JP2009136153A - 変異型ｒｎａポリメラーゼ - Google Patents

Abstract

【課題】バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの比活性を増大させ、高温度域での反応性を向上させた改良型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを提供する。
【解決手段】バクテリオファージＴ７由来の野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの、アミノ酸配列の３４４位に相当するトリプトファン残基をバリン残基に置換した、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ。
【選択図】図４

Description

本発明は、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに関する。本発明はまた、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子、当該遺伝子を有し、かつ、それを発現して変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを生産することができる細胞、当該細胞を使用する変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの製造方法、そして、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるＲＮＡの合成方法に関する。

本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡは、バクテリオファージＴ７由来の野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較して比活性（ここで「比活性」とは、例えば、０℃から１００℃の温度下で酵素活性（ＲＮＡ合成活性）を測定した場合におけるＲＮＡポリメラーゼの単位蛋白質重量あたりの酵素活性を意味する）が増大しており、例えば臨床診断で応用されている、ＮＡＳＢＡ法（特許文献１及び２、非特許文献１及び２）、３ＳＲ法（特許文献３、非特許文献３）、ＴＲＣ法（特許文献４）等の、種々の核酸増幅法において利用し得るものである。

ＤＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼは、２本鎖のＤＮＡを鋳型にしてＲＮＡを合成する酵素であり、その性質や機能について多くの研究がなされている。なかでもバクテリオファージＴ７由来のＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、単一サブユニットからなるため扱いやすく、また鋳型となる２本鎖のＤＮＡに存在する転写反応の開始プロモーター配列（Ｔ７プロモーター配列）を厳密に認識することから、遺伝子工学の分野で多用されている。

例えば、Ｔ７プロモーター配列の下流に発現させたい蛋白質遺伝子配列を配置した２本鎖ＤＮＡを、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現する細胞に導入して蛋白質を生産させる方法や、細胞を用いずにＴ７ＲＮＡポリメラーゼを加えた試験管内で蛋白質を生産させる方法が広く利用されている。そのほかにもＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ反応で得られた生成物（ＤＮＡ断片）をシーケンス用の鋳型に用いて、ＲＮＡポリメラーゼの転写に基づいた反応でシークエンスする方法なども開発されている。

また、ＲＮＡポリメラーゼは、その鋳型ＤＮＡからＲＮＡを複数コピーすることを利用して、例えばＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法、ＴＲＣ等の転写反応に基づく核酸増幅法や、当該方法を応用した臨床診断方法にも利用されている。

ＲＮＡポリメラーゼは、上述のように種々の分野で利用される過程で、その用途に応じた改良が行われている。例えば野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較して、比活性を増大する改良、野生型Ｔ７ＲＮＡと比較して、高温度域での反応性を向上する耐熱性の改良等である。天然に見出される野生型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１に示したアミノ酸配列を有するが、例えばその４３０位のセリン残基をプロリン残基に置換したもの、その８４９位のフェニルアラニン残基をイソロイシン残基に置換したもの、及び／又は８８０位のフェニルアラニン残基をチロシン残基に置換したものが特許文献５で報告されている。また６３３位のセリン残基をプロリン残基に置換したものが特許文献６で報告されている。また４３０位のセリン残基をプロリン残基に置換したもの、６３３位のセリン残基をプロリン残基に置換したもの、８４９位のフェニルアラニン残基をイソロイシン残基に置換したもの、及び、８８０位のフェニルアラニン残基をチロシン残基に置換したものが特許文献７で報告されている。このような変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、野生型のものに比較して、高温度域での反応性が向上されており、また中でも４３０位、６３３位、８４９位、８８０位のアミノ酸残基を所定のアミノ酸残基に置換したものでは、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較して、比活性が増大されている。

特許第３２４１７１７号公報 特許第２６５０１５９号公報 特許第３１５２９２７号公報 特開２０００−１４４００号公報 特開２００１−５４３８７号公報 特表２００２−５３２０９５号公報 特表２００３−５２５６２７号公報 特許第３１７２７１０号公報 Ｃｏｍｐｔｏｎ Ｊ．ら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５０（６３１３）、（９１−９２頁） Ｒｏｍａｎｏ Ｊ．Ｗ．ら、１９９６、Ｃｌｉｎｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１６（１）、（８９−１０３頁） Ｇｕａｔｅｌｌｉ Ｊ．Ｃ．ら、１９９０、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、８７（５）、（１８７４−１８７８頁） Ｍｏｆｆａｔｔ Ｂ．Ａ．ら、１９８４、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７３、（２６５−２６９頁） Ｇｒａｃｈｅｖ Ｍ．Ａ．ら、１９８４、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃｈｅｓｋａｉａ Ｋｈｉｍｉｉａ、１０、（８２４−８４３頁） Ｄａｓ Ｍ．ら、１９９８、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２８、（３３９−３４８頁） Ｂｉａｏ，Ｈ．ら、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、９、（１４２−１５１頁） Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｍ．Ｍ．、１９７６、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ７２、（２４８−２５４頁） Ｊｏｎｅｓ Ｌ．Ｊ．ら、１９９８、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ２６５、（３６８−３７４頁）

ＲＮＡポリメラーゼは、上述のように種々の分野で利用される過程で、その用途に応じた改良が行われている。かかる改良は一定の成果を上げつつあるが、未だ野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用途に応じてフレキシブルに改良し得るだけの知見が得られたとは言い難く、より一層の改良の可能性が追求されている。

またＴ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基の変異による比活性の増大等の改良は、相同性が高いバクテリオファージ由来ＲＮＡポリメラーゼの改良の指針としても期待されている。例えばＴ３ＲＮＡポリメラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ０２９８１）やＫ１１ＲＮＡポリメラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ５３２３８）等のバクテリオファージ由来のＲＮＡポリメラーゼはＴ７ＲＮＡポリメラーゼとアミノ酸配列の相同性が非常に高く、配列番号１に示したように、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基３２８位から３７７位に相当する配列は、配列番号２に示したＴ３ＲＮＡポリメラーゼではアミノ酸残基３２９位から３７８位であり、配列番号３に示したＫ１１ＲＮＡポリメラーゼではアミノ酸残基３５１位から４００位であることがわかる。したがってＴ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基３４４位のトリプトファン残基がＴ３ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基３４５位、Ｋ１１ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基３６７位のトリプトファン残基に相当することは容易に推定できる。

上記課題に鑑みてなされた本発明は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの比活性を増大させ、また、高温度域での反応性を向上させる、これまでに報告されていないＴ７ＲＮＡポリメラーゼの改良を提供するものである。

上記課題に鑑みてなされた本願請求項１の発明は、バクテリオファージＴ７由来の野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸配列（配列番号１）の３４４位に相当するトリプトファン残基がバリン残基に置換された、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである。そして本願請求項２の発明は、バクテリオファージＴ７由来の野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸配列（配列番号１）の３４４位に相当するトリプトファン残基がバリン残基に置換され、更に、３４４位以外の１以上のアミノ酸残基が置換若しくは欠失され及び／又は３４４位以外の部位へアミノ酸残基が挿入若しくは付加された、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである。

本願請求項３の発明は、上記各変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子であり、本願請求項４の発明は、かかる遺伝子を有し、かつ、それを発現して変異型ＲＮＡポリメラーゼを生産することができる細胞であり、本願請求項５の発明は、当該細胞を使用する、変異型ＲＮＡポリメラーゼの製造方法である。

そして本願請求項６の発明は、上記各変異型ＲＮＡポリメラーゼを用いる、ＲＮＡの合成方法である。

本発明は、種々の野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼや野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに基づいて人工的に製造された変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにおいて、それらのアミノ酸配列中の「野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸配列の３４４位に相当するトリプトファン残基」を、人工的にバリン残基に置換したものである。野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、非特許文献４に従えば配列番号１の通りであり、非特許文献５に従えば、６２３位のチロシン残基と６６５位のプロリン残基以外は配列番号１の通りである（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０４１９６０及びＮｏ．Ｍ３８３０８）。非特許文献４及び５のＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、いずれもそのアミノ酸配列の３４４位に「野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸配列の３４４位に相当するトリプトファン残基」を有するものであり、本発明における変異導入の対象となるものである。一方、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに基づいて人工的に製造された変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、特許文献５から７等に開示された通りであるが、これらの変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼもまた、そのアミノ酸配列中に「野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸配列の３４４位に相当するトリプトファン残基」を有するものであり、本発明における変異導入の対象となるものである。このように、本発明でいう「３４４位に相当するトリプトファン残基」は、必ずしもそのアミノ酸配列の３４４位に存在するトリプトファン残基を意味するものではなく、あくまでも野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸配列の３４４位に「相当する」トリプトファン残基を意味するものである。

本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、上記のような「野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸配列の３４４位に相当するトリプトファン残基」を有するものを対象として、当該３４４位に相当するトリプトファン残基をバリン残基に置換したもので、実施例において詳細に示したように、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較して比活性が増大している。本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを得るためには、後述する、野生型等の変異導入の対象となるＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子をまず調製し、当該遺伝子に対して「３４４位に相当するトリプトファン残基をバリン残基に置換する」変異を遺伝子レベルで導入し、それを適当な細胞中で発現させれば良く、かかる遺伝子レベルでの変異の導入や発現については、通常の遺伝子工学的手法を利用すれば良い。

本発明の他の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージＴ７由来の野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸配列（配列番号１）の３４４位に相当するトリプトファン残基がバリン残基に置換され、更に、３４４位以外の１以上のアミノ酸残基が置換若しくは欠失され及び／又は３４４位以外の部位へアミノ酸残基が挿入若しくは付加された、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである。３４４位に相当するトリプトファン残基のバリン残基への置換以外の置換等の変異は、次のように行うことが例示できる。

変異については、例えば、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの４３０位に相当するセリン残基のプロリン残基への置換、８４９位に相当するフェニルアラニン残基のイソロイシン残基への置換、８８０位に相当するフェニルアラニン残基のチロシン残基への置換、６３３位に相当するセリン残基のプロリン残基への置換、４３０位に相当するセリン残基のプロリン残基への置換、６３３位に相当するセリン残基のプロリン残基への置換、８４９位に相当するフェニルアラニン残基のイソロイシン残基への置換、８８０位に相当するフェニルアラニン残基のチロシン残基への置換等が例示できる。これらは前述した特許文献５から７で既に報告されたものであるが、これらを３４４位に相当するトリプトファン残基のバリン残基への置換に加えて行うことにより、比活性の増大や耐熱性を更に向上することが可能となる。欠失や挿入については、例えば、酵素活性の発現等に影響しない範囲でアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸残基を欠失させ、又は、１以上のアミノ酸残基を挿入することが例示できる。付加については、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列のアミノ末端（Ｎ末端）側やカルボキシル末端（Ｃ末端）側に、例えば、他の酵素等のアミノ酸配列や、細胞での発現後の精製工程を容易に行うためのタグとなるアミノ酸配列を付加することが例示できる。

本発明の野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、例えば特許文献８を参考にしてバクテリオファージＴ７のＤＮＡを調製して、それを鋳型に用いて、適当なオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーでＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）を行って得ることができる。ここで、フォワードプライマーとリバースプライマーは、例えばＧｅｎＢａｎｋにａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０４１９６０に登録されているＴ７ＲＮＡポリメラーゼの塩基配列を参考にして、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼの塩基配列の全長をＰＣＲで増幅できるように作製することが例示できる。またＴ７ＲＮＡポリメラーゼの塩基配列の一部をＰＣＲにより増幅して、得られたＤＮＡをプライマーとして利用して、もうひとつ別のプライマーと組み合わせて次のＰＣＲを行い、そのようなＰＣＲを順次繰り返してＴ７ＲＮＡポリメラーゼの塩基配列の全長をＰＣＲで増幅することもできる。また適切な制限酵素の認識配列をふくんだＤＮＡを形成するように設計したプライマーをいくつか使って、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの塩基配列をいくつかの断片に分けてＰＣＲで増幅して、増幅したＤＮＡを適切な制限酵素で消化したのち、順次連結してＴ７ＲＮＡポリメラーゼの塩基配列の全長を作製してもよい。

このようにして得られた野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を使用するに際しては、例えば、適当なプラスミドに組み込んでそのプラスミドで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を形質転換して、その大腸菌から、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有するプラスミドを調製して使用すると良い。野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込むためのプラスミドとして、例えばｐＴｒｃ９９a（商品名、ファルマシアバイオテク社製）、ｐＳＴＶ２８（商品名、（株）タカラバイオ社製）、ｐＣＤＦ−１ｂ（商品名、メルク（株）社製）、ｐＲＳＦ−１ｂ（商品名、メルク（株）社製）等の発現用プラスミドを例示できる。ここで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ末端（Ｎ末端）側又はカルボキシル末端（Ｃ末端）側、好ましくはアミノ末端に、ヒスチジンヘキサマー配列を含んだタグ配列が付加されるように遺伝子を作製することもできる（非特許文献６）。形質転換に用いる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）としては、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、ＨＢ１０１等の各種の株が例示できる。

野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ等をコードする遺伝子への変異の導入は、例えばサイトディレクテッドミュータジェネシス法等の通常の手法により実施することができる。詳しくは、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子等を鋳型に用いて、その３４４位に相当するトリプトファン残基をコードする塩基を、バリン残基をコードするコドンに置換したプライマーを用いてＰＣＲを行うことが例示できる。さらに詳しくは、例えば野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子のアミノ末端領域を含むＤＮＡの増幅が可能なフォワードプライマーと、３４４位に相当するトリプトファン残基をコードするコドン（ＴＧＧ）を、バリンをコードするコドン（例えばＧＴＧ、ＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＴ）に置換した配列を有するリバースプライマーを用い、本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ末端側をコードするＤＮＡを増幅する第１のＰＣＲを行う。このためには第１のＰＣＲで用いるリバースプライマーを、相応の相補性を有する塩基配列にすればよく、３４４位に相当するアミノ酸残基をコードする塩基配列を例えばＧＴＧと相補的なＣＡＣにしたリバースプライマーを用いれば良い。第１のＰＣＲに引き続き、第１のＰＣＲで得られたＤＮＡと、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ等のカルボキシル末端領域をコードするＤＮＡの増幅が可能なリバースプライマーを用いて、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ等をコードする遺伝子を鋳型として第２のＰＣＲを行い、本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの全長をコードする領域を含んだＤＮＡを増幅する。第２のＰＣＲで得られるＤＮＡは、上気したような適当な発現用プラスミドに組み込むと良い。

上述した手順における、ＤＮＡへの変異の導入の確認は、ＤＮＡシーケンサーを用いる等の、一般的な手法により実施することができる。また、第１のＰＣＲにより生成されるＤＮＡに、新たな制限酵素サイトが生じるように選択した塩基配列のプライマーを使用すれば、生成した遺伝子が当該サイトにて所定の制限酵素で消化されることを目安にして、目的の変異が導入できたか否かを簡易的に確認することもできる。

本発明において、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸配列の３４４位に相当するトリプトファン残基をバリン残基に置換する変異に加え、更に、変異を導入等する場合には、３４４位に相当するトリプトファン残基の置換と同時に、又はその前後に、所定の変異を導入することができる。

上述した本発明の遺伝子は、通常の遺伝子工学の分野で使用される種々の宿主で発現することが可能である。宿主としては細菌、酵母、カビ、昆虫細胞、動物細胞又は植物細胞等を例示できるが、取扱い易さ、培養の容易性、高密度培養の可否、更には遺伝子操作における宿主／ベクター系が整備されている細菌、中でもエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌が好ましい。例えば本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を組み込んだ発現用プラスミドで形質転換した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を培養・増殖させ、適当な誘導剤を培地に加えて遺伝子発現を誘導しながら更に培養した後、その菌を集菌して適当な緩衝液中でリゾチーム処理又は超音波処理により破砕すれば、本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを可溶性画分中に回収することができる。この場合、可溶性画分に含まれる本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析による分画、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等を利用して精製し、又は、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｆ３Ｇ−Ａのようなトリアジン系色素をリガンドに用いた担体への結合を利用したアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる（非特許文献７）。そして、製造された変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、例えば非特許文献８に開示された比色定量を行うことで、その濃度を求めることができる。

本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ合成反応に用いることができる。ＲＮＡ合成のための方法自体は従来知れている方法に従えば良く、例えばＴ７プロモーターを有するＤＮＡ、４種類のＮＴＰ、マグネシウムイオン、ジチオトレイトール及びＲＮａｓｅ阻害剤を含んだｐＨ８付近の緩衝液中で変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを反応させれば良い。当該反応における変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの酵素活性は、単位時間当たりに生成したＲＮＡ量を用いて表すことができ、またＲＮＡ量は、例えば波長２６０ｎｍの吸光度から、吸光度１あたりＲＮＡ濃度４０μｇ／ｍｌという一般的な換算値から求め、又は、蛍光色素結合法により既知濃度のＲＮＡで作製した標準から定量することができる（非特許文献９）が、当該方法には市販の試薬キット（商品名Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＲＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、インビトロジェン（株）社製）を利用すると良い。
また本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡを増幅する増幅方法である、例えばＮＡＳＢＡ法（特許文献１及び２、非特許文献１及び２）、３ＳＲ法（特許文献３、非特許文献３）、ＴＲＣＲ法（特許文献４）等の、種々の核酸増幅法において利用し得る。

本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの３４４位に相当するトリプトファン残基をバリン残基に置換することにより、当該置換を導入していない、例えば野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに比べ、比活性が高く、より効率よく転写反応を行うことができる。この３４４位に相当するトリプトファン残基のバリン残基への置換については従来何ら報告がなく、従って本発明は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの改良に関する知見を提供するものである。これにより、種々の分野で利用されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼを、その用途に応じて改良する際に、改良の選択肢の一つとして有用である。

また前述した通り、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基の変異による比活性の増大等の改良は、相同性が高いバクテリオファージ由来ＲＮＡポリメラーゼの改良の指針としても期待されていることから、本発明は、バクテリオファージ由来ＲＮＡポリメラーゼの改良に対しても、有用な指針の一つを示すものである。

以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。

実施例１
特許文献８を参考にしてバクテリオファージＴ７（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＢＡＡ−１０２５−Ｂ２）を感染させた大腸菌Ｃ６００よりバクテリオファージＴ７ゲノムＤＮＡを調製した。それを鋳型にして、配列番号４で示したプライマーと配列番号５で示したプライマーを用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、（株）タカラバイオ社製）を使ってＰＣＲを行って、サイズが１．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ１）を増幅した。また配列番号６で示したプライマーと配列番号７で示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、サイズが０．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ２）を増幅した。ＤＮＡ１とＤＮＡ２のそれぞれをアガロースゲル電気泳動した後、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ１５キット（商品名、ＭＯ ＢＩＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いてゲルから抽出し精製した。

精製したＤＮＡ１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと制限酵素ＢｓｐＨＩで消化したのち、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ１３８７２に登録されているプラスミドｐＴｒｃ９９a（商品名、ファルマシアバイオテク社製）を制限酵素ＮｃｏＩと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化して得た４．１ｋｂｐのＤＮＡと、ライゲーションして環化させ、ついでそれを用いて大腸菌ＪＭ１０９をトランスフォームした。ライゲーションにはＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ２．１（商品名、（株）タカラバイオ社製）を用いた。

形質転換した大腸菌は５０μｇ／ｍｌカルベニシリンナトリウムと１％グルコースを含んだＬＢ（ＬＢ／Ｃａｒｂ／ｇｌｃ）寒天培地で一晩培養して、そのコロニーを得た。得られたコロニーから大腸菌を釣菌してＬＢ／Ｃａｒｂ／ｇｌｃ培地で培養したのち、集菌して、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＫｉｔＩ（商品名、Ｏｍｅｇａ ＢＩＯ−ＴＥＫ社製）を用いてサイズが６ｋｂｐのプラスミドを得た。そのプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したのち、仔牛小腸由来アルカリホスファターゼで脱リン酸処理した。それを、ＤＮＡ２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化して得たＤＮＡと、ライゲーションして環化させ、それを用いて大腸菌ＪＭ１０９をトランスフォームした。形質転換した大腸菌はＬＢ／Ｃａｒｂ／ｇｌｃ寒天培地で一晩培養して、そのコロニーを得た。得られたコロニーから大腸菌を釣菌してＬＢ／Ｃａｒｂ／ｇｌｃ培地で培養したのち、集菌して、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＫｉｔＩを用いてサイズが６７７３ｂｐのプラスミドｐＴｒｃ−Ｔ７ＲＰ（図１）を得た。プラスミドｐＴｒｃ−Ｔ７ＲＰにコードされたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの６１０位のリジンと６１１位のロイシンをコードする塩基配列ＡＡＧＣＴＧが制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化される塩基配列ＡＡＧＣＴＴに変異しているが、翻訳されたときのアミノ酸残基は変異しないサイレント変異である。

実施例２
プラスミドｐＴｒｃ-Ｔ７ＲＰを鋳型にして、以下に示すように４段階のＰＣＲを順次実施して得たＤＮＡを用いてプラスミドｐＣＤＦ２-Ｔ７ＲＰ調製した。

第一のＰＣＲは、配列番号８で示したプライマーと配列番号９で示したプライマーを用いてｔｒｃプロモーター/オペレーター領域とＴ７ＲＮＡポリメラーゼのＮ末端メチオニン付近をコードする領域を含んだサイズが０．１ｋｂｐのＤＮＡを増幅し、アガロースゲル電気泳動した後、ＭＥＲｍａｉｄキット（商品名、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）を用いゲルから抽出し精製した。

第二のＰＣＲには、配列番号１０で示したプライマーと、精製した０．１ｋｂｐのＤＮＡをプライマーとして用いて、サイズが１．２ｋｂｐのＤＮＡを増幅し、アガロースゲル電気泳動した後、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ１５キットを用いてゲルから抽出し精製した。

第三のＰＣＲは、第二のＰＣＲで得た１．２ｋｂｐのＤＮＡと配列番号１１で示したプライマーを用いて、サイズが２．０ｋｂｐのＤＮＡを増幅し、アガロースゲル電気泳動した後、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ１５キットを用いてゲルから抽出し精製した。

第四のＰＣＲは、第三のＰＣＲで得た２．０ｋｂｐのＤＮＡと配列番号１２で示したプライマーを用いてＰＣＲで増幅したＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動した後、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ１５キットを用いてゲルから抽出し精製して、ｔｒｃプロモーター/オペレーター領域とＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含んだサイズが２．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ３）を得た。

その一方で配列番号１３に示したプライマーと配列番号１４に示したプライマーを用い、ｐＴｒｃ９９ａを鋳型にしてＰＣＲを行い、β−ラクタマーゼ遺伝子（０．９ｋｂｐのＤＮＡ）を得て、それを制限酵素ＮｈｅＩとＢｌｎＩで消化し、プラスミドｐＣＤＦ−１ｂを制限酵素ＮｈｅＩとＢｌｎＩで消化して得た２．５ｋｂｐのＤＮＡとライゲーションしたのち、それを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、β―ラクタマーゼ遺伝子をもつ大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＤＦ（＋）を得た。大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＤＦ（＋）から得られたプラスミドｐＣＤＦ（＋）は、制限酵素ＳａｃＩとＥｃｏＮＩで消化して、プラスミドｐＣＤＦ−１ｂに由来するＴ７プロモーターおよびオペレーターの配列を除去したのち、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（商品名、（株）タカラバイオ社製）を用いてＢｌｕｎｔｉｎｇ処理した。次いでＢｌｕｎｔｉｎｇ処理したＤＮＡをライゲーションして環化させ、それを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＤＦ２を得て、プラスミドｐＣＤＦ２（図２）を調製した。

先述のＤＮＡ３を制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＢｌｎＩで二重消化した後、プラスミドｐＣＤＦ２を制限酵素ＰｓｔＩとＢｌｎＩで二重消化して得た３．２ｋｂｐのＤＮＡをライゲーションして環化させた。その環化させたＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ／ｇｌｃ寒天培地で一晩培養してコロニーを得た。得られたコロニーから大腸菌を釣菌して、ＬＢ／Ｃａｒｂ／ｇｌｃ培地で培養したのち、集菌して、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＫｉｔＩを用いてプラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰ（図３）を得た。

実施例３
プラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰを鋳型に用いて、配列番号８で示したプライマーと配列番号１５で示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｔｒｃプロモーターと野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの一部を含んだＤＮＡ（１．１ｋｂｐ）を増幅した。なお配列番号１５で示したプライマーは、３４４位に相当するトリプトファン残基をコードするコドンを、バリン残基をコードするコドンに置換するための変異と、その変異導入により制限酵素ＡｌｅＩサイトが形成されるようにデザインしたものである。

増幅したＤＮＡ（１．１ｋｂｐ）は、アガロースゲル電気泳動した後、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ１５キットを用いてゲルから抽出し精製した。次に、制限酵素ＰｍａＣＩでシングルカットしてリニアライズしたプラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰを鋳型として、前記精製したＤＮＡ（１．１ｋｂｐ）と配列番号１２で示したプライマーを用いてＰＣＲを行なった後、その反応液をアガロース電気泳動して、２．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ４）を得た。

精製したＤＮＡ４を制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＢｌｎＩで二重消化した後、プラスミドｐＣＤＦ２（図３）を制限酵素ＰｓｔＩとＢｌｎＩで二重消化して得たサイズが３．２ｋｂｐのＤＮＡとライゲーションして環化させた。その環化させたＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ／ｇｌｃ寒天培地で一晩培養してコロニーを得た。

得られたコロニーから大腸菌を釣菌してＬＢ／Ｃａｒｂ／ｇｌｃ培地で培養したのち、集菌して、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＫｉｔＩを用いてプラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰ１３１を得た。得られたプラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰ１３１及びｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰを制限酵素ＡｌｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．社製）で酵素消化した後、アガロースゲル電気泳動して消化パターンを分析したところ、ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰは制限酵素ＡｌｅＩでは消化されなかったのに対して、プラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰ１３１は制限酵素ＡｌｅＩでシングルカットされ、生じたＤＮＡのサイズは５．９ｋｂｐであった。また制限酵素で消化せずにアガロースゲル電気泳動してした場合のｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰ１３１とｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰの電気泳動の移動度は一致した。

得られたプラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰ１３１をもつ大腸菌をＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰ１３１とした。

実施例４
変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰ１３１から調製した。大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰ１３１を５０μｇ／ｍｌカルベニシリンナトリウムを含んだ２×ＹＴ培地と２０％グルコースを１９対１の割合で混合した培地を用いて２８℃で一晩培養した。その培養液を、新たに用意した培地に加えて菌密度ＯＤ_６００が０．３になるようにした後、３７℃で菌密度ＯＤ_６００が１になるまで培養した。その後、培養液に１０ｍＭ ＩＰＴＧを１／１００容量加え、さらに２時間培養した。培養後の菌密度ＯＤ_６００は約２．８であった。

培養液（２５０ｍｌ）を氷上で冷却した後、遠心分離（６，０００ｒｐｍ、１０分間）して集菌した。菌は、２０ｍＭ ＮａＣｌ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で再懸濁した後、再び遠心分離した。得られた菌を菌密度ＯＤ_６００が１８になるように、５ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ ４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁し、超音波破砕機で菌を破砕した。

菌破砕液を４℃冷却下で遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分間）して上清を得たのち、１／９容量の２Ｍ硫酸アンモニウム／１ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、さらに終濃度０．１％ｗ／ｖになるように５％ｗ／ｖポリエチレンイミン水溶液を加えて、氷冷下で２０分間放置した後遠心分離した。得られた上清はポアサイズ０．２μｍのフィルターでろ過した後、そのろ液に４５％飽和濃度になるように硫酸アンモニウムを加え、４℃で一晩放置して硫安塩析をおこなった。

遠心分離して沈殿を得たのち０．２Ｍ硫酸アンモニウム／５ｍＭ ＤＴＴ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に再溶解して、２．７ｍｌの溶液を得た。そのうちの２．２ｍｌを、予め０．２Ｍ硫酸アンモニウム／５ｍＭ ＤＴＴ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＡＦ−Ｂｌｕｅ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＣ６５０Ｍ（商品名、東ソー（株）社製）を充填したカラム（ベッド体積１．５ｍｌ）にロードした。

そのカラムに、まず１５ｍｌの０．２Ｍ硫酸アンモニウム／５ｍＭ ＤＴＴ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を供し、次に７．５ｍｌの０．２Ｍ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＤＴＴ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／２Ｍ尿素／５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、そして７．５ｍｌの０．４Ｍ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＤＴＴ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／２Ｍ尿素／５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を順次供してカラム洗浄した。次に、２Ｍ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＤＴＴ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／２Ｍ尿素／５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを溶出させ、分取した。分取のサイズは０．７５ｍｌとした。

分取したフラクションの一部についてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行って、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（分子量約９．８万）を含んでいるフラクションを調べた。その結果、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはＮａＣｌ濃度が０．４Ｍの緩衝液と２Ｍの緩衝液のフラクションに検出された。

変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含んでいるフラクションには等容量の１００％飽和硫安溶液を加え、４℃で塩析した後、遠心分離して沈殿を回収して、０．２Ｍ ＮａＣｌ／２ｍＭ ＤＴＴ／０．２ｍＭ ＥＤＴＡ／４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．７）に溶解した。次いで再度遠心分離して上清を得た後、等容量の８０％ｖ／ｖグリセリン溶液を加え、それを変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｗ３４４Ｖ）のストック溶液とした。

ストック溶液中の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの蛋白量は、ウシ血清アルブミンを標準蛋白質に用いてＢｒａｄｆｏｒｄの方法（非特許文献８）で定量した結果、６．１ｍｇであった。

実施例５
実施例４で得た本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（以下、「Ｗ３４４Ｖ」とする）と同様にして調製した野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの転写活性を測定した。転写活性の測定には、Ｔ７プロモーターとＴ７ターミネーターの間にマルチクローニングサイトを有するプラスミドｐＲＳＦ−１ｂ（メルク（株）社製）を制限酵素ＮｃｏＩとＢｌｎＩで消化後、Ｔ７プロモーターとＴ７ターミネーターを含んでいないＤＮＡ（サイズは１．６ｋｂｐ）を挿入し、Ｔ７プロモーターとＴ７ターミネーターの間に当該ＤＮＡを有するサイズが５．１ｋｂｐのプラスミドを作製し、これを転写反応の鋳型ＤＮＡとして用いた。この鋳型ＤＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼの転写反応に用いるとＴ７プロモーターからＴ７ターミネーターまでのＤＮＡが転写されてサイズが約１．８ｋｂのＲＮＡを生じる。

反応は０℃に保冷したマイクロチューブに、０．０２３μｇ／ｍｌ 鋳型ＤＮＡ、１．５ｍＭ ＮＴＰ（各１．５ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰの混合溶液）、０．６Ｕ／μｌ ＲＮａｓｉｎ Ｐｌｕｓ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（プロメガ社製）、７５ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、７．５ｍＭ ＤＴＴ、６０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）からなる溶液１０μｌを分注し、Ｗ３４４Ｖ又は野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの溶液（酵素濃度は１〜４μｇ／ｍｌ）を５μｌ混合し、４２℃で１時間転写反応させ、８０℃で２分間加熱して反応を停止した。

転写反応の生成物は、アガロースゲル電気泳動によりサイズが約１．８ｋｂであることを確認した。

生成したＲＮＡは、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＲＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（商品名、インビトロジェン（株）社製）を用いて、室温で蛍光染色した後、励起波長６４４ｎｍ、蛍光波長６７４ｎｍで蛍光測定を行い、濃度既知のＲＮＡ標準品で作製した検量線を用いて定量した。

反応温度４２℃、反応時間１時間の転写反応を行なった結果、図４したように、生成するＲＮＡの濃度は酵素濃度に依存して増加した。グラフの傾きは酵素の比活性を反映しており、図４よりＷ３４４Ｖのグラフの傾き、すなわち比活性は、野生型の比活性の約３倍であることが分かる。

実施例６
酵素濃度は１．３μｇ／ｍｌとし、転写反応の反応温度を３６℃から４８℃に変化させてＷ３４４Ｖと野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの転写活性を実施例４と同様の方法で測定した。

図５に示したように温度３６℃から４８℃において、野生型とＷ３４４Ｖで生成したＲＮＡの濃度を、対応する温度ごとに比較するといずれの場合でもＷ３４４Ｖが野生型を上回っており、Ｗ３４４Ｖの比活性が野生型より高いことがわかる。

図１は、ｐＴｒｃ−Ｔ７ＲＰ（実施例１）の制限酵素地図である。 図２は、ｐＣＤＦ２（実施例２）の制限酵素地図である。 図３は、ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰ（実施例２）の制限酵素地図である。 図４は、４２℃における野生型とＷ３４４Ｖの活性の比較（実施例５）である。 図５は、野生型とＷ３４４Ｖの活性の比較（実施例６）である。

Claims (6)

1. バクテリオファージＴ７由来の野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸配列（配列番号１）の３４４位に相当するトリプトファン残基がバリン残基に置換された、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ。
2. バクテリオファージＴ７由来の野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸配列（配列番号１）の３４４位に相当するトリプトファン残基がバリン残基に置換され、更に、３４４位以外の１以上のアミノ酸残基が置換若しくは欠失され及び／又は３４４位以外の部位へアミノ酸残基が挿入若しくは付加された、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ。
3. 請求項１又は２の変異型ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子。
4. 請求項３の遺伝子を有し、かつ、それを発現して変異型ＲＮＡポリメラーゼを生産することができる細胞。
5. 請求項４の細胞を使用する、変異型ＲＮＡポリメラーゼの製造方法。
6. 請求項１又は２の変異型ＲＮＡポリメラーゼを用いる、ＲＮＡの合成方法。

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