WO2009113718A1 - 機能改善したｒｎａポリメラーゼ変異体 - Google Patents

機能改善したｒｎａポリメラーゼ変異体 Download PDF

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WO2009113718A1
WO2009113718A1 PCT/JP2009/055227 JP2009055227W WO2009113718A1 WO 2009113718 A1 WO2009113718 A1 WO 2009113718A1 JP 2009055227 W JP2009055227 W JP 2009055227W WO 2009113718 A1 WO2009113718 A1 WO 2009113718A1
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WO
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rna polymerase
amino acid
wild
seq
type
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Application number
PCT/JP2009/055227
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English (en)
French (fr)
Inventor
大江正剛
佐藤寛
井出輝彦
Original Assignee
東ソー株式会社
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)

Definitions

  • the present invention introduces a mutation in a part of the amino-type sequence of wild-type RNA polymerase so that RNase polymerase having an improved function, particularly RNase polymerase having improved thermal stability and Z or specific activity.
  • the present invention relates to a gene encoding the RNA polymerase, a method for producing the RNA polymerase, and a method for producing RNA using the RNA polymerase. Background Technology ⁇
  • the present invention relates to a mutant RNA polymerase obtained from bacteriophage, particularly T 7 RNA polymerase, which has improved stability and / or specific activity over high temperature conditions compared to wild type.
  • bacteriophages that can infect E. coli there are T3, T7, ⁇ I, ⁇ II, W31, H, Y, Al, cro C21, C22, and C23 Among them, RNA polymerase encoded by T7 phage is T7 RNA polymerase.
  • T 7 RN A polymerase As a feature of T 7 RN A polymerase, first, there is a high selectivity for the promoter sequence. T7 RNA polymerase binds to its own unique promoter sequence, but not to other promoter sequences, even from other bacteriophage promoter sequences. This high selectivity ensures that the RNA polymerase transcription reaction is directed against its own genome, not against the host genome. Second, unlike other polymerases, T 7 RNA polymerase has a series of capabilities that recognize promoters, initiate transcription, extend RNA transcripts, and terminate transcription without the need for cofactors. In addition, the transcription rate is 5 times faster than RNA polymerase from Escherichia coli.
  • T 7 RNA polymerase having the advantages described above is actively used in various fields.
  • in vitro transcription and high expression systems in Escherichia coli US Pat. No. 4,952,4 9.
  • No. 6 Patent Literature 1
  • cell-free protein synthesis system cell-free protein synthesis system
  • base sequence determination method Japanese Patent Laid-Open No. 11 1 187979: Patent Literature 2
  • isothermal nucleic acid amplification method TRC method, which is one of isothermal nucleic acid amplification methods (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-140-1400: Patent Document 3 and I shiguro T. eta 1., A na 1 ytica 1 B iochemistry, 3 1 4 , 7 7-8 6 (2 0 0 3): Non-patent document 1) will be described in detail.
  • the TRC method is a method for amplifying a target RNA containing a specific RNA sequence by the concerted action of a DNA-dependent RNA polymerase and reverse transcriptase.
  • a double-stranded DNA containing a promo sequence is synthesized by synthesizing a target RNA with a primer containing the T 7 promo sequence, reverse transcriptase and liponuclease H.
  • the nucleic acid amplification method by TRC method has the advantage that complex temperature control is not required because it can react at a constant temperature, unlike the case of amplification by PCR method.
  • T using wild-type T 7 RNA polymerase When nucleic acid amplification using the RC method was performed, the nucleic acid amplification efficiency decreased due to decreased activity of T7 RNA polymerase at 46 ° C or higher.
  • nucleic acid amplification by the current TRC method is generally performed under relatively low temperature conditions of 40 ° C to 45 ° C. Under low temperature conditions, RNA tends to have a complex higher-order structure, which has made it difficult to design a primer that can be detected with high sensitivity in the TRC method. Therefore, 4
  • RNA polymerases with various improved functions due to mutation have established a system for measuring the activity of T 7 RNA polymerase (I ke da R. A. e t a 1., B 1 o c h e m i s t r y,
  • Non-Patent Document 2 and I ke d a R. A. e t a 1., Nu c 1. A c i d. R e s.
  • Non-patent document 3
  • Patent Document 4 Enzyme with Enhanced Specific Activity and Thermal Stability at High Temperature (Special Table 2 0 3-5 2 5 6 2 7 Publication: Patent Document 5), Deletion of Amino Acids
  • Patent Document 6 an enzyme having enhanced 3′-dioxyliponuclei-H uptake ability by substitution (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-63166) (Patent Document 6). Summary of the Invention
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a T 7 RNA polymerase mutant having improved thermostability and Z or specific activity as compared with the wild type and a method for producing the same.
  • T 7 RNA polymerase mutants in which the amino group is replaced with another amino acid are wild-type T 7 R
  • thermostability and / or thermostability is improved compared to NA polymerase.
  • amino acid residue at a site different from the above site ie, 6
  • the present invention includes the following inventions:
  • T 7 RNA polymerase variant characterized by improved thermostability and Z or specific activity compared to type T7-like bacteriophage RNA polymerase
  • T 7 RNA polymerase variant characterized by improved thermostability and / or specific activity compared to 7-like bacteriophage RNA polymerase.
  • T7 RNA polymerase variant characterized by improved thermostability and Z or specific activity compared to the RNA polymerase of wild-type T7-like pacteriophage.
  • T7 RNA polymerase variant according to (6) which has improved thermal stability and specific activity as compared to RNA polymerase of T7-like bacteriophage.
  • T 7 RNA polymerase variant characterized by improved thermostability and / or specific activity compared to wild-type T 7 RNA polymerase.
  • (11) Constructs the wild type T 7 RNA polymerase shown in SEQ ID NO: 6.
  • 6 8 5th amino acid residue corresponding to 5th parin is substituted with alanine
  • 1 7 9th amino acid residue corresponding to 9th lysine is substituted with glutamic acid
  • Z or 7 8 6 A T7 RNA polymerase mutant in which the amino acid residue corresponding to the second dulamine is substituted with leucine or methionine.
  • the mutant T 7 RNA polymerase of the present invention has improved thermostability and Z or specific activity compared to the wild type T 7 RNA polymerase, and therefore has a wider temperature range than the wild type. Expected to shorten transcription reaction and Z or transcription reaction time.
  • FIG. 1 shows a restriction map of the plasmid pTrc99A-T7RNApo1 cloned with T7RNA polymerase.
  • FIG. 2 shows a restriction map of pCDF2 plasmid.
  • Figure 3 shows a restriction map of the plasmid pCDF2-T7RNAP that produces T7 RNA polymerase.
  • Figure 4 shows a restriction map of the plasmid P C DF 2 — T 7 RNA P H is that produces T 7 RNA polymerase fused with histidine hexama 1 at the N-terminus.
  • FIG. 5 shows a restriction map of pSTV GFP having a GFP gene whose expression is induced by T7 promotion.
  • Figure 6 shows the prepared T 7 RNA polymerase wild type and its mutants K 1 7 9 E, Q 7 8 6 L and double mutant (K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L). The results (electrophoresis) comparing the thermal stability to heating at 7 ° C are shown.
  • lane 1 is the wild type
  • lane 2 is the K 1 7 9 E mutant
  • lane 3 is the Q 7 8 6 L mutant
  • lane 4 is (K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L) Results obtained with each mutant T 7 RNA polymerase.
  • Figure 7 shows the prepared T 7 RNA polymerase wild type and its mutants K 1 7 9 E, Q 7 8 6 L and double mutant (K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L), respectively. The results of comparing the production of RNA from 4 3 to 50 ° C are shown below.
  • Figure 8 shows RNA production at 4 3 to 50 ° C for each of the wild-type T 7 RNA polymerase and its mutants K 1 7 9 E, K l 7 9 C and K l 7 9 N The result which compared the quantity is shown.
  • Figure 9 shows the prepared wild type T 7 RNA polymerase and its mutants Q 7 8 6 L, Q 7 8 6 M, Q 7 8 6 F and Q 7 8 6 Y 4 3 to 5 0 respectively The results of comparison of RNA production at ° C are shown.
  • Figure 10 shows wild-type T 7 RNA polymerase, mutant T 7 RNA polymerase Q 7 8 6 L, Q 7 8 6 M, Q 7 8 6 F, Q 7 8 6 Y, K 1 7 9 E, K l 7 9 C and K l 7 9 N for heating at 47 ° C each The result which compared the thermal stability with respect to is shown.
  • Figure 11 shows wild-type T 7 RNA polymerase, (K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L) double mutant, and (K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) The results of comparison of the amount of RNA produced between each of the triple mutants at 43 to 50 ° C are shown.
  • Figure 12 shows the wild-type T 7 RNA polymerase, (K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L) double mutant, and (K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) A comparison of the thermal stability of each triple mutant with heating at 48 ° C.
  • Figure 13 shows an isothermal nucleic acid amplification reaction by the TRC method using Salmonella stn RNA as a target and wild-type T 7 RNA polymerase and (Q 7 86 L + V 6 85 A) double mutant. The results are shown.
  • Fig. 14 shows the results of comparing the amounts of RNA produced from 43 to 49 ° C of wild-type T 7 RNA polymerase and V 6 85 A mutant, respectively.
  • Figure 15 shows the results of comparing the thermal stability of each of the wild-type T7RNA polymerase and the V 685 A mutant with respect to heating at 46 ° C.
  • Figure 16 shows wild-type T7 RNA polymerase, V 685 A mutant, and (V 6 85 A + Q 7 86 M) double mutant, 4 3 each. The results of comparison of RNA production at 50 ° C from the same time are shown.
  • the T7 RNA polymerase with improved thermal stability and / or specific activity disclosed in the present invention is the amino acid sequence constituting the wild type T7 RNA polymerase shown in SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid residue corresponding to at least 7 86th glutamine is substituted with another amino acid, and preferably the substituted amino acid is a hydrophobic amino acid (leucine, methionine, phenylalanin, tyrosine). More preferably, the substituted amino acid is mouth isine or methionine.
  • the “amino acid residue corresponding to the 786th glutamine” refers to the darumamin residue at the 786th position when the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is used as a reference.
  • the length of the added or deleted polypeptide is (For example, in the case of T 7 RNA polymerase in which a polypeptide consisting of 10 amino acid residues is added to the 5 ′ end of T 7 RNA polymerase consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 6, The amino acid residue corresponding to the 2nd glutamine is the 796th glutamine).
  • the T7 RNA polymerase having improved thermal stability and Z or specific activity disclosed in the present invention is an amino acid sequence constituting the wild type T7 RNA polymerase shown in SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid residue corresponding to the 179th lysine is substituted with another amino acid, and preferably the substituted amino acid is dartamic acid, asparagine, or cysteine, and more preferably Preferably, the substituted amino acid is glutamic acid.
  • the amino acid residue corresponding to the 179th lysine refers to the lysine residue at the 179th position when the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is used as a reference.
  • the T7 RNA polymerase having improved thermal stability and specific activity disclosed in the present invention is less than the amino acid sequence constituting the wild-type T7 RNA polymerase shown in SEQ ID NO: 6.
  • Both amino acid residues corresponding to the 7 8th 6th glutamine and the amino acid residue corresponding to the 1 79th 9th lysine are respectively substituted with other amino acids, and preferably the 7 8th 6th amino acid residue is hydrophobic. It is more preferable that one of the sex amino acids (leucine, methionine, phenylalanine, tyrosine) is substituted for the 1st to 9th amino acid residues with glutamic acid, asparagine, or cysteine, respectively.
  • 7 8 6th amino acid residue is leucine or methionine 1 7th 9th amino acid residue is glutamic acid, asparagine, or systemine Respectively.
  • the T7 RNA polymerase having improved thermostability and / or specific activity disclosed in the present invention is the amino acid sequence constituting the wild type T7 RNA polymerase shown in SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid residue corresponding to at least 6 85th palin is substituted with another amino acid, and preferably the amino acid is a neutral or weakly hydrophobic amino acid (alanine, glycine, serine, threonine, cis Tin, asparagine, glutamine), and more preferably the substituted amino acid is alanine.
  • amino acid residue corresponding to the 685th valine refers to the valine residue at the 685th position based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. Yes, when a polypeptide is added or deleted to the 5 'end of T7 RNA polymerase consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 6, the position is shifted by the length of the added or deleted polypeptide.
  • T7 RNA polymerase (For example, a polypeptide consisting of 10 amino acid residues at the 5 ′ end of a T 7 RNA polymerase comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 6)
  • the “amino acid residue corresponding to the 6 8th valine” is the 6 9 5th lysine.
  • T7 RNA polymerase with improved thermostability and Z or specific activity corresponds to the aforementioned 685th valine in the amino acid sequence constituting wild type T7 RNA polymerase shown in SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid residues corresponding to the 1 79th lysine and / or the 7 86th glutamine are substituted with other amino acid residues, preferably 1 7
  • the amino acid residue corresponding to the 9th lysine is substituted with dartamic acid
  • the amino acid residue corresponding to the Z or 786th darwinamine is substituted with leucine or methionine, respectively.
  • the amino acid residue corresponding to the 1 79th lysine and / or the 7 6 6th glutamine refers to the 1 7 9th when the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is used as a reference.
  • the mutant T7RNA polymerase of the present invention can be prepared by introducing a mutation into the wild-type T7RNA polymerase gene.
  • Methods for introducing a desired mutation into a predetermined nucleic acid sequence are known to those skilled in the art.
  • DNA with mutations is constructed by appropriately using known techniques such as site-directed mutagenesis, PCR using degenerate oligonucleotides, mutagenesis of cells containing nucleic acids, or exposure to radiation. be able to.
  • T7 RNA polymerase gene is not available to those skilled in the art. Any method can be used. For example, from T7 phage (DSMN o. 4 6 2 3, AT CC 1 1 3 0 3 — B 7, NCI MB 1 0 3 8 0 etc.) It can be obtained by PCR using the prepared appropriate primer.
  • the method for obtaining the enzyme of the present invention is not particularly limited, and may be a protein synthesized by chemical synthesis or a recombinant protein produced by a gene recombination technique.
  • the target enzyme can be obtained by incorporating the T7 RNA polymerase gene into the host by an appropriate method.
  • Various cultured cells such as yeast, animal cell lines, plant cells, and insect cells can be used as the host, but the T 7 RNA polymerase gene is the original bacteriophage infection site and is easy to handle. It is desirable to use E. coli as a host. Examples of Escherichia coli used for transformation include, but are not limited to, JM109 strain and HB101 strain.
  • the gene of the present invention can be used by inserting it into an appropriate vector.
  • the type of vector used in the present invention is not particularly limited, and may be, for example, a self-replicating vector, or may be one that is integrated into the host cell genome when introduced into the host cell.
  • the vector used in the present invention is an expression vector.
  • Promo is a DNA sequence that shows transcriptional activity in host cells, and can be appropriately selected according to the type of host. Promo that can be used in E. coli-in the evening l a c
  • Trp or t ac promoter etc.
  • Escherichia coli as a host, incorporate the gene of interest into an appropriate brass medium
  • the method of transformation is simple.
  • the plasmid used is ⁇ T rc Examples include expression plasmids such as 9 9 A (manufactured by GE Healthcare Biosciences) and p CDF—lb (manufactured by Yukara Bio), but are not limited thereto, and those skilled in the art can obtain any general E. coli vector.
  • the vector obtained can be used.
  • a T7 RNA polymerase gene to be produced may have a sequence useful for enzyme purification.
  • a gene can be prepared such that a signal peptide is used to make an extracellular secretory enzyme, or a tag sequence containing a histidine hexamer is added to the terminal as a signal peptide.
  • the type of signal peptide and the method for binding the signal peptide to the present enzyme are not limited to the above methods, and any signal peptide available to those skilled in the art can be used.
  • the prepared transformant can be obtained by culturing in an appropriate nutrient medium under conditions that allow expression of the introduced DNA construct.
  • isolation and purification methods commonly used for proteins may be used.
  • the enzyme of the present invention when expressed in cells, the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an appropriate aqueous buffer, and then treated with lysozyme or an ultrasonic breaker or the like. Crush to obtain a cell-free extract.
  • the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract is purified by conventional protein isolation and purification methods.
  • solvent extraction method salting out method using ammonium sulfate, desalting method, precipitation method using organic solvent, anion using resin such as Jetylaminoethyl (DEAE) Toyopearl (trade name) (manufactured by Tosoichi) Exchange chromatography method, hydrophobic chromatography method using resin such as Petit Yopal and Phenyl Toyopearl (trade name) (manufactured by Tosohichi), gel filtration method using molecular sieve, affinity chromatography method, Single or combined methods such as chromatophoresis and electrophoresis such as isoelectric focusing It can be used together to obtain a purified sample. Further, a method of purifying by a corresponding method using a signal peptide is simple, and for example, it can be easily purified by using a histidine hexamer sequence and a nickel column.
  • solvent extraction method salting out method using ammonium sulfate, desalting method, precipitation method
  • the T 7 RNA polymerase mutant of the present invention can be obtained by, for example, chemical synthesis.
  • the enzyme of the present invention described above can be used in various applications as a conventionally known T 7 RNA polymerase. That is, the enzyme of the present invention can be used as an RNA polymerase for synthesizing RNA. Specifically, single-stranded RNA can be synthesized using liponucleotides (ATP, CTP, GTP, UTP) as a substrate and a double-stranded DNA having a specific sequence in a saddle shape. .
  • liponucleotides ATP, CTP, GTP, UTP
  • RNA polymerase of the present invention can also be used in an isothermal nucleic acid amplification reaction that amplifies a target RNA containing a specific RNA sequence by concerted action with a reverse transcriptase.
  • isothermal nucleic acid amplification reaction examples include the T RC method (Patent Document 3 and Non-Patent Document 1), the NASBA method, the TMA method, and the like.
  • the T 7 RNA polymerase mutant of the present invention has improved thermostability and Z or specific activity compared to wild-type T 7 RNA polymerase. Therefore, it can be stored easily compared to the wild type and can be stored for a long time. Therefore, it is possible to provide a reagent that is easy to use and can be used for a long time.
  • the T7 RNA polymerase mutant of the present invention can be used under higher temperature conditions than the wild type, it is possible to improve the experimental conditions in transcription reactions and isothermal nucleic acid amplification reactions. It can be used in a wider temperature range than the wild type regardless of whether it is in vivo.
  • isothermal nucleic acid amplification reaction using TRC method wild type T 7 R When NA polymerase was used, the activity of the enzyme decreased when it was 46 or more. Therefore, it was necessary to carry out the nucleic acid amplification reaction under a relatively low temperature condition of 40 ° C. to 45 ° C.
  • RNA is likely to have a complex higher order structure, which has made it difficult to design a primer for highly sensitive detection.
  • the T7 RNA polymerase mutant of the present invention has improved stability and specific activity as compared with the wild type under a temperature condition of 46 ° C or higher. Therefore, the nucleic acid amplification reaction by the TRC method can be carried out at a temperature of 46 ° C. or higher, and a nucleic acid amplification reagent with a detection time shorter than before can be provided.
  • it becomes difficult for RNA to have a complex high-order structure so it is easy to design primers that detect with higher sensitivity.
  • a nucleic acid amplification reagent for detecting with higher sensitivity than before can also be provided by performing a nucleic acid amplification reaction by TRC method at a temperature of 46 ° C or higher using the T 7 RNA polymerase mutant of the present invention. can do.
  • T 7 RNA polymerase gene Cloning of the T 7 RNA polymerase gene was performed according to the following method.
  • the T7 RNA polymerase gene is divided into the first half and the second half using the following reagent composition and reaction conditions. Amplified using the method.
  • the synthetic DNA primer is used for primer FF (SEQ ID NO: 1) and for amplification of the first half.
  • Primer FR SEQ ID NO: 2
  • primer RF SEQ ID NO: 3
  • primer RR SEQ ID NO: 4
  • the first half of the PCR product was digested with restriction enzymes B sp HI and Hind III (manufactured by Yubara Bio) and the restriction enzymes NcoI (manufactured by Yubara Bio) and Hind III P T rc 9 9 A vector (manufactured by GE Healthcare Bioscience) that had been digested with B was reacted with T 4 ligase at 4 ° C for 30 minutes.
  • a DNA fragment containing the T7 RNA polymerase gene was amplified by PCR using the pTrc9 9A-T7RNApo1 (Fig. 1) prepared in Example 1 as a cage, and pCDF2 plasmid was amplified. ( Figure 2).
  • a PCR reaction was carried out using pTrc999A-T7RNApoI (Fig. 1) as a saddle type plasmid under the following reagent composition and reaction conditions.
  • pCDF2—T7 RNA P (Fig. 3) was used as a vertical plasmid, and the first PCR reaction was carried out under the following reagent composition and reaction conditions.
  • the synthetic primer is a combination of primer HisF (SEQ ID NO: 9) and primer pCDFR (SEQ ID NO: 10), or primer HisR (SEQ ID NO: 11) and primer pCDFF (SEQ ID NO: 12). A combination of was used.
  • the transformed solution was LBG / C rb agar medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 0.5% glucose, 1% agar, 50 g / It was applied to mL carpenicillin (pH 7.4) and incubated at 37 ° C overnight.
  • the plasmid was extracted from the generated colony by a conventional method to obtain pCDF 2 — T 7 R NA PH is plasmid.
  • Figure 4 shows the restriction enzyme map of p CDF 2 — T 7 R NA PH is. Furthermore, by determining the nucleotide sequence using the method shown in Example 6, it was confirmed that an unintended mutation was not introduced and that a histidine hexamer was introduced.
  • the mutation was introduced into the T 7 RNA polymerase gene of the PCDF 2 —T 7 RNA PHis plasmid (FIG. 4) prepared in Example 2 by the following procedure.
  • Fig. 2 was reacted for 30 minutes at 4 using T 4 ligase, and the DNA solution after the reaction was used as a T 7 RNA polymerase gene mutant library.
  • the G FP gene was synthesized as d s D N A on the basis of the base sequence information (Gen B ank A c ce s s s i Num ber A F 1 8 3 3 9 5).
  • the synthesized GFP gene was designed to have a T7 promoter and a cloning restriction enzyme site SphI (manufactured by Yukara Bio).
  • the synthesized GFP gene is digested with the restriction enzyme Sph I at 37 ° C for 3 hours, electrophoresed with 1.0% agarose, and then stained with ethidium bromide. It was purified by cutting out the band. This was digested and purified in the same manner, and reacted at 4 ° C for 30 minutes using pSTV 28 vector (manufactured by Yukara Bio) and T 4 ligase.
  • the obtained pSTVGFP (FIG. 5) was transformed into E. coli JM1009 strain together with the T7 RNA polymerase gene mutant library prepared in Example 3. After culturing this bacterial solution in 37 ° C S ° C medium for 1.5 hours, one clone of each strain that was observed to be fluorescent with FACA ria cell saw Yuichi (manufactured by BD Japan) was collected at 37 ° C. 2 XY T GZ 1 "13 Medium (1.6% Bact Tryptone, 1% Bacterial Yeast Ex, 0.5% NaCl, 0.5% Glucose, 50 g ZmL Carpenicillin (pH 7.4) Each of the strains grown in)) was designated as a mutant candidate strain.
  • Example 5 Screening of high-temperature T 7 RNA polymerase Mutant screening was performed using 96-well titer plates so that mutants could be evaluated efficiently.
  • Example 4 (1) 20 mL of LBG / C rb medium (1% polypeptone, 0.5% yeast exoxide, 1% NaC1, 0.5% Glucose, 50 ⁇ g / mL carpenicillin (pH 7.4)) was added, and the GFP positive colony obtained in Example 4 was inoculated, and rotated at 37 ° C for 60 ° rotation. Incubated at / min
  • the protein concentration and transcription activity were measured in the same manner as in Example 7, and the specific activity, which is the amount of transcript per protein, was determined.
  • the measurement conditions for transcription activity were set to reaction temperature 46 ° (: reaction time 60 min, T 7 RNA polymerase amount 0.5 L, and RNA quantification was Q ua nt—IT RNA assembly kit (trade name) (manufactured by Impitrogen) was used.
  • About 60 strains were screened from about 400 strains, which were about twice as high as the wild type specific activity.
  • Mutant candidate strains selected in Example 5 were 37 LB GZ C rb liquid media (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaC1, 0 ⁇ 5% glucose, 50 / After overnight culture with m L carbenicillin (PH 7.4), the plasmid was extracted by a conventional method. The base sequence of the T7 RNA polymerase gene contained in the extracted plasmid was determined by the following method.
  • the base sequence determination sample prepared in (1) was purified by the method shown below using a Centri-Sep spin column (trade name) (manufactured by ABI).
  • the DNA sequencing sample prepared in (2) was treated at 95 ° C for 2 minutes, cooled rapidly on ice, and then ABIPRISM 3 10 1 DNAA nalyzer (trade name) (manufactured by Applied Biosystems) The base sequence was determined by analyzing the above. 3 ⁇ 4.
  • the synthetic DNA primer used to determine the base sequence is the primer pT r c F s (SEQ ID NO:
  • Strain 10 contained mutations that resulted in amino acid changes. One of them is the wild type T 7 RNA polymerase nucleotide sequence (SEQ ID NO: 5
  • the T7RNA polymerase having this mutation is designated as a Q786L mutant, and the gene sequence is shown in SEQ ID NO: 33 and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 34.
  • T 7 R NA Polymerase P-Zhou was made according to the following procedure: o
  • LBG / Crb liquid medium 1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaC1, 0.5% dalcose, 50 ml carbenicillin (PH 7 • 4) Inoculate 3 mL of the transformant Daricellollus lucidum obtained in Example 5 in an 18 mL test tube.
  • the cells were centrifuged at 4 ° C. at 400 rpm for 15 minutes to collect the cells. If the cells were not disrupted immediately, they were stored at 130.
  • the collected cells were washed once with 20 mL of 20 mM potassium phosphate buffer (PH 7.0), resuspended in 20 mL of the same buffer solution, and the cells were destroyed.
  • the microbial cell disruption was processed for about 5 minutes at 5 ° C with an output of about 1550 W using an ultrasonic generator (Insone Ichiban 20 M (trade name), manufactured by Kubota Corporation).
  • Enzymatic purification was performed by the following method by affinity purification using a histidine hexomer tag added to T7 RNA polymerase.
  • Nickel was bound to the chelating resin with 5 mL of 5 O mM nickel sulfate aqueous solution on the washed nickel-killed resin, and 3 mL of buffer A (20 mM Tris-HC 1 Washed with buffer (pH 8.0), 500 mM sodium chloride, 20 mM imidazole. Add the enzyme extract above, wash with 6 mL of Buffer A, then add 1 mL of Buffer B (20 mM Tris — HC 1 Buffer (pH 8.0), 500 mM Sodium, 1 5 0 m imidazole The active fraction was recovered.
  • the collected fraction was subjected to 20 mM phosphoric acid containing 5 mM dithiothreitol and 0.1 mM EDTA using a desalting column (PD-10 (trade name), manufactured by GE Healthcare Bioscience). It was replaced with potassium buffer (PH 7.0), and an equal amount of glycerol was added.
  • the concentration of the purified T7 RNA polymerase was determined by protein assembly kit (Bio-Rad) using bovine serum albumin as a control protein. In addition, the purity of the enzyme was analyzed by 7.5% concentration of SDS-PAGE, and it was confirmed to be almost single.
  • the D-type DNA has a T 7 promoter sequence that is specifically recognized by the T 7 R N A polymerase.
  • N ase inhibitor 0, 4 mM M N T P s (AT P, C T P, G T
  • Plasmids were prepared from each of the K 1 79 9 E mutant and the Q 7 86 L mutant using the mini-prep method.
  • a plasmid prepared from the Q 7 86 L mutant was used as a cage, and the primer T 7 F 2 (SEQ ID NO: 19) and primer pT rc R s (SEQ ID NO: 16) were synthesized as synthetic primers.
  • the PCR reaction and purification were performed under the same conditions as (1) to (2) except that the combination was used.
  • PCR reaction was further performed to prepare a double mutant gene.
  • the reagent composition, reaction conditions, and purification procedure in the PCR reaction were determined by combining primer pT rc F s (SEQ ID NO: 15) and primer p T rc R s (SEQ ID NO: 16) as a synthetic DNA primer.
  • the conditions are the same as (1) to (2) except that is used.
  • the thermal stability of the mutant T 7 RNA polymerase was measured as follows. (1) From the results of the nucleotide sequence analysis of the mutant screened in Example 5 (Example 6), the activity of 1 79th amino acid, which was more active than the wild type at high temperature, was changed from lysine to glutamic acid. Substitution mutant (K 1 7 9 E), mutation (Q 7 8 6 L) in which the 6th amino acid was replaced from glutamine to leucine (Q 7 8 6 L) and double mutant (K 1 7 9 A purified enzyme was prepared according to the method described in Example 7. The protein concentration and transcription activity of the purified enzyme were measured according to the method shown in Example 7.
  • RNA produced was analyzed by electrophoresis with 1% agarose.
  • the activity of the mutant T 7 RNA polymerase at each reaction temperature is as follows: Was measured as follows.
  • Example 6 Based on the results of the nucleotide sequence analysis of the mutant screened in Example 5 (Example 6), the mutation in which the 1st to 9th amino acid, which had higher activity than the wild type in the high temperature range, was substituted from lysine to glutamic acid. (K 1 7 9 E), a mutant in which the amino acid 7 8 6 is replaced by glutamine to leucine (Q 7 8 6 L), and a double mutant that combines the two mutations (K 1 7 9 E + A purified enzyme was prepared according to the method described in Example 7. The protein concentration and transcription activity of the purified enzyme were measured according to the method shown in Example 7.
  • T 7 RNA polymerase The activity of T 7 RNA polymerase was reacted for 10 minutes at an enzyme amount of T 7 RNA polymerase of 10; g / mL and a reaction temperature in the range of 43 to 50 ° C. Measured.
  • RNA produced was determined using Quaunt — ITRNA Atskit (trade name) (manufactured by Invitrogen).
  • the measured RNA concentration is shown in FIG.
  • the mutant K 1 7 9 £ has a higher specific activity than the wild type in the range of 4 2. 9 ° C to 4 6. 8 ° C, which suggests that at least the mutation of K 1 7 9 E It can be seen that the specific activity of T 7 RNA polymerase introduced with is improved compared to the wild type.
  • the specific activity of the mutant (3 ⁇ 4 7 86 or 4 4.7 to 4 7.9 ° C was higher than that of the wild type, but this is more stable than the result of Example 9.
  • the double mutant (K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L) is from 4 2. 9 ° C to 4 7. 9 than the wild type in the temperature range of C.
  • T 7 RNA polymerase introduced with at least K 1 79 E and Q 7 86 L mutations has improved thermal stability and specific activity compared to the wild type.
  • Example 1 1 Preparation of mutant T7 RNA polymerase gene (Part 1) Preparation of a gene encoding T 7 RNA polymerase in which the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of wild-type T 7 RNA polymerase was replaced with another amino acid from the 179th lysine was as follows. Done
  • the first PCR reaction was carried out using pCDF2-T7RNAPHIs (Fig. 4) as a saddle type plasmid with the following reagent composition and reaction conditions.
  • a synthetic DNA primer for amplifying the 5 'end of the T7 polymerase gene a combination of primer pCDFF (SEQ ID NO: 1 2) and primer 1 7 9 MIXR (SEQ ID NO: 3 9) was used.
  • a synthetic primer for amplifying the 3 ′ end a combination of primer 1 79 9 MIXF (SEQ ID NO: 3 7) and primer p CDFR 2 (SEQ ID NO: 3 8) was used.
  • Primer pCDFF (SEQ ID NO: 1 2) and primer pCDFR2 (SEQ ID NO: 3 8) were synthesized using the two types of PCR products obtained (5, end and 3 'end) in a saddle shape. Using it as a DNA primer, a second PCR reaction was performed. The reagent composition and reaction conditions in the PCR reaction were the same as in (1) except for the synthetic DNA primer and cage type, and the amplified product was electrophoresed on an agarose gel as in (2), extracted, Purified.
  • the library prepared in (4) was transformed into Escherichia coli JM1009 strain and cultured at 37 ° C in LBG / Crb medium (1.0% bacter tryptone, 0.5% pact yeast. From each library, 90 colonies that had grown with the extract, 0.5% NaCl, 0.5% glucose, 50 g / mL carpenicillin (pH 7.4)) were selected.
  • (6) In the same manner as in Example 6, except that the selected strain was extracted with a conventional method and pCDFF (SEQ ID NO: 12) was used as a synthetic DNA primer for base sequencing. By making a determination, the mutation of the base sequence was confirmed.
  • the first PCR reaction was carried out with the following reagent composition and reaction conditions using PCFDF2-T7RNAPHIs (FIG. 4) as a saddle type plasmid.
  • a synthetic DNA primer for amplifying the 5 'end of the T7 polymerase gene a combination of primer Pc DFF 4 (SEQ ID NO: 4 2) and primer 7 8 6 MIXR (SEQ ID NO: 4 1)
  • a synthetic primer for amplifying the 3 ′ terminal side a combination of primer 7 86 MIXF (SEQ ID NO: 40) and primer PCDFR (SEQ ID NO: 10) was used.
  • Base sequence determination was performed in the same manner as in Example 6 except that 4 (SEQ ID NO: 42) was used as a synthetic sequence D for DNA sequencing, and the nucleotide sequence mutation was confirmed.
  • T 7 RNA polymerase and measurement of transcription activity were carried out according to the method of Example 7 from the mutant T 7 RNA polymerase gene prepared in Examples 11 and 12. The results are shown in FIG. 8 (T 7 RNA polymerase in which 1 7 9th lysine is substituted with another amino acid) and 9 (T 7 RNA polymerase in which 7 6 6th glutamine is substituted with another amino acid).
  • Tyrosine-substituted (Q 7 86 6 Y) mutants have better heat resistance and Z or specific activity than wild type, especially methionine
  • the thermal stability of the mutant T 7 RNA polymerase prepared in Example 13 was measured by the following method.
  • Table 1 shows the results of determining the half-lives of various mutant T7 RNA polymerases and wild type from the slope of the graph in FIG. Table 1 shows that various mutant T 7 RNA polymerases have a longer half-life than the wild type and are excellent in thermal stability at 48 ° C. In particular, the thermal stability of (37 8 6 and ⁇ 37 8 6 ⁇ mutant type 7 RNA polymerase is high. Table 1
  • a plasmid vector comprising (K 1 79 E + Q 7 86 L) mutant gene sequence (SEQ ID NO: 3 5) prepared in Example 8 and a histidine hexamer sequence at the 5 ′ end of the sequence.
  • 1 p CDF 2 1 T 7 R NA PH is (K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L) I entered.
  • APH is plasmid (Fig. 4) was reacted with T 4 ligase at 4 ° C for 30 minutes, and the DNA solution after the reaction was treated with T 7 RNA polymerase gene. A mutant library was used.
  • the prepared T7 RNA polymerase gene variant library was transformed into Escherichia coli JM1009 strain containing the plasmid pSTVGVGFP (Fig. 5) prepared in Example 4, and the transformant After incubation for 1 hour in 37 ° C SOC medium, LBG / C rb ZC m agar medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 0.5% glucose, 50% g / ml L-carpenicillin, 30 g / ml L chloramphenicol, 1.5% agar) and GFP fluorescence were used as candidate mutant strains.
  • a portion of the prepared library was transformed into E. coli strain JM1009 according to a conventional method using a portion of the library, the plasmid was purified, and the nucleotide sequence was determined by the method shown in Example 6 to determine the nucleotide sequence. The effect of was confirmed.
  • Example 15 Screening of the mutant strains obtained in Example 15 was performed by the same method as in Example 5. As a result of screening, about 4 00 0 mutant strains were prepared in Example 8 (K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L). 3 strains with specific activity approximately 2 times higher than mutant T 7 RNA polymerase Four strains were obtained and used as the primary candidate strain. Furthermore, the primary candidate strain was rescreened in the same manner as in Example 5, and finally the specific activity was more than twice as high as that of the (K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L) mutant T 7 RNA polymerase. One strain was selected.
  • Example 16 The strain selected in Example 16 was confirmed by the method described in Example 6 and the nucleotide sequence was confirmed to confirm the mutation site. As a result, nucleotide sequence 2 0 5 4th thymine is replaced with cytosine, GTG codon is replaced with GCG codon and amino acid sequence 6 8 5th valine is changed to alanine. I found it different.
  • the T 7 RNA polymerase having this mutation is a (K 1 79 E + Q 7 86 L + V 6 85 A) mutant, the gene sequence of which is SEQ ID NO: 4 3 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 Shown in 4.
  • Example 1 8 (K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) Production of Mutant T 7 RNA Polymerase
  • Example 1 E. coli JM 10 having triple mutant T 7 RNA polymerase having histidine hexamer sequence obtained in Example 6 (K 1 79 9 E + Q 7 86 L + V 6 85 A) Nine strains were used to prepare the enzyme according to the following procedure.
  • LB GZC rb liquid medium 1% Pepper, 0.5% yeast extract, 1% Na C 1 0.5% Glucose, o 0 ag / ml L Carpenicillin (pH 7.4)
  • the mixture was centrifuged at 4 ° C. for 15 minutes and at 70,000 rotation Z minutes to obtain 21 g of wet cells.
  • the cells should be washed with 100 mL of 20 mM phosphate phosphate buffer (PH 7.0) and not immediately treated the next time. If stored at 30 ° C.
  • the protein concentration of the purified T 7 RNA polymerase was determined from the absorbance at 28 O nm.
  • the purity of the enzyme protein was analyzed by SDS-PAGE at a concentration of 5 to 20%, and it was confirmed that the protein was almost a single protein.
  • Example 7 The in vitro transcription reaction shown in Example 7 for the activity evaluation of the triple mutant T 7 RNA polymerase produced in (K 1 7 9 E + Q 7 86 L + V 6 85 A) This was done by measuring the amount of RNA produced by the above method.
  • the transcription reaction temperature was set in the range of 43 to 50, the amount of T7 RNA polymerase enzyme was 10 ng /// L, and the reaction time was 30 minutes.
  • As a control prepared in Example 8 (K 1 79 E + Q 78 6 L) double mutant T 7 RNA polymerase and wild type T 7 RNA polymerase was used.
  • RNA produced at each temperature is shown in Fig. 11.
  • Example 1 8 (K 1 79 E + Q 7 86 L + V 6 85 A) Triple mutant T 7 RNA polymerase prepared in Example 8 (K 1 79 E + Q 7 8 6 L) Double mutant T 7 RNA polymerase and wild-type T 7 RNA polymerase were prepared to 100 g ZmL using the buffer composition shown below. 2111 ⁇ After dispensing 25 L into the tube, heat treatment was performed at 48 ° C for 1, 2, 5, 10, and 20 minutes.
  • the plasmid prepared in (4) introduction of the target mutation was confirmed by the nucleotide sequence determination method shown in Example 6.
  • the plasmid gene sequence is shown in SEQ ID NO: 45, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 46.
  • the Escherichia coli JM 10 9 strain expressing the double mutant T 7 RNA polymerase was prepared by the following method (Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) A mutant T 7 RNA polymerase was prepared.
  • Example 2 Nucleic Acid Amplification Reaction with Mutant T 7 R N A Polymerase (Q 7 8 6 L + M 6 8 5 A) Double Mutant T Prepared in Example 2 2
  • the salmonella toxin gene (stn RNA) is targeted as the target RNA by the following method.
  • Stn RNA positive standard (concentration: 10 6 copies / 5 ⁇ L) attached to Salmonella stn mRNA detection reagent (TRCR teststn -m (trade name), manufactured by Tosoh Corporation) It was diluted to 10 4 copies / 5 L with mM Tris-HC 1 buffer ( ⁇ 8.0), 1 mM EDTA 0.5 LRNase Inhibitor, 5 mM dithiothreitol. Only the diluted RNA was used in the control test group (negative).
  • reaction solution 20 having the following composition was dispensed into a 0.5 mL PCR tube, and the above RNA sample 5 jt L was added thereto.
  • reaction solution of (2) is 5 at 49 ° C, 50 ° C, and 51 ° C for the mutants, and 43 ° C and 49 ° C for the wild type. After incubating for 5 minutes, 511 L of an enzyme solution having the following composition, which was kept warm for 2 minutes at each temperature, was added.
  • composition of enzyme solution (Concentration at the final reaction volume of 30 X L or sorbyl)
  • Figure 13 shows the change over time in the fluorescence intensity ratio of the reaction solution (the value obtained by dividing the fluorescence intensity value at a given time by the background fluorescence intensity value) with the time at which the enzyme was added as 0 minutes.
  • the measurement method consists of a reaction temperature of 50 ° C (double mutant) or 4 3 ° C (wild type), and target RNA concentration of 10 0, 50 0, 100 0, 3 0 0, 5 0
  • the procedure was the same as in Example 23, except that the copy was changed to 0, 100,000 and Z 5 L.
  • Table 3 shows the detection rates of (Q 7 86 L + V 6 85 A) double mutant T 7 RNA polymerase and wild type T 7 RNA polymerase at each initial RNA copy number. From Table 3 (Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) The detection rate of stn RNA when the double mutant is used is higher than the detection rate of wild type 43 ° C, and the detection rate is 80%. When compared with the minimum RNA concentration shown above, the wild type has 100 copies / 5 L, whereas the (Q 7 86 L + V 6 85 A) double mutant has 200 copies Z 5 It was When compared at the optimum temperature conditions for both enzymes, it is clear that the (Q 7 86 L + V 6 85 A) mutant is about 5 times more sensitive than the wild type. Table 3
  • Example 2 Preparation of 5 V 6 85 A mutant T 7 RNA polymerase From the T 7 RNA polymerase gene of pCDF—T 7 RNA PH plasmid ( Figure 4) prepared in Example 2, the following procedure was performed. Thus, a T 7 RNA polymerase mutant (V 6 85 A mutant) in which the amino acid sequence 6 85 5th valine was mutated to alanine was prepared.
  • PCR reaction was carried out under the following reagent composition and reaction conditions using pCDF2-T7 RNA PHis (Fig. 4) as a saddle type plasmid.
  • the synthetic primer is a combination of primer V 6 85 AF (SEQ ID NO: 5 1) and primer p T rc R s (SEQ ID NO: 16), or PCDF 2 T 7 F 5 (SEQ ID NO: 52).
  • a combination of primer V 6 85 AR SEQ ID NO: 5 3) was used.
  • reaction solution was separated by 1% agarose electrophoresis, it was subjected to ethimubu mouth-mide staining, and purified by cutting out the band of the target product from the stained gel.
  • PCR reaction was further carried out to produce a V 685 A mutant gene.
  • the reagent composition, reaction conditions, and purification procedure in the PCR reaction were as follows: primer p CDF 2 T 7 F 5 (SEQ ID NO: 5 2) and primer p T rc R s (SEQ ID NO: 16) as synthetic DNA primers.
  • the conditions are the same as in (1) to (2) except that a combination of
  • the reaction solution of (4) was transformed into Escherichia coli JM1009 strain, and LB GZCrb agar medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 0.5% glucose) , 1.5% agar, 50 II g / mL carpenicillin (pH 7.4), selected at 37 ° C-colonies grown after sputum culture at V 6 85 A mutant It was. Furthermore, the introduction of mutation of the V 6 85 A mutant was confirmed by the nucleotide sequence determination method shown in Example 6. The gene sequence is shown in SEQ ID NO: 54, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 55.
  • Example 25 Using the Escherichia coli JM1009 strain expressing the V 6 85 A mutant T 7 RNA polymerase produced in Example 25, the method described in Example 7 was used to obtain the V 6 85 A mutant. T 7 RNA polymerase preparation and activity evaluation I did it.
  • the transcription reaction temperature is set in the range of 4 3 to 4 9 ° C, and the enzyme amount of T 7 RNA polymerase is 20 ng. L, reaction time was 30 minutes.
  • wild type T 7 RNA polymerase was used as a control.
  • Fig. 14 shows the amount of RNA produced at each temperature.
  • Figure 14 shows that the V 6 85 A mutant T 7 RNA polymerase has higher production of RNA at a reaction temperature of 45 ° C or higher than the wild type, and has improved specific activity at high temperatures.
  • Example 26 Using the V 6 85 A mutant T 7 RNA polymerase prepared in Example 26, the heat of the V 6 85 A mutant T 7 RNA polymerase as described in Example 20. Stability was evaluated. The heat treatment temperature was set at 46 ° C, and the treatment time was 1 minute, 2 minutes, and 5 minutes. As a control, wild type T 7 RNA polymerase was used.
  • FIG. Table 4 shows the results of determining the half-lives of the V 6 85 A mutant T 7 RNA polymerase and the wild type from the slope of the graph in FIG. From Table 4, it can be seen that the V 6 85 A mutant has a longer half-life than the wild type and is superior in thermal stability at 46 ° C. Table 4
  • T 7 RNA NA is plasmid (Fig. 4) inserted with the V 6 85
  • a mutant T 7 RNA polymerase gene prepared in Example 25 the following method was used.
  • a double mutant T 7 RNA polymerase was prepared in which the amino acid sequence 7 8 6th glutamine was mutated to methionine (V 6 85 A + Q 7 86 M).
  • a PCR reaction was carried out with the following composition of reagents and reaction conditions using the pCDF2—T7RNAPHis of the V6885A mutant as a saddle type plasmid.
  • the synthetic primer is a combination of primer Q 7 86 MF (SEQ ID NO: 5 6) and primer p T rc R s (SEQ ID NO: 16), or PCDF 2 T 7 F 5 (SEQ ID NO: 52) ) And primer Q 7 8 6 MR (SEQ ID NO: 5 7).
  • Use thermal cycler manufactured by Perkin-E 1 mer, heated at 96 ° C for 30 seconds, then 96 ° C ⁇ 30 seconds, 50 ° C ⁇ 30 seconds, 7 2 ° C ⁇ The temperature cycle of 1 minute was repeated 30 times.
  • PCR reaction was further carried out to produce a (V 6 85 A + Q 7 86) mutant gene.
  • the reagent composition, reaction conditions, and purification procedure in the PCR reaction were as follows: primer p CDF 2 T 7 F 5 (SEQ ID NO: 5 2) and primer p T rc R s (SEQ ID NO: 16) as synthetic DNA primers.
  • the conditions are the same as (1) to (2) except that the combination of) is used.
  • the reaction solution of (4) was transformed into E. coli strain JM1009, and LBG / Crb agar medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 0.5% Select colonies grown on glucose, 1.5% agar, 50 ag / mL carpenicillin (pH 7.4) and grow overnight at 37 ° C (V 6 8 5 A + Q 7 8 6 M) Mutant. Furthermore, the introduction of the mutation of the (V 6 85 A + Q 7 86 M) mutant was confirmed by the nucleotide sequence determination method shown in Example 6. The gene sequence is shown in SEQ ID NO: 58 and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 59.
  • Example 7 Using the E. coli strain JM1 0 9 expressing the mutant T 7 RNA polymerase prepared in Example 28 (V 6 85 A + Q 7 86 M), the method described in Example 7 ( V 6 85 A + Q 7 86 M) A mutant T 7 RNA polymerase was prepared and evaluated for activity.
  • the transcription reaction temperature was set in the range of 43 to 50, the amount of T7 RNA polymerase was 20 ng ZL, and the reaction time was 30 minutes.
  • wild type T 7 RNA polymerase was used as a control.
  • RNA produced at each temperature is shown in FIG. From Fig. 6 (V 6 85 A + Q 7 8 6 M) It can be seen that it has improved.

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Abstract

配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち少なくとも、７８６番目のグルタミン、１７９番目のリジン及び６８５番目のバリンからなる群から選ばれる少なくとも１つに相当するアミノ酸残基が、他のアミノ酸に置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して、熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。

Description

明 細 書 機能改善した R NAポリメラーゼ変異体 技術分野
本発明は野生型 RNAポリメラ一ゼのァミノ配列の一部に変異を 導入することで、 改善された機能を持つ R NAポリメラ一ゼ、 特に 熱安定性及び Zまたは比活性が向上した R NAポリメラ一ゼ、 当該 RNAポリメラ一ゼをコードする遺伝子、 当該 R N Aポリメラーゼ の生産方法、 及び当該 RNAポリ メラ一ゼによる RN Aの製造方法 に関する。 背景技術 ·
本発明は、 高温条件下で野生型よりも安定性及び/または比活性 が向上した、 バクテリオファージから得られる変異型 R N Aポリメ ラーゼ、 特に T 7 R NAポリメラ一ゼに関する。 大腸菌に感染し得 るバクテリオファージとして、 T 3、 T 7、 φ I 、 φ I I 、 W 3 1 、 H、 Y、 A l、 c r o C 2 1、 C 2 2、 及び C 2 3がある力 s、、 そ のうち T 7 ファージによってコードされる R NAボリメラ一ゼが T 7 R NAポリメラ一ゼである。
T 7 RN Aポリメラーゼの特徴として、 まず、 プロモー夕一配列 に対する高い選択性がある。 T 7 R N Aポリメラ一ゼは、 自身の特 異なプロモーター配列には結合するが、 それ以外のプロモーター配 列とは他のバクテリオファージのプロモーター配列であっても結合 しない。 この高い選択性により、 R N Aポリメラーゼの転写反応が 、 宿主のゲノムに対してではなく、 自身のゲノムに対して確実に向 けられる。 次に、 T 7 R NAポリメラーゼは他のポリメラーゼと違い、 補助 因子を必要とせずに、 プロモーターを認識し、 転写を開始、 R NA 転写物を伸長させ、 転写を終結させるといった一連の性能を有して おり、 転写速度も大腸菌の R NAポリメラ一ゼと比較して 5倍早く R N Aを伸長させることができる。
さらに、 分子量が 9 8. 6 k D a , 8 8 3アミノ酸の単鎖タンパ ク質であることから、 酵素の安易な大量製造が可能である。
以上に述べた有利な点を持つ T 7 R N Aポリメラ一ゼは、 各種分 野で積極的に用いられており、 例えば、 インヴィ トロ転写や大腸菌 における高発現系 （米国特許第 4 9 5 2 4 9 6号公報 ： 特許文献 1 ) 、 無細胞タンパク合成系、 塩基配列決定法 （特開平 1 1 一 1 8 7 9 9号公報 ： 特許文献 2 ) 、 等温核酸増幅法の中で利用されている 。 等温核酸増幅法の 1つである T R C法 （特開 2 0 0 0— 1 4 4 0 0号公報 ： 特許文献 3及び I s h i g u r o T . e t a 1 . , A n a 1 y t i c a 1 B i o c h e m i s t r y , 3 1 4 , 7 7 - 8 6 ( 2 0 0 3 ) ： 非特許文献 1 ) について詳細に説明する。
T R C法は D NA依存性 RNAポリメラ一ゼと逆転写酵素との協 奏的作用によって特定の R NA配列を含む標的 RNAを増幅する方 法である。 即ち、 標的となる RNAに対し T 7プロモ一夕一配列を 含むプライマーと逆転写酵素及びリポヌクレア一ゼ Hによりプロモ —夕一配列を含む 2本鎖 DNAを合成し、 T 7 R NAポリメラ一ゼ により特定 R NA配列から成る RNAを合成する。 以降生成した R NAを前記プロモ一夕一配列を含む 2本鎖 D NA合成の铸型とし、 上記の反応を連鎖的に行なうものである。 T R C法による核酸増幅 法は P C R法で増幅する場合と異なり、 一定の温度で反応すること が可能であるため、 複雑な温度コントロールが必要としない長所が ある。 しかしながら、 野生型 T 7 R NAポリメラーゼを使用して T R C法を用いた核酸増幅を行なうと、 4 6 °C以上の条件では T 7 R N Aポリメラーゼの活性低下により核酸増幅効率の低下が見られた 。 そのため、 現状 T R C法での核酸増幅は一般に 4 0 °Cから 4 5 °C といった比較的低温条件下で行なわれている。 低温条件下では R N Aが複雑な高次構造をとりやすく、 そのことが T R C法における高 感度に検出するプライマーの設計を困難にしてきた。 そのため、 4
6 °C以上の条件においても、 熱安定性及び Zまたは比活性の高い T
7 R N Aポリメラ一ゼが求められてきた。
変異により各種の改善された機能を持つ RNAポリメラーゼは、 T 7 R N Aポリメラーゼの活性を測定する系が確立されている （ I k e d a R . A . e t a 1 . ， B 1 o c h e m i s t r y ,
3 1 , 9 0 7 3 - 9 0 8 0 ( 1 9 9 2 ) ： 非特許文献 2及び I k e d a R . A . e t a 1 . , N u c 1 . A c i d . R e s . ,
2 0 , 2 5 1 7 - 2 5 2 4 ( 1 9 9 2 ) ： 非特許文献 3 ) ことから
、 これまでいくつか作製されている。 例えばァミノ酸置換により認 識するプロモーター配列を改変した酵素 （米国特許第 5 3 8 5 8 3
4号公報 ： 特許文献 4 ) 、 高温での比活性及び熱安定性を高めた酵 素 （特表 2 0 0 3— 5 2 5 6 2 7号公報 ： 特許文献 5 ) 、 アミノ酸 の欠失と置換により 3 ' 一デォキシリポヌクレオチ Hの取り込み能 を増強した酵素などである (特開 2 0 0 3 — 6 1 6 8 3号公報 ： 特 許文献 6 ) 。 発明の概要
本発明が解決する課題は、 野生型と比較して熱安定性及び Zまた は比活性が向上した T 7 RN Aポリメラ一ゼ変異体とその製造方法 を提供するものである。
上記課題を解決するために検討した結果、 野生型 T 7 R NAポリ メラーゼのアミノ酸を遺伝子工学的手法によって置換することで、 熱安定性または比活性が向上するアミノ酸部位を見出し、 野生株と 比較して熱安定性または比活性が向上した変異体の作成に成功した 。 さらに、 熱安定性が向上したアミノ酸部位の変異と、 比活性が向 上したアミノ酸部位の変異を組み合わせることで、 熱安定性及び比 活性が向上した変異体の作成に成功した。
R-Fし <は、 配列番号 6に示す野生型 T 7 R N Aポリメラ一ゼを構 成するァミノ酸配列のうち少なく とも、 7 8 6番目のグルタミン酸 及び Zまたは 1 7 9番目のリジンに相当するアミノ酸残基を他のァ ミノ酸に置換した T 7 R N Aポリメラーゼ変異体が、 野生型 T 7 R
N Aポリメラーゼと比較し熱安定性及び/または熱安定性が向上し ている とを見出した。
さらに 、 上記部位とは異なる部位のアミノ酸残基、 すなわち、 6
8 5番 aのバリンに相当するァミノ酸残基を他のァミノ酸に置換す ることで 、 野生型 T 7 R N Aポリメラ一ゼと比較し熱安定性及び Z または熱安定性が向上していることを見出した。
また 上記各アミノ酸残基をそれぞれ組み合わせることで、 さら に熱安定性及び/または熱安定性が向上した T 7 R N Aポリメラー ゼ変異体を得ることができた。 即ち本発明は、 以下の発明を包含する ：
( 1 ) 配列番号 6に示す野生型 T 7 R N Aポリメラ一ゼを構成する アミノ酸配列のうち少なく とも、 7 8 6番目のグルタミン、 1 7 9 番目のリジン及び 6 8 5番目のバリンからなる群から選ばれる少な く とも 1つに相当するアミノ酸残基が、 他のアミノ酸に置換され、 野生型 T 7様バクテリオファージの R N Aポリメラーゼと比較して 、 熱安定性及び/または比活性が向上していることを特徴とする T 7 R N Aポリメラ ゼ変異体
( 2 ) 配列番号 6に示す野生型 T 7 R N Aポ Uメラーゼを構成する アミノ酸配列のうち 、 少なく とも 7 8 6番目のダル夕ミンに相当す るアミノ酸残基が疎水性ァミノ酸に置換され 野生型 T 7様バクテ リオファージの R N Aポリメラ ―ゼと比較して熱安定性及び Zまた は比活性が向上していることを特徵とする T 7 R N Aポリメラーゼ 変異体
( 3 ) 配列番号 6に示す野生型 T 7 R N Aポリメラーゼを構成する アミノ酸配列のうち、 少な < とち 7 8 6番目のダル夕 ンに相当す るアミノ酸残基が口イシンまたはメチォニンに置換され 野生型 T
7様バクテリオファージの R N Aポ Uメラーゼと比較して熱安定性 及び/または比活性が向上している とを特徴とする T 7 R N Aポ リメラ一ゼ変異体。
( 4 ) 配列番号 6に示す野生型 T 7 R N Aポリメラ ゼを構成する アミノ酸配列の Όち、 さらに 少なく とも 1 7 9番巨のリジンに相 当するアミノ酸残基がダル夕 ン酸、 ァスパラギン システィンの いずれかに置換され、 野生型 T 7様バクテリオファ ジの R N Aポ リメラーゼと比較して、 熱安定性及び比活性が向上していることを 特徴とする、 （ 2 ) 又は （ 3 ) に記載の T 7 R N Aポ Uメラ―ゼ変 異体。
( 5 ) 配列番号 6に示す野生型 T 7 R N Aポリメラーゼを構成する アミノ酸配列のうち、 少なく とも 1 7 9番目のリジンに相当するァ ミノ酸残基がダルタミン酸、 ァスパラギン、 システィンのいずれか に置換され、 野生型 T 7様パクテリオファージの R N Aポリメラー ゼと比較して熱安定性及び Zまたは比活性が向上していることを特 徴とする T 7 R N Aポリメラーゼ変異体。
( 6 ) 配列番号 6に示す野生型 T 7 R N Aポリメラ一ゼを構成する アミノ酸配列のうち、 さらに、 少なく とも 6 8 5番目のバリンに相 当するアミノ酸残基が中性または弱疎水性アミノ酸に置換され、 野 生型 T 7様バクテリオファージの R NAポリメラ一ゼと比較して、 熱安定性及び比活性が向上していることを特徴とする、 （ 2 ) から ( 5 ) のいずれかの T 7 RNAポリメラーゼ変異体。
( 7 ) 配列番号 6に示す野生型 T 7 R NAポリメラ一ゼを構成する アミノ酸配列のうち、 さらに、 少なく とも 6 8 5番目のバリンに相 当するアミノ酸残基がァラニンに置換され、 野生型 T 7様バクテリ オファージの R N Aポリメラ一ゼと比較して、 熱安定性及び比活性 が向上していることを特徴とする、 （ 6 ) の T 7 R NAポリメラー ゼ変異体。
( 8 ) 配列番号 6に示す野生型 T 7 R NAポリメラーゼを構成する アミノ酸配列のうち、 少なく とも 6 8 5番目のバリンに相当するァ ミノ酸残基が中性または弱疎水性アミノ酸に置換され、 野生型 T 7 R N Aポリメラ一ゼと比較して熱安定性及び/または比活性が向上 していることを特徴とする、 T 7 RNAポリメラーゼ変異体。
( 9 ) 配列番号 6に示す野生型 T 7 R NAポリメラーゼを構成する アミノ酸配列のうち、 少なく とも 6 8 5番目のバリンに相当するァ ミノ酸残基がァラニンに置換され、 野生型 T 7 R NAポリメラーゼ と比較して熱安定性及び/または比活性が向上していることを特徴 とする、 T 7 R N Aポリメラーゼ変異体。
(10) 配列番号 6 に示す野生型 T 7 R NAポリメラーゼを構成する アミノ酸配列のうち、 6 8 5番目のバリンに相当するアミノ酸残基 が他のアミノ酸に置換され、 さらに、 1 7 9番目のリジン及び Zま たは 7 8 6番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ 酸残基に置換された T 7 RNAポリメラ一ゼ変異体。
(11) 配列番号 6に示す野生型 T 7 R NAポリメラーゼを構成する アミノ酸配列のうち、 6 8 5番目のパリンに相当するアミノ酸残基 がァラニンに置換され、 さらに、 1 7 9番目のリジンに相当するァ ミノ酸残基がグルタミン酸に置換、 及び Zまたは 7 8 6番目のダル 夕ミンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはメチォニンに置換 された T 7 R NAポリメラーゼ変異体。
(12) ( 1 ) から （11) のいずれかの T 7 R N Aポリメラ一ゼ変異 体をコードする遺伝子。
(13) ( 1 ) から （11) のいずれかの T 7 R N Aポリメラーゼ変異 体をコードする遺伝子を発現して T 7 R N Aポリメラ一ゼを生産す ることのできる細胞。
( 14) ( 1 ) から （11) のいずれかの T 7 R N Aポリメラーゼ変異 体をコードする遺伝子を発現させることによる T 7 R NAポリメラ ーゼの生産方法。
(15) ( 1 ) から （11) のいずれかの T 7 R N Aポリメラーゼ変異 体を用いて R N Aを製造する方法。
(16) ( 1 ) から （11) のいずれかの T 7 RN Aポリメラ一ゼ変異 体を用いて R NAを増幅する方法。 本発明の変異型 T 7 R NAポリメラ一ゼは、 野生型 T 7 R NAポ リメラーゼと比べて熱安定性及び Zまたは比活性が向上しているた め、 野生株と比較し、 より広い温度範囲での転写反応及び Zまたは 転写反応時間の短縮が期待できる。 図面の簡単な説明
図 1 は、 T 7 R NAポリメラーゼをクローニングしたプラスミ ド p T r c 9 9 A- T 7 R NA p o 1 の制限酵素地図を示す。
図 2は、 p C D F 2プラスミ ドの制限酵素地図を示す。 図 3は、 T 7 RNAポリメラ一ゼを生産するプラスミ ド p C D F 2— T 7 R NA Pの制限酵素地図を示す。
図 4は、 N末端にヒスチジンへキサマ一を融合した T 7 R NAポ リメラ一ゼを生産するプラスミ ド P C D F 2 — T 7 RNA P H i s の制限酵素地図を示す。
図 5は、 T 7プロモー夕一によって発現が誘導される G F P遺伝 子を持つ p S T V G F Pの制限酵素地図を示す。
図 6は、 作製した T 7 R NAポリメラーゼの野生型とその変異体 K 1 7 9 E、 Q 7 8 6 L及びニ重変異体 （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L ) それぞれの 4 7 °Cでの加熱に対する熱安定性を比較した結果 （電 気泳動写真） を示す。 なお、 図中のレーン 1は野生型の、 レーン 2 は K 1 7 9 E変異体の、 レーン 3は Q 7 8 6 L変異体の、 レーン 4 は （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L) 変異体の T 7 R NAポリメラーゼを それぞれ用いたときの結果である。
図 7は、 作製した T 7 R NAポリメラ一ゼの野生型とその変異体 K 1 7 9 E、 Q 7 8 6 L及び二重変異体 （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L ) それぞれの 4 3から 5 0 °Cでの R NA生産量を比較した結果を示 す。
図 8は、 作製した T 7 R NAポリメラ一ゼの野生型とその変異体 K 1 7 9 E、 K l 7 9 C及び K l 7 9 Nそれぞれの 4 3から 5 0 °C での RNA生産量を比較した結果を示す。
図 9は、 作製した T 7 R NAポリメラ一ゼの野生型とその変異体 Q 7 8 6 L , Q 7 8 6 M、 Q 7 8 6 F及び Q 7 8 6 Yそれぞれの 4 3から 5 0 °Cでの R NA生産量を比較した結果を示す。
図 1 0は、 野生型 T 7 R NAポリメラ一ゼ、 変異体 T 7 R NAポ リメラーゼ Q 7 8 6 L、 Q 7 8 6 M、 Q 7 8 6 F、 Q 7 8 6 Y、 K 1 7 9 E、 K l 7 9 C及び K l 7 9 Nそれぞれの 4 7 °Cでの加熱に 対する熱安定性を比較した結果を示す。
図 1 1は、 野生型 T 7 RNAポリメラ一ゼ、 （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L ) 二重変異体、 及び （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A ) 三重変異体、 それぞれの 4 3から 5 0 °Cでの R N A生産量を比較 した結果を示す。
図 1 2は、 野生型 T 7 R NAポリメラ一ゼ、 （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L ) 二重変異体、 及び （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A ) 三重変異体、 それぞれの 4 8 °Cでの加熱に対する熱安定性を比較 した結果を示す。
図 1 3は、 サルモネラ s t n R NAを標的に、 野生型 T 7 R N Aポリメラーゼ及び （Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 二重変異体を用い て、 T R C法による等温核酸増幅反応を行なった結果を示す。
図 1 4は、 野生型 T 7 R NAポリメラーゼ、 及び V 6 8 5 A変異 体、 それぞれの 4 3から 4 9 °Cでの R NA生産量を比較した結果を 示す。
図 1 5は、 野生型 T 7 R NAポリメラ一ゼ、 及び V 6 8 5 A変異 体、 それぞれの 4 6 °Cでの加熱に対する熱安定性を比較した結果を 示す。
図 1 6は、 野生型 T 7 R NAポリメラ一ゼ、 V 6 8 5 A変異体、 及び （V 6 8 5 A + Q 7 8 6 M) 二重変異体、 それぞれの 4 3。じか ら 5 0 °Cでの RNA生産量を比較した結果を示す。 発明を実施するための形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
第一の観点において、 本発明で開示する、 熱安定性及び/または 比活性が向上した T 7 R N Aポリメラーゼは、 配列番号 6に示す野 生型の T 7 R NAポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、 少 なく とも 7 8 6番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基を他のァ ミノ酸に置換したものであり、 好ましくは置換したアミノ酸が疎水 性アミノ酸 （ロイシン、 メチォニン、 フエ二ルァラニン、 チロシン ) のいずれかであり、 さらに好ましくは置換したアミノ酸が口イシ ンまたはメチォニンである。 なお、 本明細書において 「 7 8 6番目 のグルタミンに相当するアミノ酸残基」 とは、 配列番号 6に示すァ ミノ酸配列を基準としたとき、 7 8 6番目にあるダル夕ミン残基の ことをいい、 配列番号 6 に示す配列からなる T 7 R N Aポリメラ一 ゼの 5 ' 末端側にポリペプチドが付加または削除された場合は、 前 記付加または削除されたポリぺプチドの長さの分だけ位置がずれる (例えば、 配列番号 6に示す配列からなる T 7 R N Aポリメラーゼ の 5 ' 末端側にアミノ酸 1 0残基からなるポリぺプチドが付加され た T 7 R N Aポリメラーゼの場合、 「 7 8 6番目のグルタミンに相 当するァミノ酸残基」 は 7 9 6番目にあるグルタミンとなる） 。 第二の観点において、 本発明で開示する、 熱安定性及び Zまたは 比活性が向上した T 7 R N Aポリメラ一ゼは、 配列番号 6 に示す野 生型の T 7 R N Aポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、 少 なく とも 1 7 9番目のリジンに相当するアミノ酸残基を他のアミノ 酸に置換したものであり、 好ましくは置換したアミノ酸がダルタミ ン酸、 ァスパラギン、 システィンのいずれかであり、 さらに好まし くは置換したアミノ酸がグルタミン酸である。 なお、 本明細書にお いて 「 1 7 9番目のリジンに相当するアミノ酸残基」 とは、 配列番 号 6 に示すアミノ酸配列を基準としたとき、 1 7 9番目にあるリジ ン残基のことをいい、 配列番号 6に示す配列からなる T 7 R N Aポ リメラ一ゼの 5 ' 末端側にポリぺプチドが付加または削除された場 合は、 前記付加または削除されたポリべプチドの長さの分だけ位置 がずれる。 第三の観点において、 本発明で開示する、 熱安定性及.び比活性が 向上した T 7 R N Aポリメラーゼは、 配列番号 6に示す野生型の T 7 R N Aポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、 少なく とも 7 8 6番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基及び 1 7 9番目の リジンに相当するアミノ酸残基をそれぞれ他のアミノ酸に置換した ものであり、 好ましくは 7 8 6番目のアミノ酸残基を疎水性ァミノ 酸 （ロイシン、 メチォニン、 フエ二ルァラニン、 チロシン） のいず れかに、 1 7 9番目のアミノ酸残基をグルタミン酸、 ァスパラギン 、 システィンのいずれかにそれぞれ置換したものであり、 さらに好 ましくは 7 8 6番目のアミノ酸残基をロイシンまたはメチォニンに 1 7 9番目のアミノ酸残基をグルタミン酸、 ァスパラギン、 システ インのいずれかにそれぞれ置換したものである。
第四の観点において、 本発明で開示する、 熱安定性及び/または 比活性が向上した T 7 R N Aポリメラ一ゼは、 配列番号 6に示す野 生型 T 7 R N Aポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、 少な く とも 6 8 5番目のパリンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸 に置換されたものであり、 好ましくは当該アミノ酸が中性または弱 疎水性アミノ酸 （ァラニン、 グリシン、 セリン、 スレオニン、 シス ティン、 ァスパラギン、 グルタミン） のいずれかに置換され、 さら に好ましくは置換したアミノ酸がァラニンである。 なお、 本明細書 において 「 6 8 5番目のバリンに相当するアミノ酸残基」 とは、 配 列番号 6に示すアミノ酸配列を基準としたとき、 6 8 5番目にある バリ ン残基のことをいい、 配列番号 6に示す配列からなる T 7 R N Aポリメラーゼの 5 ' 末端側にポリべプチドが付加または削除され た場合は、 前記付加または削除されたポリべプチドの長さの分だけ 位置がずれる （例えば、 配列番号 6に示す配列からなる T 7 R N A ポリメラ一ゼの 5 ' 末端側にアミノ酸 1 0残基からなるポリべプチ ドが付加された T 7 R N Aポリメラーゼの場合、 「 6 8 5番目のバ リ ンに相当するァミノ酸残基」 は 6 9 5番目にあるリジンとなる） 第五の観点において、 本発明で開示する、 熱安定性及び Zまたは 比活性が向上した T 7 R N Aポリメラーゼは、 配列番号 6 に示す野 生型 T 7 R N Aポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、 前述 の 6 8 5番目のバリンに相当するアミノ酸残基の置換に加え、 さら に、 1 7 9番目のリジン及び/または 7 8 6番目のグルタミンに相 当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたものであり、 好ましくは 1 7 9番目のリジンに相当するアミノ酸残基がダルタミ ン酸に、 及び Zまたは 7 8 6番目のダル夕ミンに相当するアミノ酸 残基がロイシンまたはメチォニンにそれぞれ置換されたものである 。 なお、 本明細書において 「 1 7 9番目のリジン及び/または 7 8 6番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基」 とは、 配列番号 6に 示すアミノ酸配列を基準としたとき、 1 7 9番目にあるリジン及び Zまたは 7 8 6番目にあるグルタミン酸残基のことをいい、 配列番 号 6に示す配列からなる T 7 R N Aボリメラーゼの 5 ' 末端側にポ リベプチドが付加または削除された場合は、 前記付加または削除さ れたポリべプチドの長さの分だけ位置がずれる。
本発明の変異型 T 7 R N Aポリメラーゼは、 野生型 T 7 R N Aポ リメラーゼ遺伝子へ変異を導入することで作製することができる。 所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である 。 例えば、 部位特異的変異誘発法、 縮重オリゴヌクレオチドを用い る P C R、 核酸を含む細胞の変異誘発剤または放射線への露出とい つた公知の技術を適宜使用することによって、 変異を有する D N A を構築することができる。
野生型 T 7 R N Aポリメラーゼ遺伝子の入手は、 当業者のなし得 る方法であればいかなる方法でもよいが、 例えば T 7 ファージ （ D S M N o . 4 6 2 3 , AT C C 1 1 3 0 3 — B 7， N C I MB 1 0 3 8 0など） から、 そのゲノム情報から作製した適当なプライ マ一を用いて P C Rによって取得することができる。
本発明の酵素の取得方法については特に制限はなく、 化学合成に より合成した蛋白質でもよいし、 遺伝子組み換え技術により作製し た組み換え蛋白質でもよい。 遺伝子組み換え技術を利用して取得す る場合、 T 7 R NAポリメラ一ゼ遺伝子を適当な方法で宿主に組み 込むことで目的の酵素を得ることができる。
使用される宿主には酵母、 動物細胞株、 植物細胞、 昆虫細胞など 各種培養細胞が使用できるが、 T 7 R N Aポリメラーゼ遺伝子の場 合、 もともとのバクテリオファージの感染先であり、 かつ取り扱い の簡便な大腸菌を宿主として用いることが望ましい。 形質転換に用 いる大腸菌は J M 1 0 9株、 H B 1 0 1株が例示できるがそれらに 限定されない。
本発明の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することがで きる。 本発明で用いるベクタ一の種類は特に限定されず、 例えば、 自立複製型ベクターでもよいし、 あるいは、 宿主細胞に導入された 際に宿主細胞のゲノムに組み込まれるものでめづてもよい。 好まし くは 、 本発明で用いるベクターは発現べクタ ―である。 発現べクタ
—において本発明の遺伝子は、 転写に必要な要素 (例えば、 プロモ 一夕一等） が機能的に連結される 。 プロモー夕 は宿主細胞におい て転写活性を示す D N A配列であり、 宿主の種類に応じて適宜選択 することができる。 大腸菌で使用できるプロモ ―夕一には l a c
、 t r pもしくは t a cプロモーターなどが挙げられ、 宿主に大腸 菌を利用する場合には適当なブラスミ ドに目的の遺伝子を組み込み
、 形質転換する方法が簡便である 。 使用するプラスミ ドは ρ T r c 9 9 A ( G Eヘルスケアバイオサイエンス製） 、 p C D F— l b ( 夕カラバイオ製） といった発現用プラスミ ドが例示できるがそれら に限定されず、 一般的な大腸菌用ベクターであれば当業者が入手し 得るベクターを使用すればよい。 また、 作製する T 7 R N Aポリメ ラーゼ遺伝子は酵素の精製のために有用な配列を付加してもよい。 例えばシグナルべプチドを利用し細胞外分泌型酵素としたり、 シグ ナルペプチドとして末端にヒスチジンへキサマーを含んだタグ配列 が付加されるように遺伝子を作製することができる。 もっとも、 シ グナルペプチドの種類やシグナルペプチドと本酵素の結合方法.は上 記方法に限定されることはなく、 当業者が利用可能な任意のシグナ ルペプチドを利用することが出来る。
作製した形質転換体は、 導入された D N A構築物の発現を可能に する条件下で適切な栄養培地中で培養することで、 本発明の酵素を 取得することができる。 形質転換体の培養物からの単離精製には、 通常のタンパク質で用いられる単離、 精製法を用いればよい。 例え ば、 本発明の酵素が細胞内に発現した場合には、 培養終了後、 細胞 を遠心分離により回収し適当な水系緩衝液に懸濁後、 リゾチーム処 理ゃ超音波破碎機等により細胞を破砕し、 無細胞抽出液を得る。 さ らに無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清を通常の タンパク質の単離精製法で精製する。 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等に よる塩析法、 脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミノエチ ル （D E A E ) トヨパール （商品名） （東ソ一製） といったレジン を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 プチルトヨパール及 びフエニルトヨパール （商品名） （東ソ一製） といったレジンを用 いた疎水性クロマトグラフィー法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァ フィニティークロマトグラフィ一法、 クロマトフオーカシング法、 等電点電気泳動といった電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合 わせて用い、 精製標品を得ることができる。 また、 シグナルべプチ ドを利用し対応する方法で精製する方法も簡便であり、 例えばヒス チジンへキサマー配列とニッケルカラムを用いることで容易に精製 することができる。
本発明の T 7 R NAポリメラ一ゼ変異体は上記方法のほかにも、 例えば化学的に合成して得ることもできる。
上記で説明した本発明の酵素は、 従来知られている T 7 R NAポ リメラーゼとして、 各用途で使用することができる。 即ち、 本発明 の酵素は、 RNAポリメラーゼとして、 RNAを合成するために使 用することができる。 具体的には、 基質としてリポヌクレオチド （ AT P、 C T P、 GT P、 UT P) を使用し、 特定の配列を有する 二本鎖 D NAを铸型に、 一本鎖 RNA合成を行なう ことができる。
さらに本発明の R NAポリメラ一ゼは、 逆転写酵素との協奏的作 用によって特定の R NA配列を含む標的 R NAを増幅する等温核酸 増幅反応にも使用することができる。 等温核酸増幅反応としては T R C法 （特許文献 3及び非特許文献 1 ) 、 NA S B A法、 TMA法 などが挙げられる。
本発明の T 7 R NAポリメラ一ゼ変異体は、 野生型 T 7 R NAポ リメラーゼと比べて熱安定性及び Zまたは比活性が向上している。 そのため、 野生型と比較して保存が容易であり、 また長期間の保存 も可能である。 よって、 使い勝手がよく、 長期に渡って使用可能な 試薬を提供することができる。
また、 本発明の T 7 R N Aポリメラーゼ変異体は、 野生型よりも 高温条件下で使用可能であることから、 転写反応や等温核酸増幅反 応における実験条件を改善することが可能で、 インヴィ ト口、 イン ヴイ ヴォを問わず、 野生型よりも広い温度範囲で使用可能である。 特に T R C法を用いた等温核酸増幅反応において、 野生型 T 7 R N Aポリメラ一ゼを使用した場合は前記酵素が 4 6 以上で活性低 下を生じるため、 4 0 °Cから 4 5 °Cといった比較的低温条件下で核 酸増幅反応を行なう必要があった。 また、 前記温度条件下では、 R NAが複雑な高次構造をとりやすく、 そのことが高感度に検出する プライマーの設計を困難にしてきた。 一方、 本発明の T 7 R NAポ リメラーゼ変異体は 4 6 °C以上の温度条件下において、 野生型より 安定性及びノまたは比活性が向上している。 そのため、 T R C法に よる核酸増幅反応を 4 6 °C以上の温度条件下で実施することが可能 となり、 従来より検出時間が短縮した核酸増幅試薬を提供すること ができる。 また高温条件下では、 R NAが複雑な高次構造をとりに く くなるため、 より高感度に検出するプライマーの設計も容易にな る。 そのため、 本発明の T 7 R NAポリメラーゼ変異体を用いて、 T R C法による核酸増幅反応を 4 6 °C以上の温度条件下で行なうこ とで、 従来より高感度に検出する核酸増幅試薬も提供することがで きる。 実施例
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明 は実施例によって限定されるものではない。
実施例 1 T 7 R NAポリメラーゼ遺伝子のクローニング
T 7 R NAポリメラ一ゼ遺伝子のクローニングは以下の方法に従 い実施した。
( 1 ) T 7 ファージゲノミック D NAゲノミックライブラリ一 （シ グマ製） を錡型プラスミ ドとして、 T 7 R N Aポリメラーゼ遺伝子 を、 以下の試薬組成及び反応条件にて、 前半部分と後半部分に分け て P C R法を用い増幅した。 なお、 試薬組成のうち合成 D N Aブラ イマ一は、 前半部分の増幅にはプライマー F F (配列番号 1 ) 及び プライマー F R (配列番号 2 ) を、 後半部分の増幅にはプライマー R F (配列番号 3 ) 及びプライマー R R (配列番号 4) を、 それぞ れ用いた。
(試薬組成） （総反応液量 ： 1 0 0 L)
各 2 0 0 p M 合成 D NAプライマー
l O O n g 铸型プラスミ ド
0. 2 mM d NT P s
0. 0 2 5 u n i t / T a q D NAポリメラーゼ ( T a K a R a E x T a q (商品名） 、
夕力ラバイォ製）
酵素に付属するバッファー
(反応条件）
サーマルサイクラ一 （P e r k i n— E l m e r製） を用 レ 、 9 4でで 2分加熱後、 9 4 °C ' l分、 5 8 °C ' 3 0秒、 7 2 °C · 1分の温度サイクルを 2 5回繰り返した。
( 2 ) P C R反応後の液を 1 %ァガロース電気泳動で泳動後、 ェチ ジゥムプロマイ ド染色を行ない、 染色後のゲルから目的産物のバン ドを切り出すことで、 P C R産物を精製した。
( 3 ) 精製した P C R産物のうち、 前半部分の P C R産物を制限酵 素 B s p H I及び H i n d I I I (夕カラバイオ製） で消化し、 制 限酵素 N c o I (夕カラバイオ製） 及び H i n d I I I で消化した p T r c 9 9 Aベクタ一 (G Eヘルスケアバイオサイエンス製) に T 4 リガ一ゼを用いて 4 °Cで 3 0分反応させた。
( 4 ) ( 3 ) の反応液を大腸菌 J M 1 0 9株に形質転換させ、 L B GZC r b寒天培地 （ 1 % ポリペプトン、 0. 5 % 酵母エキス 、 1 % N a C l 、 0. 5 % グルコース、 1 % 寒天、 5 0 x g /mL カルペニシリン （ p H 7. 4 ) ) 上で選択を行ない、 3 7 でで一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミ ドを P T r c 9 9 A— T 7 Fとした。
( 5 ) 常法に従ぃ 丁 じ 9 9八ー丁 7 を調製後、 後半部分の P C R産物を制限酵素 H i n d I I I で消化し、 制限酵素 H i n d I I I で消化した p T r c 9 9 A— T 7 Fに T 4 リガ一ゼを用いて 4 °Cで 3 0分反応させた。
( 6 ) ( 5 ) の反応液を大腸菌 J M 1 0 9株に形質転換させ、 L B GZC r b寒天培地 （ 1 % ポリペプトン、 0. 5 % 酵母エキス 、 1 % N a C l 、 0. 5 % グルコース、 1 % 寒天、 5 0 x g ZmL カルペニシリン （ p H 7. 4 ) ) 上で選択を行ない、 3 7 °Cで一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミ ドを p T r c 9 9 A- T 7 RNA p o 1 とした。 図 1 に p T r c 9 9 A— T 7 R NA p o l の制限酵素地図を示す。 なお、 T 7 R NAポリメ ラーゼ遺伝子については実施例 6に示す方法を用いて塩基配列を決 定することにより、 意図しない変異が導入されていないことを確認 した。 得られた T 7 RNAポリメラーゼの遺伝子配列を配列番号 5 に、 アミノ酸配列を配列番号 6に示す。
実施例 2 発現ベクターの作製
実施例 1で作製した p T r c 9 9 A- T 7 R NA p o 1 (図 1 ) を铸型に T 7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含んだ D N A断片を P C R法にて増幅し、 p C D F 2プラスミ ド （図 2 ) と連結した。
( 1 ) p T r c 9 9 A- T 7 RNA p o l (図 1 ) を铸型プラスミ ドとして、 以下の試薬組成及び反応条件にて、 P C R反応を行なつ た。
(試薬組成） （総反応液量 ： 1 0 0 /i L )
2 0 0 p M プライマー p T r c F (配列番号 7 )
2 0 0 p M プライマ一 p T r c R (配列番号 8 ) 1 0 0 n 铸型プラスミ ド
0. 2 mM d NT P s
0. 0 2 5 u n i t /^ L T a q D NAポリメラ一ゼ ( T a K a R a E x T a q (商品名） 、
夕力ラバイォ製）
酵素に付属するバッファー
(反応条件）
サ一マルサイクラ一 （P e r k i n— E l m e r製） を用 い、 9 4 °Cで 2分加熱後、 9 4 ^ · 1分、 5 8 °C ' 3 0秒、 7 2 °C · 2分 4 0秒の温度サイクルを 2 5回繰り返した。
( 2 ) 1 %ァガロース電気泳動で泳動後、 エヂジゥムブロマイ ド染 色を行ない、 染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで 、 P C R産物を精製した。
( 3 ) 精製した P C R産物を制限酵素 E c o T 2 2 I (夕カラバイ ォ製） 及び B 1 n I (夕カラバイオ製） で消化し、 制限酵素 P s t I (夕カラバイオ製） 及び B 1 n I で消化した p C D F 2プラスミ ド （図 2 ) に T 4 リガ一ゼを用いて 4 °Cで 3 0分反応させた。
(4) ( 3 ) の反応液を大腸菌 J M 1 0 9株に形質転換させ、 L B G/C r b寒天培地 （ 1 % ポリペプトン、 0. 5 % 酵母エキス 、 1 % N a C 0. 5 % グルコース、 1 % 寒天、 5 0 g Zm L カルペニシリン ( p H 7. 4 ) ) 上で選択を行ない、 3 7 °Cで一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミ ドを p C D F 2— T 7 R NA Pとした。 図 3に p C D F 2— T 7 R NA P の制限酵素地図を示す。 なお、 T 7 R N Aポリメラーゼ遺伝子につ いては実施例 6 に示す方法を用いて塩基配列を決定することにより 、 意図しない変異が導入されていないことを確認した。
( 5 ) p C D F 2 — T 7 R NA P (図 3 ) を基に以下に示す方法で ヒスチジンへキサマーの導入を行なった。
( 5— 1 ) p C D F 2 — T 7 RNA P (図 3 ) を铸型プラスミ ドと して、 以下の試薬組成及び反応条件にて、 1回目の P C R反応を行 なった。 なお、 合成プライマーはプライマー H i s F (配列番号 9 ) とプライマー p C D F R (配列番号 1 0 ) の組み合わせ、 または プライマー H i s R (配列番号 1 1 ) とプライマ一 p C D F F (配 列番号 1 2 ) の組み合わせを用いた。
(試薬組成） （総反応液量 ： 1 0 0 L )
各 2 0 0 p M 合成 DNAプライマー
l O O n g 铸型プラスミ ド
0. 2 mM d N T P s
0. 0 2 5 u n i t / n L D NAボリメラ一ゼ （ P r i m e S TA R H S D NA p o l ym e r a s e (商 品名） 、 夕力ラバイォ製）
酵素に付属するバッファー
(反応条件）
サーマルサイクラ一 （P e r k i n— E 1 m e r製） を用 い、 9 8 °Cで 3 0秒加熱後、 9 8 °C · 3 0秒、 5 5 °C · 3 0 秒、 7 2 °C · 3分の温度サイクルを 3 0回繰り返した後、 7 2 °Cで 7分間反応した。
( 5 - 2 ) 反応液を 1 %ァガロース電気泳動で泳動後、 ェチジゥム プロマイ ド染色を行ない、 染色後のゲルから目的産物のバンドを切 り出すことで、 P C R産物を精製した。
( 5 - 3 ) 得られた 2種類の P C R産物を铸型に、 合成 D NAプラ イマ一としてプライマー p C D F R (配列番号 1 0 ) とプライマー p C D F F (配列番号 1 2 ) の組み合わせを用いて 2回目の P C R 反応を行なった。 P C R反応における試薬組成、 及び反応条件は合 成 D N Aプライマ一と銬型以外は （ 5— 1 ) と同じ条件で行ない、 増幅した産物を （ 5— 2 ) と同様にァガロースゲルにて電気泳動後 、 抽出、 精製した。
( 5— 4 ) p C D F 2 _ T 7 RNA Pプラスミ ド （図 3 ) と、 （ 5 一 3 ) で精製した 2回目の P C R産物に 0. 2 mM d NT P s、 0. 0 2 5 u n i t // L D NAポリメラーゼ及び酵素に付属す るバッファーを加え、 総反応液量を 1 0 0 ^ Lとした。 この反応液 をサーマルサイクラーを用いて 9 5 で 3 0秒加熱後、 9 5 °C · 3 0秒、 5 5 °C * 1分、 6 8 °C ' 8分の温度サイクルを 1 8回繰り返 した後、 6 8 °Cで 7分間反応させることで、 P C R反応を行なった
( 5— 5 ) P C R反応終了後、 制限酵素 D n p l を l O u n i t s 加え、 3 7 Cで 1時間消化し、 常法に従い大腸菌 J M 1 0 9に形質 転換した。
( 5 - 6 ) 形質転換した溶液は L B G/C r b寒天培地 （ 1 % ポ リペプトン、 0. 5 % 酵母エキス、 1 % N a C l 、 0. 5 % グルコース、 1 % 寒天、 5 0 g/mL カルペニシリン （ p H 7. 4 ) ) に塗布し、 3 7 °Cで一晩保温した。 生成したコロニーか ら常法によりプラスミ ドを抽出し、 p C D F 2 — T 7 R NA P H i s プラスミ ドとした。 図 4に p C D F 2 — T 7 R NA P H i s の制 限酵素地図を示す。 さらに実施例 6 に示す方法を用いて塩基配列を 決定することにより、 意図しない変異が導入されていないこと、 及 ぴヒスチジンへキサマーが導入されていることを確認した。 また培 養した菌体から酵素を抽出し、 ニッケルキレート樹脂によるァフィ 二ティ精製が可能であることを確認した。 得られたヒスチジンへキ サマーを融合した T 7 R N Aポリメラ一ゼの遺伝子配列を配列番号 1 3にアミノ酸配列を配列番号 1 4に示す。 実施例 3 変異ライブラリーの作製 （その 1 )
実施例 2で作製した P C D F 2— T 7 RNA P H i s プラスミ ド (図 4 ) の T 7 RNAポリメラーゼ遺伝子に以下の手順で変異を導 入した。
( 1 ) p C D F 2— T 7 RNA P H i s (図 4 ) を铸型プラスミ ド として、 以下の試薬組成及び反応条件にて、 エラーブローン P C R 反応を行なった。
(試薬組成） （総反応液量 ： 1 0 0 X L )
0. 1から 0. 3 mM (必要に応じて） M n C l 2 2 0 0 ρ プライマ一 p T r c F s (配列番号 1 5 ) 2 0 0 ρ M プライマー p T r c R s (配列番号 1 6 ) l O O n g 铸型プラスミ ド
0. 2 mM d A T P
0. 2 mM d G T P
1 mM d C T P
1 mM d T T P
2 mM M g C 1 2
0. 0 1 u n i t / u h T a q D NAポリメラーゼ （G o T a q (商品名） 、 P r o m e g a製）
酵素に付属する M gフリーのバッファー
(反応条件）
サーマルサイクラ一 （P e r k i n— E l m e r製） を用 レ 、 9 4 °Cで 2分加熱後、 9 4 °C . 3 0秒、 5 5 °C · 1分、 7 2で · 8分の温度サイクルを 2 5回繰り返した。
( 2 ) P C R産物を、 1 %ァガロース電気泳動で泳動後、 ェチジゥ ムブロマイ ド染色を行ない、 染色後のゲルから目的産物のバンドを 切り出すことで精製した。 ( 3 ) 精製された T 7 RNAポリメラーゼ遺伝子を制限酵素 N c o I及び P s t Iで消化後、 同酵素で消化した p C D F 2プラスミ ド
(図 2 ) に T 4 リガーゼを用いて 4でで 3 0分反応させ、 反応後の D NA溶液を T 7 RNAポリメラーゼ遺伝子変異体ライブラリーと した。
( 4 ) 作製したライブラリーの一部を定法に従い大腸菌 J M 1 0 9 株に形質転換しプラスミ ドを精製し、 実施例 6 に示す方法で塩基配 列を決定することでエラーブローン P C Rの効果を確かめた。
実施例 4 スクリーニングベクターの作製
実施例 3で作製した変異ライブラリーの活性を評価するために G F Pを用いた活性確認用べクターの作製を行なった。
( 1 ) G F P遺伝子は塩基配列情報 （G e n B a n k A c c e s s i o n N umb e r A F 1 8 3 3 9 5 ) に基づき、 d s D N Aを合成した。 合成した G F P遺伝子には、 T 7プロモーターとク ローニング用の制限酵素サイ ト S p h I (夕カラバイオ製） を持つ ように設計した。
( 2 ) 合成した G F P遺伝子は制限酵素 S p h I で 3 7 °Cで 3時間 消化し、 1. 0 %ァガロース電気泳動で泳動後、 ェチジゥムブロマ ィ ド染色を行ない、 染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出す ことで精製した。 これを同様に消化、 精製した p S T V 2 8ベクタ ― (夕カラバイオ製） と T 4 リガーゼを用いて 4 °Cで 3 0分反応さ せた。
( 3 ) ( 2 ) の反応液を大腸菌 J M 1 0 9株に形質転換させ、 L B GZCm寒天培地 （ 1 % ポリペプトン、 0. 5 % 酵母エキス、 1 % N a C 0. 5 % グルコース、 1 % 寒天、 3 0 x g Z m L クロラムフエ二コール） 上で選択を行ない、 3 7 °Cで一晚培 養後に生育してきたコロニーを取得した。 ( 4 ) 取得したコロニーは、 L B G/Cm液体培地 （ 1 % ポリべ プトン、 0. 5 % 酵母エキス、 1 % N a C l、 0. 5 % グル コース、 3 0 gZmL クロラムフエニコ一ル） を用いて、 3 7 ででー晚培養後、 プラスミ ドを回収し、 このプラスミ ドを T 7プロ モー夕一によって発現が誘導される G F P遺伝子を持つ p S T V G F Pとした。 図 5に p S TV G F Pの制限酵素地図を示す。
( 5 ) 取得した p S TV G F P (図 5 ) を、 実施例 3で作製した T 7 R NAポリメラーゼ遺伝子変異体ライブラリーと共に大腸菌 J M 1 0 9株に形質転換を行なった。 この菌液を 3 7 °Cの S〇 C培地で 1. 5時間培養後、 F A C A r i aセルソー夕一 （日本 B D製） で 蛍光が観察される株を 1 クローンずつ分取し 3 7 °Cの 2 XY T GZ 1" 13培地 （ 1. 6 % バク ト トリプトン、 1 % バク ト酵母ェキ ス、 0. 5 % N a C l、 0. 5 % グルコース、 5 0 g ZmL カルペニシリン （ p H 7. 4 ) ) で増殖してきた株を、 それぞれ 変異体候補株とした。
実施例 5 高温型 T 7 R NAポリメラーゼのスクリーニング 変異株のスクリーニングは効率的に変異体が評価できるよう 9 6 ウェルタイタ一プレートを用いて行なった。
( 1 ) l mL容量の 9 6ゥエルディープゥエルプレートに 2 0 0 Lの L B G/C r b培地 （ 1 % ポリペプトン、 0. 5 % 酵母ェ キス、 1 % N a C 1、 0. 5 % グルコース、 5 0 ^ g / m L カルペニシリン （ p H 7. 4 ) ) を加え、 実施例 4で得た G F P陽 性のコロニーを植菌し、 3 7 °Cにてー晚 6 0 0回転/分で培養した
( 2 ) 2 mL容量の 9 6ディープゥエルプレートに 1. O mLの 2 XYT GZC r b培地 （ 1. 6 % ノ ク ト 卜リプトン、 1 % Λり ト酵母エキス、 0. 5 % N a C l、 0. 5 % グルコース、 5 0 11 g /m L カルペニシリン （ p H 7. 4 ) ) を加え、 （ 1 ) での 一晩培養液を 1 0 ^ L植菌し、 3 7 °Cにて 7 5 0回転/分で培養を 開始した。
( 3 ) ( 2 ) での培養約 4時間後、 5 0 m Mの I P T G (イソプロ ピル一） S —チォガラク トピラノシド） 溶液 1 0 Lを添加し、 温度 を 3 0 °Cに下げて更に 3時間振とう培養した。 培養終了後、 4 °Cに て 3 0 0 0回転/分で 1 5分間遠心分離して菌体を回収し、 得られ た菌体は一 3 0でにて一晩凍結保存した。
( 4 ) 凍 させた菌体に溶菌液 1 0 0 L (組成 ： 2 0 m T r i s - H C 1 緩衝液 （ p H 8. 0 ) 、 0 . 2 % T r i t o n X
- 1 0 0 、 0 . 0 2 % デォキシコール酸ナトリクム 、 0. 0 3 % リゾチ ム （太陽化学製） 、 0. 2 5 u n i t の B e n z o η a s e (ノハ、ジェン製） ） を加え 、 3 0 °Cにて 5 0 0回転 Z分で 1時 間振とう し 、 4 °Cにて 3 0 0 0回転/分で 3 0分間遠心分離し 、 上 清を回収した
( 5 ) ( 4 ) で得られた上清の全量を二ッケルキレー卜樹脂 (ヒス バインド (商品名） 、 ノバジェン製） を充填した 9 6ゥエルフィル 夕ープレ一 hにアプライ し、 緩衝液 A ( 2 0 mMのィミダゾール及 ぴ 5 0 0 m Mの塩化ナトリウムを含む 2 0 mM T r i s 一 H C 1 緩衝液 （ P H 8. 0 ) ) 2 0 0 Lで 4回洗浄後、 5 0 Lの緩衝 液 B ( 1 5 0 mMのイミダゾール及び 5 0 0 mMの塩化ナ卜リウム を含む ·2 0 m M T r i s - H C 1 緩衝液 （ P H 8. 0 ) ) で溶出 させた。
( 6 ) 溶出画分は実施例 7 の手順と同様にタンパク質濃度及び転写 活性を測定し、 タンパク量あたりの転写産物量である比活性を求め た。 転写活性の測定条件は反応温度 4 6 ° (：、 反応時間 6 0分、 T 7 R NAポリメラ一ゼ量 0. 5 Lに設定し、 R NAの定量は Q u a n t — I T RNAアツセィキッ ト （商品名） （インピトロジェン 製） を用いた。 約 4 0 0 0の変異株から野生型の比活性よりも約 2 倍高い菌株 6 0種類をスクリーニングした。
実施例 6 シークェンス方法
実施例 5で選択した変異体候補株は、 3 7 の L B GZ C r b液 体培地 （ 1 % ポリペプトン、 0. 5 % 酵母エキス、 1 % N a C 1、 0 · 5 % グルコース、 5 0 / m L カルべニシリン ( P H 7. 4 ) ) で一晩培養後、 定法によりプラスミ ドを抽出した。 抽出したプラスミ ドに含まれる T 7 R NAポリメラーゼ遺伝子の塩 基配列決定は以下の方法で行なった。
( 1 ) B i g D y e T e r m i n a t o r v 3. 1 e y e 1 e S e q u e n c i n g K i t (商品名) (A p p l i e d
B i o s y s t e m s製） を用いて、 添付のバッファー 2. 0 L、 プレミックス 4. 0 L、 合成 D N Aプライマー 3 . 2 p m o 1 、 銬型プラスミ ド 5 0 O n gを滅菌水にて 2 に調製し、 サ 一マルサイクラ一 （P e r k i n— E l m e r製） を用レ 、 9 6 °C で 1分加熱後、 9 6 °C · 1 0秒、 5 0 °C · 5秒、 6 0 °C · 4分の温 度サイクルを 2 5回繰り返した。
( 2 ) ( 1 ) で調製した塩基配列決定用サンプルを C e n t r i - S e pスピンカラム （商品名） （A B I製） を用いて、 以下に示す 方法で精製した。
( 2— 1 ) C e n t r i— S e pスピンカラムに滅菌水を 8 0 0 L加え、 ボルテックスにより乾燥したゲルを十分に水和させた。
( 2— 2 ) カラムに気泡がないことを確認後、 室温にて 2時間以上 放置した。
( 2 - 3 ) 上のキャップ、 下のス トッパーを順に外しカラム内の滅 菌水をゲル表面まで自然落下させた後、 7 3 0 X gで 2分間遠心分 離を行なった。
( 2— 4) ( 2— 1 ) から （ 2— 3 ) により作製したスピンカラム の中央に塩基配列決定用サンプルをアプライし、 7 3 0 X gで 2分 間遠心分離によりサンプルをチューブに回収した。
( 2 - 5 ) 回収したサンプルについて減圧乾燥を行なった後、 ホル ムアミ ドに溶解した。
( 3 ) ( 2 ) で調製した塩基配列決定用サンプルを 9 5 °Cで 2分間 処理し、 氷上で急冷後、 A B I P R I S M 3 1 0一 D N A A n a l y z e r (商品名） （A p p l i e d B i o s y s t e rn s 製） で解析することで、 塩基配列を決定した。 ¾.基配列決定に使用 した合成 D NAプライマ一は、 プライマ一 p T r c F s (配列番号
1 5 ) 、 プライマー p T r c R s (配列番号 1 6 ) 、 プライマー T
7 F 0 (配列番号 1 7 ) 、 プライマ一 T 7 F 1 (配列番号 1 8 ) 、 プライマー T 7 F 2 (配列番号 1 9 ) 、 プライマ一 T 7 F 3 (配列 番号 2 0 ) 、 プライマ一 T 7 F 4 (配列番号 2 1 ) 、 プライマー T
7 F 5 (配列番号 2 2 ) 、 プライマー T 7 F 6 (配列番号 2 3 ) 、 プライマー T 7 R 0 (配列番号 2 4 ) 、 プライマ ― T 7 R 1 (配列 番号 2 5 ) 、 プライマー T 7 R 2 (配列番号 2 6 ) 、 プライマー Τ
7 R 3 (配列番号 2 7 ) 、 プライマー T 7 R 4 (配列番号 2 8 ) 、 プライマー T 7 R 5 (配列番号 2 9 ) 、 プライマ ― T 7 R 6 (配列 番号 3 0 ) を必要に応じて選択し使用した。
( 4 ) 決定した塩基配列は G E N E T Y X V e r . 8. 0 (商品 名） （ゼネテイクス製） を使用して解析を行な た。
解析の結果、 1 9株に塩基配列の置換が見出された 。 そのうち、
1 0株にはアミノ酸の変化をもたらす変異が含まれていた。 そのう ちの 1つは、 野生型 T 7 R NAポリメラーゼ塩基配列 (配列番号 5
) のうち、 5 3 5番目のアデニンがグァニンに置換されることで A AGコ ドンが GAGコ ドンに置換され、 当該ポリメラ一ゼアミノ酸 配列 （配列番号 6 ) の 1 7 9番目のリジンがグルタミン酸に変異し ていることがわかった。 この変異を有する T 7 R NAポリメラーゼ を K 1 7 9 E変異体とし、 その遺伝子配列を配列番号 3 1 に、 アミ ノ酸配列を配列番号 3 2に示す。 さらに、 残りの 9株は野生型 T 7 R N Aポリメラーゼ塩基配列 （配列番号 5 ) のうち、 2 3 5 7番目 のアデニンがチミンに置換されることで C AAコ ドンが C TAコ ド ンに置換され、 当該ポリメラーゼアミノ酸配列 （配列番号 6 ) の 7 8 6番目のグルタミンがロイシンに変異していることがわかった。 この変異を有する T 7 R NAポリメラ一ゼを Q 7 8 6 L変異体とし 、 その遺伝子配列を配列番号 3 3に、 アミノ酸配列を配列番号 3 4 にそれぞれ示す。
実施例 7 T 7 R N Aポリメラ —ゼの調製と活性測定
T 7 R NAポリメラ一ゼの P周製は以下に示す手順で行なつた o
( 1 ) L B G/ C r b液体培地 ( 1 % ポリペプトン、 0. 5 % 酵母エキス、 1 % N a C 1 、 0 . 5 % ダルコ一ス、 5 0 m L カルべニシリン （ P H 7 • 4 ) ) 3 mLに実施例 5で得た形 質転換体のダリセロ —ルス 卜ックを植菌し 、 1 8 mL試験管にて 3
7 °Cで一晩振とう培養した。
( 2 ) 2 XYT G/C r b培地 （ 1. 6 % パク ト トリプトン、 1 % バク ト酵母エキス、 0. 5 % N a C l 、 0. 5 % ダルコ一 ス、 5 0 gZmL カルペニシリン （ ρ Η 7. 4 ) ) l O O mL に （ 1 ) の前培養液 1. O mLを植菌し、 5 0 0 mL容量のひだ付 き Ξ角フラスコにて、 3 7 ° (：、 1 5 0回転/分 （タイテック製、 口 ータリー式） で培養した。
( 3 ) ( 2 ) の培養約 3から 4時間後 （O. D . 6 0 0 n m の値と しておよそ 1. 0程度） に 5 0 0 mIV [の I P T G (イソプロピル一 )8—チォガラク トピラノシド） 1 0 O Lを添加し、 温度を 3 0 °C に下げて更に 3時間振とう培養した。
( 4 ) 培養終了後、 4 °Cにて 4 0 0 0回転/分で 1 5分間遠心分離 し、 菌体を回収した。 直ちに菌体破砕を行わない場合は一 3 0 に 保存した。
( 5 ) 回収した菌体は 2 0 mLの 2 0 mM リン酸カリウム緩衝液 ( P H 7 . 0 ) により 1回洗浄し、 同じ組成の緩衝液 2 0 mLに再 懸濁し、 菌体破碎した。 菌体破砕は超音波発生装置 (インソネ一夕 一 2 0 1 M (商品名） 、 久保田商事製） を用いて、 5 °Cにて約 1 5 0 Wの出力で約 5分間処理した。
( 6 ) 得られた菌体破砕液を 4 °Cにて 1 2 0 0 0回転 Z分で 1 0分 間遠心分離し、 回収した上清を酵素抽出液として、 塩化ナトリウム 及びィミダゾールをそれぞれ 5 0 0 mM, 2 0 mMになるように添 加し、 ニッケルキレート樹脂によるァフィ二ティ精製に供した。
( 7 ) T 7 R NAポリメラーゼに付加させたヒスチジンへキサマー タグを利用したァフィ二ティ精製により、 以下の方法で酵素精製を 行なった。
( 7 - 1 ) 2 mLのニッケルキレート樹脂 （ヒスバインド （商品名 ) 、 ノバジェン製） のスラリーを付属の空カラムに充填し、 3 mL の滅菌水で洗浄した。
( 7 - 2 ) 洗浄したニッケルキレ一卜樹脂に 5 mLの 5 O mMの硫 酸ニッケル水溶液でキレート樹脂にニッケルを結合させ、 更に 3 m Lの緩衝液 A ( 2 0 mM T r i s - H C 1緩衝液 （ p H 8. 0 ) 、 5 0 0 mM 塩化ナトリウム、 2 0 mM イミダゾール） で洗浄 した。 そこに上記の酵素抽出液を加え、 6 mLの緩衝液 Aで洗浄後 、 l mLの緩衝液 B ( 2 0 mM T r i s — H C 1 緩衝液 （ p H 8 . 0 ) 、 5 0 0 mM 塩化ナトリウム、 1 5 0 m ィミダゾール ) で溶出し、 活性画分を回収した。
( 7 — 3 ) 回収した画分を脱塩カラム （P D— 1 0 (商品名） 、 G Eヘルスケアバイオサイエンス製） により、 5 mM ジチオスレィ トール及び 0. I mM E D TAを含む 2 0 mM リン酸カリウム 緩衝液 （ P H 7. 0 ) に置換し、 等量のグリセロールを加えた。 精 製した T 7 R NAポリメラーゼは牛血清アルブミンをコントロール タンパク質としたプロテインアツセィキッ ト （バイオラッ ド製） に より濃度を求めた。 また 7. 5 %濃度の S D S— P AG Eにより酵 素の純度を分析し、 ほぼ単一であることを確認した。
( 8 ) 活性測定を、 インヴィ トロ転写反応にて生成した R N A量を 測定する方法で行なった。 なお、 铸型 D NAは T 7 R N Aポリメラ ーゼが特異的に認識する T 7プロモーター配列を有する D N Aを用 いるが、 ここでは T 7プロモ —夕一配列を含むプラスミ Hを踌型に
P C Rで増幅した約 1. 5 k b p D N A断片を用いた。 また、 T 7 プロモータ一配列の下流の D NAの長さは 1. 0 k b pであり、 転 写される R NAは約 1. 0 k bになる。
( 8 — 1 ) T 7 R NAポリメラーゼを除いた反応液 （ 4 0 mM T r i s - H C 1 緩衝液 （ p H 8. 0 ) 、 2 0 mM M g C 1 2 5 m M ジチオスレィ トール 、 2 0 n g 鍀型 D N A、 0 ' 4 U R
N a s e阻害剤、 各 0， 4 m M N T P s (AT P , C T P， G T
P , UT P ) ) を 0. 2 m Lの P C Rチューブにいれ、 in製した T
7 R NAポリメラーゼを 0 X：に冷却した状態で加ん、 Π計 1 0 L とした。
( 8 — 2 ) 予め反応温度に保温しておいたヒートプロック (マス夕 一サイクラ一 e pグラジェント （商品名） 、 エツベンドルフ製） に 先ほど調製した P C Rチュ一ブをセッ トし、 転写反応を行なつ ,こ。 反応停止は 8 0 °Cで 2分間加熱することで行なつた。 ( 8— 3 ) 生成した R NA量は 1 %ァガロースゲルにて電気泳動し た後、 ェチジゥムブロマイ ドにて染色する方法、 及び市販の RNA 定量キッ トの Q u a n t — I T RNAアツセィキッ ト （商品名）
(インビトロジェン製） を用いて蛍光染色し、 添付の標準 R NAで 作製した検量線より濃度換算する方法にて分析した。
実施例 8 (K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L ) 二重変異体の作製
K 1 7 9 E変異体と Q 7 8 6 L変異体を基に、 K 1 7 9 Eと Q 7 8 6 Lの二つの変異を持った二重変異体を作製した。
( 1 ) K 1 7 9 E変異体と Q 7 8 6 L変異体、 それぞれからミニプ レップ法を用いてプラスミ ドを調製した。
( 2 ) K 1 7 9 E変異体から調製したプラスミ ドを錶型として、 以 下の試薬組成及び反応条件にて、 P C R反応を行なった。
(試薬組成） （総反応液量 ： 1 0 0 L )
2 0 0 p プライマ一 T 7 R 2 (配列番号 2 6 )
2 0 0 p M プライマー p T r c F s (配列番号 1 5 ) 1 0 0 n g 铸型プラスミ ド
0. 2 mM d N T P s
0. 0 2 5 u n i t / L T a q D NAポリメラーゼ (T a K a R a E x T a q (商品名） 、
タカラバイォ製）
酵素に付属するバッファー
(反応条件）
サーマルサイクラ一 （P e r k i n - E 1 m e r製） を用 い、 9 4 °Cで 2分加熱後、 9 4 °C · 1分、 5 8 °C · 3 0秒、 7 2 °C · 2分 4 0秒の温度サイクルを 2 5回繰り返した。
( 3 ) 反応液を 1 %ァガロース電気泳動で泳動後、 ェチジゥムブ口 マイ ド染色を行ない、 染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出 すことで精製した。
( 4 ) Q 7 8 6 L変異体から調製したプラスミ ドを铸型に、 合成プ ライマーとしてプライマ一 T 7 F 2 (配列番号 1 9 ) とプライマー p T r c R s (配列番号 1 6 ) の組み合わせを使用した他は （ 1 ) から （ 2 ) と同じ条件で、 P C R反応と精製を行なった。
( 5 ) ( 3 ) 及び （ 4 ) で得られた、 2種類の精製 P C R産物を铸 型として、 さらに P C R反応を行ない、 二重変異体遺伝子を作製し た。 なお、 P C R反応における試薬組成、 反応条件、 及び精製操作 は、 合成 D NAプライマーとしてプライマ一 p T r c F s (配列番 号 1 5 ) とプライマー p T r c R s (配列番号 1 6 ) の組み合わせ を使用した他は （ 1 ) から （ 2 ) と同じ条件である。
( 6 ) ( 5 ) で得られた、 精製二重変異体遺伝子は制限酵素 N c o I 及び P s t I (夕カラバイオ製） で消化後、 同酵素で消化した p C D F 2ベクターに T 4 リガーゼを用いて 4 °Cで 3 0分反応させた
( 7 ) ( 6 ) の反応液を大腸菌 J M 1 0 9株に形質転換させ、 L B G/C r b寒天培地 （ 1 % ポリペプトン、 0. 5 % 酵母エキス 、 1 % N a C 0 , 5 % グルコース、 1 % 寒天、 5 0 i g /mL カルペニシリ ン ( p H 7. 4 ) ) 上で選択を行ない、 3 7 °Cで一晩培養後に生育してきたコロニーを二重変異体とした。 さら に二重変異体は実施例 6 に示す塩基配列決定法により変異の導入を 確認し、 （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L) 変異体とした。 その遺伝子配 列を配列番号 3 5に、 アミノ酸配列を配列番号 3 6 に示す。
実施例 9 変異型 T 7 R NAポリメラーゼの熱安定性評価 （その 1 )
変異型 T 7 RNAポリメラーゼの熱安定性を以下のように測定し た。 ( 1 ) 実施例 5でスクリ一二ングした変異体の塩基配列解析の結果 (実施例 6 ) から、 高温域で野生型よりも活性が高かった、 1 7 9 番目のアミノ酸をリジンからグルタミン酸に置換した変異体 （K 1 7 9 E ) 、 7 8 6番目のアミノ酸をグルタミンからロイシンに置換 した変異体 （Q 7 8 6 L) 及び 2つの変異を合わせた二重変異体 （ K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L ) を、 実施例 7 に記載した方法に従い精製 酵素を調製した。 なお、 精製した酵素のタンパク濃度及び転写活性 は実施例 7 に示した方法に準じ測定した。
( 2 ) 実施例 7で調製した各種 T 7 R N Aポリメラーゼを希釈液 （ 4 0 mM T r i s - H C 1 緩衝液 （ ρ Η 8. 0 ) 、 2 0 mM 塩 化マグネシウム、 5 mM ジチオスレィ トール、 7 0 mM K C 1
、 0 . l m g /mL 牛血清アルブミン） を用いて 5 0 g / m L に調製した。
( 3 ) 0. 2 mLの P C Rチューブに 2 5 L分注し、 4 7 °Cにて 5分間、 1 0分間、 2 0分間、 それぞれ加熱させた。
( 4 ) 加熱処理後遠心分離に上清を回収後、 4 3 °Cにて 3 0分間転 写反応を行ない、 残存活性を求めた。
( 5 ) 生成した R NA量は 1 %ァガロースによる電気泳動にて分析 した。
結果を図 6に示した。 図 6から変異体 Q 7 8 6 L及び （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L) は野生型ではほとんど活性が無くなる 4 7ででも 、 明瞭な R N Aのバンドが認められた。 このことから、 少なく とも Q 7 8 6 Lの変異を導入した T 7 R NAポリメラーゼは、 野生型よ りも熱安定性が優れていることがわかる。
実施例 1 0 変異型 T 7 R NAポリメラーゼの活性評価 （その 1
)
変異型 T 7 R N Aポリメラーゼの各反応温度における活性を以下 のように測定した。
( 1 ) 実施例 5でスクリーニングした変異体の塩基配列解析の結果 (実施例 6 ) から、 高温域で野生型よりも活性が高かった 1 7 9番 目のアミノ酸をリジンからグルタミン酸に置換した変異体 （K 1 7 9 E ) 、 7 8 6番目のアミノ酸をグルタミンからロイシンに置換し た変異体 （Q 7 8 6 L) 及び 2つの変異を合わせた二重変異体 （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L) を、 実施例 7 に記載した方法に従い精製酵 素を調製した。 なお、 精製した酵素のタンパク濃度及び転写活性は 実施例 7に示した方法に準じ測定した。
( 2 ) T 7 R NAポリメラ一ゼの活性を、 T 7 R NAポリメラ一ゼ の酵素量を 1 0 ； g/mL、 反応温度を 4 3から 5 0 °Cの範囲で 1 0分間反応させて測定した。
( 3 ) 生成した RNA量を Q u a n t — I T R NAアツセィキッ ト （商品名） （インビトロジェン製） を用いて求めた。
測定した RNA濃度を図 7 に示した。 変異体 K 1 7 9 £は 4 2. 9 °Cから 4 6. 8 °Cの範囲で野生型よりも比活性が高いことがわか り、 このことから、 少なく とも K 1 7 9 Eの変異を導入した T 7 R N Aポリメラーゼは、 野生型よりも比活性が向上していることがわ かる。 次に、 変異体(¾ 7 8 6 しは4 4. 7でから 4 7. 9 °Cの範囲 で野生型よりも比活性が高かったが、 これは実施例 9の結果より熱 安定性が向上したことに由来すると思われる。 また、 二重変異体 （ K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L) では 4 2. 9 °Cから 4 7. 9。Cの温度域 で野生型よりも比活性が高かった。 このことから、 少なく とも K 1 7 9 E及び Q 7 8 6 Lの変異を導入した T 7 R NAポリメラ一ゼは 、 野生型よりも熱安定性及び比活性が向上していることがわかる。 実施例 1 1 変異型 T 7 R N Aポリメラーゼ遺伝子の調製 （その 1 ) 野生型 T 7 R N Aポリメラーゼのァミノ配列 （配列番号 6 ) のう ち、 1 7 9番目のリジンを他のアミノ酸に置換した T 7 R NAポリ メラーゼをコードする遺伝子の調製を、 以下に示す手順で行なった
( 1 ) p C D F 2 - T 7 R NA P H i s (図 4 ) を铸型プラスミ ド として、 以下の試薬組成及び反応条件にて、 1 回目の P C R反応を 行なった。 なお T 7ポリメラーゼ遺伝子の 5 ' 末端側を増幅するた めの合成 D NAプライマ一として、 プライマ一 p C D F F (配列番 号 1 2 ) とプライマー 1 7 9 M I X R (配列番号 3 9 ) の組み合わ せを、 3 ' 末端側を増幅するための合成プライマーとして、 プライ マ一 1 7 9 M I X F (配列番号 3 7 ) とプライマ一 p C D F R 2 ( 配列番号 3 8 ) の組み合わせをそれぞれ用いた。
(試薬組成） （総反応液量 ： 1 0 0 i L )
各 2 0 0 p M 合成 D NAプライマー
l O O n g 铸型プラスミ ド
0. 2 mM d N T P s
0. 0 2 5 u n i t / L D NAポリメラ一ゼ （P r i m e S TA R H S D NA p o l ym e r a s e (商 品名） 、 夕カラバイォ製）
酵素に付属するバッファー
(反応条件）
サーマルサイクラ一 （P e r k i n - E 1 m e r製） を用 レ 、 9 8 °Cで 3 0秒加熱後、 9 8 °C · 3 0秒、 5 5 °C · 3 0 秒、 7 2 °C · 1分 3 0秒の温度サイクルを 3 0回繰り返した 後、 7 2 °Cで 7分間反応した。
( 2 ) ( 1 ) で調製した P C R産物を、 1 %ァガロース電気泳動で 泳動後、 ェチジゥムブロマイ ド染色を行ない、 染色後のゲルから目 的産物のバンドを切り出すことで、 P C R産物を精製した。
( 3 ) 得られた 2種類 （ 5 ， 末端側及び 3 ' 末端側） の P C R産物 を铸型に、 プライマ一 p C D F F (配列番号 1 2 ) とプライマー p C D F R 2 (配列番号 3 8 ) を合成 D NAプライマ一として用いて 、 2回目の P C R反応を行なった。 P C R反応における試薬組成、 及び反応条件は合成 D NAプライマ一と铸型以外は （ 1 ) と同じ条 件で行ない、 増幅した産物を （ 2 ) と同様にァガロースゲルにて電 気泳動後、 抽出、 精製した。
( 4) ( 3 ) で精製した 2回目の P C R産物を、 制限酵素 N r u l 及び S a c I で消化後、 同酵素で消化した p C D F 2 — T 7 R N A P H i s プラスミ ド （図 4 ) に T 4 リガーゼを用いて 4 °Cで 3 0分 反応させ、 反応後の D NA溶液を T 7 R NAポリメラーゼ遺伝子変 異体ライブラリーとした。
( 5 ) ( 4) で作製したライブラリーを大腸菌 J M 1 0 9株に形質 転換し、 3 7 °Cの L B G/C r b培地 （ 1. 0 % バク ト トリプト ン、 0. 5 % パク ト酵母エキス、 0. 5 % N a C l、 0. 5 % グルコース、 5 0 g /mL カルペニシリン ( p H 7. 4 ) ) で増殖してきたコロニーを 9 0個、 各ライブラリーから選抜した。 ( 6 ) 選抜した菌株は常法によりプラスミ ドを抽出後、 p C D F F (配列番号 1 2 ) を塩基配列決定用合成 D NAプライマーとして使 用した他は、 実施例 6の手順と同様に塩基配列決定を行なうことで 、 塩基配列の変異を確認した。
実施例 1 2 変異型 T 7 RNAポリメラーゼ遺伝子の調製 （その 2 )
野生型 T 7 R NAポリメラーゼのァミノ配列 （配列番号 6 ) のう ち、 7 8 6番目のグルタミンを他のアミノ酸に置換した T 7 R NA ポリメラ一ゼをコ一ドする遺伝子の調製を、 以下に示す手順で行な つた。
( 1 ) P C D F 2 - T 7 RNA P H i s (図 4 ) を铸型プラスミ ド として 、 以下の試薬組成及び反応条件にて、 1回目の P C R反応を 行なつた 。 なお T 7ポリメラ一ゼ遺伝子の 5 ' 末端側を増幅するた めの合成 D NAプライマーとして、 プライマー P c D F F 4 (配列 番号 4 2 ) とプライマー 7 8 6 M I X R (配列番号 4 1 ) の組み合 わせ、 3 ' 末端側を増幅するための合成プライマ一として 、 プライ マー 7 8 6 M I X F (配列番号 4 0 ) とプライマ一 P C D F R (配 列番号 1 0 ) の組み合わせをそれぞれ用いた。
( 薬組成） （総反応液量 ： 1 0 0 L)
各 2 0 0 p M 合成 D NAプライマ一
1 0 0 n g 铸型プラスミ ド
0. 2 mM d N T P s
0. 0 2 5 u n i t / i L D NAポリメラ ―ゼ ( P r i m e S TAR H S D NA p o 1 y m e r a s e 、商 品名） 、 夕力ラバイォ製）
酵素に付属するバッファー
(反応条件）
サーマルサイクラ一 ( P e r k i n - E 1 m e r製） を用 い 、 9 8 °Cで 3 0秒加熱後、 9 8 °C · 3 0秒 、 5 5 °C · 3 0 秒 、 7 2 °C · 1分 3 0秒の温度サイクルを 3 0回繰り返した 後 、 7 2 °Cで 7分間反応した。
( 2 ) ( 1 ) で調製した P C R産物を、 1 %ァガロ ス電気泳動で 泳動後 、 ェチジゥムブ口マイ ド染色を行ない、 染色後のゲルから目 的産物のバンドを切り出すことで、 P C R産物を精製した。
( 3 ) 得られた 2種類 （ 5 ' 末端側及び 3 ' 末端側） の P C R産物 を鍀型に、 プライマ一 P C D F F 4 (配列番号 4 2 ) とプライマー p C D F R (配列番号 1 0 ) を合成 D N Aプライマーとして用いて 、 2回目の P C R反応を行なった。 P C R反応における試薬組成、 及び反応条件は合成 D N Aプライマーと铸型以外は （ 1 ) と同じ条 件で行ない、 増幅した産物を （ 2 ) と同様にァガロースゲルにて電 気泳動後、 抽出、 精製した。
( 4 ) ( 3 ) で精製した 2回目の P C R産物を、 制限酵素 H i n d I I I及び K p n I で消化後、 同酵素で消化した p C D F 2— T 7 R N A P H i s プラスミ ド （図 4 ) に T 4 リガーゼを用いて 4 °Cで 3 0分反応させ、 反応後の D NA溶液を T 7 R NAポリメラーゼ遺 伝子変異体 （ 1 7 9番目） ライブラリ一とした。
( 5 ) ( 4 ) で作製したライブラリ一を大腸菌 J M 1 0 9株に形質 転換し、 3 7 °Cの L B GZC r b培地 （ 1. 0 % ノ ク ト トリブト ン、 0. 5 % バク ト酵母エキス、 0. 5 % N a C 0. 5 % グルコース、 5 0 x gZmL カルべ一シリン （ ρ Η 7 ， 4 ) ) で増殖してきたコロニーを 9 0個、 各ラィブラリーから選抜した。
( 6 ) 選抜した菌株は常法によりプラス - ドを抽出し、 P C D F F
4 (配列番号 4 2 ) を塩基配列決定用合成 D Ν Αプライ 一として 使用した他は、 実施例 6の手順と同様に 基配列決定を行な 5こと で、 塩基配列の変異を確認した。
実施例 1 3 変異型 T 7 R NAポリメラーゼ変異体の活性評価 （ その 2 )
実施例 1 1及び 1 2で作製した変異型 T 7 R N Aポリメラーゼ遺 伝子から、 T 7 R N Aポリメラーゼの調製及び転写活性の測定を実 施例 7の方法に従い実施した。 結果を図 8 ( 1 7 9番目のリジンを 他のアミノ酸に置換した T 7 R NAポリメラーゼ） 及び 9 ( 7 8 6 番目のグルタミンを他のアミノ酸に置換した T 7 R NAポリメラー ゼ） に示す。 1 7 9番目のリジンを他のアミノ酸に置換した場合、 スクリー二 ングで得られたグルタミン酸置換 （K 1 7 9 E) の他にも、 システ イン置換 （K 1 7 9 C) 、 ァスパラギン置換 （K 1 7 9 N) した変 異体が野生型より耐熱性及び/または比活性が向上しており、 特に グルタミン酸に置換した （K 1 7 9 E) 変異体が、 野生型に対する 耐熱性及び比活性の向上が大きかった （図 8 ) 。
一方、 7 8 6番目のグルタミン酸を他のアミノ酸に置換した場合 、 スクリーニングで得られたロイシン置換 （Q 7 8 6 L) の他にも 、 メチォニン置換 （Q 7 8 6 M) 、 フエ二ルァラニン置換 （Q 7 8
6 F) 、 チロシン置換 （Q 7 8 6 Y) した変異体が野生型より耐熱 性及び Zまたは比活性が向上しており、 特にメチォニンに置換した
(Q 7 8 6 ) 変異体が、 野生型に対する耐熱性及び比活性の向上 が大きかった （図 9 ) 。
実施例 1 4 変異型 T 7 R NAポリメラーゼの熱安定性評価 （そ の 2 )
実施例 1 3で調製した変異型 T 7 R NAポリメラーゼの熱安定性 を以下に示す方法で測定した。
( 1 ) 実施例 1 3で調製した変異型 T 7 RNAポリメラーゼ （Q 7 8 6 M、 Q 7 8 6 L、 Q 7 8 6 F、 Q 7 8 6 Y、 K 1 7 9 E、 K 1
7 9 C、 及び K 1 7 9 N) 及び野生型 T 7 R NAポリメラーゼを以 下に示す組成の緩衝液を用いて 1 0 0 gZmLに調製し、 0. 2 mLの P C Rチューブに 2 5 L分注後、 4 7 にて 1分、 2分、 5分、 1 0分、 2 0分、 3 0分間加熱処理した。
(緩衝液組成）
4 0 mM T r i s H C 1 緩衝液 （ p H 8. 0 )
2 0 mM M g C 1 2
5 mM ジチオスレィ トール 7 0 mM K C 1
0. O l m g /mL 牛血清アルブミン
( 2 ) 加熱処理後の液を用いて、 4 3 °C · 3 0分間の転写反応によ り活性を測定し、 各処理時間の活性を加熱前の活性で割った値を残 存活性とした。
残存活性のグラフを図 1 0に示す。 また、 図 1 0のグラフの傾き から各種変異型 T 7 R NAポリメラーゼ及び野生型の半減期を求め た結果を表 1 に示す。 表 1より各種変異型 T 7 R NAポリメラーゼ は野生株より も半減期が長く、 4 8 °Cにおける熱安定性に優れてい ることがわかる。 また特に、 （37 8 6 及び<37 8 6 ¥変異型丁 7 R N Aポリメラ一ゼの熱安定性が高いことがわかる。 表 1
Figure imgf000042_0001
実施例 1 5 変異ライブラリーの作製 （その 2 )
実施例 8で作製した （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L) 変異体遺伝子配 列 （配列番号 3 5 ) 、 及び前記配列の 5 ' 末端側にヒスチジンへキ サマ一配列を含むプラスミ ドベクタ一 p C D F 2一 T 7 R NA P H i s (K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L) を用いて、 以下の手順で変異を導 入した。
( l ) p C D F 2 -T 7 RNAPH i s (K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L
) を铸型プラスミ ドとして、 以下の試薬組成及び反応条件にて、 ェ ラープ口一ン P C R反応を行なった。
(試薬組成） （総反応液量 ： 1 0 0 H L )
0 • 1から 0. 3 m M (必要に応じて） M n C 1 2
2 0 0 p M プライマ一 p T r c F s (配列番号 1 5 )
2 0 0 p M プライマー p T r c R s (配列番号 1 6 )
1 0 0 n g 铸型プラスミ ド
0 2 mM d A T P
0 2 mM d G T P
1 m d C T P
1 m M d T T P
2 m M M g C 1 2
0 • O l u n i t /zx L T a Q D N Aポリメラーゼ （G o T a q (商品名） 、 P r om e g a製）
酵素に付属する M gフリーのバッファー
(反応条件）
サ一マルサイクラ一 （P e r k i n— E 1 m e r製） を用 い 、 9 4 °Cで 2分加熱後、 9 4 °C • 3 0秒、 5 5 °C · 1分、
7 2 。C • 8分の温度サイクルを 2 5回繰り返した
( 2 ) P C R産物を、 1 %ァガロース電気泳動で泳動後 、 ェチジゥ ムブロマィ F染色により行い、 ゲルから切り出して精製した。
( 3 ) 精製された T 7 RNAポリメラーゼ遺伝子を制限酵素 N c o
I及び P s t Iで消化後、 同酵素で消化した p C D F 2 - T 7 R N
A P H i sプラスミ ド （図 4 ) に T 4リガーゼを用いて 4 °Cで 3 0 分反応させ 、 反応後の D N A溶液を T 7 R N Aポリメラーゼ遺伝子 変異体ライブラリーとした。
( 4 ) 作製した T 7 R NAポリメラーゼ遺伝子変異体ライブラリー を、 実施例 4で作製したプラスミ ド p S T VG F P (図 5 ) を含む 大腸菌 J M 1 0 9株に形質転換し、 前記形質転換液を 3 7 °Cの S O C培地で 1時間培養後、 L B G/ C r b Z C m寒天体培地 （ 1 % ポリペプトン、 0. 5 % 酵母エキス、 1 % N a C l 、 0. 5 % グルコース、 5 0 g /m L カルペニシリ ン、 3 0 g /m L クロラムフエ二コール、 1. 5 % 寒天） で増殖し、 かつ G F P 蛍光を発する株を変異体候補株とした。 なお作製したライブラリ一 は、 その一部を用いて定法に従い大腸菌 J M 1 0 9株に形質転換し プラスミ ドを精製し、 実施例 6に示す方法で塩基配列を決定するこ とでエラ一プローン P C Rの効果を確かめた。
実施例 1 6 高温型 T 7 RNAポリメラ一ゼのスクリーニング （ その 2 )
実施例 1 5で得られた変異株のスクリーニングは実施例 5 と同じ 方法でスク リーニングをを行なった。 スクリーニングの結果、 約 4 0 0 0の変異株から、 実施例 8で作製した （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L) 変異型 T 7 R N Aポリメラーゼより比活性が約 2倍高い菌株が 3 4株得られ、 これを一次候補株とした。 更に前記一次候補株を実 施例 5 と同じ方法で再スクリーニングを行ない、 最終的に （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L ) 変異型 T 7 R NAポリメラーゼより比活性が 2 倍以上高い菌株 1株を選定した。
実施例 1 7 選定株の塩基配列解析
実施例 1 6で選定した菌株を実施例 6 に記載の方法で、 塩基配列 の確認を行ない変異部位を確認した。 その結果、 塩基配列 2 0 5 4 番目のチミンがシトシンに置換されることで G T Gコ ドンが G C G コ ドンに置換されアミノ酸配列 6 8 5番目のバリンがァラニンに変 異していることがわかった。 この変異を有する T 7 R NAポリメラ ーゼを （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 変異体とし、 その 遺伝子配列を配列番号 4 3 にアミノ酸配列を配列番号 4 4に示す。 実施例 1 8 (K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 変異型 T 7 RNAポリメラーゼの作製
実施例 1 6で得られたヒスチジンへキサマー配列を有する （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 三重変異型 T 7 R NAポリメラ ーゼを発現する大腸菌 J M 1 0 9株を用い、 以下の手順で酵素を調 製した。
( 1 ) L B GZC r b液体培地 （ 1 % ポ Uぺプ卜ン、 0. 5 % 酵母エキス、 1 % N a C 1 0. 5 % グルコ —ス、 o 0 a g / m L カルペニシリ ン （ p H 7. 4 ) ) 4 0 m Lに実施例 1 6で得 られた菌株のグリセロールス トックを植菌し 1 0 O mL容量のひ だ付き三角フラスコにて 3 7 °Cで一晩振とう培養した。
( 2 ) 1. 5 Lの 2 XY T G / C r b培地 ( 1 - 6 % ノ ク 卜 卜 U プトン、 1 % パク ト酵母エキス、 0 · 5 % N a C 1 0. 5 % グルコース、 5 0 g / m L カルべ二シ U ノ ( P H 7. 4) ) に前培養液 3 0 m Lを植菌し、 3 L容量の発酵槽にて、 3 7 °Cにて ίロ^した。
( 3 ) ( 2 ) の培養約 3時間後 （O. D. 6 0 0 n m の値としてお よそ 2. 0 ) に 5 0 0 m Mの I P T G (ィソプ Πピル一 /3—チォガ ラク トピラノシド） 1. 5 m Lを添加し、 温 を 3 0 °Cに下げてさ らに 3時間培養した。 培養中酸素濃度は 1 • 6 P P m以上、 p Hは
6. 8力、ら 7. 2の範囲に 周整し こ。
( 4) 培養終了後、 4 °Cにて 1 5分間、 7 0 0 0回転 Z分で遠心分 離し、 湿菌体 2 1 gを得た。 菌体は 1 0 0 m Lの 2 0 m M リン酸 力リゥム緩衝液 （ P H 7 . 0 ) で洗浄し、 直ちに次の処理をしない 場合は一 3 0 °Cに保存した。
( 5 ) 回収した菌体の半分を 0. I mM P M S F及び I mM E D TAを含む 2 0 mM リン酸カリウム緩衝液 （ p H 7. 0 ) 4 2 mLに懸濁し、 菌体破碎した。 菌体破砕は超音波発生装置 （インソ ネー夕一 2 0 1 M (商品名） 、 久保田商事製） を用いて、 5 °Cにて 約 5分間、 約 1 5 0 Wの出力で処理し、 4 °Cにて 1 0分間、 1 2 0 0 0回転 Z分の遠心分離にて可溶性画分を回収した。
( 6 ) 回収した画分 4 5 mLに 5. l mLの 2 M 硫酸アンモニゥ ム、 及び 0. 9 5 mLの 1 0 %ポリエチレンイミンをそれぞれ添加 し、 0 で約 1時間保冷した後、 4 °Cにて 1 0分間、 1 2 0 0 0回 転/分の遠心分離にて上清を回収した。
( 7 ) 回収した上清の一部を用いて、 実施例 7 に示した方法に準じ 、 ヒスチジンへキサマータグを利用したァフィ二テイク口マトダラ フにより精製した。
精製した T 7 RNAポリメラ一ゼのタンパク濃度は 2 8 O nmの 吸光度より求めた。 また 5から 2 0 %濃度の S D S— P A G Eによ り酵素タンパク純度を分析し、 ほぼ単一のタンパクであることを確 認した。
実施例 1 9 変異型 T 7 RNAポリメラ一ゼの活性評価 （その 3
)
実施例 1 8で作製した （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 三重変異型 T 7 R NAポリメラ一ゼの活性評価を実施例 7 に示した インヴィ トロ転写反応によって生成した R NA量を測定する方法で 行なった。 なお、 転写反応温度は 4 3から 5 0 の範囲に設定し、 T 7 R NAポリメラーゼの酵素量を 1 0 n g/// L、 反応時間は 3 0分間とした。 また、 対照として実施例 8で作製した （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L) 二重変異型 T 7 RNAポリメラーゼ、 及び野生型 T 7 R N Aポリメラ一ゼを用いた。
各温度において生成した R NA量を図 1 1 に示した。 図 1 1から (K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 三重変異体は元の変異体 である （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L ) 二重変異体よりも反応温度 4 6 °C以上で比活性が高いことがわかる。
実施例 2 0 変異型 T 7 R N Aポリメラーゼの熱安定性評価 （そ の 3 )
T 7 R N Aポリメラーゼ各種変異体及び野生型の熱安定性は以下 の方法で測定した。
( 1 ) 実施例 1 8で作製した （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 三重変異型 T 7 R NAポリメラーゼ、 実施例 8で作製した （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L) 二重変異体型 T 7 R NAポリメラ一ゼ、 及 び野生型 T 7 R NAポリメラーゼを以下に示す組成の緩衝液を用い て 1 0 0 g ZmLに調製し、 0. 2111乙の？〇 チューブに 2 5 L分注後、 4 8 °Cにて 1分、 2分、 5分、 1 0分、 2 0分間加熱 処理した。
(緩衝液組成）
4 0 mM T r i s - H C 1 緩衝液 （ p H 8 . 0 )
2 0 mM M g C 1 2
5 mM ジチオスレィ トール
7 0 mM K C 1
0. 0 1 m g /mL 牛血清アルブミン
( 2 ) 加熱処理後の液を用いて、 4 3 °Cにて 3 0分間の転写反応に より活性を測定し、 各処理時間の活性を加熱前の活性で割った値を 残存活性とした。
残存活性のグラフを図 1 2に示す。 また、 図 1 2のグラフの傾き から各種変異型 T 7 R NAポリメラ一ゼ及び野生型の半減期を求め た結果を表 2に示す。 表 2より （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 三重変異体は （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L) 二重変異体や野生 株より も半減期が長く、 4 8 における熱安定性に優れていること がわかる。 表 2
Figure imgf000048_0001
実施例 2 1 (Q 7 8 6 L +M 6 8 5 A) 変異型 T 7 R NAポリ メラ一ゼの作製
実施例 1 8で作製した （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 三重変異型 T 7ボリメラーゼより、 以下の方法で （Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 二重変異型 T 7ポリメラ一ゼを作製した。
( 1 ) (K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 三重変異型 T 7 R NAポリメラ一ゼをコードする遺伝子を掙入した p C D F 2— T 7 R NA P H i s (K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) プラスミ ド、 及び野生型 T 7 R NAポリメラ一ゼをコードする遺伝子を揷入 したプラスミ ド P C D F 2— T 7 RNA P (図 3 ) をミニプレップ 法で調製した。
( 2 ) 両プラスミ ド 2 0 0 n gを常法により制限酵素 K p n l及び S a c l で消化し、 ァガロースゲル電気泳動後、 野生型の 4. 5 k b pのフラグメント及び （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 変異体の 1. 4 k b pのフラグメントをゲル抽出法により精製した ( 3 ) 精製した野生型フラグメント 4 0 n gと （K 1 7 9 E + Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 変異体のフラグメント 8 O n gを T 4 リガ一 ゼを用いて 1 6 °Cで 3 0分間反応し、 常法により大腸菌 J M 1 0 9 株に形質転換した。
( 4 ) 前記形質転換体を、 L B GZC r b寒天培地 （ 1 % ポリべ プトン、 0. 5 % 酵母エキス、 1 % N a C l、 0. 5 %ダルコ ース、 1. 5 % 寒天、 5 0 g /m L カルペニシリン ( H 7
. 4 ) ) 上で選別を行ない、 3 7 °Cで一晩培養後に生育してきたコ ロニーのプラスミ ドを調製した。
( 4 ) で調製したプラスミ ドは実施例 6に示す塩基配列決定法に より 目的とする変異の導入を確認した。 当該プラスミ ド遺伝子配列 を配列番号 4 5、 アミノ酸配列を配列番号 4 6に示す。
実施例 2 2 (Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 変異型 T 7 R NAポリ メラーゼの精製
実施例 2 1で作製した （Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 二重変異型 T 7 R NAポリメラ一ゼを発現する大腸菌 J M 1 0 9株を用い、 以下 の方法で （Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 変異型 T 7 R NAポリメラ一 ゼを調製した。
( 1 ) 実施例 1 8に示した手順に準じ培養を行ない、 湿菌体 2 8 g を得た。
( 2 ) 得られた菌体を 0. I mM P M S F及び I mM E D TA を含む 2 0 mM リン酸カリウム緩衝液 （ p H 7. 0 ) 1 1 2 mL に懸濁後、 超音波にて菌体を破砕し、 遠心分離により上清を回収し た。
( 3 ) 得られた酵素抽出液 1 3 5 mLに対し 1 7. 5 mLの 2 M 硫酸アンモニゥム及び 3. 5 mLの 1 0 % ポリエチレンイミンを 添加し、 0 °Cで約 1時間保冷後、 遠心分離により上清を回収した。 ( 4 ) 回収した上清 1 3 O mLに 5 1 gの硫酸アンモニゥムを加え 、 0 °Cで 1時間保冷後、 遠心分離にて回収した沈殿を以下の組成の 緩衝液 3 O mLに溶解させた。
(緩衝液組成）
2 0 m M リン酸力リ
1 m M ジチォスレイ
0 . 1 mM P M S F
1 mM E D T A
( 5 ) ( 4 ) で調製した沈殿溶
卜ダラフィ —にて精製した
( 5一 1 ) 疎水カラム （ T S K 5 P W (商 品名） 、 東ソ一製） により以下
(精製条件）
溶離液 A ：
2 0 mM Uン酸カリゥム緩衝液 2 )
5 0 mM N a C 1
0. 6 M 硫酸アンモニゥム
1 mM D T T
1 mM E D T A
溶離液 B ：
溶離液 Aのうち硫酸アンモニゥム
グラジェン b ：
0分から 6 0分 ： 溶離液 A 1 0 0
6 0分から 1 2 0分 ： 溶離液 A 1
二アグラジェン卜
1 2 0分から 1 3 0分 ： 溶離液 A
1 3 0分 ： 溶離液 A 0 %から 1 0 ジェン卜
検出 ： 2 8 0 n m
流速 ： 4 m L Z分
( 5— 2 ) S D S— P AG Eにより T 7 R NAポリメラ一ゼの含有 量が多い画分 1 0 0 mLを回収し、 3 9 gの硫酸アンモニゥムで塩 祈した。
( 5— 3 ) 遠心分離で回収した塩析物を以下に示す組成の緩衝液 5 mLに溶解させた。
(緩衝液組成）
2 0 mM リン酸カリウム緩衝液 （ p H 7. 6 ) 1 ηι ジチオスレィ トール
0. 1 mM P M S F
1 mM E D T A
( 5 - 4 ) 分画分子量 1 2 0 0 0の透析膜を用いて同組成の緩衝液 にー晚 4 °Cで透析し 、 ィォン交換カラム （T S K g e l D E AE
- 5 P W (商品名） 、 東ソー製） により以下の条件で精製した。
(精製条件）
溶離液 A ：
2 0 mM Uン酸力リゥム緩衝液 （ p H 7. 6 )
5 0 mM N a C 1
1 mM ジチォスレイ トール
1 mM E D T A
溶離液 B ：
溶離液 Aのうち N a C l 濃度を 0. 8 Mに変更した組成 グラジェン h ：
0分から 2 0分 ： 溶離液 A 1 0 0 %
2 0分から 8 0分 ： 溶離液 A 1 0 0 %から 0 %へのリニ アグラジェン卜
8 0分から 9 0分 ： 溶離液 A 0 %
9 0分 ： 溶離液 A 0 %から 1 0 0 %へのステップグラジ ェン卜
検出 ： 2 8 0 n m
流速 ： 4 m L Z分
( 5— 5 ) S D S— P AG E分析で T 7 R N Aポリメラ一ゼの含有 量が多い画分 5 mLを回収し、 1. 9 5 gの硫酸アンモニゥムで塩 祈した。
( 5— 6 ) ゲルろ過精製に用いる緩衝液 1 mLに溶解させ、 ゲルろ 過カラム （T S K g e 1 G 3 0 0 0 S W (商品名） 、 東ソー製） で以下の条件で精製した。
(精製条件）
溶離液 ：
4 0 mM リ ン酸カリウム緩衝液 （ p H 7. 6 )
2 0 0 m N a C 1
2 mM ジチオスレィ 卜ール
0. 2 mM E D T A
検出 ： 2 8 0 n m
流速 ： 5 m L 分
( 5— 7 ) S D S— P AG Eによる分析から T 7 R NAポリメラ一 ゼの含有量が多い画分 4 m Lを回収した。
( 5— 8 ) 回収画分を 1. 5 6 gの硫酸アンモニゥムで塩析したの ち、 脱塩カラム （P D— 1 0 (商品名） 、 G Eヘルスケアバイオサ ィエンス製） を用いてゲルろ過カラム精製と同じ組成の緩衝液で置 換し、 等量のグリセロールを加えて 2. 5 mLとした。
精製した T 7 RNAポリメラ一ゼ二重変異体のタンパク濃度を 2 8 0 n mの吸光度より求めたと ろ 1• Q m g ZmLたつに。 また
5力、ら 2 0 %濃度の S D S一 P A G Eで酵素タンパクを分析し、 ほ ぼ単一なバンドであることを確き口心 5?した
実施例 2 3 変異型 T 7 R N Aポリメラーゼによる核酸増幅反応 実施例 2 2で調製した (Q 7 8 6 L + M 6 8 5 A) 二重変異型 T
7 RNAポリメラーゼを用いた T R C法による核酸増幅を、 以下の 方法でサルモネラ毒素遺伝子 ( s t n R NA) を標的 RNAとし
、 測定した。 なお 、 対照として野生型 T 7 R NAポリメラ一ゼを用 いた。
( 1 ) サルモネラ s t n mRNA検出試薬 （T R C R t e s t s t n -m (商品名） 、 東ソー製） に添付の s t n R NA陽性標 準 (濃度 ： 1 06 コピー / 5 ^ L) を R NA希釈液 （ 1 0 mM T r i s - H C 1 緩衝液 （ ρ Η 8. 0 ) 、 1 mM E D TA 0. 5 L R N a s e I n h i b i t o r , 5 mM ジチオスレ ィ トール） にて、 1 04 コピー / 5 Lとなるよう希釈した。 コン トロール試験区 （陰性） には RNA希釈液のみを用いた。
( 2 ) 以下の組成の反応液 2 0 を 0. 5 mL容の P C R用チュ —ブに分注し、 これに上記 R N A試料 5 jt Lを添加した。
(反応液の組成） （最終反応液量 3 0 /2 Lにおける濃度または 量）
6 0 mM T r i s — H C 1 緩衝彼 （ P
1 7 mM M g C 1 2
1 0 0 m M K C 1
6 U R N a s e I n h i b i t o r
1 mM ジチォスレイ 卜 ル
各 0. 2 5 m M d A T P d C T P
d T T P 3. 6 mM I T P
各 3 0 mM AT P , C T P、 G T P、 U T P 0. 1 2 M 切断用ォリゴヌクレオチド （配列番号 4 7 、 3 ' 末端の水酸基はァミノ化）
1. 0 第一のプライマ一 （配列番号 4 8 ) 0 w M 第二のプライマ一 （配列番号 4 9 )
7. 5 n M インター力レーター性蛍光色素で標識された 核酸プローブ （配列番号 5 0、 5 ' 末端側 1 2番目の 「 A 」 と 1 3番目の 「 A」 の間にインタ一カレーター性蛍光色 '素が漂識され、 かつ 3 ' 末端側の水酸基はグリコール基で 修飾)
1 % D M S〇
調整用蒸留水
( 3 ) ( 2 ) の反応液を変異体は 4 9 °C、 5 0 °C、 5 1 °Cの各温度 で、 野生型は 4 3 °C、 4 9 °Cの各温度で、 5分間保温後、 あらかじ め各温度で 2分間保温した以下に示す組成の酵素液 5 11 Lを添加し た。
(酵素液の組成） （最終反応液量 3 0 X Lにおける濃度または ソルビ卜一ル
3 6 g 牛血清アルブミン
4 U AMV逆転写酵素 （ライフサイエンス製） 4 6 U T 7 R NAポリメラーゼ
調整用蒸留水
( 4) 直接測定可能な温度調節機能付き蛍光光度計を用い、 各温度 で P C Rチュ—ブを保温し、 励起波長 4 7 0 n m、 蛍光波長 5 1 0 n mで、 反応溶液を経時的に測定した。 酵素添加時の時間を 0分として、 反応液の蛍光強度比 （所定時間 の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度値で割った値） の経時 変化を図 1 3 に示した。 野生型 T 7 R NAポリメラーゼを使用した ときは、 反応温度 4 9 °Cの時点で s t n R N Aの増幅が見られな かったのに対し、 （Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 二重変異体は反応温 度 5 1 °Cにおいても s t n R N Aの増幅がみられた。 このことか ら、 （Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 二重変異体は野生型 T 7 R NAポ リメラーゼと比較し、 4 9 °Cから 5 1 といった高温領域での熱安 定性及び Zまたは比活性に優れていることがわかる。
実施例 2 4 T 7 RN Aポリメラ一ゼ変異体による核酸増幅反応 の最低検出濃度測定
実施例 2 2で調製した （Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 二重変異型 T 7 R NAポリメラ一ゼの s t n mR NA標準 R NAに対する最低 検出濃度を確認した。
測定方法は、 反応温度を 5 0 °C (二重変異体） または 4 3 °C (野 生型） 、 標的 R NAの濃度を 1 0、 5 0、 1 0 0、 3 0 0、 5 0 0 、 1 0 0 0コピ一Z 5 Lに変更した他は、 実施例 2 3の同様の方 法で行なった。
各初期 RNAコピー数における （Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 二重 変異型 T 7 R NAポリメラーゼ及び野生型 T 7 R NAポリメラーゼ の検出率を表 3に示した。 表 3より （Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 二 重変異体を用いた時の s t n R NAの検出率は野生型 4 3 °Cの検 出率より高く、 検出率 8 0 %以上を示す最小 R NA濃度で比較する と、 野生型では 1 0 0 0コピー / 5 Lに対し、 （Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 二重変異体は 2 0 0コピー Z 5 /か であった。 両酵素の 最適温度条件で比較した場合、 （Q 7 8 6 L + V 6 8 5 A) 変異体 は野生型より約 5倍感度が向上していることがわかる。 表 3
Figure imgf000056_0001
実施例 2 5 V 6 8 5 A変異型 T 7 R N Aポリメラーゼの作製 実施例 2で作製した p C D F— T 7 R NA P H i s プラスミ ド （ 図 4 ) の T 7 R NAポリメラーゼ遺伝子より、 以下の手順で、 アミ ノ酸配列 6 8 5番目のバリンがァラニンに変異した T 7 R N Aポリ メラーゼ変異体 （V 6 8 5 A変異体） を作製した。
( 1 ) p C D F 2 - T 7 RNA P H i s (図 4 ) を铸型プラスミ ド として、 以下の試薬組成及び反応条件にて、 P C R反応を行なった 。 なお、 合成プライマ一はプライマー V 6 8 5 A F (配列番号 5 1 ) とプライマ一 p T r c R s (配列番号 1 6 ) の組み合わせ、 また は P C D F 2 T 7 F 5 (配列番号 5 2 ) とプライマー V 6 8 5 AR (配列番号 5 3 ) の組み合わせを用いた。
(試薬組成） （総反応液量 ： 5 0 L)
各 Ι Ο Ο ρ Μ 合成 D NAプライマー
5 0 n g 铸型プラスミ ド
0. 1 mM d N T P s 、
0. 0 2 5 u n i t / L D NAポリメラ一ゼ （P r i m e S TAR H S D NA p o l ym e r a s e (商 品名） 、 タカラバイォ製）
酵素に付属するバッファー
(反応条件）
サーマルサイクラ一 （P e r k i n— E l m e r製） を用 い、 9 6 °Cで 3 0秒加熱後、 9 6 X · 3 0秒、 5 0 °C · 3 0 秒、 7 2 X： · 1分の温度サイクルを 3 0回繰り返した。
( 2 ) 反応液を 1 %ァガロース電気泳動で分離後、 ェチジゥムブ口 マイ ド染色を行ない、 染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出 すことで精製した。
( 3 ) ( 2 ) で得られた、 2種類の精製 P C R産物を踌型として、 さらに P C R反応を行ない、 V 6 8 5 A変異体遺伝子を作製した。 なお、 P C R反応における試薬組成、 反応条件、 及び精製操作は、 合成 D NAプライマ一としてプライマー p C D F 2 T 7 F 5 (配列 番号 5 2 ) とプライマ一 p T r c R s (配列番号 1 6 ) の組み合わ せを使用した他は （ 1 ) から （ 2 ) と同じ条件である。
( 4 ) ( 3 ) で得られた D NA断片を、 制限酵素 H i n d i I I 及 び K p n I (夕カラバイオ製） で消化後、 同じ酵素で消化した P C D F 2 - T 7 R NA P H i sベクタ一に T 4 リガ一ゼを用いて 4 °C で 3 0分反応させた。
( 5 ) ( 4 ) の反応液を大腸菌 J M 1 0 9株に形質転換させ、 L B GZC r b寒天培地 （ 1 % ポリペプトン、 0. 5 % 酵母エキス 、 1 % N a C l 、 0. 5 % グルコース、 1. 5 % 寒天、 5 0 II g /mL カルペニシリン （ p H 7. 4 ) ) 上で選択を行ない、 3 7 °Cでー晚培養後に生育してきたコロニーを V 6 8 5 A変異体と した。 さらに V 6 8 5 A変異体は実施例 6に示す塩基配列決定法に より変異の導入を確認した。 その遺伝子配列を配列番号 5 4に、 ァ ミノ酸配列を配列番号 5 5に示す。
実施例 2 6 V 6 8 5 A変異型 T 7 R NAポリメラ一ゼの精製と 活性評価
実施例 2 5で作製した V 6 8 5 A変異型 T 7 R NAポリメラ一ゼ を発現する大腸菌 J M 1 0 9株を用いて、 実施例 7に示した方法で 、 V 6 8 5 A変異型 T 7 R N Aポリメラーゼの調製及び活性評価を 行なった。 なお、 転写反応温度は 4 3から 4 9 °Cの範囲に設定し、 T 7 R NAポリメラ一ゼの酵素量を 2 0 n g
Figure imgf000058_0001
L、 反応時間は 3 0分間とした。 また、 対照として野生型 T 7 R N Aポリメラーゼを 用いた。
各温度において生成した R NA量を図 1 4に示した。 図 1 4から V 6 8 5 A変異型 T 7 RNAポリメラーゼは野生型よりも反応温度 4 5 °C以上で R N A生産量が多く、 高温での比活性が向上している ことがわかる。
実施例 2 7 V 6 8 5 A変異型 T 7 R NAポリメラ一ゼの熱安定 性評価
実施例 2 6で調製した V 6 8 5 A変異型 T 7 R NAポリメラ一ゼ を用いて、 実施例 2 0に示した方法で V 6 8 5 A変異型 T 7 R NA ポリメラ一ゼの熱安定性を評価した。 なお、 加熱処理温度は 4 6 °C に設定し、 処理時間は 1分、 2分、 5分間とした。 また、 対照とし て野生型 T 7 R NAポリメラ一ゼを用いた。
残存活性のグラフを図 1 5に示す。 また、 図 1 5のグラフの傾き から V 6 8 5 A変異型 T 7 R NAポリメラ一ゼ及び野生型の半減期 を求めた結果を表 4に示す。 表 4より V 6 8 5 A変異体は野生型よ りも半減期が長く、 4 6 °Cにおける熱安定性に優れていることがわ かる。 表 4
Figure imgf000058_0002
実施例 2 8 ( V 6 8 5 A + Q 7 8 6 M) 変異型 T 7 R N Aポリ メラーゼの作製
実施例 2 5で作製した、 V 6 8 5 A変異体 T 7 R NAポリメラー ゼ遺伝子を揷入した P C D F— T 7 R NA P H i s プラスミ ド （図 4 ) を用いて、 以下の方法で、 さらにアミノ酸配列 7 8 6番目のグ ル夕ミンがメチォニンに変異した （V 6 8 5 A + Q 7 8 6 M) 二重 変異型 T 7 R NAポリメラーゼを作製した。
( 1 ) V 6 8 5 A変異体の p C D F 2 — T 7 R NA P H i s を铸型 プラスミ ドとして、 以下の試薬組成及び反応条件にて、 P C R反応 を行なった。 なお、 合成プライマーはプライマ一 Q 7 8 6 M F (配 列番号 5 6 ) とプライマ一 p T r c R s (配列番号 1 6 ) の組み合 わせ、 または P C D F 2 T 7 F 5 (配列番号 5 2 ) とプライマ一 Q 7 8 6 M R (配列番号 5 7 ) の組み合わせを用いた。
(試薬組成） （総反応液量 ： 5 0 L)
各 Ι Ο Ο ρ Μ 合成 D NAプライマ一
5 0 n g 铸型プラスミ ド
0. 1 mM d N T P s
0. 0 2 5 u n i t / /x L D NAポリメラ一ゼ （P r i m e S TAR H S D NA p o l ym e r a s e (商 品名） 、 夕カラバイォ製）
酵素に付属するバッファー
(反応条件）
サ一マルサイクラ一 （P e r k i n - E 1 m e r製） を用 レ、、 9 6 °Cで 3 0秒加熱後、 9 6 °C · 3 0秒、 5 0 °C · 3 0 秒、 7 2 °C · 1分の温度サイクルを 3 0回繰り返した。
( 2 ) 反応液を 1 %ァガロース電気泳動で分離後、 ェチジゥムブ口 マイ ド染色を行ない、 染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出 すことで精製した。
( 3 ) ( 2 ) で得られた、 2種類の精製 P C R産物を铸型として、 さらに P C R反応を行ない、 （V 6 8 5 A + Q 7 8 6 ) 変異体遺 伝子を作製した。 なお、 P C R反応における試薬組成、 反応条件、 及び精製操作は、 合成 D NAプライマ一としてプライマ一 p C D F 2 T 7 F 5 (配列番号 5 2 ) とプライマ一 p T r c R s (配列番号 1 6 ) の組み合わせを使用した他は （ 1 ) から （ 2 ) と同じ条件で ある。
( 4 ) ( 3 ) で得られた D NA断片を、 制限酵素 H i n d I I I及 び K p n l (夕カラバイオ製） で消化後、 同じ酵素で消化した P C D F 2 - T 7 R NA P H i sベクターに T 4 リガ一ゼを用いて 4°C で 3 0分反応させた。
( 5 ) ( 4 ) の反応液を大腸菌 J M 1 0 9株に形質転換させ、 L B G/C r b寒天培地 （ 1 % ポリペプトン、 0. 5 % 酵母エキス 、 1 % N a C l 、 0. 5 % グルコース、 1. 5 % 寒天、 5 0 a g /mL カルペニシリン （p H 7. 4 ) ) 上で選択を行ない、 3 7 °Cで一晩培養後に生育してきたコロニーを （V 6 8 5 A + Q 7 8 6 M) 変異体とした。 さらに （V 6 8 5 A + Q 7 8 6 M) 変異体 は実施例 6に示す塩基配列決定法により変異の導入を確認した。 そ の遺伝子配列を配列番号 5 8 に、 アミノ酸配列を配列番号 5 9に示 す。
実施例 2 9 (V 6 8 5 A + Q 7 8 6 M) 変異型 T 7 R NAポリ メラーゼの精製と活性評価
実施例 2 8で作製した （V 6 8 5 A + Q 7 8 6 M) 変異型 T 7 R NAポリメラーゼを発現する大腸菌 J M 1 0 9株を用いて、 実施例 7 に示した方法で、 （V 6 8 5 A + Q 7 8 6 M) 変異型 T 7 R NA ポリメラーゼの調製及び活性評価を行なった。 なお、 転写反応温度 は 4 3から 5 0 の範囲に設定し、 T 7 R NAポリメラーゼの酵素 量を 2 0 n g Z L、 反応時間は 3 0分間とした。 また、 対照とし て野生型 T 7 RNAポリメラーゼを用いた。
各温度において生成した R NA量を図 1 6に示した。 図 1 6から ( V 6 8 5 A + Q 7 8 6 M) 変異型 T 7 R NAポリメラーゼは野生 型よりも反応温度 4 5で以上で R NA生産量が多く、 高温での比活 性が向上していることがわかる。

Claims

1. 配列番号 6に示す野生型 T 7 R NAポリメラ一ゼを構成する アミノ酸配列のうち少なく とも、 7 8 6番目のグルタミン、 1 7 9 番目のリジン及び 6 8 5番目のパリンからなる群から選ばれる少な く とも 1つに相当するア請ミノ酸残基が、 他のアミノ酸に置換され、 野生型 T 7様バクテリオファージの RNAポリメラーゼと比較して 、 熱安定性及び Zまたは比活性が向上していることを特徴とする T 7 R NAポリメラーゼ変異体。
2. 配列番号 6に示す野生型 T 7 R NAポリメラーゼを構成する アミノ酸配列のうち、 少なく とも 7 8 6番囲目のグルタミンに相当す るアミノ酸残基が疎水性アミノ酸に置換され、 野生型 T 7様バクテ リオファージの R N Aポリメラ一ゼと比較して熱安定性及び/また は比活性が向上していることを特徴とする T 7 R N Aポリメラ一ゼ 変異体。
3. 配列番号 6に示す野生型 T 7 R NAポリメラ一ゼを構成する アミノ酸配列のうち、 少なく とも 7 8 6番目のグルタミンに相当す るアミノ酸残基がロイシンまたはメチォニンに置換され、 野生型 T 7様バクテリオファージの R N Aポリメラーゼと比較して熱安定性 及び/または比活性が向上していることを特徴とする T 7 RN Aポ リメラ一ゼ変異体。
4. 配列番号 6 に示す野生型 T 7 RNAポリメラーゼを構成する アミノ酸配列のうち、 さらに、 少なく とも 1 7 9番目のリジンに相 当するアミノ酸残基がグルタミン酸、 ァスパラギン、 システィンの いずれかに置換され、 野生型 T 7様バクテリオファージの R NAポ リメラ一ゼと比較して、 熱安定性及び比活性が向上していることを 特徴とする、 請求項 2又は 3に記載の T 7 R NAポリメラ一ゼ変異 体。
5. 配列番号 6 に示す野生型 T 7 R NAポリメラ一ゼを構成する アミノ酸配列のうち、 少なく とも 1 7 9番目のリジンに相当するァ ミノ酸残基がグルタミン酸、 ァスパラギン、 システィンのいずれか に置換され、 野生型 T 7様バクテリオファージの R NAポリメラー ゼと比較して熱安定性及び または比活性が向上していることを特 徴とする T 7 R NAポリメラ一ゼ変異体。
6. 配列番号 6 に示す野生型 T 7 R NAポリメラーゼを構成する アミノ酸配列のうち、 さらに、 少なく とも 6 8 5番目のバリンに相 当するアミノ酸残基が中性または弱疎水性アミノ酸に置換され、 野 生型 T 7様バクテリオファージの RNAポリメラ一ゼと比較して、 熱安定性及び比活性が向上していることを特徴とする、 請求項 2か ら 5のいずれか 1項に記載の T 7 R N Aポリメラ一ゼ変異体。
7. 配列番号 6 に示す野生型 T 7 R NAポリメラーゼを構成する ァミノ酸配列のうち、 さらに、 少なく とも 6 8 5番目のバリ ンに相 当するアミノ酸残基がァラニンに置換され、 野生型 T 7様バクテリ オファージの R NAポリメラ一ゼと比較して、 熱安定性及び比活性 が向上していることを特徴とする、 請求項 6 に記載の T 7 R NAポ リメラ一ゼ変異体。
8. 配列番号 6 に示す野生型 T 7 RNAポリメラ一ゼを構成する アミノ酸配列のうち、 少なく とも 6 8 5番目のバリンに相当するァ ミノ酸残基が中性または弱疎水性アミノ酸に置換され、 野生型 T 7 R N Aポリメラ一ゼと比較して熱安定性及び Zまたは比活性が向上 していることを特徴とする、 T 7 R NAポリメラーゼ変異体。
9. 配列番号 6 に示す野生型 T 7 RNAポリメラーゼを構成する アミノ酸配列のうち、 少なく とも 6 8 5番目のバリンに相当するァ ミノ酸残基がァラニンに置換され、 野生型 T 7 R NAポリメラーゼ と比較して熱安定性及び zまたは比活性が向上していることを特徴 とする、 T 7 R N Aポリメラ一ゼ変異体。
10. 配列番号 6 に示す野生型 T 7 R NAポリメラ一ゼを構成する ァミノ酸配列のうち、 6 8 5番目のバリ ンに相当するアミノ酸残基 が他のアミノ酸に置換され、 さらに、 1 7 9番目のリジン及び Zま たは 7 8 6番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ 酸残基に置換された T 7 R NAポリメラーゼ変異体。
11. 配列番号 6に示す野生型 T 7 R NAポリメラ一ゼを構成する アミノ酸配列のうち、 6 8 5番目のバリ ンに相当するアミノ酸残基 がァラニンに置換され、 さらに、 1 7 9番目のリジンに相当するァ ミノ酸残基がダルタミン酸に置換、 及び/または 7 8 6番目のダル 夕ミンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはメチォニンに置換 された T 7 RNAポリメラ一ゼ変異体。
12. 請求項 1から 11のいずれか 1項に記載の T 7 R NAポリメラ —ゼ変異体をコードする遺伝子。
13. 請求項 1から 11のいずれか 1項に記載の T 7 R NAポリメラ ーゼ変異体をコードする遺伝子を発現して T 7 R N Aポリメラ一ゼ を生産することのできる細胞。
14. 請求項 1から 11のいずれか 1項に記載の T 7 R N Aポリメラ ーゼ変異体をコードする遺伝子を発現させることによる T 7 R NA ポリメラーゼの生産方法。
15. 請求項 1から 11のいずれか 1項に記載の T 7 RN Aポリメラ —ゼ変異体を用いて R N Aを製造する方法。
16. 請求項 1から 11のいずれか 1項に記載の T 7 R N Aポリメラ ーゼ変異体を用いて R N Aを増幅する方法。
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