JP2534968B2

JP2534968B2 - フラビン還元酵素遺伝子

Info

Publication number: JP2534968B2
Application number: JP5151076A
Authority: JP
Inventors: 修平善野; 井上　　敏; 薫西郷
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1993-05-27
Filing date: 1993-05-27
Publication date: 1996-09-18
Anticipated expiration: 2011-09-18
Also published as: JPH06335393A; US5578476A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、発光細菌 Xenorhabdus lumines
cens由来のフラビン還元酵素遺伝子、酵素、該遺伝子を
含む組換えベクター、および該組換えベクターを含有す
る細菌に関する。

【０００２】

【従来の技術】発光細菌に由来する酵素ルシフェラーゼ
は、還元型フラビンモノヌクレオチド（以下ＦＭＮＨ₂
という）と長鎖脂肪族アルデヒドを基質として、酸素の
存在下、酸化型フラビンモノヌクレオチド（以下ＦＭＮ
という）と長鎖カルボン酸とを生成し、その際に青色に
発光する反応を触媒する。細胞内において、この反応に
用いられる基質ＦＭＮＨ₂ は、還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド：フラビンモノヌクレオチド（Ｎ
ＡＤＨ：ＦＭＮ）還元酵素および還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸：フラビンモノヌクレオ
チド（ＮＡＤＰＨ：ＦＭＮ）還元酵素により、また長鎖
脂肪族アルデヒドは脂肪酸還元酵素複合体により供給さ
れる。最近、Spyrouらは、大腸菌からフラビン還元酵素
遺伝子を単離し、その一次構造を明らかにし、〔Spyro
u,G.,Haggard-Ljungquist,E.,Krook,M.,Jornvall,H.,Ni
lsson,E.,& Reichard,P.(1991)J.Bacteriol.173 3673-3
679〕に開示している。我々も、発光細菌 Vibrio fisch
eriのＦＭＮ還元酵素遺伝子をすでに単離し、その塩基
配列を決定した。さらに本遺伝子を大腸菌内に発現する
ことに成功している。［特願平０３−３５１，７１７］
しかしながら、未だ発光細菌 Xenorhabdus luminescens
由来のフラビン還元酵素遺伝子の単離、および大腸菌で
の発現については報告されていない。ＦＭＮＨ₂ は空気
中でたやすく、即時に自動酸化され、ＦＭＮに変換され
る。細菌ルシフェラーゼの発光能力を最大限に発揮させ
るためには、基質であるこのＦＭＮＨ₂ を常時供給し続
ける必要がある。その目的を達成するのに、最も大切な
のがＦＭＮ還元酵素である。この酵素は上述のように、
細菌ルシフェラーゼと共役し、ルシフェラーゼ反応の生
成物であるＦＭＮをＦＭＮＨ₂ に変換する反応を触媒す
る為、反応系の中にルシフェラーゼとＦＭＮ還元酵素を
共存させることにより、発光反応を持続させることがで
きる。すなわち、細菌ルシフェラーゼが何回もターンオ
ーバーするため、大過剰の長鎖アルデヒドが反応系に存
在する限り、発光しつづける。以上のように、ＦＭＮ還
元酵素は細菌ルシフェラーゼを最大限に生かす為に必須
であり、その遺伝子の取得により、大量に本酵素を調製
することが可能になる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、鋭意研
究の結果、発光細菌 Xenorhabdus luminescens（ATCC 2
9999）からフラビン還元酵素遺伝子を単離し、その一次
構造を明らかにすることに成功し、また該遺伝子を大量
に発現する大腸菌を作出することに成功し、本発明を完
成するに至った。すなわち、本発明の目的は上述の技術
的事情にかんがみ、発光細菌 Xenorhabdus luminescens
のフラビン還元酵素遺伝子および酵素を提供することで
あり、さらに該遺伝子を含む組換えベクター、および該
組換えベクターを含む細菌を提供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、つぎの（１）
〜（８）の構成を有する。

【０００５】（１）配列番号１で表される塩基配列を含
む、フラビン還元酵素遺伝子。

【０００６】（２）配列番号２で表される塩基配列を含
む前記第（１）項記載のフラビン還元酵素遺伝子。

【０００７】（３）塩基配列が配列番号３で表されるフ
ラビン還元酵素遺伝子。

【０００８】（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列
を有するフラビン還元酵素。

【０００９】（５）塩基配列が配列番号１で表されるＤ
ＮＡを含有する組換えベクター。

【００１０】（６）配列番号２で表される塩基配列を有
する遺伝子がプラスミドベクターへ挿入された前記第
（５）項記載の組換えベクター。

【００１１】（７）配列番号１で表される塩基配列を有
するＤＮＡを含む組換えベクターを含有する細菌。

【００１２】（８）塩基配列が配列番号１で表されるＤ
ＮＡを含む組換えベクターで修飾されてなる細菌を培養
することからなる配列番号４で表されるアミノ酸配列を
含む酵素の製法。

【００１３】本発明の構成と効果につき以下に詳述す
る。本発明の酵素遺伝子は、配列番号１で表される配列
の長さ７０２のヌクレオチド鎖を含むのが特徴である。
好ましく示す配列としては配列番号２で表されるヌクレ
オチド鎖を含む。塩基配列が配列番号３で表される配列
の長さが１２２５のＤＮＡであるが具体的に示すことが
できる。配列の種類は Genomic ＤＮＡであり、発光細
菌 Xenorhabdus luminescens（ATCC 29999）から単離さ
れるものである。その配列の特徴は塩基、塩基番号５３
から７５１までの２３３個のアミノ酸からなる分子量２
６４３９の蛋白質をコードしている。本発明の酵素遺伝
子産物は、フラビン還元活性を有し、たとえば、ＦＭＮ
還元活性を有するものである。本発明の酵素は、配列番
号１、２および３の塩基配列から予測される配列番号４
で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質である。その蛋
白質は２３３個のアミノ酸からなり分子量２６４３９の
ものであり、発光細菌中でフラビン還元活性を有する。

【００１４】本発明の組換えベクターは、塩基配列が配
列番号１で表されるＤＮＡを含有する。すなわち、本発
明の組換えベクターは、配列番号２で表される塩基配列
を有するＤＮＡと、機能的同等物を含む。「機能的同等
物」とは適当な宿主による発光細菌のＦＭＮ還元活性を
有する酵素の産生において、実質的に同じ結果を得るた
めに実質的に同じ方法で使用できるＤＮＡ断片のことで
ある。すなわち、塩基配列が異なっても、同一のアミノ
酸配列を有する蛋白をコードしえるＤＮＡ断片や若干の
塩基配列の相違に伴う若干のアミノ酸配列の違いがある
もののＦＭＮ還元活性を有する蛋白をコードしえるＤＮ
Ａ断片のことを意味する。具体的には配列番号１の塩基
配列や部位特異的変異導入された配列番号１の塩基配列
を示すことになる。たとえば、該塩基配列を含有するＤ
ＮＡ断片をプラスミドベクターへ挿入されたものであ
る。このベクターとしては、ｐＵＣ( C.Yanisch-Perro
n, J.Vieira &J.Messing, Gene, 33, 110-115 [1985] )
や pIN III ( Y.Masui, J.Coleman,M.Inouye, Experim
ental Manipulation of Gene Expression（ed.M.Inouy
e)、p.15Academic Press [1983] ）などが使用できる。
図３は、その組換えベクター（発現ベクター）構築工程
を示す。すなわち、還元酵素遺伝子を有するファージＤ
ＮＡλＸＳ４０からインサートの一部である約４ｋｂの
ＳａｌＩ断片をｐＵＣ１３のＳａｌＩ切断部位に挿入
し、プラスミドｐＸＳ１４を得る。ｐＸＳ１４プラスミ
ドＤＮＡをＨｐａＩとＳｍａＩで消化し、約３ｋｂの断
片をプラスミドから排出し、再び連結することにより、
発現ベクターｐＸＦＲ１を作製する。結果的に、ｐＸＦ
Ｒ１はｌａｃのプロモーターの支配下にフラビン還元酵
素遺伝子が、配置されており、フラビン還元酵素が発現
されるようになっている。

【００１５】本発明の細菌は、配列番号１で表される塩
基配列を含有する組換えベクターＤＮＡを含む。本発明
の細菌の特徴はフラビン還元活性を有する蛋白質を生産
する。

【００１６】本発明の酵素の製法は、塩基配列が配列番
号１で表されるＤＮＡを含む組換えベクター（発現ベク
ター）で修飾された細菌を培養し、配列番号４で表され
るアミノ酸配列を含む蛋白質を製造することである。細
菌としては、大腸菌、枯草菌など、培地としてはＬＢ培
地、ＹＴ培地などをあげることができる。

【００１７】以下、実施例にて本発明で重要な遺伝子の
単離とその同定に関する手順をのべる。

【実施例】

実施例１大腸菌のフラビン還元酵素遺伝子（fre)の単離と発光細
菌のゲノミック・サザンブロッティング解析大腸菌Ｃ６００株をＬＢ培地で３７℃、一晩振とう培養
した。１００００ｒｐｍで遠心分離し集菌した後、トリ
ス塩酸・ＥＤＴＡ緩衝液（以下、ＴＥ緩衝液という）に
菌体を懸濁した。３７℃で１時間リゾチーム処理した
後、ドデシル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略す）を添
加して５０℃で３時間プロテネースＫ処理をした。その
後、フェノール処理を３回し、エタノール沈殿し、乾燥
した後、ＴＥ緩衝液に溶解し再度プロテネースＫ処理し
た。その後フェノール処理３回後エタノール沈殿しゲノ
ムＤＮＡを回収した。Spyrouらによって明らかにされて
いる大腸菌のフラビン還元酵素遺伝子（fre)のコーディ
ング領域を図１に示す合成オリゴヌクレオチド・プライ
マーＦＲＥ１とＦＲＥ２を用いてＰＣＲ法［Saiki,R.
K., D.H.Gelfand, S.Stoffel, S.J.Scharf, R.Higuchi,
G.T.Horn, K.B.Mullis and H.A.Erlic(1988) Science
239 487］により増幅し、そのＤＮＡ断片をｐＵＣ８プ
ラスミドＤＮＡ［Hanna,Z.,Fregeau,C.,Prefontaine,
G.,Brousseau,R.(1984)Gene, 30 247 ］のＨｉｎｃII切
断部位に挿入した。

【００１８】制限酵素切断部位のマッピングと塩基配列
の決定［Hattori,Ｍ.& Sakaki,Y.(1986) Anal.Biochem. 152 2
32］から大腸菌fre 遺伝子であることを確認した。この
プラスミドＤＮＡから大腸菌のfre 遺伝子部分のＤＮＡ
断片をＨｉｎｄIII ／ＥｃｏＲＩで切り出し、サザンブ
ロット解析のプローブＤＮＡとして用いた。プローブＤ
ＮＡの³²Ｐ標識はランダム・プライミング法［Feinber
g,A.& Vogelstein,B.(1983)Anal.Biochem. 132 6 ］で
行った。発光細菌Alteromonas hanedai, Vibrio harvey
i,Vibrio fischeri, Vibrio orientalisをPhotobacteri
um培地で２６℃で、発光細菌Xenorhabdus luminescens
をＬＢ培地で３７℃で、それぞれ一晩振とう培養した。
上記の大腸菌のゲノムＤＮＡの調製法と同様にして、各
種発光細菌のゲノムＤＮＡも調製した。それぞれのゲノ
ムＤＮＡをＥｃｏＲＩかＨｉｎｄIII で完全消化し、ア
ガロース・ゲル電気泳動にかけ、サザンブロット解析
［Sambrook, J.,T.Maniatis andE.F.Fritsch (1989) Mo
lecular cloning : a laboratory manual, 2nd ed. Col
dSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.
Y.] した。ハイブリダイゼーションに用いるフィルター
は風乾後紫外線（ＵＶ）照射しＤＮＡを固定した後、ハ
イブリダイゼーション液｛２０ｍｌの６×ＳＥＴ緩衝液
〔２０×ＳＥＴ緩衝液：３ＭのＮａＣｌ，０．６Ｍのト
リス−塩酸（ｐＨ８．０），０．０４ＭのＥＤＴＡ〕、
１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液（牛血清アルブミン、ポ
リビニルピロリドン、Ｆｉｃｏｌｌの各０．２％溶
液）、０．１％ＳＤＳ、サケ精子ＤＮＡ（熱変性したも
の５０μｇ／ｍｌ）｝に入れ、６８℃で１時間保温し
た。さらに液を入れ替えて１時間保温後、³²Ｐ−標識し
た大腸菌ｆｒｅのプローブを加え５０℃で一晩ハイブリ
ダイゼーションした。溶液を捨てフィルターを６×ＳＥ
Ｔ緩衝液で洗浄後、６×ＳＥＴ緩衝液５５℃２０分間振
とうした。この操作を２回繰り返した後、風乾しオート
ラジオグラフィーにかけた。その結果、ＥｃｏＲＩでは
５．０Ｋｂ、ＨｉｎｄIII では４．０Ｋｂのバンドが X
enorhabdus luminescensにのみ検出された。

【００１９】実施例２発光細菌遺伝子の大腸菌ライブラリーの作製発光細菌 Xenorhabdus luminescens（ＡＴＣＣ２９９９
９）をＬＢ培地で３７℃で一晩振とう培養した。１００
００ｒｐｍで遠心分離し集菌した後、トリス塩酸・ＥＤ
ＴＡ緩衝液（以下、ＴＥ緩衝液という）に菌体を懸濁し
た。３７℃で１時間リゾチーム処理した後、ドデシル硫
酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略す）を添加し５０℃で３
時間プロテネースＫ処理をした。その後、フェノール処
理を３回しエタノール沈殿し、乾燥した後、ＴＥ緩衝液
に溶解し再度プロテネースＫ処理した。その後フェノー
ル処理３回後エタノール沈殿しゲノムＤＮＡを回収し
た。このゲノムＤＮＡの５０μｇに１００単位の制限酵
素ＨｉｎｄIII を３７℃で作用させた。反応時間１２０
分で反応をＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を加え
ることにより停止し、エタノール沈殿し回収した。それ
を少量のＴＥ緩衝液に溶解後、アガロースゲル電気泳動
にかけ４キロベース（Ｋｂ）付近の画分をＤＥ８ｌペー
パーで回収した。１ＭのＮａＣｌでＤＥ８ｌペーパーか
ら前記画分のＤＮＡを溶出し、フェノール処理３回後エ
タノールで沈殿した。それを約２００ｎｇ／μｌになる
ようにＴＥ緩衝液に溶解した。制限酵素ＨｉｎｄIII で
あらかじめ切断してアルカリフォスファターゼ（ＤＮＡ
の５’末端の脱リン酸化を触媒する酵素）で処理された
ｐＵＣｌ８プラスミドＤＮＡ（プラスミドベクター）
に、前記画分のＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ鎖
どうしまたは、ＤＮＡとＲＮＡの３’ＯＨと５’Ｐ末端
をホスホジエステルを結合をつなぐ酵素）もって１６℃
で一晩連結反応した。連結反応液をＪＭ１０９大腸菌に
形質転換し得られた形質転換株を遺伝子ライブラリーと
した。

【００２０】実施例３フラビン還元酵素遺伝子の部分断片の単離実施例２で作製した遺伝子ライブラリーのタイターを測
定後、プレート当り２００コロニーになるようにニトロ
セルロースフィルター上にまかれた。３７℃で一晩培養
しそれぞれのフィルターに対してレプリカを２枚とっ
た。２枚１組のレプリカフィルターは３７℃で培養後ハ
イブリダイゼーションに用いた。フィルターは風乾後紫
外線（ＵＶ）照射しＤＮＡを固定した後、ハイブリダイ
ゼーション液｛２０ｍｌの６×ＳＥＴ緩衝液〔２０×Ｓ
ＥＴ緩衝液：３ＭのＮａＣｌ，０．６Ｍのトリス−塩酸
（ｐＨ８．０），０．０４ＭのＥＤＴＡ〕、１０×Ｄｅ
ｎｈａｒｄｔ’ｓ液（牛血清アルブミン、ポリビニルピ
ロリドン、Ｆｉｃｏｌｌの各０．２％溶液）、０．１％
ＳＤＳ、サケ精子ＤＮＡ（熱変性したもの５０μｇ／ｍ
ｌ）｝に入れ、６８℃で１時間保温した。さらに液を入
れ替えて１時間保温後、³²Ｐ−標識した大腸菌ｆｒｅの
プローブを加え５０℃で一晩ハイブリダイゼーションし
た。溶液を捨てフィルターを６×ＳＥＴ緩衝液で洗浄
後、６×ＳＥＴ緩衝液５５℃で２０分間振とうした。こ
の操作を２回繰り返した後、風乾しオートラジオグラフ
ィーにかけた。フィルターと現像したＸ線フィルムを重
ねインクマーカーの位置をフィルム上に写し取った。１
枚のプレートからできた二枚のフィルム上でシグナルが
重なると同定されたコロニー（クローン）を形質転換株
１００個から１つ得た。これをｐＸＨ３と名付けた。

【００２１】ｐＸＨ３のインサートＤＮＡは、実施例１
でのサザンブロット解析での４．０Ｋｂと同じサイズで
あった。ｐＸＨ３プラスミドＤＮＡに対して大腸菌ｆｒ
ｅをプローブとして各種６塩基認識制限酵素を用いて、
サザンブロット解析し、ハイブリダイゼーションする領
域を決定した。その付近をジデオキシ法［Hattori,M.&
Sakaki,Y.(1986) Anal.Biochem. 152 232]で塩基配列を
決定した。その結果、大腸菌ｆｒｅのコーディング領域
の３’側に対応する部分を含んでいることがわかった。
このｐＸＨ３はコーディングの５’側領域を欠いていた
ので、再度、完全鎖長クローンを単離する目的で、新た
に Sau３ＡＩ部分分解による遺伝子ライブラリーを作製
することにした。

【００２２】実施例４発光細菌遺伝子のラムダ・ファージライブラリーの作製発光細菌 Xenorhabdus luminescens（ＡＴＣＣ２９９９
９）をＬＢ培地で３７℃で一晩振とう培養した。１００
００ｒｐｍで遠心分離し集菌した後、トリス塩酸・ＥＤ
ＴＡ緩衝液（以下、ＴＥ緩衝液という）に菌体を懸濁し
た。３７℃で１時間リゾチーム処理した後、ドデシル硫
酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略す）を添加し５０℃で３
時間プロテネースＫ処理をした。その後、フェノール処
理を３回しエタノール沈殿し、乾燥した後、ＴＥ緩衝液
に溶解し再度プロテネースＫ処理した。その後フェノー
ル処理３回後エタノール沈殿しゲノムＤＮＡを回収し
た。このゲノムＤＮＡの５０μｇに１０単位の制限酵素
Ｓａｕ３ＡＩを３７℃で作用させた。反応時間５，１
０，２０，３０，４５，６０，９０，１２０分で一部分
取し反応をＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を加え
ることにより停止した。それぞれの一部をアガロースゲ
ル電気泳動にかけゲノムＤＮＡの部分分解の度合を確認
した。各時間ごとの反応液を１本にまとめエタノール沈
殿回収した。それを少量のＴＥ緩衝液に溶解後、アガロ
ースゲル電気泳動にかけ９〜２３キロベース（Ｋｂ）の
画分を電気溶出操作で回収した。９〜２３Ｋｂ画分を含
むアガロースゲルから前記９〜２３Ｋｂ画分のＤＮＡを
透析チューブ内に電気泳動的に溶出し、フェノール処理
３回後エタノールで沈殿した。それを約２００ｎｇ／μ
ｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した。制限酵素Ｂａｍ
ＨＩであらかじめ切断してアルカリフォスファターゼ
（ＤＮＡの５’末端の脱リン酸化を触媒する酵素）で処
理されたＥＭＢＬ３ファージＤＮＡに、前記９〜２３Ｋ
ｂ画分のＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ鎖どうし
または、ＤＮＡとＲＮＡの３’ＯＨと５’Ｐ末端をホス
ホジエステルを結合をつなぐ酵素）もって１６℃で一晩
連結反応した。連結反応液をパッケージング抽出液と混
合し、２２℃で２時間反応して組換えファージとした。
このファージを遺伝子ライブラリーとした。

【００２３】実施例５完全鎖長のフラビン還元酵素遺伝子の単離実施例４で作製の遺伝子ライブラリーのタイター測定
後、プレート当り１万個のファージがプラークを形成す
るようにまき、３７℃で一晩培養した。４℃に２時間放
置後、それぞれのプレートに対して、ナイロンメンブレ
ン・フィルターで２枚づつｐｈａｇｅをトランスファー
した。フィルターを変性し、中和後、紫外線照射した。
その後は実施例３に示したように、プレハイブリダイゼ
ーションを６８℃１時間し、５０℃で一晩ハイブリダイ
ゼーションした。洗浄も同様に６×ＳＥＴ、５５℃で行
い、その後オートラジオグラフィーした。陽性クローン
を１個単離し、λＸＳ４０と名付けた。λＸＳ４０のフ
ァージＤＮＡをＳａｌＩ消化し、その消化物を７０℃、
１０分間処理した後エタノール沈殿した。それを少量の
ＴＥに溶解し、ｐＵＣ１８のＳａｌＩ消化物とＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結した。そのＤＮＡ溶液を大腸菌
ＪＭ１０９株に形質転換した。形質転換株からプラスミ
ドＤＮＡを調製し、ｐＸＨ３インサートＤＮＡをプロー
ブとして、Ｓａｌ消化のサザンブロット解析を行った。
その結果、４．０Ｋｂの断片のバンドが検出された。そ
の４．０Ｋｂを含むプラスミドをｐＸＳ１４と名付け
た。

【００２４】ｐＸＳ１４のプラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、ｐＸＨ３の塩基配列を基に調製した合成オリゴヌク
レオチドプライマー（２０ｍｅｒ）を用いて、ジデオキ
シ法［Hattori,M.& Sakaki,Y.(1986) Anal.Biochem. 15
2 232]で塩基配列を決定した。また、新たにその塩基配
列を基に合成プライマーを作製し、同様にして塩基配列
を決定した。図２にその制限マップと配列決定の戦略を
示した。ｐＸＨ３及びｐＸＳ１４から決定された塩基配
列は、配列番号３に示される通りで、１２２５ｂｐの長
さで、塩基番号５３〜７５１までの２３３個のアミノ酸
からなる分子量２６４３９の蛋白質をコードすると考え
られた。そのコーディング領域は大腸菌のｆｒｅと比較
して、塩基レベルで６７．０％、アミノ酸レベルで７
３．０％のホモロジーを有していた。

【００２５】実施例６フラビン還元酵素遺伝子の発現ベクターの構築とその形
質転換株の調製（図３参照）組換えプラスミドｐＸＳ１４のＤＮＡをＨｐａＩ及びＳ
ｍａＩで消化し、それぞれの酵素を失活後、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼで連結反応した。その反応液の一部を大腸菌Ｄ
１２１０株に形質転換した。形質転換株からプラスミド
ＤＮＡを調製し、インサートＤＮＡが約１Ｋｂのものを
選択した。そのプラスミドをｐＸＦＲ１と名付けた。ｐ
ＸＦＲ１はラクトースオペロン（ｌａｃ）のプロモータ
ーの支配下にフラビン還元酵素遺伝子を配置した形とな
っており、フラビン還元酵素を発現するように構築して
ある。

【００２６】実施例７フラビン還元酵素の調製とその活性測定この形質転換株の一晩培養液０．２５ｍｌをアンピシリ
ンを含有したＬＢ液体（１０ｍｌ）培地に植菌し、３７
℃で２時間振とう培養後、最終濃度が１ｍＭになるよう
にイソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシ
ド（ＩＰＴＧと略す）を添加し、さらに３時間培養し
た。ＩＰＴＧ誘導処理した培養液３．０ｍｌを１０００
０ｒｐｍで遠心分離し上清を除く。菌体を５０ｍＭリン
酸カリウム・１ｍＭジチオスレイトール緩衝液０．７５
ｍｌに懸濁し超音波破砕した。１２０００ｒｐｍ、４℃
で３０分間遠心分離しその上清を細胞抽出液とした。そ
の細胞抽出液に対して、酵素還元活性を測定し、その結
果を表１に示す。フラビン還元活性：〔Jablonski,E. & DeLuca,M. (19
77) Biochemistry,16,2932〕の方法で行った。蛋白量は
バイオラッド製の蛋白分析キットを用いて色素結合法
〔Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72,248-25
4〕により決定した。

【００２７】

【表１】

【００２８】表１の結果からｐＸＦＲ１のＦＭＮあるい
はリボフラビン還元活性は、ｐＵＣ１３に比べて１ケタ
高い値を示した。この遺伝子がフラビン還元酵素をコー
ドすることが確認された。

【符号の説明】

ｌａｃＰラクトースオペロンプロモーターｐＵＣ１３プラスミド・ベクター λＸＳ４０組換えファージＤＮＡｐＸＳ１４組換えプラスミドｐＸＦＲ１発現プラスミドＨｐａＩ制限酵素ＥｃｏＲＩ〃ＥｃｏＲＶ〃ＮｒｕＩ〃ｓｔｙＩ〃ＮｓｐＶ〃ＢａｌＩ〃ＳａｌＩ〃ＨｉｎｄIII 〃ＳｐｈＩ〃

【００２９】

【発明の効果】本発明の酵素遺伝子は、発光細菌 Xenor
habdus luminescensのＦＭＮ還元活性を有する酵素の遺
伝子としては、はじめて単離されたものである。適当な
宿主、例えば大腸菌を宿主とすることにより、その大腸
菌から大量に該酵素蛋白を調製することができる。その
発現ベクターを適当な宿主たとえば、大腸菌に導入する
ことにより、発光細菌のＦＭＮ還元活性を有する酵素を
大量に発現する生物あるいは微生物を作出することがで
き、さらにその遺伝子導入生物から抽出することにより
該還元酵素を大量に調製することができる。該還元酵素
は上述した機能から細菌ルシフェラーゼの発光反応を増
幅し、多くの測定法に応用でき、たとえば診断薬や検査
薬に有用である。

【００３０】

【配列表】

【００３１】配列番号：１配列の長さ：７０２配列の型：核酸鎖の数：１トポロジー：直鎖配列の種類：Genomic ＤＮＡ起源生物名：Xenorhabdus luminescens 株名：ＡＴＣＣ２９９９９配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ特徴を決定した方法：Ｅ

【００３２】配列 ATG ACL ACL XTY QRS TGK AAJ GTL ACL QRS GTL GAJ GCL ATM ACL GAK 48 Met Thr Thr Leu Ser Cys Lys Val Thr Ser Val Glu Ala Ile Thr Asp 1 5 10 15 ACL GTL TAK WGZ GTL WGZ XTY XTY CCL GAK QRS CCL TTK XTY TTK WGZ 96 Thr Val Tyr Arg Val Arg Leu Leu Pro Asp Ser Pro Phe Leu Phe Arg 20 25 30 GCL GGL CAJ TAK XTY ATG GTL GTL ATG GAK GAJ WGZ GAK AAJ WGZ CCL 144 Ala Gly Gln Tyr Leu Met Val Val Met Asp Glu Arg Asp Lys Arg Pro 35 40 45 TTK QRS ATG GCL QRS ACL CCL QRS GAJ AAJ GAJ TTK ATM GAJ XTY CAK 192 Phe Ser Met Ala Ser Thr Pro Ser Glu Lys Glu Phe Ile Glu Leu His 50 55 60 ATM GGL GCL QRS GAJ XTY AAK XTY TAK GCL ATG GCL GTL ATG GAK WGZ 240 Ile Gly Ala Ser Glu Leu Asn Leu Tyr Ala Met Ala Val Met Asp Arg 65 70 75 80 ATM XTY GAK CAJ AAJ GTL ATM AAK ATM GAK ATM CCL CAK GGL AAJ GCL 288 Ile Leu Asp Gln Lys Val Ile Asn Ile Asp Ile Pro His Gly Lys Ala 85 90 95 TGG TTK WGZ AAJ QRS QRS GCL AAK CCL XTY XTY XTY ATM GCL GGL GGL 336 Trp Phe Arg Lys Ser Ser Ala Asn Pro Leu Leu Leu Ile Ala Gly Gly 100 105 110 ACL GGL TTK QRS TAK ACL WGZ QRS ATM XTY XTY ACL GCL XTY GAJ GAJ 384 Thr Gly Phe Ser Tyr Thr Arg Ser Ile Leu Leu Thr Ala Leu Glu Glu 115 120 125 CAJ CCL AAJ WGZ CAK ATM QRS ATG TAK TGG GGL GGL WGZ GAJ QRS CAJ 432 Gln Pro Lys Arg His Ile Ser Met Tyr Trp Gly Gly Arg Glu Ser Gln 130 135 140 CAK XTY TAK GAK XTY GCL GAJ XTY WGZ XTY XTY ACL GAJ WGZ TAK CCL 480 His Leu Tyr Asp Leu Ala Glu Leu Arg Leu Leu Thr Glu Arg Tyr Pro 145 150 155 160 AAK XTY AAJ GTL ATM CCL GTL GTL GAJ CAJ QRS GAK AAK GGL TGG TGK 528 Asn Leu Lys Val Ile Pro Val Val Glu Gln Ser Asp Asn Gly Trp Cys 165 170 175 GGL WGZ ACL GGL ACL GTL XTY AAJ GCL GTL XTY GAJ GAK TTK GGL QRS 576 Gly Arg Thr Gly Thr Val Leu Lys Ala Val Leu Glu Asp Phe Gly Ser 180 185 190 XTY GCL AAK TAK GAK ATM TAK ATM GCL GGL WGX TTK GAJ ATG GCL AAJ 624 Leu Ala Asn Tyr Asp Ile Tyr Ile Ala Gly Arg Phe Glu Met Ala Lys 195 200 205 ATM GCL WGZ GAJ WGZ TTK TGK QRS GAJ WGZ GAK GCL QRS GCL GAK QRS 672 Ile Ala Arg Glu Arg Phe Cys Ser Glu Arg Asp Ala Ser Ala Asp Ser 210 215 220 ATG TAK GGL GAK GCL TTK GAJ TTK ATM TAG 702 Met Tyr Gly Asp Ala Phe Glu Phe Ile *** 225 230 （ただし、塩基の３文字連鎖は、左側に５’末端を及び
右側に３’末端を表わしている。この文字はヌクレオチ
ド配列を形成するプリン又はピリミジン塩基を表わす。
また、Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｊ：ＡもしくはＧ、Ｋ：ＴもしくはＣ、Ｌ：Ａ、Ｔ、ＣもしくはＧ、Ｍ：Ａ、ＣもしくはＴ、Ｔ：チミン、Ｘ：ＹがＡもしくはＧの場合はＴまたはＣ、或いはＹがＣもしくはＴの場合はＣ、Ｙ：ＸがＣの場合はＡ、Ｇ、ＣまたはＴ、或いはＸがＴの場合はＡまたはＧ、Ｗ：ＺがＧもしくはＡの場合はＣまたはＡ、或いはＺがＣもしくはＴの場合はＣ、Ｚ：ＷがＧの場合はＡ、Ｇ、ＣまたはＴ、或いはＷがＡの場合はＡまたはＧ、ＱＲ：ＳがＡ、Ｇ、ＣまたはＴの場合はＴＣ、＊＊＊はＴＡＡ、ＴＡＧもしくはＴＧＡを表す。）

【００３３】配列番号：２配列の長さ：７０２配列の型：核酸鎖の数：１トポロジー：直鎖配列の種類：Genomic ＤＮＡ起源生物名：Xenorhabdus luminescens 株名：ＡＴＣＣ２９９９９配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ特徴を決定した方法：Ｅ

【００３４】配列 ATG ACA ACA CTG AGC TGT AAA GTA ACC TCT GTA GAG GCT ATT ACT GAT 48 Met Thr Thr Leu Ser Cys Lys Val Thr Ser Val Glu Ala Ile Thr Asp 1 5 10 15 ACG GTT TAT CGG GTA CGG TTG CTT CCC GAT TCT CCG TTC TTA TTC CGC 96 Thr Val Tyr Arg Val Arg Leu Leu Pro Asp Ser Pro Phe Leu Phe Arg 20 25 30 GCC GGT CAG TAT CTG ATG GTG GTA ATG GAT GAG AGA GAT AAA CGT CCG 144 Ala Gly Gln Tyr Leu Met Val Val Met Asp Glu Arg Asp Lys Arg Pro 35 40 45 TTT TCA ATG GCG TCA ACG CCT TCA GAA AAG GAG TTT ATT GAA TTA CAT 192 Phe Ser Met Ala Ser Thr Pro Ser Glu Lys Glu Phe Ile Glu Leu His 50 55 60 ATT GGT GCT TCT GAA CTG AAT TTG TAT GCA ATG GCT GTG ATG GAT AGA 240 Ile Gly Ala Ser Glu Leu Asn Leu Tyr Ala Met Ala Val Met Asp Arg 65 70 75 80 ATT CTG GAT CAG AAA GTG ATC AAT ATT GAT ATC CCT CAT GGC AAA GCT 288 Ile Leu Asp Gln Lys Val Ile Asn Ile Asp Ile Pro His Gly Lys Ala 85 90 95 TGG TTC CGT AAA AGC AGC GCT AAT CCG TTG TTA TTA ATT GCT GGC GGT 336 Trp Phe Arg Lys Ser Ser Ala Asn Pro Leu Leu Leu Ile Ala Gly Gly 100 105 110 ACG GGG TTT TCT TAC ACC CGT TCA ATA TTA TTG ACA GCG TTG GAA GAA 384 Thr Gly Phe Ser Tyr Thr Arg Ser Ile Leu Leu Thr Ala Leu Glu Glu 115 120 125 CAA CCA AAA CGT CAT ATC TCT ATG TAT TGG GGG GGC AGA GAA TCA CAA 432 Gln Pro Lys Arg His Ile Ser Met Tyr Trp Gly Gly Arg Glu Ser Gln 130 135 140 CAT TTA TAT GAT CTT GCT GAA TTA CGG TTA CTT ACA GAA CGC TAT CCT 480 His Leu Tyr Asp Leu Ala Glu Leu Arg Leu Leu Thr Glu Arg Tyr Pro 145 150 155 160 AAT TTG AAG GTT ATT CCA GTT GTT GAA CAG TCA GAT AAT GGT TGG TGT 528 Asn Leu Lys Val Ile Pro Val Val Glu Gln Ser Asp Asn Gly Trp Cys 165 170 175 GGA CGT ACA GGA ACA GTG CTT AAA GCA GTA CTA GAG GAT TTT GGT AGT 576 Gly Arg Thr Gly Thr Val Leu Lys Ala Val Leu Glu Asp Phe Gly Ser 180 185 190 TTG GCC AAT TAT GAT ATC TAC ATT GCA GGG CGA TTC GAA ATG GCA AAA 624 Leu Ala Asn Tyr Asp Ile Tyr Ile Ala Gly Arg Phe Glu Met Ala Lys 195 200 205 ATT GCT CGC GAG CGC TTT TGT AGT GAG CGT GAT GCT TCT GCT GAC AGC 672 Ile Ala Arg Glu Arg Phe Cys Ser Glu Arg Asp Ala Ser Ala Asp Ser 210 215 220 ATG TAT GGT GAT GCT TTC GAA TTC ATT TAG 702 Met Tyr Gly Asp Ala Phe Glu Phe Ile *** 225 230

【００３５】配列番号：３配列の長さ：１２２５配列の型：核酸鎖の数：１トポロジー：直鎖配列の種類：Genomic ＤＮＡ起源生物名：Xenorhabdus luminescens 株名：ＡＴＣＣ２９９９９配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：５３−７５１特徴を決定した方法：Ｅ

【００３６】配列 G TCG ACA AAA TCT GGG ATG AAT TAG ATA TTT TAG GAC CAT AAG AGG 46 GAA CGC ATG ACA ACA CTG AGC TGT AAA GTA ACC TCT GTA GAG GCT ATT 94 Met Thr Thr Leu Ser Cys Lys Val Thr Ser Val Glu Ala Ile 1 5 10 ACT GAT ACG GTT TAT CGG GTA CGG TTG CTT CCC GAT TCT CCG TTC TTA 142 Thr Asp Thr Val Tyr Arg Val Arg Leu Leu Pro Asp Ser Pro Phe Leu 15 20 25 30 TTC CGC GCC GGT CAG TAT CTG ATG GTG GTA ATG GAT GAG AGA GAT AAA 190 Phe Arg Ala Gly Gln Tyr Leu Met Val Val Met Asp Glu Arg Asp Lys 35 40 45 CGT CCG TTT TCA ATG GCG TCA ACG CCT TCA GAA AAG GAG TTT ATT GAA 238 Arg Pro Phe Ser Met Ala Ser Thr Pro Ser Glu Lys Glu Phe Ile Glu 50 55 60 TTA CAT ATT GGT GCT TCT GAA CTG AAT TTG TAT GCA ATG GCT GTG ATG 286 Leu His Ile Gly Ala Ser Glu Leu Asn Leu Tyr Ala Met Ala Val Met 65 70 75 GAT AGA ATT CTG GAT CAG AAA GTG ATC AAT ATT GAT ATC CCT CAT GGC 334 Asp Arg Ile Leu Asp Gln Lys Val Ile Asn Ile Asp Ile Pro His Gly 80 85 90 AAA GCT TGG TTC CGT AAA AGC AGC GCT AAT CCG TTG TTA TTA ATT GCT 382 Lys Ala Trp Phe Arg Lys Ser Ser Ala Asn Pro Leu Leu Leu Ile Ala 95 100 105 110 GGC GGT ACG GGG TTT TCT TAC ACC CGT TCA ATA TTA TTG ACA GCG TTG 430 Gly Gly Thr Gly Phe Ser Tyr Thr Arg Ser Ile Leu Leu Thr Ala Leu 115 120 125 GAA GAA CAA CCA AAA CGT CAT ATC TCT ATG TAT TGG GGG GGC AGA GAA 478 Glu Glu Gln Pro Lys Arg His Ile Ser Met Tyr Trp Gly Gly Arg Glu 130 135 140 TCA CAA CAT TTA TAT GAT CTT GCT GAA TTA CGG TTA CTT ACA GAA CGC 526 Ser Gln His Leu Tyr Asp Leu Ala Glu Leu Arg Leu Leu Thr Glu Arg 145 150 155 TAT CCT AAT TTG AAG GTT ATT CCA GTT GTT GAA CAG TCA GAT AAT GGT 574 Tyr Pro Asn Leu Lys Val Ile Pro Val Val Glu Gln Ser Asp Asn Gly 160 165 170 TGG TGT GGA CGT ACA GGA ACA GTG CTT AAA GCA GTA CTA GAG GAT TTT 622 Trp Cys Gly Arg Thr Gly Thr Val Leu Lys Ala Val Leu Glu Asp Phe 175 180 185 190 GGT AGT TTG GCC AAT TAT GAT ATC TAC ATT GCA GGG CGA TTC GAA ATG 670 Gly Ser Leu Ala Asn Tyr Asp Ile Tyr Ile Ala Gly Arg Phe Glu Met 195 200 205 GCA AAA ATT GCT CGC GAG CGC TTT TGT AGT GAG CGT GAT GCT TCT GCT 718 Ala Lys Ile Ala Arg Glu Arg Phe Cys Ser Glu Arg Asp Ala Ser Ala 210 215 220 GAC AGC ATG TAT GGT GAT GCT TTC GAA TTC ATT TAG AAT AAT AAA AAA 766 Asp Ser Met Tyr Gly Asp Ala Phe Glu Phe Ile *** 225 230 ACC CGC CCC TGA CAG GCG GGA ATT ACG GCA ACA ACG ACT CAG TTA TAA 814 TAA TTC TTA TAT ACC CGT CAT CTT TCA AGT TGC CTC TTT GTT GGC TGC 862 ACT CAC TCA CCC CGG TTA CAT AGT TTT CTA TGC TCC TGG GGA TTC ATT 910 CAC TTG CCG CCG CGC TGC AAC TCG AAA TCT ATT AGG TAT AGA TAA GTT 958 CTT AAT CCA TTC TTT CTA TAA TGG TGG CGA TAC CTT GGC CTA AAC CGA 1006 TAC ACA TGG TTG CTA GGC CAA ACT GAA CAT CGC GGC GTT CCA TTA AGT 1054 TCA ACA ACG TTG TTG TGA TGC GAG CGC CTG AGC AGC CTA AAG GAT GAC 1102 CCA GAG CAA TTG CGC CAC CAT TCA GGT TAA CTT TGT CAT CCA TAC TAT 1150 CCA GCA AAT TCA GAC TTT CAG GCA GGC AAG TGA CTG AGC AGC AAA TGC 1198 TTC GTT TAG TTC AAT CAC GCC GAT ATC 1225

【００３７】配列番号：４配列の長さ：２２３配列の型：アミノ酸配列の種類：タンパク質

【００３８】配列 Met Thr Thr Leu Ser Cys Lys Val Thr Ser Val Glu Ala Ile Thr Asp 5 10 15 Thr Val Tyr Arg Val Arg Leu Leu Pro Asp Ser Pro Phe Leu Phe Arg 20 25 30 Ala Gly Gln Tyr Leu Met Val Val Met Asp Glu Arg Asp Lys Arg Pro 35 40 45 Phe Ser Met Ala Ser Thr Pro Ser Glu Lys Glu Phe Ile Glu Leu His 50 55 60 Ile Gly Ala Ser Glu Leu Asn Leu Tyr Ala Met Ala Val Met Asp Arg 65 70 75 80 Ile Leu Asp Gln Lys Val Ile Asn Ile Asp Ile Pro His Gly Lys Ala 85 90 95 Trp Phe Arg Lys Ser Ser Ala Asn Pro Leu Leu Leu Ile Ala Gly Gly 100 105 110 Thr Gly Phe Ser Tyr Thr Arg Ser Ile Leu Leu Thr Ala Leu Glu Glu 115 120 125 Gln Pro Lys Arg His Ile Ser Met Tyr Trp Gly Gly Arg Glu Ser Gln 130 135 140 His Leu Tyr Asp Leu Ala Glu Leu Arg Leu Leu Thr Glu Arg Tyr Pro 145 150 155 160 Asn Leu Lys Val Ile Pro Val Val Glu Gln Ser Asp Asn Gly Trp Cys 165 170 175 Gly Arg Thr Gly Thr Val Leu Lys Ala Val Leu Glu Asp Phe Gly Ser 180 185 190 Leu Ala Asn Tyr Asp Ile Tyr Ile Ala Gly Arg Phe Glu Met Ala Lys 195 200 205 Ile Ala Arg Glu Arg Phe Cys Ser Glu Arg Asp Ala Ser Ala Asp Ser 210 215 220 Met Tyr Gly Asp Ala Phe Glu Phe Ile 225 230

【図面の簡単な説明】

【図１】大腸菌のフラビン還元酵素のＮ末端及びＣ末端
アミノ酸配列と合成オリゴヌクレオチド・プライマー。

【図２】本発明の酵素遺伝子の制限酵素地図およびシー
ケンス・ストラテジーを示す。矢印は塩基配列を決定し
た方向を示す。ボックスで示したところが、酵素の構造
遺伝子部分に相当する。

【図３】本発明に係る発光細菌のフラビン還元酵素遺伝
子を含有する本発明の発現ベクターｐＸＦＲ１の構築工
程を示す。白ボックスはフラビン還元酵素遺伝子のコー
ディング領域である。点線はｐＵＣのベクター部分を、
黒ボックスは大腸菌のラクトースオペロンのプロモータ
ー部分を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/02 (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 1:01）Ｃ１２Ｒ 1:01））

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で表される塩基配列を含む、
フラビン還元酵素遺伝子。【配列表１】
【請求項２】配列番号２で表される塩基配列を含む請
求項１記載のフラビン還元酵素遺伝子。【配列表２】
【請求項３】塩基配列が配列番号３で表されるフラビ
ン還元酵素遺伝子。【配列表３】
【請求項４】配列番号４で表されるアミノ酸配列を有
するフラビン還元酵素。【配列表４】
【請求項５】塩基配列が配列番号１で表されるＤＮＡ
を含有する組換えベクター。【配列表１】
【請求項６】配列番号２で表される塩基配列を有する
遺伝子がプラスミドベクターへ挿入された請求項５記載
の組換えベクター。【配列表１】
【請求項７】配列番号１で表される塩基配列を有する
ＤＮＡを含む組換えベクターを含有する細菌。【配列表１】
【請求項８】塩基配列が配列番号１で表されるＤＮＡ
を含む組換えベクターで修飾されてなる細菌を培養する
ことからなる配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む
酵素の製法。【配列表１】