CN116200363A - Taq酶突变体、其制备方法和应用 - Google Patents

Taq酶突变体、其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116200363A
CN116200363A CN202111445100.1A CN202111445100A CN116200363A CN 116200363 A CN116200363 A CN 116200363A CN 202111445100 A CN202111445100 A CN 202111445100A CN 116200363 A CN116200363 A CN 116200363A
Authority
CN
China
Prior art keywords
taq enzyme
leu
enzyme mutant
amino acid
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111445100.1A
Other languages
English (en)
Inventor
蒋析文
张伟
连献兰
陆雪兰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Da'an Gene Co ltd filed Critical Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Priority to CN202111445100.1A priority Critical patent/CN116200363A/zh
Priority to PCT/CN2022/100276 priority patent/WO2023098036A1/zh
Publication of CN116200363A publication Critical patent/CN116200363A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本申请公开了一种Taq酶突变体、其制备方法和应用。本申请中，所述Taq酶突变体包括：与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列；所述氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点发生突变：D335、G499、E634、F769或其组合。本申请提供的Taq酶突变体具有高扩增活性，在同等PCR循环次数下，相比野生型Taq酶可以得到更多的扩增产物、同时耐全血和高盐且不损失5’～3’外切酶活性。

Description

Taq酶突变体、其制备方法和应用
技术领域
本发明实施例涉及PCR检测领域，特别涉及Taq酶突变体、其制备方法和应用。
背景技术
Taq酶是一种来源于耐热性细菌Thermus aquaticus的耐热性DNA聚合酶，分子量94KDa，在镁离子存在的条件下，其最适反应温度为75-80℃，在95℃下的活性半衰期为40分钟，具有5’-3’核酸外切酶活性。由于其具有耐高温的特性，因此广泛用于聚合酶链式反应(PCR)，是核酸扩增、检测等反应的首选用酶。商品化Taq酶使用大肠杆菌原核表达系统进行克隆及表达。现代分子生物检测技术对PCR反应的灵敏度、精确度、耐用性要求越来越高，野生型Taq酶无法完全满足实际应用的需求。
为使其更加适应特定技术的使用，现有技术中对Taq酶序列进行了多种形式的突变改造，例如，(1)增加结构域；(2)去除Taq酶上非必要的结构域；(3)与其他具有3’～5’外切活性的聚合酶的混合；和(4)定点突变。其中，定点突变指的是对Taq酶上的活性位点、镁离子结合位点、DNA结合位点的氨基酸进行定点突变，以提高各位点对底物、模板及引物的亲和力，进而提高对各种抑制剂的耐受性。
但是发明人在研究中发现，虽然对Taq酶序列进行定点突变可以一定程度上提高DNA聚合活性(Mutant Taq DNA polymerases with improved elongation ability as auseful reagent for genetic engineering.Front Microbiol 5:461.doi:10.3389/fmicb.2014.00461)，但其致使5’～3’外切酶活性降低，且突变后的Taq酶不耐全血和高盐，不利于临床检测。
因此，开发一种不损失5’～3’外切酶活性的，且耐全血和高盐的Taq酶突变体尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Taq酶突变体。
本发明的另一目的在于提供一种编码上述Taq酶突变体的核苷酸分子。
本发明的另一目的在于提供一种载体。
本发明的另一目的在于提供一种宿主细胞。
本发明的另一目的在于提供一种Taq酶突变体的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种含有Taq酶突变体的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种Taq酶突变体，所述Taq酶突变体包括：
与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，所述氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点发生突变：D335、G499、E634、F769或其组合。
在一些优选的方案中，所述氨基酸序列发生选自下组的任一种或几种突变：D335V、G499K、E634G和F769I。
在一些优选的方案中，所述氨基酸序列在下述四个位点发生突变D335V、G499K、E634G和F769I。
在一些优选的方案中，所述Taq酶突变体对氯化钠的抗性不低于70mM,，更优选不低于80mM，更优选不低于90mM，更优选不低于100mM，更优选不低于130mM，更优选不低于150mM，最优选不低于180mM。
在一些优选的方案中，所述Taq酶突变体对氯化钾的抗性不低于100mM,，更优选不低于110mM，更优选不低于120mM，更优选不低于130mM，更优选不低于140mM，更优选不低于150mM，更优选不低于180mM，更优选不低于190mM，最优选不低200mM。
在一些优选的方案中，所述Taq酶突变体对EDTA全血的抗性不低于5％(这里的百分比指的是血浆体积占PCR溶液体系总体积的百分比))，更优选不低于7％，更优选不低于10％，更优选不低于20％，更优选不低于30％，更优选不低于40％，最优选不低于45％。
在一些优选的方案中，所述Taq酶突变体对肝素全血的抗性不低于1％(这里的百分比指的是血浆体积占PCR溶液体系总体积的百分比)，更优选不低于3％，更优选不低于5％，更
优选不低于10％，更优选不低于20％，更优选不低于30％，最优选不低于35％。
SEQ ID NO:1(野生型Taq酶DNA序列如下)：
ATGCGTGGCATGCTGCCTCTGTTTGAACCGAAAGGCCGCGTGTTACTGGTTGATGGCCATCATCTGGCCTATCGTACCTTTCACGCACTGAAGGGTCTGACCACAAGCCGTGGCGAGCCGGTTCAGGCCGTGTACGGCTTCGCCAAAAGCCTGCTGAAAGCCCTGAAAGAAGACGGCGATGCCGTGATCGTGGTTTTCGACGCCAAGGCACCGAGCTTTCGTCATGAGGCTTATGGTGGCTATAAAGCCGGTCGCGCACCGACACCGGAGGATTTCCCGCGCCAGCTGGCCTTAATTAAAGAGCTGGTGGATCTGTTAGGCCTGGCCCGCCTGGAGGTTCCGGGTTATGAAGCCGACGACGTGCTGGCCAGCTTAGCCAAGAAGGCAGAGAAAGAGGGCTATGAGGTGCGCATTCTGACCGCAGACAAGGACCTGTATCAGCTGCTGAGCGATCGCATTCATGTGCTGCATCCGGAGGGCTACCTGATTACCCCGGCCTGGCTGTGGGAAAAATATGGTCTGCGCCCGGATCAATGGGCAGATTATCGCGCACTGACAGGCGATGAAAGCGATAACCTGCCGGGTGTTAAAGGCATTGGCGAGAAGACAGCACGTAAGCTGCTGGAAGAATgGGGTAgCCTGGAAGCCCTGTTAAAGAACCTGGACCGTCTGAAGCCGGCAATCCGCGAGAAGATTCTGGCCCACATGGATGATCTGAAGCTGAGTTGGGATCTGGCCAAAGTTCGCACAGACTTACCGCTGGAAGTGGACTTTGCCAAGCGTCGTGAACCGGACCGCGAACGTCTGCGTGCCTTCTTAGAACGCCTGGAATTCGGTAGCCTGCTGCACGAATTTGGTCTGCTGGAAAGCCCGAAAGCCTTAGAAGAAGCTCCGTGGCCGCCTCCGGAAGGTGCCTTTGTTGGCTTTGTTCTGAGCCGCAAAGAGCCGATGTGGGCAGATTTACTGGCCCTGGCCGCAGCACGCGGTGGTCGTGTTCATCGTGCCCCGGAACCGTATAAAGCCCTGCGCGACCTGAAAGAGGCACGTGGTCTGTTAGCAAAGGACCTGAGCGTGTTAGCACTGCGTGAAGGTCTGGGCTTACCGCCTGGTGATGATCCGATGCTGCTGGCCTACCTGCTGGACCCGAGCAACACCACCCCTGAGGGTGTGGCACGCCGTTATGGTGGTGAATGGACCGAGGAAGCAGGTGAACGCGCCGCACTGAGTGAGCGTCTGTTTGCAAACCTGTGGGGCCGTCTGGAAGGCGAGGAACGTCTGCTGTGGCTGTACCGCGAAGTGGAACGCCCGCTGAGCGCCGTTTTAGCCCACATGGAGGCCACCGGCGTTCGCTTAGATGTGGCCTATCTGCGCGCCCTGAGCCTGGAAGTTGCAGAAGAAATCGCCCGTCTGGAGGCAGAGGTGTTTCGTTTAGCCGGCCATCCGTTCAACCTGAATAGCCGCGACCAGCTGGAACGCGTGCTGTTTGATGAACTGGGCTTACCGGCCATTGGCAAGACCGAGAAGACCGGTAAACGTAGTACCAGTGCAGCCGTTCTGGAAGCACTGCGTGAAGCCCACCCTATTGTGGAAAAGATTCTGCAATATCGCGAGTTAACCAAACTGAAGAGCACCTACATCGATCCTCTGCCTGATCTGATTCACCCGCGCACCGGTCGTCTGCACACCCGCTTTAATCAAACAGCCACAGCCACCGGTCGTCTGAGCAGCAGCGATCCGAACTTACAGAACATTCCGGTGCGCACCCCTCTGGGCCAACGCATTCGTCGCGCCTTCATTGCCGAAGAAGGCTGGTTACTGGTGGCCCTGGACTACAGCCAGATTGAGCTGCGTGTTTTAGCCCATCTGAGCGGCGACGAAAACCTGATTCGCGTGTTTCAAGAGGGCCGCGATATTCATACAGAGACCGCCAGCTGGATGTTTGGTGTTCCTCGCGAAGCCGTTGATCCGCTGATGCGCCGCGCAGCCAAAACAATTAACTTCGGTGTGCTGTATGGTATGAGCGCCCACCGTTTAAGCCAGGAGCTGGCCATTCCGTATGAAGAGGCCCAGGCATTTATCGAGCGCTACTTCCAGAGTTTCCCTAAGGTGCGTGCATGGATCGAGAAAACACTGGAGGAAGGTCGCCGTCGTGGCTACGTGGAAACCCTGTTTGGCCGCCGTCGCTATGTGCCGGATCTGGAAGCCCGCGTGAAAAGCGTTCGTGAGGCAGCAGAGCGCATGGCATTTAATATGCCGGTGCAGGGTACCGCAGCCGACCTGATGAAACTGGCAATGGTGAAGCTGTTTCCGCGTCTGGAAGAGATGGGCGCCCGCATGTTACTGCAGGTGCACGACGAACTGGTTCTGGAGGCACCGAAAGAACGTGCCGAAGCAGTGGCACGCCTGGCCAAAGAGGTTATGGAAGGCGTTTATCCGTTAGCCGTTCCGCTGGAGGTGGAGGTTGGCATTGGCGAAGACTGGCTGAGTGCAAAAGAATAA
SEQ ID NO:2(野生型Taq酶氨基酸序列如下)：
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE
在一些优选的方案中，所述Taq酶突变体包括与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；更优选地，所述Taq酶突变体包括与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；更优选地，所述Taq酶突变体包括与SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
本发明的第二方面还提供了一种核苷酸分子，所述核苷酸分子编码本发明第一方面所述的的突的Taq酶突变体。
本发明的第三方面还提供了一种含有本发明第二方面所述的核苷酸分子的载体。
本发明的第四方面还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第二方面所述的核苷酸分子或染色体整合有本发明第二方面所述的核苷酸分子。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞为原核细胞、或真核细胞。
在一些优选的方案中，所述原核细胞为大肠杆菌。
在一些优选的方案中，所述真核细胞为酵母细胞。
本发明的第五方面还提供了一种含有本发明第一方面所述的Taq酶突变体的试剂盒。
本发明第六方面还提供了一种制备本发明第一方面所述的Taq酶突变体的方法，所述方法包括步骤：
(i)在适合的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出所述的Taq酶突变体；和
(ii)分离所述的Taq酶突变体。
本发明的第七方面还提供了本发明的第五方面所述的试剂盒的用途，应用于DNA测序，DNA标记，引物延伸，扩增等。
本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
(1)本发明提供的Taq酶突变体具有高扩增活性，在同等PCR循环次数下，相比野生型Taq酶可以得到更多的扩增产物；
(2)本发明提供的Taq酶突变体同时耐全血和高盐；
(3)本发明提供的Taq酶突变体不损失5’～3’外切酶活性。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1是根据本发明实施例中Taq-aCM蛋白纯化电泳图；
图2是根据本发明实施例中野生型Taq酶抗NaCl实验结果图；
图3是根据本发明实施例中Taq-aCM抗NaCl实验结果图；
图4是根据本发明实施例中野生型Taq酶抗KCl实验结果图；
图5是根据本发明实施例中Taq-aCM抗KCl实验结果图；
图6是根据本发明实施例中野生型Taq酶抗EDTA血液实验结果图；
图7是根据本发明实施例中Taq-aCM抗EDTA血液实验结果图；
图8是根据本发明实施例中野生型Taq酶抗肝素血液实验结果图；
图9是根据本发明实施例中Taq-aCM抗肝素血液实验结果图；
图10是根据本发明实施例8中RFU-循环曲线图。
具体实施方式
野生型Taq酶难以在一些极端条件下进行扩增，即在一些极端条件下，其聚合活性很低，例如高盐、全血的环境。虽然现有技术中尝试对野生型Taq酶进行突变，以增强其对极端条件的耐受性，但收效甚微，且常常致使5’～3’外切酶活性降低。本发明人通过广泛而深入的研究，应用酶定点突变技术的步骤，筛选出性能良好的Taq酶突变体，其聚合活性好，对高盐和全血有很好的耐受性，不损失5’～3’外切酶活性，适宜临床使用。
本发明的一些优选的实施方式提供了一种Taq酶突变体，所述Taq酶突变体包括：
与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，所述氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点发生突变：D335、G499、E634、F769或其组合。
在一些优选的方案中，所述氨基酸序列发生选自下组的任一种或几种突变：
D335V、G499K、E634G和F769I。
在一些优选的方案中，所述氨基酸序列在下组四个位点发生突变D335V、G499K、E634G和F769I。
在一些优选的方案中，所述Taq酶突变体对氯化钠的抗性不低于70mM,，更优选不低于80mM，更优选不低于90mM，更优选不低于100mM，更优选不低于130mM，更优选不低于150mM，最优选不低于180mM。
在一些优选的方案中，所述Taq酶突变体对氯化钾的抗性不低于100mM,，更优选不低于110mM，更优选不低于120mM，更优选不低于130mM，更优选不低于140mM，更优选不低于150mM，更优选不低于180mM，更优选不低于190mM，最优选不低200mM。
在一些优选的方案中，所述Taq酶突变体对EDTA全血的抗性不低于5％，更优选不低于7％，更优选不低于10％，更优选不低于20％，更优选不低于30％，更优选不低于40％，最优选不低于45％。
在一些优选的方案中，所述Taq酶突变体对肝素全血的抗性不低于1％，更优选不低于3％，更优选不低于5％，更优选不低于10％，更优选不低于20％，更优选不低于30％，最优选不低于35％。
SEQ ID NO:1(野生型Taq酶DNA序列如下)：
ATGCGTGGCATGCTGCCTCTGTTTGAACCGAAAGGCCGCGTGTTACTGGTTGATGGCCATCATCTGGCCTATCGTACCTTTCACGCACTGAAGGGTCTGACCACAAGCCGTGGCGAGCCGGTTCAGGCCGTGTACGGCTTCGCCAAAAGCCTGCTGAAAGCCCTGAAAGAAGACGGCGATGCCGTGATCGTGGTTTTCGACGCCAAGGCACCGAGCTTTCGTCATGAGGCTTATGGTGGCTATAAAGCCGGTCGCGCACCGACACCGGAGGATTTCCCGCGCCAGCTGGCCTTAATTAAAGAGCTGGTGGATCTGTTAGGCCTGGCCCGCCTGGAGGTTCCGGGTTATGAAGCCGACGACGTGCTGGCCAGCTTAGCCAAGAAGGCAGAGAAAGAGGGCTATGAGGTGCGCATTCTGACCGCAGACAAGGACCTGTATCAGCTGCTGAGCGATCGCATTCATGTGCTGCATCCGGAGGGCTACCTGATTACCCCGGCCTGGCTGTGGGAAAAATATGGTCTGCGCCCGGATCAATGGGCAGATTATCGCGCACTGACAGGCGATGAAAGCGATAACCTGCCGGGTGTTAAAGGCATTGGCGAGAAGACAGCACGTAAGCTGCTGGAAGAATgGGGTAgCCTGGAAGCCCTGTTAAAGAACCTGGACCGTCTGAAGCCGGCAATCCGCGAGAAGATTCTGGCCCACATGGATGATCTGAAGCTGAGTTGGGATCTGGCCAAAGTTCGCACAGACTTACCGCTGGAAGTGGACTTTGCCAAGCGTCGTGAACCGGACCGCGAACGTCTGCGTGCCTTCTTAGAACGCCTGGAATTCGGTAGCCTGCTGCACGAATTTGGTCTGCTGGAAAGCCCGAAAGCCTTAGAAGAAGCTCCGTGGCCGCCTCCGGAAGGTGCCTTTGTTGGCTTTGTTCTGAGCCGCAAAGAGCCGATGTGGGCAGATTTACTGGCCCTGGCCGCAGCACGCGGTGGTCGTGTTCATCGTGCCCCGGAACCGTATAAAGCCCTGCGCGACCTGAAAGAGGCACGTGGTCTGTTAGCAAAGGACCTGAGCGTGTTAGCACTGCGTGAAGGTCTGGGCTTACCGCCTGGTGATGATCCGATGCTGCTGGCCTACCTGCTGGACCCGAGCAACACCACCCCTGAGGGTGTGGCACGCCGTTATGGTGGTGAATGGACCGAGGAAGCAGGTGAACGCGCCGCACTGAGTGAGCGTCTGTTTGCAAACCTGTGGGGCCGTCTGGAAGGCGAGGAACGTCTGCTGTGGCTGTACCGCGAAGTGGAACGCCCGCTGAGCGCCGTTTTAGCCCACATGGAGGCCACCGGCGTTCGCTTAGATGTGGCCTATCTGCGCGCCCTGAGCCTGGAAGTTGCAGAAGAAATCGCCCGTCTGGAGGCAGAGGTGTTTCGTTTAGCCGGCCATCCGTTCAACCTGAATAGCCGCGACCAGCTGGAACGCGTGCTGTTTGATGAACTGGGCTTACCGGCCATTGGCAAGACCGAGAAGACCGGTAAACGTAGTACCAGTGCAGCCGTTCTGGAAGCACTGCGTGAAGCCCACCCTATTGTGGAAAAGATTCTGCAATATCGCGAGTTAACCAAACTGAAGAGCACCTACATCGATCCTCTGCCTGATCTGATTCACCCGCGCACCGGTCGTCTGCACACCCGCTTTAATCAAACAGCCACAGCCACCGGTCGTCTGAGCAGCAGCGATCCGAACTTACAGAACATTCCGGTGCGCACCCCTCTGGGCCAACGCATTCGTCGCGCCTTCATTGCCGAAGAAGGCTGGTTACTGGTGGCCCTGGACTACAGCCAGATTGAGCTGCGTGTTTTAGCCCATCTGAGCGGCGACGAAAACCTGATTCGCGTGTTTCAAGAGGGCCGCGATATTCATACAGAGACCGCCAGCTGGATGTTTGGTGTTCCTCGCGAAGCCGTTGATCCGCTGATGCGCCGCGCAGCCAAAACAATTAACTTCGGTGTGCTGTATGGTATGAGCGCCCACCGTTTAAGCCAGGAGCTGGCCATTCCGTATGAAGAGGCCCAGGCATTTATCGAGCGCTACTTCCAGAGTTTCCCTAAGGTGCGTGCATGGATCGAGAAAACACTGGAGGAAGGTCGCCGTCGTGGCTACGTGGAAACCCTGTTTGGCCGCCGTCGCTATGTGCCGGATCTGGAAGCCCGCGTGAAAAGCGTTCGTGAGGCAGCAGAGCGCATGGCATTTAATATGCCGGTGCAGGGTACCGCAGCCGACCTGATGAAACTGGCAATGGTGAAGCTGTTTCCGCGTCTGGAAGAGATGGGCGCCCGCATGTTACTGCAGGTGCACGACGAACTGGTTCTGGAGGCACCGAAAGAACGTGCCGAAGCAGTGGCACGCCTGGCCAAAGAGGTTATGGAAGGCGTTTATCCGTTAGCCGTTCCGCTGGAGGTGGAGGTTGGCATTGGCGAAGACTGGCTGAGTGCAAAAGAATAA
SEQ ID NO:2(野生型Taq酶氨基酸序列如下)：
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE
在一些优选的方案中，所述Taq酶突变体包括与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；更优选地，所述Taq酶突变体包括与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；更优选地，所述Taq酶突变体包括与SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
本发明的一些优选的实施方式提供了一种核苷酸分子，所述核苷酸分子编码本发明第一方面所述的的突的Taq酶突变体。
本发明的一些优选的实施方式提供了一种含有本发明第二方面所述的核苷酸分子的载体。
本发明的一些优选的实施方式提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第二方面所述的核苷酸分子或染色体整合有本发明第二方面所述的核苷酸分子。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞为原核细胞、或真核细胞。
在一些优选的方案中，所述原核细胞为大肠杆菌。
在一些优选的方案中，所述真核细胞为酵母细胞。
本发明的一些优选的实施方式提供了一种含有本发明第一方面所述的Taq酶突变体的试剂盒。
本发明的一些优选的实施方式提供了一种制备本发明第一方面所述的Taq酶突变体的方法，所述方法包括步骤：
(i)在适合的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出所述的Taq酶突变体；和
(ii)分离所述的Taq酶突变体。
本发明的一些优选的实施方式提供了本发明的第五方面所述的试剂盒的用途，应用于DNA测序，DNA标记，引物延伸，扩增等。
术语
如本文所用，术语“氨基酸”在其最广泛的含义中是指可掺入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有通用结构H2N-C(H)(R)-COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常在天然存在的肽中发现的二十种标准L-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除了标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论是合成制备的还是从天然来源获得的。如本文所用，“合成氨基酸”包括经化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(诸如酰胺)和/或取代物。氨基酸，包括肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸，可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化和/或用其它化学物质取代进行修饰，而不对其活性产生不利影响。氨基酸可以具有二硫键。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”可互换使用，并且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。无论该术语是指游离氨基酸还是肽的残基，从使用该术语的上下文中都将是显而易见的。应当注意，所有氨基酸残基序列在本文中都由左右取向为氨基末端到羧基末端的常规方向的式表示。
如本文所用，术语“突变”是指引入亲本序列的改变，包括但不眼于取代、插入、缺失(包括截短)。突变的后果包括但不限于在由亲本序列编码的蛋白中未发现的新特性、性质、功能、表型或性状的产生。术语"突变体"是指经修饰的蛋白，当与亲本蛋白相比时，所述经修饰的蛋白呈现改变的特征。
如本文所用，术语“％同源性”在本文中与术语“％同一性”可互换地使用，并且是指当使用序列比对程序进行比对时，编码本发明多肽的任何一个的核酸序列或本发明多肽的氨基酸序列之间的核酸或氨基酸序列同一性的水平。
如本文所用，术语“核苷酸”是指，自糖部分(戊糖)、磷酸酯以及含氮杂环碱基构成的DNA或RNA的单体单元。碱基经由糖苷碳(戊糖的1’碳)而连接至糖部分，并且碱基和糖的组合是核苷。当核苷包含键合至戊糖的3'-或5'-位置的磷酸酯基团时，它被称作核苷酸。可操作连接的核苷酸的序列在本文中通常称作"碱基序列"或"核苷酸序列并列，并且在本文中这样的形式表示，其左方向到右方向是在5'-末端至3'-末端的常规方向。
如本文所用，术语“载体”是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指能够在外来细胞中掺入并表达异源DNA片段的载体。许多原核和真核表达载体是可商购的。合适的表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指被目的基因侵入的细胞，其中目的基因可以以结合到载体(如病毒、染色体或质粒)上的形式侵入细胞，实现复制。
如本文所用，术语“染色体整合”是指通过同源重组将目的基因的多拷贝整合到充分限定的位点的整合方式。
Taq酶突变体的制备
本领域的普通技术人员可以使用的常规方法获得本发明的Taq酶基因序列，例如全人工合成或PCR法合成。一种优选的合成法为不对称PCR法。不对称PCR法是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(ssDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50-100∶1。在PCR反应的最初10-15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明的Taq酶突变体可以通过常规的重组DNA技术进行表达或生产，包括步骤：
(1)用编码本发明蛋白的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化目的蛋白质，从而获得Taq酶突变体。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明Taq酶突变体的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，优选市售的载体：pET28。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
所述重组载体在5'到3'方向上包括：启动子，目的基因和终止子。如果需要，所述重组载体还可以包括以下元件：蛋白纯化标签；3'多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；选择标记(抗生素抗性基因、荧光蛋白等)；增强子；或操作子。
用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以被采用。
本领域普通技术人员可以采用熟知的方法构建含有本发明启动子和/或目的基因序列的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
本发明的表达载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主转录目的RNA或表达目的蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。
实施例1、Taq酶突变体Taq-aCM的制备
Taq酶突变体制备的步骤，
步骤1：以野生型Taq酶表达载体为模板，利用QuikChange Lightning多位点突变试剂盒制备Taq-aCM突变质粒，其中野生型表达载体由广州达安基因股份有限公司保存，载体为pET28a，N端添加His6标签。突变质粒均送检测序，测序结果表明突变载体构建成功。
步骤2：重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)
取1μL质粒，在冰浴条件下，加入到30μL大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，冰浴放置20分钟，42℃水浴热激45秒，立刻冰上放置2分钟，加入400μL不含抗生素的SOC培养基，37℃、220rpm振荡培养50分钟。取100μL菌液均匀涂布到含100μg/mL卡那抗性的LB平板上，37℃培养箱培养过夜。
步骤3：目的蛋白表达
挑取步骤2中的单克隆，无菌操作接种于含100μg/mL卡那抗性的TB培养基中，37℃220rpm振荡培养至OD600在0.6至0.8之间，IPTG进行诱导(终浓度为0.1mM)，分别放置于37℃和18℃振荡培养过夜，不加IPTG组作为对照，37℃培养3小时，每组实验重复一次。取样超声破碎进行SDS-PAGE鉴定。
步骤4：Taq-aCM的纯化
TB培养基摇瓶培养1.5L菌液，表达条件与3)目的蛋白表达一致。离心收集菌体，两种蛋白菌体湿重约为30g。取称取约4g菌体，加入35ml Lysis Buffer在冰上重悬。超声破碎后离心，20000rpm，4℃离心30分钟，取上清，0.22μm针式过滤器过滤得到上清液。上清液过Ni-柱亲和层析，0～60％Buffer B进行线性洗脱，取洗脱主峰洗脱液进离子交换洗脱，所用纯化柱为HisTrapTM Q-HP，用0-60％Buffer C进行线性洗脱。
电泳图如图1所示。计算目的蛋白表达含量，Taq-aCM为2.5mg/mL，其中，所用溶液浓度如下所示：
Buffer B:50mM Tris,50mM NaCl,500mM Imidazole,5％Glycerol,pH8.5；
Lysis Buffer:50mM Tris,300mM NaCl,5％Glycerol,pH8.5；
Buffer C:100mM Tris,1M NaCl,10％Glycerol,pH8.5。
实施例2、Taq-aCM抗NaCl性能测试
配制不同的NaCl浓度梯度溶液(NaCl浓度梯度配置如下表1所示)，分别配制Buffer A和Buffer B(Buffer A和Buffer B的配方如下表1所示)，通过将Buffer A和Buffer B以不同比例混合形成NaCl浓度梯度溶液。
表1
Figure BDA0003383877160000121
以野生型Taq酶为阳性对照测定Taq-aCM对NaCl的抗性。
按照表2的配方配制PCR反应体系，其中RV和M4引物购自TaKaRa，5X Fast TaqBuffer、pUC19质粒由广州达安基因股份有限公司保存。每10μL的PCR反应体系加入的酶量为5U。以pUC19质粒为模板进行扩增实验，PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。
表2
试剂 BufferA BufferB
RV(10pmol) 1.2μL 1.2μL
M4(10pmol) 1.2μL 1.2μL
pUC19plasmid 6μL 6μL
5X Fast Taq Buffer 12μL 12μL
野生型Taq/Taq 2C2/Taq 2C2 Mut 30U 30U
1M NaCl 6μL 0μL
ddH2O 31.6μL 37.6μL
反应条件：95℃2分钟，(95℃15秒，44℃15秒，72℃1分钟)×30个循环，72℃1分钟，扩增产物电泳结果如图3和图4。
如图2，1～11分别为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mM NaCl浓度下野生型Taq酶PCR产物泳道；
如图3，1～9分别为110、120、130、140、150、160、170、180、190mM NaCl浓度下Taq-aCM的PCR产物泳道。
根据图2和图3可得，野生型Taq酶对NaCl的抗性为70mM,Taq-aCM对NaCl的抗性达到了180mM，因此Taq酶突变体与野生型Taq酶相比其抗NaCl性能显著提高。
实施例3、Taq-aCM抗KCl性能测试
参考实施例2中配制不同的KCl浓度梯度溶液(表3)，将BufferA中NaCl替换成KCl。
表3
KCl浓度/mM 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Buffer A/μL 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Buffer B/μL 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
按照与实施例2相同的方法测试Taq-aCM对KCl的抗性，扩增产物电泳结果如图4和图5。
如图4，1～11分别为50、80、100、150、160、170、180、190、200、250、300mM KCl浓度下野生型Taq酶PCR产物泳道；
如图5，10～20分别为50、80、100、150、160、170、180、190、200、250、300mM KCl浓度下Taq-aCM的PCR产物泳道；+为正对照。
根据图4和图5，野生型Taq酶对KCl的抗性为100mM，Taq突变酶Taq-aCM对NaCl的抗性达到了200mM，因此Taq酶突变体与野生型Taq酶相比其抗KCl性能显著提高。
实施例4、Taq-aCM抗EDTA全血性能测试
参考实施例2中配制不同的全血浓度梯度溶液(表4)，将将BufferA中NaCl替换成EDTA全血，按加入PCR反应体系的血液体积计算体积分数。
表4
Figure BDA0003383877160000131
按照与实施例2相同的方法测试Taq-aCM对EDTA全血的抗性，扩增产物电泳结果如图6和图7。
如图6，1～10分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50％(V/V)EDTA血液浓度下野生型Taq酶PCR产物泳道；
如图7，11～20分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50％(V/V)EDTA血液浓度下Taq-aCM的PCR产物泳道。
根据图6和图7可得，野生型Taq酶对EDTA全血的抗性为5％(按加入PCR的血液体积占PCR体系总体积的百分比计算体积分数)，Taq突变酶Taq-aCM对EDTA全血抗性达到了45％，因此Taq酶突变体与野生型Taq酶相比其抗EDTA全血性能显著提高。
实施例5、Taq-aCM抗肝素全血性能测试
参考实施例2中配制不同的全血浓度梯度溶液(表5)，将BufferA中NaCl替换成肝素全血，按加入PCR反应体系的血液体积计算体积分数。
表5
Figure BDA0003383877160000141
按照与实施例2相同的方法测试Taq-aCM对肝素全血的抗性，扩增产物电泳结果如图8和图9。
如图8，1～10分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50％(V/V)肝素血液浓度下野生型Taq酶PCR产物泳道；
如图9，1～10分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50％(V/V)肝素血液浓度下Taq-aCM的PCR产物泳道。
根据图8和图9可得，野生型Taq酶对肝素全血的抗性为0％，Taq突变酶Taq-aCM对肝素全血抗性达到了35％，因此Taq酶突变体与野生型Taq酶相比其抗肝素全血性能显著提高。
实施例6、Taq-aCM5’～3’外切酶活性测试
5’～3’外切酶活性采用荧光探针PCR法检测，以野生型Taq酶(ThermoFisherScientific)为阳性对照，稀释至1U、2U、3U、4U、5U，Taq-aCM同样稀释至相同的活性浓度。配制反应体系如下表5(其中10X Taq Buffer购自TaRaKa)：
表5
试剂 混合量
10X Taq Buffer 2.5ul
25mM MgCl2 4.5ul
2.5mM dNTPs 0.2ul
Probe2(10pmol) 0.5ul
DNA polymerase test 2(10pmol) 0.25μl
ddH2O 16.05μL
PCR反应条件：95℃10分钟，(95℃10秒，55℃30秒读取荧光)×40个循环，以反应循环为X轴，每个循环对应的荧光值(RFU)为Y轴，作RFU-循环曲线图。以已知的酶浓度为X轴，RFU-循环曲线图对应的初始斜率为Y轴拟合标准曲线，得到的线性回归方程的斜率可表示5`～3`外切酶活性大小。结果如图10。
根据图10，经突变后，Taq-aCM的5’～3’外切酶活性与野生型Taq酶基本一致。
按照文献Mutant Taq DNA polymerases with improved elongation abilityas a useful reagent for genetic engineering.Front Microbiol 5:461.doi:10.3389/fmicb.2014.00461中的方法制备Taq酶突变体Taq2C2，并在相同条件下测试其5’～3’外切酶活性，Taq-2C2 5`～3`外切酶活性为野生型Taq酶的66％。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州达安基因股份有限公司
<120> Taq酶突变体、其制备方法和应用
<130> P210836
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2499
<212> DNA
<213> Thermus aquaticus
<400> 1
atgcgtggca tgctgcctct gtttgaaccg aaaggccgcg tgttactggt tgatggccat 60
catctggcct atcgtacctt tcacgcactg aagggtctga ccacaagccg tggcgagccg 120
gttcaggccg tgtacggctt cgccaaaagc ctgctgaaag ccctgaaaga agacggcgat 180
gccgtgatcg tggttttcga cgccaaggca ccgagctttc gtcatgaggc ttatggtggc 240
tataaagccg gtcgcgcacc gacaccggag gatttcccgc gccagctggc cttaattaaa 300
gagctggtgg atctgttagg cctggcccgc ctggaggttc cgggttatga agccgacgac 360
gtgctggcca gcttagccaa gaaggcagag aaagagggct atgaggtgcg cattctgacc 420
gcagacaagg acctgtatca gctgctgagc gatcgcattc atgtgctgca tccggagggc 480
tacctgatta ccccggcctg gctgtgggaa aaatatggtc tgcgcccgga tcaatgggca 540
gattatcgcg cactgacagg cgatgaaagc gataacctgc cgggtgttaa aggcattggc 600
gagaagacag cacgtaagct gctggaagaa tggggtagcc tggaagccct gttaaagaac 660
ctggaccgtc tgaagccggc aatccgcgag aagattctgg cccacatgga tgatctgaag 720
ctgagttggg atctggccaa agttcgcaca gacttaccgc tggaagtgga ctttgccaag 780
cgtcgtgaac cggaccgcga acgtctgcgt gccttcttag aacgcctgga attcggtagc 840
ctgctgcacg aatttggtct gctggaaagc ccgaaagcct tagaagaagc tccgtggccg 900
cctccggaag gtgcctttgt tggctttgtt ctgagccgca aagagccgat gtgggcagat 960
ttactggccc tggccgcagc acgcggtggt cgtgttcatc gtgccccgga accgtataaa 1020
gccctgcgcg acctgaaaga ggcacgtggt ctgttagcaa aggacctgag cgtgttagca 1080
ctgcgtgaag gtctgggctt accgcctggt gatgatccga tgctgctggc ctacctgctg 1140
gacccgagca acaccacccc tgagggtgtg gcacgccgtt atggtggtga atggaccgag 1200
gaagcaggtg aacgcgccgc actgagtgag cgtctgtttg caaacctgtg gggccgtctg 1260
gaaggcgagg aacgtctgct gtggctgtac cgcgaagtgg aacgcccgct gagcgccgtt 1320
ttagcccaca tggaggccac cggcgttcgc ttagatgtgg cctatctgcg cgccctgagc 1380
ctggaagttg cagaagaaat cgcccgtctg gaggcagagg tgtttcgttt agccggccat 1440
ccgttcaacc tgaatagccg cgaccagctg gaacgcgtgc tgtttgatga actgggctta 1500
ccggccattg gcaagaccga gaagaccggt aaacgtagta ccagtgcagc cgttctggaa 1560
gcactgcgtg aagcccaccc tattgtggaa aagattctgc aatatcgcga gttaaccaaa 1620
ctgaagagca cctacatcga tcctctgcct gatctgattc acccgcgcac cggtcgtctg 1680
cacacccgct ttaatcaaac agccacagcc accggtcgtc tgagcagcag cgatccgaac 1740
ttacagaaca ttccggtgcg cacccctctg ggccaacgca ttcgtcgcgc cttcattgcc 1800
gaagaaggct ggttactggt ggccctggac tacagccaga ttgagctgcg tgttttagcc 1860
catctgagcg gcgacgaaaa cctgattcgc gtgtttcaag agggccgcga tattcataca 1920
gagaccgcca gctggatgtt tggtgttcct cgcgaagccg ttgatccgct gatgcgccgc 1980
gcagccaaaa caattaactt cggtgtgctg tatggtatga gcgcccaccg tttaagccag 2040
gagctggcca ttccgtatga agaggcccag gcatttatcg agcgctactt ccagagtttc 2100
cctaaggtgc gtgcatggat cgagaaaaca ctggaggaag gtcgccgtcg tggctacgtg 2160
gaaaccctgt ttggccgccg tcgctatgtg ccggatctgg aagcccgcgt gaaaagcgtt 2220
cgtgaggcag cagagcgcat ggcatttaat atgccggtgc agggtaccgc agccgacctg 2280
atgaaactgg caatggtgaa gctgtttccg cgtctggaag agatgggcgc ccgcatgtta 2340
ctgcaggtgc acgacgaact ggttctggag gcaccgaaag aacgtgccga agcagtggca 2400
cgcctggcca aagaggttat ggaaggcgtt tatccgttag ccgttccgct ggaggtggag 2460
gttggcattg gcgaagactg gctgagtgca aaagaataa 2499
<210> 2
<211> 832
<212> PRT
<213> Thermus aquaticus
<400> 2
Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val
50 55 60
Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu
85 90 95
Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu
100 105 110
Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys
115 120 125
Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp
130 135 140
Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro
165 170 175
Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn
180 185 190
Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu
195 200 205
Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu
210 215 220
Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys
225 230 235 240
Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val
245 250 255
Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe
260 265 270
Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu
275 280 285
Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly
290 295 300
Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp
305 310 315 320
Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro
325 330 335
Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu
340 345 350
Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro
355 360 365
Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn
370 375 380
Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu
385 390 395 400
Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu
405 410 415
Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu
420 425 430
Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly
435 440 445
Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala
450 455 460
Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His
465 470 475 480
Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp
485 490 495
Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg
500 505 510
Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile
515 520 525
Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr
530 535 540
Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu
545 550 555 560
His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser
565 570 575
Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln
580 585 590
Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala
595 600 605
Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly
610 615 620
Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr
625 630 635 640
Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro
645 650 655
Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly
660 665 670
Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
675 680 685
Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg
690 695 700
Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val
705 710 715 720
Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg
725 730 735
Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro
740 745 750
Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu
755 760 765
Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His
770 775 780
Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala
785 790 795 800
Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro
805 810 815
Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu
820 825 830

Claims (10)

1.一种Taq酶突变体，其特征在于，所述Taq酶突变体包括：
与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列；
所述氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点发生突变：D335、G499、E634、F769或其组合。
2.根据权利要求1所述的Taq酶突变体，其特征在于，所述氨基酸序列发生选自下组的任一种或几种突变：D335V、G499K、E634G和F769I。
3.根据权利要求2所述的Taq酶突变体，其特征在于，所述氨基酸序列在下述四个位点发生突变：D335V、G499K、E634G和F769I。
4.根据权利要求1至3任一项所述的Taq酶突变体，其特征在于，所述Taq酶突变体对氯化钠的抗性不低于70mM；
和/或，所述Taq酶突变体对氯化钾的抗性不低于100mM。
5.根据权利要求1至3任一项所述的Taq酶突变体，其特征在于，所述Taq酶突变体对EDTA全血的抗性不低于5％；
和/或，所述Taq酶突变体对肝素全血的抗性不低于1％。
6.一种核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码如权利要求1至5任一项所述的Taq酶突变体。
7.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求6所述的核苷酸分子。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求7所述的载体或染色体整合有如权利要求5所述的核酸分子。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求求1至5任一项所述的Taq酶突变体。
10.一种制备如权利要求1所述的Taq酶突变体的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(i)在适合的条件下，培养权利要求8所述的宿主细胞，从而表达出所述的Taq酶突变体；和
(ii)分离所述的Taq酶突变体。
CN202111445100.1A 2021-11-30 2021-11-30 Taq酶突变体、其制备方法和应用 Pending CN116200363A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111445100.1A CN116200363A (zh) 2021-11-30 2021-11-30 Taq酶突变体、其制备方法和应用
PCT/CN2022/100276 WO2023098036A1 (zh) 2021-11-30 2022-06-22 Taq酶突变体、其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111445100.1A CN116200363A (zh) 2021-11-30 2021-11-30 Taq酶突变体、其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116200363A true CN116200363A (zh) 2023-06-02

Family

ID=86513466

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111445100.1A Pending CN116200363A (zh) 2021-11-30 2021-11-30 Taq酶突变体、其制备方法和应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN116200363A (zh)
WO (1) WO2023098036A1 (zh)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9758773B2 (en) * 2014-02-14 2017-09-12 Agilent Technologies, Inc. Thermostable type-A DNA polymerase mutant with increased resistance to inhibitors in blood
CN110684752B (zh) * 2019-10-08 2020-09-29 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 一种耐受性提高的突变型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用
CN112029749B (zh) * 2019-10-29 2021-05-04 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 一种Taq DNA聚合酶突变体Mut3及其应用
CN112725299B (zh) * 2020-12-30 2023-10-10 苏州白垩纪生物科技有限公司 改善Taq DNA聚合酶耐受性的突变体及制备方法和应用
CN113174380A (zh) * 2021-03-12 2021-07-27 翌圣生物科技（上海）有限公司 一种突变型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用
CN113373127B (zh) * 2021-03-30 2022-10-04 中国农业科学院生物技术研究所 Taq DNA聚合酶突变体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023098036A1 (zh) 2023-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4163001B2 (ja) Ｒｎａポリメラーゼから誘導されたポリペプチド及びそれらの使用
EP0482714B1 (en) Increased production of thermus aquaticus DNA polymerase in E. coli
JP5308027B2 (ja) 変異型ｐｃｎａ
EP3425045A1 (en) Dna polymerases
KR20190091499A (ko) 내열성의 역전사 효소 돌연변이체
CA2559415A1 (en) Methods for obtaining thermostable enzymes, dna polymerase i variants from thermus aquaticus having new catalytic activities, methods for obtaining the same, and applications of the same
CN112639089B (zh) 重组型kod聚合酶
CN108070577B (zh) 一种抗血清干扰TaqDNA聚合酶及其制备和应用
CN109937252B (zh) 重组dna聚合酶
CN111172129B (zh) 一种提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29 DNA聚合酶突变体及其应用
EP3381947A1 (en) Dna polymerase variant
KR20210031699A (ko) Rna로부터의 핵산 증폭반응에 적합한 dna 폴리머라아제 돌연변이체
CN112899253B (zh) 具有dna聚合酶活性的多肽、重组载体及其制备方法与应用
CN108795900B (zh) Dna聚合酶及其制备方法
CN116200363A (zh) Taq酶突变体、其制备方法和应用
CN116200362A (zh) Taq酶突变体及其制备方法和用途
CN114573673B (zh) 双叉犀金龟表皮蛋白，编码核苷酸序列及其应用
CN108588047B (zh) 同型半胱氨酸甲基转移酶突变体及其应用、以及核酸、表达载体、宿主细胞、试剂
WO2021231483A1 (en) Thermostable terminal deoxynucleotidyl transferase
JP2022534004A (ja) 末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの変異体及びその使用
Couch et al. Construction of expression vectors to produce affinity-tagged proteins in Pseudomonas
JP3498808B2 (ja) Ｄｎａポリメラーゼ遺伝子
EP1306434B1 (en) Genes encoding proteins capable of regenerating luciferin, recombinant dna and process for producing protein capable of regenerating luciferin
CN112899254B (zh) 一种用于恒温直接扩增核酸的dna聚合酶及其应用方法
CN111349623B (zh) 9°n dna聚合酶突变体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination