ
Ｅに対して透析し、次いで260 nmでの吸光度をチェック
することにより正確な濃度に調整した。アリコート(0.5
〜1.0 ml) を−20℃で保存し；使用時に、１バイアルを
解凍し、そして再冷凍しないで４℃に維持した。

【００４７】５．ポリメラーゼアッセイの結果 Taq Pol アッセイの結果を表１に示す。ベクターpTaq1
は、生来のTaq Pol 配列である配列番号１の配列を有し
ており、一方他の４つのプラスミドは上述のように本発
明に従って変更されている配列を有する。

【００４８】表１は、意外にも、pTaq3 （配列番号２）
がpTaq1 の活性の200 倍までのTaqPol 活性を発現し；p
Taq4 （配列番号３）がpTaq1 の活性の約10倍の活性を
有し；pTaq5 （配列番号４）が実験に応じてpTaq1 より
約10〜50倍大きい活性を有し；そしてpTaq6 （配列番号
５）がpTaq1 （配列番号１）の少なくとも10倍大きい活
性であったことを示す。それらの結果は予想外であっ
た。配列表中の短いヌクレオチド配列は、生来の遺伝子
の最初の30ヌクレオチドにおける配列変更を表す。それ
らの配列は、全体で2,000 ヌクレオチド以上を含む完全
なTaq Pol 遺伝子の小部分のみを表すと解釈すべきであ
る。

【００４９】

【表１】

【００５０】表１─種々の発現プラスミドによりコード
される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ活性のアッセイ。ポ
リメラーゼ活性は、遺伝子発現とポリメラーゼ生産の反
映と解釈される。

【００５１】

【発明の効果】本発明は、200 倍高い増強されたポリメ
ラーゼ活性レベルを提供する。本発明の組換えポリメラ
ーゼは、生来のTaq Pol とは機能的に識別不可能であ
る。

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２４９９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：サーマス・アクアチクス(Thermus aquaticus) 単離クローン名：ＹＴ１，ＡＴＣＣ ２５１０４ 直接の起源：ゲノムＤＮＡから増幅させたもの 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１−２４９６ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報 刊行物情報 著者：Lawyer, F. C., Stoffel, S., Saiki, R. K., My
ambo, K.,Drummond, R.,Gelfand, D. H. 題：Isolation, characterization and expression in
Escherichia coliof the DNA polymerase gene from Th
ermus aquaticus 刊行物：Journal of Biological Chemistry 巻：２６４ 号：１１ 頁：６４２７−６４３７ 発行日：１９８９年４月１５日 配列 ATG AGG GGG ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG GGC CGG GTC CTC 45 Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu 5 10 15 CTG GTG GAC GGC CAC CAC CTG GCC TAC CGC ACC TTC CAC GCC CTG 90 Leu Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu 20 25 30 AAG GGC CTC ACC ACC AGC CGG GGG GAG CCG GTG CAG GCG GTC TAC 135 Lys Gly Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr 35 40 45 GGC TTC GCC AAG AGC CTC CTC AAG GCC CTC AAG GAG GAC GGG GAC 180 Gly Phe Ala Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp 50 55 60 GCG GTG ATC GTG GTC TTT GAC GCC AAG GCC CCC TCC TTC CGC CAC 225 Ala Val Ile Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His 65 70 75 GAG GCC TAC GGG GGG TAC AAG GCG GGC CGG GCC CCC ACG CCG GAG 270 Glu Ala Tyr Gly Gly Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu 80 85 90 GAC TTT CCC CGG CAA CTC GCC CTC ATC AAG GAG CTG GTG GAC CTC 315 Asp Phe Pro Arg Gln Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu 95 100 105 CTG GGG CTG GCG CGC CTC GAG GTC CCG GGC TAC GAG GCG GAC GAC 360 Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp 110 115 120 GTC CTG GCC AGC CTG GCC AAG AAG GCG GAA AAG GAG GGC TAC GAG 405 Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu 125 130 135 GTC CGC ATC CTC ACC GCC GAC AAA GAC CTT TAC CAG CTC CTT TCC 450 Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp Leu Tyr Gln Leu Leu Ser 140 145 150 GAC CGC ATC CAC GTC CTC CAC CCC GAG GGG TAC CTC ATC ACC CCG 495 Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly Tyr Leu Ile Thr Pro 155 160 165 GCC TGG CTT TGG GAA AAG TAC GGC CTG AGG CCC GAC CAG TGG GCC 540 Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro Asp Gln Trp Ala 170 175 180 GAC TAC CGG GCC CTG ACC GGG GAC GAG TCC GAC AAC CTT CCC GGG 585 Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn Leu Pro Gly 185 190 195 GTC AAG GGC ATC GGG GAG AAG ACG GCG AGG AAG CTT CTG GAG GAG 630 Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu Glu Glu 200 205 210 TGG GGG AGC CTG GAA GCC CTC CTC AAG AAC CTG GAC CGG CTG AAG 675 Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu Lys 215 220 225 CCC GCC ATC CGG GAG AAG ATC CTG GCC CAC ATG GAC GAT CTG AAG 720 Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 230 235 240 CTC TCC TGG GAC CTG GCC AAG GTG CGC ACC GAC CTG CCC CTG GAG 765 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu 245 250 255 GTG GAC TTC GCC AAA AGG CGG GAG CCC GAC CGG GAG GGG CTT AGG 810 Val Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270 GCC TTT CTG GAG AGG CTT GAG TTT GGC AGC CTC CTC CAC GAG TTC 855 Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe 275 280 285 GGC CTT CTG GAA AGC CCC AAG GCC CTG GAG GAG GCC CCC TGG CCC 900 Gly Leu Leu Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro 290 295 300 CCG CCG GAA GGG GCC TTC GTG GGC TTT GTG CTT TCC CGC AAG GAG 945 Pro Pro Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu 305 310 315 CCC ATG TGG GCC GAT CTC CTC GCC CTG GCC GCC GCC AGG GGG GGC 990 Pro Met Trp Ala Asp Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly 320 325 330 CGG GTC CAC CGG GCC CCC GAG CCT TAT AAA GCC CTC AGG GAC CTG 1035 Arg Val His Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu 335 340 345 AAG GAG GCG CGG GGG CTT CTC GCC AAA GAC CTG AGC GTT CTG GCC 1080 Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala 350 355 360 CTG AGG GAA GGC CTT GGC CTC CCG CCC GGC GAC GAC CCC ATG CTC 1125 Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu 365 370 375 CTC GCC TAC CTC CTG GAC CCT TCC AAC ACC ACC CCC GAG GGG GTG 1170 Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val 380 385 390 GCC CGG CGC TAC GGC GGG GAG TGG ACG GAG GAG GCG GGG GAG CGG 1215 Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Glu Ala Gly Glu Arg 395 400 405 GCC GCC CTT TCC GAG AGG CTC TTC GCC AAC CTG TGG GGG AGG CTT 1260 Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu Trp Gly Arg Leu 410 415 420 GAG GGG GAG GAG AGG CTC CTT TGG CTT TAC CGG GAG GTG GAG AGG 1305 Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu Arg 425 430 435 CCC CTT TCC GCT GTC CTG GCC CAC ATG GAG GCC ACG GGG GTG CGC 1350 Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg 440 445 450 CTG GAC GTG GCC TAT CTC AGG GCC TTG TCC CTG GAG GTG GCC GAG 1395 Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala Glu 455 460 465 GAG ATC GCC CGC CTC GAG GCC GAG GTC TTC CGC CTG GCC GGC CAC 1440 Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 470 475 480 CCC TTC AAC CTC AAC TCC CGG GAC CAG CTG GAA AGG GTC CTC TTT 1485 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe 485 490 495 GAC GAG CTA GGG CTT CCC GCC ATC GGC AAG ACG GAG AAG ACC GGC 1530 Asp Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly 500 505 510 AAG CGC TCC ACC AGC GCC GCC GTC CTG GAG GCC CTC CGC GAG GCC 1575 Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala 515 520 525 CAC CCC ATC GTG GAG AAG ATC CTG CAG TAC CGG GAG CTC ACC AAG 1620 His Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys 530 535 540 CTG AAG AGC ACC TAC ATT GAC CCC TTG CCG GAC CTC ATC CAC CCC 1665 Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro 545 550 555 AGG ACG GGC CGC CTC CAC ACC CGC TTC AAC CAG ACG GCC ACG GCC 1710 Arg Thr Gly Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala 560 565 570 ACG GGC AGG CTA AGT AGC TCC GAT CCC AAC CTC CAG AAC ATC CCC 1755 Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro 575 580 585 GTC CGC ACC CCG CTT GGG CAG AGG ATC CGC CGG GCC TTC ATC GCC 1800 Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala 590 595 600 GAG GAG GGG TGG CTA TTG GTG GCC CTG GAC TAT AGC CAG ATA GAG 1845 Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu 605 610 615 CTC AGG GTG CTG GCC CAC CTC TCC GGC GAC GAG AAC CTG ATC CGG 1890 Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg 620 625 630 GTC TTC CAG GAG GGG CGG GAC ATC CAC ACG GAG ACC GCC AGC TGG 1935 Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr Glu Thr Ala Ser Trp 635 640 645 ATG TTC GGC GTC CCC CGG GAG GCC GTG GAC CCC CTG ATG CGC CGG 1980 Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg 650 655 660 GCG GCC AAG ACC ATC AAC TTC GGG GTC CTC TAC GGC ATG TCG GCC 2025 Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala 665 670 675 CAC CGC CTC TCC CAG GAG CTA GCC ATC CCT TAC GAG GAG GCC CAG 2070 His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Gln 680 685 690 GCC TTC ATT GAG CGC TAC TTT CAG AGC TTC CCC AAG GTG CGG GCC 2115 Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala 695 700 705 TGG ATT GAG AAG ACC CTG GAG GAG GGC AGG AGG CGG GGG TAC GTG 2160 Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 710 715 720 GAG ACC CTC TTC GGC CGC CGC CGC TAC GTG CCA GAC CTA GAG GCC 2205 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala 725 730 735 CGG GTG AAG AGC GTG CGG GAG GCG GCC GAG CGC ATG GCC TTC AAC 2250 Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn 740 745 750 ATG CCC GTC CAG GGC ACC GCC GCC GAC CTC ATG AAG CTG GCT ATG 2295 Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met 755 760 765 GTG AAG CTC TTC CCC AGG CTG GAG GAA ATG GGG GCC AGG ATG CTC 2340 Val Lys Leu Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu 770 775 780 CTT CAG GTC CAC GAC GAG CTG GTC CTC GAG GCC CCA AAA GAG AGG 2385 Leu Gln Val His Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg 785 790 795 GCG GAG GCC GTG GCC CGG CTG GCC AAG GAG GTC ATG GAG GGG GTG 2430 Ala Glu Ala Val Ala Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val 800 805 810 TAT CCC CTG GCC GTG CCC CTG GAG GTG GAG GTG GGG ATA GGG GAG 2475 Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu 815 820 825 GAC TGG CTC TCC GCC AAG GAG TGA 2499 Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu End 830 配列番号：２ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ATG CGT GGT ATG CTG CCT CTG TTT GAG CCG AAG 33 Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys 5 10 配列番号：３ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ATG CGT GGG ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG 33 Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys 5 10 配列番号：４ 配列の長さ：５７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG CGT GGT ATG CTG CCC CTC 45 Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Arg Gly Met Leu Pro Leu 5 10 15 TTT GAG CCC AAG 57 Phe Glu Pro Lys 配列番号：５ 配列の長さ：５７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG AGG GGG ATG CTG CCC CTC 45 Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Arg Gly Met Leu Pro Leu 5 10 15 TTT GAG CCC AAG 57 Phe Glu Pro Lys 配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GAATTCATGA GGGGGATGCT 20 配列番号：７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GGTGGAATTC ACTCCTTGGC GGA 23 配列番号：８ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG 24 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 5 配列番号：９ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列番号：１０ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GTGGTCTTTG ACGCCAAG 18 配列番号：１１ 配列の長さ：５９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 AGGGGCAGCA TACCACGCTT GTCATCGTCG TCCTTGTAGT CCATAATTCT 50 GTTTCCTGT 59 配列番号：１２ 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 AGGGGCAGCA TCCCCCTCTT GTCATCGTCG TCCTTGTAGT CCATGAATTC 50 TGTTTCCTGT 60 配列番号：１３ 配列の長さ：４８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GCCCTTCGGC TCAAACAGTG GCAGCATACC ACGCATAATT CTGTTTCC 48 配列番号：１４ 配列の長さ：５３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CGGCCCTTGG GCTCAAAGAG GGGCAGCATC CCACGCATGA ATTCCTGTTT 50 CCT 53

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、大腸菌宿主を形質転換するのに使用さ
れるベクターpSCW562 の関連遺伝成分を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/72 //(Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ａ）配列番号２、配列番号３および配列
   番号４から成る群から選択された変更ヌクレオチド配列
   と置換することにより、または Ｂ）生来の成熟タンパク質の開始コドン（ＡＴＧ）と生
   来の成熟タンパク質の２番目のアミノ酸のコドン（ＡＧ
   Ｇ）との間に、配列番号８の配列を挿入することによ
   り、成熟の生来のタンパク質中の最初の10アミノ酸をコ
   ードする生来の遺伝子中の最初の30ヌクレオチド塩基の
   配列が変更されている、Taq ポリメラーゼ遺伝子。
2. 【請求項２】 成熟タンパク質中の最初のアミノ酸配列
   として配列番号９の配列を有する、熱安定性サーマス・
   アクアチクス（Thermus aquaticus）ＤＮＡポリメラー
   ゼ。
3. 【請求項３】 Taq ポリメラーゼの生産を増加させる方
   法であって、次の段階： Ａ）i)配列番号２、配列番号３および配列番号４から成
   る群から選択された変更ヌクレオチド配列と置換するこ
   とにより、または ii）生来の成熟タンパク質の開始コドン（ＡＴＧ）と生
   来の成熟タンパク質の２番目のアミノ酸のコドン（ＡＧ
   Ｇ）との間に、配列番号８の配列を挿入することによ
   り、生来の成熟タンパク質中の最初の10アミノ酸をコー
   ドする生来の遺伝子中の最初の30ヌクレオチド塩基の配
   列が変更されているTaq ポリメラーゼ遺伝子を有するベ
   クターを提供し； Ｂ）Ａ）のベクターを用いて適合性大腸菌（E. coli）
   宿主をトランスフェクトせしめ、それにより形質転換さ
   れた大腸菌宿主細胞を得；そして Ｃ）Ｂ）の形質転換細胞を増殖条件下で培養し、それに
   よって形質転換宿主細胞により合成されるTaq ポリメラ
   ーゼを生産させる、を含んで成る方法。
4. 【請求項４】 Ａ）配列番号２、配列番号３および配列
   番号４から成る群から選択された変更ヌクレオチド配列
   と置換することにより、または Ｂ）生来の成熟タンパク質の開始コドン（ＡＴＧ）と生
   来の成熟タンパク質の２番目のアミノ酸のコドン（ＡＧ
   Ｇ）との間に、配列番号８の配列を挿入することによ
   り、生来の成熟Taq ポリメラーゼ中の最初の10アミノ酸
   をコードする生来の遺伝子中の最初の30ヌクレオチド塩
   基の配列が変更されているTaq ポリメラーゼをコードす
   る遺伝子を有するベクターであって、 i) 選択可能マーカー、 ii) 適当なプロモーター、および iii) 遺伝子発現を調節するための適切な調節配列 を有するベクター。