KR20110044753A - 기능 개선된 ｒｎａ 중합효소 변이체 - Google Patents

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Abstract

서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 적어도 786번째의 글루타민, 179번째의 리신 및 685번째의 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개에 상당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어, 야생형 T7유사 박테리오파지의 RNA 중합효소와 비교해서, 열안정성 및/또는 비활성이 향상되어 있는 것을 특징으로 하는 T7 RNA 중합효소 변이체.

Description

기능 개선된 ＲＮＡ 중합효소 변이체{RNA POLYMERASE MUTANT WITH IMPROVED FUNCTIONS}
본 발명은 야생형 RNA 중합효소(polymerase)의 아미노 서열의 일부에 변이를 도입함으로써 개선된 기능을 가지는 RNA 중합효소, 특히 열안정성 및/또는 비활성(specific activity)이 향상된 RNA 중합효소, 해당 RNA 중합효소를 코드하는 유전자, 상기 RNA 중합효소의 생산방법 및 상기 RNA 중합효소에 의한 RNA의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 고온 조건하에서 야생형보다도 안정성 및/또는 비활성이 향상된, 박테리오파지(bacteriophage)로부터 얻어지는 변이형 RNA 중합효소, 특히 T7 RNA 중합효소에 관한 것이다. 대장균에 감염시킬 수 있는 박테리오파지로서, T3, T7, φI, φII, W31, H, Y, A1, croC21, C22 및 C23이 있지만, 그 중 T7 파지에 의해서 코드되는 RNA 중합효소가 T7 RNA 중합효소이다.
T7 RNA 중합효소의 특징으로서, 우선, 프로모터(promoter) 서열에 대한 높은 선택성이 있다. T7 RNA 중합효소는, 자신의 특이한 프로모터 서열에는 결합하지만, 그 이외의 프로모터 서열과는 다른 박테리오파지의 프로모터 서열이더라도 결합하지 않는다. 이 높은 선택성에 의해, RNA 중합효소의 전사 반응이 숙주의 게놈에 대해서가 아니라 자신의 게놈에 대해서 확실히 지향될 수 있다.
다음에, T7 RNA 중합효소는, 다른 중합효소와 달리, 보조 인자를 필요로 하지 않고, 프로모터를 인식하여, 전사를 개시하고, RNA 전사물을 신장시켜, 전사를 종결시킨다고 하는 일련의 성능을 지니고 있고, 전사 속도도 대장균의 RNA 중합효소와 비교해서 5배 빠르게 RNA를 신장시킬 수 있다.
또한, 분자량이 98.6kDa이고 883 아미노산의 단쇄 단백질이므로, 효소의 안이한 대량 제조가 가능하다.
이상 기술된 유리한 점을 지니는 결과, T7 RNA 중합효소는 각종 분야에서 적극적으로 이용되고 있고, 예를 들어, 시험관내 전사(in vitro transcription)나 대장균에 있어서의 고발현계(미국 특허 제4952496호: 특허문헌 1), 무세포 단백 합성계, 염기 서열 결정법(일본국 공개특허 평11-18799호 공보: 특허문헌 2), 등온핵산증폭법 중에서 이용되고 있다. 등온핵산증폭법의 하나인 TRC법(일본국 공개특허 제2000-14400호 공보: 특허문헌 3 및 Ishiguro T. et al., Analytical Biochemistry, 314, 77-86(2003): 비특허문헌 1)에 대해서 상세히 설명한다.
TRC법은 DNA 의존성 RNA 중합효소와 역전사효소와의 협주적 작용에 의해서 특정한 RNA 서열을 포함하는 표적 RNA를 증폭하는 방법이다. 즉, 표적으로 되는 RNA에 대해서 T7 프로모터 서열을 포함하는 프라이머와 역전사효소 및 리보누크레아제 H에 의해 프로모터 서열을 포함하는 2본쇄 DNA를 합성하여, T7 RNA 중합효소에 의해 특정 RNA 서열로 이루어진 RNA를 합성한다. 이후 생성된 RNA를 상기 프로모터 서열을 포함하는 2본쇄 DNA 합성의 주형으로 해서, 상기의 반응을 연쇄적으로 행하는 것이다. TRC법에 의한 핵산증폭법은 PCR법으로 증폭할 경우와 달리, 일정한 온도에서 반응시키는 것이 가능하므로, 복잡한 온도 컨트롤을 필요로 하지 않는 장점이 있다. 그러나, 야생형 T7 RNA 중합효소를 사용해서 TRC법을 이용한 핵산증폭을 행하면, 46℃ 이상의 조건에서는 T7 RNA 중합효소의 활성저하에 의해 핵산증폭 효율의 저하를 보였다. 그 때문에 현상황의 TRC법에서의 핵산증폭은 일반적으로 40℃ 내지 45℃라고 하는 비교적 저온 조건하에서 행해지고 있다. 저온조건하에서는, RNA가 복잡한 고차구조를 취하기 쉽고, 그것이 TRC법에 있어서의 고감도로 검출하는 프라이머의 설계를 곤란하게 해왔다. 그 때문에. 46℃ 이상의 조건에 있어서도, 열안정성 및/또는 비활성이 높은 T7 RNA 중합효소가 요구되어 왔다.
변이에 의해 각종 개선된 기능을 지니는 RNA 중합효소는, T7 RNA 중합효소의 활성을 측정하는 계가 확립되어 있으므로(Ikeda R. A. et al., Biochemistry, 31, 9073-9080(1992): 비특허문헌 2 및 Ikeda R. A. et al., Nucl. Acid. Res., 20, 2517-2524(1992): 비특허문헌 3), 지금까지 몇 가지 제작되어 있다. 예를 들어, 아미노산 치환에 의해 인식하는 프로모터 서열을 개변한 효소(미국 특허 제5385834호 공보: 특허문헌 4), 고온에서의 비활성 및 열안정성을 높인 효소(일본국 특표 제2003-525627호 공보: 특허문헌 5), 아미노산의 결실과 치환에 의해 3'-데옥시리보뉴클레오타이드의 취입능을 증강시킨 효소 등이다(일본국 공개특허 제2003-61683호 공보: 특허문헌 6).
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 야생형과 비교해서 열안정성 및/또는 비활성이 향상된 T7 RNA 중합효소 변이체와 그 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해서 검토한 결과, 야생형 T7 RNA 중합효소의 아미노산을 유전자공학적 수법에 의해서 치환함으로써, 열안정성 또는 비활성이 향상되는 아미노산 부위를 찾아내어, 야생주와 비교해서 열안정성 또는 비활성이 향상된 변이체의 작성에 성공하였다. 또한, 열안정성이 향상된 아미노산 부위의 변이와, 비활성이 향상된 아미노산 부위의 변이를 조합시킴으로써, 열안정성 및 비활성이 향상된 변이체의 작성에 성공하였다.
상세하게는, 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 적어도 786번째의 글루타민 및/또는 179번째의 리신에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산으로 치환한 T7 RNA 중합효소 변이체가, 야생형 T7 RNA 중합효소와 비교해서 열안정성 및/또는 열안정성이 향상되어 있는 것을 찾아내었다.
또, 상기 부위와는 다른 부위의 아미노산 잔기, 즉, 685번째의 발린에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산으로 치환함으로써, 야생형 T7 RNA 중합효소와 비교해서 열안정성 및/또는 열안정성이 향상되어 있는 것을 찾아내었다.
또한, 상기 각 아미노산 잔기를 각각 조합시킴으로써, 더욱더 열안정성 및/또는 열안정성이 향상된 T7 RNA 중합효소 변이체를 얻을 수 있었다.
즉, 본 발명은, 이하의 발명을 포함한다:
(1) 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 적어도 786번째의 글루타민, 179번째의 리신 및 685번째의 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개에 상당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어, 야생형 T7유사 박테리오파지의 RNA 중합효소와 비교해서, 열안정성 및/또는 비활성이 향상되어 있는 것을 특징으로 하는 T7 RNA 중합효소 변이체.
(2) 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 적어도 786번째의 글루타민에 상당하는 아미노산 잔기가 소수성 아미노산으로 치환되어, 야생형 T7유사 박테리오파지의 RNA 중합효소와 비교해서 열안정성 및/또는 비활성이 향상되어 있는 것을 특징으로 하는 T7 RNA 중합효소 변이체.
(3) 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 적어도 786번째의 글루타민에 상당하는 아미노산 잔기가 로이신 또는 메티오닌으로 치환되어, 야생형 T7유사 박테리오파지의 RNA 중합효소와 비교해서 열안정성 및/또는 비활성이 향상되어 있는 것을 특징으로 하는 T7 RNA 중합효소 변이체.
(4) 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 추가로, 적어도 179번째의 리신에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산, 아스파라긴, 시스테인 중 어느 하나로 치환되어, 야생형 T7유사 박테리오파지의 RNA 중합효소와 비교해서, 열안정성 및 비활성이 향상되어 있는 것을 특징으로 하는, 상기 (2) 또는 (3)항에 기재된 T7 RNA 중합효소 변이체.
(5) 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 적어도 179번째의 리신에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산, 아스파라긴, 시스테인 중 어느 하나로 치환되어, 야생형 T7유사 박테리오파지의 RNA 중합효소와 비교해서 열안정성 및/또는 비활성이 향상되어 있는 것을 특징으로 하는 T7 RNA 중합효소 변이체.
(6) 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 추가로, 적어도 685번째의 발린에 상당하는 아미노산 잔기가 중성 또는 약소수성 아미노산으로 치환되어, 야생형 T7유사 박테리오파지의 RNA 중합효소와 비교해서, 열안정성 및 비활성이 향상되어 있는 것을 특징으로 하는, 상기 (2) 내지 (5)항 중 어느 한 항의 T7 RNA 중합효소 변이체.
(7) 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 추가로, 적어도 685번째의 발린에 상당하는 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환되어, 야생형 T7유사 박테리오파지의 RNA 중합효소와 비교해서, 열안정성 및 비활성이 향상되어 있는 것을 특징으로 하는, 상기 (6)항의 T7 RNA 중합효소 변이체.
(8) 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 적어도 685번째의 발린에 상당하는 아미노산 잔기가 중성 또는 약소수성 아미노산으로 치환되어, 야생형 T7 RNA 중합효소와 비교해서 열안정성 및/또는 비활성이 향상되어 있는 것을 특징으로 하는 T7 RNA 중합효소 변이체.
(9) 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 적어도 685번째의 발린에 상당하는 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환되어, 야생형 T7 RNA 중합효소와 비교해서 열안정성 및/또는 비활성이 향상되어 있는 것을 특징으로 하는 T7 RNA 중합효소 변이체.
(10) 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 685번째의 발린에 상당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되고, 추가로, 179번째의 리신 및/또는 786번째의 글루타민에 상당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 T7 RNA 중합효소 변이체.
(11) 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 685번째의 발린에 상당하는 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환되고, 추가로, 179번째의 리신에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환 및/또는 786번째의 글루타민에 상당하는 아미노산 잔기가 로이신 또는 메티오닌으로 치환된 T7 RNA 중합효소 변이체.
(12) 상기 (1) 내지 (11)항 중 어느 한 항의 T7 RNA 중합효소 변이체를 코드하는 유전자.
(13) 상기 (1) 내지 (11)항 중 어느 한 항의 T7 RNA 중합효소 변이체를 코드하는 유전자를 발현해서 T7 RNA 중합효소를 생산하는 것이 가능한 세포.
(14) 상기 (1) 내지 (11)항 중 어느 한 항의 T7 RNA 중합효소 변이체를 코드하는 유전자를 발현시키는 것에 의한 T7 RNA 중합효소의 생산방법.
(15) 상기 (1) 내지 (11)항 중 어느 한 항의 T7 RNA 중합효소 변이체를 이용해서 RNA를 제조하는 방법.
(16) 상기 (1) 내지 (11)항 중 어느 한 항의 T7 RNA 중합효소 변이체를 이용해서 RNA를 증폭하는 방법.
본 발명의 변이형 T7 RNA 중합효소는, 야생형 T7 RNA 중합효소와 비교해서, 열안정성 및/또는 비활성이 향상되어 있기 때문에, 야생주와 비교해서, 보다 넓은 온도 범위에서의 전사 반응 및/또는 전사 반응 시간의 단축을 기대할 수 있다.
도 1은 T7 RNA 중합효소를 클로닝한 플라스미드 pTrc99A-T7 RNApol의 제한효소지도를 나타낸 도면;
도 2는 pCDF2 플라스미드의 제한효소지도를 나타낸 도면;
도 3은 T7 RNA 중합효소를 생산하는 플라스미드 pCDF2-T7 RNAP의 제한효소지도를 나타낸 도면;
도 4는 N 말단에 히스티딘 헥사머를 융합한 T7 RNA 중합효소를 생산하는 플라스미드 pCDF2-T7 RNAPHis의 제한효소지도를 나타낸 도면;
도 5는 T7 프로모터에 의해서 발현이 유도되는 GFP 유전자를 가지는 pSTVGFP의 제한효소지도를 나타낸 도면;
도 6은 제작한 T7 RNA 중합효소의 야생형과 그 변이체 K179E, Q786L 및 이중변이체(K179E+Q786L) 각각의 47℃에서의 가열에 대한 열안정성을 비교한 결과(전기영동사진)를 나타낸 도면으로, 해당 도면 중의 레인 1은 야생형의, 레인 2는 K179E변이체의, 레인 3은 Q786L 변이체의, 레인 4는 (K179E+Q786L) 변이체의 T7 RNA 중합효소를 각각 이용한 때의 결과임;
도 7은 제작한 T7 RNA 중합효소의 야생형과 그 변이체 K179E, Q786L 및 이중변이체(K179E+Q786L) 각각의 43℃ 내지 50℃에서의 RNA 생산량을 비교한 결과를 나타낸 도면;
도 8은 제작한 T7 RNA 중합효소의 야생형과 그 변이체 K179E, K179C 및 K179N 각각의 43℃ 내지 50℃에서의 RNA 생산량을 비교한 결과를 나타낸 도면;
도 9는 제작한 T7 RNA 중합효소의 야생형과 그 변이체 Q786L, Q786M, Q786F 및 Q786Y 각각의 43℃ 내지 50℃에서의 RNA 생산량을 비교한 결과를 나타낸 도면;
도 10은 야생형 T7 RNA 중합효소, 변이체 T7 RNA 중합효소 Q786L, Q786M, Q786F, Q786Y, K179E, K179C 및 K179N 각각의 47℃에서의 가열에 대한 열안정성을 비교한 결과를 나타낸 도면;
도 11은 야생형 T7 RNA 중합효소, (K179E+Q786L) 이중변이체 및 (K179E+Q786L+V685A) 삼중변이체, 각각의 43℃ 내지 50℃에서의 RNA 생산량을 비교한 결과를 나타낸 도면;
도 12는 야생형 T7 RNA 중합효소, (K179E+Q786L) 이중변이체 및 (K179E+Q786L+V685A) 삼중변이체, 각각의 48℃에서의 가열에 대한 열안정성을 비교한 결과를 나타낸 도면;
도 13은 살모넬라 stn RNA를 표적으로, 야생형 T7 RNA 중합효소 및 (Q786L+V685A) 이중변이체를 이용하여, TRC법에 의한 등온 핵산 증폭반응을 행한 결과를 나타낸 도면;
도 14는 야생형 T7 RNA 중합효소 및 V685A 변이체 각각의 43℃ 내지 49℃에서의 RNA 생산량을 비교한 결과를 나타낸 도면;
도 15는 야생형 T7 RNA 중합효소 및 V685A 변이체 각각의 46℃에서의 가열에 대한 열안정성을 비교한 결과를 나타낸 도면;
도 16은 야생형 T7 RNA 중합효소, V685A 변이체 및 (V685A+Q786M) 이중변이체, 각각의 43℃ 내지 50℃에서의 RNA 생산량을 비교한 결과를 나타낸 도면.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
제1관점에 있어서, 본 발명에서 개시하는, 열안정성 및/또는 비활성이 향상된 T7 RNA 중합효소는, 서열 번호 6으로 표시되는 야생형의 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 적어도 786번째의 글루타민에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산으로 치환한 것으로, 바람직하게는 치환한 아미노산이 소수성 아미노산(로이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신) 중 어느 하나이며, 더 바람직하게는 치환한 아미노산이 로이신 또는 메티오닌이다. 또, 본 명세서에 있어서 「786번째의 글루타민에 상당하는 아미노산 잔기」란, 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 기준으로 했을 때, 786번째에 있는 글루타민 잔기를 의미하고, 서열 번호 6으로 표시되는 서열로 이루어진 T7 RNA 중합효소의 5'말단측에 폴리펩타이드가 부가 또는 삭제된 경우에는, 상기 부가 또는 삭제된 폴리펩타이드의 길이의 분량만큼 위치가 어긋난다(예를 들어 서열 번호 6으로 표시되는 서열로 이루어진 T7 RNA 중합효소의 5'말단측에 아미노산 10잔기로 이루어진 폴리펩타이드가 부가된 T7 RNA 중합효소의 경우, 「786번째의 글루타민에 상당하는 아미노산 잔기」는 796번째에 있는 글루타민으로 된다).
제2관점에 있어서, 본 발명에서 개시하는, 열안정성 및/또는 비활성이 향상된 T7 RNA 중합효소는, 서열 번호 6으로 표시되는 야생형의 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 적어도 179번째의 리신에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산으로 치환한 것으로, 바람직하게는 치환한 아미노산이 글루타민산, 아스파라긴, 시스테인 중 어느 하나이며, 더 바람직하게는 치환한 아미노산이 글루타민산이다. 또, 본 명세서에 있어서 「179번째의 리신에 상당하는 아미노산 잔기」란, 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 기준으로 했을 때, 179번째에 있는 리신 잔기를 의미하고, 서열 번호 6으로 표시되는 서열로 이루어진 T7 RNA 중합효소의 5'말단측에 폴리펩타이드가 부가 또는 삭제된 경우에는, 상기 부가 또는 삭제된 폴리펩타이드의 길이의 분량만큼 위치가 어긋난다.
제3관점에 있어서, 본 발명에서 개시하는, 열안정성 및 비활성이 향상된 T7 RNA 중합효소는, 서열 번호 6으로 표시되는 야생형의 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 적어도 786번째의 글루타민에 상당하는 아미노산 잔기 및 179번째의 리신에 상당하는 아미노산 잔기를 각각 다른 아미노산으로 치환한 것으로, 바람직하게는 786번째의 아미노산 잔기를 소수성 아미노산(로이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신) 중 어느 하나로, 179번째의 아미노산 잔기를 글루타민산, 아스파라긴, 시스테인 중 어느 하나로 각각 치환한 것이며, 더 바람직하게는 786번째의 아미노산 잔기를 로이신 또는 메티오닌으로, 179번째의 아미노산 잔기를 글루타민산, 아스파라긴, 시스테인 중 어느 하나로 각각 치환한 것이다.
제4관점에 있어서, 본 발명에서 개시하는, 열안정성 및/또는 비활성이 향상된 T7 RNA 중합효소는, 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 적어도 685번째의 발린에 상당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 것이며, 바람직하게는 상기 아미노산이 중성 또는 약소수성 아미노산(알라닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민) 중 어느 하나로 치환되고, 더 바람직하게는 치환된 아미노산이 알라닌이다. 또, 본 명세서에 있어서 「685번째의 발린에 상당하는 아미노산 잔기」란, 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 기준으로 했을 때, 685번째에 있는 발린 잔기를 의미하고, 서열 번호 6으로 표시되는 서열로 이루어진 T7 RNA 중합효소의 5'말단측에 폴리펩타이드가 부가 또는 삭제된 경우에는, 상기 부가 또는 삭제된 폴리펩타이드의 길이의 분량만큼 위치가 어긋난다(예를 들어, 서열 번호 6으로 표시되는 서열로 이루어진 T7 RNA 중합효소의 5'말단측에 아미노산 10잔기로 이루어진 폴리펩타이드가 부가된 T7 RNA 중합효소의 경우, 「685번째의 발린에 상당하는 아미노산 잔기」는 695번째에 있는 리신으로 된다).
제5관점에 있어서, 본 발명에서 개시하는, 열안정성 및/또는 비활성이 향상된 T7 RNA 중합효소는, 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 전술한 685번째의 발린에 상당하는 아미노산 잔기의 치환에 부가해서, 또한, 179번째의 리신 및/또는 786번째의 글루타민에 상당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 것이며, 바람직하게는 179번째의 리신에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 및/또는 786번째의 글루타민에 상당하는 아미노산 잔기가 로이신 또는 메티오닌으로 각각 치환된 것이다. 또한, 본 명세서에 있어서 「179번째의 리신 및/또는 786번째의 글루타민에 상당하는 아미노산 잔기」란, 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 기준으로 했을 때, 179번째에 있는 리신 및/또는 786번째에 있는 글루타민 잔기를 의미하고, 서열 번호 6으로 표시되는 서열로 이루어진 T7 RNA 중합효소의 5'말단측에 폴리펩타이드가 부가 또는 삭제된 경우에는, 상기 부가 또는 삭제된 폴리펩타이드의 길이의 분량만큼 위치가 어긋난다.
본 발명의 변이형 T7 RNA 중합효소는, 야생형 T7 RNA 중합효소 유전자에 변이를 도입하는 것으로 제작할 수 있다. 소정의 핵산서열에 원하는 변이를 도입하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 부위특이적 변이유발법, 축중 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 PCR, 핵산을 포함하는 세포의 변이유발제 또는 방사선에의 노출이라고 하는 공지의 기술을 적절하게 사용함으로써, 변이를 지니는 DNA를 구축할 수 있다.
야생형 T7 RNA 중합효소 유전자의 입수는, 당업자가 할 수 있는 방법이면 어떠한 방법이라도 되지만, 예를 들어, T7 파지(DSM No. 4623, ATCC 11303-B7, NCIMB10380 등)로부터, 그 게놈 정보로부터 제작한 적당한 프라이머를 이용해서 PCR에 의해서 취득할 수 있다.
본 발명의 효소의 취득 방법에 대해서는, 특별히 제한은 없고, 화학합성에 의해 합성한 단백질이어도 되고, 유전자 재조합 기술에 의해 제작한 재조합 단백질이어도 된다. 유전자 재조합 기술을 이용해서 취득할 경우, T7 RNA 중합효소 유전자를 적당한 방법으로 숙주에 편입시킴으로써 목적의 효소를 얻 수 있다.
사용되는 숙주에는 효모, 동물세포주, 식물세포, 곤충세포 등 각종 배양 세포를 사용할 수 있지만, T7 RNA 중합효소 유전자의 경우, 원래의 박테리오파지의 감염처이며, 또한 취급이 간편한 대장균을 숙주로서 이용하는 것이 바람직하다. 형질전환에 이용하는 대장균은 JM109주, HB101주를 예시할 수 있지만 그들로 한정되지 않는다.
본 발명의 유전자는 적당한 벡터 중에 삽입해서 사용할 수 있다. 본 발명에서 이용하는 벡터의 종류는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 자립 복제형 벡터이어도 되고, 혹은, 숙주세포에 도입되었을 때 숙주세포의 게놈에 편입되는 것이어도 된다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용하는 벡터는 발현 벡터이다. 발현 벡터에 있어서 본 발명의 유전자는, 전사에 필요한 요소(예를 들어, 프로모터 등)가 기능적으로 연결된다. 프로모터는 숙주세포에 있어서 전사 활성을 나타내는 DNA 서열이며, 숙주의 종류에 따라서 적절하게 선택할 수 있다. 대장균으로 사용할 수 있는 프로모터에는 lac, trp 혹은 tac 프로모터 등을 들 수 있고, 숙주에 대장균을 이용할 경우에는 적절한 플라스미드에 목적의 유전자를 편입시켜 넣고, 형질전환시키는 방법이 간편하다. 사용하는 플라스미드는 pTrc99A(GE헬스케어 바이오사이언스사 제품), pCDF-1b(다카라 바이오사 제품)라고 하는 발현용 플라스미드를 예시할 수 있지만, 그들로 한정되지 않고, 일반적인 대장균용 벡터이면 당업자가 입수할 수 있는 벡터를 사용하면 된다. 또한, 제작하는 T7 RNA 중합효소 유전자는 효소의 정제를 위하여 유용한 서열을 부가해도 된다. 예를 들어, 시그널 펩타이드를 이용해서 세포외 분비형 효소로 하거나, 시그널 펩타이드로서 말단에 히스티딘 헥사머를 포함한 태그(tag) 서열이 부가되도록 유전자를 제작할 수 있다. 무엇보다, 시그널 펩타이드의 종류나 시그널 펩타이드와 본 효소의 결합 방법은 상기 방법에 한정되는 것은 아니고, 당업자가 이용 가능한 임의의 시그널 펩타이드를 이용할 수 있다.
제작한 형질전환체는, 도입된 DNA 구축물의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 적절한 영양배지 중에서 배양함으로써, 본 발명의 효소를 취득할 수 있다. 형질전환체의 배양물로부터의 단리정제에는, 통상의 단백질에서 이용되는 단리, 정제법을 이용하면 된다. 예를 들어, 본 발명의 효소가 세포 내에 발현되었을 경우에는, 배양 종료 후, 세포를 원심분리에 의해 회수해서 적당한 수계 완충액에 현탁 후, 리소자임 처리나 초음파 파쇄기 등에 의해 세포를 파쇄하여, 무세포 추출액을 얻는다. 또한, 무세포 추출액을 원심분리함으로써 얻어진 상청액을 통상의 단백질의 단리정제법으로 정제한다. 즉, 용매추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기용매에 의한 침전법, 다이에틸아미노에틸(DEAE) 토요펄(상품명)(토소사 제품)이라고 하는 레진(resin)을 이용한 음이온교환 크로마토그래피법, 뷰틸토요펄 및 페닐토요펄(상품명)(토소사 제품)이라고 하는 레진을 이용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 이용한 겔여과법, 친화성 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점전기영동이라고 하는 전기영동법 등의 수법을 단독 혹은 조합시켜서 이용하여, 정제 표품(標品)을 얻는 것이 가능하다. 또한, 시그널 펩타이드를 이용해서 대응하는 방법으로 정제하는 방법도 간편하며, 예를 들어, 히스티딘 헥사머 서열과 니켈 칼럼을 사용함으로써 용이하게 정제할 수 있다.
본 발명의 T7 RNA 중합효소 변이체는, 상기 방법 이외에도, 예를 들어, 화학적으로 합성해서 얻을 수도 있다.
상기에서 설명한 본 발명의 효소는, 종래 알려져 있는 T7 RNA 중합효소로서, 각 용도에서 사용할 수 있다. 즉, 본 발명의 효소는, RNA 중합효소로서, RNA를 합성하기 위해서 사용할 수 있다. 구체적으로는, 기질로서 리보누클레오타이드(ATP, CTP, GTP, UTP)를 사용하여, 특정 서열을 갖는 이중쇄 DNA를 주형으로 해서, 단일쇄 RNA 합성을 행할 수 있다.
또, 본 발명의 RNA 중합효소는, 역전사효소와의 협주적 작용에 의해 특정한 RNA 서열을 포함하는 표적 RNA를 증폭하는 등온 핵산 증폭반응에도 사용할 수 있다. 등온 핵산 증폭반응으로서는 TRC법(특허문헌 3 및 비특허문헌 1), NASBA법, TMA법 등을 들 수 있다.
본 발명의 T7 RNA 중합효소 변이체는, 야생형 T7 RNA 중합효소와 비교해서 열안정성 및/또는 비활성이 향상되어 있다. 그 때문에, 야생형과 비교해서 보존이 용이하고, 또 장기간의 보존도 가능하다. 따라서, 사용하기 편하고, 장기에 걸쳐서 사용가능한 시약을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 T7 RNA 중합효소 변이체는, 야생형보다도 고온 조건하에서 사용 가능하므로, 전사 반응이나 등온 핵산 증폭반응에 있어서의 실험 조건을 개선하는 것이 가능하여, 시험관내, 생체내를 막론하고, 야생형보다도 넓은 온도범위에서 사용가능하다.
특히 TRC법을 이용한 등온 핵산 증폭반응에 있어서, 야생형 T7 RNA 중합효소를 사용한 경우에는 상기 효소가 46℃ 이상에서 활성저하를 일으키므로, 40℃ 내지 45℃라고 하는 비교적 저온 조건하에서 핵산증폭 반응을 행할 필요가 있었다. 또, 상기 온도조건 하에서는, RNA가 복잡한 고차구조를 취하기 쉽고, 그것이 고감도로 검출하는 프라이머의 설계를 곤란하게 해왔다. 한편, 본 발명의 T7 RNA 중합효소 변이체는 46℃ 이상의 온도조건 하에서, 야생형보다 안정성 및/또는 비활성이 향상되고 있다. 그 때문에, TRC법에 의한 핵산증폭 반응을 46℃ 이상의 온도 조건하에서 실시하는 것이 가능해지고, 종래보다 검출 시간이 단축된 핵산증폭 시약을 제공할 수 있다. 또 고온조건하에서는, RNA가 복잡한 고차구조를 취하기 어려워지므로, 보다 고감도로 검출하는 프라이머의 설계도 용이해진다. 그 때문에, 본 발명의 T7 RNA 중합효소 변이체를 이용해서, TRC법에 의한 핵산증폭 반응을 46℃ 이상의 온도 조건하에서 행함으로써, 종래보다 고감도로 검출하는 핵산 증폭 시약도 제공할 수 있다.
실시예
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 - T7 RNA 중합효소 유전자 의 클로닝
T7 RNA 중합효소 유전자의 클로닝은 이하의 방법에 따라서 실시하였다.
(1) T7 파지 게노믹 DNA 게노믹 라이브러리(시그마사 제품)를 주형 플라스미드로 하고, T7 RNA 중합효소 유전자를, 이하의 시약조성 및 반응 조건에서, 전반부분과 후반부분으로 나누어서 PCR법을 이용해서 증폭하였다. 또, 시약조성 중 합성 DNA 프라이머는, 전반부분의 증폭에는 프라이머 FF(서열 번호 1) 및 프라이머 FR(서열 번호 2)을, 후반부분의 증폭에는 프라이머 RF(서열 번호 3) 및 프라이머 RR(서열 번호 4)을 각각 이용하였다.
(시약조성) (총 반응액량: 100㎕)
합성 DNA 프라이머 각 200pM
주형 플라스미드 100ng
dNTPs 0.2mM
TaqDNA 중합효소 0.025유닛(unit)/㎕
(TaKaRa Ex Taq(상품명), 다카라 바이오사 제품)
효소에 부속되는 버퍼
(반응 조건)
써멀 사이클러(Thermal cycler)(퍼킨-엘머사 제품)를 이용해서, 94℃에서 2분 가열 후, 94℃에서 1분, 58℃에서 30초 및 72℃에서 1분의 온도 사이클을 25회 반복하였다.
(2) PCR 반응 후의 액을 1% 아가로스 전기영동으로 영동 후, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 염색을 행하고, 염색 후의 겔로부터 목적 산물의 밴드(band)를 잘라냄으로써, PCR 산물을 정제하였다.
(3) 정제한 PCR 산물 중, 전반부분의 PCR 산물을 제한 효소 BspHI 및 HindIII(타카라바이오사 제품)로 소화시키고, 제한 효소 NcoI(타카라바이오사 제품) 및 HindIII로 소화시킨 pTrc99A 벡터(GE 헬스케어 바이오사이언스사 제품)에 T4 리가제를 이용해서 4℃에서 30분 반응시켰다.
(4) 상기 (3)의 반응액을 이용해서 대장균 JM109주를 형질전환시키고, LBG/Crb 한천 배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, 0.5% 글루코스, 1% 한천, 50㎍/㎖ 카베니실린(Carbenicillin)(pH 7.4)) 상에서 선택적으로 배양하고, 37℃에서 하룻밤 배양 후에 생육되어온 콜로니가 보유하는 플라스미드를 pTrc99A-T7F라 하였다.
(5) 상법에 따라 pTrc99A-T7F를 조제 후, 후반부분의 PCR 산물을 제한 효소 HindIII로 소화시키고, 제한 효소 HindIII로 소화시킨 pTrc99A-T7F에 T4 리가제를 이용해서 4℃에서 30분 반응시켰다.
(6) 상기 (5)의 반응액을 이용해서 대장균 JM109주를 형질전환시키고, LBG/Crb 한천 배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, 0.5% 글루코스, 1% 한천, 50㎍/㎖ 카베니실린(pH 7.4)) 상에서 선택적으로 배향하고, 37℃에서 하룻밤 배양 후에 생육되어온 콜로니가 보유하는 플라스미드를 pTrc99A-T7 RNApol이라 하였다. 도 1에 pTrc99A-T7 RNApol의 제한효소지도를 나타낸다. 또한, T7 RNA 중합효소 유전자에 대해서는 실시예 6에 나타낸 방법을 이용해서 염기 서열을 결정함으로써, 의도하지 않는 변이가 도입되어 있지 않은 것을 확인하였다. 얻어진 T7 RNA 중합효소의 유전자 서열을 서열 번호 5에 나타내는 한편, 아미노산 서열을 서열 번호 6에 나타낸다.
실시예 2 - 발현 벡터의 제작
실시예 1에서 제작한 pTrc99A-T7 RNApol(도 1)을 주형으로 해서 T7 RNA 중합효소 유전자를 포함한 DNA 단편을 PCR법에서 증폭시키고, pCDF2 플라스미드(도 2)와 연결하였다.
(1) pTrc99A-T7 RNApol(도 1)을 주형 플라스미드로 해서, 이하의 시약조성 및 반응 조건에서 PCR 반응을 행하였다.
(시약조성)(총 반응액량: 100㎕)
프라이머 pTrcF(서열 번호 7) 200pM
프라이머 pTrcR(서열 번호 8) 200pM
주형 플라스미드 100ng
dNTPs 0.2mM
TaqDNA 중합효소 0.025유닛/㎕
(TaKaRa Ex Taq(상품명), 타카라바이오사 제품)
효소에 부속되는 버퍼
(반응 조건)
써멀 사이클러(퍼킨-엘머사 제품)를 이용해서, 94℃에서 2분 가열 후, 94℃에서 1분, 58℃에서 30초 및 72℃에서 2분40초의 온도 사이클을 25회 반복하였다.
(2) 1% 아가로스 전기영동으로 영동 후, 에티디움 브로마이드 염색을 행하고, 염색 후의 겔로부터 목적 산물의 밴드를 잘라냄으로써, PCR 산물을 정제하였다.
(3) 정제한 PCR 산물을 제한 효소 EcoT22I(타카라바이오사 제품) 및 BlnI(타카라바이오사 제품)로 소화시키고, 제한 효소 PstI(타카라바이오사 제품) 및 BlnI로 소화시킨 pCDF2 플라스미드(도 2)에 T4 리가제를 이용해서 4℃에서 30분 반응시켰다.
(4) 상기 (3)의 반응액을 이용해서 대장균 JM109주를 형질전환시키고, LBG/Crb 한천 배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, 0.5% 글루코스, 1% 한천, 50㎍/㎖ 카베니실린(pH 7.4)) 상에서 선택적으로 배양하고, 37℃에서 하룻밤 배양 후에 생육되어온 콜로니가 보유하는 플라스미드를 pCDF2-T7 RNAP라 하였다. 도 3에 pCDF2-T7 RNAP의 제한효소지도를 나타낸다. 또한, T7 RNA 중합효소 유전자에 대해서는 실시예 6에 나타낸 방법을 이용해서 염기 서열을 결정함으로써, 의도하지 않은 변이가 도입되어 있지 않은 것을 확인하였다.
(5) pCDF2-T7 RNAP(도 3)를 기초로 이하에 나타낸 방법으로 히스티딘 헥사머의 도입을 행하였다.
(5-1) pCDF2-T7 RNAP(도 3)를 주형 플라스미드로 해서, 이하의 시약조성 및 반응 조건에서 1회째의 PCR 반응을 행하였다. 또한, 합성 프라이머는 프라이머 HisF(서열 번호 9)와 프라이머 pCDFR(서열 번호 10)의 조합, 또는 프라이머 HisR(서열 번호 11)과 프라이머 pCDFF(서열 번호 12)의 조합을 이용하였다.
(시약조성)(총 반응액량: 100㎕)
합성 DNA 프라이머 각 200pM
주형 플라스미드 100ng
dNTPs 0.2mM
DNA 중합효소 0.025유닛/㎕
(PrimeSTAR HS DNA polymerase(상품명), 타카라바이오사 제품)
효소에 부속되는 버퍼
(반응 조건)
써멀 사이클러(퍼킨-엘머사 제품)를 이용해서, 98℃에서 30초 가열 후, 98℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 3분의 온도 사이클을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 반응시켰다.
(5-2) 반응액을 1% 아가로스 전기영동으로 영동 후, 에티디움 브로마이드 염색을 행하고, 염색 후의 겔로부터 목적 산물의 밴드를 잘라냄으로써, PCR 산물을 정제하였다.
(5-3) 얻어진 2종류의 PCR 산물을 주형으로 하고, 합성 DNA 프라이머로서 프라이머 pCDFR(서열 번호 10)과 프라이머 pCDFF(서열 번호 12)의 조합을 이용해서 2회째의 PCR 반응을 행하였다. PCR 반응에 있어서의 시약조성 및 반응 조건은 합성 DNA 프라이머와 주형 이외에는 (5-1)과 같은 조건으로 행하고, 증폭한 산물을 (5-2)와 마찬가지로 아가로스겔에서 전기영동 후, 추출, 정제하였다.
(5-4) pCDF2-T7 RNAP 플라스미드(도 3)와, (5-3)에서 정제한 2회째의 PCR 산물에 0.2mM dNTPs, 0.025유닛/㎕ DNA 중합효소 및 효소에 부속되는 버퍼를 가하여, 총 반응액량을 100㎕로 하였다. 이 반응액을 써멀 사이클러를 이용해서 95℃에서 30초 가열 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 1분 및 68℃에서 8분의 온도 사이클을 18회 반복한 후, 68℃에서 7분간 반응시킴으로써 PCR 반응을 행하였다.
(5-5) PCR 반응 종료 후, 제한 효소 DpnI를 10유닛 가하여, 37℃에서 1시간 소화시키고, 상법에 따라 대장균 JM109에 형질전환하였다.
(5-6) 형질전환한 용액은 LBG/Crb한천 배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, 0.5% 글루코스, 1% 한천, 50㎍/㎖ 카베니실린(pH 7.4))에 도포하고, 37℃에서 하룻밤 보온하였다. 생성된 콜로니로부터 상법에 의해 플라스미드를 추출하고, pCDF2-T7 RNAPHis 플라스미드로 하였다. 도 4에 pCDF2-T7 RNAPHis의 제한효소지도를 나타낸다. 또한, 실시예 6에 나타낸 방법을 이용해서 염기 서열을 결정함으로써, 의도하지 않는 변이가 도입되어 있지 않은 것 및 히스티딘 헥사머가 도입되어 있는 것을 확인하였다. 또 배양한 균체로부터 효소를 추출하고, 니켈 킬레이트 수지에 의한 친화성 정제가 가능한 것을 확인하였다. 얻어진 히스티딘 헥사머를 융합한 T7 RNA 중합효소의 유전자 서열을 서열 번호 13에 나타내는 한편, 아미노산 서열을 서열 번호 14에 나타낸다.
실시예 3 - 변이 라이브러리의 제작( 파트 1)
실시예 2에서 제작한 pCDF2-T7 RNAPHis 플라스미드(도 4)의 T7 RNA 중합효소 유전자에 이하의 순서로 변이를 도입하였다.
(1) pCDF2-T7 RNAPHis(도 4)를 주형 플라스미드로 해서, 이하의 시약조성 및 반응 조건에서, 에러-프론 PCR(error-prone PCR) 반응을 행하였다.
(시약조성)(총 반응액량: 100㎕)
MnCl2 0.1 내지 0.3mM(필요에 따라서)
프라이머 pTrcFs(서열 번호 15) 200pM
프라이머 pTrcRs(서열 번호 16) 200pM
주형 플라스미드 100ng
dATP 0.2mM
dGTP 0.2mM
dCTP 1mM
dTTP 1mM
MgCl2 2mM
TaqDNA 중합효소 0.01유닛/㎕
(GoTaq(상품명), 프로메가사 제품)
효소에 부속되는 Mg 프리(free)의 버퍼
(반응 조건)
써멀 사이클러(퍼킨-엘머사 제품)를 이용해서, 94℃에서 2분 가열 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 1분 및 72℃에서 8분의 온도 사이클을 25회 반복하였다.
(2) PCR 산물을, 1% 아가로스 전기영동으로 영동 후, 에티디움 브로마이드 염색을 행하고, 염색 후의 겔로부터 목적 산물의 밴드(band)를 잘라냄으로써 정제하였다.
(3) 정제된 T7 RNA 중합효소 유전자를 제한 효소 NcoI 및 PstI로 소화 후, 동일 효소로 소화된 pCDF2플라스미드(도 2)에 T4 리가제를 이용해서 4℃에서 30분 반응시켜, 반응 후의 DNA 용액을 T7 RNA 중합효소 유전자 변이체 라이브러리라 하였다.
(4) 제작한 라이브러리의 일부를 정법에 따라 대장균 JM109주에 형질전환 하여 플라스미드를 정제하고, 실시예 6에 나타낸 방법으로 염기 서열을 결정함으로써 에러-프론 PCR의 효과를 확인하였다.
실시예 4 - 스크리닝 벡터의 제작
실시예 3에서 제작한 변이 라이브러리의 활성을 평가하기 위해서 GFP를 이용한 활성 확인용 벡터의 제작을 행하였다.
(1) GFP 유전자는 염기 서열정보(GenBank Accession Number AF183395)에 의거해서, dsDNA를 합성하였다. 합성한 GFP 유전자에는, T7 프로모터와 클로닝용의 제한 효소 SphI(타카라바이오사 제품)의 염기 서열을 갖도록 설계하였다.
(2) 합성한 GFP 유전자는 제한 효소 SphI로 37℃에서 3시간 소화시키고, 1.0% 아가로스 전기영동으로 영동 후, 에티디움 브로마이드 염색을 행하고, 염색 후의 겔로부터 목적 산물의 밴드를 잘라냄으로써 정제하였다. 이것을 마찬가지로 소화, 정제한 pSTV28 벡터(타카라바이오사 제품)와 T4 리가제를 이용해서 4℃에서 30분 반응시켰다.
(3) 상기 (2)의 반응액을 이용해서 대장균 JM109주를 형질전환시키고, LBG/Cm 한천 배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, 0.5% 글루코스, 1% 한천, 30㎍/㎖ 클로람페니콜) 상에서 선택적으로 배양하여, 37℃에서 하룻밤 배양 후에 생육되어온 콜로니를 취득하였다.
(4) 취득한 콜로니는, LBG/Cm 액체배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, 0.5% 글루코스, 30㎍/㎖ 클로람페니콜)를 이용해서, 37℃에서 하룻밤 배양 후, 플라스미드를 회수하고, 이 플라스미드를 T7 프로모터에 의해서 발현이 유도되는 GFP 유전자를 가지는 pSTVGFP라 하였다. 도 5에 pSTVGFP의 제한효소지도를 나타낸다.
(5) 취득한 pSTVGFP(도 5)를, 실시예 3에서 제작한 T7 RNA 중합효소 유전자 변이체 라이브러리와 함께 대장균 JM109주에 형질전환을 행하였다. 이 균액을 37℃의 SOC 배지에서 1.5시간 배양 후, FACAria 셀 소터(cell sorter)(일본 BD 제품)에서 형광이 관찰되는 주를 1클론씩 분취해서 37℃의 2×YTG/Crb 배지(1.6% 박토트립톤(Bactotripton), 1% 박토 효모엑기스, 0.5% NaCl, 0.5% 글루코스, 50㎍/㎖ 카베니실린(pH 7.4))에서 증식되어온 주를, 각각 변이체 후보주라 하였다.
실시예 5 - 고온형 T7 RNA 중합효소의 스크리닝
변이주의 스크리닝은 효율적으로 변이체가 평가될 수 있도록 96-웰 타이터 플레이트(96-well titer plates)를 이용해서 행하였다.
(1) 1㎖ 용량의 96-웰 딥 웰 플레이트(96-well deep well plates)에 200㎕의 LBG/Crb 배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, 0.5% 글루코스, 50㎍/㎖ 카베니실린(pH 7.4))를 가하고, 실시예 4에서 얻어진 GFP 양성의 콜로니를 식균하고, 37℃에서 하룻밤 600회전/분에서 배양하였다.
(2) 2㎖ 용량의 96 딥 웰 플레이트에 1.0㎖의 2×YTG/Crb 배지(1.6% 박토트립톤, 1% 박토 효모엑기스, 0.5% NaCl, 0.5% 글루코스, 50㎍/㎖ 카베니실린(pH 7.4))를 가하고, 상기 (1)에서의 하룻밤 배양액을 10㎕ 식균하고, 37℃에서 750회전/분에서 배양을 개시하였다.
(3) 상기 (2)에서의 배양 약 4시간 후, 50mM의 IPTG(이소프로필-β-티오갈락토피라노시드)용액 10㎕를 첨가하고, 온도를 30℃로 내리고 더욱 3시간 진탕 배양하였다. 배양 종료 후, 4℃에서 3000회전/분에서 15분간 원심분리하여 균체를 회수하고, 얻어진 균체는 -30℃에서 하룻밤 동결보존하였다.
(4) 동결시킨 균체에 용균액 100㎕(조성: 20mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0), 0.2% Triton X-100, 0.02% 데옥시콜산나트륨, 0.03% 리소자임(다이요카가쿠사 제품), 0.25유닛의 벤조나제(Benzonase)(노바젠사 제품))를 가하여, 30℃에서 500회전/분에서 1시간 진탕시키고 나서, 4℃에서 3000회전/분에서 30분간 원심분리하여, 상청액을 회수하였다.
(5) 상기 (4)에서 얻어진 상청액의 전량을 니켈 킬레이트 수지(히스바인드(상품명), 노바젠사 제품)를 충전한 96-웰 필터 플레이트에 가하고, 완충액 A(20mM의 이미다졸 및 500mM의 염화나트륨을 함유하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)) 200㎕로 4회 세정 후, 50㎕의 완충액 B(150mM의 이미다졸 및 500mM의 염화나트륨을 포함하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0))에서 용출시켰다.
(6) 용출분획은 실시예 7의 순서와 마찬가지로 단백질 농도 및 전사 활성을 측정하고, 단백량당의 전사 산물량인 비활성을 구하였다. 전사 활성의 측정 조건은 반응온도 46℃, 반응시간 60분, T7 RNA 중합효소량 0.5㎕에 설정하고, RNA의 정량은 Quant-IT RNA 분석 키트(상품명)(인비트로젠사 제품)를 이용하였다. 약 4000의 변이주로부터 야생형의 비활성보다도 약 2배 높은 균주 60종류를 스크리닝하였다.
실시예 6 - 시퀀스 방법
실시예 5에서 선택한 변이체 후보주는, 37℃의 LBG/Crb 액체배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, 0.5% 글루코스, 50㎍/㎖ 카베니실린(pH 7.4))에서 하룻밤 배양 후, 정법에 의해 플라스미드를 추출하였다. 추출한 플라스미드에 포함되는 T7 RNA 중합효소 유전자의 염기 서열 결정은 이하의 방법으로 행하였다.
(1) Big Dye Terminator v3.1 cycle Sequencing Kit(상품명)(어플라이드 바이오시스템즈사(Applied Biosystems) 제품)를 이용해서, 첨부의 버퍼 2.0㎕, 프리믹스 4.0㎕, 합성 DNA 프라이머 3.2pmol, 주형 플라스미드 500ng을 멸균수에서 20㎕로 조제하고, 써멀 사이클러(퍼킨-엘머사 제품)를 이용해서, 96℃에서 1분 가열 후, 96℃에서 10초, 50℃에서 5초 및 60℃에서 4분의 온도 사이클을 25회 반복하였다.
(2) 상기 (1)에서 조제한 염기 서열 결정용 샘플을 Centri-Sep 스핀칼럼(상품명)(ABI사 제품)을 이용해서, 이하에 나타낸 방법으로 정제하였다.
(2-1) Centri-Sep 스핀칼럼에 멸균수를 800㎕ 가하고, 보텍스(vortex)에 의해 건조시킨 겔을 충분히 수화시켰다.
(2-2) 칼럼에 기포가 없는 것을 확인 후, 실온에서 2시간 이상 방치하였다.
(2-3) 위쪽 캡, 아래쪽 스토퍼를 순차적으로 빼내어 칼럼 내의 멸균수를 겔 표면까지 자연낙하시킨 후, 730×g에서 2분간 원심분리를 행하였다.
(2-4) 상기 (2-1)에서부터 (2-3)에 의해 제작한 스핀칼럼의 중앙에 염기 서열 결정용 샘플을 가하고, 730×g에서 2분간 원심분리에 의해 샘플을 튜브에 회수하였다.
(2-5) 회수한 샘플에 대해서 감압 건조를 행한 후, 포름아마이드에 용해시켰다.
(3) 상기 (2)에서 조제한 염기 서열 결정용 샘플을 95℃에서 2분간 처리하고, 빙상에서 급랭 후, ABI PRISM310-DNA Analyzer(상품명)(어플라이드 바이오시스템즈사제품)에서 해석함으로써 염기 서열을 결정하였다. 염기 서열 결정에 사용한 합성 DNA 프라이머는, 프라이머 pTrcFs(서열 번호 15), 프라이머 pTrcRs(서열 번호 16), 프라이머 T7F0(서열 번호 17), 프라이머 T7F1(서열 번호 18), 프라이머 T7F2(서열 번호 19), 프라이머 T7F3(서열 번호 20), 프라이머 T7F4(서열 번호 21), 프라이머 T7F5(서열 번호 22), 프라이머 T7F6(서열 번호 23), 프라이머 T7R0(서열 번호 24), 프라이머 T7R1(서열 번호 25), 프라이머 T7R2(서열 번호 26), 프라이머 T7R3(서열 번호 27), 프라이머 T7R4(서열 번호 28), 프라이머 T7R5(서열 번호 29), 프라이머 T7R6(서열 번호 30)을 필요에 따라서 선택해서 사용하였다.
(4) 결정한 염기 서열은 GENETYX ver.8.0(상품명)(제네틱스사 제품)을 사용해서 해석을 행하였다.
해석의 결과, 19주에 염기 서열의 치환이 발견되었다. 그중, 10주에는 아미노산의 변화를 초래하는 변이가 포함되어 있었다. 그 중의 1개는, 야생형 T7 RNA 중합효소 염기 서열(서열 번호 5) 중, 535번째의 아데닌이 구아닌으로 치환됨으로써 AAG 코돈이 GAG 코돈으로 치환되어, 상기 중합효소 아미노산 서열(서열 번호 6)의 179번째의 리신이 글루타민산으로 변이되어 있는 것을 알 수 있었다. 이 변이를 갖는 T7 RNA 중합효소를 K179E 변이체로 해서, 그 유전자 서열을 서열 번호 31에 나타내는 한편, 아미노산 서열을 서열 번호 32에 나타낸다. 또, 나머지 9주는 야생형 T7 RNA 중합효소 염기 서열(서열 번호 5) 중, 2357번째의 아데닌이 티민으로 치환됨으로써 CAA 코돈이 CTA 코돈으로 치환되어, 상기 중합효소 아미노산 서열(서열 번호 6)의 786번째의 글루타민이 로이신으로 변이되어 있는 것을 알 수 있었다. 이 변이를 갖는 T7 RNA 중합효소를 Q786L 변이체로 해서, 그 유전자 서열을 서열 번호 33에 나타내는 한편, 아미노산 서열을 서열 번호 34에 각각 나타낸다.
실시예 7 - T7 RNA 중합효소의 조제와 활성측정
T7 RNA 중합효소의 조제는 이하에 나타낸 순서로 행하였다.
(1) LBG/Crb 액체배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, 0.5% 글루코스, 50㎍/㎖ 카베니실린(pH 7.4)) 3㎖에 실시예 5에서 얻어진 형질전환체의 글라이세롤 스톡(glycerol stock)을 식균하고, 18㎖ 시험관에서 37℃에서 하룻밤 진탕 배양하였다.
(2) 2×YTG/Crb 배지(1.6% 박토트립톤, 1% 박토 효모엑기스, 0.5% NaCl, 0.5% 글루코스, 50㎍/㎖ 카베니실린(pH 7.4)) 100㎖에 상기 (1)의 전(前)배양액 1.0㎖를 식균하고, 500㎖ 용량의 주름부착 삼각플라스크에서, 37℃, 150회전/분(타이테크사 제품, 로터리식)에서 배양하였다.
(3) 상기 (2)의 배양 이후 약 3 내지 4시간 후(O.D.600㎚의 값으로서 약 1.0 정도)에 500mM의 IPTG(아이소프로필-β-티오갈락토피라노시드) 100㎕를 첨가하고, 온도를 30℃로 내려서 더욱 3시간 진탕배양하였다.
(4) 배양 종료 후, 4℃에서 4000회전/분에서 15분간 원심분리하고, 균체를 회수하였다. 즉시 균체 파쇄를 행하지 않은 경우에는 -30℃에 보존하였다.
(5) 회수한 균체는 20㎖의 20mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)에 의해 1회 세정하고, 같은 조성의 완충액 20㎖에 재현탁시키고, 균체 파쇄하였다. 균체 파쇄는 초음파발생장치(인소네이터 201M(상품명), 쿠보타 상사 제품)를 이용해서, 5℃에서 약 150W의 출력으로 약 5분간 처리하였다.
(6) 얻어진 균체 파쇄액을 4℃에서 12000회전/분에서 10분간 원심분리하고, 회수한 상청액을 효소추출액으로 해서, 염화나트륨 및 이미다졸을 각각 500mM, 20mM로 되도록 첨가하고, 니켈 킬레이트 수지에 의한 친화성 정제에 제공하였다.
(7) T7 RNA 중합효소에 부가시킨 히스티딘헥사머 태그를 이용한 친화성 정제에 의해, 이하의 방법으로 효소정제를 행하였다.
(7-1) 2㎖의 니켈 킬레이트 수지(히스바인드(상품명), 노바젠사 제품)의 슬러리를 부속의 빈 칼럼에 충전시키고, 3㎖의 멸균수로 세정하였다.
(7-2) 세정한 니켈 킬레이트 수지에 5㎖의 50mM의 황산 니켈 수용액으로 킬레이트수지에 니켈을 결합시키고, 또한 3㎖의 완충액 A(20mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0), 500mM 염화나트륨, 20mM 이미다졸)로 세정하였다. 거기에 상기 효소추출액을 가하고, 6㎖의 완충액 A로 세정 후, 1㎖의 완충액 B(20mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0), 500mM 염화나트륨, 150mM 이미다졸)로 용출시키고, 활성 분획을 회수하였다.
(7-3) 회수한 분획을 탈염 칼럼(PD-10(상품명), GE헬스케어 바이오사이언스사 제품)에 의해, 5mM 다이티오트레이톨 및 0.1mM EDTA를 포함하는 20mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 치환하고, 등량의 글라이세롤을 가하였다. 정제한 T7 RNA 중합효소는 소혈청 알부민을 대조군 단백질로 한 단백질 분석 키트(바이오라드사(Bio-Rad) 제품)에 의해 농도를 구하였다. 또, 7.5%농도의 SDS-PAGE에 의해 효소의 순도를 분석하여, 거의 단일인 것을 확인하였다.
(8) 활성측정을, 시험관내 전사 반응에서 생성된 RNA 양을 측정하는 방법으로 행하였다. 또한, 주형 DNA는 T7 RNA 중합효소가 특이적으로 인식하는 T7 프로모터 서열을 갖는 DNA를 이용하지만, 여기에서는 T7 프로모터 서열을 포함하는 플라스미드를 주형으로 해서 PCR에서 증폭한 약 1.5kbp DNA 단편을 이용하였다. 또한, T7 프로모터 서열의 하류의 DNA의 길이는 1.0kbp이며, 전사되는 RNA는 약1.0kb로 된다.
(8-1) T7 RNA 중합효소를 제외한 반응액(40mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0), 20mM MgCl2, 5mM 다이티오트레이톨, 20ng 주형 DNA, 0.4U RNA 분해효소 조해제, 각 0.4mM NTPs(ATP, CTP, GTP, UTP))을 0.2㎖의 PCR 튜브에 넣고, 정제한 T7 RNA 중합효소를 0℃로 냉각한 상태에서 가하여, 합계 10㎕로 하였다.
(8-2) 미리 반응온도로 보온해둔 히트 블록(마스터사이클러ep그라디엔트(상품명), 에펜도르프사(Eppendorf) 제품)에 조금 전에 조제한 PCR 튜브를 세트하고, 전사 반응을 행하였다. 반응 정지는 80℃에서 2분간 가열하는 것으로 행하였다.
(8-3) 생성된 RNA 양은 1% 아가로스겔에서 전기영동한 후, 에티디움 브로마이드에서 염색하는 방법 및 시판의 RNA 정량 키트인 Quant-IT RNA 분석 키트(상품명)(인비트로젠사 제품)를 이용해서 형광염색하고, 첨부의 표준 RNA로 제작한 검량선으로부터 농도 환산하는 방법으로 분석하였다.
실시예 8 - ( K179E + Q786L ) 이중변이체의 제작
K179E 변이체와 Q786L 변이체를 기초로, K179E와 Q786L의 2개의 변이를 가진 이중변이체를 제작하였다.
(1) K179E 변이체와 Q786L 변이체 각각으로부터 미니프레프(Miniprep)법을 이용해서 플라스미드를 조제하였다.
(2) K179E 변이체로부터 조제한 플라스미드를 주형으로 해서, 이하의 시약조성 및 반응 조건에서 PCR 반응을 행하였다.
(시약조성)(총 반응액량: 100㎕)
프라이머 T7R2(서열 번호 26) 200pM
프라이머 pTrcFs(서열 번호 15) 200pM
주형 플라스미드 100ng
dNTPs 0.2mM
TaqDNA 중합효소 0.025유닛/㎕
(TaKaRa Ex Taq(상품명), 타카라바이오사 제품)
효소에 부속되는 버퍼
(반응 조건)
써멀 사이클러(퍼킨-엘머사 제품)를 이용해서, 94℃에서 2분 가열 후, 94℃에서 1분, 58℃에서 30초 및 72℃에서 2분40초의 온도 사이클을 25회 반복하였다.
(3) 반응액을 1% 아가로스 전기영동으로 영동 후, 에티디움 브로마이드 염색을 행하고, 염색 후의 겔로부터 목적 산물의 밴드를 잘라냄으로써 정제하였다.
(4) Q786L 변이체로부터 조제한 플라스미드를 주형으로 해서, 합성 프라이머로서 프라이머 T7F2(서열 번호 19)와 프라이머 pTrcRs(서열 번호 16)의 조합을 사용한 것 이외에는 상기 (1) 내지 (2)와 같은 조건으로, PCR 반응과 정제를 행하였다.
(5) 상기 (3) 및 (4)에서 얻어진, 2종류의 정제 PCR 산물을 주형으로 해서, 더욱 PCR 반응을 행하여, 이중변이체 유전자를 제작하였다. 또, PCR 반응에 있어서의 시약조성, 반응 조건 및 정제 조작은, 합성 DNA 프라이머로서 프라이머 pTrcFs(서열 번호 15)와 프라이머 pTrcRs(서열 번호 16)의 조합을 사용한 것 이외에는 상기 (1) 내지 (2)와 같은 조건이다.
(6) 상기 (5)에서 얻어진, 정제 이중변이체 유전자는 제한 효소 NcoI 및 PstI(타카라바이오사 제품)로 소화 후, 동일 효소로 소화시킨 pCDF2 벡터에 T4 리가제를 이용해서 4℃에서 30분 반응시켰다.
(7) 상기 (6)의 반응액을 이용해서 대장균 JM109주를 형질전환시키고, LBG/Crb 한천 배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, 0.5% 글루코스, 1% 한천, 50㎍/㎖ 카베니실린(pH 7.4)) 상에서 선택적으로 배양하여, 37℃에서 하룻밤 배양 후에 생육되어온 콜로니를 이중변이체라 하였다. 또한, 이중변이체는 실시예 6에 나타낸 염기 서열 결정법에 의해 변이의 도입을 확인하고, (K179E+Q786L) 변이체라 하였다. 그 유전자 서열을 서열 번호 35에 나타내는 한편, 아미노산 서열을 서열 번호 36에 나타낸다.
실시예 9 - 변이형 T7 RNA 중합효소의 열안정성 평가( 파트 1)
변이형 T7 RNA 중합효소의 열안정성을 이하와 같이 측정하였다.
(1) 실시예 5에서 스크리닝한 변이체의 염기 서열 해석의 결과(실시예 6)로부터, 고온영역에서 야생형보다도 활성이 높았던, 179번째의 아미노산을 리신으로부터 글루타민산으로 치환한 변이체(K179E), 786번째의 아미노산을 글루타민으로부터 로이신으로 치환한 변이체(Q786L) 및 2개의 변이를 합친 이중변이체(K179E+Q786L)를, 실시예 7에 기재한 방법에 따라 정제 효소를 조제하였다. 또한, 정제한 효소의 단백 농도 및 전사 활성은 실시예 7에 나타낸 방법에 준해 측정하였다.
(2) 실시예 7에서 조제한 각종 T7 RNA 중합효소를 희석액(40mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0), 20mM 염화마그네슘, 5mM 다이티오트레이톨, 70mM KCl, 0.1㎎/㎖ 소혈청알부민)을 이용해서 50㎍/㎖로 조제하였다.
(3) 0.2㎖의 PCR 튜브에 25㎕ 분주하고, 47℃에서 5분간, 10분간, 20분간, 각각 가열시켰다.
(4) 가열 처리 후 원심분리에 상청액을 회수 후, 43℃에서 30분간 전사 반응을 행하고, 잔존 활성을 구하였다.
(5) 생성된 RNA 양은 1% 아가로스에 의한 전기영동으로 분석하였다.
결과를 도 6에 나타내었다. 도 6으로부터 변이체 Q786L 및 (K179E+Q786L)은 야생형에서는 거의 활성이 없어지는 47℃에서도, 명료한 RNA의 밴드가 확인되었다. 이로부터, 적어도 Q786L의 변이를 도입한 T7 RNA 중합효소는, 야생형보다도 열안정성이 우수한 것을 알 수 있다.
실시예 10 - 변이형 T7 RNA 중합효소의 활성평가( 파트 1)
변이형 T7 RNA 중합효소의 각 반응 온도에 있어서의 활성을 이하와 같이 측정하였다.
(1) 실시예 5에서 스크리닝한 변이체의 염기 서열 해석의 결과(실시예 6)로부터, 고온영역에서 야생형보다도 활성이 높았던 179번째의 아미노산을 리신으로부터 글루타민산으로 치환한 변이체(K179E), 786번째의 아미노산을 글루타민으로부터 로이신으로 치환한 변이체(Q786L) 및 2개의 변이를 합친 이중변이체(K179E+Q786L)를, 실시예 7에 기재한 방법에 따라 정제 효소를 조제하였다. 또한, 정제한 효소의 단백 농도 및 전사 활성은 실시예 7에 나타낸 방법에 준해 측정하였다.
(2) T7 RNA 중합효소의 활성을, T7 RNA 중합효소의 효소량을 10㎍/㎖, 반응온도를 43℃ 내지 50℃의 범위에서 10분간 반응시켜서 측정하였다.
(3) 생성된 RNA 양을 Quant-IT RNA 분석 키트(상품명)(인비트로젠사 제품)를 이용해서 구하였다.
측정한 RNA 농도를 도 7에 나타내었다. 변이체 K179E는 42.9℃ 내지 46.8℃의 범위에서 야생형보다도 비활성이 높은 것을 알 수 있고, 이것으로부터, 적어도 K179E의 변이를 도입한 T7 RNA 중합효소는, 야생형보다도 비활성이 향상되어 있는 것을 알 수 있다. 다음에, 변이체 Q786L은 44.7℃ 내지 47.9℃의 범위에서 야생형보다도 비활성이 높았지만, 이것은 실시예 9의 결과보다 열안정성이 향상한 것에 유래하는 것으로 여겨진다. 또한, 이중변이체(K179E+Q786L)에서는 42.9℃ 내지 47.9℃의 온도 영역에서 야생형보다도 비활성이 높았다. 이것으로부터, 적어도 K179E 및 Q786L의 변이를 도입한 T7 RNA 중합효소는, 야생형보다도 열안정성 및 비활성이 향상되어 있는 것을 알 수 있다.
실시예 11 - 변이형 T7 RNA 중합효소 유전자의 조제( 파트 1)
야생형 T7 RNA 중합효소의 아미노 서열(서열 번호 6) 중, 179번째의 리신을 다른 아미노산으로 치환한 T7 RNA 중합효소를 코드하는 유전자의 조제를 이하에 나타낸 순서로 행하였다.
(1) pCDF2-T7 RNAPHis(도 4)를 주형 플라스미드로 해서, 이하의 시약조성 및 반응 조건에서 1회째의 PCR 반응을 행하였다. 또, T7 중합효소 유전자의 5'말단측을 증폭하기 위한 합성 DNA 프라이머로서, 프라이머 pCDFF(서열 번호 12)와 프라이머 179MIXR(서열 번호 39)의 조합을, 3'말단측을 증폭하기 위한 합성 프라이머로서, 프라이머 179MIXF(서열 번호 37)와 프라이머 pCDFR2(서열 번호 38)의 조합을 각각 이용하였다.
(시약조성)(총 반응액량: 100㎕)
합성 DNA 프라이머 각 200pM
주형 플라스미드 100ng
dNTPs 0.2mM
DNA 중합효소 0.025유닛/㎕
(PrimeSTAR HS DNA polymerase(상품명), 타카라바이오사 제품)
효소에 부속되는 버퍼
(반응 조건)
써멀 사이클러(퍼킨-엘머사 제품)를 이용해서, 98℃에서 30초 가열 후, 98℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분30초의 온도 사이클을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 반응시켰다.
(2) 상기 (1)에서 조제한 PCR 산물을, 1% 아가로스 전기영동으로 영동 후, 에티디움 브로마이드 염색을 행하고, 염색 후의 겔로부터 목적 산물의 밴드를 잘라냄으로써, PCR 산물을 정제하였다.
(3) 얻어진 2종류(5'말단측 및 3'말단측)의 PCR 산물을 주형으로 해서, 프라이머 pCDFF(서열 번호 12)와 프라이머 pCDFR2(서열 번호 38)를 합성 DNA 프라이머로서 이용하여, 2회째의 PCR 반응을 행하였다. PCR 반응에 있어서의 시약조성 및 반응 조건은 합성 DNA 프라이머와 주형 이외에는 상기 (1)과 같은 조건으로 행하여, 증폭한 산물을 (2)와 마찬가지로 아가로스겔에서 전기영동 후, 추출, 정제하였다.
(4) 상기 (3)에서 정제한 2회째의 PCR 산물을, 제한 효소 NruI 및 SacI로 소화 후, 동일 효소로 소화시킨 pCDF2-T7 RNAPHis 플라스미드(도 4)에 T4 리가제를 이용해서 4℃에서 30분 반응시켜, 반응 후의 DNA 용액을 T7 RNA 중합효소 유전자 변이체 라이브러리라 하였다.
(5) 상기 (4)에서 제작한 라이브러리를 대장균 JM109주에 형질전환시키고, 37℃의 LBG/Crb 배지(1.0% 박토트립톤, 0.5% 박토 효모엑기스, 0.5% NaCl, 0.5% 글루코스, 50㎍/㎖ 카베니실린(pH 7.4))에서 증식되어온 콜로니를 90개, 각 라이브러리로부터 선발하였다.
(6) 선발한 균주는 상법에 의해 플라스미드를 추출 후, pCDFF(서열 번호 12)를 염기 서열 결정용 합성 DNA 프라이머로서 사용한 것 이외에는, 실시예 6의 순서와 마찬가지로 염기 서열 결정을 행함으로써 염기 서열의 변이를 확인하였다.
실시예 12 - 변이형 T7 RNA 중합효소 유전자의 조제( 파트 2)
야생형 T7 RNA 중합효소의 아미노 서열(서열 번호 6) 중, 786번째의 글루타민을 다른 아미노산으로 치환한 T7 RNA 중합효소를 코드하는 유전자의 조제를, 이하에 나타낸 순서로 행하였다.
(1) pCDF2-T7 RNAPHis(도 4)를 주형 플라스미드로 해서, 이하의 시약조성 및 반응 조건에서 1회째의 PCR 반응을 행하였다. 또, T7 중합효소 유전자의 5'말단측을 증폭하기 위한 합성 DNA 프라이머로서, 프라이머 pCDFF4(서열 번호 42)와 프라이머 786MIXR(서열 번호 41)의 조합, 3'말단측을 증폭하기 위한 합성 프라이머로서, 프라이머 786MIXF(서열 번호 40)와 프라이머 pTrcRS(서열 번호 16)의 조합을 각각 이용하였다.
(시약조성)(총 반응액량: 100㎕)
합성 DNA 프라이머 각 200pM
주형 플라스미드 100ng
dNTPs 0.2mM
DNA 중합효소 0.025유닛/㎕
(PrimeSTAR HS DNA polymerase(상품명), 타카라바이오사 제품)
효소에 부속되는 버퍼
(반응 조건)
써멀 사이클러(퍼킨-엘머사 제품)를 이용해서, 98℃에서 30초 가열 후, 98℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분30초의 온도 사이클을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 반응시켰다.
(2) 상기 (1)에서 조제한 PCR 산물을, 1% 아가로스 전기영동으로 영동 후, 에티디움 브로마이드 염색을 행하고, 염색 후의 겔로부터 목적 산물의 밴드를 잘라냄으로써, PCR 산물을 정제하였다.
(3) 얻어진 2종류(5'말단측 및 3'말단측)의 PCR 산물을 주형으로 해서, 프라이머 pCDFF4(서열 번호 42)와 프라이머 pTrcRS(서열 번호 16)를 합성 DNA 프라이머로서 이용하여, 2회째의 PCR 반응을 행하였다. PCR 반응에 있어서의 시약조성 및 반응 조건은 합성 DNA 프라이머와 주형 이외에는 상기 (1)과 같은 조건에서 행하여, 증폭한 산물을 상기 (2)와 마찬가지로 아가로스겔에서 전기영동 후, 추출, 정제하였다.
(4) 상기 (3)에서 정제한 2회째의 PCR 산물을, 제한 효소 HindIII 및 KpnI로 소화 후, 동일 효소로 소화시킨 pCDF2-T7 RNAPHis 플라스미드(도 4)에 T4 리가제를 이용해서 4℃에서 30분 반응시켜, 반응 후의 DNA 용액을 T7 RNA 중합효소 유전자 변이체(179번째) 라이브러리라 하였다.
(5) 상기 (4)에서 제작한 라이브러리를 대장균 JM109주에 형질전환시키고, 37℃의 LBG/Crb 배지(1.0% 박토트립톤, 0.5% 박토 효모엑기스, 0.5% NaCl, 0.5% 글루코스, 50㎍/㎖ 카베니실린(pH 7.4))에서 증식되어온 콜로니를 90개, 각 라이브러리로부터 선발하였다.
(6) 선발한 균주는 상법에 의해 플라스미드를 추출하고, pCDFF4(서열 번호 42)를 염기 서열 결정용 합성 DNA 프라이머로서 사용한 것 이외에는, 실시예 6의 순서와 마찬가지로 염기 서열 결정을 행함으로써, 염기 서열의 변이를 확인하였다.
실시예 13 - 변이형 T7 RNA 중합효소 변이체의 활성평가( 파트 2)
실시예 11 및 12에서 제작한 변이형 T7 RNA 중합효소 유전자로부터, T7 RNA 중합효소의 조제 및 전사 활성의 측정을 실시예 7의 방법에 따라 실시하였다. 결과를 도 8(179번째의 리신을 다른 아미노산으로 치환한 T7 RNA 중합효소) 및 도 9(786번째의 글루타민을 다른 아미노산으로 치환한 T7 RNA 중합효소)에 나타낸다.
179번째의 리신을 다른 아미노산으로 치환했을 경우, 스크리닝에서 얻어진 글루타민산 치환(K179E) 이외에도, 시스테인 치환(K179C), 아스파라긴 치환(K179N)한 변이체가 야생형보다 내열성 및/또는 비활성이 향상되어 있고, 특히 글루타민산으로 치환한 (K179E) 변이체가, 야생형에 대한 내열성 및 비활성의 향상이 컸다(도 8).
한편, 786번째의 글루타민을 다른 아미노산으로 치환했을 경우, 스크리닝에서 얻어진 로이신 치환(Q786L) 이외에도, 메티오닌 치환(Q786M), 페닐알라닌 치환(Q786F), 티로신 치환(Q786Y)한 변이체가 야생형보다 내열성 및/또는 비활성이 향상되어 있고, 특히 메티오닌으로 치환한 (Q786M) 변이체가 야생형에 대한 내열성 및 비활성의 향상이 컸다(도 9).
실시예 14 - 변이형 T7 RNA 중합효소의 열안정성 평가( 파트 2)
실시예 13에서 조제한 변이형 T7 RNA 중합효소의 열안정성을 이하에 나타낸 방법으로 측정하였다.
(1) 실시예 13에서 조제한 변이형 T7 RNA 중합효소(Q786M, Q786L, Q786F, Q786Y, K179E, K179C 및 K179N) 및 야생형 T7 RNA 중합효소를 이하에 나타낸 조성의 완충액을 이용해서 100㎍/㎖로 조제하고, 0.2㎖의 PCR 튜브에 25㎕ 분주 후, 47℃에서 1분, 2분, 5분, 10분, 20분, 30분간 가열 처리하였다.
(완충액 조성)
Tris-HCl 완충액(pH 8.0) 40mM
MgCl2 20mM
다이티오트레이톨 5mM
KCl 70mM
소혈청알부민 0.01㎎/㎖
(2) 가열 처리 후의 액을 이용해서, 43℃에서 30분간의 전사 반응에 의해 활성을 측정하고, 각 처리 시간의 활성을 가열 전의 활성으로 나눈 값을 잔존 활성이라 하였다.
잔존 활성의 그래프를 도 10에 나타낸다. 또한, 도 10의 그래프의 기울기로부터 각종 변이형 T7 RNA 중합효소 및 야생형의 반감기를 구한 결과를 표 1에 나타낸다. 표 1로부터 각종 변이형 T7 RNA 중합효소는 야생주보다도 반감기가 길고, 48℃에 있어서의 열안정성이 우수한 것을 알 수 있다. 또한, 특히, Q786L 및 Q786M 변이형 T7 RNA 중합효소의 열안정성이 높은 것을 알 수 있다.
T7 RNA 중합효소 반감기(분)
Q786M 변이형 12.9
Q786L 변이형 19.9
Q786F 변이형 4.0
Q786Y 변이형 4.7
K179E 변이형 4.0
K179C 변이형 2.1
K179N 변이형 1.9
야생형 1.6
실시예 15 - 변이 라이브러리의 제작( 파트 2)
실시예 8에서 제작한 (K179E+Q786L) 변이체 유전자 서열(서열 번호 35) 및 상기 서열의 5'말단측에 히스티딘 헥사머 서열을 포함하는 플라스미드 벡터 pCDF2-T7 RNAPHis(K179E+Q786L)를 이용해서, 이하의 순서로 변이를 도입하였다.
(1) pCDF2-T7 RNAPHis(K179E+Q786L)를 주형 플라스미드로 해서, 이하의 시약조성 및 반응 조건에서 에러-프론 PCR 반응을 행하였다.
(시약조성)(총 반응액량: 100㎕)
MnCl2 0.1 내지 0.3mM(필요에 따라서)
프라이머 pTrcFs(서열 번호 15) 200pM
프라이머 pTrcRs(서열 번호 16) 200pM
주형 플라스미드 100ng
dATP 0.2mM
dGTP 0.2mM
dCTP 1mM
dTTP 1mM
MgCl2 2mM
TaqDNA 중합효소 0.01유닛/㎕
(GoTaq(상품명), 프로메가사 제품)
효소에 부속되는 Mg 프리의 버퍼
(반응 조건)
써멀 사이클러(퍼킨-엘머사 제품)를 이용해서, 94℃에서 2분 가열 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 1분 및 72℃에서 8분의 온도 사이클을 25회 반복하였다.
(2) PCR 산물을, 1% 아가로스 전기영동으로 영동 후, 에티디움 브로마이드 염색에 의해 행하여, 겔로부터 잘라내어 정제하였다.
(3) 정제된 T7 RNA 중합효소 유전자를 제한 효소 NcoI 및 PstI로 소화 후, 동일 효소로 소화시킨 pCDF2-T7 RNAPHis 플라스미드(도 4)에 T4 리가제를 이용해서 4℃에서 30분 반응시켜, 반응 후의 DNA 용액을 T7 RNA 중합효소 유전자 변이체 라이브러리라 하였다.
(4) 제작한 T7 RNA 중합효소 유전자 변이체 라이브러리를, 실시예 4에서 제작한 플라스미드 pSTVGFP(도 5)를 포함하는 대장균 JM109주에 형질전환시키고, 상기 형질전환액을 37℃의 SOC 배지에서 1시간 배양 후, LBG/Crb/Cm 한천체 배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, 0.5% 글루코스, 50㎍/㎖ 카베니실린, 30㎍/㎖ 클로람페니콜, 1.5% 한천)에서 증식시키고, 또한 GFP 형광을 발하는 주를 변이체 후보주라 하였다. 또한, 제작한 라이브러리는, 그 일부를 이용해서 정법에 따라 대장균 JM109주에 형질전환시켜 플라스미드를 정제하고, 실시예 6에 나타낸 방법으로 염기 서열을 결정함으로써 에러-프론 PCR의 효과를 확인하였다.
실시예 16 - 고온형 T7 RNA 중합효소의 스크리닝( 파트 2)
실시예 15에서 얻어진 변이주의 스크리닝은 실시예 5과 같은 방법으로 스크리닝을 행하였다. 스크리닝의 결과, 약 4000의 변이주로부터, 실시예 8에서 제작한 (K179E+Q786L) 변이형 T7 RNA 중합효소보다 비활성이 약 2배 높은 균주가 34주 얻어졌고, 이것을 1차 후보주라 하였다. 또한, 상기 1차 후보주를 실시예 5와 같은 방법으로 재스크리닝을 행하여, 최종적으로 (K179E+Q786L) 변이형 T7 RNA 중합효소보다 비활성이 2배 이상 높은 균주 1주를 선정하였다.
실시예 17 - 선정주의 염기 서열 해석
실시예 16에서 선정한 균주를 실시예 6에 기재된 방법으로, 염기 서열의 확인을 행하여 변이 부위를 확인하였다. 그 결과, 염기 서열 2054번째의 티민이 시토신으로 치환됨으로써 GTG 코돈이 GCG 코돈으로 치환되어 아미노산 서열 685번째의 발린이 알라닌으로 변이되어 있는 것을 알 수 있었다. 이 변이를 가진 T7 RNA 중합효소를 (K179E+Q786L+V685A) 변이체로 해서, 그 유전자 서열을 서열 번호 43에 나타내는 한편, 아미노산 서열을 서열 번호 44에 나타낸다.
실시예 18 - ( K179E + Q786L + V685A ) 변이형 T7 RNA 중합효소의 제작
실시예 16에서 얻어진 히스티딘 헥사머 서열을 갖는 (K179E+Q786L+V685A) 삼중변이형 T7 RNA 중합효소를 발현하는 대장균 JM109주를 이용해서, 이하의 순서로 효소를 조제하였다.
(1) LBG/Crb 액체배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, 0.5% 글루코스, 50㎍/㎖ 카베니실린(pH 7.4)) 40㎖에 실시예 16에서 얻어진 균주의 글라이세롤 스톡을 식균하고, 100㎖ 용량의 주름부착 삼각 플라스크에서 37℃에서 하룻밤 진탕배양하였다.
(2) 1.5ℓ의 2×YTG/Crb 배지(1.6% 박토트립톤, 1% 박토 효모엑기스, 0.5% NaCl, 0.5% 글루코스, 50㎍/㎖ 카베니실린(pH 7.4))에 전(前)배양액 30㎖를 식균하고, 3ℓ 용량의 발효조에서 37℃에서 배양하였다.
(3) 상기 (2)의 배양 약 3시간 후(O.D.600㎚의 값으로서 약 2.0)에 500mM의 IPTG(이소프로필-β-티오갈락토피라노시드) 1.5㎖를 첨가하고, 온도를 30℃로 내려서 더욱 3시간 배양하였다. 배양중 산소농도는 1.6ppm 이상, pH는 6.8 내지 7.2의 범위로 조정하였다.
(4) 배양 종료 후, 4℃에서 15분간, 7000회전/분에서 원심분리하여, 습균체 21g을 얻었다. 균체는 100㎖의 20mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 세정하고, 즉시 다음의 처리를 하지 않는 경우에는 -30℃에 보존하였다.
(5) 회수한 균체의 반 정도를 0.1mM PMSF 및 1mM EDTA를 함유하는 20mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0) 42㎖에 현탁시키고, 균체 파쇄하였다. 균체 파쇄는 초음파 발생장치(인소네이터 201M(상품명), 쿠보타 상사 제품)를 이용해서, 5℃에서 약 5분간, 약 150W의 출력으로 처리하고, 4℃에서 10분간, 12000회전/분의 원심분리에서 가용성 분획을 회수하였다.
(6) 회수한 분획 45㎖에 5.1㎖의 2M 황산암모늄 및 0.95㎖의 10% 폴리에틸렌이민을 각각 첨가하고, 0℃에서 약 1시간 보냉한 후, 4℃에서 10분간, 12000회전/분의 원심분리에서 상청액을 회수하였다.
(7) 회수한 상청액의 일부를 이용해서, 실시예 7에 나타낸 방법에 준하여, 히스티딘 헥사머 태그를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
정제한 T7 RNA 중합효소의 단백 농도는 280㎚의 흡광도로부터 구하였다. 또, 5 내지 20% 농도의 SDS-PAGE에 의해 효소 단백 순도를 분석하여, 거의 단일의 단백인 것을 확인하였다.
실시예 19 - 변이형 T7 RNA 중합효소의 활성평가( 파트 3)
실시예 18에서 제작한 (K179E+Q786L+V685A) 삼중변이형 T7 RNA 중합효소의 활성평가를 실시예 7에 나타낸 시험관내 전사 반응에 의해 생성된 RNA 양을 측정하는 방법으로 행하였다. 또, 전사 반응온도는 43℃ 내지 50℃의 범위로 설정하고, T7 RNA 중합효소의 효소량을 10ng/㎕, 반응시간은 30분간으로 하였다. 또, 대조로서 실시예 8에서 제작한 (K179E+Q786L) 이중변이형 T7 RNA 중합효소 및 야생형 T7 RNA 중합효소를 이용하였다.
각 온도에 있어서 생성된 RNA 양을 도 11에 나타내었다. 도 11로부터 (K179E+Q786L+V685A) 삼중변이체는 원래의 변이체인 (K179E+Q786L) 이중변이체보다도 반응온도 46℃ 이상으로 비활성이 높은 것을 알 수 있다.
실시예 20 - 변이형 T7 RNA 중합효소의 열안정성 평가( 파트 3)
T7 RNA 중합효소 각종 변이체 및 야생형의 열안정성은 이하의 방법으로 측정하였다.
(1) 실시예 18에서 제작한 (K179E+Q786L+V685A) 삼중변이형 T7 RNA 중합효소, 실시예 8에서 제작한 (K179E+Q786L) 이중변이체형 T7 RNA 중합효소 및 야생형 T7 RNA 중합효소를 이하에 나타낸 조성의 완충액을 이용해서 100㎍/㎖로 조제하고, 0.2㎖의 PCR 튜브에 25㎕ 분주 후, 48℃에서 1분, 2분, 5분, 10분, 20분간 가열 처리하였다.
(완충액 조성)
Tris-HCl 완충액(pH 8.0) 40mM
MgCl2 20mM
다이티오트레이톨 5mM
KCl 70mM
소혈청알부민 0.01㎎/㎖
(2) 가열 처리 후의 액을 이용해서, 43℃에서 30분간의 전사 반응에 의해 활성을 측정하고, 각 처리 시간의 활성을 가열 전의 활성으로 나눈 값을 잔존 활성이라 하였다.
잔존 활성의 그래프를 도 12에 나타낸다. 또한, 도 12의 그래프의 기울기로부터 각종 변이형 T7 RNA 중합효소 및 야생형의 반감기를 구한 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2로부터 (K179E+Q786L+V685A) 삼중변이체는 (K179E+Q786L) 이중변이체나 야생주보다도 반감기가 길고, 48℃에 있어서의 열안정성이 우수한 것을 알 수 있다.
T7 RNA 중합효소 반감기(분)
(K179E+Q786L+V685A) 변이형 5.3
(K179E+Q786L) 변이형 1.7
야생형 <1
실시예 21 - ( Q786L + M685A ) 변이형 T7 RNA 중합효소의 제작
실시예 18에서 제작한 (K179E+Q786L+V685A) 삼중변이형 T7 중합효소로부터, 이하의 방법으로 (Q786L+V685A) 이중변이형 T7 중합효소를 제작하였다.
(1) (K179E+Q786L+V685A) 삼중변이형 T7 RNA 중합효소를 코드하는 유전자를 삽입한 pCDF2-T7 RNAPHis(K179E+Q786L+V685A) 플라스미드 및 야생형 T7 RNA 중합효소를 코드하는 유전자를 삽입한 플라스미드 pCDF2-T7 RNAP(도 3)를 미니프레프법으로 조제하였다.
(2) 양 플라스미드 200ng을 상법에 의해 제한 효소 KpnI 및 SacI로 소화시키고, 아가로스 겔전기영동 후, 야생형의 4.5kbp의 프래그먼트 및 (K179E+Q786L+V685A) 변이체의 1.4kbp의 프래그먼트를 겔 추출법에 의해 정제하였다.
(3) 정제한 야생형 프래그먼트 40ng과 (K179E+Q786L+V685A) 변이체의 프래그먼트 80ng을 T4 리가제를 이용해서 16℃에서 30분간 반응시키고, 상법에 의해 대장균 JM109주에 형질전환시켰다.
(4) 상기 형질전환체를, LBG/Crb 한천 배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, 0.5% 글루코스, 1.5% 한천, 50㎍/㎖ 카베니실린(pH 7.4)) 상에서 선별을 행하고, 37℃에서 하룻밤 배양 후에 생육되어온 콜로니의 플라스미드를 조제하였다.
상기 (4)에서 조제한 플라스미드는 실시예 6에 나타낸 염기 서열 결정법에 의해 목적으로 하는 변이의 도입을 확인하였다. 상기 플라스미드 유전자 서열을 서열 번호 45에 나타내는 한편, 아미노산 서열을 서열 번호 46에 나타낸다.
실시예 22 - ( Q786L + V685A ) 변이형 T7 RNA 중합효소의 정제
실시예 21에서 제작한 (Q786L+V685A) 이중변이형 T7 RNA 중합효소를 발현하는 대장균 JM109주를 이용해서, 이하의 방법으로 (Q786L+V685A) 변이형 T7 RNA 중합효소를 조제하였다.
(1) 실시예 18에 나타낸 순서에 준해 배양을 행하고, 습균체 28g을 얻었다.
(2) 얻어진 균체를 0.1mM PMSF 및 1mM EDTA를 포함하는 20mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0) 112㎖에 현탁 후, 초음파에 의해서 균체를 파쇄하고, 원심분리에 의해 상청액을 회수하였다.
(3) 얻어진 효소추출액 135㎖에 대해서 17.5㎖의 2M 황산암모늄 및 3.5㎖의 10% 폴리에틸렌이민을 첨가하고, 0℃에서 약 1시간 보냉 후, 원심분리에 의해 상청액을 회수하였다.
(4) 회수한 상청액 130㎖에 51g의 황산암모늄을 가하고, 0℃에서 1시간 보냉 후, 원심분리에서 회수한 침전을 이하의 조성의 완충액 30㎖에 용해시켰다.
(완충액 조성)
인산 칼륨 완충액(pH 7.6) 20mM
다이티오트레이톨 1mM
PMSF 0.1mM
EDTA 1mM
(5) 상기 (4)에서 조제한 침전 용해액을 이하의 방법으로 고속액체크로마토그래피에서 정제하였다.
(5-1) 소수 칼럼(TSKgel Phenyl-5PW(상품명), 토소사 제품)에 의해 이하의 조건에서 정제하였다.
(정제 조건)
용리액 A:
인산 칼륨 완충액(pH 7.2) 20mM
NaCl 50mM
황산암모늄 0.6M
DTT 1mM
EDTA 1mM
용리액 B:
용리액 A 중 황산암모늄을 제외한 조성
구배:
0분 내지 60분: 용리액 A 100%
60분 내지 120분: 용리액 A 100%로부터 0%로의 선형 구배
120분 내지 130분: 용리액 A 0%
130분: 용리액 A 0%로부터 100%로의 스텝 구배
검출: 280㎚
유속: 4㎖/분
(5-2) SDS-PAGE에 의해 T7 RNA 중합효소의 함유량이 많은 분획 100㎖를 회수하고, 39g의 황산암모늄으로 염석하였다.
(5-3) 원심분리에서 회수한 염석물을 이하에 나타낸 조성의 완충액 5㎖에 용해시켰다.
(완충액 조성)
인산 칼륨 완충액(pH 7.6) 20mM
다이티오트레이톨 1mM
PMSF 0.1mM
EDTA 1mM
(5-4) 분획 분자량 12000의 투석막을 이용해서 동일 조성의 완충액에 하룻밤 4℃에서 투석하고, 이온 교환 칼럼(TSKgel DEAE-5PW(상품명), 토소사 제품)에 의해 이하의 조건에서 정제하였다.
(정제 조건)
용리액 A:
인산 칼륨 완충액(pH 7.6) 20mM
NaCl 50mM
다이티오트레이톨 1mM
EDTA 1mM
용리액 B:
용리액 A 중 NaCl 농도를 0.8M로 변경한 조성 구배:
0분 내지 20분: 용리액 A 100%
20분 내지 80분: 용리액 A 100%에서부터 0%로의 선형 구배
80분 내지 90분: 용리액 A 0%
90분: 용리액 A 0%로부터 100%로의 스텝 구배
검출: 280㎚
유속: 4㎖/분
(5-5) SDS-PAGE 분석으로 T7 RNA 중합효소의 함유량이 많은 분획 5㎖를 회수하고, 1.95g의 황산암모늄으로 염석하였다.
(5-6) 겔여과 정제에 이용하는 완충액 1㎖에 용해시켜, 겔여과 칼럼(TSKgel G3000SW(상품명), 토소사 제품)을 이용해서 이하의 조건에서 정제하였다.
(정제 조건)
용리액:
인산 칼륨 완충액(pH 7.6) 40mM
NaCl 200mM
다이티오트레이톨 2mM
EDTA 0.2mM
검출: 280㎚
유속: 5㎖/분
(5-7) SDS-PAGE에 의한 분석으로부터 T7 RNA 중합효소의 함유량이 많은 분획 4㎖를 회수하였다.
(5-8) 회수 분획을 1.56g의 황산암모늄으로 염석한 뒤, 탈염 칼럼(PD-10(상품명), GE헬스케어 바이오사이언스사 제품)을 이용해서 겔여과 칼럼 정제와 같은 조성의 완충액으로 치환하고, 등량의 글라이세롤을 가해서 2.5㎖로 하였다.
정제한 T7 RNA 중합효소 이중변이체의 단백 농도를 280㎚의 흡광도로부터 구한 바 1.9㎎/㎖였다. 또, 5 내지 20% 농도의 SDS-PAGE에서 효소 단백을 분석하여, 거의 단일 밴드인 것을 확인하였다.
실시예 23 - 변이형 T7 RNA 중합효소에 의한 핵산증폭 반응
실시예 22에서 조제한 (Q786L+M685A) 이중변이형 T7 RNA 중합효소를 이용한 TRC법에 의한 핵산증폭을, 이하의 방법으로 살모넬라 독소유전자(stn RNA)를 표적 RNA로 해서 측정하였다. 또, 대조로서 야생형 T7 RNA 중합효소를 이용하였다.
(1) 살모넬라 stn mRNA 검출 시약(TRCRtest stn-m(상품명), 토소사 제품)에 첨부의 stn RNA 양성 표준(농도: 106카피/5㎕)을 RNA 희석액(10mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0), 1mM EDTA, 0.5U/㎕ RNA 분해효소 억제제, 5mM 다이티오트레이톨)에서, 104카피/5㎕로 되도록 희석하였다. 대조 시험구(음성)에는 RNA 희석액만을 이용하였다.
(2) 이하의 조성의 반응액 20㎕를 0.5㎖ 용적의 PCR용 튜브에 분주하고, 이것에 상기 RNA 시료 5㎕를 첨가하였다.
(반응액의 조성) (최종 반응액량 30㎕에 있어서의 농도 또는 양)
Tris-HCl 완충액(pH 8.6) 60mM
MgCl2 17mM
KCl 100mM
RNA 분해효소 억제제 6U
다이티오트레이톨 1mM
dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각 0.25mM
ITP 3.6mM
ATP, CTP, GTP, UTP 각 3.0mM
절단용 올리고뉴클레오타이드 0.12μM
(서열 번호 47, 3'말단의 수산기는 아미노화)
제1 프라이머(서열 번호 48) 1.0μM
제2 프라이머(서열 번호 49) 1.0μM
인터칼레이터성 형광색소로 표지된 핵산 프로브 7.5nM
(서열 번호 50, 5'말단측 12번째의 「A」와 13번째의 「A」 사이에 인터칼레이터성 형광색소가 표지되고, 또한 3'말단측의 수산기는 글라이콜기로 수식)
DMSO 1%
용량조정용 증류수
(3) 상기 (2)의 반응액을 변이체는 49℃, 50℃, 51℃의 각 온도에서, 야생형은 43℃, 49℃의 각 온도에서, 5분간 보온 후, 미리 각 온도로 2분간 보온한 이하에 나타낸 조성의 효소액 5㎕를 첨가하였다.
(효소액의 조성)(최종 반응액량 30㎕에 있어서의 농도 또는 양)
솔비톨 2%
소혈청알부민 3.6㎍
AMV 역전사효소(라이프 사이언스사 제품) 4U
T7 RNA 중합효소 46U
용량조정용 증류수
(4) 직접 측정가능한 온도조절기능 부착 형광광도계를 이용하여, 각 온도에서 PCR 튜브를 보온하고, 여기파장 470㎚, 형광파장 510㎚에서, 반응 용액을 경시적으로 측정하였다.
효소첨가 시의 시간을 0분으로 해서, 반응액의 형광강도비(소정 시간의 형광강도값을 백그라운드의 형광강도값으로 나눈 값)의 시간에 따른 변화를 도 13에 나타내었다. 야생형 T7 RNA 중합효소를 사용했을 때는, 반응온도 49℃의 시점에서 stn RNA의 증폭이 보이지 않았던 것에 대해서, (Q786L+V685A) 이중변이체는 반응온도 51℃에 있어서도 stn RNA의 증폭이 보였다. 이로부터, (Q786L+V685A) 이중변이체는 야생형 T7 RNA 중합효소와 비교해서, 49℃ 내지 51℃라고 하는 고온영역에서의 열안정성 및/또는 비활성이 우수한 것을 알 수 있다.
실시예 24 - T7 RNA 중합효소 변이체에 의한 핵산증폭 반응의 최저 검출 농도측정
실시예 22에서 조제한 (Q786L+V685A) 이중변이형 T7 RNA 중합효소의 stn mRNA 표준 RNA에 대한 최저 검출 농도를 확인하였다.
측정 방법은, 반응온도를 50℃(이중변이체) 또는 43℃(야생형), 표적 RNA의 농도를 10, 50, 100, 300, 500, 1000카피/5㎕로 변경한 것 이외에는, 실시예 23과 마찬가지 방법으로 행하였다.
각 초기 RNA 카피수에 있어서의 (Q786L+V685A) 이중변이형 T7 RNA 중합효소 및 야생형 T7 RNA 중합효소의 검출률을 표 3에 나타내었다. 표 3으로부터 (Q786L+V685A) 이중변이체를 이용했을 때의 stn RNA의 검출률은 야생형 43℃의 검출률보다 높고, 검출률 80% 이상을 나타내는 최소 RNA 농도에서 비교하면, 야생형에서는 1000카피/5㎕에 대해서, (Q786L+V685A) 이중변이체는 200카피/5㎕였다. 양 효소의 최적온도조건에서 비교했을 경우, (Q786L+V685A) 변이체는 야생형보다 약 5배 감도가 향상되어 있는 것을 알 수 있다.
사용 재조합균 반응온도 각 초기 RNA(카피/테스트)에 있어서의 검출률(%)
0 50 100 200 300 500 1000
야생형 43℃ 0 0 13 43 50 63 100
(Q786L+V685A) 변이형 50℃ 0 38 63 88 86 100 100
실시예 25 - V685A 변이형 T7 RNA 중합효소의 제작
실시예 2에서 제작한 pCDF-T7 RNAPHis 플라스미드(도 4)의 T7 RNA 중합효소 유전자로부터, 이하의 순서로, 아미노산 서열 685번째의 발린이 알라닌으로 변이된 T7 RNA 중합효소 변이체(V685A 변이체)를 제작하였다.
(1) pCDF2-T7 RNAPHis(도 4)를 주형 플라스미드로 해서, 이하의 시약조성 및 반응 조건에서 PCR 반응을 행하였다. 또한, 합성 프라이머는 프라이머 V685AF(서열 번호 51)와 프라이머 pTrcRs(서열 번호 16)의 조합 또는 pCDFF4(서열 번호 42)와 프라이머 V685AR(서열 번호 53)의 조합을 이용하였다.
(시약조성)(총 반응액량: 50㎕)
합성 DNA 프라이머 각 100pM
주형 플라스미드 50ng
dNTPs 0.1mM
DNA 중합효소 0.025유닛/㎕
(PrimeSTAR HS DNA polymerase(상품명), 타카라바이오사 제품)
효소에 부속되는 버퍼
(반응 조건)
써멀 사이클러(퍼킨-엘머사 제품)를 이용해서, 96℃에서 30초 가열 후, 96℃에서 30초, 50℃에서 30초 및 72℃에서 1분의 온도 사이클을 30회 반복하였다.
(2) 반응액을 1% 아가로스 전기영동으로 분리 후, 에티디움 브로마이드 염색을 행하고, 염색 후의 겔로부터 목적 산물의 밴드를 잘라냄으로써 정제하였다.
(3) 상기 (2)에서 얻어진, 2종류의 정제 PCR 산물을 주형으로 해서, 더욱 PCR 반응을 행하여, V685A 변이체 유전자를 제작하였다. 또한, PCR 반응에 있어서의 시약조성, 반응 조건 및 정제 조작은, 합성 DNA 프라이머로서 프라이머 pCDFF4(서열 번호 42)와 프라이머 pTrcRs(서열 번호 16)의 조합을 사용한 것 이외에는 상기 (1) 내지 (2)와 같은 조건이다.
(4) 상기 (3)에서 얻어진 DNA 단편을, 제한 효소 HindIII 및 KpnI(타카라바이오사 제품)로 소화 후, 동일 효소로 소화시킨 pCDF2-T7 RNAPHis 벡터에 T4 리가제를 이용해서 4℃에서 30분 반응시켰다.
(5) 상기 (4)의 반응액을 이용해서 대장균 JM109주를 형질전환시키고, LBG/Crb 한천 배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, 0.5% 글루코스, 1.5% 한천, 50㎍/㎖ 카베니실린(pH 7.4)) 상에서 선택적으로 배양하여, 37℃에서 하룻밤 배양 후에 생육되어온 콜로니를 V685A 변이체라 하였다. 또한, V685A 변이체는 실시예 6에 나타낸 염기 서열 결정법에 의해 변이의 도입을 확인하였다. 그 유전자 서열을 서열 번호 54에 나타내는 한편, 아미노산 서열을 서열 번호 55에 나타낸다.
실시예 26 - V685A 변이형 T7 RNA 중합효소의 정제와 활성평가
실시예 25에서 제작한 V685A 변이형 T7 RNA 중합효소를 발현하는 대장균 JM109주를 이용해서, 실시예 7에 나타낸 방법으로, V685A 변이형 T7 RNA 중합효소의 조제 및 활성평가를 행하였다. 또한, 전사 반응온도는 43℃ 내지 49℃의 범위에 설정하고, T7 RNA 중합효소의 효소량을 20ng/㎕, 반응시간은 30분간으로 하였다. 또, 대조로서 야생형 T7 RNA 중합효소를 이용하였다.
각 온도에 있어서 생성된 RNA 양을 도 14에 나타내었다. 도 14로부터 V685A 변이형 T7 RNA 중합효소는 야생형보다도 반응온도 45℃ 이상에서 RNA 생산량이 많아, 고온에서의 비활성이 향상되어 있는 것을 알 수 있다.
실시예 27 - V685A 변이형 T7 RNA 중합효소의 열안정성 평가
실시예 26에서 조제한 V685A 변이형 T7 RNA 중합효소를 이용하여, 실시예 20에 나타낸 방법으로 V685A 변이형 T7 RNA 중합효소의 열안정성을 평가하였다. 또, 가열 처리 온도는 46℃에 설정하고, 처리 시간은 1분, 2분, 5분간으로 하였다. 또한, 대조로서 야생형 T7 RNA 중합효소를 이용하였다.
잔존 활성의 그래프를 도 15에 나타낸다. 또, 도 15의 그래프의 기울기로부터 V685A 변이형 T7 RNA 중합효소 및 야생형의 반감기를 구한 결과를 표 4에 나타낸다. 표 4로부터 V685A 변이체는 야생형보다도 반감기가 길고, 46℃에 있어서의 열안정성이 우수한 것을 알 수 있다.
T7 RNA 중합효소 반감기(분)
V685A 변이형 1.4
야생형 0.9
실시예 28 - ( V685A + Q786M ) 변이형 T7 RNA 중합효소의 제작
실시예 25에서 제작한 V685A 변이체 T7 RNA 중합효소 유전자를 삽입한 pCDF-T7 RNAPHis 플라스미드(도 4)를 이용해서, 이하의 방법으로, 또한 아미노산 서열 786번째의 글루타민이 메티오닌으로 변이된 (V685A+Q786M) 이중변이형 T7 RNA 중합효소를 제작하였다.
(1) V685A 변이체의 pCDF2-T7 RNAPHis를 주형 플라스미드로 해서, 이하의 시약조성 및 반응 조건에서 PCR 반응을 행하였다. 또한, 합성 프라이머는 프라이머 Q786MF(서열 번호 56)와 프라이머 pTrcRs(서열 번호 16)의 조합, 또는 pCDFF4(서열 번호 42)와 프라이머 Q786MR(서열 번호 57)의 조합을 이용하였다.
(시약조성)(총 반응액량: 50㎕)
합성 DNA 프라이머 각 100pM
주형 플라스미드 50ng
dNTPs 0.1mM
DNA 중합효소 0.025유닛/㎕
(PrimeSTAR HS DNA polymerase(상품명), 타카라바이오사 제품)
효소에 부속되는 버퍼
(반응 조건)
써멀 사이클러(퍼킨-엘머사 제품)를 이용해서, 96℃에서 30초 가열 후, 96℃에서 30초, 50℃에서 30초 및 72℃에서 1분의 온도 사이클을 30회 반복하였다.
(2) 반응액을 1% 아가로스 전기영동으로 분리 후, 에티디움 브로마이드 염색을 행하고, 염색 후의 겔로부터 목적 산물의 밴드를 잘라냄으로써 정제하였다.
(3) 상기 (2)에서 얻어진, 2종류의 정제 PCR 산물을 주형으로 해서, 더욱 PCR 반응을 행하고, (V685A+Q786M) 변이체 유전자를 제작하였다. 또한, PCR 반응에 있어서의 시약조성, 반응 조건 및 정제 조작은, 합성 DNA 프라이머로서 프라이머 pCDFF4(서열 번호 42)와 프라이머 pTrcRs(서열 번호 16)의 조합을 사용한 것 이외에는 상기 (1) 내지 (2)와 같은 조건이다.
(4) 상기 (3)에서 얻어진 DNA 단편을, 제한 효소 HindIII 및 KpnI(타카라바이오사 제품)로 소화 후, 동일 효소로 소화시킨 pCDF2-T7 RNAPHis 벡터에 T4 리가제를 이용해서 4℃에서 30분 반응시켰다.
(5) 상기 (4)의 반응액을 이용해서 대장균 JM109주를 형질전환시키고, LBG/Crb 한천 배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, 0.5% 글루코스, 1.5% 한천, 50㎍/㎖ 카베니실린(pH 7.4)) 상에서 선택적으로 배양하여, 37℃에서 하룻밤 배양 후에 생육되어온 콜로니를 (V685A+Q786M) 변이체라 하였다. 또한, (V685A+Q786M) 변이체는 실시예 6에 나타낸 염기 서열 결정법에 의해 변이의 도입을 확인하였다. 그 유전자 서열을 서열 번호 58에 나타내는 한편, 아미노산 서열을 서열 번호 59에 나타낸다.
실시예 29 - ( V685A + Q786M ) 변이형 T7 RNA 중합효소의 정제와 활성평가
실시예 28에서 제작한 (V685A+Q786M) 변이형 T7 RNA 중합효소를 발현하는 대장균 JM109주를 이용해서, 실시예 7에 나타낸 방법으로, (V685A+Q786M) 변이형 T7 RNA 중합효소의 조제 및 활성평가를 행하였다. 또, 전사 반응온도는 43℃ 내지 50℃의 범위에 설정하고, T7 RNA 중합효소의 효소량을 20ng/㎕, 반응시간은 30분간으로 하였다. 또한, 대조로서 야생형 T7 RNA 중합효소를 이용하였다.
각 온도에 있어서 생성된 RNA 양을 도 16에 나타내었다. 도 16으로부터 (V685A+Q786M) 변이형 T7 RNA 중합효소는 야생형보다도 반응온도 45℃ 이상에서 RNA 생산량이 많고, 고온에서의 비활성이 향상되고 있는 것을 알 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> TOSOH CORPORATION <120> RNA Polymerase Mutant With Improved Functions <150> JP2008-205491 <151> 2008-08-08 <150> JP2009-038979 <151> 2009-02-23 <150> JP2009-038980 <151> 2009-02-23 <160> 59 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 gcacttcatg aacacgatta acatcgc 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 agtgccaagc ttgactttct cagagat 27 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 gtcaagcttg gcactaaggc actggctgg 29 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 ctagataagc tttacgcgaa cgcgaagtcc g 31 <210> 5 <211> 2652 <212> DNA <213> Bacteriophage T7 <400> 5 atg aac acg att aac atc gct aag aac gac ttc tct gac atc gaa ctg 48 Met Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu 1 5 10 15 gct gct atc ccg ttc aac act ctg gct gac cat tac ggt gag cgt tta 96 Ala Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu 20 25 30 gct cgc gaa cag ttg gcc ctt gag cat gag tct tac gag atg ggt gaa 144 Ala Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu 35 40 45 gca cgc ttc cgc aag atg ttt gag cgt caa ctt aaa gct ggt gag gtt 192 Ala Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val 50 55 60 gcg gat aac gct gcc gcc aag cct ctc atc act acc cta ctc cct aag 240 Ala Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys 65 70 75 80 atg att gca cgc atc aac gac tgg ttt gag gaa gtg aaa gct aag cgc 288 Met Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg 85 90 95 ggc aag cgc ccg aca gcc ttc cag ttc ctg caa gaa atc aag ccg gaa 336 Gly Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu 100 105 110 gcc gta gcg tac atc acc att aag acc act ctg gct tgc cta acc agt 384 Ala Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser 115 120 125 gct gac aat aca acc gtt cag gct gta gca agc gca atc ggt cgg gcc 432 Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala 130 135 140 att gag gac gag gct cgc ttc ggt cgt atc cgt gac ctt gaa gct aag 480 Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys 145 150 155 160 cac ttc aag aaa aac gtt gag gaa caa ctc aac aag cgc gta ggg cac 528 His Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His 165 170 175 gtc tac aag aaa gca ttt atg caa gtt gtc gag gct gac atg ctc tct 576 Val Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser 180 185 190 aag ggt cta ctc ggt ggc gag gcg tgg tct tcg tgg cat aag gaa gac 624 Lys Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp 195 200 205 tct att cat gta gga gta cgc tgc atc gag atg ctc att gag tca acc 672 Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr 210 215 220 gga atg gtt agc tta cac cgc caa aat gct ggc gta gta ggt caa gac 720 Gly Met Val Ser Leu His Arg Gln Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp 225 230 235 240 tct gag act atc gaa ctc gca cct gaa tac gct gag gct atc gca acc 768 Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr 245 250 255 cgt gca ggt gcg ctg gct ggc atc tct ccg atg ttc caa cct tgc gta 816 Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro Met Phe Gln Pro Cys Val 260 265 270 gtt cct cct aag ccg tgg act ggc att act ggt ggt ggc tat tgg gct 864 Val Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala 275 280 285 aac ggt cgt cgt cct ctg gcg ctg gtg cgt act cac agt aag aaa gca 912 Asn Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala 290 295 300 ctg atg cgc tac gaa gac gtt tac atg cct gag gtg tac aaa gcg att 960 Leu Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile 305 310 315 320 aac att gcg caa aac acc gca tgg aaa atc aac aag aaa gtc cta gcg 1008 Asn Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala 325 330 335 gtc gcc aac gta atc acc aag tgg aag cat tgt ccg gtc gag gac atc 1056 Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile 340 345 350 cct gcg att gag cgt gaa gaa ctc ccg atg aaa ccg gaa gac atc gac 1104 Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp 355 360 365 atg aat cct gag gct ctc acc gcg tgg aaa cgt gct gcc gct gct gtg 1152 Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Val 370 375 380 tac cgc aag gac aag gct cgc aag tct cgc cgt atc agc ctt gag ttc 1200 Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe 385 390 395 400 atg ctt gag caa gcc aat aag ttt gct aac cat aag gcc atc tgg ttc 1248 Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe 405 410 415 cct tac aac atg gac tgg cgc ggt cgt gtt tac gct gtg tca atg ttc 1296 Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe 420 425 430 aac ccg caa ggt aac gat atg acc aaa gga ctg ctt acg ctg gcg aaa 1344 Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys 435 440 445 ggt aaa cca atc ggt aag gaa ggt tac tac tgg ctg aaa atc cac ggt 1392 Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly 450 455 460 gca aac tgt gcg ggt gtc gat aag gtt ccg ttc cct gag cgc atc aag 1440 Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys 465 470 475 480 ttc att gag gaa aac cac gag aac atc atg gct tgc gct aag tct cca 1488 Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro 485 490 495 ctg gag aac act tgg tgg gct gag caa gat tct ccg ttc tgc ttc ctt 1536 Leu Glu Asn Thr Trp Trp Ala Glu Gln Asp Ser Pro Phe Cys Phe Leu 500 505 510 gcg ttc tgc ttt gag tac gct ggg gta cag cac cac ggc ctg agc tat 1584 Ala Phe Cys Phe Glu Tyr Ala Gly Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr 515 520 525 aac tgc tcc ctt ccg ctg gcg ttt gac ggg tct tgc tct ggc atc cag 1632 Asn Cys Ser Leu Pro Leu Ala Phe Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln 530 535 540 cac ttc tcc gcg atg ctc cga gat gag gta ggt ggt cgc gcg gtt aac 1680 His Phe Ser Ala Met Leu Arg Asp Glu Val Gly Gly Arg Ala Val Asn 545 550 555 560 ttg ctt cct agt gaa acc gtt cag gac atc tac ggg att gtt gct aag 1728 Leu Leu Pro Ser Glu Thr Val Gln Asp Ile Tyr Gly Ile Val Ala Lys 565 570 575 aaa gtc aac gag att cta caa gca gac gca atc aat ggg acc gat aac 1776 Lys Val Asn Glu Ile Leu Gln Ala Asp Ala Ile Asn Gly Thr Asp Asn 580 585 590 gaa gta gtt acc gtg acc gat gag aac act ggt gaa atc tct gag aaa 1824 Glu Val Val Thr Val Thr Asp Glu Asn Thr Gly Glu Ile Ser Glu Lys 595 600 605 gtc aag ctt ggc act aag gca ctg gct ggt caa tgg ctg gct tac ggt 1872 Val Lys Leu Gly Thr Lys Ala Leu Ala Gly Gln Trp Leu Ala Tyr Gly 610 615 620 gtt act cgc agt gtg act aag cgt tca gtc atg acg ctg gct tac ggg 1920 Val Thr Arg Ser Val Thr Lys Arg Ser Val Met Thr Leu Ala Tyr Gly 625 630 635 640 tcc aaa gag ttc ggc ttc cgt caa caa gtg ctg gaa gat acc att cag 1968 Ser Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gln Gln Val Leu Glu Asp Thr Ile Gln 645 650 655 cca gct att gat tcc ggc aag ggt ctg atg ttc act cag ccg aat cag 2016 Pro Ala Ile Asp Ser Gly Lys Gly Leu Met Phe Thr Gln Pro Asn Gln 660 665 670 gct gct gga tac atg gct aag ctg att tgg gaa tct gtg agc gtg acg 2064 Ala Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu Ile Trp Glu Ser Val Ser Val Thr 675 680 685 gtg gta gct gcg gtt gaa gca atg aac tgg ctt aag tct gct gct aag 2112 Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met Asn Trp Leu Lys Ser Ala Ala Lys 690 695 700 ctt ctg gct gct gag gtc aaa gat aag aag act gga gag att ctt cgc 2160 Leu Leu Ala Ala Glu Val Lys Asp Lys Lys Thr Gly Glu Ile Leu Arg 705 710 715 720 aag cgt tgc gct gtg cat tgg gta act cct gat ggt ttc cct gtg tgg 2208 Lys Arg Cys Ala Val His Trp Val Thr Pro Asp Gly Phe Pro Val Trp 725 730 735 cag gaa tac aag aag cct att cag acg cgc ttg aac ctg atg ttc ctc 2256 Gln Glu Tyr Lys Lys Pro Ile Gln Thr Arg Leu Asn Leu Met Phe Leu 740 745 750 ggt cag ttc cgc tta cag cct acc att aac acc aac aaa gat agc gag 2304 Gly Gln Phe Arg Leu Gln Pro Thr Ile Asn Thr Asn Lys Asp Ser Glu 755 760 765 att gat gca cac aaa cag gag tct ggt atc gct cct aac ttt gta cac 2352 Ile Asp Ala His Lys Gln Glu Ser Gly Ile Ala Pro Asn Phe Val His 770 775 780 agc caa gac ggt agc cac ctt cgt aag act gta gtg tgg gca cac gag 2400 Ser Gln Asp Gly Ser His Leu Arg Lys Thr Val Val Trp Ala His Glu 785 790 795 800 aag tac gga atc gaa tct ttt gca ctg att cac gac tcc ttc ggt acc 2448 Lys Tyr Gly Ile Glu Ser Phe Ala Leu Ile His Asp Ser Phe Gly Thr 805 810 815 att ccg gct gac gct gcg aac ctg ttc aaa gca gtg cgc gaa act atg 2496 Ile Pro Ala Asp Ala Ala Asn Leu Phe Lys Ala Val Arg Glu Thr Met 820 825 830 gtt gac aca tat gag tct tgt gat gta ctg gct gat ttc tac gac cag 2544 Val Asp Thr Tyr Glu Ser Cys Asp Val Leu Ala Asp Phe Tyr Asp Gln 835 840 845 ttc gct gac cag ttg cac gag tct caa ttg gac aaa atg cca gca ctt 2592 Phe Ala Asp Gln Leu His Glu Ser Gln Leu Asp Lys Met Pro Ala Leu 850 855 860 ccg gct aaa ggt aac ttg aac ctc cgt gac atc tta gag tcg gac ttc 2640 Pro Ala Lys Gly Asn Leu Asn Leu Arg Asp Ile Leu Glu Ser Asp Phe 865 870 875 880 gcg ttc gcg taa 2652 Ala Phe Ala <210> 6 <211> 883 <212> PRT <213> Bacteriophage T7 <400> 6 Met Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu 1 5 10 15 Ala Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu 20 25 30 Ala Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu 35 40 45 Ala Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val 50 55 60 Ala Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys 65 70 75 80 Met Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg 85 90 95 Gly Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu 100 105 110 Ala Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser 115 120 125 Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala 130 135 140 Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys 145 150 155 160 His Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His 165 170 175 Val Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser 180 185 190 Lys Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp 195 200 205 Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr 210 215 220 Gly Met Val Ser Leu His Arg Gln Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp 225 230 235 240 Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr 245 250 255 Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro Met Phe Gln Pro Cys Val 260 265 270 Val Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala 275 280 285 Asn Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala 290 295 300 Leu Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile 305 310 315 320 Asn Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala 325 330 335 Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile 340 345 350 Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp 355 360 365 Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Val 370 375 380 Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe 385 390 395 400 Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe 405 410 415 Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe 420 425 430 Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys 435 440 445 Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly 450 455 460 Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys 465 470 475 480 Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro 485 490 495 Leu Glu Asn Thr Trp Trp Ala Glu Gln Asp Ser Pro Phe Cys Phe Leu 500 505 510 Ala Phe Cys Phe Glu Tyr Ala Gly Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr 515 520 525 Asn Cys Ser Leu Pro Leu Ala Phe Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln 530 535 540 His Phe Ser Ala Met Leu Arg Asp Glu Val Gly Gly Arg Ala Val Asn 545 550 555 560 Leu Leu Pro Ser Glu Thr Val Gln Asp Ile Tyr Gly Ile Val Ala Lys 565 570 575 Lys Val Asn Glu Ile Leu Gln Ala Asp Ala Ile Asn Gly Thr Asp Asn 580 585 590 Glu Val Val Thr Val Thr Asp Glu Asn Thr Gly Glu Ile Ser Glu Lys 595 600 605 Val Lys Leu Gly Thr Lys Ala Leu Ala Gly Gln Trp Leu Ala Tyr Gly 610 615 620 Val Thr Arg Ser Val Thr Lys Arg Ser Val Met Thr Leu Ala Tyr Gly 625 630 635 640 Ser Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gln Gln Val Leu Glu Asp Thr Ile Gln 645 650 655 Pro Ala Ile Asp Ser Gly Lys Gly Leu Met Phe Thr Gln Pro Asn Gln 660 665 670 Ala Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu Ile Trp Glu Ser Val Ser Val Thr 675 680 685 Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met Asn Trp Leu Lys Ser Ala Ala Lys 690 695 700 Leu Leu Ala Ala Glu Val Lys Asp Lys Lys Thr Gly Glu Ile Leu Arg 705 710 715 720 Lys Arg Cys Ala Val His Trp Val Thr Pro Asp Gly Phe Pro Val Trp 725 730 735 Gln Glu Tyr Lys Lys Pro Ile Gln Thr Arg Leu Asn Leu Met Phe Leu 740 745 750 Gly Gln Phe Arg Leu Gln Pro Thr Ile Asn Thr Asn Lys Asp Ser Glu 755 760 765 Ile Asp Ala His Lys Gln Glu Ser Gly Ile Ala Pro Asn Phe Val His 770 775 780 Ser Gln Asp Gly Ser His Leu Arg Lys Thr Val Val Trp Ala His Glu 785 790 795 800 Lys Tyr Gly Ile Glu Ser Phe Ala Leu Ile His Asp Ser Phe Gly Thr 805 810 815 Ile Pro Ala Asp Ala Ala Asn Leu Phe Lys Ala Val Arg Glu Thr Met 820 825 830 Val Asp Thr Tyr Glu Ser Cys Asp Val Leu Ala Asp Phe Tyr Asp Gln 835 840 845 Phe Ala Asp Gln Leu His Glu Ser Gln Leu Asp Lys Met Pro Ala Leu 850 855 860 Pro Ala Lys Gly Asn Leu Asn Leu Arg Asp Ile Leu Glu Ser Asp Phe 865 870 875 880 Ala Phe Ala <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 cacgatgcat ctgaaatgag ctgttgac 28 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 atacctaggc tgcagctacg cgaacgcgaa 30 <210> 9 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 atggggcatc atcatcatca tcatatgaac acgattaaca tc 42 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 gtcgatgtct tccggtttca tcggg 25 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 atgatgatga tgatgatgcc ccatggtctg tttcctgtgt g 41 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 gcttccacag caatggcatc ctggtc 26 <210> 13 <211> 2676 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> T7 RNA polymerase gene <400> 13 atg ggg cat cat cat cat cat cat atg aac acg att aac atc gct aag 48 Met Gly His His His His His 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Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp 340 345 350 aag cat tgt ccg gtc gag gac atc cct gcg att gag cgt gaa gaa ctc 1104 Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu 355 360 365 ccg atg aaa ccg gaa gac atc gac atg aat cct gag gct ctc acc gcg 1152 Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala 370 375 380 tgg aaa cgt gct gcc gct gct gtg tac cgc aag gac aag gct cgc aag 1200 Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Val Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys 385 390 395 400 tct cgc cgt atc agc ctt gag ttc atg ctt gag caa gcc aat aag ttt 1248 Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe 405 410 415 gct aac cat aag gcc atc tgg ttc cct tac aac atg gac tgg cgc ggt 1296 Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly 420 425 430 cgt gtt tac gct gtg tca atg ttc aac ccg caa ggt aac gat atg acc 1344 Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr 435 440 445 aaa gga ctg ctt acg ctg gcg aaa ggt aaa cca atc ggt aag gaa ggt 1392 Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly 450 455 460 tac tac tgg ctg aaa atc cac ggt gca aac tgt gcg ggt gtc gat aag 1440 Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys 465 470 475 480 gtt ccg ttc cct gag cgc atc aag ttc att gag gaa aac cac gag aac 1488 Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn 485 490 495 atc atg gct tgc gct aag tct cca ctg gag aac act tgg tgg gct gag 1536 Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro Leu Glu Asn Thr Trp Trp Ala Glu 500 505 510 caa gat tct ccg ttc tgc ttc ctt gcg ttc tgc ttt gag tac gct ggg 1584 Gln Asp Ser Pro Phe Cys Phe Leu Ala Phe Cys Phe Glu Tyr Ala Gly 515 520 525 gta cag cac cac ggc ctg agc tat aac tgc tcc ctt ccg ctg gcg ttt 1632 Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr Asn Cys Ser Leu Pro Leu Ala Phe 530 535 540 gac ggg tct tgc tct ggc atc cag cac ttc tcc gcg atg ctc cga gat 1680 Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln His Phe Ser Ala Met Leu Arg Asp 545 550 555 560 gag gta ggt ggt cgc gcg gtt aac ttg ctt cct agt gaa acc gtt cag 1728 Glu Val Gly Gly Arg Ala Val Asn Leu Leu Pro Ser Glu Thr Val Gln 565 570 575 gac atc tac ggg att gtt gct aag aaa gtc aac gag att cta caa gca 1776 Asp Ile Tyr Gly Ile Val Ala Lys Lys Val Asn Glu Ile Leu Gln Ala 580 585 590 gac gca atc aat ggg acc gat aac gaa gta gtt acc gtg acc gat gag 1824 Asp Ala Ile Asn Gly Thr Asp Asn Glu Val Val Thr Val Thr Asp Glu 595 600 605 aac act ggt gaa atc tct gag aaa gtc aag ctt ggc act aag gca ctg 1872 Asn Thr Gly Glu Ile Ser Glu Lys Val Lys Leu Gly Thr Lys Ala Leu 610 615 620 gct ggt caa tgg ctg gct tac ggt gtt act cgc agt gtg act aag cgt 1920 Ala Gly Gln Trp Leu Ala Tyr Gly Val Thr Arg Ser Val Thr Lys Arg 625 630 635 640 tca gtc atg acg ctg gct tac ggg tcc aaa gag ttc ggc ttc cgt caa 1968 Ser Val Met Thr Leu Ala Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gln 645 650 655 caa gtg ctg gaa gat acc att cag cca gct att gat tcc ggc aag ggt 2016 Gln Val Leu Glu Asp Thr Ile Gln Pro Ala Ile Asp Ser Gly Lys Gly 660 665 670 ctg atg ttc act cag ccg aat cag gct gct gga tac atg gct aag ctg 2064 Leu Met Phe Thr Gln Pro Asn Gln Ala Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu 675 680 685 att tgg gaa tct gtg agc gtg acg gtg gta gct gcg gtt gaa gca atg 2112 Ile Trp Glu Ser Val Ser Val Thr Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met 690 695 700 aac tgg ctt aag tct gct gct aag ctt ctg gct gct gag gtc aaa gat 2160 Asn Trp Leu Lys Ser Ala Ala Lys Leu Leu Ala Ala Glu Val Lys Asp 705 710 715 720 aag aag act gga gag att ctt cgc aag cgt tgc gct gtg cat tgg gta 2208 Lys Lys Thr Gly Glu Ile Leu Arg Lys Arg Cys Ala Val His Trp Val 725 730 735 act cct gat ggt ttc cct gtg tgg cag gaa tac aag aag cct att cag 2256 Thr Pro Asp Gly Phe Pro Val Trp Gln Glu Tyr Lys Lys Pro Ile Gln 740 745 750 acg cgc ttg aac ctg atg ttc ctc ggt cag ttc cgc tta cag cct acc 2304 Thr Arg Leu Asn Leu Met Phe Leu Gly Gln Phe Arg Leu Gln Pro Thr 755 760 765 att aac acc aac aaa gat agc gag att gat gca cac aaa cag gag tct 2352 Ile Asn Thr Asn Lys Asp Ser Glu Ile Asp Ala His Lys Gln Glu Ser 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agc ctt gag ttc 1200 Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe 385 390 395 400 atg ctt gag caa gcc aat aag ttt gct aac cat aag gcc atc tgg ttc 1248 Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe 405 410 415 cct tac aac atg gac tgg cgc ggt cgt gtt tac gct gtg tca atg ttc 1296 Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe 420 425 430 aac ccg caa ggt aac gat atg acc aaa gga ctg ctt acg ctg gcg aaa 1344 Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys 435 440 445 ggt aaa cca atc ggt aag gaa ggt tac tac tgg ctg aaa atc cac ggt 1392 Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly 450 455 460 gca aac tgt gcg ggt gtc gat aag gtt ccg ttc cct gag cgc atc aag 1440 Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys 465 470 475 480 ttc att gag gaa aac cac gag aac atc atg gct tgc gct aag tct cca 1488 Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro 485 490 495 ctg gag aac act tgg tgg gct gag caa gat tct ccg ttc tgc ttc ctt 1536 Leu Glu Asn Thr Trp Trp Ala Glu Gln Asp Ser Pro Phe Cys Phe Leu 500 505 510 gcg ttc tgc ttt gag tac gct ggg gta cag cac cac ggc ctg agc tat 1584 Ala Phe Cys Phe Glu Tyr Ala Gly Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr 515 520 525 aac tgc tcc ctt ccg ctg gcg ttt gac ggg tct tgc tct ggc atc cag 1632 Asn Cys Ser Leu Pro Leu Ala Phe Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln 530 535 540 cac ttc tcc gcg atg ctc cga gat gag gta ggt ggt cgc gcg gtt aac 1680 His Phe Ser Ala Met Leu Arg Asp Glu Val Gly Gly Arg Ala Val Asn 545 550 555 560 ttg ctt cct agt gaa acc gtt cag gac atc tac ggg att gtt gct aag 1728 Leu Leu Pro Ser Glu Thr Val Gln Asp Ile Tyr Gly Ile Val Ala Lys 565 570 575 aaa gtc aac gag att cta caa gca gac gca atc aat ggg acc gat aac 1776 Lys Val Asn Glu Ile Leu Gln Ala Asp Ala Ile Asn Gly Thr Asp Asn 580 585 590 gaa gta gtt acc gtg acc gat gag aac act ggt gaa atc tct gag aaa 1824 Glu Val Val Thr Val Thr Asp Glu Asn Thr Gly Glu Ile Ser Glu Lys 595 600 605 gtc 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Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe 405 410 415 cct tac aac atg gac tgg cgc ggt cgt gtt tac gct gtg tca atg ttc 1296 Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe 420 425 430 aac ccg caa ggt aac gat atg acc aaa gga ctg ctt acg ctg gcg aaa 1344 Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys 435 440 445 ggt aaa cca atc ggt aag gaa ggt tac tac tgg ctg aaa atc cac ggt 1392 Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly 450 455 460 gca aac tgt gcg ggt gtc gat aag gtt ccg ttc cct gag cgc atc aag 1440 Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys 465 470 475 480 ttc att gag gaa aac cac gag aac atc atg gct tgc gct aag tct cca 1488 Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro 485 490 495 ctg gag aac act tgg tgg gct gag caa gat tct ccg ttc tgc ttc ctt 1536 Leu Glu Asn Thr Trp Trp Ala Glu Gln Asp Ser Pro Phe Cys Phe Leu 500 505 510 gcg ttc tgc ttt gag tac gct ggg gta cag cac cac ggc ctg 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gtc atg acg ctg gct tac ggg 1920 Val Thr Arg Ser Val Thr Lys Arg Ser Val Met Thr Leu Ala Tyr Gly 625 630 635 640 tcc aaa gag ttc ggc ttc cgt caa caa gtg ctg gaa gat acc att cag 1968 Ser Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gln Gln Val Leu Glu Asp Thr Ile Gln 645 650 655 cca gct att gat tcc ggc aag ggt ctg atg ttc act cag ccg aat cag 2016 Pro Ala Ile Asp Ser Gly Lys Gly Leu Met Phe Thr Gln Pro Asn Gln 660 665 670 gct gct gga tac atg gct aag ctg att tgg gaa tct gcg agc gtg acg 2064 Ala Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu Ile Trp Glu Ser Ala Ser Val Thr 675 680 685 gtg gta gct gcg gtt gaa gca atg aac tgg ctt aag tct gct gct aag 2112 Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met Asn Trp Leu Lys Ser Ala Ala Lys 690 695 700 ctt ctg gct gct gag gtc aaa gat aag aag act gga gag att ctt cgc 2160 Leu Leu Ala Ala Glu Val Lys Asp Lys Lys Thr Gly Glu Ile Leu Arg 705 710 715 720 aag cgt tgc gct gtg cat tgg gta act cct gat ggt ttc cct gtg tgg 2208 Lys Arg Cys Ala Val His Trp Val Thr Pro Asp Gly Phe Pro Val Trp 725 730 735 cag gaa tac 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aac atc gct aag aac gac ttc tct gac atc gaa ctg 48 Met Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu 1 5 10 15 gct gct atc ccg ttc aac act ctg gct gac cat tac ggt gag cgt tta 96 Ala Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu 20 25 30 gct cgc gaa cag ttg gcc ctt gag cat gag tct tac gag atg ggt gaa 144 Ala Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu 35 40 45 gca cgc ttc cgc aag atg ttt gag cgt caa ctt aaa gct ggt gag gtt 192 Ala Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val 50 55 60 gcg gat aac gct gcc gcc aag cct ctc atc act acc cta ctc cct aag 240 Ala Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys 65 70 75 80 atg att gca cgc atc aac gac tgg ttt gag gaa gtg aaa gct aag cgc 288 Met Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg 85 90 95 ggc aag cgc ccg aca gcc ttc cag ttc ctg caa gaa atc aag ccg gaa 336 Gly Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu 100 105 110 gcc gta gcg tac atc acc att aag acc act ctg gct tgc cta acc agt 384 Ala Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser 115 120 125 gct gac aat aca acc gtt cag gct gta gca agc gca atc ggt cgg gcc 432 Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala 130 135 140 att gag gac gag gct cgc ttc ggt cgt atc cgt gac ctt gaa gct aag 480 Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys 145 150 155 160 cac ttc aag aaa aac gtt gag gaa caa ctc aac aag cgc gta ggg cac 528 His Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His 165 170 175 gtc tac aag aaa gca ttt atg caa gtt gtc gag gct gac atg ctc tct 576 Val Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser 180 185 190 aag ggt cta ctc ggt ggc gag gcg tgg tct tcg tgg cat aag gaa gac 624 Lys Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp 195 200 205 tct att cat gta gga gta cgc tgc atc gag atg ctc att gag tca acc 672 Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr 210 215 220 gga atg gtt 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Ile Asp Ser Gly Lys Gly Leu Met Phe Thr Gln Pro Asn Gln 660 665 670 gct gct gga tac atg gct aag ctg att tgg gaa tct gcg agc gtg acg 2064 Ala Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu Ile Trp Glu Ser Ala Ser Val Thr 675 680 685 gtg gta gct gcg gtt gaa gca atg aac tgg ctt aag tct gct gct aag 2112 Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met Asn Trp Leu Lys Ser Ala Ala Lys 690 695 700 ctt ctg gct gct gag gtc aaa gat aag aag act gga gag att ctt cgc 2160 Leu Leu Ala Ala Glu Val Lys Asp Lys Lys Thr Gly Glu Ile Leu Arg 705 710 715 720 aag cgt tgc gct gtg cat tgg gta act cct gat ggt ttc cct gtg tgg 2208 Lys Arg Cys Ala Val His Trp Val Thr Pro Asp Gly Phe Pro Val Trp 725 730 735 cag gaa tac aag aag cct att cag acg cgc ttg aac ctg atg ttc ctc 2256 Gln Glu Tyr Lys Lys Pro Ile Gln Thr Arg Leu Asn Leu Met Phe Leu 740 745 750 ggt cag ttc cgc tta cag cct acc att aac acc aac aaa gat agc gag 2304 Gly Gln Phe Arg Leu Gln Pro Thr Ile Asn Thr Asn Lys Asp Ser Glu 755 760 765 att gat gca cac aaa cag gag tct ggt atc gct cct aac ttt 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Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp 195 200 205 Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr 210 215 220 Gly Met Val Ser Leu His Arg Gln Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp 225 230 235 240 Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr 245 250 255 Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro Met Phe Gln Pro Cys Val 260 265 270 Val Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala 275 280 285 Asn Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala 290 295 300 Leu Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile 305 310 315 320 Asn Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala 325 330 335 Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile 340 345 350 Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp 355 360 365 Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Val 370 375 380 Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe 385 390 395 400 Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe 405 410 415 Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe 420 425 430 Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys 435 440 445 Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly 450 455 460 Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys 465 470 475 480 Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro 485 490 495 Leu Glu Asn Thr Trp Trp Ala Glu Gln Asp Ser Pro Phe Cys Phe Leu 500 505 510 Ala Phe Cys Phe Glu Tyr Ala Gly Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr 515 520 525 Asn Cys Ser Leu Pro Leu Ala Phe Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln 530 535 540 His Phe Ser Ala Met Leu Arg Asp Glu Val Gly Gly Arg Ala Val Asn 545 550 555 560 Leu Leu Pro Ser Glu Thr Val Gln Asp Ile Tyr Gly Ile Val Ala Lys 565 570 575 Lys Val Asn Glu Ile Leu Gln Ala Asp Ala Ile Asn Gly Thr Asp Asn 580 585 590 Glu Val Val Thr Val Thr Asp Glu Asn Thr Gly Glu Ile Ser Glu Lys 595 600 605 Val Lys Leu Gly Thr Lys Ala Leu Ala Gly Gln Trp Leu Ala Tyr Gly 610 615 620 Val Thr Arg Ser Val Thr Lys Arg Ser Val Met Thr Leu Ala Tyr Gly 625 630 635 640 Ser Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gln Gln Val Leu Glu Asp Thr Ile Gln 645 650 655 Pro Ala Ile Asp Ser Gly Lys Gly Leu Met Phe Thr Gln Pro Asn Gln 660 665 670 Ala Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu Ile Trp Glu Ser Ala Ser Val Thr 675 680 685 Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met Asn Trp Leu Lys Ser Ala Ala Lys 690 695 700 Leu Leu Ala Ala Glu Val Lys Asp Lys Lys Thr Gly Glu Ile Leu Arg 705 710 715 720 Lys Arg Cys Ala Val His Trp Val Thr Pro Asp Gly Phe Pro Val Trp 725 730 735 Gln Glu Tyr Lys Lys Pro Ile Gln Thr Arg Leu Asn Leu Met Phe Leu 740 745 750 Gly Gln Phe Arg Leu Gln Pro Thr Ile Asn Thr Asn Lys Asp Ser Glu 755 760 765 Ile Asp Ala His Lys Gln Glu Ser Gly Ile Ala Pro Asn Phe Val His 770 775 780 Ser Met Asp Gly Ser His Leu Arg Lys Thr Val Val Trp Ala His Glu 785 790 795 800 Lys Tyr Gly Ile Glu Ser Phe Ala Leu Ile His Asp Ser Phe Gly Thr 805 810 815 Ile Pro Ala Asp Ala Ala Asn Leu Phe Lys Ala Val Arg Glu Thr Met 820 825 830 Val Asp Thr Tyr Glu Ser Cys Asp Val Leu Ala Asp Phe Tyr Asp Gln 835 840 845 Phe Ala Asp Gln Leu His Glu Ser Gln Leu Asp Lys Met Pro Ala Leu 850 855 860 Pro Ala Lys Gly Asn Leu Asn Leu Arg Asp Ile Leu Glu Ser Asp Phe 865 870 875 880 Ala Phe Ala

Claims (16)

  1. 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소(polymerase)를 구성하는 아미노산 서열 중, 적어도 786번째의 글루타민, 179번째의 리신 및 685번째의 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개에 상당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어, 야생형 T7유사 박테리오파지의 RNA 중합효소와 비교해서, 열안정성 및/또는 비활성(specific activity)이 향상되어 있는 것을 특징으로 하는 T7 RNA 중합효소 변이체.
  2. 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 적어도 786번째의 글루타민에 상당하는 아미노산 잔기가 소수성 아미노산으로 치환되어, 야생형 T7유사 박테리오파지의 RNA 중합효소와 비교해서 열안정성 및/또는 비활성이 향상되어 있는 것을 특징으로 하는 T7 RNA 중합효소 변이체.
  3. 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 적어도 786번째의 글루타민에 상당하는 아미노산 잔기가 로이신 또는 메티오닌으로 치환되어, 야생형 T7유사 박테리오파지의 RNA 중합효소와 비교해서 열안정성 및/또는 비활성이 향상되어 있는 것을 특징으로 하는 T7 RNA 중합효소 변이체.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 추가로, 적어도 179번째의 리신에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산, 아스파라긴, 시스테인 중 어느 하나로 치환되어, 야생형 T7유사 박테리오파지의 RNA 중합효소와 비교해서, 열안정성 및 비활성이 향상되어 있는 것을 특징으로 하는 T7 RNA 중합효소 변이체.
  5. 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 적어도 179번째의 리신에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산, 아스파라긴, 시스테인 중 어느 하나로 치환되어, 야생형 T7유사 박테리오파지의 RNA 중합효소와 비교해서 열안정성 및/또는 비활성이 향상되어 있는 것을 특징으로 하는 T7 RNA 중합효소 변이체.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 추가로, 적어도 685번째의 발린에 상당하는 아미노산 잔기가 중성 또는 약소수성 아미노산으로 치환되어, 야생형 T7유사 박테리오파지의 RNA 중합효소와 비교해서, 열안정성 및 비활성이 향상되어 있는 것을 특징으로 하는 T7 RNA 중합효소 변이체.
  7. 제6항에 있어서, 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 추가로, 적어도 685번째의 발린에 상당하는 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환되어, 야생형 T7유사 박테리오파지의 RNA 중합효소와 비교해서, 열안정성 및 비활성이 향상되어 있는 것을 특징으로 하는 T7 RNA 중합효소 변이체.
  8. 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 적어도 685번째의 발린에 상당하는 아미노산 잔기가 중성 또는 약소수성 아미노산으로 치환되어, 야생형 T7 RNA 중합효소와 비교해서 열안정성 및/또는 비활성이 향상되어 있는 것을 특징으로 하는 T7 RNA 중합효소 변이체.
  9. 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 적어도 685번째의 발린에 상당하는 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환되어, 야생형 T7 RNA 중합효소와 비교해서 열안정성 및/또는 비활성이 향상되어 있는 것을 특징으로 하는 T7 RNA 중합효소 변이체.
  10. 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 685번째의 발린에 상당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되고, 추가로, 179번째의 리신 및/또는 786번째의 글루타민에 상당하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 T7 RNA 중합효소 변이체.
  11. 서열 번호 6으로 표시되는 야생형 T7 RNA 중합효소를 구성하는 아미노산 서열 중, 685번째의 발린에 상당하는 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환되고, 추가로, 179번째의 리신에 상당하는 아미노산 잔기가 글루타민산으로 치환 및/또는 786번째의 글루타민에 상당하는 아미노산 잔기가 로이신 또는 메티오닌으로 치환된 T7 RNA 중합효소 변이체.
  12. 제1항 내지 제11항 어느 한 항에 기재된 T7 RNA 중합효소 변이체를 코드하는 유전자.
  13. 제1항 내지 제11항 어느 한 항에 기재된 T7 RNA 중합효소 변이체를 코드하는 유전자를 발현해서 T7 RNA 중합효소를 생산하는 것이 가능한 세포.
  14. 제1항 내지 제11항 어느 한 항에 기재된 T7 RNA 중합효소 변이체를 코드하는 유전자를 발현시키는 것에 의한 T7 RNA 중합효소의 생산방법.
  15. 제1항 내지 제11항 어느 한 항에 기재된 T7 RNA 중합효소 변이체를 이용해서 RNA를 제조하는 방법.
  16. 제1항 내지 제11항 어느 한 항에 기재된 T7 RNA 중합효소 변이체를 이용해서 RNA를 증폭하는 방법.
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