CS324291A3 - Increase in production of thermus aquaticus dna polymerase in escherichia coli - Google Patents

Description

moc i ?/ ý/ý/r

E.coli

Oblast vynálezu

Tento vynález se týká oblasti genetického inženýr-ství. Přes_něji se tento vynález týká úpravy přirozenéhogenu k poskytnutí mutantní formy využitelné k expresiv Ejcoli.

Dosavadní stav techniky

Jedním z velkého množství úspěchů v rekombinantnítechnologii je "high level" exprese /nadprodukce/ cizíchproteinů v prokaryotických buňkách jako je Escherichiacoli /E.coli/. Nedávno byla tato technologie využita k do-sažení medicínsky a vědecky důležitých proteinů, z nichžněkolik je vždy užitečných pro klinickou terapii a vědeckévýzkumy. Ngdprodukce proteinu v prokaryotických buňkáchje demonstrována přímým měřením aktivity enzymu s vhodnýmsubstrátem mebo měřením fyzického množství produkované-ho specifického proteinu. Vysoká hladina produkce protei-nu může být dosažena zlepšením exprese genu kódujícího pro-tein. Důležitým aspektem exprese genu je účinnost v trans-laci nukleotidové sekvence kódující protein. Velmi zají-mavé na zlepšení produkce bakteriálních enzymů je to, žejsou užitečné jako reagens v biochemii nukleových kyselin samy osobě, například DNA ligáza, DNA polymeráza a tak dále.

Bohužel tato technologie většinou neposkytuje velký protei- nový výtěžek a je proto nepoužitelná pro translaci nukleo- tidových sekvencí kódujících cizí protein. Zvětšení pro- teinových výtěžků závisí, inter alia, na zajištění účinné translace. -2-

Rozsáhlými studiemi v několika laboratořích bylo n.ynízjištěno, že nukleotidová sekvence na N-konci kódujícíoblasti genu je jeden z faktorů silně ovlivňujících pů-sobivost translace. Je také zjištěno, že změna kodonu vzačátku genu může ořekonat slsbou translaci. Jedním postu-pem je tedy přepracování první Části kódující sekvencepoužitím známé degenerace genetického kódu ke změně vý-běru kodonu.

Nicméně tyto studie nepředpověděly, nestanovily nebonedaly návod, které báze jsou důležité nebo které sekven-ce by měly být změněny pro jednotlivý protein. Proto musívýzkumník přijmout nezbytné empirické přiblížení, pokud sepokouší optimalizovat produkci proteinu využitím těchtorekombinantních technik.

Empirické přiblížení je pracné. Obecně, varieta syn-tetických oligonukleotidů, zahrnující všechny potenciálníkodony pro úpravu aminokyselinové sekvence je substituová-na do N-konoc kódující oblasti, ^ohou být využity různémetody k selekci nebo screeningu pro jeden nukleotid, kte-rý dévé,· vyšší expresní hladiny. Jiné přiblížení je získatsérii derivátů náhodnou mutagenezí původní sekvence. Roz-sáhlé screeningové metody snad získají klon s vysokou hladinou exprese. Tento kandidát je pak analyzován ke zjiště-ní "optimální" sekvence a sekvence je užita k nahrazeníkorespondujících fragmentů v původním genu. Toto shot-gunpřiblížení je primitivní.

Ayto zdlouhavé postupy jsou upotřebeny ke zvýšenísyntézy požadovaného proteinu, který je produkován nezměněným /přirozeným/ genem pouze v malých množstvích. Termo-stabilní DN A-polymeráza z Thermus Anuaticus /Tsq Pol/ jetakovým produktem. -3-

Tac ?ol katalyzuje kombinace, nukleotidových trifos-fátů k formování řetězce nukleové kyseliny komplementární-ho k templátovému řetězci nukleové kyseliny, Aplikace ter-mostabilní Tao Pol k amnlifikaci nukleové kyseliny polyme-rázovou řetězovou reakcí /PCR/ byla klíčovým krokem vevývoji k jeho novému dominantnímu postavení v molekulárníbiologii. Gen kódující Tací Pol bvl klonován, sekvenován aexprimován E.coli, poskytlo oouze skromné množství Tac Pol.

Problém je ten, že ačkoliv Tao Pol je dosažitelná ob-chodně z několika zdrojů je drahá, částečně proto, žev současné době je užitím těchto metod' dosažitelné malémnožství. Zvýšení produkce Tao Pol je jasně žádoucí kesplnění zvýšených požadavků a k vytvoření ekonomičtějšíprodukce.

Gbr.1 - pouze ilustrace - ukazuje relevantní genetickékomponenty vektoru pSCW562, použitého ke transformaci E.coli hostitele. Předkládaný vynález poskytuje gen pro Tao polymerá-zu, kde sekvence prvních třiceti nukleotidových bází vpřirozeném genu, které kódují nrvních deset aminokyselin vezralém přirozeném proteinu, bylo změněno: a/ substituováním, aby modifikovaná nukleotidová sek-vence byla vybrána ze skuniny, zahrnující ’· SEQ ID NO:2:

ATG CGT GGT ATG CTG CCT CTG TTT G/G CCG AAG SEQ ID NO: 3·. ATG CGT GGG ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG a SEQ ID NO 4: -4-

ATG G/C TX AAG GX GX GAT GX AAG CGT GGT ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG, hebo b/ inzercí mezi kodony /ATG/ pro první aminokyselinu hoto-vého přirozeného proteinu a kodon /AGG/ pro druhou ami-nokyselinu maturovaného přirozeného proteinu, sekvence: SEQ ID NO:5: GX TX AAG GX GX GAT GX AAG.

Vynález také poskytuje metodu pro zvýšení produkceTaq Pol použitím výše změněných genů.

Vynález poskytuje zvýšení úrovně aktivity polymerázy200násobně. Pekombinantní polymeráza podle vynálezu jefunkčně nerozlišitelná od přirozené Tací Pol.

Podstata vynálezu Předmětem předkládaného vynálezu je zvýšení produkce^ao polymerázy v E.coli změněním vybraných nukleotidovýchsekvencí v 5* oblasti genu, kódujícího N-konec polymerázy.

Vynález poskytuje čtyři nukleotidové sekvence, kterése liší od přirozeného Thermus apuaticus polymerázového /Taqpol/ genu v jednom až několika nukleotidech. Když se zave-dou do přirozeného genu a transfektují do E.coli, poskytu-jí tyto DNA sekvence zlepšenou expresi genu, prokázanouzvýšením aktivity enzymu. Velikost zvýšení je široce zá-vislá na provedených nukleotidových změnách a také na ji-ných faktorech jako je in< ukce IPTG, inkubační doba E.co-li a tak podobně. -5-

Geny poskytnuté předloženým, vynálezem jsou shodnés přirozeným Τεα Pol genem s výjimkou změn v přirozené sek-venci provedených v souladu s předkládaným vynálezem, ídejsou tyto změny provedeny, tam jsou specificky popsány a uká-zány na příkladech a v seznamu sekvencí. Změnv jsou pouzev oblasti kódující N-konec proteinu. Přesněji, změny jsouprovedeny pouze v oblasti do jedenáctého kodonu /AAG/ kódu-jícího jedenáctou aminokyselinu /lysin/ zralého přirozenéhoproteinu. vedenáctý kodon je nezměněn, ale je uváděn vseznamu sekvencí jmko závorka nebo jako bod, od kteréhojsou prováděny změny v provedení vynálezu. S výjimkoutěchto určených změn zůstávají následující sekvence TsqPol genu nezměněny.

Termín "Τεα Pol gen" jak je zde použitý znamená nukleo-tidovou sekvenci kódující termostabilní DNA polymerázu Ther-mus aouaticus a obsahuje mutantní formy, spontánní neboindukované, přirozeného genu tak dlouhé, dokud mutace ne-podminuje změny v základní aktivitě přirozené polymerázy. Výraz "Tao Pol" jak je zde použitý znamená polyme-rázu kočovanou Tao Pol genem. Výraz "nativní" jak je zde použit znamená nezměněnounukleotidovou sekvenci Tsq Pol genu nebo nezměněnou amino-kyselinovou sekvenci jako genu nebo enzymu vyskytujícího se přirozeně v T.aouaticus. Viz SEQ ID NO:1.(SEQ ID NO = sekvid.č.). A/ poskytnutí vektoru s Tao Pol genem podle vyná-lezu, 3/ transfekci kompatibilní E.coli hostitelské buňkyvektorem A/, aby se získaly transformované E.colihostitelské buňky a -6- C/ kultivaci transformovaných buněk 3/ za podmínekpro růst, aby se produkovala Tao polymeráza synte-tizované transformovanými hostitelskými buňkami. Následující bakteriální kmeny, plasmidy, fágy a reagensbyly použity ve způsobech podle vynálezu.

Bakteriální kmeny

Pro izolaci nativní LNA bvl použit Thermus acuaticus YT-I,ATCC No.25104 Hostitelský kmen E.coli pro všechny klono-vací a plssmidové manipulace, DH5 c< /F“ G80dlacZ AM1 5Δ/lacZYAargF/UI69 recAl endA1 hsdR17/r^”, an/"/ supE44 thilgyrA rel A1 / byl získán od BRL.

Pro pokusy exprese proteinů byl také použit kmenJM103 /thi”, strA, supE, endA, sbcB, hsdR“, D/lac-pro/, F traD36, proAB, lacl°, lacZMD15/ /lanisch-Perron a kol.,Improved Ml 3 Phage Oloning Vecto.ts and Host Strains: Nuc-leotide Seauences of Íď13mp18 and pUC19 Vectors, Gene33:103-119/1985/.

Hostitelským kmenem pro přípravu jednořetězcové LNA proužití v mutegenezi byl CJ236 /pCJ105, dut ung thi rel A//Yunkel a spol., Rapid and Efficient Site-specific ^uta-genesis without Phenotypic Selection, ^ethods Enzymol154:367-382, /1987//. fl fág R408 /Russel a spol., An Improved FilementousHelper Phage for Generating Single-stranded DNA, Gene45:333-338 /198$// byl použit jako pomocný /helper/ přigenerování jednořetězcového plasmidu pro mutagenezi. Plas-midem použitým pro veškeré klonovací a expresní práce bylpSCW562 nebo jeho derivát pTeql. Disgram pSCW562 je zná- -7- zorněn na obrázku 1. Když je nativní ^aq Pol gen zapojendo pSC’,V562 je výsledný plasmid označen pTaql, Jestližeje nativní Taq Pol gen změněn mutagenezí, je mutantníplasmid označen pTaq3, plao4, pTaoo neb© p^eqó podle nukleo-tidové sekvence, kterou je mutagenizován. Λβagens

Chemikálie byly zakoupeny od Sigma, International 3io- technologies, lne. nebo ^sstman Kodak. L3 medium bylo získáno od Gibco. Snzymy byly získány od New Englaud Biolabs

131, 3RL, 3oehringer-^ennheim nebo U.S.Biochemie ais aTM byly užívány podle návodu výrobce. Sequenase kity prosekvenování DNA byly získány od U.3,Biochemie ais. Radio-izotomy byly od firmy Anersham. Teq polymeráza byla zakou-pena od Cetus. Příklady provedení vynálezu

Metoda zvýšení produkce Taq Pol

Stupen A - Poskytnutí vektoru s Tac Pol genem podle vyná-lezu vednou z metod' poskytujících vektor s Tcc Pol genempodle vynálezu je: - poskytnutí nativní DNA z Thermus equatieus, - amplifikace nativní Tací Pol DNA a inkoroorace restrikč-míst v obou koncích DNA fragmentů, - ligace DNA fragmentů ii/ do vhodného vektoru, - využití místně řízené mutageneze ke změně nukleotidovésekvence nativní DNA a - sereening na vektory, nesoucí změněnou nukleotidovousekvenci podle vynálezu. -8- i. Poskytnutí nativního genu ze T.aouaticus Všechny DNA manipulace byly provedeny užitím standard-ních protokolů /maniatis a spol., ^olecular Cloning: A Dabo-rs ory "*anual, Cold Spring Harbor Laboratory, Celo SpringHarbor, New York, 1982 a Ausebel a spol., Current Proto-cols in i.ioleculsr 3iology, John Wiley and Sons, New York,

New York, 1987/. Všechna DNA z T.aquaticus /kmen YT-1, ATCCč. 25104/ byls izolována ze 40 ml kultury organismu rostou-cí pres noc při 70 C v ATCC mediu č. 461. 3unkv byly pe-letovány centrifugscí, promývány jednou 10 mli tris HC1, pH8,0, 1 miC kyseliny ethylendiamintetraoctové /EDTA/, 10πώΐ Tris HC1 /pH 8,0/ /TE/ a resuspendovány v 5 ml TE. Bylpřidán lysozym do koncentrace 1 mg/ml a roztok byl inkubo-ván při 37 °C 30 minut, Byl přifián EDTA, dodec.ylsulf átsodný /SDS/ a proteinkináza do koncentrace 50 mM, 0,5 ?óa 100 /Ug/ml celkem a roztok se inkubuje 4 hodiny při 50 °C.Vzorek se extrahuje třikrát pomocí srrěsi fenol-chloroforma jednou chloroformem a DNA se vysráží přidáním octanu sod-ného do koncentrace 0,3 M a dvou objemů ethanolu. DNAbyla spojena, promyta v 70% ethanolu a roznuštěna y /TE/. ii. Amplifikace nativního Tep Pol genu a inkorporace restrikčnich míst.

Nejrychlejší postup pro produkci většího množství ^aqPol genu je využití publikované sekvence nukleové kyseli-ny genu /Lawyer a spol., -^solation, Characterizotion andExpression in Escherichia coli of the DNA Polymerase fromThermus aouaticus, Journal of 3iological O-hemistry, 264:6427-6437, 1989/ k sestavení oligonukleotidových primerů,které mohou být použity v PCR k amplifikaci genomické DNA.

Viz SEQ IDNO:1: pro celou genovou sekvenci. PCR je amplifikační technikou dobře známou v oboru /Saiki a spol., Primer-directed Enzymatic Amplification -9- of DNAwith ε xhermostable DNA Polymer as e, Science 239:487-491 /1988/, která zahrnuje řetězovou reakci, produku-jícíjící velká množství soecifické známé nukleotidovésekvence. PCR vyžaduje, aby sekvence nukleové kyseliny,která má být amplifikována, byla známá dostatečně detail-ně, aby mohly být připraveny oligonukleotidové primery,které by byly dostatečně komplementární k požadované sek-venci nukleové kyseliny, aby jimi byla hvbridizována abvly syntetizovány další produkty. ^rimery jsou oligonukleotid.y, přirozené nebo synte-tické, které jsou schopné hrát roli iniciačního bodu proDNA syntézu, je-li umístěn do podmínek, ve kterých jeindukována syntéza na přiměř navazujícího produktu, kterýje komplementární k řetězci nukleové kyseliny, to je zapřítomnosti čtyř rozdílných nukleotidových trifosfátůa termostabilních enzymů ve vhodném pufru a při vhodné tep-lotě. PCR amplifikace byla provedena na Tap Pol DNA i/ v pod-statě jak popisuje Saiki a spol.v termocyklovači Rricomp.Primery bylv označeny podle publikované sekvence Taq Polgenu /Lawyer a spol./.

Amplifikační směs obsahovala přibližně 100 /Ug DNAT.aouaticus, 1 yuM každého ze svou primerů, 200 ^uM dATP, dGTP,dCTP, dTTP a 2 jednotky Tao Pol v objemu 0,05 ml. Směs bylazahřáta na 94 °C na 10 sekund, ochlazena na 40 °C na 30sekund a prodlužována při 72 °C 5 minut po 5 cyklů. Pronásledujících 20 cyklů byla chladící teplota zvýšena na 55 °Cextenzní doba snížena na 3 minuty. A’akonec byla směs in-kubována při 72 °C po 15 minut, abv se maximalizovalo množ-ství plně dvouřetězcového produktu. Celá PCR reakční směsbyla frakcionována na 1% agarozovém gelu a 2,5 kb gen Tac -1 0- polymerázy byl oddělen a extrahován. DNA fr?gmenty bylyizolovány z agarozového gelu použitím "freeze-scueese"techniky, -“garorozové plátky byly rozdrobeny, zmraženy vsuchém ledu s rychle roznuštěn.y při 37 °C do dobu 5 minut.suspenze1 byle odstředěna přes membránu .willipore 0,45 mmDurapore a tak zfiltrována. Filtrát byl extrahován jednouvodou nasycenou fenolem, jednou směsí fenol-chloroform/1:1/ a jednou chloroformem. DNA byla získána ethanolovýmsrážením.

Inkorporace restrikčních míst: Aby bylo dovoleno oddě-lení s získání ^ap Pol genu během PCR a také aby byloumožněno klonování Taq Pol genu do expresního vektoru,byla zavedena dvě restrikční místa na 5 'konec obou řetěz-ců genu. Přesněji, jedno restrikční místo bylo zavedenoblízko a po směru řetězce od start / ATG/ kodonu a jinérestrikční místo bylo zavedeno blízko a proti směru od stop/TGA/ kodonu /seq IDNO :6 a 7/. Nukleotidy, tvořící restrikční místa byly obsaženy na syntetických primerech použitýchv PCR. V příkladech zde uvedených byla nukleotidová sek-vence GAATTC, tvořící FcoR1 restrikční místo, obsažena vprimerech.

Jiná restrikční místa mohou být použita v provedenítohoto vynálezu s tou podmínkou, že 1/ expresní vektorměl odpovídající místa, kde má být Tao DNAligována, 2/ restrikční místa se nevyskytovala uvnitř Taq Pol genu.

Jak ukazuje obrázek 1, EcoR1 je jedno z několika re-strikčních míst v pSCW562. Jiná příkladná restrikční místajsou Xbal a SphI. Jistě, expresní vektory, mající jinárestrikční místa, mohou poskytovat mnohem více potenciál-ních restrikčních míst, která mohou být užitečná při pro-vedení vynálezu. -1 1-

Jsou-li tráveny vhodným enzymem, vytvářejí tato restrikč-ní místa lenivé konce, které mohou být konvenčně ligovánvns odpovídajícím způsobem trávená restrikční místa naexpresním vektoru. Restrikční místa nenostihují aminokyse-linovou sekvenci T?q Pol.

Alternativní metoda: Místo výše ponsané PCR techniky,může být nativní Taq Pol gen alternativně poskytnut kon-venčním klonováním genu. V tomto případě mohou být restrikč-ní místa zavedena místně řízenou mutagenezí. konečný výsle-dek obou procedur se neliší. iii. Ligace DNA fragmentů do vektoru DNA ze stupně ii/ je pak ligována do vhodného expres-ního vektoru. Vektorem vybraným pro klonování byl pSCW562,který obsahuje EcoRI místo 11 párů bází proti směru řetězceod ribozového vázajícího místa a silný tac /trp-lac hybrid/promotor· /br.1/. Taq Pol gen neobsahuje žádné EcoRI místo,takže PCR primery byly označeny EcoR1 místy poblž jejich5 konců /stupen ii//, dovolujícími přímé klonování do EcoRImísta pSCW562.

Kromě EcoRI místa obsahuje vektor pSC'»"562 1/ fágovýzdroj replikace /F, 2/ plasmidový zdroj replikace-/ORI/, 3/ markér antibiotikové rezistence /AMP/ a 4/ konečnousekvenci transkripce dolů po řetězci od restrikčních míst.Tento plasmid byl konstruován použitím technik dobře zná-mých v oboru rekombinantní DNA jak popisuje ^aniatis a spol.,Moleculer Cloning: A Laboratory Menual, Cold Sprin Harbor,

New York /1982/. Nicméně tento důležitý plasmid není rozho-dující pro vynález,. Jakýkoliv vektor, obsahující vhodnýpromotor a restrikční místa by bvl v této metodě vhodný.

EcoRI trávený PCR produkt ze stupně ii/ byl frakciono- ván na 1/i agarozovém gelu a eluován. Vektor pSCV/562, bvl -12- tráven přes noc ScoHI /10 jednotek //\xz/ nodroben působe- ni telecí intestinální alkalické fosfstázy /1 jednotka/1/ug/, extrahován směsí fenol/chloroform, srážen ethano-lem ε resuspendován v TE. Přibližně 200 ng připravenéhovektoru bylo smícháno s 500 ng čištěného PCR produktu aligováno po 18 hodin v 50 mM TrisHCl, pH 7,8, 10 mil MgCl2, 20 mM dithithreitolu, 1 mM ATP, s 0,5 Weissovými jednot-kami T4 DNA Ligázy v objemu 20 /ul. iv. Použití místně řízené mutageneze ke změně nukleotido-vé eekvence nativního Taq Pol genu. .'listně řízená mutageneze je metodou změny nukleo-tidové sekvence DNA fragmentů specifickou substitucí, inzer-cí nebo delecí vybraných nukleotidů uvnitř sekvence, ježmá být změněna. Metoda zahrnuje primování DNA syntézy invitro chemickými syntetizovanými nukleotidy, které nesounevhodně spojené nukleotidy s templátovou sekvencí. Syn-tetický oligonukleotid primuje DNA syntézu a je sám inkor-porován do výsledné heterodujhlexní molekuly. Po transfor-maci hostitelských buněk dává tento heteroduplex vznikhomoduplexu, jehož sekvence nesou mutagenní nukleotidy. Mu-tantní kmeny jsou vybrány screeningovými procedurami v obo-ru dobře známými, jako je hybridizace nukleových kyselin značenými probami a DNA sekvenování.

Použitím místně řízené mutageneze se zkonstruujímutantní geny pro Taq polymerázu, kde byla změněna sekven-ce prvních třiceti nukleotidových bází v nativním genu, kte-ré kódují prvních deset aminokyselin ve zralém nativnímproteinuj a/ substitucí, aby modifikovaná nukleotidová sekvence byla vybrána ze skupiny, zahrnující: -13- Příklad 1 - 5 EQ ID NO: 2: ATG CGT GGT ATG CTG CCT CTG TTT GAG CCG AAG > 33 Příklad 2 - SEQ ID N0:3: ATG CGT GGG ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG a 33 Příklad 3 - SEQ ID NO:4: ATG GJC T/C AAG GJC GJC GAT GfC AAG CGT GGT ATG 36 CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG 57 nebo příklad 4 B/ inzerci mezi start kodon /ATG/ pro první aminokyselinuzralého nativního proteinu a kodon /AGG/ pro druhouaminokyselinu zralého nativního proteinu, sekvence- SEQ ID NO: 13: GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG. 24 V nříkladech výše uvedených jsou báze, které jsouzměněny, zdůrazněny tučným typem písma. Efekt, že tytozměny nesou polymerázovou aktivitu je ukázán v tabulce I.Výše zmíněné příkla y jsou míněnv pouze jako ilustrativnía v žádném případě nejsou zamýšleny jako omezení vynálezu. V těchto příkladech byly všechny genové modifikaceprovedeny místně řízenou mutagenezí. Nicméně alternativ-ní metody jsou známé v oboru a mohou poskytnout stejnévýsledky. Například, změny v Taq Pol genu popsané výše mohoubýt zavedeny přímo do genu během amplifikace /PCR/ vhod-ným sestrojením oligonukleotidového nrimeru /po řetězci/obsahujícího nukleotidovou sekvenci podle vynálezu. -14- vinou alternativou může být inkorporace jednohorestrikčního místa, spojujícího prvních deset kodonů genu.Toto dovoluje odstranění sekvence kódující aminokonecštěpením restrikční endonukleázou a nahrazení použitímdvouřetězcového syntetického fragmentu. Jakákoliv z těchtometod může být užita k dosažení nukleotidových změn výšeuvedených. kístně řízená mutegeneze byle provedena podle- Kun-kela a spol. Rapid and Efficient Site specific iíutagenesisWithout Phenotypic Selection, ^ethods Enzymol, 154:367-382 /1987/ za použití kitu získaného od Bio -Rad. Jednořetězcová DNA byla připravena infikováním rané exoonenciálnífáze- kultur CJ236 /nesoucí pTaql/ S408 v opakováním in-fekce asi 10 - 20. Po kultivaci pres noc při 37 °C bylybuňky odstraněny centrifugací a fág srážen přidáním poly-ethylenglykolu /5%/ a NaCl /0,5M/· Fág byl peletováncentrifugací a DNA byla izolována fenol-chloroformovouextrakcí a ethanolovým srážením. Mutagenní oligonukleotidybyly fosforylovány T4 polynukleotidovou kinázou a 9 pmolbylo anelováno na asi 3 pmol jednořetězcové olesmidové DNA.Anelační směs byla prodlužována T4 DNA polymerázoz, li-gována a transformována do DH5 nebo JM103· PlasmidováDNA byla izolována z transformantů prudkým varem /Hol-mes a Quigley, A Rapid Boiling iviethod for the Preparationof Bacterial Plesmids, Anal.Biochem, 114:193-199, 1981/ atrávena EcoR1 kvůli identifikaci klonů, které mají prodě-lanou mutaci. v. Screening vektorů s Tag Pol genem X ověření, že klony i v/ nesly požadovaný ^eq Pol gen byly klony zachyceny na nitrocelulozových filtrecha a iden- tifikovány jako Taq Pol transformanty hybridizací kolonie. -15-

Hybridizace kolonie: '^ato technika identifikuje sneci-fické sekvence nukleové kvseliny vytvářením podmínek, abyjeden řetězec specifické sekvence nukleové kyseliny bylzákladem pro párování /hybridizací/ s komplementárnímiradioaktivními jednořetězcovými fragmenty /probami/ nukleo-vé kyseliny. Dvouřetězcové oblasti se vytvoří tam, kdetyto dva typy DNA měly komplementární nukleotidové sek-vence a jsou detegovány svoji radioaktivitou.

Kolonie obsahující Taa Pol fragment byly identifiko-vány hybridizací s vnitřním oligonukleotidem: SEQ ID NO: 15*. GTGGTCTTTG ACGCCAAG, značeným ^2p na 5*konci s T4 polynukleotidovou kinázou.Hybridizace kolonií byla provedena jak je popsáno ω-ania-tisem a spol, supra, v 5X SSPE /1XSSPE v 10 mM fosfátusodného, pH 7,0, 0,18 M NaCl, 1 mM EDTA/, 0,1% lauroylsar-kosinu sodném, 0,02?ó SDS, 0,5 % blokačního činidla /Boeh-ringer-wiannheim/, obsahujícím přibližně 5 ng ne ml Pznačeného oligonukleotidu. Hybridizace se prováděla při42 °C 4-18 hodin. Filtry byly promyty ve 2X SSPE, 0,1?6SDS při teplotě místnosti třikrát, potom promyty ve stej-ném roztoku při 42 °C. Pozitivní kolonie byly identifi-kovány autoradiograficky.

Sekvenční analýza: Pro zjištění, zda byla nebo nebylaTaa Pol DNA inkorporována ve správné orientaci byla pro-vedena DNA sekvenční analýza na alkalicky denaturované superstočené DNA jek popisuje Zhang a spol., Double Stranded DNA

seauencing as a Choice for DNA Seouencing, Nucleic AcidsTM

Research 16:1220 /1988/ za použití Seouenase kitu od -1 δ- ι— U.S.Biochemicals a /“^S/d 4TP. ^bvykle, 1,0 ^ul supersto-čené, CSCl-vázané DNA bylo denaturováno ve 20 ^ul 0211 NeOH,0,2 mil EDTA po 5 minut. Roztok byl neutralizován 2 yul211 octsnu amonného /pK 4,6/ a srážen 60 ml ethenolu. Směsbyla centrifugována po 10 minut, promyta 1-krát 80?6ethanolem, sušena 10 minut a resuspendováns v 7 ml vody. Popřidání 5 ng primeru a 2 ^ul 5X nufru bvly vzorkv zahřá-tý na 65 °C a byly ponechány zchladnout na teplotu pod37 °C během 30-45 minut. Sekvenační reakce pak byly pro-vedeny podle návodu. Aeakční směsi byly oodrobeny elektro-foréze na 6% sekvenačním gelu, příležitostně za využití gra-dientu soli octanu sodného ke zlepšení rozložení v blíz-kosti spodku gelu /Sheen a spol., Electrolyte Gradient Gelsfor DNA Seouencing, Bio íechnioues 6:942-944, 1989/. Alter-nativně, plasmidová DNA připravená rychlým varem neboalkalickými miniprep postupy byla použita pro sekvenovánípo extrakci fenol-chloroformem a ethanolovém sráženi, i kdyžs určitou sníženou spolehlivostí. v

Stupen B - Transfekce hostitelských buněk vektorem z A/

Vektor stupně 4/ je použit k transfekci vhodnéhohostitele a transformovaný hostitel je kultivován za nej-lepších podmínek pro růst. Prokaryotičtí hostitelé jsouobecně účinnější a vhodnější v technikách genetického in-ženýrství o jsou proto preferovány pro expresi Taa poly-merázy. Prokaryot.y jsou nejčastěji reprezentovány různýmikmeny E.coli jako jsou DH5a a JIH 03, což jsou kmemy užitédále v příkladech. Nicméně mohou být také použity jinémikrobiální kmeny, pokud je kmen vybraný jako hostitel kom-patibilní s plasmidovým vektorem, kterým je transformován.Kompatibilta hostitele a plesmidu/vektoru znamená, že hosti-tel důsledně replikuje plasmid/vektorovou DNA a dovolujevlastní funkci výše uvedených kontrolních elementů. V na- -17- šem systému, DH5 «Λ a JM103 jsou kompatibilní s pSCV/562. Pět ml ligační směsi ze stupně B bylo smícháno s 0,1/ul DH5 nebo UL11Q3 buněk připravených zpracováním s CaCl^jak popisuje Cohen a spol., Proč .National Academy ofScience, USA, 69:2110/1972/. ?o inkubaci v ledu po 15-30minut byla směs inkubována 90 sekund při 42 °C. Po tepelnémšoku byl přidán 1 ml L3 media a buňky byly inkubovány jed-nu hodinu při 37 °C.

Selekce transformantů: Po jednohodinové inkubacibyly podíly z inkubované směsi rozprostřeny na LB agaro-vé plotny obsahující: 50 /Ug/ml ampicilinu a inkubovány 18hodin 37 °C. V tomto mediu mohou růst pouze transformo-vané E.coli nesoucí ABdP /markér/ gen. X selekci transfor-mantů které také nesly Taq Pol gen ve správné orientacibyly provedeny hybridizace kolonií a sekvenční analýzapoužitím technik již popsaných dříve.

Stupeň C: Kultivace transformovaných hostitelů E.coli transformanty ověřené, že obsahují Tao Polgen ve správné orientaci, byly kultivovány ve 40 ml LBpůdy při 37 °C do střední log fáze a kde to bylo vhodné,byly indukovány 1 mM isopropyl- P-D-thi ogalaktosidázy v v /IPTG/. Bunkv bvly kultivovány bud další dvě hodiny nebo v pres noc a byly získány centrifugací. 3unky byly resuspendovány v 0,25 ml 50 mM tris HC1, pH 7,5, 1 mid EDTA, 0,5/Ug/ml leuoeptinu, 2,4 mM fenylmethylsulfonylfluoridu azpracovány ultrazvukem. Lyzát byl zředěn 0,25 ml 10 mMTrisHCl, pH 8,0, 50 mM XC1, 0,5 % Tweenu 20, 0,5 % NP-40a zahříván na 74 °C po 20 minut. Po ochlazení na ledubyly buněčné zbytky odstraněna odstředěním při 4 °C po20 minut. Podíly frakce supernatantu byly zkoušeny na DNApolymerázovou aktivitu za použití aktivované lososí sper- -18- matické DNA jako substrátu. DNA polymerázová zkouška: Tato zkouška je založenane schopnosti DNA polymeráz vyplňovat jednořetězcové me-zery vyrobené ve dvouřetězcové DNA. Je použito jecnořetěz-cové mezery jako templátu a volné 3 'hvdroxylové skupinyna hranici jednořetězcové mezery, jako primeru, ve kte-rém se za ne syntéza. Přesněji, 5 /ul enzymového přípravkubylo inkubováno 10 minut při 74 °C v celkem 50 /Ul směsiobsahující: 25 πώί tris/hydroxymethyl/methyl-3-amino-pro-pansulfonovou kyselinu /TAPS/ /pH 9,8 při 22 °C/, 50 mkíKC1, 1 mlví 2-merkaptoethanolu, 2 mivl LígClg, 0,30 mg/mlaktivované lososí spermatické DNA, po 0,2 mM dCTP, dGTP,dTTP a 0,1 mivl /200 nCi/nmol/ /8-^H/dáTP. Reakce byla ukon-čena přídavkem 100 /ul 0,15 M p.yrofosforečnanu sodného, 0,105 ? sodného EDTA, pH 8,0, s následujícím přídavkemledem chlazené 10% kyseliny trichloroctové /TCA/. Směsbyla udržována 15 sž 30 minut v ledu před započetím vakuo-vé filtrace' předem zvlhčenými 25 mm Thatman filtry ze skle-něných vláken /GFC/. ^ysrážený reakční produkt byl pro-mytím zbaven neinkorporovaného na filtru celkovým množ-stvím 12 ml ledově chladné 107 TCA a následujícími celkem12 ml ledově chladného 9% ethanolu. Filtrv byly vakuověsušeny, pak sušeny vzduchem a pak spočítány přímo v kapalině•Enzymové přípravky, které vyžadují ředění byly zředěny roz-tokem 10 mivl Tris, 50 mivl NC1, 10 m.ví tígCl^, 1,0 mg/ml žela-tiny, 0,5 % nonidetu P40, 0,5 % Tweenu 20, 1 mM 2-merkapto-ethenolu, pH 8,0. Jedna jednotka aktivity je množství enzy-mu potřebné k inkorporaci 10 nmol všeho nukleosidu za 30min při 74 °C; adenin tvoří přibližně 29,7 % všch bázílososí spermatické DNA.

Lososí spermatická DNA /Sigma type III,produkt č. D1 626/ byl rozpuštěn na 1,3 mg/ml v TM pufru /10 mM Tris, -19- 5 mil idgClg, pH 7,2/ a míchán pomalu 24 hodin při 4 °C.

Potom byl zředěn 2,5krát Til pufrem a upraven na 0,3 M vNaCl před extrakcí při teplotě místnosti stejným objememsměsi fenol/chloroform /1:1 obj/obj./ fenol nasycený TMpufrem/. Směs byla centrifugována při 2700 x g po 5 minutpři teplotě místnosti za účelem oddělení fází, vodná fázebyla oddělena a extrahována stejným objemem chloroformu.Směs byla odstředována jak je uvedeno výše a vodná fázeopět oddělena. Aktivovaná LNA ve vodné fázi byla vysráženadvěma objemy 95% ethanolu při -20 °C; vysrážená směsbyla udržována při -20 °C po 12-18 hodin. Vysrážená DNA by-la oddělena centrifugací při 13700 x g po 30 minut při 2 °CPeleta byla sušena proudem dusíku a pak znovu rozpuštěna na3-6 mg/ml s TE /10 mM Tris, 1 mM ELTA, pH 7,5/ za pomalého pohupování při teplotě místnosti. Roztok byl dialyzovánproti TE a pak upraven na vhodnou koncentraci kontrolouabsorbance při 260 nm. Podíly /0,5 - 1,0 ml/ byly ucho-vávány při -20 °C. Pro použití byla jedna lahvička rozta-vena a pak uchovávána při 4 °C než byla znovu zmizena. 5. Výsledky polymerázové studie Výsledky Taq Pol studie jsou uvedeny v tabulce I. Vek-tor pTaql nese Seq ID NO:1, která je nativní Taq Pol sek-vencí, zatímco další čtyři plasmidy nesou sekvence, kteréjsou změněny podle vynálezu, jak bylo dříve popsáno.

Tabulka I ukazuje, neočekávaně, že pTaq3 /SEQ ID N0:2/exprimuje Taq Pol aktivitu až 200 násobně vzhledem k pTaql;pTaq4 /SEQ ID NO:3/ má asi lOnásobnou aktivitu vzhledemk pTaol,’ pTaq5 /SEQ ID NO:4/ je asi 10 - 50 krát vyššínež pTAQ1, podle pokusu a pTaq6 /SEQ NO:5/ má nejméně 10krát větší aktivitu než pZAQ1 /SEQ ID NO:1/. Tyto výsledkyjsou neočekávané. -20- Xřátké nukleotidové sekvence v Seznamu sekvencípředstavují změny sekvencí v prvních 30 nukleotidech natiního genu. Tyto sekvence představují pouze melou část kompletního Tsc ?ol genu, který celý obsshujennsd 2000nukleotidů. 21 abulka I - Studie termostabilní DNA polymerázové aktivity kódující různé expresníplasmidy. Polymerázové aktivita je interpretována jako vztah expresegenu ' a produkce polymerázy. η ω τ) C Ό ω τι ω ω Ν το tp Η pj η3 Φ Η PJ ι-3 hr4 Η κ '3 a ο a řO a ο a ο a ο "'•Λ ο σ rJl II ο η Ο ο Φ a ct· σ> I-Η τη Μ 4- γΗ Ου r-i —* H Oj Η- p Ο © α ϋ Ο 1-0 ct· Φ ο a ω 3 Pp ζ; » ΤΙ Pj 1—1 C+ Ο Ο ο ο ο l·-’ Qj Μ a • · • · • » ·♦ • · a φ< ?< 071 -4 ου ΓΟ Μ Η ο 3 Φ Η· Ρ ?r φ Ο, J—J ηο 3 Ρ Ρ ·· Φ ο Ρ • · ο ΓΌ -4 4* 4- ΓΟ ο 00 X -4 ΤΟ -4 1 Ο ΡΡ II σο Ο Ο ο Ο \ 071 η Ρ< φ —» ω -Τ —» ΟΟ CT Ο ΓΟ Ρ •4 SJ 071 4* ΤΟ Ο ο ϋ Ο Ο ο + Ο X ο \ τη 55 + II Ν Γ0 <Ρ 3) σ\ —» -4 < ο Ο —* —» + ΡΤ —* Φ τ: CT 00 τη ο ο Οι ϋ ο ο ο ο Ου Φ Ρ Ηχ 4- ·_ 4^ ΓΟ <Ρ 1 CT οπ τη ΓΟ + Τ τ: —» —4 —* -~4 ΡΤ —» II ϋ Ο Ο Ο Ο C ου Ρ φ Ν a —» ΓΟ φ 4* τη —4 —» C-. ο- —* Ο -4 ο ο řj φ X ΟΟ 00 ΓΟ Ου + —» Ρ Ο Ο ο ο Ο sí ο ο Ου C. Ου —* ΓΟ =g 071 ΟΟ •4 σ\ 1 —J Si Ο ο Ο ο ΡΤ ο ο Ο ο ο ου Ο (Τ -Γ ΓΟ —* X Ο Ου 00 —» ΓΟ ϋ Ο CT —* 00 + ο ο ο ΡΤ Ο ou

Tabulka I /jednotky/mg proteinu/ -22-

Identifikace sekvence 1/ Obecné informace: i/ přihlašovatel: Sullivan ^ark -Alan ii/ název vynázu: Zvýšení produkce Thermus acuaticusDNA polymerázy v E.coli iii/ počet sekvencí: 14 iv/ Airesa oro koresoondenci: /A/ adresa: Eastman Kodak Company, patentové oddělení/3/ ulice: 343 State Street /C/ město: Rochester/D/ stát: New York/E/ země: USA/F/ zip: 14650-2201 v/ počítačová čtecí forma: A/ typ media: disketa, 3,5 palce, kapacita 800 KbB/ počítač: Apole Macintosh C/ operační systém: Macintosh 6,0D/ software: WriteNow ví/ údaje o přihlášce: A/ číslo přihlášky: 3/ datum podání: C/ třídění: vii/ data prioritní přihlášky: ne viii/ informace o právním zástupciA/ jméno: Wells, Doreen M. 3/ registrační číslo: 34278C/ referenční/docket číslo: 58374D-W1100 ix/ telekomunikační informace·: A/ telefon: /716/ 477-05543/ telefax: /716/ 477-4646 -23- 2/ Informace pro SFQ ID NO: : 1 : i/ charakteristiky sekvenceA/ délka: 24993/ typ: nukleová kyselinaC/ řetězec: dvojitýD/ topologie: lineární

ii/ typ molekuly: genomická DNA iii/ hypotetická: ne iv/ nesmyslný: ne vi/ originální zdroj: A/ organismus: Thermus aquaticus3/ izolát: YT1, ATCC 25104

vii/ přímý zdroj: amplifikována z genomické DNA ix/ Rysy: A/ jméno/základ: peptid3/ lokace: 1-2496 C/ metoda identifikace: porovnání se sekvencí vGen3ank, číslo JO4639. x/ publikované informace: A7 Autoři: Lawyer F.C., Stoffel S., Saiki R.N.,

Myambo K., Drummond R., Gelfand D.H. 3/ Název: Isoletion, characterization and expression in Escherichia coli of the DNA polymerasefrom Thermus acuatirus. C/ časopis: Journal of Biolcgical Chemistr.yD/ svazek: 264E/ ročník: 1 1F/ strany: 6427-6437G/ datum: 15.dubna 1989 gene -24-

Cxi) copis sekvence: SEQ IB NO:1: ATG AGG GGG ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG GGC CGG GTC CTC 45 Met 1 Arg Gly Met Leu 5 Pro Leu Phe Glu Pro 10 Lys Gly Arg Val Leu 15 CTG GTG GAC GGC CAC CAC CTG GCC TAC CGC ACC TTC CAC GCC CTG 90 Leu Val Asp Gly His 20 His Leu Ala Tyr Arg 25 Thr Phe His Ala Leu 30 AAG GGC CTC ACC ACC AGC CGG GGG GAG CCG GTG CAG GCG GTC TAC 135 Lys Gly Leu Thr Thr 35 Ser Arg Gly Glu Pro 40 Val Gin Ala Val Tyr 45 GGC TTC GCC AAG AGC CTC CTC AAG GCC CTC AAG GAG GAC GGG GAC 180 Gly Phe Ala Lys Ser 50 Leu Leu Lys Ala Leu 55 Lys Glu Asp Gly Asp 60 GCG GTG ATC GTG GTC TTT GAC GCC AAG GCC CCC TCC TTC CGC CAC 225 Ala Val Ile Val Val 65 Phe Asp Ala Lys Ala 70 Pro Ser Phe Arg His 75 GAG GCC TAC GGG GGG TAC AAG GCG GGC CGG GCC CCC ACG CCG GAG 270 Glu Ala Tyr Gly Gly 80 Tyr Lys Ala Gly Arg 85 Ala Pro Thr Pro Glu 90 GAC TTT CCC CGG CAA CTC GCC CTC ATC AAG GAG CTG GTG GAC CTC 315 Asp Phe Pro Arg Gin 95 Leu Ala Leu Ile Lys 100 Glu Leu Val Asp Leu 105 CTG GGG CTG GCG CGC CTC GAG GTC CCG GGC TAC GAG GCG GAC GAC 360 Leu Gly Leu Ala Arg 110 Leu Glu Val Pro Gly 115 Tyr Glu Ala Asp Asp 120 GTC CTG GCC AGC CTG GCC AAG AAG GCG GAA AAG GAG GGC TAC GAG 405 Val Leu Ala Ser Leu 125 Ala Lys Lys Ala Glu 130 Lys Glu Gly Tyr Glu 135 GTC CGC ATC CTC ACC GCC GAC AAA GAC CTT TAC CAG CTC CTT TCC 450 Val Arg Ile Leu Thr 140 Ala Asp Lys Asp Leu 145 Tyr Gin Leu Leu Ser 150 GAC CGC ATC CAC GTC CTC CAC CCC GAG GGG TAC CTC ATC ACC CCG 495 Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly Tyr Leu Ile Thr Pro 155 160 165 -25- GCC TGG CTT TGG GAA AAG TAC GGC CTG AGG CCC GAC CAG TGG GCC 540 Ala Trp Leu Trp Glu17.0 Lys Tyr Gly Leu Arg17 5 Pro Asp Gin Trp Ala 180 GAC TAC CGG GCC CTG ACC GGG GAC GAG TCC GAC AAC CTT CCC GGG 585 Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn Leu Pro Gly 185 190 195 GTC AAG GGC ATC GGG GAG AAG ACG GCG AGG AAG CTT CTG GAG GAG 630 Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu Glu Glu 200 205 210 TGG GGG AGC CTG GAA GCC CTC CTC AAG AAC CTG GAC CGG CTG AAG 675 Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu Lys 215 220 225 CCC GCC ATC CGG GAG AAG ATC CTG GCC CAC ATG GAC GAT CTG AAG 720 Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 230 235 240 CTC TCC TGG GAC CTG GCC AAG GTG CGC ACC GAC CTG CCC CTG GAG 765 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu 245 250 255 GTG GAC TTC GCC AAA AGG CGG GAG CCC GAC CGG GAG GGG CTT AGG 810 Val Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270 GCC TTT CTG GAG AGG CTT GAG TTT GGC AGC CTC CTC CAC GAG TTC 855 Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe 275 280 • 285 GGC CTT CTG GAA AGC CCC AAG GCC CTG GAG GAG GCC CCC TGG CCC 900 Gly Leu Leu Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro 290 295 300 CCG CCG GAA GGG GCC TTC GTG GGC TTT GTG CTT TCC CGC AAG GAG 945 Pro Pro Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu 305 310 315 CCC ATG TGG GCC GAT CTC CTC GCC CTG GCC GCC GCC AGG GGG GGC 990 Pro Met Trp Ala Asp Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly 320 325 330 CGG GTC CAC CGG GCC CCC GAG CCT TAT AAA GCC CTC AGG GAC CTG 1035 Arg Val His Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu 335 340 345 AAG GAG GCG CGG GGG CTT CTC GCC AAA GAC CTG AGC GTT CTG GCC 1080 Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala 350 355 360 -26- CTG AGG GAA GGC CTT GGC CTC CCG CCC GGC GAC GAC CCC ATG CTC 1125 Leu Arg Glu Gly Leu 365 Gly Leu Pro Pro Gly 370 Asp Asp Pro Met Leu 375 CTC GCC TAC CTC CTG GAC CCT TCC AAC ACC ACC CCC GAG GGG GTG 1170 Leu Ala Tyr Leu Leu 380 Asp Pro Ser Asn Thr 385 Thr Pro Glu Gly Val 390 GCC CGG CGC TAC GGC GGG GAG TGG ACG GAG GAG GCG GGG GAG CGG 1215 Ala Arg Arg Tyr Gly 395 Gly Glu Trp Thr Glu 400 Glu Ala Gly Glu Arg 405 GCC GCC CTT TCC GAG AGG CTC TTC GCC AAC CTG TGG GGG AGG CTT 1260 Ala Ala Leu Ser Glu 410 Arg Leu Phe Ala Asn 415 Leu Trp Gly Arg Leu 420 GAG GGG GAG GAG AGG CTC CTT TGG CTT TAC CGG GAG GTG GAG AGG 1305 Glu Gly Glu Glu Arg 425 Leu Leu Trp Leu Tyr 430 Arg Glu Val Glu Arg 435 CCC CTT TCC GCT GTC CTG GCC CAC ATG GAG GCC ACG GGG GTG CGC Í350 Pro Leu Ser Ala Val 440 Leu Ala HiS Met Glu 445 Ala Thr Gly Val Arg 450 CTG GAC GTG GCC TAT CTC AGG GCC TTG TCC CTG GAG GTG GCC GAG 1395 Leu Asp Val Ala Tyr 455 Leu Arg Ala Leu Ser 460 Leu Glu Val Ala Glu 465 GAG ATC GCC CGC CTC GAG GCC GAG GTC TTC CGC CTG GCC GGC CAC 1440 Glu Ile Ala Arg Leu 470 Glu Ala Glu Val Phe 475 Arg Leu Ala Gly His 480 CCC TTC AAC CTC AAC TCC CGG GAC CAG CTG GAA AGG GTC CTC TTT 1485 Pro Phe Asn Leu Asn 485 Ser Arg Asp Gin Leu 490 Glu Arg Val Leu Phe 495 GAC GAG CTA GGG CTT CCC GCC ATC GGC AAG ACG GAG AAG ACC GGC 1530 Asp Glu Leu Gly Leu 500 Pro Ala Ile Gly Lys 505 Thr Glu Lys Thr Gly 510 AAG CGC TCC ACC AGC GCC GCC GTC CTG GAG GCC CTC CGC GAG GCC 1575 Lys Arg Ser Thr Ser 515 Ala Ala Val Leu Glu 520 Ala Leu Arg Glu Ala 525 CAC CCC ATC GTG GAG AAG ATC CTG CAG TAC CGG GAG CTC ACC AAG 1620 His Pro Ile Val Glu 530 Lys Ile Leu Gin Tyr 535 Arg Glu Leu Thr Lys 540 CTG AAG AGC ACC TAC ATT GAC CCC TTG CCG GAC CTC ATC CAC CCC 1665 Leu Lys Ser Thr Tyr 545 Ile Asp Pro Leu Pro 550 Asp Leu Ile His Pro 555 -27- AGG ACG GGC CGC CTC CAC ACC CGC TTC AAC CAG ACG GCC ACG GCC 1710 Arg Thr Gly Arg Leu 560 His Thr Arg Phe Asn 565 Gin Thr Ala Thr Ala 570 ACG GGC AGG CTA AGT AGC TCC GAT CCC AAC CTC CAG AAC ATC CCC 1755 Thr Gly Arg Leu Ser 575 Ser Ser Asp Pro Asn 580 Leu Gin Asn Ile Pro 585 GTC CGC ACC CCG CTT GGG CAG AGG ATC CGC CGG GCC TTC ATC GCC 1800 Val Arg Thr Pro Leu 590 Gly Gin Arg Ile Arg 595 Arg Ala Phe Ile Ala 600 GAG GAG GGG TGG CTA TTG GTG GCC CTG GAC TAT AGC CAG ATA GAG 1845 Glu Glu Gly Trp Leu 605 Leu Val Ala Léu Asp 610 Tyr Ser Gin Ile Glu 615 CTC AGG GTG CTG GCC CAC CTC TCC GGC GAC GAG AAC CTG ATC CGG 1890 Leu Arg Val Leu Ala 620 His Leu Ser Gly Asp 625 Glu Asn Leu Ile Arg 630 GTC TTC CAG GAG GGG CGG GAC ATC CAC ACG GAG ACC GCC AGC TGG 1935 Val Phe Gin Glu Gly 635 Arg Asp Ile His Thr 640 Glu Thr Ala Ser Trp 645 ATG TTC GGC GTC CCC CGG GAG GCC GTG GAC CCC CTG ATG CGC CGG 1980 Met Phe Gly Val Pro 650 Arg Glu Ala Val Asp 655 Pro Leu Met Arg Arg 660 GCG GCC AAG ACC ATC AAC TTC GGG GTC CTC TAC GGC ATG TCG GCC 2025 Ala Ala Lys Thr Ile 665 Asn Phe Gly Val Leu 670 Tyr Gly Met Ser Ala 675 CAC CGC CTC TCC CAG GAG CTA GCC ATC CCT TAC GAG GAG GCC CAG 2070 His Arg Leu Ser Gin 680 Glu Leu Ala Ile Pro 685 Tyr Glu Glu Ala Gin 690 GCC TTC ATT GAG CGC TAC TTT CAG AGC TTC CCC AAG GTG CGG GCC 2115 Ala Phe Ile Glu Arg 695 Tyr Phe Gin Ser Phe 700 Pro Lys Val Arg Ala 705 TGG ATT GAG AAG ACC CTG GAG GAG GGC AGG AGG CGG GGG TAC GTG 2160 Trp Ile Glu Lys Thr 710 Leu Glu Glu Gly Arg 715 Arg Arg Gly Tyr Val 720 GAG ACC CTC TTC GGC CGC CGC CGC TAC GTG CCA GAC CTA GAG GCC 2205 Glu Thr Leu Phe Gly 725 Arg Arg Arg Tyr Val 730 Pro Asp Leu Glu Ala 735 CGG GTG AAG AGC GTG CGG GAG GCG GCC GAG CGC ATG GCC TTC AAC 2250 Arg Val Lys Ser Val 740 Arg Glu Ala Ala Glu 745 Arg Met Ala Phe Asn 750 -28- ATG Met CCC GTC CAG GGC ACC GCC GCC GAC CTC ATG AAG CTG GCT Ala ATG Met 765 Pro Val Gin Gly 755 Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu760 GTG AAG CTC TTC CCC AGG CTG GAG GAA ATG GGG GCC AGG ATG CTC Val Lys Leu Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu 770 775 780 CTT CAG GTC CAC GAC GAG CTG GTC CTC GAG GCC CCA AAA GAG AGG Leu Gin Val His Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg 785 790 795 GCG GAG GCC GTG GCC CGG CTG GCC AAG GAG GTC ATG GAG GGG GTG Ala Glu Ala Val Ala Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val 800 805 810 TAT CCC CTG GCC GTG CCC CTG GAG GTG GAG GTG GGG ATA GGG GAG Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu 815 820 825 GAC TGG CTC TCC GCC AAG GAG TGA Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu End 2295 2340 2385 2430 2475 2499 830 -29- /3/ Informace pro SEQ ID NO:2: /i/ Charakteristiky sekvence: /A/ délka: 33 /3/ typ: nukleová kyselina/C/ 5etězec: dvojitý/D/ topologie: lineární /xi/ popis sekvence: SEC ID N0:2: ATG CGT GGT ATG CTG CCT CTG TTT GAG CCG AAG 33

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro L.ys 1 5 10 /4/ Informace pro SEQ ID NO:3: /1/ Charakteristiky sekvence/A/ délka: 33 /3/ typ: nukleová kyselina/C/ řetězec: dvojitý/D/ topologie: lineární /xi/ popis sekvence: SEQ. ID N0:3: ATG CGT GGG ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG 33

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro L.ys 1 5 10 /5/ Informace pro SEQ ID NO:4: /1/ Charakteristiky sekvence/A/ délka: 57 /3/ typ: nukleová kyselina/C/: řetězec: dvojitý/D/ topologie: lineární /xi/ popis sekvence: SEQ ID N0:4: -30- ATG GJC TJC AJG GJC GJC GAT GJC AAGCCGT GGT ATGMet Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys ^cg Gly Met 1 5 10

CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG

Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys15 /6/ Informace pro SEQ ID NC:5: /i/ Charakteristiky sekvence/A/ délka: 57 /3/ typ: nukleová kyselina/C/ řetězec: dvojitý/D/ topologie: lineární /xi/ popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

ATG GJC TJC AAG GJC GJC GAT GJC AAG

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

AGG GGG ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG

Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys 10 15 /7/ Informace peo SEQ ID NO:6: /i/ Charakteristiky sekvence/A/ délka: 20 /3/ typ: nukleová kyselina/C/ řetězec:jednoduchý/D/topologie: lineární /xi/ popis sekvence: SEQ ID NC: 6:

GAATTC ATG AGG GGG ATG CT 36 57 27 57 20 -31- /8/ Informace pro SEC ID NO:7:/i/ Charakteristiky sekvence /A/ délka: 23 /3/ typ: nukleová kyselina/0/ řetězec: jednoduchý/D/ topologie: lineární /xi/ oois sekvence: SEC ID 30:7: GGTGGAAT TCACTC CTT GX GGA 23 /9/ Informace pro SEC ID N0:8: /i/ Charakteristiky sekvence/A/ délka: 24 /3/ typ: nukleová kyselina/C/ řetězec: dvojitý/D/ topologie: lineární /xi/ popis sekvence: SEC ID N0:8: gac ta: aag gac gac gat gac aag 24

Asp Typ Lys Asp -«sp Asp Asp Lys 1 5 /10/ Informace pro SEQ ID 30:9: /i/ Charakteristiky sekvence/A/ délka: 8 aminokvselin/B/ typ: aminokyselins/0/ topologie: lineární /ii/ tvp molekuly: protein /xi/ popis sekvence: SEC. ID 30: 9:

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 /11/ Informace pro SEQ ID NO: 10: /i/ Ch arakteristiky sekvence/A/ délka: 18 /3/ typ: nukleová kvseline,/C/ řetězec: jednoduchý/D/ tonologie: lineární /xi/ nepiš sekvence: SEC ID NO: 10: GTGGTCTTTG ACGCCAAG 18 /12/ Informace pro SEQ ID NO:11: /i/ Charakteristiky sekvence/A/ délka: 59 /3/ typ: nukleová kyselina/C/ řetězec: jednoduchý/D/ topologie: lineární /xi/ýopis sekvence: SEQ ID NO: 11: AGGGGC AGC A TACCACGCTT GTC ATCGTCG TCCTTGTAGT CCATAATTCT 50 GTTTCCTGT 59 /13/ Informace pro SEQ ID NO: 12 /i/ charakteristiky sekvence/A/ délka: 59 /3/ typ: nukleová kyselina/0/ řetězec: jednoduchý/D/ tonologie: Lineární /xi/ nopis sekvence: SEQ ID NO: 12: AGGGGC AGC A TCCCCCTCTT GTCAICGTCG TCCTTGTAST CCATGAATTC 50TGTTTCCTGT 60 33- /14/ Informace oro SEC ID NO: 13: /i/ Charakteristiky sekvence/A/ délka: 48 /3/ typ: nukleová kyselina/0/ řetě zec: jednoduchý/D/ topologie: lineární /xi/ popis sekvence: SEC ID NO: 13: GCCCTTCGGC TCAAAIAGTG GCAGCATJCC JCGCATAATT CTGTTTCC 48 /15/ Informace pro SEQ ID NO: 14: /i/ Charakteristiky sekvence/A/ délka: 53 /3/ typ: nukleová kyselina/C/ řetězec: jednoduchý/D/ topologie: lineární /xi/ popis sekvence: SEQ ID NO: 14: CGGCCCTTG GCTCAAAGAG GGGC AGC ATC CCACGC ATGA ATTCCTGTTT 50

CCT 53

Claims (10)

-34- ?/ -vo PATENTOVÁ NÁROKY

1. Gen pro Tep polymerázu, kde byle změněna sekven- ce prvních třiceti nukleotidových bází v nativním ge avyn které kódují prvních deset aminokyselin ve zralém nstw > λΛΞΓΘΟν nim proteinu ’ λΖ3ΐγ.\ΛΛ oad &amp;/ substitucí modifikovanou nukleotidovou sekvencívybranou ze skupiny, zahrnující 16 X S Z SEQ ID NO:2: ATG CGT GGT ATG CTG CCT CTG TTT GAG CCG AAG, SEQ ID NO: 3: ATG CGT GGG ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG a SEQ ID NO: 4: ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GJC AAG CGT GGT ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG <32° σ -¾ 9 T 6 Ϊ 0 33 36 57 nebo B/ inzercí mezi start kodon /ATG/ maturovaného nativ- · ního proteinu a kodon /AGG/ pro druhou aminokyselinu ma-turovaného nativního proteinu, sekvence SEQ ID NO: 5: GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG. 24 -35-

2. Gen podle nároku 1, sející restrikční místo zave-dené po směru řetězce od start /ATG/ kodonu, a stejné re-strikční místo zavedené protisměru od stop /TGA/ kodonu.

3. Gen podle nároku 2, kde restrikční místa jsoukočována nukleotidovou sekvencí GAATTC.

4. Gen podle nároku 1, kde nativní sekvence: SEC ID NO: 1 ATG AGG GGG ATG CTG CCC CTC TTT (JAG CCC AAG 33 je změněna na SEC ID NO: 2 ATG CGT GGT ATG CTG CCT CTG TTT GAG CCG AAG. 33

5. Termostabilní Thermus aciuaticus DNA polymeráza,mající první aminokyselinovou sekvenci v maturovanémproteinu: SEC. ID NO: 9: Met- Asp-Tyr-Lys- Asp- Asp- Asp- Asp-Lys. 1 5

6. Způsob zvýšení produkce Taq polymeráz.y, vyzna- čující se tím, že zahrnuje stupněA/ přípravu vektoru s genem pro Taq polymerázu, ve kterém sekvence prvních třiceti nukleotidových bází v nativ-ním genu, která kóduje prvních deset aminokyselin vmaturovaném nativním proteinu, byla změněnai/substitucí modifikované nukleotidové sekvence vybra- né ze skupiny, zahrnující: -JČ- SEC ΙΌ NO: 2: ATG CGT GGT ATG CTG CCT CTG TTT GAG CCG AAG, 33 SEC ID NG:j: ATC- CGT GGG ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG 7 a 33 SEC ID NO: 4: ATG GAC TJC AAG GAC GAC GAT GAC AAG CGT GGT ATG 36 CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG, 57 nebo ii/ inzercí mezi start kodon /ATG/ maturovaného nativ-ního proteinu a kodon./AGG/ pro druhou aminokyse-linu maturovaného nativního proteinu, sekvence SEQ ID NO: 8 TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG, 24 3/ transfekci kompatibilního E.coli hostitele vektoremA/ pro získání transformovaných E.coli hostitelskýchbuněk a C/ kultivaci transformovaných buněk 3/ za podmínekrůstu, kdy produkují Taq polymerázu syntetizovanou trans-formovanými hostitelskými buňkami.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačujícíse t í m, že vektor ze stupně A má indukce schopnýpromotor.

8. Způsob podle nároku 6, vyznačující setím, že produkce Taq polymerázy je indukována iso-propyl-^ -D-thiogalaktosidem /I?TG/.

9. Vektor s genem kočujícím Tac oolymerázu, kde sek vence prvních třiceti nukleotidových bází v notivnímgenu, které kc 'ují prvních deset aminokyselin v maturo-vanéi nativní polymeráze byla změněna A/ substitucí modifikované nukleotidové sekvence vybra-né ze skupiny, zahrnující SEQ ID NO: 2: ATG CGT GGT ATG CTG CCT CTG TTT GAG GCG AAG 33 SEQ ID NO:3 • • ATG CGT GGG ATG CTG GCC CTC TTT GAG CCC AAG, 33 A SEQ ID NO: 4: ATG G/C TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG CGT GGT ATG 36 CTG CCC CTC TTT GAG CCC * ΛΠ 57 nebo 3/ inzercí mezi start kodon /ATG/ maturovaného n ativ- ního proteinu a kodon /AGG/ druhé aminokyseliny matu- rovaného nativního proteinu, sekvence: SEQ ID NO: 5: GAC TAC AAG AAG GAC GAC GAT GAC AAG, 24 uvedený vektor má i/ selektovatelné markéry, ii/vhodný promotor a iii/ vlastní regulační sekvence nro řízení genové -38- exprese.

10. E.coli hostitelská buňka, obsahující vektorpodle nároku 9.