JPH09266A

JPH09266A - 大腸菌のフラビン還元酵素

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Publication number: JPH09266A
Application number: JP7176736A
Authority: JP
Inventors: Shuhei Yoshino; 修平善野
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1995-06-19
Filing date: 1995-06-19
Publication date: 1997-01-07
Anticipated expiration: 2020-03-23
Also published as: JP3632246B2

Abstract

(57)【要約】【目的】安定で高活性な新規なフラビン還元酵素を提供
すること。【構成】ニトロ還元酵素遺伝子に変異を導入して得られ
るフラビン還元酵素遺伝子。この遺伝子がコードしてい
るフラビン還元酵素。このフラビン還元酵素をコードす
る遺伝子を組み込んだベクター、及び当該ベクターを用
いたフラビン還元酵素の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は大腸菌のフラビン還元酵
素遺伝子、フラビン還元酵素、該遺伝子をベクターＤＮ
Ａに挿入した組み換え体ＤＮＡ、および該組み換え体Ｄ
ＮＡを含有する微生物を使用したフラビン還元酵素の製
造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】発光細菌のルシフェラーゼは、還元型フ
ラビンモノヌクレオチド（以下ＦＭＮＨ₂という）と長
鎖脂肪アルデヒドを基質として、酸素の存在下、酸化型
フラビンモノヌクレオチド（以下ＦＭＮという）と長鎖
カルボン酸とを生成し、その際に青色に発光する反応を
触媒する。発光細菌ルシフェラーゼは、この発光を指
標とする各種の生理活性物質の測定に有用であるが、試
験管内等で細菌ルシフェラーゼを利用する場合、基質で
あるＦＭＮＨ₂が即時に自動酸化され、ＦＭＮに変換さ
れるため、その反応系にフラビン還元酵素を共存させる
必要がある。

【０００３】そこで、フラビン還元酵素は細菌ルシフェ
ラーゼの発光を指標とした検出系に欠かせない酵素であ
る。しかし、発光細菌 Vibrio fischeriのフラビン還
元酵素は、不安定で活性低下を起こしやすい欠点があっ
た。一方、フラビン還元酵素は、Vibrio fischeriにお
いては、１種類の酵素が存在することが分かっているに
過ぎなかった。「Duane,W.andHastings,J.W.(1975)Mol.
Cell.Biochem.6,53-64」最近、本発明者は発光細菌 Vibrio fischeriのフラビ
ン還元酵素が、アミノ酸配列レベルでニトロ還元酵素に
類似し、低レベルのニトロ還元酵素活性を有することを
見い出した『特願平３−３５１７１７号記載』。また、
大腸菌のニトロ還元酵素遺伝子を単離し、その１次構造
を明かにした『特願平５−３４００６１号記載』。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで、検査や診断な
どに利用するため、より安定で高い活性を有するフラビ
ン還元酵素が待ち望まれていた。すなわち、本発明の目
的は安定で高活性を有するフラビン還元酵素を開発する
ことを主たる課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
ついて鋭意研究の結果、ニトロ還元酵素遺伝子に変異を
導入することにより、安定で高活性なフラビン還元酵素
をコードするフラビン還元酵素遺伝子の作出に成功し、
本発明を完成した。すなわち、本願は以下の発明を提供
するものである。（１）大腸菌由来である野生型ニトロ還元酵素遺伝子に
変異処理を行って得られるフラビン還元酵素遺伝子。（２）野生型ニトロ還元酵素遺伝子がｎｆｓＡ遺伝子、
ｎｆｓＢ遺伝子、ｎｆｎＡ遺伝子またはｎｆｎＢ遺伝子
であることを特徴とする前記第１項に記載のフラビン還
元酵素遺伝子。（３）野生型ニトロ還元酵素遺伝子がｎｆｓＢ遺伝子ま
たはｎｆｎＢ遺伝子であり、該遺伝子のコードするアミ
ノ酸配列において、１２４位のフェニルアラニンのアミ
ノ酸がフェニルアラニン以外のアミノ酸に変異されてい
るか欠失しているアミノ酸配列をコードする前記第２項
記載のフラビン還元酵素遺伝子。（４）配列表の配列番号１で表される塩基配列を含む、
フラビン還元酵素遺伝子。（５）野生型ニトロ還元酵素遺伝子がｎｆｓＢ遺伝子ま
たはｎｆｎＢ遺伝子であり、該遺伝子のコードするアミ
ノ酸配列において、１２４位のフェニルアラニンのアミ
ノ酸がセリンのアミノ酸に変異されているアミノ酸配列
をコードする前記第３項記載のフラビン還元酵素遺伝
子。（６）前記第３項に記載のフラビン還元酵素遺伝子がコ
ードするフラビン還元酵素。（７）前記第４項に記載のフラビン還元酵素遺伝子がコ
ードする配列番号２のフラビン還元酵素。（８）塩基配列が配列表の配列番号１で表されるＤＮＡ
をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組み換え
体ＤＮＡ。（９）前記第８項に記載の組み換え体ＤＮＡを含み、フ
ラビン還元酵素生産能を有するエッシェリシア属に属す
る微生物を培地に培養し、培養物よりフラビン還元酵素
を採取することを特徴とするフラビン還元酵素の製造
法。

【０００６】本発明の構成と効果につき以下に詳述す
る。本発明のフラビン還元酵素遺伝子は、ニトロ還元酵
素遺伝子を基に改変して得られた遺伝子である。例え
ば、大腸菌由来である野生型ニトロ還元酵素のアミノ酸
配列において、１２４位のアミノ酸がフェニルアラニン
以外のアミノ酸に変異されているアミノ酸配列をコード
する、フラビン還元酵素遺伝子である。この１２４位の
アミノ酸はフェニルアラニン以外であればよいが、フェ
ニルアラニンよりも分子量が小さいアミノ酸に変異され
もしくは１２４位が欠失していることが好ましい。特に
この１２４位のアミノ酸がセリンであるアミノ酸配列を
コードするフラビン還元酵素遺伝子が好ましく、そのよ
うな例として、配列の長さ６５１ヌクレオチド鎖を含
み、２１７個のアミノ酸からなる蛋白をコードしてい
る、配列番号１で表わされる塩基配列を含む遺伝子を例
で示すことができる。この遺伝子の配列の種類はゲノム
DNAである。本発明の酵素は、フラビン還元活性を有
し、たとえば、ＦＭＮ還元活性を有するものであり、た
とえば配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋
白質である。本発明の組換え体ＤＮＡは、塩基配列が配
列番号１で表わされるＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入し
たものである。本発明の酵素の製法は、たとえば、塩基
配列が配列番号１で表わされるＤＮＡをベクターＤＮＡ
に挿入した組換え体ＤＮＡで修飾された微生物を培養
し、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含む蛋白を
製造することである。

【０００７】本発明における遺伝子の改変による熱安定
な高活性なフラビン還元酵素が提供される前提として、
野性型のニトロ還元酵素遺伝子およびその組換え体DNA
を調製することが必要である。野性型のニトロ還元酵素
遺伝子等の種類は、提供が企図される熱安定な高活性な
フラビン還元酵素遺伝子の種類に応じて用いられる。そ
して、大腸菌に由来するあらゆる野生型のニトロ還元酵
素遺伝子を用いることが可能であり、たとえば、すでに
クローン化されているニトロ還元酵素遺伝子を用いるこ
とができる。そのような遺伝子として、大腸菌nfsB/nfn
Bニトロ還元酵素遺伝子『特願平５ー３４００６１
号』、大腸菌nfsAニトロ還元酵素遺伝子『特願平6-2989
36号』、などが例示される。これらの遺伝子等は、すで
に公知の方法に従って調製される。たとえば、野性型大
腸菌遺伝子およびその組換え体DNAは、特願平５−３４
００６１号に記載の方法により調製することができる。

【０００８】野性型ニトロ還元酵素遺伝子の変異処理
は、企図する変異形態に応じた通常公知の方法で行い得
る。すなわち、野性型ニトロ還元酵素遺伝子あるいは当
該遺伝子の組み込まれた組換え体DNAと変異原となる薬
剤とを接触作用させる方法、紫外線照射法、遺伝子工学
的手法、または蛋白工学的手法等を広く用いることがで
きる。上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤とし
ては、たとえば、ヒドロキシルアミン、N-メチル-N'-ニ
トロ-N-ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラ
ジン、蟻酸、5-ブロモウラシル等を挙げることができ
る。この接触作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応
じて選択することが可能であり、現実に、野性型ニトロ
還元酵素遺伝子において、所望の変異を起こすことがで
きるかぎり特に限定されない。通常、上記薬剤を好まし
くは0.5-12Mの濃度において、20-80℃の反応温度下で１
０分間以上、好ましくは１０ー１８０分間接触作用させ
ることで、所望の変異を起こすことができる。

【０００９】紫外線照射を行う場合においても、「現代
科学、pp24-30, 1989年6月号」記載の方法に従い変異を
起こすことができる。蛋白工学的手法としては、一般的
に、サイトスペシフィックミュータジェネシス(site-sp
ecific mutagenesis)として知られる方法を用いること
ができる。たとえば、Kramer法「Kramer W. et al. (19
84) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456」, Eckstein法
「Taylor, J. W. et al. (1985) Nucleic Acids Res. 1
3, 8749-8764」, Kunkel法「Kunkel, T. A. (1985) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 82,488-492」等があげられ
る。なお、上記の遺伝子改変法のほかに、有機合成法ま
たは酵素合成法により、直接所望の改変ニトロ還元酵素
遺伝子、すなわち、熱安定な高活性なフラビン還元酵素
遺伝子を合成し得ることはもちろんである。上記の方法
により得られる所望のフラビン還元酵素遺伝子の塩基配
列の決定確認は、たとえば、ジデオキシ変法『Hattori,
M. and Sakaki,Y. (1986) アナリティカルバイオケミス
トリー（Anal. Biochem.) 152, 232』などにより行いえ
る。

【００１０】上述の如くして得られた熱安定な高活性な
フラビン還元酵素遺伝子を、常法により、バクテリオフ
ァージ、コスミド、または原核細胞若くは真核細胞の形
質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込
み、それぞれのベクターに対応する宿主を常法により形
質転換あるいは形質導入することができる。たとえば、
宿主として、大腸菌JM83, 大腸菌D1210, 大腸菌JM109,
大腸菌HB101等を選択する場合には、『Sambrook,J.,Fri
tsch,E.F. and Maniatis,T. (1989) Molecular cloni
ng: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Labora
tory Press, Cold Spring Harbor, New York』記載の方
法等により、形質導入をすることにより、形質導入株を
得ることができる。

【００１１】そして、上記菌株より熱安定な高活性なフ
ラビン還元酵素生産能を有する菌株をスクリーニングす
ることにより、熱安定な高活性なフラビン還元酵素遺伝
子をベクターDNAに挿入した組換え体DNAを含み、熱安定
な高活性なフラビン還元酵素生産能を有する大腸菌菌株
を得ることができる。このようにして得られた菌株より
純化された新規組換え体DNAを得るには、たとえば、ア
ルカリ法『Sambrook,J.,Fritsch,E.F. and Maniatis,T.
(1989) Molecular cloning: a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring H
arbor, New York』などを用いればよい。

【００１２】そして、このようにして得られた組換え体
DNAより熱安定な高活性なフラビン還元酵素遺伝子を含
有するDNAを得るには、たとえば、該組換え体DNAに制限
酵素、たとえばEcoRIおよびXbaIを温度３０ー４０℃で
１〜２４時間、好ましくは３７℃で２時間作用させて、
反応終了液をアガロースゲル電気泳動法『Sambrook,J.,
Fritsch,E.F. and Maniatis,T. (1989) Molecular cl
oning: a laboratorymanual. Cold Spring Harbor Labo
ratory Press, Cold Spring Harbor, New York』で処理
することにより得ることができる。

【００１３】上記のようにして、得られた熱安定な高活
性なフラビン還元酵素遺伝子をベクターDNAに挿入した
組換え体DNAを含み、熱安定な高活性なフラビン還元酵
素生産能を有する大腸菌菌株を用いて熱安定な高活性な
フラビン還元酵素を生産するには、この菌株を通常の固
体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を
採用して培養するのが好ましい。

【００１４】また、上記菌株を培養する培地としては、
たとえば酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキ
ス、コーンスティープリカーあるいは大豆若くは小麦ふ
すまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウ
ム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マ
グネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２
鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類に１種以上を添加
し、さらに必要に応じて糖質原料、ビタミン等を適宜添
加したものが用いられる。

【００１５】なお、培地の初発pHは、pH７ー９に調整す
るのが適当である。また、培養は３０ー４２℃、好まし
くは３７℃で４ー２４時間、より好ましくは３７℃で１
２時間通気攪拌培養、振とう培養、静置培養等により実
施するのが好ましい。培養終了後、該培養物より熱安定
な高活性なフラビン還元酵素を採取するには、通常の酵
素採取手段を用いて得ることができる。

【００１６】たとえば、常法により菌体を、超音波破壊
処理、磨砕処理などするか、または、リゾチーム等の溶
菌酵素を用いて本酵素を排出するか、またはトルエン等
の存在下で振とうもしくは放置して、自己消化をおこな
わせ本酵素を菌体外に排出させることができる。そし
て、この溶液をろ過、遠心分離などして固形部分を除去
し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン
硫酸塩、硫酸マンガン等により核酸を除去した後、これ
を硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈
殿物を採取し、粗酵素を得る。

【００１７】上記粗酵素よりさらに精製酵素標品を得る
には、たとえば、セファデックス、ウルトロゲルもしく
はバイオゲル等を用いるゲルろ過法、イオン交換体を用
いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電
気泳動法、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、
しょ糖密度勾配遠心法等の沈殿法、アフィニティクロマ
ト法、分子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分画法
等を適宜選択し、またこれらを組合わせて実施すること
により、精製された酵素標品を得ることができる。この
ようにして、所望の熱安定な高活性なフラビン還元酵素
を得ることができる。

【００１８】

【実施例】以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
る。（１）PCR反応の鋳型として使用する組換え体プラスミ
ドpNR1DNAの調製特願平5ー340061号記載の方法により構築されたニトロ還
元酵素遺伝子を発現しうるプラスミト゛ｐＮＲ１を含有す
る大腸菌ＪＭ８３株を３７℃で一晩培養し、アルカリ法
『Sambrook,J.,Fritsch,E.F. and Maniatis,T. (1989)
Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N
ew York』を用いてpNR１プラスミドDNAを調製した。す
なわち、この培養液1.5mLを遠心分離して、菌体を集
め、これを0.1mLのリゾチーム溶液（50mMグルコース・1
0mMＥＤＴＡ・25mMトリス塩酸pH8・4mg/mLリゾチーム
液）に懸濁させ、室温で5分間反応させ溶菌液を得た。
この溶菌液に0.2mLの0.2N水酸化ナトリウム・1%ドデシ
ル硫酸ナトリウム（SDS）溶液を添加し、混合後5分間氷
中に置きアルカリ変性させた。さらに、この変性物に0.
15mLの3N酢酸ナトリウムpH5.2を加え混合し、5分間氷中
で中和した。この中和物を遠心分離し、沈殿物を除いた
上澄みに、等量のTE緩衝液（10mMトリス塩酸pH8・1mMＥ
ＤＴＡ）飽和フェノールを加えて除蛋白操作を行った
後、水層を回収し、これに2倍量のエタノールを加え、
混合した後、12000rpmで10分間遠心分離し、沈殿物を得
た。この沈殿物を0.05mLのTE緩衝液に溶解し、これに0.
001mLの0.5mg/mLRNA分解酵素A溶液を加え、混合後37℃
で30分間反応させ、RNAを分解した。この反応液に20%ポ
リエチレングリコール・2.5M塩化ナトリウム溶液を加
え、氷中で1時間放置した後、12000rpm、10分間遠心分
離した。これにより生じた沈殿を70%エタノールで洗浄
した後乾燥させ、0.05mLのTE緩衝液に溶解して組換え体
pNR1プラスミドDNAを調製した。

【００１９】（２）PCRによるニトロ還元酵素遺伝子の
ランダム変異調製したpNR1プラスミドDNAを鋳型として、開始コドンA
TGを含んだ上流側の合成オリゴヌクレオチドプライマー
NR-Nと終止コドンTAAを含んだ下流側の合成プライマーN
R-C（図１に示す）を用いて、ランダムに変異が導入で
きるPCR法『Innis,M.A., Gelfand,D.H., Sninsky,J.J.
and White,T.J. (1990) PCR Protocols:A Guide to Met
hods And Applications. Academic Press』により、ニ
トロ還元酵素遺伝子のコーディング領域を増幅反応し
た。すなわち、Taq DNAポリメラーゼの基質であるdNTP
の濃度を、dTTP, dCTP, dGTPについては、それぞれ1 m
M, dATPは0.2 mMとし、0.5 mM MnCl₂を含む6.1 mM MgCl
₂、そして1 ngの標的プラスミドに対して25サイクルのP
CR反応をおこなった。アガロース電気泳動『Sambrook,
J.,Fritsch,E.F. and Maniatis,T. (1989) Molecular
cloning: a laboratorymanual. Cold Spring Harbor L
aboratory Press, Cold Spring Harbor, New York』
で、標的DNAの増幅の確認を行った後、このPCR反応液を
上記（１）項に記載のように、フェノールで除蛋白処理
した後、1/10量の3M酢酸ナトリウムpH5.2及び2.5倍量の
エタノールを加え、温度-70℃で15分間放置した後、120
00rpmで10分間遠心分離し、沈殿物を得た。この沈殿物
を乾燥した後、0.05mLのTE緩衝液に溶解し、変異ニトロ
還元酵素遺伝子のＤＮＡ断片溶液を作製した。

【００２０】（３）変異ニトロ還元酵素遺伝子を発現し
うるプラスミドを有する大腸菌の作製得られた変異ニトロ還元酵素遺伝子のＤＮＡ断片の溶液
0.05ｍＬを、0.006mLのMed緩衝液（10ｍＭトリス塩酸pH
7.5・10mM塩化マグネシウム・1mMジチオスレイトール・
50mM塩化ナトリウム）と10ユニットの制限酵素XbaIおよ
びEcoRIを加え、温度37 ℃で１時間反応させて切断し
た。この切断物を70 ℃で処理し、制限酵素を失活し
た。この処理物を上記（１）項に記載の方法と同様にフ
ェノール抽出し、その後、上記（２）に記載の方法と同
様にエタノール沈殿し、沈殿物を得た。この沈殿物を乾
燥後、0.01mLのTE緩衝液に溶解した。この溶液の0.005m
Lに、0.001mLのX10ライゲーション緩衝液（20mM塩化マ
グネシウム・660mMトリス塩酸pH7.6・10mMＡＴＰ・150
ｍＭジチオスレイトール）、１ユニットのT4DNAライゲ
ース及び変異ニトロ還元酵素遺伝子のDNA断片と同様に
して制限酵素XbaI及びEcoRIにより切断処理されたpUC11
8プラスミド『Vieira,J. and Messing,J. (1987) メソ
ッズインエンザイモロジー(Methods Enzymol.) 153,
3』の0.001mgを加え、さらに、水を加えて全量0.01mLと
して、温度16℃にて16時間反応を行った。得られた反応
液を用い、『Sambrook,J.,Fritsch,E.F. and Maniatis,
T. (1989)Molecular cloning: a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring H
arbor, New York』に記載の形質転換法により、大腸菌J
M８３株『Messing,J. and Vieira,J.(1982) ジーン(Gen
e), 19, 269』を形質転換し、アンピシリン耐性及びベ
ーターガラクトシダーゼ活性を検討し、形質転換株を得
た。図２に変異ニトロ還元酵素遺伝子を発現しうるプラ
スミドの構築工程を示す。

【００２１】（４）フラビン還元酵素遺伝子を発現する
プラスミドを含有する大腸菌の選択得られた形質転換株の９０株について、コロニーを0.05
mg/mLアンピシリン含有LB培地（1Ｌ当り、トリプトン10
g・イーストエクストラクト5g・塩化ナトリウム10gを含
有し、水酸化ナトリウムで中和してある）『Sambrook,
J.,Fritsch,E.F. and Maniatis,T. (1989) Molecular
cloning: a laboratory manual. ColdSpring Harbor L
aboratory Press, Cold Spring Harbor, New York』の1
0ｍＬに植菌し、37 ℃で５時間培養した。その菌体に対
して、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
電気泳動（SDSーPAGEと略す）による分析『Laemmli,U.
K. (1970) ネイチャー(Nature), 277, 680』を行い、プ
ラスミドを有していない大腸菌の発現蛋白のパターンと
比較して、形質転換株のプラスミドから発現する変異ニ
トロ還元酵素の量とサイズを見積もったところ、その発
現量はまちまちで、そのサイズは分子量27,000を示し
た。

【００２２】次に、変異ニトロ還元酵素の発現が確認で
きた形質転換株に対して、上記の培養液1.5mlを10,000r
pmで遠心分離し、上清を除いた。菌体を50mMリン酸カリ
ウム緩衝液（pH７）0.5mlに懸濁し、ブランソン社製の
ソニファイヤー２５０を用いて、超音波破砕した。この
破砕物を12,000rpm、4℃で30分間遠心分離し、この上清
を粗酵素抽出液とした。この抽出液に対して、フラビン
還元酵素活性とニトロ還元酵素活性を測定した。フラビ
ン還元酵素活性の測定は、電子供与体としてNADHを用
い、電子受容体としてFMNを用いて、善野らの方法『Zen
no,S., Saigo,K.,Kanoh,H. and Inouye,S. (1994) ジャ
ーナルオブバクテリオロジー(J. Bacteriol.), 176, 35
36』で行った。一方、ニトロ還元酵素活性の測定は、電
子供与体としてNADHを用い、電子受容体としてニトロフ
ラゾンを用いて、Petersonらの方法『Peterson,F.J., M
ason,R.P., Hovsepian,J. and Holtzman,J.L. (1979)
ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー(J. Biol.
Chem.), 254, 4009』で行った。さらに、蛋白濃度の測
定はバイオラッド社製のプロテインアッセイキットを用
いて、標準蛋白を牛血漿グロブリンとして、色素結合法
『Bradford,M.M. (1976) アナリティカルバイオケミス
トリー（Anal. Biochem.) 72, 248』により決定した。
以上の結果、ニトロ還元酵素活性よりフラビン還元酵素
活性の方が明らかに高い形質転換株を１株得た。この株
の含有するプラスミドをpNR247と名付けた。すなわち、
プラスミドpNR247にコードされる変異ニトロ還元酵素
は、フラビン還元酵素であった。

【００２３】（５）プラスミドpNR247にコードされるフ
ラビン還元酵素の精製上記（４）に準拠して、pNR247を含有するJM83株を培養
し、この培養液から粗酵素抽出液を得た。この抽出液を
出発物として、以下のように、フラビン還元酵素を4 ℃
にて精製した。粗酵素抽出液を、10 mMリン酸カリウム
緩衝液（pH７）に対して透析した。この透析物を Q Sep
harose(Pharmacia LKB社製)陰イオン交換カラム(2.6 x
10 cm)にかけた。50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH７）
で洗浄後、50-500 mMリン酸カリウム緩衝液（pH７）を
用いて溶出した。本クロマトグラフィーは流速2.0 ml/m
inで行った。それぞれの画分に対して、フラビン還元酵
素活性を測定した。次に、酵素活性のピーク画分を10 m
Mリン酸カリウム緩衝液（pH７）に対して透析した後、B
lue Sepharose (Pharmacia LKB社製)カラム(1.0 x10 c
m)にかけた。20 mMリン酸カリウム緩衝液（pH７）で洗
浄後、1 mM NADH・20mMリン酸カリウム緩衝液（pH７）
を用いて溶出した。流速1.0 ml/minで行った。さらに、
酵素活性のピーク画分に硫酸アンモニウムを20 ％にな
るように加え、Phenyl Sepharose (Pharmacia LKB社製)
カラム(1.0 x 1５ cm)にかけた。20％硫酸アンモニウム
/50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH７）で洗浄後、20-4 %
硫酸アンモニウム/50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH７）
を用いて溶出した。流速1.0ml/minで行った。最後に、
酵素活性のピーク画分をCentricon 10（Amicon社製）で
濃縮し、Superose 12 (Pharmacia LKB社製)ゲルろ過カ
ラム(1 x 30 cm)にかけた。本クロマトグラフィーは100
mMリン酸カリウム緩衝液（pH７）を用いて、流速0.2 m
l/minで行った。この酵素活性画分を精製フラビン還元
酵素とした。本標品を上記（４）に記載のSDSーPAGEに
よる分析で評価したところ、単一バンドの蛋白として検
出された。

【００２４】また、本酵素のニトロ還元酵素活性とフラ
ビン還元酵素活性を測定したところ、それぞれ9.55 mmo
l/mg蛋白および1380mmol/mg蛋白であった。それに対し
て、同様にして精製した変異を導入していない正常なニ
トロ還元酵素の、ニトロ還元酵素活性とフラビン還元酵
素活性は、それぞれ9.74 mmol/mg蛋白および0.647mmol/
mg蛋白であった。よって、pNR247にコードされる酵素は
フラビン還元酵素であり、変異を導入することにより、
ニトロ還元酵素をフラビン還元酵素に変換できた。ま
た、善野らの方法『Zenno,S., Saigo,K., Kanoh,H. and
Inouye,S. (1994)ジャーナルオブバクテリオロジー(J.
Bacteriol.), 176, 3536』で精製したVibrio fischeri
のフラビン還元酵素は、ニトロ還元酵素活性とフラビン
還元酵素活性が、それぞれ14.1 mmol/mg蛋白および35.2
mmol/mg蛋白であった。このことから、今回得たニトロ
還元酵素を改変して得られたフラビン還元酵素が、大腸
菌のニトロ還元酵素とV. fischeriのフラビン還元酵素
より、高いフラビン還元酵素活性を有していた。

【００２５】（６）プラスミドpNR247にコードされるフ
ラビン還元酵素遺伝子の塩基配列の決定フラビン還元酵素遺伝子を有するpNR247プラスミドDNA
を、上記（１）項に記載のアルカリ法を用いて調製し
た。pNR247プラスミドの挿入DNA断片の塩基配列をジデ
オキシ変法『Hattori,M. and Sakaki,Y. (1986) アナリ
ティカルバイオケミストリー（Anal. Biochem.) 152, 2
32』にて決定した。その塩基配列は、配列番号１に示
す。また、その塩基配列から予測されるアミノ酸配列
を、配列番号２に示す。図３に示すように、正常なニト
ロ還元酵素のアミノ酸配列と得られた塩基配列から予測
されるアミノ酸配列を比較したところ、アミノ酸配列の
124番目のフェニルアラニン(Phe)がセリン(Ser)に置換
していた。

【００２６】（７）プラスミドpNR247にコードされるフ
ラビン還元酵素の熱安定性試験上記（５）で得られたフラビン還元酵素を１mg／mlの濃
度で、0.1ｍＬづつ1.5ｍＬチューブに入れ密栓し、１時
間で４〜60℃に加温して処理した後、上記（４）に記載
の方法でフラビン還元酵素活性を測定した。比較とし
て、善野らの方法『Zenno,S., Saigo,K., Kanoh,H. and
Inouye,S. (1994) ジャーナルオブバクテリオロジー
(J. Bacteriol.), 176, 3536』で精製した発光細菌Vibr
io fischeriのフラビン還元酵素に関しても、同様に、
熱安定性を試験した。これらの結果を図４に示す。本発
明のフラビン還元酵素は40℃まで安定なのに対して、発
光細菌Vibrio fischeriのフラビン還元酵素は30℃まで
しか安定でなかった。本発明のフラビン還元酵素の方
が、発光細菌Vibrio fischeriのフラビン還元酵素より
安定な酵素であることが解った。

【００２７】

【発明の効果】本発明により、大腸菌のニトロ還元酵素
遺伝子に変異を導入することにより、大腸菌のニトロ還
元酵素および発光細菌V. fischeriのフラビン還元酵素
より、高いフラビン還元活性を有し、V. fischeriのフ
ラビン還元酵素より、安定な新規なフラビン還元酵素を
提供することができた。そして、本発明の方法により、
高いフラビン還元活性を有する、安定なフラビン還元酵
素を効率よく生産することができるので、本発明は産業
上極めて有用である。

【００２８】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：６５４配列の型：核酸鎖の数：１トポロジー：直鎖配列の種類：ゲノムＤＨＡ起源生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ株名：Ｃ６００配列の特徴特徴を表わす記号：ＣＤＳ特徴を決定した方法：Ｅ配列 1 ATG GAT ATC ATT TCT GTC GCC TTA AAG CGT CAT TCC ACT AAG GCA TTT 48 1 Met Asp Ile Ile Ser Val Ala Leu Lys Arg His Ser Thr Lys Ala Phe 16 49 GAT GCC AGC AAA AAA CTT ACC CCG GAA CAG GCC GAG CAG ATC AAA ACG 96 17 Asp Ala Ser Lys Lys Leu Thr Pro Glu Gln Ala Glu Gln Ile Lys Thr 32 97 CTA CTG CAA TAC AGC CCA TCC AGC ACC AAC TCC CAG CCG TGG CAT TTT 144 33 Leu Leu Gln Tyr Ser Pro Ser Ser Thr Asn Ser Gln Pro Trp His Phe 48 145 ATT GTT GCC AGC ACG GAA GAA GGT AAA GCG CGT GTT GCC AAA TCC GCT 192 49 Ile Val Ala Ser Thr Glu Glu Gly Lys Ala Arg Val Ala Lys Ser Ala 64 193 GCC GGT AAT TAC GTG TTC AAC GAG CGT AAA ATG CTT GAT GCC TCG CAC 240 95 Ala Gly Asn Tyr Val Phe Asn Glu Arg Lys Met Leu Asp Ala Ser His 80 241 GTC GTG GTG TTC TGT GCA AAA ACC GCG ATG GAC GAT GTC TGG CTG AAG 288 81 Val Val Val Phe Cys Ala Lys Thr Ala Met Asp Asp Val Trp Leu Lys 96 289 CTG GTT GTT GAC CAG GAA GAT GCC GAT GGC CGC TTT GCC ACG CCG GAA 336 97 Leu Val Val Asp Gln Glu Asp Ala Asp Gly Arg Phe Ala Thr Pro Glu 112 337 GCG AAA GCC GCG AAC GAT AAA GGT CGC AAG TTC TCC GCT GAT ATG CAC 384 113 Ala Lys Ala Ala Asn Asp Lys Gly Arg Lys Phe Ser Ala Asp Met His 128 385 CGT AAA GAT CTG CAT GAT GAT GCA GAG TGG ATG GCA AAA CAG GTT TAT 432 129 Arg Lys Asp Leu His Asp Asp Ala Glu Trp Met Ala Lys Gln Val Tyr 144 433 CTC AAC GTC GGT AAC TTC CTG CTC GGC GTG GCG GCT CTG GGT CTG GAC 480 145 Leu Asn Val Gly Asn Phe Leu Leu Gly Val Ala Ala Leu Gly Leu Asp 160 481 GCG GTA CCC ATC GAA GGT TTT GAC GCC GCC ATC CTC GAT GCA GAA TTT 528 161 Ala Val Pro Ile Glu Gly Phe Asp Ala Ala Ile Leu Asp Ala Glu Phe 176 529 GGT CTG AAA GAG AAA GGC TAC ACC AGT CTG GTG GTT GTT CCG GTA GGT 576 177 Gly Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Thr Ser Leu Val Val Val Pro Val Gly 192 577 CAT CAC AGC GTT GAA GAT TTT AAC GCT ACG CTG CCG AAA TCT CGT CTG 624 193 His His Ser Val Glu Asp Phe Asn Ala Thr Leu Pro Lys Ser Arg Leu 208 625 CCG CAA AAC ATC ACC TTA ACC GAA GTG TAA 554 208 Pro Gln Asn Ile Thr Leu Thr Glu Val *** 218 （ただし、塩基の３文字連鎖は、左側に５’末端をおよ
び右側に３’末端を表わしている。この文字はヌクレオ
チド配列形成するプリンまたはピリミジン塩基を表わ
す。また、Ｇはグアニン，Ａはアデニン、Ｔはチミン、
Ｃはシトシンを表わす。この塩基配列より予測されるア
ミノ酸配列を下側に３文字表記で示し、左側にＮ末端を
および右側にＣ末端を表わしている。）配列番号：２配列の長さ：２１７配列の型：アミノ酸配列の種類：蛋白質配列 10 N-Met Asp Ile Ile Ser Val Ala Leu Lys Arg His Ser Thr Lys Ala Phe 20 30 Asp Ala Ser Lys Lys Leu Thr Pro Glu Gln Ala Glu Gln Ile Lys Thr 40 Leu Leu Gln Tyr Ser Pro Ser Ser Thr Asn Ser Gln Pro Trp His Phe 50 60 Ile Val Ala Ser Thr Glu Glu Gly Lys Ala Arg Val Ala Lys Ser Ala 70 80 Ala Gly Asn Tyr Val Phe Asn Glu Arg Lys Met Leu Asp Ala Ser His 90 Val Val Val Phe Cys Ala Lys Thr Ala Met Asp Asp Val Trp Leu Lys 100 101 Leu Val Val Asp Gln Glu Asp Ala Asp Gly Arg Phe Ala Thr Pro Glu 120 Ala Lys Ala Ala Asn Asp Lys Gly Arg Lys Phe Ser Ala Asp Met His 130 140 Arg Lys Asp Leu His Asp Asp Ala Glu Trp Met Ala Lys Gln Val Tyr 150 160 Leu Asn Val Gly Asn Phe Leu Leu Gly Val Ala Ala Leu Gly Leu Asp 170 Ala Val Pro Ile Glu Gly Phe Asp Ala Ala Ile Leu Asp Ala Glu Phe 180 190 Gly Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Thr Ser Leu Val Val Val Pro Val Gly 200 His His Ser Val Glu Asp Phe Asn Ala Thr Leu Pro Lys Ser Arg Leu 210 Pro Gln Asn Ile Thr Leu Thr Glu Val ***-c

【図面の簡単な説明】

【図１】ニトロ還元酵素遺伝子の変異導入に用いられた
ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマー（ＮＲ−Ｎお
よびＮＲ−Ｃ）。制限酵素切断部位は下線で示した。

【図２】本発明に係わる大腸菌の変異ニトロ還元酵素遺
伝子を含有する本発明の組換えプラスミド構築工程を示
す。ｐＵＣプラスミドベクターに由来する部分は白色
で、変異ニトロ還元酵素遺伝子の部分は斜め線で示し
た。

【図３】正常なニトロ還元酵素遺伝子とフラビン還元酵
素遺伝子の塩基配列の相違部分とその周辺の構造を示
す。番号は正常なニトロ還元酵素およびフラビン還元酵
素のアミノ酸配列の位置を示す。正常なニトロ還元酵素
遺伝子とフラビン還元酵素活性遺伝子の塩基配列の相違
部分は矢印で示した。

【図４】フラビン還元酵素の熱安定性試験の結果を示
す。酵素活性は４℃での活性を１００％として、各温度
における活性を相対活性として％で表した。○は本発明
のフラビン還元酵素で、□は発光細菌のフラビン還元酵
素である。

【符号の説明】

ｌａｃＰラクトースオペロンのプロモーターＡｍｐr アンピシリン耐性遺伝子ｐＵＣ１１８プラスミドベクターｐＮＲ１正常なニトロ還元酵素遺伝子発現プラ
スミドｐＮＲ２４７フラビン還元酵素遺伝子発現プラスミ
ドＮｒｕＩ制限酵素切断部位（ＴＣＧＣＧＡ）ＰｓｔＩ制限酵素切断部位（ＣＴＧＣＡＧ）ＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位（ＧＡＡＴＴＣ）ＸｂａＩ制限酵素切断部位（ＴＣＴＡＧＡ）ＨｉｎｃII 制限酵素切断部位（ＧＴＰｙＰｕＡ
Ｃ：Ｐｙはピリミジン、Ｐｕはプリンを表す）ｎｒ正常なニトロ還元酵素遺伝子の塩基配
列ｆｒフラビン還元酵素遺伝子の塩基配列ＮＲ正常なニトロ還元酵素のアミノ酸配列ＦＲフラビン還元酵素のアミノ酸配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:63） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】大腸菌由来である野生型ニトロ還元酵素
遺伝子に変異処理を行って得られるフラビン還元酵素遺
伝子。
【請求項２】野生型ニトロ還元酵素遺伝子がｎｆｓＡ
遺伝子、ｎｆｓＢ遺伝子、ｎｆｎＡ遺伝子またはｎｆｎ
Ｂ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載のフラ
ビン還元酵素遺伝子。
【請求項３】野生型ニトロ還元酵素遺伝子がｎｆｓＢ
遺伝子またはｎｆｎＢ遺伝子であり、該遺伝子のコード
するアミノ酸配列において、１２４位のフェニルアラニ
ンのアミノ酸がフェニルアラニン以外のアミノ酸に変異
されているか欠失しているアミノ酸配列をコードする請
求項２記載のフラビン還元酵素遺伝子。
【請求項４】配列表の配列番号１で表される塩基配列
を含む、フラビン還元酵素遺伝子。
【請求項５】野生型ニトロ還元酵素遺伝子がｎｆｓＢ
遺伝子またはｎｆｎＢ遺伝子であり、該遺伝子のコード
するアミノ酸配列において、１２４位のフェニルアラニ
ンのアミノ酸がセリンのアミノ酸に変異されているアミ
ノ酸配列をコードする請求項３記載のフラビン還元酵素
遺伝子。
【請求項６】請求項３に記載のフラビン還元酵素遺伝
子がコードするフラビン還元酵素。
【請求項７】請求項４に記載のフラビン還元酵素遺伝
子がコードする配列番号２のフラビン還元酵素。
【請求項８】塩基配列が配列表の配列番号１で表され
るＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする
組み換え体ＤＮＡ。
【請求項９】請求項８に記載の組み換え体ＤＮＡを含
み、フラビン還元酵素生産能を有するエッシェリシア属
に属する微生物を培地に培養し、培養物よりフラビン還
元酵素を採取することを特徴とするフラビン還元酵素の
製造法。