CN107460177B

CN107460177B - 可利用化学修饰核苷酸的rna聚合酶突变体

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Publication number: CN107460177B
Application number: CN201610392442.4A
Authority: CN
Inventors: 张海生; 李强
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-06-06
Filing date: 2016-06-06
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2036-06-06
Also published as: CN107460177A

Abstract

本发明通过导入新颖性突变，提供了一种T7RNA聚合酶突变体，其选自：SEQ ID NO:1所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的632位的精氨酸被半胱氨酸取代的突变体(R632C)，所述T7RNA聚合酶突变体具有DNA依赖的RNA聚合酶活性，且与野生型T7RNA聚合酶相比，所述T7RNA聚合酶突变体可以各种2’修饰三磷酸核苷作为合成底物。以及合成该突变体、含有一种或多种修饰核苷酸的核酸的方法和试剂盒。

Description

可利用化学修饰核苷酸的RNA聚合酶突变体

发明领域

本发明涉及酶工程领域，具体的讲本发明涉及T7 RNA聚合酶的改良突变体，所述突变导致酶合成利用修饰三磷酸核苷合成RNA性能的改善。

背景技术

T7 RNA聚合酶(E.C.2.7.7.6.)是一种单体的噬菌体编码的DNA指导的RNA聚合酶，其催化5'→3'方向的RNA形成。在转录启动的过程中，T7识别特定的启动子序列，即T7启动子。T7由883个氨基酸组成，且具有99kDa的分子量。在氨基酸序列水平，T7与T3RNA聚合酶具有高度同源性，且与SP6RNA聚合酶具有更低的程度的同源性。T7的三维结构非常类似于具有不同模板和底物特异性的其它聚合酶，尽管存在低序列相似性。T7由不同的结构域组成：N-端结构域、“拇指”、“掌”和“指”(Sousa,R.,和Mukherjee,S.,Prog.Nucl.AcidRes.Mol.Biol.73(2003)1-41)。转录反应的详细研究证实，该酶象分子机器一样起作用，表现出该酶的柔性部分的非常协调的动作(Steitz,T.A.,EMBO J.25(2006)3458-3468；Steitz,T.A.,Curr.Opin.Struct.Biol.14(2004)4-9；Yin,Y.W.,和Steitz,T.A.,Cell 116(2004)393-404)。

解析了与启动子DNA复合的T7的几种结构，且可在蛋白数据库(pdb)得到。在高分辨率解析了T7 RNA聚合酶的起始复合物的结构(Cheetham,G.M.T.,等人,Nature 399(1999)80-83；Cheetham,G.M.T.,和Steitz,T.A.,Science 286(1999)2305-2309)。在2.9A分辨率解析的延伸复合物的结构显示出N-端区域的重排(Tahirov,T.H.,等人,Nature 420(2002)43-50)。结构研究表明，N-端结构域的构象会在起始和延伸阶段之间改变。最近，描述了从起始向延伸阶段变迁的转录T7的结构(Durniak,K.J.,等人,Science 322(2008)553-557)。

已经描述了编码T7的基因的克隆和表达(Studier等人,US 4,952,496)，通过诱变集中地研究了T7，以探究转录过程中的构象变化(Ma,K.,等人,Proc.Nat.Acad.Sci.102(2005)17612-17617)，以促进启动子清除(Guillerez,J.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.102(2005)5958-5963)，或研究失败的循环现象(He,B.,等人,J.Mol.Biol.265(1997)275-288)。Bonner,G.,等人,J.Biol.Chem.269(1994)25120-25128描述了一组具有改变的延伸速率的活性部位突变体。由于启动子特异性和高RNA聚合酶酶活性，T7可用于分子生物学中的多种用途。在重组蛋白表达领域，T7被用于重组基因在大肠杆菌中的高水平表达(Studier,F.W.,和Moffat,B.A.,J.Mol.Biol.189(1986)113-130)。Milligan,J.F.,等人,Nucl.Aids Res.15(1987)8783-8798描述了确定的寡核糖核苷酸的合成。

另外，T7被用于核酸扩增方法中，用于诊断目的。用于这种用途的第一个实例是称作“基于核酸序列的扩增”(NASBA)的技术，该过程包括下述步骤：(a)将RNA模板加入反应混合物中，其中第一种引物与在模板的3'末端处的互补位点对合；(b)反转录与RNA模板互补的DNA链，其中形成RNA/DNA异源双链体；(c)通过RNA酶H活性，降解所述异源双链体的RNA链；(d)使第二种引物对合DNA链的5'末端；(e)使用T7 RNA聚合酶，重复合成互补的RNA链，其中所述合成的RNA链可以再次用作步骤(a)的模板。所述NASBA技术已经被用于开发几种病原性病毒(尤其是具有单链RNA基因组的那些)的快速诊断实验。

诊断性等温扩增方法的另一个实例是“转录介导的扩增”(TMA)，为了扩增靶RNA，使用两种酶，它们是逆转录酶(RT)和T7 RNA聚合酶。通过具有RNA酶H活性的RT和在5’-末端含有T7-启动子的引物，产生样品RNA的互补DNA(cDNA)。通过RT的RNA酶H活性，降解由RNA–DNA双链体的产生RNA。另一种引物然后结合已经含有来自第一种引物的T7-启动子序列的cDNA，并通过RT的DNA聚合酶活性，合成双链DNA。T7 RNA聚合酶会识别在双链DNA分子内的T7-启动子序列，并合成许多RNA反义转录物。每个新生成的RNA扩增子重新进入TMA过程，并用作新一轮RT至双链DNA的模板，包括T7-启动子和反义扩增子的转录。反义转录物在扩增过程中的循环，导致靶RNA的指数扩增。

对于NASBA、TMA和有关的方法，以及对于其它用途，如果可以升高反应温度来提高反应动力学，是有利的。例如，等温扩增的更高的反应温度允许扩增具有二级结构的RNA。还已经使用聚合酶链式反应(PCR)技术证实，高退火温度允许引物与它的靶物的特异性杂交，导致高度特异性的扩增。具有相同的优点，更耐热的酶原则上也可以应用于等温扩增。

而RNA不仅在解码和传递遗传信息中起主要作用，同时因其具有多变的构象，它还表现出各种调节和引导细胞功能的作用。一些RNA分子可形成催化中心，而有些则可以通过与RNA、DNA或蛋白质分子间发生特异性相互作用而形成独特的结构。这些特性揭示了RNA分子作为各种人类疾病的治疗药物，如基因抑制剂、基因修正剂、蛋白抑制剂或免疫刺激剂的应用潜力。此外最近许多用酶、放射性同位素、荧光物质及生物素等标记RNA适配体以作为检测分子应用于生物传感器、和医学检验领域的研究报道也显示出RNA适配体在体外诊断和检测中的巨大潜能。然而，临床治疗或体外诊断等应用需要使用经化学修饰的RNA分子，以提高其对细胞或生物体液中核酸酶降解的耐受性、和改善药物代谢动力学特性。研究表明RNA分子结构中核糖2'-OH的化学修饰(如2'-O-甲基、2'-氟取代)对提高RNA的稳定性具有重要意义。其中2'-O-甲基(2'-OMe)修饰是最佳选择方案，因2'-O-甲基核苷酸的合成比合成其它2'-修饰核苷酸的成本更低，同时2'-O-甲基修饰是细胞中常见的RNA转录后修饰方式，2'-O-甲基化修饰RNA可作为模板进行逆转录，可利用这一特性对高度稳定的甲基化修饰RNA适配体进行体外筛选。

酶法合成2'-O-甲基修饰RNA是一种简单并具有成本效益的技术路线。可惜的是，这一RNA体外转录合成反应中常用的酶--野生型T7 RNA聚合酶(T7RNAP)，掺入化学修饰核苷酸的效率非常低下。因此通过基因工程对T7 RNA聚合酶进行蛋白质改造以寻找可高效掺入2'-O-甲基核苷酸的T7 RNA聚合酶突变体，是解决目前无法通过酶法合成在体外大量转录生成2'-O-甲基修饰RNA问题的关键。

最早通过蛋白工程设计出来的可掺入2'-O-甲基核苷酸的T7 RNA聚合酶突变体如E593G/V685A，虽然能掺入2'-OMe-ATP，2'-OMe CTP，2'-OMe UTP等三种2'-O-甲基核苷酸，但不能掺入2'-OMe GTP，因而不能合成完全2'-O-甲基修饰的RNA分子，同时由于工程酶的持续合成能力降低而导致2'-O-甲基修饰RNA酶法合成效率非常低下，而且只能合成短链产品。随后Kennedy等人发现的R425C突变体虽然解决了2'-OMe GTP掺入的问题，但其合成效率仍很低，远不能满足在体外转录大量合成完全2'-O-甲基修饰RNA的需要。

本发明利用T7 RNA聚合酶可以催化自身酶蛋白表达的特性，通过定点突变和基于酶活力筛选的方法发现并构建了一个能高效利用各种2'-O-甲基核苷酸底物合成RNA的T7RNA聚合酶突变体—R632C。体外转录检测结果表明，R632C突变体完全克服了以上两个变种的不足，不仅可以利用包括2'-OMe GTP在内的所有2'-O-甲基核苷酸底物转录合成完全2'-O-甲基修饰的RNA分子，而且合成效率非常高，其使用全部2'-O-甲基核苷酸为底物时的转录活性甚至超过了野生型T7 RNA聚合酶以全天然核苷酸底物时的正常转录活性。而且，在利用天然核苷酸底物进行转录时，该R632C变种的活力比野生型T7 RNA聚合酶的活力提高了1.7倍。因此，R632C突变体可广泛用于体外转录反应，以非修饰核苷酸(即天然核苷酸)、或2'-O-甲基三磷酸核苷酸(包括2'-OMe-ATP,2'-OMe-CTP,2'-OMe-GTP和2'-OMe-UTP)为底物，高效地大量合成正常非修饰的或2'-O-甲基修饰RNA分子。R632C变种是迄今为止所报道的在利用2'-O-甲基核苷酸为底物进行体外转录反应合成2'-O-甲基修饰RNA效率最高的RNA聚合酶。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供与野生型相比，转录活力提高，并可以2’修饰三磷酸核苷，特别是2'-O-甲基三磷酸核苷酸为底物高效、大量合成2'-O-甲基修饰RNA分子的T7 RNA聚合酶突变体及其制造方法。

为解决上述问题，本发明通过定点突变和基于酶活力筛选的方法发现并构建了一个能高效利用各种2'-O-甲基核苷酸底物合成RNA的T7 RNA聚合酶突变体—R632C。体外转录检测结果表明，R632C突变体完全克服了以上两个变种的不足，不仅可以利用包括2'-OMeGTP在内的所有2'-O-甲基核苷酸底物转录合成完全2'-O-甲基修饰的RNA分子，而且合成效率非常高，其使用全部2'-O-甲基核苷酸为底物时的转录活性甚至超过了野生型T7 RNA聚合酶以全天然核苷酸底物时的正常转录活性。而且，在利用天然核苷酸底物进行转录时，该R632C变种的活力比野生型T7 RNA聚合酶的活力提高了1.7倍。

具体地，本发明一方面提供一种T7RNA聚合酶突变体，其选自：SEQ ID NO:1所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的632位的精氨酸被半胱氨酸取代的突变体(R632C)，所述T7RNA聚合酶突变体具有DNA依赖的RNA聚合酶活性，且与野生型T7RNA聚合酶相比，所述T7RNA聚合酶突变体可以各种2’修饰三磷酸核苷作为合成底物。

进一步地，所述2’修饰三磷酸核苷选自2’–羟基、2’-脱氧、2’-氧-甲基、2’-NH2、2’-氟、和2’-甲氧基乙基修饰。

特别地，所述2’修饰三磷酸核苷是2’-氧-甲基修饰。

本发明一方面提供一种基因，所述基因编码T7RNA聚合酶突变体，所述基因的DNA序列如SEQ ID NO：2所示，该突变体选自SEQ ID NO:1所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的632位的精氨酸被半胱氨酸取代的突变体(R632C)，所述T7RNA聚合酶突变体具有DNA依赖的RNA聚合酶活性，且与野生型T7RNA聚合酶相比，所述T7RNA聚合酶突变体可以各种2’修饰三磷酸核苷作为合成底物。

本发明一方面提供一种细胞，所述细胞能够表达编码T7RNA聚合酶突变体的基因从而生产T7RNA聚合酶，该突变体选自SEQ ID NO:1所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的632位的精氨酸被半胱氨酸取代的突变体(R632C)，所述T7RNA聚合酶突变体具有DNA依赖的RNA聚合酶活性，且与野生型T7RNA聚合酶相比，所述T7RNA聚合酶突变体可以各种2’修饰三磷酸核苷作为合成底物。

本发明另一方面提供一种制备T7RNA聚合酶突变体的方法，其包括如下步骤：(1)从野生型T7RNA聚合酶氨基酸序列的N-端开始编号，从Arg632中选择氨基酸；(2)用不同氨基酸置换所选择的氨基酸，形成T7RNA聚合酶突变体，其中所述氨基酸置换为Arg632Cys(R632C)；(3)在表达体系中表达核酸分子，其为编码步骤(2)的T7RNA聚合酶突变体的核苷酸序列，并从所述表达体系分离表达所述T7RNA聚合酶突变体。所述突变体选自SEQ ID NO:1所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的632位的精氨酸被半胱氨酸取代的突变体(R632C)，所述T7RNA聚合酶突变体具有DNA依赖的RNA聚合酶活性，且与野生型T7RNA聚合酶相比，所述T7RNA聚合酶突变体可以各种2’修饰三磷酸核苷作为合成底物。

本发明还提供一种制备含有一种或多种修饰核苷酸的核酸的方法，具体步骤包括：(1)制备转录反应混合物，包括T7RNA聚合酶突变体、2’修饰三磷酸核苷酸(NTPs)、镁离子、和一种或多种核苷酸转录模板；(2)在一定条件下转录上述一种或多种核苷酸模板，由此所述T7RNA聚合酶突变体高效利用所述2’修饰三磷酸核苷酸底物合成2’修饰RNA分子。所述突变体选自SEQ ID NO:1所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的632位的精氨酸被半胱氨酸取代的突变体(R632C)，所述T7RNA聚合酶突变体具有DNA依赖的RNA聚合酶活性，且与野生型T7RNA聚合酶相比，所述T7RNA聚合酶突变体可以各种2’修饰三磷酸核苷作为合成底物。

特别地，所述2’修饰三磷酸核苷是2’-氧-甲基修饰。

进一步地，所述2’修饰三磷酸核苷全部是2’-氧-甲基修饰。

进一步地，所述转录反应混合物中还包括亚精氨。

此外，本发明还提供一种用于合成2’修饰RNA分子的试剂盒，其在单独的容器中包括T7RNA聚合酶突变体或根据本发明所述制备方法得到的T7RNA聚合酶突变体、以及含有一种或多种2’修饰三磷酸核苷酸的缓冲液。其中所述突变体选自SEQ ID NO:1所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的632位的精氨酸被半胱氨酸取代的突变体(R632C)，所述T7RNA聚合酶突变体具有DNA依赖的RNA聚合酶活性，且与野生型T7RNA聚合酶相比，所述T7RNA聚合酶突变体可以各种2’修饰三磷酸核苷作为合成底物。

进一步地，所述一种或多种2’修饰三磷酸核苷酸全部为2’-氧-甲基修饰。

附图说明

图1：T7 RNA聚合酶R632C突变体筛选示意图；

图2：T7 RNA聚合酶R632C突变体950-nt模板的体外转录结果，如图所示分别以四种天然NTPs，各种2'-OMe-NTP替代相应的天然NTP以及全部四种2'-OMe-NTP替代底物进行，转录产物经消化去除模板DNA后进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色分析，野生型T7 RNA聚合酶以四种天然NTP和全部四种2'-OMe-NTP替代底物利用相同模板的转录反应作为对照。

图3：T7 RNA聚合酶R632C突变体的体外转录RNA产物RNase A降解分析，R632C突变体如图所示分别以四种天然NTPs、单一2'-OMe-GTP替代天然GTP、和全部四种2'-OMe-NTP替代底物进行体外转录反应，转录产物经消化去除模板DNA、加0.001U RNase A酶25℃降解1h后进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色分析，野生型T7 RNA聚合酶和以四种天然NTPs为底物转录RNA作为对照。

发明详述

本发明的目的是提供与野生型相比，转录活力提高，并可以2’修饰三磷酸核苷，特别是2'-O-甲基三磷酸核苷酸为底物高效、大量合成2'-O-甲基修饰RNA分子的T7 RNA聚合酶突变体及其制造方法。

在下述说明中将会详细阐述本发明的一个或者多个实施方案。尽管在实施或者检验本发明过程中可以使用与文中所述相同或者相似的任何方法与材料，但是下文将描述优选的方法与材料。参照说明书，本发明的其它特点、目的和优点将显而易见。在说明书中除非文中有明确的表示，否则单数形式也包括复数的情况。除非另有说明，文中所用的所有技术与科学名词具有与本领域普通技术人员普遍理解相同的含义。在发生冲突的情况下以本说明书为准。

当核酸的至少一部分或它的互补物可以被直接翻译以提供肽或蛋白的氨基酸序列时，或当可以使用单独的或作为表达载体的一部分的分离的核酸来在体外、在原核宿主细胞中或在真核宿主细胞中表达肽或蛋白时，核苷酸序列“编码”肽或多肽。

编码肽或多肽的核苷酸序列的编码部分从编码甲硫氨酸的起始密码子开始，所述甲硫氨酸因而变成初级翻译产物的N-端氨基酸。作为翻译后加工的一部分，所述N-端甲硫氨酸经常被切掉，例如通过甲硫氨酸氨基肽酶，它是一种普遍存在的酶。在这样的情况下，初级翻译产物可以产生这样的混合物，其包含没有N-端甲硫氨酸的成员和保留该氨基酸作为N-端的成员。没有N-端甲硫氨酸的酶形式是唯一可分离的形式，也是可能的。但是，在序列表中描述了野生型T7聚合酶和根据本发明的T7变体的氨基酸序列，包括N-端甲硫氨酸。但是本发明也包括不包含N-端甲硫氨酸的所述T7变体。

为了本文所述的T7聚合酶变体的速记命名的目的，应当指出，对于每个突变，数字是指沿着在SEQ ID NO:1中给出的野生型T7聚合酶蛋白的参照氨基酸序列的氨基酸残基/位置。氨基酸鉴别使用氨基酸的三字母缩写以及单字母字母表，即，Asp D天冬氨酸、Ile I异亮氨酸、Thr T苏氨酸、Leu L亮氨酸、Ser S丝氨酸、Tyr Y酪氨酸、Glu E谷氨酸、Phe F苯丙氨酸、Pro P脯氨酸、His H组氨酸、Gly G甘氨酸、Lys K赖氨酸、Ala A丙氨酸、Arg R精氨酸、Cys C半胱氨酸、Trp W色氨酸、Val V缬氨酸、Gln Q谷氨酰胺、Met M甲硫氨酸、Asn N天冬酰胺。在氨基酸序列中的特定位置处的氨基酸，用它的三字母缩写和数字给出。因此，“Arg632”表示在SEQ ID NO:1的氨基酸位置632处的精氨酸残基。在本文公开的任意的T7突变体中，给出的氨基酸置换，作为添加在指示位置的数字之后的三字母缩写。例如，“Arg632Cys”表示用Cys置换在SEQ ID NO:1的位置632处的Arg。

术语“多肽”或“蛋白”表示由通过肽键连接起来的多个氨基酸单体组成的聚合物。优选地，所述聚合物包含50个或更多个单体。根据本发明的优选的多肽或蛋白是T7变体。“肽键”是第一个氨基酸和第二个氨基酸之间的共价键，其中第一个氨基酸的α-氨基键合到第二个氨基酸的α-羧基上。

本发明的T7变体也包含具有亲和标签的融合蛋白，例如，但不限于，组氨酸标签(His-标签)。技术人员众所周知，His-标签是含有几个、优选3-7个、更优选6个连续组氨酸的氨基酸序列。在His-标签序列中，组氨酸代表基本部分。但是可选择地，在His-标签中包含几个额外的氨基酸。例如，包含His-标签的N-端T7序列可以包含序列N-Met His His HisHis His His Gly Ser-。为此目的，参见包含前述氨基酸序列的SEQ ID NO:1。在本示例性的His-标签中，氨基酸Gly和Ser形成与T7变体的N-端的接头。所述接头氨基酸是His-标签的一部分，且通常作为编码该His-标签的核苷酸序列的克隆人工制品而产生。优选地，该His-标签中的接头序列包含1-5个氨基酸。

通过固定化的金属亲和色谱法，有效地进行His-标签化的T7野生型或变体多肽的纯化。该方法是广泛使用的方法，用于纯化含有由组氨酸残基组成的短亲和-标签(His-标签)的重组蛋白。固定化的金属-亲和色谱法(由Porath,J.,等人,Nature 258(1975)598–599描述)是基于固定化在颗粒金属螯合亲和基质上的过渡金属离子(Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+)和特定氨基酸侧链之间的相互作用。组氨酸是表现出与固定化的金属离子基质的最强相互作用的氨基酸，作为组氨酸咪唑环上的电子供体基团，容易地与固定化的过渡金属形成配位键。

“载体”被定义为可以包含(即携带)和维持根据本发明的DNA片段的DNA，包括，例如，噬菌体和质粒。基因工程领域的技术人员会理解这些术语。术语“表达盒”表示编码前蛋白的核苷酸序列，其可操作地连接到启动子和终止子上。关于含有表达盒的载体，术语“载体”和“表达载体”作为同义词使用。

术语“寡核苷酸”用于表示长度小于100个核苷酸的核酸分子、DNA(或RNA)。优选地，寡核苷酸的长度是约75、约50或更少的核苷酸。

“转化”是指将DNA导入生物体，即宿主生物体，使得所述DNA是可复制的，无论是作为染色体外元件还是通过染色体整合。

术语“表达”和动词“表达”表示DNA序列的转录和/或转录的mRNA在宿主生物体中的翻译，产生前蛋白，即不包括翻译后加工。

术语“启动子”是刺激转录的调节核苷酸序列。基因工程领域的技术人员会理解这些术语。像启动子一样，“启动子元件”刺激转录，但是构成更大的启动子序列的亚片段。

术语“T7 RNA聚合酶”(T7 RNA Polymerase)是一种RNA聚合酶，分子量约99kDa。专门催化5'→3'方向的RNA形成过程。T7RNA聚合酶具有高度启动子专一性，且只会催化位于T7启动子下游的的DNA或DNA复制品的转录。

术语“突变体”：发生突变的个体叫做突变体。突变体往往具有与野生型不同的表型，这样就为缺失组分的功能提供了有益的信息。同样，会将含有某一组分过量表达的个体也称为突变体。

术语“体外转录”：转录通常发生在生物体内，如果我们将含有RNA转录酶、NTP等条件，在体外无细胞系统中，用DNA作为模板，模仿体内转录过程生成RNA，这样的技术则能够控制转录的基因、转录的过程和转录后RNA的用途，该技术被称为体外转录。

野生型RNA在生命体内不稳定。通过在2’位置嵌入修饰基团，可以显著增加抗核酸酶降解特性。人们已经成功地将氟和氨基基团嵌入核苷酸库，然后从上述库筛选出RNA。然而，因为修饰的核苷酸可以循环进入宿主的DNA的可能性，又引发了安全问题。含有2’-氧—甲基(2’-OMe)核苷酸的适体克服了上述缺点。含有2’-氧—甲基核苷酸的低核苷酸具有抗核酸酶特性，并且可以廉价合成。尽管2’-氧—甲基核苷酸普遍存在于生物系统中，但是在生理条件下天然聚合酶不能接受2’-氧—甲基三磷酸核苷做为底物，因此，就不存在2’-氧-甲基核苷酸循环进入宿主DNA的安全问题。2'-O-甲基核苷酸：包括2'-OMe-ATP,2'-OMe-CTP,2'-OMe-GTP和2'-OMe-UTP在内的四种分子结构中核糖2'-OH发生甲基化修饰的核苷酸，可用作体外转录反应的底物合成2'-O-甲基修饰的RNA分子，以提高RNA分子的生化稳定性和药代动力学性能。

具体实施方式

实施例1：T7 RNA聚合酶多肽中氨基酸交换突变的设计

根据文献报道，R425、R632和H811氨基酸残基负责与第一个启动核苷酸3-dGTP-(1)相互作用，而第二个启动核苷酸3-dGTP-(2)与K441、R425、R627、K631、H784和D812残基相互作用。由于K441、R425与Y639残基已被报道与2'-O-甲基核苷酸掺入能力提高相关联，我们选择了分别对R627、K631、和R632位点随机突变构建T7自调控基因文库，以发现新的具有改善的2'-OMe GTP催化活性的突变酶。聚合酶突变文库克隆于T7启动子下游,并与一个带有同样受T7启动子控制的氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因的载体一道引入大肠杆菌细胞。在突变文库转化含有报告基因质粒的细胞后,细胞生长至饱和并用(IPTG)诱导。培养物然后涂布于含0、50、100或200mg/ml氯霉素和1mM IPTG的固体培养基上。选择可在氯霉素(Cam)板上生长的聚合酶变异克隆于微孔板进行表达培养，随后经碱裂解、中和、并离心分离细胞碎片后，转移上清液中的可溶性蛋白质(裂解液)到干净的微孔板并存储在4℃，以供进行下一步基于活力的筛选，具体操作流程如图1所示。

实施例2：野生型T7 RNA聚合酶自调控基因载体、随机突变文库和报告基因质粒构建

2.1材料

大肠杆菌DH5α以及BL21(DE3)感受态细胞和快速质粒小提试剂购自天根生化科技(北京)有限公司；

pET28a+购自Novagen，报告质粒pCAT3-promoter购自Promaga；Phusion高保真DNA聚合酶；

限制性内切酶Nde I、BamH I、Nhe I、Xho I、和DpnI；RNase A以及溶菌酶，均购自New England Biolabs；

IPTG、氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、NaCl、Tris–HCl、EDTA、DTT、MgCl2、亚精胺(spermidine)、鲑精DNA、琼脂糖、和溴化乙锭等，均购自上海生工；

Ni-NTA Agarose购自Qiagen，Quick Start Bradford蛋白测定试剂盒购自Bio-Rad；

在转录反应中使用的所有2'-修饰核苷酸均购自Trilink Biotechnologies，常规核苷5'-三磷酸和包括随机突变引物在内的所有寡核苷酸购自上海生工；

RNA测序由铂尚生物进行。

2.2细菌培养：

使用大肠杆菌DH5α进行克隆及筛选实验，用BL21(DE3)表达T7 RNA聚合酶。细菌培养使用LB培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl、pH 7.0)或YT培养基(8g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L氯化钠、pH 7.0)在37℃培养箱或摇床中培养。

2.3野生型T7自调控基因载体、随机突变文库和报告基因质粒构建

2.3.1野生型T7自调控基因载体构建：

野生型T7自调控基因载体是通过引物(PolF primer:5'-GCCGCATATGAACACGATTAACATCGCTAAGAACG-3'和PolR primer:5'-CCGCGGATCCTCTT ACGCGAACGCGAAGTCC-3')，以Phusion高保真DNA聚合酶扩增T7 RNA聚合酶基因，PCR产物经Nde I、BamH I酶切后克隆到含卡那霉素抗性基因的pET28a+载体T7启动子下游Nde I、BamH I位点。

2.3.2自调控随机突变基因文库构建：

利用T7 RNA聚合酶基因R627、K631、和R632位点随机突变构建T7自调控基因文库。通过PCR生成包含每个随机突变位点的双链DNA片段：使用的随机引物中编码氨基酸R627(5'-CTTACGGTGTTACTNNNAGTGTGACTAAGCG-3',和5'-CGCTTAGTCACACTNNNAGTAACACCGTAAG-3')、K631(5'-ACTCGCAG TGTGACTNNNCGTTCAGTCATGAC-3',和5'-GTCATGACTGAACGNNNAGTCACACTGCGAGT-3'),和R632(5'-CGCAGTGTGACTAAGNNNTCAGTCATGAC GCT-3',和5'-AGCGTCATGACTGANNNC TTAGTCACACTGCG-3')的密码子为N，其中N表示等摩尔的所有四种核苷酸混合物，使用Phusion高保真DNA聚合酶通过重叠PCR(以PolF primer和PolR primer引物)进行DNA片段连接。用Nde I和BamH I限制性内切酶消化并连接到经相同酶消化的野生型T7自调控基因载体，得到自调控随机突变基因文库。

2.3.3报告基因质粒构建：

含T7启动子序列的寡核苷酸5'-GCCGGCTAGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGCTCGAGCCGC-3'及其互补链经退火、Nhe I和Xho I内切酶消化后连接到经相同酶消化的含氨苄青霉素抗性基因的pCAT3-promoter质粒上，构建得到含有受T7启动子控制表达的氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因的报告基因载体pCATT7。

实施例3：活性T7 RNA聚合酶突变株筛选：

用自调控随机突变T7 RNA聚合酶基因文库与CAT报告基因载体pCATT7共转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化文库首先在不含抗生素的液体LB培养基中恢复培养，然后在培养基中加入25mg/ml卡那霉素和100mg/ml氨苄青霉素，37℃培养2小时。培养物中加30mg/ml氯霉素，和1mM IPTG进行诱导。细胞于37℃培养6小时。饱和培养物涂布于含25mg/ml卡那霉素，1mM IPTG，和100mg/ml氨苄青霉素，以及不同浓度(50、100和200mg/ml)氯霉素的LB平板上，于37℃培养16小时。可观察到具有较高的浓度的氯霉素板上长出数量更少的菌落，菌落大小不一。从每个平板挑取菌落并将其用于基于活力的筛选。作为阴性对照，转化子也被涂布于LB-Kan/Amp/Cam LB平板(无诱导)，阴性对照没有菌落产生。上述筛选实验重复数次以筛选更多数量的变种。

实施例4：T7 RNA聚合酶突变体表达：

N-端含有6×组氨酸标签的聚合酶基因自调控质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞以进行蛋白表达和纯化。转化后的T7 RNA聚合酶(野生型或突变体)挑取一个新鲜的菌落接种10毫升YT培养基(含氨苄青霉素200mg/ml)。37℃培养过夜后取3.3毫升转移到200毫升YT培养基的锥形瓶(含200mg/ml氨苄青霉素)。37℃震荡培养直到600nm光密度达到0.4-0.6，然后加入终浓度为1mM IPTG诱导蛋白表达4小时，离心收集菌体(在提取之前可存放在-80℃)。用50μL裂解缓冲液1(50mM Tris–HCl,pH 8.0,15mM EDTA)震荡10分钟(550rpm，4℃)重悬细胞，再与10μL 200mM NaOH震荡混合10min(550rpm,4℃)。用5μL缓冲液N(1M Tris–HCl,pH 8.0,4M NaCl)中和后，加10μL溶菌酶(50g/L lysozyme,25mM DTT)在550rpm，4℃下孵育1h继续裂解。离心(3700rpm,4℃)5min分离细胞碎片，转移上清液中的可溶性蛋白质(裂解液)到干净的微孔板并存储在4℃。随后根据Qiagen提供的说明书进行镍亲和纯化。纯化的酶蛋白经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色确定蛋白纯度，通过Bradford蛋白质检测(Bio-Rad)测定纯化的酶浓度。野生型T7 RNA聚合酶也使用相同方法进行纯化并作为所有转录检测中的对照。从200毫升的培养物中可纯化得到的突变体蛋白量在20-30mg之间，类似于野生型酶蛋白质产率。

实施例5：T7 RNA聚合酶突变体活性检测：

T7 RNA聚合酶及其突变体克隆的DNA-依赖性RNA聚合酶活性检测利用了分子信标引物/模板，以384孔板形式通过荧光方法进行测定(Summerer and Marx,2002)。分子信标5'-GCGAGAXCCAAAAAAAAAAACCAYCTCGCCGAATTCGC CCTATAGTGAGTCGTATTA-3'，其中X＝Dabcyl-dT和Y＝TAMRA-dT(0.4μM)与含T7启动子寡核苷酸5'-TAATACGACTCACTATA-3'(0.44μM)于1X反应缓冲液(40mM Tris–HCl pH 8.0,30mM MgCl2,10mM DTT,6mM spermidine)中进行杂交,于反应体系中加入rNTPs(每种浓度为200μM)或2'-OMe-GTP(200μM)，另外使用裂解液的反应需额外加鲑精DNA(5μg/μL裂解液)。加入纯化T7 RNA聚合酶(0.4μM)或表达活性T7 RNA聚合酶突变体克隆的细胞裂解液(1μL)以开始反应，在37℃继续孵育。使用PerKinElmer Envision 2104微孔板检测仪(Perkin Elmer)以540nm激发波长和590nm监测波长进行荧光强度检测。对照实验以类似的反应体系进行但不加rNTPs。各种处理的实验数据减去没有NTPs的对照反应数据得到真实值。根据10分钟内荧光强度的线性增加可计算反应速率，并与野生型酶在rNTPs底物下的标准活力进行比较。RNA聚合酶的专一活性单位等于每分钟和每毫克T7 RNA聚合酶所能够产生的被分子信标识别的RNA转录产物的总量，它以kU/mg表示。根据各突变体以2'-OMe GTP进行反应的效率，选择了一些克隆进行质粒制备、序列分析、和蛋白质的制备。

表1.T7 RNA聚合酶变种的氨基酸突变及其利用2'-OMe-GTP替代底物合成RNA的活力

*相对酶活力为T7 RNA聚合酶变种利用天然NTPs底物或2'-OMe-GTP替代底物时的专一活力与野生型(WT)T7 RNA聚合酶利用天然NTPs底物时的标准活力的百分比。

随后的筛选利用基于分子信标的检测方法确定RNA聚合酶突变体掺入天然和2'-O-甲基核苷酸的能力。每一种突变克隆的裂解液通过三种反应类型进行检测：(a)四种碱基全是天然核苷酸(rNTPs)，(b)不加NTPs，(c)加2'-OMe-GTP。根据荧光检测数据，在反应中野生型T7 RNA聚合酶以及多数突变克隆并不能利用2'-OMe-GTP进行任何转录，但发现有20多个T7 RNA聚合酶突变克隆可利用2'-OMe-GTP合成RNA。选择这些克隆进行质粒制备和DNA序列分析。测序分析发现存在8个不同T7 RNA聚合酶突变体，在使用2'-OMe-GTP替换天然GTP条件下可进行转录合成RNA，其中大多数突变体利用2'-OMe-GTP进行RNA合成的活力与野生型在利用天然NTPs进行合成时的标准活力相比均有不同程度的降低，但发现有一个突变体C8，利用2'-OMe-GTP进行RNA合成的活力与野生型RNA聚合酶利用天然NTPs进行转录时的标准活力相比反而有少许提高(表1)；并且在利用天然NTPs进行转录时，该突变体的活力比野生型RNA聚合酶的活力提高了1.7倍(表1)。此突变体经DNA序列分析证明在其氨基酸序列的第632位氨基酸残基发生了替代突变—由野生型的精氨酸(Arg)替换为半胱氨酸(Cys)，因此该突变体命名为R632C(SEQ ID NO:1所示)。

实施例6：T7 RNA聚合酶突变体体外转录活性检测：

为了验证R632C突变体具有利用编码长链RNA分子的DNA模板进行转录合成的能力，我们对R632C突变体进行以质粒DNA模板合成约950nt RNA的体外转录实验。体外转录实验以线性化pCATT7模板(转录产物约为950-nt)进行。DNA(1.5nM)和T7 RNA聚合酶(野生型或变种，150nM)在2X转录缓冲液(80mM Tris–HCl,pH 8.9,16mM MgCl2,20mM NaCl,4mMspermidine,60mM DTT)，辅以2mM rNTPs或2'-OMe-NTPs在37℃反应3h。在用Dpn I(1U)消化去除模板DNA后，RNA产品经琼脂糖凝胶电泳(用含有0.1％次氯酸钠NaOCl的1×TAE缓冲液配制的1％琼脂糖凝胶)和溴化乙锭染色进行分析。

图2结果证明利用R632C突变体的转录反应生成了全长约950nt转录产物，这是目前为止的所有研究中唯一使用修饰核苷酸进行转录可得到全长转录子的报道。R632C突变体不仅在单一2'-O-甲基核苷酸替代的情况下有转录活性，而且在当所有天然NTPs被其2'-O-甲基核苷酸类似物取代的情况下也能进行转录。R632C突变体在使用2'-O-甲基核苷酸底物进行转录反应的RNA产量与野生型T7 RNA聚合酶以四种天然NTP底物进行转录时的RNA产量水平相当。在一个R632C突变体利用2'-O-甲基核苷酸的典型体外转录反应(50uL反应)中，可获得约4-5mg RNA产物。

实施例7：R632C突变体的体外转录RNA产物RNaseA降解分析：

我们接着对使用R632C突变体的体外转录反应合成的950-nt RNA产物进行了RNase A降解反应，以验证R632C突变体的体外转录RNA产物是否因掺入了2'-O-甲基修饰核苷酸而提高了对RNase A降解的耐受力。图3的结果显示，利用野生型T7 RNA聚合酶和R632C变种以四种天然核苷酸(rNTPs)为底物合成的正常RNA可被RNaseA完全降解，而R632C变种以单一2'-OMe-GTP，或全部四种2'-O-甲基核苷酸为底物所合成的2'-O-甲基修饰RNA则对可完全消化正常RNA浓度RNase A的切割有高度抗性。这些结果进一步证实了该R632C突变体可忠实地掺入2'-O-甲基核苷酸从而提高产物RNA分子对核酸酶降解的耐受度。

所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。

序列表

　　<110> 张海生

　　<120> 可利用化学修饰核苷酸的RNA聚合酶突变体

　　<140> 201610392442.4

　　<141> 2016-06-06

　　<160> 3

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 883

　　<212> PRT

　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)

　　<400> 1

　　Met Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu

　　1 5 10 15

　　Ala Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu

　　 20 25 30

　　Ala Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu

　　 35 40 45

　　Ala Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val

　　 50 55 60

　　Ala Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys

　　65 70 75 80

　　Met Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg

　　 85 90 95

　　Gly Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu

　　 100 105 110

　　Ala Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser

　　 115 120 125

　　Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala

　　 130 135 140

　　Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys

　　145 150 155 160

　　His Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His

　　 165 170 175

　　Val Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser

　　 180 185 190

　　Lys Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp

　　 195 200 205

　　Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr

　　 210 215 220

　　Gly Met Val Ser Leu His Arg Gln Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp

　　225 230 235 240

　　Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr

　　 245 250 255

　　Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro Met Phe Gln Pro Cys Val

　　 260 265 270

　　Val Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala

　　 275 280 285

　　Asn Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala

　　 290 295 300

　　Leu Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile

　　305 310 315 320

　　Asn Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala

　　 325 330 335

　　Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile

　　 340 345 350

　　Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp

　　 355 360 365

　　Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Val

　　 370 375 380

　　Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe

　　385 390 395 400

　　Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe

　　 405 410 415

　　Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe

　　 420 425 430

　　Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys

　　 435 440 445

　　Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly

　　 450 455 460

　　Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys

　　465 470 475 480

　　Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro

　　 485 490 495

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　　 500 505 510

　　Ala Phe Cys Phe Glu Tyr Ala Gly Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr

　　 515 520 525

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　　 580 585 590

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　　Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met Asn Trp Leu Lys Ser Ala Ala Lys

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　　 805 810 815

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　　<211> 2652

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)

　　<400> 2

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　　ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120

　　catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180

　　gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240

　　atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300

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　　accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420

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　　attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900

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　　aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta 1020

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　　<210> 3

　　<211> 883

　　<212> PRT

　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)

　　<400> 3

　　Met Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu

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　　Ala Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu

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　　 165 170 175

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　　 245 250 255

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　　 275 280 285

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　　 565 570 575

　　Lys Val Asn Glu Ile Leu Gln Ala Asp Ala Ile Asn Gly Thr Asp Asn

　　 580 585 590

　　Glu Val Val Thr Val Thr Asp Glu Asn Thr Gly Glu Ile Ser Glu Lys

　　 595 600 605

　　Val Lys Leu Gly Thr Lys Ala Leu Ala Gly Gln Trp Leu Ala Tyr Gly

　　 610 615 620

　　Val Thr Arg Ser Val Thr Lys Arg Ser Val Met Thr Leu Ala Tyr Gly

　　625 630 635 640

　　Ser Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gln Gln Val Leu Glu Asp Thr Ile Gln

　　 645 650 655

　　Pro Ala Ile Asp Ser Gly Lys Gly Leu Met Phe Thr Gln Pro Asn Gln

　　 660 665 670

　　Ala Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu Ile Trp Glu Ser Val Ser Val Thr

　　 675 680 685

　　Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met Asn Trp Leu Lys Ser Ala Ala Lys

　　 690 695 700

　　Leu Leu Ala Ala Glu Val Lys Asp Lys Lys Thr Gly Glu Ile Leu Arg

　　705 710 715 720

　　Lys Arg Cys Ala Val His Trp Val Thr Pro Asp Gly Phe Pro Val Trp

　　 725 730 735

　　Gln Glu Tyr Lys Lys Pro Ile Gln Thr Arg Leu Asn Leu Met Phe Leu

　　 740 745 750

　　Gly Gln Phe Arg Leu Gln Pro Thr Ile Asn Thr Asn Lys Asp Ser Glu

　　 755 760 765

　　Ile Asp Ala His Lys Gln Glu Ser Gly Ile Ala Pro Asn Phe Val His

　　 770 775 780

　　Ser Gln Asp Gly Ser His Leu Arg Lys Thr Val Val Trp Ala His Glu

　　785 790 795 800

　　Lys Tyr Gly Ile Glu Ser Phe Ala Leu Ile His Asp Ser Phe Gly Thr

　　 805 810 815

　　Ile Pro Ala Asp Ala Ala Asn Leu Phe Lys Ala Val Arg Glu Thr Met

　　 820 825 830

　　Val Asp Thr Tyr Glu Ser Cys Asp Val Leu Ala Asp Phe Tyr Asp Gln

　　 835 840 845

　　Phe Ala Asp Gln Leu His Glu Ser Gln Leu Asp Lys Met Pro Ala Leu

　　 850 855 860

　　Pro Ala Lys Gly Asn Leu Asn Leu Arg Asp Ile Leu Glu Ser Asp Phe

　　865 870 875 880

　　Ala Phe Ala

　　1

Claims

1.一种T7 RNA聚合酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述T7 RNA聚合酶突变体具有DNA依赖的RNA聚合酶活性，且与野生型T7 RNA聚合酶相比，所述T7 RNA聚合酶突变体可以2’-氧-甲基修饰三磷酸核苷作为合成底物。

2.一种基因，所述基因编码权利要求1所述的T7 RNA聚合酶突变体，其DNA序列如SEQID NO：2所示。

3. 一种细胞，所述细胞能够表达编码权利要求2所述的T7 RNA聚合酶突变体的基因从而生产T7 RNA聚合酶。

4. 一种制备权利要求1所述的T7 RNA聚合酶突变体的方法，其包括如下步骤：

(1)从氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的野生型T7 RNA聚合酶氨基酸序列的N-端开始编号，选择第632位的Arg；

(2)用Cys氨基酸置换所选择的氨基酸，形成T7 RNA聚合酶突变体；

(3)在表达体系中表达核酸分子，其为编码步骤(2)的T7 RNA聚合酶突变体的核苷酸序列，并从所述表达体系分离表达所述T7 RNA聚合酶突变体。

5.一种制备含有一种修饰核苷酸的核酸的方法，具体步骤包括：

(1)制备转录反应混合物，包括权利要求1所述的T7 RNA聚合酶突变体、2’-氧-甲基修饰三磷酸核苷酸、镁离子、和核苷酸转录模板；

(2)在一定条件下转录上述核苷酸模板，由此所述T7 RNA聚合酶突变体高效利用所述2’-氧-甲基修饰三磷酸核苷酸底物合成2’-氧-甲基修饰RNA分子。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述转录反应混合物中还包括亚精氨。

7. 一种用于合成含有一种修饰核苷酸的核酸分子的试剂盒，其在单独的容器中包括权利要求1所述的T7 RNA聚合酶突变体或根据权利要求4的方法得到的T7 RNA聚合酶突变体、以及含有2’-氧-甲基修饰三磷酸核苷酸的缓冲液。