JP2011224002A - 増強された熱安定性を有する新規なt7rnaポリメラーゼ変異体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】Val426、Ser633、Val650、Thr654、Ala702、Val795、およびそれらの組合せの位置で示された、新規な突然変異を導入することにより得られた、T7RNAポリメラーゼの改善された熱安定性をもたらす変異体。
【選択図】なし
Description
本発明の第1の態様は、T7 RNAポリメラーゼの変異型ポリペプチド(T7変異体)であり、ただし、該T7変異体は、(i) DNA依存性RNAポリメラーゼ活性、(ii) 配列番号2で示される883個のアミノ酸のT7 RNAポリメラーゼポリペプチド(野生型参照)と比較して増強された熱安定性、および(iii) 野生型参照と比較して異なるアミノ酸組成により特徴付けられ、該変異体は、異なる位置の少なくとも1個のアミノ酸であって4個までのアミノ酸が置換されている野生型参照のポリペプチドを含み、野生型参照のN末端から番号付けされたVal426、Ser633、Val650、Thr654、Ala702、およびVal795からなる群から選択されるアミノ酸が異なるアミノ酸に置換され、かつ該異なるアミノ酸は、異なるアミノ酸がVal426と置き換わる場合はLeu、Ile、およびPhe(Val426Leu、Val426Ile、Val426Phe)、異なるアミノ酸がSer633と置き換わる場合はValおよびMet(Ser633Val、Ser633Met)、異なるアミノ酸がVal650と置き換わる場合はLeu(Val650Leu)、異なるアミノ酸がThr654と置き換わる場合はLeu(Thr654Leu)、異なるアミノ酸がAla702と置き換わる場合はVal(Ala702Val)、異なるアミノ酸がVal795と置き換わる場合はIle(Val795Ile)からなる群から選択される。
・ 異なるアミノ酸がVal426と置き換わる場合はLeu、Ile、およびPhe(Val426Leu、Val426Ile、Val426Phe)、
・ 異なるアミノ酸がSer633と置き換わる場合はValおよびMet(Ser633Val、Ser633Met)、
・ 異なるアミノ酸がVal650と置き換わる場合はLeu(Val650Leu)、
・ 異なるアミノ酸がThr654と置き換わる場合はLeu(Thr654Leu)、
・ 異なるアミノ酸がAla702と置き換わる場合はVal(Ala702Val)、
・ 異なるアミノ酸がVal795と置き換わる場合はIle(Val795Ile)、
からなる群から選択される。
該変異体が、異なる位置の少なくとも1個のアミノ酸であって4個までのアミノ酸が置換されている野生型参照のポリペプチドを含み、
野生型参照のN末端から番号付けされたVal426、Ser633、Val650、Thr654、Ala702、およびVal795からなる群から選択されるアミノ酸が異なるアミノ酸に置換され、かつ
該異なるアミノ酸が:
・ 異なるアミノ酸がVal426と置き換わる場合はLeu、Ile、およびPhe(Val426Leu、Val426Ile、Val426Phe)、
・ 異なるアミノ酸がSer633と置き換わる場合はValおよびMet(Ser633Val、Ser633Met)、
・ 異なるアミノ酸がVal650と置き換わる場合はLeu(Val650Leu)、
・ 異なるアミノ酸がThr654と置き換わる場合はLeu(Thr654Leu)、
・ 異なるアミノ酸がAla702と置き換わる場合はVal(Ala702Val)、
・ 異なるアミノ酸がVal795と置き換わる場合はIle(Val795Ile)、
からなる群から選択される、上記T7変異体。
(a) 野生型参照のN末端から番号付けされたVal426、Ser633、Val650、Thr654、Ala702、およびVal795からなる群からアミノ酸を選択する工程、
(b) 選択されたアミノ酸を異なるアミノ酸で置換してT7変異体を形成する工程、ただし、異なるアミノ酸は、
・ 異なるアミノ酸がVal426と置き換わる場合はLeu、Ile、およびPhe(Val426Leu、Val426Ile、Val426Phe)、
・ 異なるアミノ酸がSer633と置き換わる場合はValおよびMet(Ser633Val、Ser633Met)、
・ 異なるアミノ酸がVal650と置き換わる場合はLeu(Val650Leu)、
・ 異なるアミノ酸がThr654と置き換わる場合はLeu(Thr654Leu)、
・ 異なるアミノ酸がAla702と置き換わる場合はVal(Ala702Val)、
・ 異なるアミノ酸がVal795と置き換わる場合はIle(Val795Ile)、
からなる群から選択され、
異なる位置の野生型参照の少なくとも1個のアミノ酸であって4個までのアミノ酸は置換される、
(c) 工程(b)の置換されたアミノ酸を有するT7変異体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子を発現系形質転換宿主生物中で発現させて、発現されたT7変異体を発現系宿主生物から単離する工程、
を含み、それによりT7変異体を製造する、上記方法。
(a) 項目1〜20のいずれかに記載のポリペプチドのアミノ酸配列または項目21〜23のいずれかに記載の方法により取得可能なポリペプチドのアミノ酸配列を逆転写することにより核酸配列を得る工程、続いて、
(b) 工程(a)を行った後に得られた核酸配列を有する核酸分子を合成する工程、
を含み、それにより、T7変異体をコードする核酸分子を製造する、上記方法。
(b) 工程(a)の鋳型DNAを、項目1〜20のいずれかに記載のT7 RNAポリメラーゼの変異型ポリペプチド(T7変異体)または項目21〜23のいずれかに記載の方法により取得可能なT7変異体に接触させる工程、続いて、
(c) リボヌクレオシド三リン酸の存在下で鋳型DNAおよびT7変異体をインキュベートする工程、
を含み、それによりRNA分子を合成する、RNA分子の合成方法。
配列番号1 N末端メチオニンをコードする開始コドンを含む、野生型T7 DNA依存性RNAポリメラーゼをコードするNA(=核酸; この場合および以下の配列番号の項目では、とくに指定されていなければ、DNAとして解釈される)配列; 表3の#1に対応。
Protein Data Bank(http://www.wwpdb.org/pdb; codes: 1cez[Cheetham, G.M.T., et al., Nature 399 (1999) 80-83参照]、および1s77[Yin, Y.W., and Steitz, T.A., Cell 116 (2004) 393-404参照])に登録されたT7 RNAポリメラーゼのX線構造を調べて、タンパク質の安定性を増大させる突然変異を導入するための候補部位を特定した。
すべての分子生物学的手順は、標準的方法(Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual second Edition, B.27 Cold Spring Harbor Laboratory Press NY (USA))に従って実施した。記載されているコンビナトリアル合成戦略(van den Brulle, J., et al., Biotechniques 45(3) (2008) 340-343)により、野生型および突然変異型T7ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を合成した。
実施例2に記載されるようにして得られた形質転換大腸菌(E. coli)発現株を、アンピシリン(100μg/mL)およびカナマイシン(50μg/mL)を含有するLB培地中、37℃で、培養した。1mMの最終濃度でIPTGを添加することにより、0.7の光学濃度(578nmで測定される)で組換え発現の誘導を行った。5時間後、細胞を遠心分離により収集し、-20℃で凍結させた。
転写に基づく非放射アッセイを用いて、実施例3に記載されるようにして得られた精製された野生型および変異型T7 RNAポリメラーゼの活性を測定した。40μLの反応緩衝液(40mM Tris/HCl、6mM MgCl2、1mM NTP(各種)、10mM DTE、2mMスペルミジン、pH8.0、SspIで切断された1μg pSPT18)中で酵素活性を測定した。T7野生型またはT7変異型ポリメラーゼ酵素を希釈形態で添加した。37℃で30分間インキュベートした後、EDTA(0.4M、4μL)を添加して反応を停止させた。LC480 Light Cyclerプラットフォーム(Roche Applied Science, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim)でQuant-iT RNAアッセイ(Invitrogen)を用いて、RNA定量を行った。参照酵素として、市販のT7 RNAポリメラーゼ(Roche Applied Science, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim)を使用した。
野生型T7ポリメラーゼおよびT7変異体の安定性を調べるために、第1のパラメーターとして半減期を測定した。貯蔵緩衝液(10mMリン酸カリウム、200mM KCl、0.1mM EDTA、30mMメルカプトエタノール、50%グリセロール、0.1% Tween 20、pH7.9)中、50℃で、野生型酵素および精製変異体(実施例3参照)のサンプルをインキュベートした。異なる時点(10、20、および30分)でサンプルを採取し、実施例3に記載されるように残留酵素活性を測定した。分[min]数で表される半減期T1/2は、この時点でのそれぞれのT7変異体の活性が実験を開始した時点すなわち50℃への暴露を行った時点での活性の50%であることを意味する。表4に測定の結果をまとめる。
タンパク質熱変性の測定により、野生型T7ポリメラーゼ酵素およびT7 RNAポリメラーゼの変異体の安定性をさらに調べた。リアルタイムPCR計測と組み合わせた蛍光プローブ結合によりおよびレポーター色素としてSYPRO Orangeを用いて、膜タンパク質の変性遷移を測定すべく、本質的にYeh, A.P., et al., Acta Cryst. D62 (2006) 451-457によるものと同様にしてアッセイを行った。
記載どおり(He, B., et al., Protein Expr Purif 9 (1997) 142-151)に、モル吸光係数E280nm=1.4×105 M-1 cm-1を用いて、280nmで光学濃度を測定することにより、タンパク質濃度を測定した。
Claims (15)
- T7 RNAポリメラーゼの変異型ポリペプチド(T7変異体)であって、該T7変異体が、(i) DNA依存性RNAポリメラーゼ活性、(ii) 配列番号2で示される883個のアミノ酸のT7 RNAポリメラーゼポリペプチド(野生型参照)と比較して増強された熱安定性、および(iii) 該野生型参照と比較して異なるアミノ酸組成により特徴付けられ、
該変異体が、異なる位置の少なくとも1個のアミノ酸であって4個までのアミノ酸が置換されている野生型参照のポリペプチドを含み、
該野生型参照のN末端から番号付けされたVal426、Ser633、Val650、Thr654、Ala702、およびVal795からなる群から選択されるアミノ酸が、異なるアミノ酸に置換され、かつ
該異なるアミノ酸が:
・ 異なるアミノ酸がVal426と置き換わる場合はLeu、Ile、およびPhe(Val426Leu、Val426Ile、Val426Phe)、
・ 異なるアミノ酸がSer633と置き換わる場合はValおよびMet(Ser633Val、Ser633Met)、
・ 異なるアミノ酸がVal650と置き換わる場合はLeu(Val650Leu)、
・ 異なるアミノ酸がThr654と置き換わる場合はLeu(Thr654Leu)、
・ 異なるアミノ酸がAla702と置き換わる場合はVal(Ala702Val)、
・ 異なるアミノ酸がVal795と置き換わる場合はIle(Val795Ile)、
からなる群から選択される、上記T7変異体。 - Val426、Val650、Ala702、およびVal795からなる群から選択されるアミノ酸が、異なるアミノ酸に置換される、請求項1に記載のT7変異体。
- 異なる位置の4個のアミノ酸が置換され、かつ該異なるアミノ酸が、Val426Leu、Val650Leu、Ala702Val、およびVal795Ileである、請求項2に記載のT7変異体。
- Val426、Ala702、およびVal795からなる群から選択されるアミノ酸が異なるアミノ酸に置換され、かつ異なる位置の3個までのアミノ酸が置換される、請求項1に記載のT7変異体。
- 異なる位置の2または3個のアミノ酸が置換され、かつ異なるアミノ酸が、Val426Leu、Ala702Val、およびVal795Ileからなる群から選択される、請求項4に記載のT7変異体。
- 異なる位置の3個のアミノ酸が置換され、かつ異なるアミノ酸が、Val426Leu、Ala702Val、およびVal795Ileである、請求項4に記載のT7変異体。
- T7 RNAポリメラーゼの変異型ポリペプチド(T7変異体)の製造方法であって、該T7変異体が、(i) DNA依存性RNAポリメラーゼ活性、(ii) 配列番号2で示される883個のアミノ酸のT7 RNAポリメラーゼポリペプチド(野生型参照)と比較して増強された熱安定性、および(iii) 該野生型参照と比較して異なるアミノ酸組成により特徴付けられ、該方法が、
(a) 該野生型参照のN末端から番号付けされたVal426、Ser633、Val650、Thr654、Ala702、およびVal795からなる群からアミノ酸を選択する工程、
(b) 選択されたアミノ酸を異なるアミノ酸で置換してT7変異体を形成する工程、ただし、該異なるアミノ酸は、
・ 異なるアミノ酸がVal426と置き換わる場合はLeuおよびIle(Val426Leu、Val426Ile)、
・ 異なるアミノ酸がSer633と置き換わる場合はValおよびMet(Ser633Val、Ser633Met)、
・ 異なるアミノ酸がVal650と置き換わる場合はLeu(Val650Leu)、
・ 異なるアミノ酸がThr654と置き換わる場合はLeu(Thr654Leu)、
・ 異なるアミノ酸がAla702と置き換わる場合はVal(Ala702Val)、
・ 異なるアミノ酸がVal795と置き換わる場合はIle(Val795Ile)、
からなる群から選択され、
該野生型参照の少なくとも1個のアミノ酸であって異なる位置の4個までのアミノ酸は置換される、
(c) 工程(b)のT7変異体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子を発現系で発現させて、発現されたT7変異体を該発現系から単離する工程、
を含み、それによりT7変異体を製造する、上記方法。 - T7 RNAポリメラーゼの変異型ポリペプチド(T7変異体)をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子の製造方法であって、該T7変異体が、(i) DNA依存性RNAポリメラーゼ活性、(ii) 配列番号2で示される883個のアミノ酸のT7 RNAポリメラーゼポリペプチド(野生型参照)と比較して増強された熱安定性、および(iii) 該野生型参照と比較して異なるアミノ酸組成により特徴付けられ、該方法が、
(a) 請求項1〜6のいずれかに記載のポリペプチドのアミノ酸配列または請求項7に記載の方法により取得可能なポリペプチドのアミノ酸配列を逆転写することにより核酸配列を得る工程、続いて、
(b) 工程(a)を行った後に得られた核酸配列を有する核酸分子を合成する工程、
を含み、それにより、T7変異体をコードする核酸分子を製造する、上記方法。 - T7 RNAポリメラーゼの変異型ポリペプチド(T7変異体)をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子であって、該T7変異体が、(i) DNA依存性RNAポリメラーゼ活性、(ii) 配列番号2で示される883個のアミノ酸のT7 RNAポリメラーゼポリペプチド(野生型参照)と比較して増強された熱安定性、および(iii) 該野生型参照と比較して異なるアミノ酸組成により特徴付けられ、該核酸が請求項8に記載の方法により取得可能である、上記核酸分子。
- 前記核酸のヌクレオチド配列が、配列番号9、配列番号11、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号29、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、および配列番号47からなる群から選択される配列を含む、請求項9に記載の核酸分子。
- 請求項9および10のいずれかに記載の核酸分子を含む発現ベクターであって、該核酸分子が、転写および/または翻訳を制御可能な1つ以上のヌクレオチド配列に機能的に連結されている、発現ベクター。
- 請求項11に記載の発現ベクターで形質転換されている、ポリペプチドの組換え発現が可能な宿主生物。
- (a) T7プロモーターを含む鋳型DNA分子を提供する工程、ただし、該T7プロモーターは、転写される標的ヌクレオチド配列に機能的に連結されている、
(b) 工程(a)の鋳型DNAを、請求項1〜6のいずれかに記載のT7 RNAポリメラーゼの変異型ポリペプチド(T7変異体)または請求項7に記載の方法により取得可能なT7変異体に、接触させる工程、続いて、
(c) リボヌクレオシド三リン酸の存在下で該鋳型DNAおよび該T7変異体をインキュベートする工程、
を含み、それによりRNA分子を合成する、RNA分子の合成方法。 - 転写される標的ヌクレオチド配列に機能的に結合されたT7プロモーターを有する鋳型DNA分子と、リボヌクレオシド三リン酸と、請求項1〜6のいずれかに記載のT7 RNAポリメラーゼの変異型ポリペプチド(T7変異体)または請求項7に記載の方法により取得可能なT7変異体と、を含む組成物。
- 個別の容器内に、請求項1〜6のいずれかに記載のT7 RNAポリメラーゼの変異型ポリペプチド(T7変異体)または請求項7に記載の方法により取得可能なT7変異体と、1種以上のリボヌクレオシド三リン酸を含む緩衝液と、を含むキット。
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