JPH07155188A - ニトロ還元酵素遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】大腸菌ニトロ還元酵素遺伝子を提供すること。 【構成】配列の長さ８４０の塩基配列を有するＤＮＡか
らなるニトロ還元活性を有する酵素遺伝子。この遺伝子
がコードしている２１７個のアミノ酸からなる分子量２
３９０４のニトロ還元酵素。この遺伝子を含有する組換
えベクター、このベクターを含む細菌。

Description

【発明の詳細な説明】

【００１０】

【技術分野】本発明は大腸菌のニトロ還元酵素遺伝子、
酵素、該遺伝子を含む組換えベクター、および該組換え
ベクターを含有する細菌に関する。

【００１１】

【従来の技術】我々の身の回りには、遺伝子ＤＮＡに損
傷を与える物質（変異原）が多数存在しており、我々は
これらの物質に暴露されながら生活している。ニトロア
レーン類はこうした環境変異原の一グループであり、自
動車の排気ガス、焼却場の煙、都市の大気、河川の底
質、ストーブを焚く室内の空気、あるいは焼鳥の焦げた
部分に含まれている。変異原性、発癌性を示すニトロア
レーンとして２ーニトロフルオレンがよく知られてい
る。

【００１２】 ニトロアレーン自体が直接反応してＤＮ
Ａを損傷するわけではなく、ニトロアレーンの代謝物が
突然変異を起こしＤＮＡを損傷する。たとえばニトロフ
ルオレンは、微生物細胞内ではニトロ還元酵素によって
Ｎーヒドロキシ体に還元されて細胞内に入り、その後Ｏ
ーアセチル転移酵素によって活性化され、最終的に生じ
たニトレニウムイオンがＤＮＡを攻撃するものと考えら
れる。従って、ニトロ還元酵素と２ーニトロフルオレン
との反応が２ーニトロフルオレンの変異原性発現の律速
段階と考えることができる。渡辺らは、サルモネラ菌か
らニトロ還元酵素遺伝子を単離し、（Ｗａｔａｎａｂ
ｅ，Ｍ．，Ｉｓｈｉｄａｔｅ，Ｍ．Ｊｒ．＆ Ｎｏｈｍ
ｉ，Ｔ．（１９８９）ミュウテーション リサーチ（Ｍ
ｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），２１６，２１１
ー２２０）に開示している。また、その一次構造を明か
にし、（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｍ．，Ｉｓｈｉｄａｔｅ，
Ｍ．Ｊｒ．＆ Ｎｏｈｍｉ，Ｔ．（１９９０）ヌクレイ
ック アシッドリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１８，１０５９）に示している。

【００１３】 Ｂｒｙａｎｔらはエンテロバクター菌か
らニトロ還元酵素遺伝子を単離し、その一次構造を決定
し、（Ｂｒｙａｎｔ，Ｃ．，Ｈｕｂｂａｒｄ，Ｌ．，ａ
ｎｄ ＭｃＥｌｒｏｙ，Ｗ．Ｄ．（１９９１）ジャーナ
ル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．），２６６，４１２６ー４１３０）に開
示している。Ａｎｌｅｚａｒｋらは、大腸菌からニトロ
還元酵素を精製し、その部分アミノ酸配列を決定し、
（Ａｎｌｅｚａｒｋ，Ｇ．Ｍ．，Ｍｅｌｔｏｎ，Ｒ．
Ｇ．，Ｓｈｅｒｗｏｏｄ，Ｒ．Ｆ．，Ｃｏｌｅｓ，
Ｂ．，Ｆｒｉｅｄｌｏｓ，Ｆ．，ａｎｄ Ｋｎｏｘ，
Ｒ．Ｊ．（１９９２）バイオケミカル ファーマコロジ
ー（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．），４４，
２２８９ー２２９５）に開示している。また、渡辺らは
ニトロ還元酵素遺伝子を導入したサルモネラ菌がニトロ
アレーンに対し高い感受性を示す指標菌株として用いる
ことができることを（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｍ．，Ｉｓｈ
ｉｄａｔｅ，Ｍ．Ｊｒ．＆ Ｎｏｈｍｉ，Ｔ．（１９８
９）ミュウテーション リサーチ（Ｍｕｔａｔｉｏｎ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ），２１６，２１１ー２２０）に示し
ている。

【００１４】 すなわち、ニトロ還元酵素遺伝子は、上
述の変異原性あるいは発癌性物質を検出する感度の向上
に有用である。しかしながら、いまだ大腸菌のニトロ還
元酵素遺伝子の単離、およびその大腸菌での生産につい
ては報告されていない。

【本発明が解決しようとする課題】

【００１５】本発明者らは、鋭意研究の結果、大腸菌か
らニトロ還元活性を有する酵素遺伝子を単離し、その一
次構造を明かにすることに成功し、また該遺伝子を大量
に発現する細菌を作出することに成功し、本発明を完成
するに至った。すなわち、本発明の目的は、上述の技術
的事情に鑑み、大腸菌のニトロ還元酵素活性を有する酵
素遺伝子および酵素を提供することであり、さらに該遺
伝子を含む組換えベクター、および該組換えベクターを
含む細菌を提供することである。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明は次の（１）〜
（８）の構成を有する。 （１）配列番号１で表される塩基配列を含む、ニトロ還
元酵素遺伝子。 （２）配列番号２で表される塩基配列を含む前記（１）
項記載のニトロ還元酵素遺伝子。 （３）塩基配列が配列番号３で表されるニトロ還元酵素
遺伝子。 （４）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するニト
ロ還元酵素。 （５）塩基配列が配列番号１で表されるＤＮＡを含有す
る組換えベクター。 （６）配列番号２で表される塩基配列を有する遺伝子が
プラスミドベクターへ挿入された前記（５）項記載の組
換えベクター。 （７）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡを
含む組換えベクターを含有する細菌。 （８）塩基配列が配列番号１で表されるＤＮＡを含む組
換えベクターで修飾されてなる細菌を培養することから
なる配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む酵素の製
法。

【００１７】本発明の構成と効果につき以下に詳述す
る。本発明の酵素遺伝子は、配列番号１で表される配列
の長さ６５１のヌクレオチド鎖を含むのが特徴である。
好ましく示す配列としては配列番号２で表されるヌクレ
オチド鎖を含む。塩基配列が配列番号３で表される配列
の長さが８４０のＤＮＡであるが具体的に示すことがで
きる。配列の種類はゲノム ＤＮＡであり、例えば、大
腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ６００株か
ら単離されるものである。その配列の特徴は塩基、塩基
番号９１から７４２までの２１７個のアミノ酸からなる
分子量２３９０４の蛋白質をコードしている。本発明の
酵素遺伝子産物は、ニトロ還元活性を有し、たとえば、
ニトロフラゾン還元活性を有するものである。本発明の
酵素は、配列番号１、２、および３の塩基配列から予測
される配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白
質である。その蛋白質は２１７個のアミノ酸からなり分
子量２３９０４のものであり、大腸菌中でニトロ還元活
性を有する。

【００１８】本発明の組換えベクターは、塩基配列が配
列番号１で表されるＤＮＡを含有する。すなわち、本発
明の組換えベクターは、配列番号３で表される塩基配列
を有するＤＮＡと、機能的同等物を含む。「機能的同等
物」とは適当な宿主において、実質的に同じ結果を得る
ために実質的に同じ方法で使用できるＤＮＡ断片のこと
である。すなわち、塩基配列が異なっても、同一のアミ
ノ酸配列を有する蛋白をコードしえるＤＮＡ断片や若干
の塩基配列の相違に伴う若干のアミノ酸配列の違いがあ
るもののニトロ還元活性を有する蛋白をコードしえるＤ
ＮＡ断片のことを意味する。具体的には配列番号１の塩
基配列および部位特異的変異導入された配列番号１の塩
基配列を有するＤＮＡ断片を示し、本発明の組換えベク
ターとしては、例えば、該塩基配列を含有するＤＮＡ断
片を挿入したプラスミドベクターが挙げられる。このベ
クターとしてｐＵＣ（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，
Ｃ．，Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．，ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，
Ｊ．（１９８５）ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１１０ー
１１５）などが使用できる。

【００１９】図３は、その組換えベクター（発現ベクタ
ー）構築行程を示す。すなわち、ニトロ還元酵素遺伝子
を有する大腸菌のＤＮＡを制限酵素ＮｒｕＩとＰｓｔＩ
で消化し、該酵素の構造遺伝子領域を切り出し、ｐＵＣ
８（Ｈａｎｎａ，Ｚ．，Ｆｒｅｇｅａｕ，Ｃ．，Ｐｒｅ
ｆｏｎｔａｔｉｎｅ，Ｇ．，Ｂｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｒ．
（１９８４）Ｇｅｎｅ，３０ ２４７）のＨｉｎｃII／
ＰｓｔＩ切断部位に挿入し組換えベクター（発現ベクタ
ー）ｐＮＲ１を構築した。被構築物の方向付けのためア
ンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）に制限酵素切断部位
を示した。

【００２０】本発明の細菌は、配列番号１で表される塩
基配列を含有する組換えベクターＤＮＡを含む。本発明
の細菌の特徴はニトロ還元活性を有する蛋白質を生産す
る。

【００２１】本発明の酵素の製法は、塩基配列が配列番
号１で表されるＤＮＡを含む組換えベクター（発現ベク
ター）で修飾された細菌を培養し、配列番号４で表され
るアミノ酸配列を含む蛋白質を製造することである。細
菌としては大腸菌、枯草菌など、培地としてはＬＢ培
地、ＹＴ培地などをあげることができる。以下、実施例
にて本発明で重要な遺伝子の単離とその同定に関する手
順をのべる。

【００２２】

【実施例】

実施例１ 大腸菌のニトロ還元酵素に関する遺伝子断片の単離 大腸菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ６００
株をＬＢ培地で３７℃で一晩培養した。１００００ｒｐ
ｍで遠心分離し集菌した後、トリス塩酸・ＥＤＴＡ緩衝
液（以下、ＴＥ緩衝液という）に菌体を懸濁した。３７
℃で１時間リゾチーム処理した後、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（以下ＳＤＳと略す）を添加して５０℃で３時間プ
ロテネースＫ処理をした。その後、フェノール処理を３
回し、エタノール沈殿し、乾燥した後、ＴＥ緩衝液に溶
解し再度プロテネースＫ処理した。その後フェノール処
理３回後エタノール沈殿しゲノムＤＮＡを回収した。そ
のゲノムＤＮＡを鋳型として、渡辺らによって明らかに
されているニトロ還元酵素のアミノ酸配列と我々が以
前、明らかにしたニトロ還元酵素に相同性を有する発光
細菌Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｎのフラビン還元酵素
のアミノ酸配列（特願平０４ー２７９０２９）の保存領
域に関するアミノ酸配列に対応する合成オリゴヌクレオ
チド・プライマーＮＲ−２とＮＲ−３を用いてＰＣＲ法
（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ，
Ｓ．Ｓｔｏｆｆｅｌ，Ｓ．Ｊ．Ｓｃｈａｒｆ，Ｒ．Ｈｉ
ｇｕｃｈｉ，Ｇ．Ｔ．Ｈｏｒｎ，Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ
ａｎｄ Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃ（１９８８）サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３９ ４８７）により増幅反応
し、そのＤＮＡ断片をｐＵＣ８プラスミドＤＮＡ（Ｈａ
ｎｎａ，Ｚ．，Ｆｒｅｇｅａｕ，Ｃ．，Ｐｒｅｆｏｎｔ
ａｔｉｎｅ，Ｇ．，Ｂｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｒ．（１９８
４）Ｇｅｎｅ，３０ ２４７）のＨｉｎｃII切断部位に
挿入した。

【００２３】制限酵素切断部位のマッピングと塩基配列
の決定 （Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｍ．＆ Ｓａｋａｋｉ，Ｙ．（１９
８６）アナリティカルバイオケミストリー（Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１５２ ２３２）から大腸菌ニトロ
還元酵素遺伝子であることを確認した。このプラスミド
ＤＮＡから大腸菌のニトロ還元酵素遺伝子部分のＤＮＡ
断片をＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩで切り出し、遺伝子マ
ッピングのプローブＤＮＡとして用いた。プローブＤＮ
Ａの³²Ｐ標識はランダム・プライミング法（Ｆｅｉｎｂ
ｅｒｇ，Ａ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（１９８３）
アナリティカル バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．）１３２ ６）で行った。大腸菌のゲノム
全域をほぼカバーする整列クローンライブラリ−（Ｋｏ
ｈａｒａ，Ｙ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｉｓ
ｏｎｏ，Ｋ．（１９８７）セル（Ｃｅｌｌ），５０，４
９５ー５０８）のクローンＤＮＡを一枚のナイロンメン
ブレン上に付着させたＧｅｎｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｍｅ
ｍｂｒａｎｅ（宝酒造製）をハイブリダイゼーション液
（２０ｍｌの６×ＳＥＴ緩衝液（２０×ＳＥＴ緩衝液：
３ＭのＮａＣｌ、０．６Ｍのトリスー塩酸（ｐＨ８．
０）０．０４ＭのＥＤＴＡ）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄ
ｔ’ｓ液（牛血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、
Ｆｉｃｏｌｌの各０．２％溶液）、０．１％ＳＤＳ、サ
ケ精子ＤＮＡ（熱変性したもの５０μｇ／ｍｌ））に入
れ、６８℃で１時間保温した。さらに液を入れ替えて１
時間保温後、³²Ｐー標識プローブを加え６５℃で一晩ハ
イブリダイゼーションした。溶液を捨てフィルターを６
×ＳＥＴ緩衝液で洗浄後、０．５×ＳＥＴ緩衝液６５℃
２０分間振とうした。この操作を２回繰り返した後、風
乾しオートラジオグラフィーにかけた。フィルターと現
像したＸ線フィルムを重ね、陽性クローンを決定した。
陽性クローンは２１Ａ９Ｓと２Ｄ１２であった。２１Ａ
９ＳのＤＮＡをＨｉｎｄIIIで消化後、６ｋｂのＤＮＡ
断片をアガロース電気泳動により分離し、ＤＥ８１ペー
パーからＤＮＡを溶出し、フェノール処理３回後エタノ
ールで沈殿した。それを約２００ｎｇ／μｌになるよう
にＴＥ緩衝液に溶解した。ｐＵＣ８のＨｉｎｄIII消化
物とそのＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ鎖どうし
または、ＤＮＡとＲＮＡの３’ＯＨと５’Ｐ末端のホス
ホジエステルの結合をつなぐ酵素）をもって１６℃一晩
連結反応した。連結反応液を大腸菌ＧＭ４８株に形質転
換した。

【００２４】実施例２ 酵素遺伝子の構造決定 得られた形質転換株を３７℃で一晩培養し、アルカリＳ
ＤＳ法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，
Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ．）を用いてプラスミドＤＮＡ（ｐＮＲ−Ｈ）を調製
した。実施例１にて得た部分ＤＮＡ配列を基にして、合
成オリゴヌクレオチド・プライマーを調製し、完全なニ
トロ還元酵素遺伝子の配列をジデオキシ変法（Ｈａｔｔ
ｏｒｉ，Ｍ．＆ Ｓａｋａｋｉ，Ｙ．（１９８６）アナ
リティカル バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．）１５２ ２３２）にて決定し、配列表３に示
す一次構造を明らかにした。その結果、大腸菌のニトロ
還元酵素は、配列表４に示す２１７個のアミノ酸からな
る分子量２３９０４のポリペプチドで、サルモネラ菌と
エンテロバクター菌のそれらと８８％の相同性を示し
た。

【００２５】実施例３ ニトロ還元酵素遺伝子の組換えベクター（発現ベクタ
ー）の構築（図３参照）組換えプラスミドｐＮＲ−Ｈの
ＤＮＡを制限酵素ＮｒｕＩとＰｓｔＩで消化した後、ー
８０℃で１０分間処理した。それをアガロースゲル電気
泳動にかけ約１ＫｂＤＮＡ断片をＤＥ８１ペーパーで分
離回収した。ＤＥ８１ペーパーから１ＭのＮａＣｌでＤ
ＮＡ溶出し、フェノール処理３回後エタノール沈殿し
た。それを約２００ｎｇ／μｌになるようにて緩衝液に
溶解した。制限酵素ＨｉｎｃII／ＰｓｔＩであらかじめ
切断し、アルカリホスファターゼ処理されたｐＵＣ８プ
ラスミドＤＮＡ（プラスミドベクター）に、上記ＤＮＡ
をＴ４ＤＮＡリガーゼをもって１６℃一晩連結反応し
た。連結反応液をＪＭ１０９大腸菌に形質転換し５ープ
ロモークロロー３ーインドリルーβーＤ−ガラクシド
（Ｘｇａｌ）を含んだ培地で選択し、一晩培養を行い、
白コロニーを形成させた。この白コロニーがインサート
ＤＮＡを挿入したプラスミドを含有する形質転換株であ
る。それらの形質転換株からプラスミドＤＮＡを調製
し、制限酵素試験して、発現ベクターｐＮＲ１を含有す
る株を得た。このｐＮＲ１はニトロ還元酵素遺伝子をラ
クトースオペロンのプロモーターの支配下で発現しえる
ように設計されている。

【００２６】実施例４ ニトロ還元酵素の大腸菌による生産 これらの形質転換株の一晩培養液０．２５ｍｌをアンピ
シリンを含有したＬＢ液体（１０ｍｌ）培地に植菌し、
３７℃で２時間振とう培養後、最終濃度が１ｍＭになる
ようにイソプロピルーβーＤ（ー）ーチオガラクトピラ
ノシド（ＩＰＴＧと略す）を添加し、さらに３時間培養
した。その菌体に対してドデシル硫酸ナトリウムーポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略
す）による分析を（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７
０）Ｎａｔｕｒｅ，２７７，６８０）に記述されている
方法で行った。その結果、ｐＮＲ１を含有する大腸菌で
は、プラスミドを含有しない大腸菌と比較して、大量に
発現している蛋白が、分子量２６０００に見いだされ
た。

【００２７】ＩＰＴＧ誘導処理した培養液１．５ｍｌを
１００００ｒｐｍで遠心分離し上清を除く。菌体を５０
ｍＭリン酸カリウム・１ｍＭジチオスレイトール緩衝液
０．５ｍｌに懸濁し超音波破砕した。１２０００ｒｐ
ｍ、４℃で３０分間遠心分離しその上清を細胞抽出液と
した。その細胞抽出液に対して、酵素活性を測定した。
ニトロ還元酵素活性は（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｍ．，Ｉｓ
ｈｉｂａｔｅ，Ｍ．Ｊｒ．＆ Ｎｏｈｍｉ，Ｔ．（１９
８９）ミューテーション リサーチ（Ｍｕｔａｔｉｏｎ
ｒｅｓｅａｒｃｈ），２１６，２１１ー２２０）の方
法で行った。蛋白量はバイオラッド製の蛋白分析キット
を用いて色素結合法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．（１
９７６）アナリティカル バイオケミストリー（Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）７２，２４８ー２５４）により
決定した。ｐＮＲ１を含有した大腸菌の抽出液におい
て、３５５ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパクの酵素活性
を有していたのに対して、プラスミドを含まない大腸菌
の抽出液の酵素活性は、７ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇタン
パクであった。ニトロ還元酵素遺伝子を導入した大腸菌
では、導入していない菌の５０倍のニトロ還元活性を示
したことになる。この遺伝子はニトロ還元活性を有する
酵素蛋白の遺伝子と同定できた。

【００２８】

【発明の効果】本発明の酵素遺伝子は、大腸菌のニトロ
還元活性を有する酵素の遺伝子としては、初めて単離さ
れたものである。適当な宿主、たとえば大腸菌を宿主と
することにより変異原あるいは発癌性物質の好感受性株
を作出することにこれを使用できる。またその大腸菌か
ら大量に該還元酵素蛋白を調製することもできる。その
発現ベクターを適当な宿主たとえば、大腸菌に導入する
ことにより、ニトロ還元活性を有する酵素を大量に発現
する生物あるいは微生物を作出することが出来、さらに
その遺伝子導入生物から抽出することにより該遺伝子導
入生物あるいは微生物は上述した機能から変異原あるい
は発癌性物質に対して高い感受性を示し、高感度に変異
原あるいは発癌性物質を検出する指標として有用であ
る。

【００２９】

【配列表】

【００３０】配列番号：１ 配列の長さ：６５４ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖 配列の種類：ゲノム ＤＮＡ 起源 生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ 株名：Ｃ６００ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 特徴を決定した方法：Ｅ

【００３１】 配列 1 ATG GAK ATM ATM QRS GTL GCL XTY AAJ WGZ CAK QRS ACL AAJ GCL TTK 48 1 Met Asp Ile Ile Ser Val Ala Leu Lys Arg His Ser Thr Lys Ala Phe 16 49 GAK GCL QRS AAJ AAJ XTY ACL CCL GAJ CAJ GCL GAJ CAJ ATM AAJ ACL 96 17 Asp Ala Ser Lys Lys Leu Thr Pro Glu Gln Ala Glu Gln Ile Lys Thr 32 97 XTY XTY CAJ TAK QRS CCL QRS QRS ACL AAK QRS CAJ CCL TGG CAK TTK 144 33 Leu Leu Gln Tyr Ser Pro Ser Ser Thr Asn Ser Gln Pro Trp His Phe 48 145 ATM GTL GCL QRS ACL GAJ GAJ GGL AAJ GCL WGZ GTL GCL AAJ QRS GCL 192 49 Ile Val Ala Ser Thr Glu Glu Gly Lys Ala Arg Val Ala Lys Ser Ala 64 193 GCL GGL AAK TAK GTL TTK AAK GAJ WGZ AAJ ATG XTY GAK GCL QRS CAK 240 65 Ala Gly Asn Tyr Val Phe Asn Glu Arg Lys Met Leu Asp Ala Ser His 80 241 GTL GTL GTL TTK TGK GCL AAJ ACL GCL ATG GAK GAK GTL TGG XTY AAJ 288 81 Val Val Val Phe Cys Ala Lys Thr Ala Met Asp Asp Val Trp Leu Lys 96 289 XTY GTL GTL GAK CAJ GAJ GAK GCL GAK GGL WGZ TTK GCL ACL CCL GAJ 336 97 Leu Val Val Asp Gln Glu Asp Ala Asp Gly Arg Phe Ala Thr Pro Glu 112 337 GCL AAJ GCL GCL AAK GAK AAJ GGL WGZ AAJ TTK TTK GCL GAK ATG CAK 384 113 Ala Lys Ala Ala Asn Asp Lys Gly Arg Lys Phe Phe Ala Asp Met His 128 385 WGZ AAJ GAK XTY CAK GAK GAK GCL GAJ TGG ATG GCL AAJ CAJ GTL TAK 432 129 Arg Lys Asp Leu His Asp Asp Ala Glu Trp Met Ala Lys Gln Val Tyr 144 433 XTY AAK GTL GGL AAK TTK XTY XTY GGL GTL GCL GCL XTY GGL XTY GAK 480 145 Leu Asn Val Gly Asn Phe Leu Leu Gly Val Ala Ala Leu Gly Leu Asp 160 481 GCL GTL CCL ATM GAJ GGL TTK GAK GCL GCL ATM XTY GAK GCL GAJ TTK 528 161 Ala Val Pro Ile Glu Gly Phe Asp Ala Ala Ile Leu Asp Ala Glu Phe 176 529 GGL XTY AAJ GAJ AAJ GGL TAK ACL QRS XTY GTL GTL GTL CCL GTL GGL 576 177 Gly Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Thr Ser Leu Val Val Val Pro Val Gly 192 577 CAK CAK QRS GTL GAJ GAK TTK AAK GCL ACL XTY CCL AAJ QRS WGZ XTY 624 193 His His Ser Val Glu Asp Phe Asn Ala Thr Leu Pro Lys Ser Arg Leu 208 625 CCL CAJ AAK ATM ACL XTY ACL GAJ GTL TAA 654 209 Pro Gln Asn Ile Thr Leu Thr Glu Val *** 218 （ただし、塩基の３文字連鎖は、左側に５’末端を及び
右側に３’末端を表している。この文字はヌクレオチド
配列を形成するプリン又はピリミジン塩基を表す。ま
た、Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｊ：
ＡもしくはＧ、Ｋ：ＴもしくはＣ、Ｌ：Ａ、Ｔ、Ｃもし
くはＧ、Ｍ：Ａ、ＣもしくはＴ、Ｔ：チミン、Ｘ：Ｙが
ＡもしくはＧの場合はＴまたはＣ、或いはＹがＣもしく
はＴの場合はＣ、Ｙ：ＸがＣの場合はＡ、Ｇ、Ｃまたは
Ｔ、或いはＸがＴの場合はＡまたはＧ、Ｗ：ＺがＣもし
くはＴの場合はＣまたはあ、或いはＺがＣもしくはＴの
場合はＣ、Ｚ：ＷがＧの場合はＡ、Ｇ、ＣまたはＴ、或
いはＷがＡの場合はあまたはＧ、ＱＲ：ＳがＡ，Ｇ、Ｃ
もしくはＴの場合はＴＣ、＊＊＊はＴＡＡ ＴＡＧ も
しくはＴＧＡを表す。）

【００３２】配列番号：２ 配列の長さ：６５４ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖 配列の種類：ゲノム ＤＮＡ 起源 生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ 株名：Ｃ６００ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 特徴を決定した方法：Ｅ

【００３３】 配列 1 ATG GAT ATC ATT TCT GTC GCC TTA AAG CGT CAT TCC ACT AAG GCA TTT 48 1 Met Asp Ile Ile Ser Val Ala Leu Lys Arg His Ser Thr Lys Ala Phe 16 49 GAT GCC AGC AAA AAA CTT ACC CCG GAA CAG GCC GAG CAG ATC AAA ACG 96 17 Asp Ala Ser Lys Lys Leu Thr Pro Glu Gln Ala Glu Gln Ile Lys Thr 32 97 CTA CTG CAA TAC AGC CCA TCC AGC ACC AAC TCC CAG CCG TGG CAT TTT 144 33 Leu Leu Gln Tyr Ser Pro Ser Ser Thr Asn Ser Gln Pro Trp His Phe 48 145 ATT GTT GCC AGC ACG GAA GAA GGT AAA GCG CGT GTT GCC AAA TCC GCT 192 49 Ile Val Ala Ser Thr Glu Glu Gly Lys Ala Arg Val Ala Lys Ser Ala 64 193 GCC GGT AAT TAC GTG TTC AAC GAG CGT AAA ATG CTT GAT GCC TCG CAC 240 95 Ala Gly Asn Tyr Val Phe Asn Glu Arg Lys Met Leu Asp Ala Ser His 80 241 GTC GTG GTG TTC TGT GCA AAA ACC GCG ATG GAC GAT GTC TGG CTG AAG 288 81 Val Val Val Phe Cys Ala Lys Thr Ala Met Asp Asp Val Trp Leu Lys 96 289 CTG GTT GTT GAC CAG GAA GAT GCC GAT GGC CGC TTT GCC ACG CCG GAA 336 97 Leu Val Val Asp Gln Glu Asp Ala Asp Gly Arg Phe Ala Thr Pro Glu 112 337 GCG AAA GCC GCG AAC GAT AAA GGT CGC AAG TTC TTC GCT GAT ATG CAC 384 113 Ala Lys Ala Ala Asn Asp Lys Gly Arg Lys Phe Phe Ala Asp Met His 128 385 CGT AAA GAT CTG CAT GAT GAT GCA GAG TGG ATG GCA AAA CAG GTT TAT 432 129 Arg Lys Asp Leu His Asp Asp Ala Glu Trp Met Ala Lys Gln Val Tyr 144 433 CTC AAC GTC GGT AAC TTC CTG CTC GGC GTG GCG GCT CTG GGT CTG GAC 480 145 Leu Asn Val Gly Asn Phe Leu Leu Gly Val Ala Ala Leu Gly Leu Asp 160 481 GCG GTA CCC ATC GAA GGT TTT GAC GCC GCC ATC CTC GAT GCA GAA TTT 528 161 Ala Val Pro Ile Glu Gly Phe Asp Ala Ala Ile Leu Asp Ala Glu Phe 176 529 GGT CTG AAA GAG AAA GGC TAC ACC AGT CTG GTG GTT GTT CCG GTA GGT 576 177 Gly Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Thr Ser Leu Val Val Val Pro Val Gly 192 577 CAT CAC AGC GTT GAA GAT TTT AAC GCT ACG CTG CCG AAA TCT CGT CTG 624 193 His His Ser Val Glu Asp Phe Asn Ala Thr Leu Pro Lys Ser Arg Leu 208 625 CCG CAA AAC ATC ACC TTA ACC GAA GTG TAA 654 209 Pro Gln Asn Ile Thr Leu Thr Glu Val *** 218

【００３４】配列番号：３ 配列の長さ：８４０ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖 配列の種類：ゲノム ＤＮＡ 起源 生物名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ 株名：Ｃ６００ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：９１ー７４５ 特徴を決定した方法：Ｅ

【００３５】 配列 1 GGA AAT CTA TAG CGC ATT TTT CTC GCT TAC CAT TTC TCG TTG AAC CTT 48 49 GTA ATC TGC TGG CAC GCA AAA TTA CTT TCA CAT GGA GTC TTT ATG GAT 96 1 Met Asp 2 97 ATC ATT TCT GTC GCC TTA AAG CGT CAT TCC ACT AAG GCA TTT GAT GCC 144 3 Ile Ile Ser Val Ala Leu Lys Arg His Ser Thr Lys Ala Phe Asp Ala 18 145 AGC AAA AAA CTT ACC CCG GAA CAG GCC GAG CAG ATC AAA ACG CTA CTG 192 19 Ser Lys Lys Leu Thr Pro Glu Gln Ala Glu Gln Ile Lys Thr Leu Leu 34 193 CAA TAC AGC CCA TCC AGC ACC AAC TCC CAG CCG TGG CAT TTT ATT GTT 240 35 Gln Tyr Ser Pro Ser Ser Thr Asn Ser Gln Pro Trp His Phe Ile Val 50 241 GCC AGC ACG GAA GAA GGT AAA GCG CGT GTT GCC AAA TCC GCT GCC GGT 288 51 Ala Ser Thr Glu Glu Gly Lys Ala Arg Val Ala Lys Ser Ala Ala Gly 66 289 AAT TAC GTG TTC AAC GAG CGT AAA ATG CTT GAT GCC TCG CAC GTC GTG 336 67 Asn Tyr Val Phe Asn Glu Arg Lys Met Leu Asp Ala Ser His Val Val 82 337 GTG TTC TGT GCA AAA ACC GCG ATG GAC GAT GTC TGG CTG AAG CTG GTT 384 83 Val Phe Cys Ala Lys Thr Ala Met Asp Asp Val Trp Leu Lys Leu Val 98 385 GTT GAC CAG GAA GAT GCC GAT GGC CGC TTT GCC ACG CCG GAA GCG AAA 432 99 Val Asp Gln Glu Asp Ala Asp Gly Arg Phe Ala Thr Pro Glu Ala Lys 114 433 GCC GCG AAC GAT AAA GGT CGC AAG TTC TTC GCT GAT ATG CAC CGT AAA 480 115 Ala Ala Asn Asp Lys Gly Arg Lys Phe Phe Ala Asp Met His Arg Lys 130 481 GAT CTG CAT GAT GAT GCA GAG TGG ATG GCA AAA CAG GTT TAT CTC AAC 528 131 Asp Leu His Asp Asp Ala Glu Trp Met Ala Lys Gln Val Tyr Leu Asn 146 529 GTC GGT AAC TTC CTG CTC GGC GTG GCG GCT CTG GGT CTG GAC GCG GTA 576 147 Val Gly Asn Phe Leu Leu Gly Val Ala Ala Leu Gly Leu Asp Ala Val 162 577 CCC ATC GAA GGT TTT GAC GCC GCC ATC CTC GAT GCA GAA TTT GGT CTG 624 163 Pro Ile Glu Gly Phe Asp Ala Ala Ile Leu Asp Ala Glu Phe Gly Leu 178 625 AAA GAG AAA GGC TAC ACC AGT CTG GTG GTT GTT CCG GTA GGT CAT CAC 672 179 Lys Glu Lys Gly Tyr Thr Ser Leu Val Val Val Pro Val Gly His His 194 673 AGC GTT GAA GAT TTT AAC GCT ACG CTG CCG AAA TCT CGT CTG CCG CAA 720 195 Ser Val Glu Asp Phe Asn Ala Thr Leu Pro Lys Ser Arg Leu Pro Gln 210 721 AAC ATC ACC TTA ACC GAA GTG TAA TTC TCT CTT GCC GGG CAT CTG CCC 768 211 Asn Ile Thr Leu Thr Glu Val *** 218 769 GCT ATT TCC TCT CAG ATT CTC CTG ATT TGC ATA ACC CTG TTT CAG CCG 816 817 TCA TCA TAG GCT GCT GTT GTA TAA 840

【００３６】配列番号：４ 配列の長さ：２１７ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質

【００３７】 配列 10 N- Met Asp Ile Ile Ser Val Ala Leu Lys Arg His Ser Thr Lys Ala Phe 20 30 Asp Ala Ser Lys Lys Leu Thr Pro Glu Gln Ala Glu Gln Ile Lys Thr 40 Leu Leu Gln Tyr Ser Pro Ser Ser Thr Asn Ser Gln Pro Trp His Phe 50 60 Ile Val Ala Ser Thr Glu Glu Gly Lys Ala Arg Val Ala Lys Ser Ala 70 80 Ala Gly Asn Tyr Val Phe Asn Glu Arg Lys Met Leu Asp Ala Ser His 90 Val Val Val Phe Cys Ala Lys Thr Ala Met Asp Asp Val Trp Leu Lys 100 101 Leu Val Val Asp Gln Glu Asp Ala Asp Gly Arg Phe Ala Thr Pro Glu 120 Ala Lys Ala Ala Asn Asp Lys Gly Arg Lys Phe Phe Ala Asp Met His 130 140 Arg Lys Asp Leu His Asp Asp Ala Glu Trp Met Ala Lys Gln Val Tyr 150 160 Leu Asn Val Gly Asn Phe Leu Leu Gly Val Ala Ala Leu Gly Leu Asp 170 Ala Val Pro Ile Glu Gly Phe Asp Ala Ala Ile Leu Asp Ala Glu Phe 180 190 Gly Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Thr Ser Leu Val Val Val Pro Val Gly 200 His His Ser Val Glu Asp Phe Asn Ala Thr Leu Pro Lys Ser Arg Leu 210 Pro Gln Asn Ile Thr Leu Thr Glu Val *** -C

【図面の簡単な説明】

【図１】ニトロ還元酵素とフラビン還元酵素の間で保存
されるアミノ酸配列と合成オリゴヌクレオチド・プライ
マー（ＮＲ−２及びＮＲ−３）を示す。番号はサルモネ
ラ菌のニトロ還元酵素のアミノ酸の位置を示す。

【図２】本発明の酵素遺伝子の制限酵素地図およびシー
クエンスストラテジーを示す。矢印は塩基配列を決定し
た方向を示す。ボックスで示したところが酵素遺伝子に
相当する部分である。

【図３】本発明に係わる大腸菌のニトロ還元活性を有す
る酵素遺伝子を含有する本発明の組換えベクター（発現
ベクターｐＮＲ１）の構築工程を示す。

【符号の説明】 ｌａｃＰ ラクトースプロモーター Ａｍｐｒ アンピシリン耐性遺伝子 ｐＵＣ８ プラスミド・ベクター ｐＮＲ１ 発現ベクター ＮｒｕＩ ６塩基認識制限酵素 ＰｓｔＩ ６塩基認識制限酵素 ＫｐｎＩ ６塩基認識制限酵素 ＥｃｏＲＶ ６塩基認識制限酵素 ＨｉｎｃII ６塩基認識制限酵素 ＢｇｌII ６塩基認識制限酵素 ＳｍａＩ ６塩基認識制限酵素 ｐＮＲーＨ 組換えプラスミド

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１で表される塩基配列を含む、ニ
   トロ還元酵素遺伝子。 【配列表１】
2. 【請求項２】配列番号２で表される塩基配列を含む請求
   項１記載のニトロ還元酵素遺伝子。 【配列表２】
3. 【請求項３】塩基配列が配列番号３で表されるニトロ還
   元酵素遺伝子。 【配列表３】
4. 【請求項４】配列番号４で表されるアミノ酸配列を有す
   るニトロ還元酵素。 【配列表４】
5. 【請求項５】塩基配列が配列番号１で表されるＤＮＡを
   含有する組み換えベクター。 【配列表１】
6. 【請求項６】配列番号２で表される塩基配列を有する遺
   伝子がプラスミドベクターへ挿入された請求項５記載の
   組み換えベクター。 【配列表２】
7. 【請求項７】配列番号１で表される塩基配列を有するＤ
   ＮＡを含む組み換えベクターを含有する細菌。 【配列表１】
8. 【請求項８】塩基配列が配列番号１で表されるＤＮＡを
   含む組み換えベクターで修飾されてなる細菌を培養する
   ことからなる配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む
   酵素の製法。 【配列表１】 【配列表４】