JPH0956383A - 変異型ウリカーゼ、変異型ウリカーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び変異型ウリカーゼの製造法 - Google Patents
変異型ウリカーゼ、変異型ウリカーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び変異型ウリカーゼの製造法Info
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- JPH0956383A JPH0956383A JP7216239A JP21623995A JPH0956383A JP H0956383 A JPH0956383 A JP H0956383A JP 7216239 A JP7216239 A JP 7216239A JP 21623995 A JP21623995 A JP 21623995A JP H0956383 A JPH0956383 A JP H0956383A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
- C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 配列番号１で表される野生型ウリカーゼ
のアミノ酸配列のうち、第165〜170位のアミノ酸が変異
したアミノ酸配列を含む変異型ウリカーゼ、該ウリカー
ゼをコードする変異型ウリカーゼ遺伝子、該変異型ウリ
カーゼ遺伝子がベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え
体ＤＮＡ、該組み換え体ＤＮＡを含み、変異型ウリカー
ゼ生産能を有する微生物を培地に培養し、得られる培養
物から変異型ウリカーゼを採取することを特徴とする変
異型ウリカーゼの製造方法。 【効果】 本発明により、安定な変異型ウリカーゼ及び
該変異型ウリカーゼをコードする遺伝子が提供される。
のアミノ酸配列のうち、第165〜170位のアミノ酸が変異
したアミノ酸配列を含む変異型ウリカーゼ、該ウリカー
ゼをコードする変異型ウリカーゼ遺伝子、該変異型ウリ
カーゼ遺伝子がベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え
体ＤＮＡ、該組み換え体ＤＮＡを含み、変異型ウリカー
ゼ生産能を有する微生物を培地に培養し、得られる培養
物から変異型ウリカーゼを採取することを特徴とする変
異型ウリカーゼの製造方法。 【効果】 本発明により、安定な変異型ウリカーゼ及び
該変異型ウリカーゼをコードする遺伝子が提供される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、変異型ウリカー
ゼ、変異型ウリカーゼ遺伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ
及び変異型ウリカーゼの製造法に関する。
ゼ、変異型ウリカーゼ遺伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ
及び変異型ウリカーゼの製造法に関する。
【０００２】
ウリカーゼは次式： 尿酸＋O2＋2H2O → アラントイン＋H2O2＋CO2 で示される反応を触媒する酵素である。そして、該酵素
の触媒作用によって生成する過酸化水素を定量すること
により、血清中又は尿中の尿酸を簡便かつ特異的に定量
することができるため、ウリカーゼは臨床診断分野にお
いて極めて有用な酵素である。
の触媒作用によって生成する過酸化水素を定量すること
により、血清中又は尿中の尿酸を簡便かつ特異的に定量
することができるため、ウリカーゼは臨床診断分野にお
いて極めて有用な酵素である。
【０００３】従来、ウリカーゼは、例えば、キャンディ
ダ・ウチリス由来のウリカーゼ遺伝子をベクターＤＮＡ
に挿入した組み換え体ＤＮＡを含むエッシェリシア属に
属する微生物を培地に培養し、得られる培養物よりウリ
カーゼを採取することにより製造されている（特開平5-
317055号公報）。しかしながら、上記製造法により得ら
れるウリカーゼは、酸化安定性及び熱安定性が欠如する
ため、試薬として保存した場合、失活しやすいという欠
点があった。従って、物理的、化学的に安定なウリカー
ゼの開発が望まれていた。
ダ・ウチリス由来のウリカーゼ遺伝子をベクターＤＮＡ
に挿入した組み換え体ＤＮＡを含むエッシェリシア属に
属する微生物を培地に培養し、得られる培養物よりウリ
カーゼを採取することにより製造されている（特開平5-
317055号公報）。しかしながら、上記製造法により得ら
れるウリカーゼは、酸化安定性及び熱安定性が欠如する
ため、試薬として保存した場合、失活しやすいという欠
点があった。従って、物理的、化学的に安定なウリカー
ゼの開発が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は物理的、化学
的に安定な変異型ウリカーゼ、該変異型ウリカーゼをコ
ードする遺伝子、該遺伝子が組み込まれた組換え体及び
変異型ウリカーゼの製造方法を提供することを目的とす
る。
的に安定な変異型ウリカーゼ、該変異型ウリカーゼをコ
ードする遺伝子、該遺伝子が組み込まれた組換え体及び
変異型ウリカーゼの製造方法を提供することを目的とす
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
に基づいて種々検討した結果、野生型ウリカーゼにおけ
る特定のアミノ酸の周辺のアミノ酸配列を、特定の配列
に変異させることにより、上記課題を解決し得ることを
見い出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、配
列番号１で表される野生型ウリカーゼのアミノ酸配列の
うち、第１６５位〜第１７０位のアミノ酸が変異したア
ミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする変異型ウリ
カーゼ遺伝子である。かかる変異したアミノ酸配列とし
ては、配列番号２で表わされるものが挙げられる。
に基づいて種々検討した結果、野生型ウリカーゼにおけ
る特定のアミノ酸の周辺のアミノ酸配列を、特定の配列
に変異させることにより、上記課題を解決し得ることを
見い出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、配
列番号１で表される野生型ウリカーゼのアミノ酸配列の
うち、第１６５位〜第１７０位のアミノ酸が変異したア
ミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする変異型ウリ
カーゼ遺伝子である。かかる変異したアミノ酸配列とし
ては、配列番号２で表わされるものが挙げられる。
【０００６】さらに、本発明は、前記変異型ウリカーゼ
遺伝子がベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え体ＤＮ
Ａである。さらに、本発明は、前記組み換え体ＤＮＡを
含み、変異型ウリカーゼ生産能を有するエッシェリシア
属に属する微生物を培地に培養し、得られる培養物から
変異型ウリカーゼを採取することを特徴とする変異型ウ
リカーゼの製造方法である。
遺伝子がベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え体ＤＮ
Ａである。さらに、本発明は、前記組み換え体ＤＮＡを
含み、変異型ウリカーゼ生産能を有するエッシェリシア
属に属する微生物を培地に培養し、得られる培養物から
変異型ウリカーゼを採取することを特徴とする変異型ウ
リカーゼの製造方法である。
【０００７】さらに、本発明は、配列番号１で表される
野生型ウリカーゼのアミノ酸配列のうち、第１６５位〜
第１７０位のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を含む変
異型ウリカーゼである。ここで、変異したアミノ酸配列
としては、配列番号２で表わされるものが挙げられる。
以下、本発明を詳細に説明する。
野生型ウリカーゼのアミノ酸配列のうち、第１６５位〜
第１７０位のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を含む変
異型ウリカーゼである。ここで、変異したアミノ酸配列
としては、配列番号２で表わされるものが挙げられる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】本発明の変異型ウリカーゼは、配列番号１
で表される野生型ウリカーゼのアミノ酸配列のうち、第
165位〜第170位のアミノ酸が変異されたものである。本
発明において、変異とは、目的とするウリカーゼ活性が
得られる限り、上記第165位〜第170位のそれぞれの位置
に示されるアミノ酸配列が、該アミノ酸配列とは異なる
アミノ酸に置換され、欠失され、又は挿入されてもよい
ことを意味する。例えば、野生型ウリカーゼの第165位
のアミノ酸がチロシン、第166位のアミノ酸がアスパラ
ギンであれば、本発明の変異型ウリカーゼは第165位の
アミノ酸についてはチロシン以外、第166位のアミノ酸
についてはアスパラギン以外の19種類のアミノ酸のいず
れかに置換されてもよく、チロシンやアスパラギンが欠
失してもよく、チロシンとアスパラギンとの間にいずれ
かのアミノ酸が挿入されていてもよいことを意味する。
第167位〜第170位のアミノ酸についても同様である。
で表される野生型ウリカーゼのアミノ酸配列のうち、第
165位〜第170位のアミノ酸が変異されたものである。本
発明において、変異とは、目的とするウリカーゼ活性が
得られる限り、上記第165位〜第170位のそれぞれの位置
に示されるアミノ酸配列が、該アミノ酸配列とは異なる
アミノ酸に置換され、欠失され、又は挿入されてもよい
ことを意味する。例えば、野生型ウリカーゼの第165位
のアミノ酸がチロシン、第166位のアミノ酸がアスパラ
ギンであれば、本発明の変異型ウリカーゼは第165位の
アミノ酸についてはチロシン以外、第166位のアミノ酸
についてはアスパラギン以外の19種類のアミノ酸のいず
れかに置換されてもよく、チロシンやアスパラギンが欠
失してもよく、チロシンとアスパラギンとの間にいずれ
かのアミノ酸が挿入されていてもよいことを意味する。
第167位〜第170位のアミノ酸についても同様である。
【０００９】次に、本発明の変異型ウリカーゼ遺伝子に
ついて説明する。本発明の変異型ウリカーゼ遺伝子は、
前記変異型ウリカーゼをコードする遺伝子であり、遺伝
子工学的手法により得ることができる。本発明の変異型
ウリカーゼを得るにあたり、まず、野生型ウリカーゼの
遺伝子及びその組換え体ＤＮＡを調製する。野生型ウリ
カーゼの遺伝子は、如何なるものでも用いることが可能
である。例えば、Candida属に属する微生物等由来のも
のを用いることができる。
ついて説明する。本発明の変異型ウリカーゼ遺伝子は、
前記変異型ウリカーゼをコードする遺伝子であり、遺伝
子工学的手法により得ることができる。本発明の変異型
ウリカーゼを得るにあたり、まず、野生型ウリカーゼの
遺伝子及びその組換え体ＤＮＡを調製する。野生型ウリ
カーゼの遺伝子は、如何なるものでも用いることが可能
である。例えば、Candida属に属する微生物等由来のも
のを用いることができる。
【００１０】野生型ウリカーゼ遺伝子等は、既知の方法
に従って調製される。例えば、野生型ウリカーゼ遺伝子
及びその組み換え体ＤＮＡは、キャンディダ・ウチリス
（Candida utilis）ATCC9950株を遺伝子源として、当該
菌株からクローニング（特開平5-317055号公報参照）す
ることにより調製することができる。次に、野生型ウリ
カーゼ遺伝子の変異処理を行う。かかる変異処理は、企
図する前記変異形態に応じ、公知のいずれかの方法で行
なうことができる。すなわち、野生型ウリカーゼ遺伝子
又は当該遺伝子の組み込まれた組み換え体ＤＮＡと変異
原となる薬剤とを接触・作用させる方法、紫外線照射
法、遺伝子工学的手法、又は蛋白質工学的手法を駆使す
る方法等を広く用いることができる。
に従って調製される。例えば、野生型ウリカーゼ遺伝子
及びその組み換え体ＤＮＡは、キャンディダ・ウチリス
（Candida utilis）ATCC9950株を遺伝子源として、当該
菌株からクローニング（特開平5-317055号公報参照）す
ることにより調製することができる。次に、野生型ウリ
カーゼ遺伝子の変異処理を行う。かかる変異処理は、企
図する前記変異形態に応じ、公知のいずれかの方法で行
なうことができる。すなわち、野生型ウリカーゼ遺伝子
又は当該遺伝子の組み込まれた組み換え体ＤＮＡと変異
原となる薬剤とを接触・作用させる方法、紫外線照射
法、遺伝子工学的手法、又は蛋白質工学的手法を駆使す
る方法等を広く用いることができる。
【００１１】上記変異処理に用いられる変異原となる薬
剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、N-メチル-
N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)、亜硝酸、亜硫
酸、ヒドラジン、蟻酸、5-ブロモウラシル等を挙げるこ
とができる。この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の
種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所
望の変異を野生型ウリカーゼ遺伝子において惹起するこ
とができる限り特に限定されない。通常、好ましくは0.
5〜l2Mの上記薬剤濃度において、20〜80℃の反応温度下
で10分間以上、好ましくは10〜l80分間接触・作用させ
ることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を
行なう場合においても、上記の通り常法に従うことがで
きる（現代化学、pp24〜30、1989年6月号）。
剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、N-メチル-
N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)、亜硝酸、亜硫
酸、ヒドラジン、蟻酸、5-ブロモウラシル等を挙げるこ
とができる。この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の
種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所
望の変異を野生型ウリカーゼ遺伝子において惹起するこ
とができる限り特に限定されない。通常、好ましくは0.
5〜l2Mの上記薬剤濃度において、20〜80℃の反応温度下
で10分間以上、好ましくは10〜l80分間接触・作用させ
ることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を
行なう場合においても、上記の通り常法に従うことがで
きる（現代化学、pp24〜30、1989年6月号）。
【００１２】蛋白質工学的手法を駆使する方法として
は、一般的に、部位特異的変異（SiteSpecific Mutagen
esis ）として知られる手法を用いることができる。例
えば、Kramer法〔Kramer,W. et al., Nucl. Acids Re
s., vol. 12, pp9441-9456 (1984): Kramer,W. et al.,
Methods in Enzymol., vol. 154, pp350-367 (1987):
Bauer, C.E. et al., Gene, vol. 37, pp73-81 (1985),
vol. 37, pp73-81(l985)〕、 Eckstein法〔Taylor, J.
W. et al., Nucleic Acids Res. vol. 13, pp8749-8764
(l985): Taylor, J. W. et al., Nucleic Acids Res. v
ol. 13, pp8765-8785(l985): Nakamaye,K.,et al., Nu
cleic Acids Res. vol. 14, pp9679-9698(1986)〕、Kun
kel法〔Kunkel. T. A., Proc. Natl. Acad. Sci., vol.
82, pp488-492（1985）: Kunkel, T. A., et al., Met
hods Enzymol.,vol.154, pp367-382(1987)〕等が挙げら
れる。
は、一般的に、部位特異的変異（SiteSpecific Mutagen
esis ）として知られる手法を用いることができる。例
えば、Kramer法〔Kramer,W. et al., Nucl. Acids Re
s., vol. 12, pp9441-9456 (1984): Kramer,W. et al.,
Methods in Enzymol., vol. 154, pp350-367 (1987):
Bauer, C.E. et al., Gene, vol. 37, pp73-81 (1985),
vol. 37, pp73-81(l985)〕、 Eckstein法〔Taylor, J.
W. et al., Nucleic Acids Res. vol. 13, pp8749-8764
(l985): Taylor, J. W. et al., Nucleic Acids Res. v
ol. 13, pp8765-8785(l985): Nakamaye,K.,et al., Nu
cleic Acids Res. vol. 14, pp9679-9698(1986)〕、Kun
kel法〔Kunkel. T. A., Proc. Natl. Acad. Sci., vol.
82, pp488-492（1985）: Kunkel, T. A., et al., Met
hods Enzymol.,vol.154, pp367-382(1987)〕等が挙げら
れる。
【００１３】また、上記遺伝子改変法の他に、有機合成
法又は酵素合成法により、直接所望の改変ウリカーゼ遺
伝子を合成し得ることはもちろんである。上記方法によ
り得られる所望のウリカーゼ遺伝子の塩基配列の決定・
確認は、例えばマキサムーキルバートの化学惨飾法〔Ma
xam and Gilbert, Methods in Enzymol., vol. 65, pp4
99‐560（1980）〕やM13ファージを用いるジデオキシヌ
クレオチド鎖終結法〔Messing, et al. Gene, voI. 19,
pp269-276 (1982)〕等により行なうことができる。
法又は酵素合成法により、直接所望の改変ウリカーゼ遺
伝子を合成し得ることはもちろんである。上記方法によ
り得られる所望のウリカーゼ遺伝子の塩基配列の決定・
確認は、例えばマキサムーキルバートの化学惨飾法〔Ma
xam and Gilbert, Methods in Enzymol., vol. 65, pp4
99‐560（1980）〕やM13ファージを用いるジデオキシヌ
クレオチド鎖終結法〔Messing, et al. Gene, voI. 19,
pp269-276 (1982)〕等により行なうことができる。
【００１４】以上の変異手法により、野生型ウリカーゼ
のアミノ酸配列のうち、第１６５位〜第１７０位のアミ
ノ酸が変異したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
ドする変異型ウリカーゼ遺伝子を得ることができる。第
１６５位〜第１７０位のアミノ酸が変異したアミノ酸配
列としては、例えば、配列番号２で表されるものが挙げ
られる。なお、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の
中には同一のアミノ酸をコードする２種以上のコドン
（縮重コドン）も含まれる。
のアミノ酸配列のうち、第１６５位〜第１７０位のアミ
ノ酸が変異したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
ドする変異型ウリカーゼ遺伝子を得ることができる。第
１６５位〜第１７０位のアミノ酸が変異したアミノ酸配
列としては、例えば、配列番号２で表されるものが挙げ
られる。なお、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の
中には同一のアミノ酸をコードする２種以上のコドン
（縮重コドン）も含まれる。
【００１５】上述の如くして得られた変異型ウリカーゼ
遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミ
ド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いら
れるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクタ
ーに対応する宿主を常法により、形質転換・形質導入を
することができる。ここで用いられる宿主としては、エ
ッシェリシア属に属する微生物、例えば大腸菌（E.col
i）JMl01（ATCC33876）、大腸菌（E.coli）DＨl（ATCC3
3849）、大腸菌（E.coli）HB10l（ATCC33694）、大腸菌
（E.coli）XL1-blue（フナコシより購入）等が挙げら
れ、これらの微生物を選択する場合には、ハナハン（Ha
nahan）の方法〔ディーエヌエー・クローニング（DNA C
loning）、第l巻、第l09〜135頁（l985）〕等により形
質転換するか、又は〔モレキュラー・クローニング（Mo
lecular Cloning）、第256〜268頁、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor L
aboratory）（1982）〕記載の方法等により形質導入す
ることにより形質転換株又は形質導入株を得ることが可
能である。
遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミ
ド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いら
れるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクタ
ーに対応する宿主を常法により、形質転換・形質導入を
することができる。ここで用いられる宿主としては、エ
ッシェリシア属に属する微生物、例えば大腸菌（E.col
i）JMl01（ATCC33876）、大腸菌（E.coli）DＨl（ATCC3
3849）、大腸菌（E.coli）HB10l（ATCC33694）、大腸菌
（E.coli）XL1-blue（フナコシより購入）等が挙げら
れ、これらの微生物を選択する場合には、ハナハン（Ha
nahan）の方法〔ディーエヌエー・クローニング（DNA C
loning）、第l巻、第l09〜135頁（l985）〕等により形
質転換するか、又は〔モレキュラー・クローニング（Mo
lecular Cloning）、第256〜268頁、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor L
aboratory）（1982）〕記載の方法等により形質導入す
ることにより形質転換株又は形質導入株を得ることが可
能である。
【００１６】そして、上記菌株より変異型ウリカーゼ生
産能を有する菌株をスクリーニングすることにより、目
的とする形質転換体、すなわち、変異型ウリカーゼ遺伝
子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含
み、変異型ウリカーゼ生産能を有するエッシェリシア属
に属する菌株を得ることができる。このようにして得ら
れた菌株より純化された新規な組み換え体ＤＮＡを得る
には、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology
(WILEY Interscience, 1989) unit 1. 7 等により得る
ことができる。
産能を有する菌株をスクリーニングすることにより、目
的とする形質転換体、すなわち、変異型ウリカーゼ遺伝
子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含
み、変異型ウリカーゼ生産能を有するエッシェリシア属
に属する菌株を得ることができる。このようにして得ら
れた菌株より純化された新規な組み換え体ＤＮＡを得る
には、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology
(WILEY Interscience, 1989) unit 1. 7 等により得る
ことができる。
【００１７】そして、このようにして得られた組み換え
体ＤＮＡより変異型ウリカーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ
を得るには、例えば、該プラスミドＤＮＡに制限酵素、
例えばEcoRIを温度30〜40℃、好ましくは37℃程度で１
〜24時間、好ましくは２時間程度作用させて、反応終了
液をアガロースゲル電気泳動法〔モレキュラー・クロー
ニング（Molecular Cloning）、第150頁、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harb
or Laboratory）(1982)記載〕で処理することにより得
ることができる。
体ＤＮＡより変異型ウリカーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ
を得るには、例えば、該プラスミドＤＮＡに制限酵素、
例えばEcoRIを温度30〜40℃、好ましくは37℃程度で１
〜24時間、好ましくは２時間程度作用させて、反応終了
液をアガロースゲル電気泳動法〔モレキュラー・クロー
ニング（Molecular Cloning）、第150頁、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harb
or Laboratory）(1982)記載〕で処理することにより得
ることができる。
【００１８】次に、本発明の変異型ウリカーゼの製造方
法について説明する。本発明の変異型ウリカーゼは、上
記のようにして得られた形質転換体を培養し、得られる
培養物からウリカーゼを精製することにより得られる。
培養方法は通常の固体培養法で培養してもよいが、液体
培養法を採用して培養するのが好ましい。
法について説明する。本発明の変異型ウリカーゼは、上
記のようにして得られた形質転換体を培養し、得られる
培養物からウリカーゼを精製することにより得られる。
培養方法は通常の固体培養法で培養してもよいが、液体
培養法を採用して培養するのが好ましい。
【００１９】上記菌株を培養する培地としては、例え
ば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コ
ーンスティープリカー又は大豆若しくは小麦ふすまの浸
出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸
第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄又は硫
酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要
により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが挙げ
られる。
ば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コ
ーンスティープリカー又は大豆若しくは小麦ふすまの浸
出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸
第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄又は硫
酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要
により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが挙げ
られる。
【００２０】なお、培地の初発pHは、pH７〜９に調整す
るのが適当である。また培養時間は30〜42℃、好ましく
は37℃前後で４〜24時間、好ましくは６〜20時間であ
り、通気撹拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実
施するのが好ましい。培養終了後、該培養物より変異型
ウリカーゼを採取するには、通常の酵素精製手段を用い
て得ることができる。例えば、常法により菌体を超音波
破壊処理、磨砕処理等するか、または、リゾチーム等の
溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン
等の存在下で振盪もしくは放置して自己消化を行なわせ
本酵素を菌体外に排出させることができる。
るのが適当である。また培養時間は30〜42℃、好ましく
は37℃前後で４〜24時間、好ましくは６〜20時間であ
り、通気撹拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実
施するのが好ましい。培養終了後、該培養物より変異型
ウリカーゼを採取するには、通常の酵素精製手段を用い
て得ることができる。例えば、常法により菌体を超音波
破壊処理、磨砕処理等するか、または、リゾチーム等の
溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン
等の存在下で振盪もしくは放置して自己消化を行なわせ
本酵素を菌体外に排出させることができる。
【００２１】そして、この溶液を濾過、遠心分離などし
て固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫
酸塩、プロタミン硫酸塩、硫酸マンガン等を添加して核
酸を除去する。次いで、これに硫安、アルコール、アセ
トン等を添加して分画し、沈殿物を採取し、粗酵素液を
得る。該粗酵素液を各種クロマトグラフィー、電気泳動
等にかけて精製酵素標品を得る。例えばセファデック
ス、ウルトロゲルもしくはバイオゲル等を用いるゲル濾
過法、イオン交換体を用いる吸着溶出法、ポリアクリル
アミドゲル等を用いる電気泳動法、ヒドロキシアパタイ
トを用いる吸着溶出法、蔗糖密度勾配遠心法等の沈降
法、アフィニティクロマト法、分子ふるい膜若しくは中
空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又は、これら
を組合わせて実施することにより、精製された酵素標品
を得ることが出来る。
て固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫
酸塩、プロタミン硫酸塩、硫酸マンガン等を添加して核
酸を除去する。次いで、これに硫安、アルコール、アセ
トン等を添加して分画し、沈殿物を採取し、粗酵素液を
得る。該粗酵素液を各種クロマトグラフィー、電気泳動
等にかけて精製酵素標品を得る。例えばセファデック
ス、ウルトロゲルもしくはバイオゲル等を用いるゲル濾
過法、イオン交換体を用いる吸着溶出法、ポリアクリル
アミドゲル等を用いる電気泳動法、ヒドロキシアパタイ
トを用いる吸着溶出法、蔗糖密度勾配遠心法等の沈降
法、アフィニティクロマト法、分子ふるい膜若しくは中
空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又は、これら
を組合わせて実施することにより、精製された酵素標品
を得ることが出来る。
【００２２】なお、精製された変異型ウリカーゼが目的
とする変異を有するアミノ酸配列を有するか否かの確認
は、公知のアミノ酸分析、例えばエドマン分解法による
自動アミノ酸配列決定法等により行うことができる。ま
た、変異型ウリカーゼと野生型ウリカーゼとの活性の比
較については、上記で得られた酵素液を60℃、15分間加
熱処理した後の残存ウリカーゼ活性を指標として行うこ
とができる。
とする変異を有するアミノ酸配列を有するか否かの確認
は、公知のアミノ酸分析、例えばエドマン分解法による
自動アミノ酸配列決定法等により行うことができる。ま
た、変異型ウリカーゼと野生型ウリカーゼとの活性の比
較については、上記で得られた酵素液を60℃、15分間加
熱処理した後の残存ウリカーゼ活性を指標として行うこ
とができる。
【００２３】
１．組み換え体プラスミドDNApUO1001の作製 特開平5-317055公報記載の組み換え体プラスミドDNApUO
X101（FERM BP-3842として寄託済み）を制限酵素BalI及
びEcoRIで切断後、アガロース電気泳動法により約700bp
のＤＮＡ断片を採取し、HincII及びEcoRIで切断したpUC
119に挿入し、組み換え体プラスミドDNApUO1001を作製
した。なお、大腸菌JM109（pUOX101）野生型のウリカー
ゼ遺伝子の塩基配列を配列番号３に、また、この遺伝子
から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号
１にそれぞれ示した。
X101（FERM BP-3842として寄託済み）を制限酵素BalI及
びEcoRIで切断後、アガロース電気泳動法により約700bp
のＤＮＡ断片を採取し、HincII及びEcoRIで切断したpUC
119に挿入し、組み換え体プラスミドDNApUO1001を作製
した。なお、大腸菌JM109（pUOX101）野生型のウリカー
ゼ遺伝子の塩基配列を配列番号３に、また、この遺伝子
から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号
１にそれぞれ示した。
【００２４】２．変異型ウリカーゼの取得 組み換え体プラスミドDNApUO1001で大腸菌（E.coli）CJ
236（BIO-RAD社より購入）を形質転換し、常法に従い組
み換え体プラスミドDNApUO1001の一本鎖ＤＮＡを取得し
た。この一本鎖ＤＮＡを鋳型にし、配列番号４で表され
る塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、
BIO-RAD社製のミュータジェン in vitroミュータジェネ
シスキット（Muta-Gene in vitro mutagenesis kit）を
使用して部位特異的変異を行なった。
236（BIO-RAD社より購入）を形質転換し、常法に従い組
み換え体プラスミドDNApUO1001の一本鎖ＤＮＡを取得し
た。この一本鎖ＤＮＡを鋳型にし、配列番号４で表され
る塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、
BIO-RAD社製のミュータジェン in vitroミュータジェネ
シスキット（Muta-Gene in vitro mutagenesis kit）を
使用して部位特異的変異を行なった。
【００２５】得られた変異型ＤＮＡで大腸菌XL1-Blue
〔フナコシ（株）より入手〕を形質転換した。得られた
形質転換株より、常法に従い、組み換え体プラスミドDN
ApUO1002を調製した。pUO1002を制限酵素BstXI及びXhoI
で切断した後、アガロースゲル電気泳動により310 bpの
ＤＮＡ断片を取得し、BstXI及びXhoIで切断したpUOX101
に挿入し、大腸菌XL1-Blueを形質転換した。得られたプ
ラスミドＤＮＡをpUOX101βとした。得られた大腸菌XL1
-Blue（pUOX101β）は、工業技術院生命工学工業技術研
究所にFERM BP-5204として寄託されている。
〔フナコシ（株）より入手〕を形質転換した。得られた
形質転換株より、常法に従い、組み換え体プラスミドDN
ApUO1002を調製した。pUO1002を制限酵素BstXI及びXhoI
で切断した後、アガロースゲル電気泳動により310 bpの
ＤＮＡ断片を取得し、BstXI及びXhoIで切断したpUOX101
に挿入し、大腸菌XL1-Blueを形質転換した。得られたプ
ラスミドＤＮＡをpUOX101βとした。得られた大腸菌XL1
-Blue（pUOX101β）は、工業技術院生命工学工業技術研
究所にFERM BP-5204として寄託されている。
【００２６】３．変異株の性質 このようにして得られた大腸菌XL1-Blue（pUOX101β）
を、１mM IPTG、100μg/mlアンピシリンを添加したＴＹ
培地〔１％(W/V)トリプトン、0.5％(W/V)酵母エキス、
0.5％(W/V)食塩〕で、37℃で20時間培養後、超音波破砕
して遠心分離し粗酵素液を調製した。このようにして調
製した粗酵素液0.1mlをエッペンドルフチューブにと
り、60℃で15分間熱処理したのち、残存する酵素活性を
Agri. Biol. Chem. vol. 31, no. 11, p. 1256-1264 (1
967)記載の方法に従い測定した。その結果を表１に示
す。なお、大腸菌JM109（pUOX101）（野生型）の値も同
様に示した。表中、カッコ内の数字は、無処理粗酵素液
の酵素活性に対する、熱処理後の残存活性の比率であ
る。
を、１mM IPTG、100μg/mlアンピシリンを添加したＴＹ
培地〔１％(W/V)トリプトン、0.5％(W/V)酵母エキス、
0.5％(W/V)食塩〕で、37℃で20時間培養後、超音波破砕
して遠心分離し粗酵素液を調製した。このようにして調
製した粗酵素液0.1mlをエッペンドルフチューブにと
り、60℃で15分間熱処理したのち、残存する酵素活性を
Agri. Biol. Chem. vol. 31, no. 11, p. 1256-1264 (1
967)記載の方法に従い測定した。その結果を表１に示
す。なお、大腸菌JM109（pUOX101）（野生型）の値も同
様に示した。表中、カッコ内の数字は、無処理粗酵素液
の酵素活性に対する、熱処理後の残存活性の比率であ
る。
【００２７】 表 １ ──────────────────────────────────── 無処理 60 ℃, 15分間処理 ──────────────────────────────────── 大腸菌JM109 (pUOX101) 0.738U/ml (100 ％） 0.048U/ml (6.5％） 野生型 ──────────────────────────────────── 大腸菌XL1-Blue(pUOX101β) 0.807U/ml（100 ％） 0.856U/ml (106％） 変異型 ────────────────────────────────────
【００２８】
【発明の効果】本発明により、変異型ウリカーゼ、変異
型ウリカーゼ遺伝子及び新規な組み換え体ＤＮＡが提供
される。また、本発明の変異型ウリカーゼの製造方法に
より安定な変異型ウリカーゼを効率よく得られる。
型ウリカーゼ遺伝子及び新規な組み換え体ＤＮＡが提供
される。また、本発明の変異型ウリカーゼの製造方法に
より安定な変異型ウリカーゼを効率よく得られる。
【００２９】
配列番号１ 配列の長さ：３０３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val 1 5 10 15 Lys Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln 20 25 30 Glu Val Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe 35 40 45 Asp Thr Ser Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr 50 55 60 Asp Thr Val Lys Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu 65 70 75 Ile Trp Pro Ile Glu Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe 80 85 90 Val Glu Lys Tyr Ser His Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val 95 100 105 Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp 110 115 120 His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu 125 130 135 Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys Leu Ser Ser Ala Ile Lys 140 145 150 Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser Met Phe Tyr Gly Tyr 155 160 165 Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr Thr Asp Arg Ile 170 175 180 Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp Asn Lys Lys 185 190 195 Ile Gly Ser Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys Gly Ile 200 205 210 Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr Thr 215 220 225 Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn 230 235 240 Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val 245 250 255 Ser Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys 260 265 270 Trp Lys Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro 275 280 285 His Pro Asn Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys 290 295 300 Thr Lys Leu 303
【００３０】配列番号２ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００３１】配列番号３ 配列の長さ：９０９ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： ATGTCAACAACGCTCTCATCATCCACCTACGGCAAGGACAACGTCAAGTTCCTCAAGGTC 60 AAGAAGGACCCGCAAAACCCAAAGAAGCAGGAGGTTATGGAGGCCACCGTCACGTGTCTG 120 CTTGAAGGTGGGTTCGACACCTCGTACACGGAGGCTGACAACTCGTCCATCGTGCCAACA 180 GACACCGTGAAGAACACCATTCTCGTGTTGGCAAAGACCACGGAGATTTGGCCAATTGAG 240 AGATTTGCAGCCAAGCTGGCCACGCACTTTGTTGAGAAGTACTCGCACGTCTCTGGCGTC 300 TCCGTCAAGATTGTCCAGGACAGATGGGTCAAGTACGCCGTTGATGGCAAGCCACACGAC 360 CACTCTTTTATCCACGAAGGTGGTGAGAAGAGAATCACTGACCTGTACTACAAGAGATCC 420 GGTGATTACAAGCTGTCGTCTGCCATCAAGGACTTGACGGTGCTGAAGTCCACCGGCTCG 480 ATGTTCTACGGCTACAACAAGTGTGACTTCACCACCTTGCAACCAACAACTGACAGAATC 540 TTGTCCACCGACGTCGATGCCACCTGGGTTTGGGATAACAAGAAGATTGGCTCTGTCTAC 600 GACATCGCCAAGGCTGCAGACAAGGGAATCTTTGACAACGTTTACAACCAGGCTAGAGAG 660 ATCACCTTGACCACCTTTGCTCTCGAGAACTCTCCATCTGTGCAGGCCACGATGTTCAAC 720 ATGGCTACTCAGATCTTGGAAAAGGCATGCTCTGTCTACTCGGTTTCATACGCCTTGCCA 780 AACAAGCACTACTTCCTCATTGACTTGAAATGGAAAGGTTTGGAGAACGACAACGAGTTG 840 TTCTACCCATCTCCACATCCAAATGGGTTGATCAAGTGTACTGTTGTCCGTAAGGAGAAG 900 ACCAAGTTG 909
【００３２】配列番号４ 配列の長さ：４８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡリンカー 配列： TGGTTGCAAG GTGGTGTATT CATCGCGAAT GAAGCCGTAG AACATCGA
Claims (6)
- 【請求項１】 配列番号１で表される野生型ウリカーゼ
のアミノ酸配列のうち、第１６５位〜第１７０位のアミ
ノ酸が変異したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
ドする変異型ウリカーゼ遺伝子。 - 【請求項２】 変異したアミノ酸配列が、配列番号２で
表わされるものである請求項１記載の変異型ウリカーゼ
遺伝子。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載の変異型ウリカーゼ
遺伝子がベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え体ＤＮ
Ａ。 - 【請求項４】 請求項３記載の組み換え体ＤＮＡを含
み、変異型ウリカーゼ生産能を有するエッシェリシア属
に属する微生物を培地に培養し、得られる培養物から変
異型ウリカーゼを採取することを特徴とする変異型ウリ
カーゼの製造方法。 - 【請求項５】 配列番号１で表される野生型ウリカーゼ
のアミノ酸配列のうち、第１６５位〜第１７０位のアミ
ノ酸が変異したアミノ酸配列を含む変異型ウリカーゼ。 - 【請求項６】 変異したアミノ酸配列が、配列番号２で
表わされるものである請求項５記載の変異型ウリカー
ゼ。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21623995A JP3462313B2 (ja) | 1995-08-24 | 1995-08-24 | 変異型ウリカーゼ、変異型ウリカーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び変異型ウリカーゼの製造法 |
| US08/701,952 US5700674A (en) | 1995-08-24 | 1996-08-23 | Mutant uricase, a mutant uricase gene, a novel recombinant DNA, and a process for producing mutant uricase |
| US08/938,471 US5801036A (en) | 1995-08-24 | 1997-09-29 | Mutant uricase, a mutant uricase gene, a novel recombinant DNA, and a process for producing mutant uricase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21623995A JP3462313B2 (ja) | 1995-08-24 | 1995-08-24 | 変異型ウリカーゼ、変異型ウリカーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び変異型ウリカーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0956383A true JPH0956383A (ja) | 1997-03-04 |
| JP3462313B2 JP3462313B2 (ja) | 2003-11-05 |
Family
ID=16685462
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21623995A Expired - Fee Related JP3462313B2 (ja) | 1995-08-24 | 1995-08-24 | 変異型ウリカーゼ、変異型ウリカーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び変異型ウリカーゼの製造法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5700674A (ja) |
| JP (1) | JP3462313B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008022768A (ja) * | 2006-07-20 | 2008-02-07 | Toyobo Co Ltd | ウリカーゼの安定性を向上させる方法、および安定性の向上した改変型ウリカーゼ |
| JP2008022767A (ja) * | 2006-07-20 | 2008-02-07 | Toyobo Co Ltd | 安定な尿酸測定試薬 |
| CN111373034A (zh) * | 2017-07-07 | 2020-07-03 | 艾乐娜制药有限公司 | 重组尿酸酶 |
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|---|---|---|---|---|
| CA2395398A1 (en) * | 2000-01-31 | 2001-08-02 | Human Genome Sciences, Inc. | Nucleic acids, proteins, and antibodies |
| US6913915B2 (en) * | 2001-08-02 | 2005-07-05 | Phoenix Pharmacologics, Inc. | PEG-modified uricase |
| WO2012149393A2 (en) | 2011-04-29 | 2012-11-01 | Selecta Biosciences, Inc. | Tolerogenic synthetic nanocarriers for antigen-specific deletion of t effector cells |
| EA201592103A3 (ru) | 2013-05-03 | 2016-08-31 | Селекта Байосайенсиз, Инк. | Способы и композиции для усиления cd4+ регуляторных t-клеток |
| WO2016037163A1 (en) | 2014-09-07 | 2016-03-10 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods and compositions for attenuating gene therapy anti-viral transfer vector immune responses |
| MX2018011012A (es) | 2016-03-11 | 2019-03-28 | Selecta Biosciences Inc | Formulaciones y dosis de uricasa pegilada. |
| WO2018169811A1 (en) | 2017-03-11 | 2018-09-20 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods and compositions related to combined treatment with anti-inflammatories and synthetic nanocarriers comprising an immunosuppressant |
| JP2022535121A (ja) | 2019-06-04 | 2022-08-04 | セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド | ペグ化ウリカーゼの処方物および用量 |
| EP4054531A1 (en) | 2019-11-08 | 2022-09-14 | Selecta Biosciences, Inc. | Formulations and doses of pegylated uricase |
| KR20240031241A (ko) * | 2021-06-29 | 2024-03-07 | 주식회사 프로앱텍 | Bcn 링커를 이용한 요산산화효소-알부민 컨쥬게이트의 생산 방법 및 이의 용도 |
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|---|---|---|---|---|
| JP2971218B2 (ja) * | 1991-12-04 | 1999-11-02 | 協和醗酵工業株式会社 | ウリカーゼ遺伝子およびウリカーゼの製造法 |
-
1995
- 1995-08-24 JP JP21623995A patent/JP3462313B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-08-23 US US08/701,952 patent/US5700674A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-09-29 US US08/938,471 patent/US5801036A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008022768A (ja) * | 2006-07-20 | 2008-02-07 | Toyobo Co Ltd | ウリカーゼの安定性を向上させる方法、および安定性の向上した改変型ウリカーゼ |
| JP2008022767A (ja) * | 2006-07-20 | 2008-02-07 | Toyobo Co Ltd | 安定な尿酸測定試薬 |
| CN111373034A (zh) * | 2017-07-07 | 2020-07-03 | 艾乐娜制药有限公司 | 重组尿酸酶 |
| JP2020530282A (ja) * | 2017-07-07 | 2020-10-22 | アレナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | 組換えウリカーゼ酵素 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5700674A (en) | 1997-12-23 |
| JP3462313B2 (ja) | 2003-11-05 |
| US5801036A (en) | 1998-09-01 |
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