JP2003525627A - 増加した熱安定性を有するrnaポリメラーゼ変異体 - Google Patents
増加した熱安定性を有するrnaポリメラーゼ変異体Info
- Publication number
- JP2003525627A JP2003525627A JP2001565862A JP2001565862A JP2003525627A JP 2003525627 A JP2003525627 A JP 2003525627A JP 2001565862 A JP2001565862 A JP 2001565862A JP 2001565862 A JP2001565862 A JP 2001565862A JP 2003525627 A JP2003525627 A JP 2003525627A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna polymerase
- mutation
- rna
- sequence
- mutant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 title claims abstract description 50
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims abstract description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 49
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 37
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 37
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 33
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 32
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 15
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 8
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 5
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 abstract description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 101100273253 Rhizopus niveus RNAP gene Proteins 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 4
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 3
- 101150015069 RNAP gene Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036738 Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-11 Human genes 0.000 description 1
- 101100283445 Homo sapiens GNA11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100293260 Homo sapiens NAA15 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 208000007727 Muscle Tissue Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100026781 N-alpha-acetyltransferase 15, NatA auxiliary subunit Human genes 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 241000567363 Puccinellia maritima Species 0.000 description 1
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 1
- 108091028733 RNTP Proteins 0.000 description 1
- JQYMGXZJTCOARG-UHFFFAOYSA-N Reactive blue 2 Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC(S(O)(=O)=O)=C1 JQYMGXZJTCOARG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241001468001 Salmonella virus SP6 Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 208000021592 benign granular cell tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 201000004130 myoblastoma Diseases 0.000 description 1
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- -1 proline amino acid Chemical class 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07006—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Heat Sensitive Colour Forming Recording (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Description
RNAポリメラーゼに関する。バクテリオファージによりコードされるRNAポ
リメラーゼの一例は、T7 RNAポリメラーゼである。T7は、大腸菌に感染
することができるバクテリオファージである。その他の大腸菌感染性T7類似の
バクテリオファージの例は、T3、φI、φII、W31、H、Y、A1、cr
oC21、C22、及びC23である。サルモネラ・チフィムリウム(Salm
onella typhimurium)感染性バクテリオファージの一例は、
SP6である。バクテリオファージのRNAポリメラーゼは、自己のプロモータ
ー配列に対して高い選択性を有する。T7 RNAポリメラーゼは、T7 RN
Aポリメラーゼプロモーター配列とは結合するが、他のバクテリオファージのプ
ロモーター配列とは結合しないであろう。高度のプロモーター特異性によって、
バクテリオファージの転写反応は、自己のゲノムにのみ起こり、宿主のゲノムで
は起こらないことが確実となる。T7バクテリオファージのヌクレオチド配列の
完全長が既知であり、ファージRNAポリメラーゼは、T7遺伝子1によりコー
ドされている。T7 RNAポリメラーゼと類似しているその他のRNAポリメ
ラーゼは、バクテリオファージSP6及びT3のRNAポリメラーゼである。T
3 RNAPは、T7 RNAPとの約80%の相同性を示す。T7遺伝子1は
、クローニングされ、細菌において発現されており、酵素の大量生産が可能とな
っている(Studierらの米国特許第4952496号)。T7ポリメラー
ゼは、98.6Kdaという分子量を有する883アミノ酸の単鎖タンパク質で
ある。T7 RNAポリメラーゼは、正確に転写されるため補助因子を必要とし
ない。酵素は、単独で、そのプロモーターを認識し、転写を開始させ、RNA転
写物を伸長させ、転写を終結させることができる。T7 RNAポリメラーゼは
、自己のプロモーターからのDNAの転写効率が極めて高く、大腸菌RNAポリ
メラーゼと比較して5倍の速度でRNAを伸長させる。バクテリオファージ由来
のポリメラーゼは、その選択性、活性、及び完全な転写物生成能により、多様な
目的に極めて有用である。
する。
載されている。例えば、WO91/05866には、オルタナティブ発現系が記
載されている。その系は、細菌においてクローニングされた遺伝子を直接転写さ
せるため、バクテリオファージT7プロモーターを使用しようという試みである
。その系は、短縮型T7 RNAポリメラーゼを使用する。その遺伝子は、ヌク
レオチド(野生型T7ポリメラーゼ遺伝子の塩基3809及び3877に相当す
る塩基1個以上)の欠失により変異している。この欠失は、フレームシフトを起
こし、その結果、新たな翻訳終止コドンが作られる。米国特許第号538583
4号にも、変異T7 RNAPが記載されている。米国特許第5385834号
に記載された変異体は、グルタミン酸(222)をリジンに変換する、T7遺伝
子1のヌクレオチド664におけるGからAへの転位である。この変異体は、改
変されたプロモーターを認識し、従って、変異体は、通常は不活性であるT7プ
ロモーター点変異から転写を開始させることができる。
,31:9073−9080,1992及びIkeda,R.A.et al.
Nucl.Acid.Res.,20:2517−2524,1992)は、変
異型T7 RNAP遺伝子配列又はプロモーター配列の活性をスクリーニングす
るために使用されうる2つの適合性プラスミドを記載している。第一のプラスミ
ドは、大腸菌tacプロモーターと連結したT7遺伝子1(T7 RNAポリメ
ラーゼをコードする遺伝子)を保持しており、第二のプラスミドは、CAT(ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)をコードする遺伝子を保持し
ている。T7ポリメラーゼがT7プロモーターと相互作用し、第二のプラスミド
からCAT遺伝子を転写する場合、これらの2つのプラスミドを保持している大
腸菌は、CAM(クロラムフェニコール)耐性である。T7プロモーター又はT
7 RNAポリメラーゼのいずれかが不活性である場合には、CAT遺伝子は転
写されず、従って大腸菌はcam感受性であろう。Ikedaらは、それらのプ
ラスミドを使用して、いくつかの変異のT7 RNAポリメラーゼプロモーター
の活性に対する効果を調査した。T7 RNAポリメラーゼ遺伝子1が適当なプ
ロモーターの調節下にある1つのプラスミド上にあり、T7 RNAポリメラー
ゼプロモーターがCATのような耐性遺伝子を調節する第二のプラスミド上にあ
る、Ikedaらにより記載されたものと同様のプラスミド系を用いて、変異T
7 RNAポリメラーゼの活性に関してスクリーニングすることも可能である。
RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、及びSP6 RNAポリメラ
ーゼ)を利用したインビトロ転写は、分子生物学において広範に適用される手法
となっている。インビトロ転写の後に、多量のRNAバクテリオファージを作製
する手法としてのRNAポリメラーゼは核酸増幅法の一部である。そのような方
法は、例えばNASBA、3SR、及びTMAである。インビトロ転写は、PC
R増幅後の付加的な長さの増幅工程として、PCRとの組み合わせても記載され
ている。
して、より高温で等温増幅法(NASBA、3SR、及びTMA)が実施できる
よう、反応温度を上昇させることが可能であれば有利であろう。より高温でのイ
ンキュベーションで該等温増幅反応を行うと、構築されたRNAがより効率よく
増幅できる。このことは、長いRNA配列が長い場合(500ヌクレオチド超)
の増幅及び多重反応(即ち、1つの反応混合物における複数のRNA配列の増幅
)の場合に重要となる。
ゼの変異体に関する。
ら41℃である)よりも高温で酵素活性を可能にする、可能な変異が多数明らか
となった。バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stear
othermophilus)において、Ikedaら(1992)に記載され
た、2プラスミド系でランダムに変異誘発されたT7 RNAポリメラーゼ配列
が、スクリーニングすることにより分析された。バチルス・ステアロサーモフィ
ルスを高温(45から50℃)で培養すると、これらの温度において、変異型T
7配列がポリメラーゼ活性を示し、より安定なT7 RNAポリメラーゼをコー
ドする場合にのみ、CAM耐性が得られた。バチルス・ステアロサーモフィルス
系において、一方のプラスミドはT7プロモーターの調節下にある抗生物質耐性
遺伝子(CAT)を含有し、他方のプラスミドはバチルスプロモーターの調節下
にあるT7 RNAポリメラーゼの変異体ライブラリーを含有する。変異によっ
て、T7 RNAポリメラーゼが高温において機能することが可能になった場合
、バチルス・ステアロサーモフィルスはCAM耐性となるであろう。安定性が向
上したT7ポリメラーゼ変異体は、同時係属中の共有の出願番号PCT/EP9
9/09716に既に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込
まれる。PCT/EP99/09716に記載された変異のうちの一つは、酵素
の633位におけるセリンからプロリンへの変異であった。本発明により、酵素
の安定性を高めるさらなる変異が見出された。本発明に係る変異には、T7配列
におけるF849I変異、F880Y変異、及びS430P変異が含まれる。好
ましいのは、これらの変異のうちの2個以上を、好ましくはS633P変異と組
み合わせて含む変異体である。本発明に係る変異体は、例えば、F849I変異
又はF880Y変異のいずれかと組み合わせてS633P変異を含みうる。本発
明に係るもう一つの変異体は、F880Y変異と組み合わせてF84I変異を含
む。改良された安定性に関する良好な結果は、S633P変異及びF849I変
異を含み、さらにF880Y変異を含む変異体によっても得られた。本発明の最
も好ましい実施態様は、S430P変異とS633P変異とF8491変異とF
880Y変異とを含む四重変異体(4個の変異を含む変異体)である。この変異
体は、50℃において、野生型酵素よりも少なくとも44倍ほど熱安定性が高ま
る(野生型の1.9分に対し84.5分というT1/2を有する)。さらに、5
0℃における四重変異体の比活性は、50℃における野生型の比活性よりも約1
2倍大きい(野生型の4.8単位/μgに対し、変異体は56.8単位/μg)
。本発明に係る好ましい変異型RNAポリメラーゼは、T7又はSP3バクテリ
オファージ由来の変異RNAポリメラーゼである。これらの酵素間では相同性が
高いので、T7遺伝子1配列での変異は、T3バクテリオファージの対応する遺
伝子配列においても同一の効果を有する可能性が高い。T7 RNAポリメラー
ゼとT3 RNAポリメラーゼとの相同性は80%であるため、T7遺伝子にお
ける633セリン→プロリン変異と同一の効果が、T3 RNAポリメラーゼに
おける634セリン→プロリンアミノ酸変異についても予想されうる。
合は野生型タンパク質と比較するとコードされたRNAポリメラーゼの安定性を
高める変異を1個以上含有するRNAポリメラーゼをコードする遺伝子も、本発
明の一部である。T7 RNAポリメラーゼのアミノ酸配列の633位における
セリンからプロリンへのタンパク質内アミノ酸変化は、T7 RNAポリメラー
ゼヌクレオチド配列の1897位におけるT→C変異に起因している。バクテリ
オファージT7の完全ゲノム配列の3171番目のヌクレオチドであるT7 R
NAポリメラーゼ遺伝子の最初のヌクレオチドを1番として、Dunn,J.J
.及びStudier,F.W.[(1983)Complete nucle
otide sequence of bacteriophage T7 D
NA and the locations of T7 genetic e
lements J.Mol.Biol.166(4),477−535]によ
り発表されたT7 RNAポリメラーゼ野生型配列と比較して変異を、評価する
。
現方法に関する。
可能にする制御配列の調節下に置く。通常、これは、発現させる遺伝子をそのよ
うな制御配列の下流にクローニングして実施される。遺伝子又は遺伝子断片の発
現を可能にする制御配列は、例えば、エンハンサー配列と組み合わせてもよいし
、又は組み合わせなくてもよいプロモーター配列でありうる。これらの配列は、
その天然形態において遺伝子と連結されていることが見出されるプロモーター配
列でありうる。又は、それは、異種プロモーターであってもよい。異種プロモー
ターを使用する利点は、遺伝子の天然プロモーターを認識しない宿主細胞におい
て遺伝子を発現させることが可能になる点である。さらに、異種プロモーターは
、遺伝子の発現を任意の所望の時点で開始させることができるよう、誘導可能プ
ロモーターであってもよい。プロモーター部位は、転写の最初に、RNAポリメ
ラーゼが結合する配列である。プロモーター部位は、それらの起源である細胞の
型に応じて、多様な型で存在する。プロモーター配列は、原核生物、真核生物、
及びウイルスの起源のプロモーターに関して記載されている。前記の型の組換え
DNA分子は、例えば、適当なDNA断片を適当な制限酵素で切断し、制御配列
を含有する断片を同酵素で切断し、そして発現させるべき核酸配列がプロモータ
ー配列の調節下に置かれるよう、両断片を連結することにより作成されうる。有
用な組換え体を作成するための多くの方法が、Sambrook(Sambro
ok et al.,Molecular Cloning,a labora
tory manual,Cold Spring Laboratory P
ress,Cold Spring Harbor,New York(198
9))に記載されている。一般に、組換え核酸配列は、いわゆるベクター分子に
クローニングされよう。次いで、クローニングされた核酸配列を細胞へと運ぶた
めに、適当な宿主細胞において自己複製能を有する組換えベクター分子が使用さ
れうる。これは、組換えベクター分子の複製が起こる細胞であり得る。それは、
本発明に係る変異型RNAポリメラーゼが発現されるよう、ベクターの制御配列
が認識されるような細胞であってもよい。細菌において使用するためのベクター
、例えばpBR322、325、及び328、様々なpUCベクター、即ちpU
C8、9、18、19、特異的発現ベクター;pGEM、pGEX、及びBlu
escript(R)、バクテリオファージに基づくベクター;ラムダ−gtW
es、Charon28、M13由来ファージ、SV40、パピローマウイルス
、アデノウイルス、又はポリオーマウイルスに基づくウイルス配列を含有する真
核細胞における発現のためのベクターを含む、広範囲のベクターが現在既知であ
る(Rodriquez,R.L.及びDenhardt,D.T.編;Vec
tors:A survey of molecular cloning v
ectors and their uses,Butterworths(1
988),Lenstra et al.Arch.Virol.;110:1
−24(1990))。変異型RNAポリメラーゼの発現を可能にする制御配列
の調節下にある核酸配列を含む全ての組換え分子が、本発明の一部と見なされる
。
異型RNAポリメラーゼの発現を可能にする制御配列の調節下にある変異型RN
Aポリメラーゼをコードする組換え核酸配列を含有する宿主細胞を含む。本発明
は、変異型RNAポリメラーゼをコードする核酸配列、又は変異型RNAポリメ
ラーゼの発現を可能にする制御配列の調節下にある変異型RNAポリメラーゼを
コードする組換え核酸分子を含有するウイルスベクターを含有する宿主細胞も含
む。高頻度に使用される発現系は、細菌、酵母、真菌、昆虫、及び哺乳動物の細
胞の発現系である。そのような系は、当分野において周知であり、容易に入手可
能であり、例えばClontech Laboratories,Inc.40
30 Fablan Way,Palo Alto,California 9
4303−4607,USAより市販されている。宿主細胞は、pBR322の
ような細菌に基づくベクター、又はpGEMのような細菌発現ベクター、又はバ
クテリオファージと組み合わされた、細菌起源、例えば大腸菌、バチルス・ズブ
チリス、及びラクトバチルス属の細胞であり得る。宿主細胞は、真核生物起源の
細胞、例えば酵母特異的ベクター分子と組み合わされた酵母細胞、又はベクター
もしくは組換えバキュロウイルスと組み合わされた昆虫細胞(Luckow e
t al;Bio−technology 6:47−55(1988))、例
えばTiプラスミドに基づくベクターもしくは植物ウイルスベクターと組み合わ
された植物細胞(Barton,K.A.et al;Cell 32:103
3(1983))、やはり適切なベクターもしくは組換えウイルスと組み合わさ
れたHela細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、もしくはCr
andellネコ腎細胞のような哺乳動物細胞のような高等真核生物の細胞であ
ってもよい。
調節配列とを含む発現ベクター、及びそれらで形質転換された宿主細胞も、本発
明の一部である。
れる過程、及びRNAポリメラーゼが例えば高温で使用され、従って改良された
安定性が向上し有利であろう過程、全てにおいて有用である。本発明に係る変異
型RNAポリメラーゼは、核酸の増幅のための等温転写介在増幅過程において特
に有用であろう。従って、等温転写介在増幅法におけるRNAポリメラーゼの使
用も、本発明の一部である。
む鋳型からの複数のRNAコピーの転写を含む。これらの方法によると、複数の
RNAコピーが、RNAポリメラーゼにより認識される機能的プロモーターを含
むDNA鋳型から転写される。該コピーは、再び標的として使用され、それらか
ら、ある量のDNA鋳型が新たに得られる、等である。そのような方法は、Gi
ngerasらのWO88/10315及びBurgらのWO89/1050に
記載されている。等温転写介在増幅技術は、DaveyらのEP323822(
NASBA法と関連)、GingerasらのEP373960、及びKaci
anらのEP408295に記載されている。転写介在増幅反応は、熱安定酵素
を用いても実施されうる。転写介在増幅は、通常、およそセ氏37から41度の
温度で実施される。これらの熱安定酵素は、より高温(41℃超)での反応が可
能である。そのような熱安定法は、Toyo Boseki KKの名称で出願
されたEP682121に記載されている。
法は、等温連続法である。この方法は、増幅を達成するために、RNA依存性D
NAポリメラーゼ活性、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性、RNase(H
)活性、及びRNAポリメラーゼ活性という4つの酵素活性が必要とされる。こ
れらの活性のうちのいくつかは、1つの酵素で一体化されうるため、通常必要な
のは2又は3個の酵素である。RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵
素は、RNA鋳型からDNAを合成する酵素である。DNA依存性DNAポリメ
ラーゼは、DNA鋳型からDNAを合成する。転写介在増幅反応においては、A
MV(トリ筋芽細胞腫ウイルス)又はMMLV(モロニーマウス白血病ウイルス
)のような逆転写酵素が、これらの活性のため使用されうる。そのような酵素は
、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性及びDNA依存性DNAポリメラーゼ活
性を有するが、内因性RNaseH活性は有しない。さらに、大腸菌RNase
HのようなRNaseHが、転写介在増幅反応の反応混合物に添加されうる。
Aポリメラーゼである。従って、複数のRNAコピーを転写するために使用され
る鋳型に組み込まれるプロモーターは、T7プロモーターであろう。通常、標的
配列を含む核酸から、プロモーターを含む鋳型が作出されなければならない。該
核酸は、増幅反応のために投入される出発材料中に存在しうる。出発材料中に存
在する核酸は、通常、はるかに長い配列の一部に標的配列を含有するであろう。
標的配列の3’末及び5’末の両方に、別の核酸配列が存在していてもよい。増
幅反応は、出発材料由来のこの核酸と、前記活性を共同で提供する適切な酵素と
、少なくとも1個、通常は2個のオリゴヌクレオチドとを混合することにより開
始する。これらのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1個は、プロモーター
の配列を含むべきである。
るが、一本鎖又は二本鎖のDNAも、インプット材料として使用されうる。転写
介在増幅法が、標的配列の3’末及び5’末の両方に付加的な配列を含む(「プ
ラス」方向の)一本鎖RNAを含む試料に対して実施される場合、先行技術に記
載されたような方法により便利に使用されるオリゴヌクレオチド対は、 − 5’末にプロモーター(好ましくは、T7プロモーター)の配列が接着して
いる、標的配列の3’末とハイブリダイズすることができる第一オリゴヌクレオ
チド(通常、「プロモーター−オリゴヌクレオチド」と呼ばれる)(このオリゴ
ヌクレオチドのハイブリダイズする部分は、インプット材料として使用されるプ
ラスRNAと反対の極性を有する)、 − 標的配列の3’末を含む第二オリゴヌクレオチド(「プライマー」)(この
オリゴヌクレオチドは、プラスRNAと同一の極性を有する) からなるであろう。そのようなオリゴヌクレオチド対を、適切な活性を有する全
ての酵素と、十分な量の必要なリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチド
と共に1つの反応混合物中に混合し、適切な条件下で(即ち、適切な緩衝条件下
で、かつ適切な温度で)で十分な時間、保持した場合に、等温連続増幅反応が起
こる。
。ポリメラーゼ連鎖反応では、バクテリオファージRNAポリメラーゼのための
プロモーター配列、特にT7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列を組み込
んでいるプライマーが使用される場合がある。これによって、PCR反応のDN
A産物を生成するためのRNAの転写が可能となる。この場合にも、本発明に係
るRNAポリメラーゼが適用されうる。
性を有する酵素と、RnaseH活性を有する酵素とを含む、等温転写介在増幅
反応において使用するための酵素混合物も、本発明の一部である。
以上の)変異の導入 変異の置換は、QuickChange部位特異的変異誘発キット(STRA
TAGENE)を使用した部位特異的変異誘発により実施した。全ての手順を、
キットに同封された製造業者のプロトコルに従い実施した。T7 RNAポリメ
ラーゼのアミノ酸633位におけるセリンからプロリンへの変異の導入に使用し
たオリゴプライマーは、以下の通りである。 A:5’−GTG−TGA−CTA−AGC−GTC−CGG−TCA−TGA
−CGC−TGG−3’ B:5’−CCA−GCG−TCA−TGA−CCG−GAC−GCT−TAG
−TCA−CAC−3’ オリゴヌクレオチドBは、オリゴヌクレオチドAと相補的である。下線が施さ
れた配列は、T7 RNAポリメラーゼヌクレオチド配列の1897位における
T→C変異を含むオリゴヌクレオチド配列を含有する変異クローンのスクリーニ
ングに使用されるMspI制限部位を示す。その他の変異を導入するために使用
したプライマーを、以下に示す。
合した、データベースに発表されているような完全なT7 RNAポリメラーゼ
野生型遺伝子配列(Dunn,J.J.and Studiew,F.W.(1
983)Complete nucleotide sequence of
bacteriophage T7 DNA and the locatio
ns of T7 genetic elements J.Mol.Biol
.166(4),477−535)を含有している。T7 DNA(Sigma D4931)を鋳型として使用したPCRにより、T7 RNAポリメラーゼ
遺伝子をクローニングした。次いで、tag配列をpUC18のマルチプルクロ
ーニングサイト(MCS)へ挿入することにより予め作成しておいたpUC18
(tag)プラスミドの適切な制限部位へ、PCR増幅されたT7 RNAポリ
メラーゼDNAをクローニングした。配列決定によりT7 RNAP遺伝子のD
NA配列が挿入されたことを確認した後、Tag−T7 RNAポリメラーゼ融
合遺伝子を、pKK223−3発現プラスミド(Pharmacia Biot
ech 27−4935−01)の適切な部位へとサブクローニングし、Tag
−T7 RNAP/pKK223−3を作成した。以下の温度周期プロトコルに
よりPCR反応を実施した。 95℃ 30秒 55℃ 1分 68℃ 14分/18サイクル PCR反応の後、DpnI制限酵素10単位を添加し、37℃で1時間インキュ
ベートした。次いで、DpnI処理されたDNA1μlを使用して、大腸菌JM
109を形質転換した。最後に、MspI制限酵素を使用したプラスミドDNA
のスクリーニングにより、変異T7 RNAポリメラーゼクローンを単離した。
同断片との置換により、複数個の変異(アミノ酸置換)を含有する(1個以上の
)変異T7 RNAポリメラーゼ遺伝子を構築した。置換のため使用した制限部
位は、以下の通りであった。
+S430P)の比活性の比較 以下のプロトコルを使用して、T7 RNAポリメラーゼの酵素的転写活性を
決定する。
。
。
.5mlを添加して反応を停止させ、氷上で10分間インキュベートする。
る。 活性(単位/μl)=[cpm(試料)−cpm(ブランク)]×24/cpm
(全) (1単位とは、60分間に1nmolの標識ヌクレオチド三リン酸の酸不溶性材
料への組み込みを触媒する活性と定義される)
する。 希釈緩衝液:20mM KPO4(pH7.5) 100mM NaCl 1mM EDTA 1mM DTT 50%(V/V)グリセロール
ーゼの半減期T1/2を決定する。
gCl2、及び50mM DTT)
(実施例3参照)へと移し、(残存)活性を測定する。
ブランク)]−[cpm(t=0)−cpm(ブランク)]]をプロットする。
調査した。最終的に決定された条件は、以下の通りであった。精製条件に関して
は、Studier(P.N.A.S.,USA,81,2035−2039,
1984)による発表を参照のこと。
LB培地2mlへと接種し、30℃で16時間培養(種種培養)。
種培養)。
培養(主培養)。(使用される培地は、全て、1ml当たり50μgのアンピシ
リンを含有する。)
り破砕した。次いで、この溶解物を遠心分離し、上清(粗抽出物)を得た。
し、核酸を沈殿させた。遠心分離により上清を得た。
混合物を45℃で30分間攪拌し、沈殿を可能にした。硫酸アンモニウム沈殿物
を遠心分離により収集し、緩衝液B(+50mM NaCl)200mlに溶解
させ、次いで同緩衝液に対し透析した。
カラムに担荷させた。カラムを緩衝液B(+100mM NaCl)で洗浄し、
緩衝液B(+2mM NaCl)でタンパク質を溶出させた。ピーク画分をプー
ルした。
で、硫酸アンモニウム沈殿物を収集し、緩衝液B(+25mM NaCl)20
0mlに溶解させ、同緩衝液に対し透析し、DEAE−セルロファイン(cel
lulofine)カラムの200mlカラムに担荷させた。カラムを緩衝液B
(+25mM NaCl)で洗浄し、25mM NaClから150mM Na
Clへの勾配1000mlでタンパク質を溶出させた。ピーク画分を収集した。
で、硫酸アンモニウム沈殿物を収集し、保存緩衝液30mlに溶解させ、同緩衝
液に対し透析した。 得られた酵素は、最後に濾過し、−300℃で保存した。
l Assays)及びインビトロ転写アッセイにより試験した。
37℃で4時間インキュベートした。酸可溶性DNAの放出は、0.01%/単
位/時間である。
間インキュベートする。アガロースゲル電気泳動におけるバンドパターンに可視
的変化は検出されない。
ger)2μgと共に37℃で4時間インキュベートする。アガロースゲル電気
泳動におけるバンドパターンに可視的変化は検出されない。
写アッセイにおいて使用した。混合物をセ氏37度及び48度の両方で1時間イ
ンキュベートした。精製された酵素によりセ氏48度で産生されたRNAの量は
、市販の酵素により37度で産生されたRNAの量とほぼ同一であった。
ある。
Claims (10)
- 【請求項1】 S430P、F8491I、及びF880Yからなる群より
選択される変異を少なくとも1個含み、安定性が改良された、野生型配列と比較
して変異しているT7 RNAポリメラーゼ。 - 【請求項2】 少なくとも、アミノ酸配列の633位にセリンからプロリン
へのアミノ酸変化を有するという点でも変異している、請求項1記載のT7 R
NAポリメラーゼ。 - 【請求項3】 該群より選択される変異を2個以上含むことを特徴とする、
請求項1記載のT7 RNAポリメラーゼ。 - 【請求項4】 S663P変異とF849I変異とF880Y変異とを少な
くとも含む、請求項2記載のT7 RNAポリメラーゼ。 - 【請求項5】 S430P変異とS663P変異とF849I変異とF88
0Y変異とを含む、請求項4記載のT7 RNAポリメラーゼ。 - 【請求項6】 請求項1記載の変異型T7 RNAポリメラーゼをコードす
る、RNAポリメラーゼをコードする遺伝子。 - 【請求項7】 請求項6記載の遺伝子と適当な発現調節配列とを含む発現ベ
クター。 - 【請求項8】 請求項7記載のベクターで形質転換されており、かつ変異型
T7 RNAポリメラーゼを発現することができる細胞。 - 【請求項9】 等温転写介在核酸増幅反応における請求項1から5のいずれ
かに記載のRNAポリメラーゼの使用。 - 【請求項10】 −請求項1から5のいずれかに記載のRNAポリメラーゼ
と、 −逆転写酵素活性を有し、場合によりRnaseH活性も有する酵素とを含む
、等温転写介在増幅反応において使用するための酵素混合物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP00200787 | 2000-03-07 | ||
EP00200787.0 | 2000-03-07 | ||
PCT/EP2001/002327 WO2001066705A1 (en) | 2000-03-07 | 2001-03-01 | Rna polymerase mutants with increased thermostability |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003525627A true JP2003525627A (ja) | 2003-09-02 |
JP2003525627A5 JP2003525627A5 (ja) | 2008-04-17 |
JP4832694B2 JP4832694B2 (ja) | 2011-12-07 |
Family
ID=8171152
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001565862A Expired - Lifetime JP4832694B2 (ja) | 2000-03-07 | 2001-03-01 | 増加した熱安定性を有するrnaポリメラーゼ変異体 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7507567B2 (ja) |
EP (1) | EP1261696B1 (ja) |
JP (1) | JP4832694B2 (ja) |
AT (1) | ATE294855T1 (ja) |
AU (1) | AU2001237425A1 (ja) |
CA (1) | CA2400049C (ja) |
DE (1) | DE60110564T2 (ja) |
ES (1) | ES2242733T3 (ja) |
WO (1) | WO2001066705A1 (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009136153A (ja) * | 2007-12-03 | 2009-06-25 | Tosoh Corp | 変異型rnaポリメラーゼ |
WO2009113718A1 (ja) * | 2008-03-11 | 2009-09-17 | 東ソー株式会社 | 機能改善したrnaポリメラーゼ変異体 |
WO2010016621A1 (ja) | 2008-08-08 | 2010-02-11 | 東ソー株式会社 | 機能改善したrnaポリメラーゼ変異体 |
JP2011224002A (ja) * | 2010-04-16 | 2011-11-10 | F Hoffmann La Roche Ag | 増強された熱安定性を有する新規なt7rnaポリメラーゼ変異体 |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2611922A1 (en) | 2010-08-31 | 2013-07-10 | Greenlight Biosciences, Inc. | Methods for control of flux in metabolic pathways through protease manipulation |
US9062292B2 (en) | 2010-09-13 | 2015-06-23 | Enzo Life Sciences Inc. | Mutant T7 polymerases |
FR2981088B1 (fr) | 2011-10-06 | 2013-11-29 | Biomerieux Sa | Arn polymerases mutees |
US9045740B2 (en) * | 2012-02-24 | 2015-06-02 | University Of Massachusetts | Modified T7-related RNA polymerases and methods of use thereof |
AU2014306074B2 (en) | 2013-08-05 | 2018-08-30 | Greenlight Biosciences, Inc. | Engineered proteins with a protease cleavage site |
WO2015024017A2 (en) * | 2013-08-16 | 2015-02-19 | President And Fellows Of Harvard College | Rna polymerase, methods of purification and methods of use |
WO2015143318A1 (en) * | 2014-03-20 | 2015-09-24 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | T7 rna polymerase variants with expanded substrate range and enhanced transcriptional yield |
BR112017020690A2 (pt) | 2015-03-30 | 2018-06-26 | Greenlight Biosciences Inc | produção livre de células de ácido ribonucleico |
WO2017001058A1 (en) * | 2015-07-01 | 2017-01-05 | Curevac Ag | Method for analysis of an rna molecule |
CN108779446B (zh) | 2016-01-13 | 2023-04-21 | 新英格兰生物实验室公司 | T7 rna聚合酶的热稳定变体 |
SG11201808721YA (en) | 2016-04-06 | 2018-11-29 | Greenlight Biosciences Inc | Cell-free production of ribonucleic acid |
US10034951B1 (en) | 2017-06-21 | 2018-07-31 | New England Biolabs, Inc. | Use of thermostable RNA polymerases to produce RNAs having reduced immunogenicity |
CN111032863A (zh) | 2017-06-30 | 2020-04-17 | 科德克希思公司 | T7 rna聚合酶变体 |
CN111417724A (zh) | 2017-06-30 | 2020-07-14 | 科德克希思公司 | T7 rna聚合酶变体 |
AR113764A1 (es) | 2017-10-11 | 2020-06-10 | Greenlight Biosciences Inc | Métodos y composiciones para la producción de nucleósido trifosfato y ácido ribonucleico |
CA3095620A1 (en) * | 2018-04-10 | 2019-10-17 | Greenlight Biosciences, Inc. | T7 rna polymerase variants |
US20230076421A1 (en) * | 2019-05-24 | 2023-03-09 | Primordial Genetics Inc. | Methods and compositions for manufacturing polynucleotides |
CN112980811B (zh) * | 2021-03-06 | 2022-02-25 | 苏州瀚源新酶生物科技有限公司 | Rna聚合酶突变体及其应用、重组载体及其制备方法和应用、重组工程菌及其应用 |
EP4108770A1 (en) | 2021-06-24 | 2022-12-28 | Aptamimetics GmbH | Age-selex method for aptamer identification and use |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH1175867A (ja) * | 1997-07-07 | 1999-03-23 | Rikagaku Kenkyusho | Rnaポリメラーゼ |
JP2001054387A (ja) * | 1999-08-17 | 2001-02-27 | Toyobo Co Ltd | 改良されたrnaポリメラーゼ |
JP2002532095A (ja) * | 1998-12-11 | 2002-10-02 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | 安定性を増大させたrnaポリメラーゼ変異体 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4952496A (en) * | 1984-03-30 | 1990-08-28 | Associated Universities, Inc. | Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase |
CA1340807C (en) | 1988-02-24 | 1999-11-02 | Lawrence T. Malek | Nucleic acid amplification process |
US5385834A (en) | 1993-08-13 | 1995-01-31 | Georgia Tech Research Corporation | Mutant T7 RNA polymerase GP1(lys222) exhibiting altered promoter recognition |
FR2761695B1 (fr) | 1997-04-04 | 1999-09-24 | Bio Merieux | Arn polymerase fonctionnant preferentiellement sur matrice d'arn, sa preparation et son utilisation |
-
2001
- 2001-03-01 ES ES01909810T patent/ES2242733T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-01 DE DE60110564T patent/DE60110564T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-01 JP JP2001565862A patent/JP4832694B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-01 US US10/220,908 patent/US7507567B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-01 WO PCT/EP2001/002327 patent/WO2001066705A1/en active IP Right Grant
- 2001-03-01 AU AU2001237425A patent/AU2001237425A1/en not_active Abandoned
- 2001-03-01 EP EP01909810A patent/EP1261696B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-01 AT AT01909810T patent/ATE294855T1/de active
- 2001-03-01 CA CA2400049A patent/CA2400049C/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH1175867A (ja) * | 1997-07-07 | 1999-03-23 | Rikagaku Kenkyusho | Rnaポリメラーゼ |
JP2002532095A (ja) * | 1998-12-11 | 2002-10-02 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | 安定性を増大させたrnaポリメラーゼ変異体 |
JP2001054387A (ja) * | 1999-08-17 | 2001-02-27 | Toyobo Co Ltd | 改良されたrnaポリメラーゼ |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6010053354, Biochemistry, 1997, 36, 2908−18 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009136153A (ja) * | 2007-12-03 | 2009-06-25 | Tosoh Corp | 変異型rnaポリメラーゼ |
WO2009113718A1 (ja) * | 2008-03-11 | 2009-09-17 | 東ソー株式会社 | 機能改善したrnaポリメラーゼ変異体 |
WO2010016621A1 (ja) | 2008-08-08 | 2010-02-11 | 東ソー株式会社 | 機能改善したrnaポリメラーゼ変異体 |
US8551752B2 (en) | 2008-08-08 | 2013-10-08 | Tosoh Corporation | RNA polymerase mutant with improved functions |
JP5625908B2 (ja) * | 2008-08-08 | 2014-11-19 | 東ソー株式会社 | 機能改善したrnaポリメラーゼ変異体 |
JP2011224002A (ja) * | 2010-04-16 | 2011-11-10 | F Hoffmann La Roche Ag | 増強された熱安定性を有する新規なt7rnaポリメラーゼ変異体 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1261696A1 (en) | 2002-12-04 |
ES2242733T3 (es) | 2005-11-16 |
ATE294855T1 (de) | 2005-05-15 |
AU2001237425A1 (en) | 2001-09-17 |
CA2400049C (en) | 2010-10-05 |
US20030175738A1 (en) | 2003-09-18 |
US7507567B2 (en) | 2009-03-24 |
DE60110564T2 (de) | 2006-01-19 |
DE60110564D1 (en) | 2005-06-09 |
WO2001066705A1 (en) | 2001-09-13 |
CA2400049A1 (en) | 2001-09-13 |
JP4832694B2 (ja) | 2011-12-07 |
EP1261696B1 (en) | 2005-05-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4832694B2 (ja) | 増加した熱安定性を有するrnaポリメラーゼ変異体 | |
US20060252083A1 (en) | Methods of synthesizing polynucleotides using thermostable enzymes | |
US6399320B1 (en) | Modified DNA-polymerase from carboxydothermus hydrogenoformans and its use for coupled reverse transcription and polymerase chain reaction | |
US8551752B2 (en) | RNA polymerase mutant with improved functions | |
RU2769465C2 (ru) | Способ получения днк и набор для связывания фрагментов днк | |
JPH09511643A (ja) | バチルス・ステアロサーモフィルス由来の精製dnaポリメラーゼ | |
JP2009520461A (ja) | Ssb−ポリメラーゼ融合タンパク質 | |
EP1154017B1 (en) | Modified thermostable dna polymerase from pyrococcus kodakarensis | |
JP4485066B2 (ja) | 安定性を増大させたrnaポリメラーゼ変異体 | |
KR20230075403A (ko) | 활성 및 열안정성이 증가된 역전사효소 돌연변이체 | |
JP2003525603A (ja) | サーモアクチノマイセス−ブルガリス由来の好熱性ポリメラーゼ | |
JP2002506626A (ja) | Themoanaerobacterthermohydrosulfricus由来の熱安定性DNAポリメラーゼ | |
WO2006081463A2 (en) | Thermococcus zilligii dna polymerases and variants thereof | |
EP0835935A1 (en) | Thermostable DNA Polymerase from Anaerocellum thermophilum | |
JP2002543795A (ja) | 核酸合成の感度および特異性の増大のための組成物および方法 | |
JP4808361B2 (ja) | 新規dna合成酵素 | |
EP0922765B1 (en) | Modified DNA-polymerase from carboxydothermus hydrogenoformans and its use for coupled reverse transcription and polymerase chain reaction | |
AU2001286268B2 (en) | Method of forming complex | |
US20040157213A1 (en) | Fungal reverse transcriptases with enhanced capabilities |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080222 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080222 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100914 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20101208 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20101215 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110314 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110412 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110808 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20110816 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110906 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110921 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4832694 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140930 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |