JP4163001B2 - Rnaポリメラーゼから誘導されたポリペプチド及びそれらの使用 - Google Patents

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Description

本発明の目的は、RNAポリメラーゼから誘導されるポリペプチド、また指定される変異型RNAポリメラーゼ、同様にそれらの使用、特に対象のRNAのインビボ又はインビトロ調製法にある。
完全に明白な配列の大量のDNA分子を得るときは、高純粋で、小サイズ(10から100nt)の化学合成法が、現在もっとも経済的な方法である。現在、市場には必要に応じてこれらの合成を行う非常に多数の企業がある。これらの同じ会社はまたRNA合成も提供している、しかし、その技術はとても費用がかかり、これはDNA対するより少なくとも10倍高く、現在非常に高いものとなっている。
それゆえ酵素的合成法が、化学的合成又はプラスミド起源のDNA鋳型につないだRNAポリメラーゼの使用で好まれている。これは使用するポリメラーゼのプロモーター配列の下流に転写される配列を含むものである。必要な要素(ポリメラーゼ、rNTP、クローニングベクター)は、最適化されたキットの形で入手できる。
バクテリオファージT7RNAポリメラーゼは、組換えDNAの鋳型からRNAの大量合成(ミリグラムまで)の目的で、インビトロ転写反応を行うために非常に広範囲に使われる。これらのインビトロ合成RNAは、生物学、バイオテクノロジー、医薬で多くの使用のために必要である;特に以下で述べられる:
−インビトロ翻訳、
−RNA成熟の研究、
−遺伝子発現へのアンチセンスRNAの効果、
−RNA−たんぱく質相互作用、
−小細胞RNAs(tRNA,rRNA)相同物の合成、
−リボザイムの生産。
より一般的にはこれらのRNAは、また分子プローブや構造研究の基質として使われる。
少数のT7ポリメラーゼ変異がすでに記述されている。これらは、野生型T7ポリメラーゼから誘導された変異型RNAポリメラーゼであり、次の変異のひとつを含む。
・グルタミン酸のよる222位のリジン(K)の置換;このように変異されたRNAポリメラーゼは、この変異により変更したプロモーター認識特性を有し、そして米国特許5,385,834に記述されている。
・フェニルアラニン(F)による639位のチロシン(Y)の置換;このように変異されたRNAポリメラーゼは、リボヌクレオチドの代わりにデオキシリボヌクレオチドを取り込む特性を有す、それゆえRNAの代わりにDNAを合成し、そして米国特許6,107,037に記述されている。
・セリン(S)による810位のイソロイシン(I)の置換;このように変異されたRNAポリメラーゼは、野生型RNAポリメラーゼより遅い特性を有し、そしてBonner等、The Journal of Biochemical Chemistry, 269, pp. 25120-25128 (1994)に記述されている。
本発明で解決される課題は、供与DNA鋳型上でのT7RNAポリメラーゼ(及び、さらに他の既知のRNAポリメラーゼのすべて)の活性が、供与RNAをコードするヌクレオチド配列の転写される最初の6から12ヌクレオチド(最初の転写配列、ITS)の性質に強く依存する(Miligan et al., 1987)という事実と結びついている。もしITSが共通配列5′GGGAGA...から違いすぎると、そのときポリメラーゼは、しばしば中断し大量のリボヌクレシド3リン酸が希望の大RNAsを損なった中断の小RNAsの合成のために消費される。
それゆえ、実験者は一般的に効率的な転写を得るために都合のよいITS(また、共通(consensus)又は共通の(consensual)ITSといわれる)を付加する転写配列の改変をせざるおえない。多くの場合は、この強制は非常に面倒でさらに受け入れられにくい。
全ての非共通の5′末端RNAを得るための潜在的方法は、共通ITSの下流に希望の配列を含むRNAの後処理を使う;後者(目的)のRNAはそれゆえ大量に生産される。さらに、削除されるようにRNAの3′末端に補完されるDNA配列のキメラDNA−RNAオリゴヌクレオチドを化学的に合成する必要があり、それから目的の転写物とオリゴとで形成するハイブリッドがRnase Hで消化される。この複雑で煩わしい方法は、もし希望のRNAが非常に大サイズで、その5′末端が厳密に明らかならばもっともである。
反応培地への合成ポリアミンの添加は、中断サイクル数を減少させることでRNA生産を増加するらしい;しかしながら、最適な実験条件の決定は(ポリアミン、使用濃度の選択)研究ごとに必要である。さらに、鋳型がプラスミド起源(二本鎖)のときには、これらポリアミンの効果は弱く、無いことさえあるということを注意べきである(Frugier et al., 1994)。
これら2つの方法は、共通で使用できず(特定のポリアミン又はオリゴヌクレオチド)お決まりの使用には不向きな試薬を使用する。はじめに、中断の少ない性質のポリメラーゼの獲得の実現がこの課題を解決するもっと簡単な方法であるということは明らかである。
本発明は、RNAポリメラーゼのペプチド配列の改変で転写されるヌクレオチド配列のITSの性質への上記の改変型RNAポリメラーゼの感受性が減少できるという事実の発明者による実証の結果である。
本発明は、対象のRNA生産に通常使用される野生型RNAポリメラーゼから誘導されるポリペプチドを提供することを目的とする。これは、該野生型RNAポリメラーゼより非共通のITSの性質への感受性が際立って低い。
本発明は、野生型RNAポリメラーゼが、対象の該RNAをコードしているヌクレオチド配列のITSに過敏である時、野生型RNAポリメラーゼを使用する方法より多い収量で対象のRNAを生産する新しい方法を提供することをまた目的とする。
本発明の主題は、ファージ起源の変異型RNAポリメラーゼの使用で、すなわちファージ由来のRNAポリメラーゼであって、そのRNAポリメラーゼのペプチド鎖は誘導される野生型RNAポリメラーゼに対して少なくともひとつのアミノ酸の置換、又は欠失、又は付加により改変される変異型RNAポリメラーゼであって、この改変は対象のRNAをコードするDNA配列に含まれるITSへの該RNAポリメラーゼの感受性を減らす効果を有しており、対象の該RNA又は対象のこのRNAにコードされるたんぱく質を生産するための方法の実施のために、対象の該RNAをコードするDNA配列を含む所定のヌクレオチドから始まり、この転写は、上記の野生型RNAポリメラーゼ及び変異型RNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターの制御下にあり、該方法は(対象の該RNAをコードするDNA配列に含まれるものと同じ非共通のITSの存在下で)野生型RNAポリメラーゼの使用の場合に得られる収量より多い該RNAの生産収量を有する方法である。
対象の該RNAをコードするDNA配列の転写において上記の変異型該RNAポリメラーゼ活性は、このDNA配列の非共通のITSを構成するヌクレオチドの性質により目立った影響を受けず、誘導された野生型RNAポリメラーゼにはなく、これによってこれら変異型RNAポリメラーゼを野生型ポリメラーゼよりもおおよそ40倍まで活性にし、それゆえ本発明の上記の方法においてこの同じ非共通のITSの存在下で野生型RNAポリメラーゼを使用した場合に得られる収量より多い該RNAの生産収量で特徴図けられる。
本発明の別の特に有利な概念には、本発明の変異型RNAポリメラーゼが対象の該RNAをコードする配列に存在下するいかなるITSでも対象のRNAを実際的に同一収量で得ることを可能とすることである。
有利的には、上記の変異型RNAポリメラーゼの使用は、非共通のITSの存在下で野生型RNAポリメラーゼの使用場合に得られる収量よりおおよそ10倍まで多い収量で対象のRNAを生産する方法を実施させる。
上記の変異型RNAポリメラーゼを使用する本発明に従った方法の実施で大量に生産しうる対象のRNAは、天然又はキメラRNAsであり、もし1つあるいはそれ以上の非標準のヌクレオシド単リン酸(すなわち、もしこの類似物がポリメラーゼにより認識されるならば天然の核酸塩基の1つの類似物を任意に所持できる該糖自身たとえばリボースの代わりのデオキシリボース)を含むならば該RNAsである。後者の場合、本発明の主題はまた核酸分子の配列決定のための方法の実施における該上記のRNAポリメラーゼ使用の上記の方法の使用である。
使用される変異型RNAポリメラーゼは、野生型ファージ単量体ポリメラーゼから有利的に誘導されるもので、W. T. McAllister及びC. A. Raskin, Molecular Microbiology (1993), 10 (1), 1-6.の論文で特に記述されており、特にそれぞれT7, T3, K11, SP6のようなバクテリオファージの単量体RNAポリメラーゼに由来するものである。
好ましくは、上記の変異型RNAポリメラーゼは、1位及びおおよそ410位間、特におおよそ90位及び320位間、より特に115位及び300位間に位置する少なくとも1つのアミノ酸が置換又は欠失で改変される野生型RNAポリメラーゼから誘導されるものである。
有利的には、使用されるRNAポリメラーゼは、野生型T7RNAポリメラーゼの266位に位置するプロリン又はT3の267位、K11の289位及びSP6の239位に位置するプロリンのようにバクテリオファージ野生型RNAポリメラーゼの相同位置に位置するプロリンに代えて266位のロイシンを含むものである。
本発明のより特定の主題は、上記のすべての変異型RNAポリメラーゼの上記の使用であって、上で定義のプロリン及び/又は上記のプロリン周辺に位置する少なくとも1つのアミノ酸、すなわち該RNAポリメラーゼがその3次元構造で考えられたときに対象のプロリンからおおよそ10オングストロームに等しいかそれ以下の距離に位置するアミノ酸(Cheetham, G. M. & Steitz, T. A. (1999), Science 286, 2305-2309; Cheetham, G. M. et al., Nature 399, 80-83; Sousa, R. et al., Nature 364, 539-599に記述されるように)が置換又は欠失で改変されるすべての変異型RNAポリメラーゼの使用である。
本発明は、また特に好ましくは次から選択される変異型RNAポリメラーゼの上記の使用に関する。
*野生型T7RNAポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも1つを含むもの:
−バリン(V)による117位のイソロイシン(I)の置換、
−バリン(V)による119位のイソロイシン(I)の置換、
−アラニン(A)による134位のバリン(V)の置換、
−アスパラギン(N)による147位のアスパラギン酸(D)の置換、
−アルギニン(R)による230位のヒスチジン(H)の置換、
−ロイシン(L)による266位のプロリン(P)の置換、
−システイン(C)による291位のアルギニン(R)の置換、
*野生型T3RNAポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも1つを含むもの:
−アスパラギン(N)による148位のアスパラギン酸(D)の置換、
−ロイシン(L)による267位のプロリン(P)の置換、
−システイン(C)による292位のアルギニン(R)の置換、
*野生型K11RNAポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも1つを含むもの:
−アスパラギン(N)による167位のアスパラギン酸(D)の置換、
−ロイシン(L)による289位のプロリン(P)の置換、
−システイン(C)による314位のアルギニン(R)の置換、
*野生型SP6RNAポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも1つを含むもの:
−アスパラギン(N)による117位のアスパラギン酸(D)の置換、
−ロイシン(L)による239位のプロリン(P)の置換。
本発明のより特定の主題は、次の変異型RNAポリメラーゼの上記の使用である。
−プロリンに代えて266位のロイシンを含む配列番号2で表される変異型T7RNAポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて117位のバリン、及びバリンに代えて134位のアラニンを含む配列番号4で表される変異型T7RNAポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて119位のバリン、及びアスパラギン酸に代えて147位のアスパラギンを含む配列番号6で表される変異型T7RNAポリメラーゼ、
−ヒスチジンに代えて230位のアルギニン、及びアルギニンに代えて291位のシステインを含む配列番号8で表される変異型T7RNAポリメラーゼ
−プロリンに代えて266位のロイシン、及びチロシンに代えて639位のフェニルアラニンを含む配列番号10で表される変異型T7RNAポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて810位のアスパラギンを含む配列番号12で表される変異型T7RNAポリメラーゼ、
−プロリンに代えて266位のロイシン、及びイソロイシンに代えて810位のアスパラギンを含む配列番号14で表される変異型T7RNAポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて119位のバリン、アスパラギン酸に代えて147位のアスパラギン、及びイソロイシンに代えて810位のアスパラギンを含む配列番号16で表される変異型T7RNAポリメラーゼ。
本発明の主題は、また上記のアミノ酸の改変と同様にDNA配列の転写の適用範囲内におけるITSへの感受性以外の機構に関与する少なくとも一つの他のアミノ酸の置換又は欠失又は付加による改変であって、たとえば上記の改変型RNAポリメラーゼがRNA鎖に非標準のヌクレオシド3リン酸(たとえば、dNTP)を取り込むことを可能とし、それゆえにDNA合成が可能となるアミノ酸の改変、そして/又は遅いRNAポリメラーゼの獲得を可能とし、それゆえに本発明の変異と関係して対象のたんぱく質の合成収量の向上が可能となるアミノ酸の改変を含む上記の変異型RNAポリメラーゼの上記の使用である。
それゆえ本発明のより特定の主題は、上記の変異と同様にフェニルアラニンによるT7の639位、又は上記の他のポリメラーゼの類似位置のチロシンの置換に相当する変異、そして/又、セリン又はアスパラギンによるT7の810位、又は上記の他のポリメラーゼの類似位置のイソロイシンの置換に相当する変異を含む上記の変異型RNAポリメラーゼの上記の使用である。
それゆえ本発明はまた配列番号10で表される上記の変異型T7RNAポリメラーゼの使用とより特に関係する。
本発明の主題は、また:
* 117、119、134、147、230、266又は291位で上記の変異の少なくとも1つ、及び任意で次の追加変異の少なくとも一つを含む野生型T7RNAポリメラーゼから誘導される変異型RNAポリメラーゼ:
−フェニルアラニン(F)による639位のチロシン(Y)の置換、
−アスパラギン(N)による810位のイソロイシン(I)の置換、
* 148、267、又は292位で上記の変異の少なくとも1つ、及び任意で次の追加変異の少なくとも一つを含む野生型T3RNAポリメラーゼから誘導される変異型RNAポリメラーゼ:
−フェニルアラニン(F)による640位のチロシン(Y)の置換、
−アスパラギン(N)による811位のイソロイシン(I)の置換、
* 167、289、又は314位で上記の変異の少なくとも1つ、及び任意で次の追加変異の少なくとも一つを含む野生型K11RNAポリメラーゼから誘導される変異型RNAポリメラーゼ:
−フェニルアラニン(F)による662位のチロシン(Y)の置換、
−アスパラギン(N)による833位のイソロイシン(I)の置換、
* 117、又は239位で上記変異の少なくとも1つ、及び任意で次の追加変異の少なくとも一つを含む野生型SP6RNAポリメラーゼから誘導される変異型RNAポリメラーゼ:
−フェニルアラニン(F)による631位のチロシン(Y)の置換、
−アスパラギン(N)による804位のイソロイシン(I)の置換。
本発明は、また上記のファージ起源の変異型RNAポリメラーゼの調製のためのすべての方法に関する、すなわち、対象のRNAをコードするDNA配列を含み、転写がそれらが由来するファージ起源の野生型RNAポリメラーゼ及び変異型RNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターの制御下におかれるRNAポリメラーゼの所定のヌクレオチド配列転写活性が、野生型RNAポリメラーゼによるこの所定の配列の転写活性より高いものであって、特に該所定のヌクレオチド配列で始まる対象のRNAを生産するための方法の実施の適用範囲内では該野生型RNAポリメラーゼよりおおよそ40倍までの活性である変異型RNAポリメラーゼの調製の方法に関するものであって、該方法は:
− 該野生型RNAポリメラーゼをコードする遺伝子の少なくとも1つのコドンの置換又は欠失又は付加によるファージ起源の野生型RNAポリメラーゼのペプチド鎖の改変の工程、そして上記の改変遺伝子を含むベクターでの大腸菌のような適当な細胞の形質転換の工程、
−大腸菌のような適当な細胞内、特に前述の細胞内での特定のマーカーの生産収量が同じ条件下で野生型RNAポリメラーゼの使用で得られるこの同じマーカーの生産収量より多い上述の変異型RNAポリメラーゼを生産する細胞を検出する工程であって、特定のマーカーが、上記のRNAポリメラーゼで認識されるプロモーターの下流に挿入されるヌクレオチド配列によりコードされる色原性マーカー又は抗生物質耐性マーカーのようなマーカーであり、このマーカーをコードする配列及びプロモーターは野生型RNAポリメラーゼの活性に影響を及ぼすことで知られる最初のおおよそ6から12ヌクレオチドの性質によるITSにより分離されている工程、
−前工程で検出された細胞からの上記の変異型RNAポリメラーゼの精製工程、
を含む方法。
本発明のより特定の主題は、上記の調製方法の実施により得られるファージ起源の変異型RNAポリメラーゼの上記の使用である。
本発明は、また上記の調製方法の実施により得られるファージ起源の変異型RNAポリメラーゼに関する。
本発明のより特定の主題は、上記の調製方法の実施により得られるファージ起源の変異型RNAポリメラーゼで野生型ファージ単量体ポリメラーゼの改変に由来するもので、特にT7、T3、K11、SP6のようなバクテリオファージの単量体RNAポリメラーゼに由来するものである。
本発明の主題は、また野生型T7RNAポリメラーゼから誘導される変異型RNAポリメラーゼを除外するために1位とおおよそ410位間、特におおよそ90位と320位間、より特に115位と300位間に位置する少なくとも1つのアミノ酸が置換又は欠失したファージ起源の野生型RNAポリメラーゼから誘導される次の変異を含むファージ起源の変異型RNAポリメラーゼ:
・グルタミン酸による222位のリジン(K)の置換。
本発明のより特定の主題は、野生型T7RNAポリメラーゼの266位、又はT3の267位、K11の289位、及びSP6の239位のような野生型バクテリオファージRNAポリメラーゼの相同位置のプロリンに代えて266位のロイシンを含む上記の変異型RNAポリメラーゼである。
本発明のより特定の主題は、また上記のすべての変異型RNAポリメラーゼにおいて上記のプロリン、及び/又は上記のプロリン周辺に位置する少なくとも1つのアミノ酸、すなわち該RNAポリメラーゼがその3次元構造で考えられたときに対象のプロリンからおおよそ10オングストロームに等しいかそれ以下の距離に位置するアミノ酸が置換又は欠失で改変されるすべての変異型RNAポリメラーゼである。
本発明のより特定の主題は、T7、T3、K11、又はSP6のような野生型RNAポリメラーゼから誘導される変異型RNAポリメラーゼに関するもので、次から選ばれる:
*野生型T7RNAポリメラーゼから誘導され、少なくとも1つの次の変異を含むもの:
−バリン(V)による117位のイソロイシン(I)の置換、
−バリン(V)による119位のイソロイシン(I)の置換、
−アラニン(A)による134位のバリン(V)の置換、
−アスパラギン(N)による147位のアスパラギン酸(D)の置換、
−アルギニン(R)による230位のヒスチジン(H)の置換、
−ロイシン(L)による266位のプロリン(P)の置換、
−システイン(C)による291位のアルギニン(R)の置換、
任意で次の付加的変異の少なくとも1つを含む該変異型RNAポリメラーゼ:
−フェニルアラニン(F)による639位のチロシン(Y)の置換、
−アスパラギン(N)による810位のイソロイシン(I)の置換、
*野生型T3RNAポリメラーゼから誘導され、少なくとも1つの次の変異を含むもの:
−アスパラギン(N)による148位のアスパラギン酸(D)の置換、
−ロイシン(L)による267位のプロリン(P)の置換、
−システイン(C)による292位のアルギニン(R)の置換、
任意で次の付加的変異の少なくとも1つを含む該変異型RNAポリメラーゼ:
−フェニルアラニン(F)による640位のチロシン(Y)の置換、
−アスパラギン(N)による811位のイソロイシン(I)の置換
*野生型K11RNAポリメラーゼから誘導され、少なくとも1つの次の変異を含むもの:
−アスパラギン(N)による167位のアスパラギン酸(D)の置換、
−ロイシン(L)による289位のプロリン(P)の置換、
−システイン(C)による314位のアルギニン(R)の置換、
任意で次の付加的変異の少なくとも1つを含む該変異型RNAポリメラーゼ:
−フェニルアラニン(F)による662位のチロシン(Y)の置換、
−アスパラギン(N)による833位のイソロイシン(I)の置換
*野生型SP6RNAポリメラーゼから誘導され、少なくとも1つの次の変異を含むもの:
−アスパラギン(N)による117位のアスパラギン酸(D)の置換、
−ロイシン(L)による239位のプロリン(P)の置換
任意で次の付加的変異の少なくとも1つを含む該変異型RNAポリメラーゼ:
−フェニルアラニン(F)による631位のチロシン(Y)の置換、
−アスパラギン(N)による804位のイソロイシン(I)の置換。
本発明のより特定の主題は、次の変異型RNAポリメラーゼである:
−プロリンに代えて266位のロイシンを含む配列番号2で表される変異型T7RNAポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて117位のバリン、及びバリンに代えて134位のアラニンを含む配列番号4で表される変異型T7RNAポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて119位のバリン、及びアスパラギン酸に代えて147位のアスパラギンを含む配列番号6で表される変異型T7RNAポリメラーゼ、
−ヒスチジンに代えて230位のアルギニン、及びアルギニンに代えて291位のシステインを含む配列番号8で表される変異型T7RNAポリメラーゼ、
−プロリンに代えて266位のロイシン、及びチロシンに代えて639位のフェニルアラニンを含む配列番号10で表される変異型T7RNAポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて810位のアスパラギンを含む配列番号12で表される変異型T7RNAポリメラーゼ、
−プロリンに代えて266位のロイシン、及びイソロイシンに代えて810位のアスパラギンを含む配列番号14で表される変異型T7RNAポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて119位のバリン、アスパラギン酸に代えて147位のアスパラギン、及びイソロイシンに代えて810位のアスパラギンを含む配列番号16で表される変異型T7RNAポリメラーゼ。
本発明は、また上記のファージ起源の変異型RNAポリメラーゼをコードしたヌクレオチド配列に関する。
それゆえ本発明のより特定の主題は、上記の配列番号2、4、6、8、10、12、14、16のたんぱく質配列をそれぞれコードする配列番号1、3、5、7、9、11、13、15のヌクレオチド配列、又は遺伝コードの縮重により上記のヌクレオチド配列から誘導され上記のたんぱく質をコードする性質を保持するヌクレオチド配列。
本発明の主題は、また上記のヌクレオチド配列を含むすべてのベクター、特にすべてのプラスミドである。
本発明の主題は、また上記ベクターで形質転換される全ての細胞、特に細菌(たとえば大腸菌)、酵母、又は高等真核生物から選ばれる該細胞である。
本発明は、またファージ起源の上記の変異型RNAポリメラーゼの調製のための全ての方法に関するものであって、適当な培養培地での上記の形質転換細胞の培養及び該細胞で生産されるRNAポリメラーゼの精製を含む。
本発明の主題は、また対象のRNAをインビトロ調製する全ての方法であって、適当な培地中で、上記の少なくとも一つの変異型RNAポリメラーゼ、対象の該RNAをコードするDNA配列を含む所定のヌクレオチド配列を結合し、転写を上記の野生型RNAポリメラーゼ及び変異型RNAポリメラーゼで認識されるプロモーターの制御下に行うことを含む方法。
本発明は、また対象のRNAをインビボ調製する全ての方法に関するものであって、ゲノムが対象の該RNAをコードするDNA配列を含む所定のヌクレオチド配列を含むように改変され、転写が上記の野生型RNAポリメラーゼ及び変異型RNAポリメラーゼで認識されるプロモーターの制御下で行われる本発明に記載の少なくとも一つのファージ起源の変異型RNAポリメラーゼを生産する該細胞の培養を含む方法。
本発明の主題は、また上記の細胞培養を含む対象のたんぱく質をインビボ調製する全ての方法であって、ゲノムが対象の該たんぱく質をコードするDNA配列を含む所定のヌクレオチド配列を含むように改変され、転写が上記の野生型RNAポリメラーゼ及び変異型RNAポリメラーゼで認識されるプロモーターの制御下で行われる本発明に記載の少なくとも一つのファージ起源の変異型RNAポリメラーゼを生産する該細胞の培養を含む方法。
有利的には、上記の対象のたんぱく質を調製するための全ての方法の実施の場合、細胞で生産される変異型RNAポリメラーゼは配列番号:12、14及び16から選ばれる。
本発明は、また対象のRNA又はたんぱく質をインビトロ又はインビボで調製するための全ての方法に関するものであって、さらに、Frugier等に記述の合成ポリアミンの添加の工程も含む。使用できるポリアミン間には、次のものが記述されている:
NH(CHNH(CH10NH(CHNH
NH(CHNH(CHNH(CH10NH(CHNH(CHNH
本発明では、さらに本発明記載のファージ起源の変異型RNAポリメラーゼの生産、及び野生型RNAポリメラーゼ使用での同じRNAs生産と比べた所定のRNAs生産の増大のためのそれらの使用について以下の詳細な記述を使って説明される。
バクテリオファージT7のRNAポリメラーゼは、通常、伸長工程では非常に進行的であるが、ITSの転写中においてはそのケースでない:この場合、初期転写は、未熟なまま放される(中断転写)可能性が高い。これは、酵素がITSを上手く転写し伸長工程に入る前に平均に果たしている中断サイクルの回数であり、これが完全転写の合成頻度を決定している。この回数は、ITSがバクテリオファージT7のクラスIII遺伝子の5′配列(‘共通の’ITS;5′GGGAGA...)に対応しているときが最小である。しかしながら、これらの条件でさえ、中断転写物は、全転写物の大部分(40%から60%)を構成する。この比率は、ITSが共通から除かれたり、又はRNAポリメラーゼが伸長率を減らす変異を有しITSの通過の必要時間を増加する時には非常に急激に増大する(Bonner et al., 1994; Bonner et al., 1992)。場合により非共通のITS及び遅いポリメラーゼの組み合わせは、酵素が中断工程のいつまでもループである状況に至り:そこから大転写物は合成されない。この特性は、T7RNAポリメラーゼを発現している大腸菌細胞において、インビトロだけではなくインビボにおいても観察される(Lopez et al., 1997; Makarova et al., 1995)。われわれが野生型酵素のそれよりITSの性質への感受性が少ない活性でT7RNAポリメラーゼの変異体を選択するために開発したのは後者の状況である。
われわれは、T7プロモーターの制御下に標的遺伝子を置いた、この発現は、非共通のITSにより先導され−lacZ遺伝子でその産物はΒガラクドシダーゼである−容易に検出可能である。この遺伝子は、それから触媒部位に変異のT7ポリメラーゼ(すなわち、‘遅い’ポリメラーゼ)をコードするプラスミドをさらに含む細菌細胞に導入される。上で示したように中断工程で妨げられるシステムでは大転写物を生産しない、それゆえにΒガラクドシダーゼを生産しない。しかしながら、プラスミドのランダム変異導入後に標的遺伝子を発現できる新変異の酵素を合成する細菌クローンを選択することは可能である。われわれは、触媒部位の初期変異の復帰変異以外で、触媒に関与していない酵素のN末端部分の変異体をこのようにして単離した。これら新変異が野生型酵素、すなわち触媒部位に変異のない野生型酵素に導入された時、我々はそれらがITSの厳格な性質への酵素の感受性を減らすことを観察した。これらが、本発明の主題を形成しここで、より特に記述される点変異P266Lである。実際、野生型酵素がほとんど動作しない鋳型で使用レベルの転写を可能とする。
詳細な記述
a)調整、精製及び保存
得られた点変異配列番号2は、T7ポリメラーゼ配列のプロリン266のロイシン(P266L)への変換に対応している。この変異型T7ポリメラーゼの遺伝子は、誘導プロモーター(pLac UV5)の制御下でpAR1219プラスミドに含まれる。このたんぱく質(ポリメラーゼ)は、大腸菌BL21(ompF−)で過剰発現される。抽出、精製及び精製たんぱく質の保存のプロトコールは、野生型ポリメラーゼのそれらと同一である。精製を促進するために、ポリメラーゼは、pBH161プラスミド(He et al., 1977)中の同等のコード配列に代えて変異領域を移すことにより6個のN末端ヒスチジンで標識される。この標識は決してポリメラーゼの触媒活性特性を改変しない。その後>90%の純粋たんぱく質を得るためにはニッケルアフィニティーカラムに細菌上清を通すことだけで十分である。−20℃での長期間(2年)の保存は、酵素特性を変えない。
b)触媒活性
野生型ポリメラーゼで使用される標準条件下でこの変異体は供給される全てのrNTPsをRNAにまた転換できる。しかしながら、この取り込みが実行される率は変異体でおおよそ3倍低い、すなわち完全転写には長時間を必要とする(たとえば、2時間に代わりに6時間)。
以下で言及するように、野生型ポリメラーゼと変異体間の主な区別は、得られるRNAsのサイズ作用としての分布レベル(それゆえ集団)で見出されることである。RNAの2つの型:中断RNA及び大RNAは、インビトロ転写の完了で観察できる。
われわれは、7箇所の非常に異なるITS上での野生型ポリメラーゼ及び変異体で得られたインビトロ転写の結果を以下で示す。鋳型は、プロモーターの下流31から71ntに位置する制限部位で線状化されたプラスミドDNAs(約6kbp)である。反応は、場合により10、20、又は30分で止められ、そして表示は、α32PGTP、α32PUTP、又はγ32PGTPである。使用された実験条件は、J. Mol. Biol. (1997) 269:41-51に記述されている。転写物は、高解像度の変性ポリアクリルアミドゲルで分離された。
G10(5′GGGAGACCA..33ntで線状化)は、共通のITSを保持する。事実、この場合の最初の30ヌクレオチドはT7ポリメラーゼでよりよく転写されるものの一つであるファージT7の遺伝子10配列に対応する。
GGLac(5′GGGGAAUU.69ntで線状化)は、T7転写を任意に抑制するためにLacリプレッサーの結合部位を含む市販プラスミドpET15b(ナルゲン)に見出されるITSを保持する。
Lac(5′GGAAUUG.30ntで線状化)は、前記のものと同等のプラスミドであり、その作動部位がプロモーターの2ヌクレオチド近づく。
TyrG(5′GUCUCGG.78ntで線状化)、Gly(5′ACUCUUU.71ntで線状化)、Tyr(5′CUCUCGG.78ntで線状化)、及びVal(5′GGUUUCG.31ntで線状化)は、tRNA又はtRNA断片のインビトロ合成に意図された鋳型に対応するプラスミドで転写困難である。
図1から7は、観察された中断RNAsを示す詳細な結果で、ITS G10(図1)、GGLac(図2)、TyrG(図3)、Lac(図4)、Gly(図5)、Tyr(図6)、Val(図7)の存在下、変異型RNAポリメラーゼ配列番号2使用の場合(またP266Lと指定し、灰色カラムを使って表示)及び野生型T7ポリメラーゼ使用の場合(またwtと指定し、黒カラムを使って表示)における全転写物数に対するそれらのパーセンテージ、同様に中断工程を逃れた長い転写物に対する同等図も示す。中断転写物は、2merと13mer間に分布している(X軸に沿った2から13で番号付けしている)。中断工程を逃れたポリメラーゼ由来の転写物は、長い転写物として同定されている(X軸に沿ったLT)。あまり十分とはいえない転写物を定量化できるように対数スケールがY軸で使われている。
これらの結果は、明らかに全ての場合で変異体は、5番目、6番目、そして7番目ヌクレオチド取り込みにおいて野生型ポリメラーゼより困難性が少ないことを示している。そして/又、もしこれらの位置でポリメラーゼがピリミジン(U又はC)を取りこまなければならないならば、野生型ポリメラーゼの中断率は上昇し、全てで変異体のハンディキャップ除去率がより大きくなる。
当座の結論が図8にまとめられている。これは、前記の結果を含み、次第に好ましくなくなるITSsに対する2つのポリメラーゼの生産性の比較の図である。示された値は、野生型T7ポリメラーゼ(wt,黒カラム)の使用の場合及び変異型RNAポリメラーゼ配列番号2(P266L、灰色カラム)使用の場合での大転写物へのrNTPの取り込みパーセンテージに対応して示してある。
2つのポリメラーゼが完全な履行を与えるG10及びGGLac以外では、他の全ての場合において野生型ポリメラーゼは低い収量、22%と1%間を含む非常に低い収量であるが、一方変異体のそれは30%と85%間を含む理にかなったままである。
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図1は、観察された中断RNAsを示す詳細な結果で、ITS G10の存在下、変異型RNAポリメラーゼ配列番号2使用の場合(またP266Lと指定し、灰色カラムを使って表示)及び野生型T7ポリメラーゼ使用の場合(またwtと指定し、黒カラムを使って表示)における全転写物数に対するそれらのパーセンテージ、同様に中断工程を逃れた長い転写物に対する同等図も示す。中断転写物は、2merと13mer間に分布している(X軸に沿った2から13で番号付けしている)。中断工程を逃れたポリメラーゼ由来の転写物は、長い転写物として同定されている(X軸に沿ったLT)。あまり十分とはいえない転写物を定量化できるように対数スケールがY軸で使われている。 図2は、観察された中断RNAsを示す詳細な結果で、ITS GGLacの存在下、変異型RNAポリメラーゼ配列番号2使用の場合(またP266Lと指定し、灰色カラムを使って表示)及び野生型T7ポリメラーゼ使用の場合(またwtと指定し、黒カラムを使って表示)における全転写物数に対するそれらのパーセンテージ、同様に中断工程を逃れた長い転写物に対する同等図も示す。中断転写物は、2merと13mer間に分布している(X軸に沿った2から13で番号付けしている)。中断工程を逃れたポリメラーゼ由来の転写物は、長い転写物として同定されている(X軸に沿ったLT)。あまり十分とはいえない転写物を定量化できるように対数スケールがY軸で使われている。 図3は、観察された中断RNAsを示す詳細な結果で、ITS TyrGの存在下、変異型RNAポリメラーゼ配列番号の2使用の場合(またP266Lと指定し、灰色カラムを使って表示)及び野生型T7ポリメラーゼ使用の場合(またwtと指定し、黒カラムを使って表示)における全転写物数に対するそれらのパーセンテージ、同様に中断工程を逃れた長い転写物に対する同等図も示す。中断転写物は、2merと13mer間に分布している(X軸に沿った2から13で番号付けしている)。中断工程を逃れたポリメラーゼ由来の転写物は、長い転写物として同定されている(X軸に沿ったLT)。あまり十分とはいえない転写物を定量化できるように対数スケールがY軸で使われている。 図4は、観察された中断RNAsを示す詳細な結果で、ITS Lacの存在下、変異型RNAポリメラーゼ配列番号2使用の場合(またP266Lと指定し、灰色カラムを使って表示)及び野生型T7ポリメラーゼ使用の場合(またwtと指定し、黒カラムを使って表示)における全転写物数に対するそれらのパーセンテージ、同様に中断工程を逃れた長い転写物に対する同等図も示す。中断転写物は、2merと13mer間に分布している(X軸に沿った2から13で番号付けしている)。中断工程を逃れたポリメラーゼ由来の転写物は、長い転写物として同定されている(X軸に沿ったLT)。あまり十分とはいえない転写物を定量化できるように対数スケールがY軸で使われている。 図5は、観察された中断RNAsを示す詳細な結果で、ITS Glyの存在下、変異型RNAポリメラーゼ配列番号2使用の場合(またP266Lと指定し、灰色カラムを使って表示)及び野生型T7ポリメラーゼ使用の場合(またwtと指定し、黒カラムを使って表示)における全転写物数に対するそれらのパーセンテージ、同様に中断工程を逃れた長い転写物に対する同等図も示す。中断転写物は、2merと13mer間に分布している(X軸に沿った2から13で番号付けしている)。中断工程を逃れたポリメラーゼ由来の転写物は、長い転写物として同定されている(X軸に沿ったLT)。あまり十分とはいえない転写物を定量化できるように対数スケールがY軸で使われている。 図6は、観察された中断RNAsを示す詳細な結果で、ITS Tyrの存在下、変異型RNAポリメラーゼ配列番号2使用の場合(またP266Lと指定し、灰色カラムを使って表示)及び野生型T7ポリメラーゼ使用の場合(またwtと指定し、黒カラムを使って表示)における全転写物数に対するそれらのパーセンテージ、同様に中断工程を逃れた長い転写物に対する同等図も示す。中断転写物は、2merと13mer間に分布している(X軸に沿った2から13で番号付けしている)。中断工程を逃れたポリメラーゼ由来の転写物は、長い転写物として同定されている(X軸に沿ったLT)。あまり十分とはいえない転写物を定量化できるように対数スケールがY軸で使われている。 図7は、観察された中断RNAsを示す詳細な結果で、ITS Valの存在下、変異型RNAポリメラーゼ配列番号2使用の場合(またP266Lと指定し、灰色カラムを使って表示)及び野生型T7ポリメラーゼ使用の場合(またwtと指定し、黒カラムを使って表示)における全転写物数に対するそれらのパーセンテージ、同様に中断工程を逃れた長い転写物に対する同等図も示す。中断転写物は、2merと13mer間に分布している(X軸に沿った2から13で番号付けしている)。中断工程を逃れたポリメラーゼ由来の転写物は、長い転写物として同定されている(X軸に沿ったLT)。あまり十分とはいえない転写物を定量化できるように対数スケールがY軸で使われている。 図8は、前記の結果を含み、次第に好ましくなくなるITSsに対する2つのポリメラーゼの生産性の比較の図である。示された値は、野生型T7ポリメラーゼ(wt,黒カラム)の使用場合及び変異型RNAポリメラーゼ配列番号2(P266L、灰色カラム)使用場合での大転写物へのrNTPの取り込みパーセンテージに対応して示してある。
配列表
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Claims (13)

  1. ファージ起源の変異型RNAポリメラーゼは、野生型T7RNAポリメラーゼの266位のプロリンがロイシンに置換された変異型T7RNAポリメラーゼ、または、野生型RNAポリメラーゼの相同位置に位置するプロリンが置換された変異型RNAポリメラーゼであって、野生型T3RNAポリメラーゼの267位のプロリンがロイシンに置換された変異型T3RNAポリメラーゼ、野生型のK11RNAポリメラーゼの289位のプロリンがロイシンに置換された変異型K11RNAポリメラーゼおよび野生型SP6RNAポリメラーゼの239位のプロリンがロイシンに置換された変異型SP6RNAポリメラーゼからなる群から選択された変異型RNAポリメラーゼ、から選択され、対象のRNA又はこのRNAにコードされるたんぱく質の生産の方法の実施のために、対象の該RNAをコードするDNA配列を含む所定のヌクレオチド配列から始まり、この転写は、上記野生型RNAポリメラーゼ及び変異型RNAポリメラーゼにより認識されるプロモーター制御下にあり、該方法は、対象の該RNAをコードするDNA配列に含まれるものと同じ非共通のITS存在下で野生型RNAポリメラーゼの使用場合に得られる収量より多い該RNA生産収量を有する、ファージ起源の変異型RNAポリメラーゼの使用。
  2. 対象のRNAの収量が、野生型RNAポリメラーゼを使用した場合に得られる収量のおおよそ10倍まで多い、対象のRNAの生産方法の実施のための請求項1記載の使用。
  3. プロリンに代えて266位のロイシンを含む配列番号2で表される変異型T7RNAポリメラーゼの請求項1または2記載の使用。
  4. 請求項1〜3のいずれか1項に記載のファージ起源の変異型RNAポリメラーゼを調製するための方法であって
    該方法は:
    −該野生型RNAポリメラーゼをコードする遺伝子の少なくとも1つのコドンの置換によるファージ起源の野生型RNAポリメラーゼのペプチド鎖の改変及び上記の改変遺伝子を含むベクターによる大腸菌のような適当な細胞の形質転換、及び、上記RNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターの下流に挿入されかつマーカーをコードするヌクレオチド配列、ここで該マーカーは抗生物質への耐性のマーカーであるか、または色原性マーカーであり、該プロモーターとマーカーをコードする配列はITSにより分離されている、を含む工程、
    −大腸菌のような適当な細胞内、特に前述の細胞内での特定のマーカーの生産収量が同じ条件下で野生型RNAポリメラーゼの使用で得られるこの同じマーカーの生産収量より多い上述の変異型RNAポリメラーゼを生産する細胞を検出する工程
    −前工程で検出された細胞からの上記の変異型RNAポリメラーゼの精製工程、
    を含む方法。
  5. 野生型T7RNAポリメラーゼの266位のプロリンがロイシンに置換された変異型T7RNAポリメラーゼ、または、野生型RNAポリメラーゼの相同位置に位置するプロリンが置換された変異型RNAポリメラーゼであって、野生型T3RNAポリメラーゼの267位のプロリンがロイシンに置換された変異型T3RNAポリメラーゼ、野生型のK11RNAポリメラーゼの289位のプロリンがロイシンに置換された変異型K11RNAポリメラーゼおよび野生型SP6RNAポリメラーゼの239位のプロリンがロイシンに置換された変異型SP6RNAポリメラーゼからなる群から選択された変異型RNAポリメラーゼ、から選択された、請求項4記載の方法によって得られた変異型RNAポリメラーゼ
  6. プロリンに代えて266位のロイシンを含む配列番号2で表される、請求項5記載の変異型T7RNAポリメラーゼ。
  7. 請求項4記載の方法によって得られた変異型RNAポリメラーゼまたは請求項5または6記載の変異型RNAポリメラーゼをコードする核酸分子であって、
    配列番号2のたんぱく質配列をコードする配列番号1のヌクレオチド配列、又は遺伝コードの縮重により上記のヌクレオチド配列から誘導され、上記のたんぱく質をコードする特性を保持する全てのヌクレオチド配列から選択される核酸分子
  8. 請求項記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
  9. 請求項記載のベクターにより形質転換された細胞。
  10. 対象のRNAをインビトロ調製するための方法であって、適当な培地中で請求項4記載の方法によって得られた少なくとも一つの変異型RNAポリメラーゼまたは請求項5または6記載の少なくとも一つの変異型RNAポリメラーゼと対象の該RNAをコードするDNA配列を含む所定のヌクレオチド配列を結合し転写を上記の野生型RNAポリメラーゼ及び変異型RNAポリメラーゼで認識されるプロモーターの制御下に行うことを含む方法。
  11. 対象のRNAをインビボ調製するための方法であって、ゲノムが対象の該RNAをコードするDNA配列を含む所定のヌクレオチド配列を含むように改変され、転写が上記の野生型RNAポリメラーゼ及び変異型RNAポリメラーゼで認識されるプロモーターの制御下で行われる、請求項4記載の方法によって得られた少なくとも1つの変異型RNAポリメラーゼまたは請求項5または6記載の少なくとも1つの変異型RNAポリメラーゼを生産する請求項記載の細胞の培養を含む方法。
  12. 対象のたんぱく質をインビボ調製するための方法であって、ゲノムが対象の該たんぱく質をコードするDNA配列を含む所定のヌクレオチド配列を含むように改変され、転写が上記の野生型RNAポリメラーゼ及び変異型RNAポリメラーゼで認識されるプロモーターの制御下行われる、請求項4記載の方法によって得られた少なくとも1つの変異型RNAポリメラーゼまたは請求項5または6記載の少なくとも1つの変異型RNAポリメラーゼを生産する請求項記載の細胞の培養を含む方法。
  13. 請求項10から12のいずれか1項記載の対象のRNA又はたんぱく質をインビトロ又はインビボで調製するための方法であって、合成ポリアミンの添加の工程も含む方法。
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