JP2002532095A - 安定性を増大させたｒｎａポリメラーゼ変異体 - Google Patents
安定性を増大させたｒｎａポリメラーゼ変異体Info
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Abstract
(57)【要約】
本出願は、例えば、高温条件下での増大した安定性を有する、バクテリオファージから得られる変異型ＲＮＡポリメラーゼに関する。バクテリオファージによってコードされるＲＮＡポリメラーゼの一例がＴ７ＲＮＡポリメラーゼである。Ｔ７は、大腸菌細胞に感染し得るバクテリオファージである。大腸菌に感染する他のＴ７様バクテリオファージの例には、Ｔ３、φＩ、φＩＩ、Ｗ３１、Ｈ、Ｙ、Ａ１、ｃｒｏＣ２１、Ｃ２２およびＣ２３がある。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに感染するバクテリオファージの例がＳＰ６である。本発明は、Ｔ７様バクテリオファージの変異させたＲＮＡポリメラーゼに関する。これらの変異ために、ＲＮＡＰは増大した安定性を有する。本発明による好ましい変異型ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７バクテリオファージまたはＴ３バクテリオファージに由来する変異型ＲＮＡポリメラーゼである。これらの酵素間の大きな相同性のために、Ｔ７遺伝子１の配列における変異は、Ｔ３バクテリオファージの対応する遺伝子配列において同じ効果を有すると考えられる。本発明の特に好ましい実施形態は、タンパク質におけるセリンからプロリンへのアミノ酸変化をアミノ酸配列の６３３位に有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼである。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとＴ３ＲＮＡポリメラーゼとの相同性は８０％であるので、Ｔ７遺伝子における６３３位のセリンからプロリンへの変異の同じ効果が、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼにおける６３４位のセリンからプロリンへのアミノ酸の変異について予想され得る。
Description
【０００１】 本出願は、例えば、高温条件下での増大した安定性を有する、バクテリオファ
ージから得られる変異型ＲＮＡポリメラーゼに関する。バクテリオファージによ
ってコードされるＲＮＡポリメラーゼの一例がＴ７ＲＮＡポリメラーゼである。
Ｔ７は、大腸菌細胞に感染し得るバクテリオファージである。大腸菌に感染する
他のＴ７様バクテリオファージの例には、Ｔ３、φＩ、φＩＩ、Ｗ３１、Ｈ、Ｙ
、Ａ１、ｃｒｏＣ２１、Ｃ２２およびＣ２３がある。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔ
ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに感染するバクテリオファージの例がＳＰ６である。
ージから得られる変異型ＲＮＡポリメラーゼに関する。バクテリオファージによ
ってコードされるＲＮＡポリメラーゼの一例がＴ７ＲＮＡポリメラーゼである。
Ｔ７は、大腸菌細胞に感染し得るバクテリオファージである。大腸菌に感染する
他のＴ７様バクテリオファージの例には、Ｔ３、φＩ、φＩＩ、Ｗ３１、Ｈ、Ｙ
、Ａ１、ｃｒｏＣ２１、Ｃ２２およびＣ２３がある。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔ
ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに感染するバクテリオファージの例がＳＰ６である。
【０００２】 バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼは、自身のプロモーター配列に対す
る高い選択性を有している。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼのプロモーター配列には結合するが、それ以外のバクテリオファージのプロモ
ーター配列のいずれとも結合しない。この高いプロモーター特異性により、バク
テリオファージの転写反応が、宿主のゲノムに対してではなく、自身のゲノムに
対して確実に向けられている。Ｔ７バクテリオファージの全ヌクレオチド配列は
知られており、このファージのＲＮＡポリメラーゼはＴ７遺伝子１によってコー
ドされている。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと類似する他のＲＮＡポリメラーゼには
、バクテリオファージＳＰ６およびバクテリオファージＴ３のＲＮＡポリメラー
ゼがある。Ｔ３ＲＮＡＰはＴ７ＲＮＡＰと約８０％の相同性を示す。
る高い選択性を有している。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼのプロモーター配列には結合するが、それ以外のバクテリオファージのプロモ
ーター配列のいずれとも結合しない。この高いプロモーター特異性により、バク
テリオファージの転写反応が、宿主のゲノムに対してではなく、自身のゲノムに
対して確実に向けられている。Ｔ７バクテリオファージの全ヌクレオチド配列は
知られており、このファージのＲＮＡポリメラーゼはＴ７遺伝子１によってコー
ドされている。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと類似する他のＲＮＡポリメラーゼには
、バクテリオファージＳＰ６およびバクテリオファージＴ３のＲＮＡポリメラー
ゼがある。Ｔ３ＲＮＡＰはＴ７ＲＮＡＰと約８０％の相同性を示す。
【０００３】 Ｔ７遺伝子１はクローニングされ、細菌において発現され、酵素の大量製造が
可能になっている（Ｓｔｕｄｉｅｒ他、米国特許第４９５２４９６号）。Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼは、分子量が９８．６Ｋｄａである８８３アミノ酸の単鎖タン
パク質である。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、正確な転写のために何らかの補助因
子を必要としない。この酵素は単独で、そのプロモーターを認識して、転写を開
始させ、ＲＮＡ転写物を伸長させ、かつ転写を終結させることができる。Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼは、自身のプロモーターからＤＮＡを転写させることが非常に
効率的であり、大腸菌のＲＮＡポリメラーゼと比較して５倍早くＲＮＡを伸長さ
せる。完全な転写物を産生させるその選択性、活性および能力により、バクテリ
オファージから得られるポリメラーゼは様々な目的に関して非常に役立つ。
可能になっている（Ｓｔｕｄｉｅｒ他、米国特許第４９５２４９６号）。Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼは、分子量が９８．６Ｋｄａである８８３アミノ酸の単鎖タン
パク質である。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、正確な転写のために何らかの補助因
子を必要としない。この酵素は単独で、そのプロモーターを認識して、転写を開
始させ、ＲＮＡ転写物を伸長させ、かつ転写を終結させることができる。Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼは、自身のプロモーターからＤＮＡを転写させることが非常に
効率的であり、大腸菌のＲＮＡポリメラーゼと比較して５倍早くＲＮＡを伸長さ
せる。完全な転写物を産生させるその選択性、活性および能力により、バクテリ
オファージから得られるポリメラーゼは様々な目的に関して非常に役立つ。
【０００４】 本発明は、Ｔ７様バクテリオファージの変異させたＲＮＡポリメラーゼに関す
る。
る。
【０００５】 Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼのいくつかの具体的な変異体
が記載されている。例えば、国際特許公開ＷＯ９１／０５８６６には、別の発現
システムが記載されている。このシステムは、クローニングされた遺伝子を細菌
において転写させるためにバクテリオファージのＴ７ＲＮＡプロモーターを使用
しようとするものである。このシステムは短縮型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使
用し、その遺伝子は、ヌクレオチド（野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩
基３８０９および塩基３８７７に対応する１つまたは２つ以上の塩基）を欠失さ
せることによって変異している。この欠失はフレームシフトを生じさせ、その結
果、新しい翻訳停止コドンが作出される。米国特許第５３８５８３４号には、変
異型のＴ７ＲＮＡＰもまた記載されている。米国特許第５３８５８３４号に記載
されている変異体は、グルタミン酸（２２２）をリシンに変換するＴ７遺伝子１
のヌクレオチド６６４におけるＧからＡへのトランジションである。この変異体
は、変化したプロモーター認識を示している。従って、この変異体は、通常は不
活性であるＴ７プロモーターの点変異部から転写を開始させることができる。
が記載されている。例えば、国際特許公開ＷＯ９１／０５８６６には、別の発現
システムが記載されている。このシステムは、クローニングされた遺伝子を細菌
において転写させるためにバクテリオファージのＴ７ＲＮＡプロモーターを使用
しようとするものである。このシステムは短縮型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使
用し、その遺伝子は、ヌクレオチド（野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩
基３８０９および塩基３８７７に対応する１つまたは２つ以上の塩基）を欠失さ
せることによって変異している。この欠失はフレームシフトを生じさせ、その結
果、新しい翻訳停止コドンが作出される。米国特許第５３８５８３４号には、変
異型のＴ７ＲＮＡＰもまた記載されている。米国特許第５３８５８３４号に記載
されている変異体は、グルタミン酸（２２２）をリシンに変換するＴ７遺伝子１
のヌクレオチド６６４におけるＧからＡへのトランジションである。この変異体
は、変化したプロモーター認識を示している。従って、この変異体は、通常は不
活性であるＴ７プロモーターの点変異部から転写を開始させることができる。
【０００６】 Ｉｋｅｄａ他（Ｉｋｅｄａ，Ｒ．Ａ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１：
９０７３〜９０８０、１９９２；およびＩｋｅｄａ，Ｒ．Ａ．他、Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄ．Ｒｅｓ．、２０：２５１７〜２５２４、１９９２）は、変異型Ｔ７ＲＮ
ＡＰの遺伝子配列およびプロモーター配列の活性をスクリーニングするために使
用できる２つの適合性プラスミドを記載している。第１のプラスミドは、大腸菌
のｔａｃプロモーターに連結されたＴ７遺伝子１（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコ
ードする遺伝子）を有し、第２のプラスミドは、Ｔ７プロモーターに連結された
ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝
子を有する。これらの２つのプラスミドを有する大腸菌細胞は、Ｔ７ポリメラー
ゼがＴ７プロモーターと相互作用して、ＣＡＴ遺伝子が第２のプラスミドから転
写された場合にＣＡＭ（クロラムフェニコール）耐性になる。Ｔ７プロモーター
またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼのいずれかが不活性である場合、ＣＡＴ遺伝子は
転写されず、従って、大腸菌細胞はｃａｍ感受性である。Ｉｋｅｄａ他はこれら
のプラスミドを使用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの活性に対する
いくつかの変異の影響を調べた。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子１が好適なプロ
モーターの制御下で一方のプラスミドに存在し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモ
ーターがＣＡＴのような耐性遺伝子を制御する別のプラスミドに存在するＩｋｅ
ｄａ他により記載されたシステムのようなプラスミドシステムを用いて、変異型
のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ自体をその活性について同様にスクリーニングするこ
とができる。
９０７３〜９０８０、１９９２；およびＩｋｅｄａ，Ｒ．Ａ．他、Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄ．Ｒｅｓ．、２０：２５１７〜２５２４、１９９２）は、変異型Ｔ７ＲＮ
ＡＰの遺伝子配列およびプロモーター配列の活性をスクリーニングするために使
用できる２つの適合性プラスミドを記載している。第１のプラスミドは、大腸菌
のｔａｃプロモーターに連結されたＴ７遺伝子１（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコ
ードする遺伝子）を有し、第２のプラスミドは、Ｔ７プロモーターに連結された
ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝
子を有する。これらの２つのプラスミドを有する大腸菌細胞は、Ｔ７ポリメラー
ゼがＴ７プロモーターと相互作用して、ＣＡＴ遺伝子が第２のプラスミドから転
写された場合にＣＡＭ（クロラムフェニコール）耐性になる。Ｔ７プロモーター
またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼのいずれかが不活性である場合、ＣＡＴ遺伝子は
転写されず、従って、大腸菌細胞はｃａｍ感受性である。Ｉｋｅｄａ他はこれら
のプラスミドを使用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの活性に対する
いくつかの変異の影響を調べた。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子１が好適なプロ
モーターの制御下で一方のプラスミドに存在し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモ
ーターがＣＡＴのような耐性遺伝子を制御する別のプラスミドに存在するＩｋｅ
ｄａ他により記載されたシステムのようなプラスミドシステムを用いて、変異型
のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ自体をその活性について同様にスクリーニングするこ
とができる。
【０００７】 バクテリオファージによりコードされるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）
を利用したインビトロ転写は分子生物学で広く適用される手段になっている。自
身に対するインビトロ転写と並んで、ＲＮＡポリメラーゼは、所要量のＲＮＡバ
クテリオファージを短時間で作製する手段として核酸増幅反応の一部になってい
る。そのような方法は、例えば、ＮＡＳＢＡ、３ＲＳおよびＴＭＡである。イン
ビトロ転写はまた、ＰＣＲ増幅後のさらなる線形増幅工程としてＰＣＲとの組合
せで記載されている。
ＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）
を利用したインビトロ転写は分子生物学で広く適用される手段になっている。自
身に対するインビトロ転写と並んで、ＲＮＡポリメラーゼは、所要量のＲＮＡバ
クテリオファージを短時間で作製する手段として核酸増幅反応の一部になってい
る。そのような方法は、例えば、ＮＡＳＢＡ、３ＲＳおよびＴＭＡである。イン
ビトロ転写はまた、ＰＣＲ増幅後のさらなる線形増幅工程としてＰＣＲとの組合
せで記載されている。
【０００８】 上記の適用のすべてに関して、等温的な増幅方法（ＮＡＳＢＡ、３ＲＳおよび
ＴＭＡ）がより高い温度で実施できることは、反応温度を高くすることができ、
その結果、転写反応の速度論がより良好になり、かつより重要になる場合には好
都合である。等温的な増幅反応のインキュベーション温度をこのように高くする
ことは、構造化したＲＮＡの増幅をより効率的にすることができる。このことが
重要である適用は、長いＲＮＡ配列（＞５００ヌクレオチド）の増幅であり、多
重反応（すなわち、１つの反応混合物中における多数のＲＮＡ配列の増幅）であ
る。
ＴＭＡ）がより高い温度で実施できることは、反応温度を高くすることができ、
その結果、転写反応の速度論がより良好になり、かつより重要になる場合には好
都合である。等温的な増幅反応のインキュベーション温度をこのように高くする
ことは、構造化したＲＮＡの増幅をより効率的にすることができる。このことが
重要である適用は、長いＲＮＡ配列（＞５００ヌクレオチド）の増幅であり、多
重反応（すなわち、１つの反応混合物中における多数のＲＮＡ配列の増幅）であ
る。
【０００９】 本発明は、Ｔ７様バクテリファージに由来し、増大した安定性を有するＲＮＡ
ポリメラーゼの変異体に関する。
ポリメラーゼの変異体に関する。
【００１０】 無作為に変異させたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体の分析により、Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラーゼタンパク質に対する安定化作用を有し、かつ通常（通常とは３７℃
〜４１℃である）よりも高い温度での酵素活性を可能にする多数の可能な変異が
明らかにされた。無作為に変異させたＴ７ＲＮＡポリメラーゼの配列を、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいて、Ｉｋｅｄａ他（
１９９２）に記載されているような２つのプラスミドのシステムで配列をスクリ
ーニングすることによって分析した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ細胞を高温（４５℃〜５０℃）で生育させた。その際、変異型
のＴ７配列が、このような温度でポリメラーゼ活性を可能にするより安定なＴ７
ＲＮＡポリメラーゼをコードする場合にだけ、ＣＡＭ耐性が得られる。このＢａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのシステムにおいて、一
方のプラスミドは、Ｔ７プロモーターの制御下に抗生物質耐性遺伝子（ＣＡＴ）
を含み、もう一方のプラスミドは、Ｂａｃｉｌｌｕｓプロモーターの制御下にＴ
７ＲＮＡポリメラーゼの変異ライブラリーを含む。変異によりＴ７ＲＮＡポリメ
ラーゼが高い温度で機能的になり得るそのような場合に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓはＣＡＭ耐性になる。上記に記載されるシ
ステムを使用して、４３クローンのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が見出された
。この集団の中で、１２クローンをさらに詳しく分析した。すなわち、コードす
る遺伝子のヌクレオチド配列を決定した。分析された１１クローンの集団は、ア
ミノ酸の変化をもたらす変異とサイレントな変異との両方からなった（表１参照
）。アミノ酸の変化をもたらす変異をさらに調べた。
ポリメラーゼタンパク質に対する安定化作用を有し、かつ通常（通常とは３７℃
〜４１℃である）よりも高い温度での酵素活性を可能にする多数の可能な変異が
明らかにされた。無作為に変異させたＴ７ＲＮＡポリメラーゼの配列を、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいて、Ｉｋｅｄａ他（
１９９２）に記載されているような２つのプラスミドのシステムで配列をスクリ
ーニングすることによって分析した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ細胞を高温（４５℃〜５０℃）で生育させた。その際、変異型
のＴ７配列が、このような温度でポリメラーゼ活性を可能にするより安定なＴ７
ＲＮＡポリメラーゼをコードする場合にだけ、ＣＡＭ耐性が得られる。このＢａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのシステムにおいて、一
方のプラスミドは、Ｔ７プロモーターの制御下に抗生物質耐性遺伝子（ＣＡＴ）
を含み、もう一方のプラスミドは、Ｂａｃｉｌｌｕｓプロモーターの制御下にＴ
７ＲＮＡポリメラーゼの変異ライブラリーを含む。変異によりＴ７ＲＮＡポリメ
ラーゼが高い温度で機能的になり得るそのような場合に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓはＣＡＭ耐性になる。上記に記載されるシ
ステムを使用して、４３クローンのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が見出された
。この集団の中で、１２クローンをさらに詳しく分析した。すなわち、コードす
る遺伝子のヌクレオチド配列を決定した。分析された１１クローンの集団は、ア
ミノ酸の変化をもたらす変異とサイレントな変異との両方からなった（表１参照
）。アミノ酸の変化をもたらす変異をさらに調べた。
【００１１】
【表１】
【００１２】 上記の変異を含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼのクローンをさらに調べ、酵素活性
および熱安定性に関してこれらの変異型Ｔ７ポリメラーゼの特性を明らかにする
ことができる。
および熱安定性に関してこれらの変異型Ｔ７ポリメラーゼの特性を明らかにする
ことができる。
【００１３】 本発明による好ましい変異型ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７バクテリオファージ
またはＳＰ３バクテリオファージに由来する変異型ＲＮＡポリメラーゼである。
これらの酵素間の大きな相同性のために、Ｔ７遺伝子１の配列における変異は、
Ｔ３バクテリオファージの対応する遺伝子配列において同じ効果を有すると考え
られる。本発明の特に好ましい実施形態は、タンパク質におけるセリンからプロ
リンへのアミノ酸変化をアミノ酸配列の６３３位に有するＴ７ＲＮＡポリメラー
ゼである。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとＴ３ＲＮＡポリメラーゼとの相同性は８０
％であるので、Ｔ７遺伝子における６３３位のセリンからプロリンへの変異の同
じ効果が、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼにおける６３４位のセリンからプロリンへの
アミノ酸の変異について予想され得る。
またはＳＰ３バクテリオファージに由来する変異型ＲＮＡポリメラーゼである。
これらの酵素間の大きな相同性のために、Ｔ７遺伝子１の配列における変異は、
Ｔ３バクテリオファージの対応する遺伝子配列において同じ効果を有すると考え
られる。本発明の特に好ましい実施形態は、タンパク質におけるセリンからプロ
リンへのアミノ酸変化をアミノ酸配列の６３３位に有するＴ７ＲＮＡポリメラー
ゼである。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとＴ３ＲＮＡポリメラーゼとの相同性は８０
％であるので、Ｔ７遺伝子における６３３位のセリンからプロリンへの変異の同
じ効果が、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼにおける６３４位のセリンからプロリンへの
アミノ酸の変異について予想され得る。
【００１４】 ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子であって、野生型のタンパク質と比較
したときにそのコードされるＲＮＡポリメラーゼの増大した安定性をもたらす１
つまたは２以上の変異を含む遺伝子は、同様に本発明の一部である。特に、Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子が本発明
では関連する。
したときにそのコードされるＲＮＡポリメラーゼの増大した安定性をもたらす１
つまたは２以上の変異を含む遺伝子は、同様に本発明の一部である。特に、Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子が本発明
では関連する。
【００１５】 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の６３３位におけるセリンからプロリ
ンへのアミノ酸の変化は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列の１８９
７位におけるＴからＣへの変異の結果である。
ンへのアミノ酸の変化は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列の１８９
７位におけるＴからＣへの変異の結果である。
【００１６】 従って、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列の１８９７位におけるＴ
からＣへの変異を有する変異型Ｔ７ポリメラーゼの遺伝子は、同様に本発明の一
部である。変異は、Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．およびＳｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．［（１
９８３）バクテリオファージＴ７ＤＮＡの完全なヌクレオチド配列およびＴ７遺
伝子エレメントの位置、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６（４）、４７７〜５３５
］によって発表されているＴ７ＲＮＡポリメラーゼの野生型配列と比較して評価
される。この場合、１位はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の最初のヌクレオチド
ンであり、これはバクテリオファージＴ７の完全なゲノム配列におけるヌクレオ
チド番号３１７１である。
からＣへの変異を有する変異型Ｔ７ポリメラーゼの遺伝子は、同様に本発明の一
部である。変異は、Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．およびＳｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．［（１
９８３）バクテリオファージＴ７ＤＮＡの完全なヌクレオチド配列およびＴ７遺
伝子エレメントの位置、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６（４）、４７７〜５３５
］によって発表されているＴ７ＲＮＡポリメラーゼの野生型配列と比較して評価
される。この場合、１位はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の最初のヌクレオチド
ンであり、これはバクテリオファージＴ７の完全なゲノム配列におけるヌクレオ
チド番号３１７１である。
【００１７】 本発明はさらに、本発明による変異型ＲＮＡポリメラーゼを発現させるための
発現ベクターに関する。
発現ベクターに関する。
【００１８】 遺伝子を発現させるために、遺伝子は、その遺伝子によってコードされるタン
パク質の発現を可能にする調節配列の制御下に置かれる。通常、これは、発現さ
せる遺伝子をそのような調節配列の下流にクローニングすることによって行われ
る。遺伝子または遺伝子フラグメントの発現を可能にする調節配列は、例えば、
エンハンサー配列と組み合わせたプロモーター配列であってもよく、あるいはプ
ロモーター配列はエンハンサー配列と組み合わせなくてもよい。
パク質の発現を可能にする調節配列の制御下に置かれる。通常、これは、発現さ
せる遺伝子をそのような調節配列の下流にクローニングすることによって行われ
る。遺伝子または遺伝子フラグメントの発現を可能にする調節配列は、例えば、
エンハンサー配列と組み合わせたプロモーター配列であってもよく、あるいはプ
ロモーター配列はエンハンサー配列と組み合わせなくてもよい。
【００１９】 これらの配列は、その天然の形態で遺伝子に結合していることが見出されてい
るプロモーター配列であり得る。あるいは、異種のプロモーターであり得る。異
種のプロモーターを使用することの利点は、そのようなプロモーターにより、遺
伝子本来のプロモーターを認識しない宿主細胞において遺伝子を発現させる可能
性が得られることである。さらに、異種のプロモーターは誘導可能なプロモータ
ーであり得る。その結果、遺伝子の発現を任意の所望するときに開始させること
ができる。
るプロモーター配列であり得る。あるいは、異種のプロモーターであり得る。異
種のプロモーターを使用することの利点は、そのようなプロモーターにより、遺
伝子本来のプロモーターを認識しない宿主細胞において遺伝子を発現させる可能
性が得られることである。さらに、異種のプロモーターは誘導可能なプロモータ
ーであり得る。その結果、遺伝子の発現を任意の所望するときに開始させること
ができる。
【００２０】 プロモーター部位は、ＲＮＡポリメラーゼが転写に先立って結合する配列であ
る。プロモーター部位は様々なタイプで存在する。すなわち、細胞のタイプに依
存して、プロモーター部位が考え出されている。様々なプロモーター配列が、原
核生物、真核生物およびウイルスを起源とするプロモーターについて記載されて
いる。上記に言及されたタイプの組換えＤＮＡ分子は、例えば、好適な制限酵素
で好適なＤＮＡフラグメントを切断し、調節配列を含むフラグメントを同じ酵素
で切断し、その後、発現させる核酸がプロモーター配列の制御下にあるような方
法で両フラグメントを連結することによって作製することができる。有用な組換
え体を作製するための多くの異なる方法がＳａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎ
ｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））に記載され
ている。
る。プロモーター部位は様々なタイプで存在する。すなわち、細胞のタイプに依
存して、プロモーター部位が考え出されている。様々なプロモーター配列が、原
核生物、真核生物およびウイルスを起源とするプロモーターについて記載されて
いる。上記に言及されたタイプの組換えＤＮＡ分子は、例えば、好適な制限酵素
で好適なＤＮＡフラグメントを切断し、調節配列を含むフラグメントを同じ酵素
で切断し、その後、発現させる核酸がプロモーター配列の制御下にあるような方
法で両フラグメントを連結することによって作製することができる。有用な組換
え体を作製するための多くの異なる方法がＳａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎ
ｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））に記載され
ている。
【００２１】 一般に、組換え核酸配列は、いわゆるベクター分子にクローニングされる。そ
のときに形成された組換えベクター分子は、多くの場合、好適な宿主細胞内で自
己複製することができ、クローニングされた核酸配列を細胞内に入れるために使
用することができる。これは、組換えベクター分子の複製が生じる細胞であり得
る。それはまた、ベクターの調節配列が認識され、その結果、本発明による変異
型ＲＮＡポリメラーゼが発現する細胞でもあり得る。広範囲のベクターが現在知
られており、これには、細菌において使用されるベクター、例えば、ｐＢＲ３２
２、ｐＢＲ３２５およびｐＢＲ３２８、様々なｐＵＣベクター（すなわち、ｐＵ
Ｃ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９）、特異的な発現ベクター；ｐＧＥＭ
、ｐＧＥＸおよびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）、バクテリオファージに基
づくベクター；λ−ｇｔＷｅｓ、Ｃｈａｒｏｎ２８、Ｍ１３由来ファージ、ＳＶ
４０またはパピローマウイルスまたはアデノウイルスまたはポリオーマウイルス
に基づくウイルス配列を含む真核生物における発現用ベクターが含まれる（Ｒｏ
ｄｒｉｑｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．およびＤｅｎｈａｒｄｔ，Ｄ．Ｔ．編、Ｖｅｃｔｏｒ
ｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔ
ｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ（１９８８
）；Ｌｅｎｓｔｒａ他、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．、１１０：１〜２４（１９９０
））。変異型ＲＮＡポリメラーゼの発現を可能にする調節配列の制御下に核酸配
列を含む組換え分子はすべて本発明の一部と見なされる。
のときに形成された組換えベクター分子は、多くの場合、好適な宿主細胞内で自
己複製することができ、クローニングされた核酸配列を細胞内に入れるために使
用することができる。これは、組換えベクター分子の複製が生じる細胞であり得
る。それはまた、ベクターの調節配列が認識され、その結果、本発明による変異
型ＲＮＡポリメラーゼが発現する細胞でもあり得る。広範囲のベクターが現在知
られており、これには、細菌において使用されるベクター、例えば、ｐＢＲ３２
２、ｐＢＲ３２５およびｐＢＲ３２８、様々なｐＵＣベクター（すなわち、ｐＵ
Ｃ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９）、特異的な発現ベクター；ｐＧＥＭ
、ｐＧＥＸおよびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）、バクテリオファージに基
づくベクター；λ−ｇｔＷｅｓ、Ｃｈａｒｏｎ２８、Ｍ１３由来ファージ、ＳＶ
４０またはパピローマウイルスまたはアデノウイルスまたはポリオーマウイルス
に基づくウイルス配列を含む真核生物における発現用ベクターが含まれる（Ｒｏ
ｄｒｉｑｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．およびＤｅｎｈａｒｄｔ，Ｄ．Ｔ．編、Ｖｅｃｔｏｒ
ｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔ
ｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ（１９８８
）；Ｌｅｎｓｔｒａ他、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．、１１０：１〜２４（１９９０
））。変異型ＲＮＡポリメラーゼの発現を可能にする調節配列の制御下に核酸配
列を含む組換え分子はすべて本発明の一部と見なされる。
【００２２】 さらに、本発明は、変異型ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列、または
変異型ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸分子を、変異型ＲＮＡポリメ
ラーゼの発現を可能にする調節配列の制御下に含む宿主細胞を含む。
変異型ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸分子を、変異型ＲＮＡポリメ
ラーゼの発現を可能にする調節配列の制御下に含む宿主細胞を含む。
【００２３】 本発明はまた、変異型ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列、または変異
型ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸分子を、変異型ＲＮＡポリメラー
ゼの発現を可能にする調節配列の制御下に含むウイルスベクターを含む宿主細胞
を含む。
型ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸分子を、変異型ＲＮＡポリメラー
ゼの発現を可能にする調節配列の制御下に含むウイルスベクターを含む宿主細胞
を含む。
【００２４】 頻繁に使用される発現システムは、細菌、酵母、真菌、昆虫および哺乳動物細
胞の発現システムである。そのようなシステムは当分野ではよく知られており、
容易に入手することができ、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ，Ｉｎｃ．（４０３０ Ｆａｂｉａｎ Ｗａｙ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉａ ９４３０３−４６０７、米国）から市販されている。
胞の発現システムである。そのようなシステムは当分野ではよく知られており、
容易に入手することができ、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ，Ｉｎｃ．（４０３０ Ｆａｂｉａｎ Ｗａｙ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉａ ９４３０３−４６０７、米国）から市販されている。
【００２５】 宿主細胞は、ｐＢＲ３２２のような細菌型ベクター、またはｐＧＥＸのような
細菌発現ベクター、またはバクテリオファージと組み合わせた細菌起源の細胞、
例えば、大腸菌、枯草菌およびラクトバチルス種の細胞であり得る。宿主細胞は
また、真核生物起源であってもよく、例えば、酵母に特異的なベクター分子と組
み合わせた酵母細胞、あるいはベクターまたは組換えバキュロウイルスと組み合
わせた昆虫細胞のような高等真核生物細胞（Ｌｕｃｋｏｗ他、Ｂｉｏ−ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ、６：４７〜５５（１９８８））、あるいは例えばＴｉプラスミド
型ベクターまたは植物ウイルスベクターと組み合わせた植物細胞（Ｂａｒｔｏｎ
，Ｋ．Ａ．他、Ｃｅｌｌ、３２：１０３３（１９８３））、あるいは適切なベク
ターまたは組換えウイルスと同様に組み合わせたＨｅｌａ細胞、チャイニーズハ
ムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣｒａｎｄｅｌｌネコ腎臓細胞のような哺乳
動物細胞である。
細菌発現ベクター、またはバクテリオファージと組み合わせた細菌起源の細胞、
例えば、大腸菌、枯草菌およびラクトバチルス種の細胞であり得る。宿主細胞は
また、真核生物起源であってもよく、例えば、酵母に特異的なベクター分子と組
み合わせた酵母細胞、あるいはベクターまたは組換えバキュロウイルスと組み合
わせた昆虫細胞のような高等真核生物細胞（Ｌｕｃｋｏｗ他、Ｂｉｏ−ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ、６：４７〜５５（１９８８））、あるいは例えばＴｉプラスミド
型ベクターまたは植物ウイルスベクターと組み合わせた植物細胞（Ｂａｒｔｏｎ
，Ｋ．Ａ．他、Ｃｅｌｌ、３２：１０３３（１９８３））、あるいは適切なベク
ターまたは組換えウイルスと同様に組み合わせたＨｅｌａ細胞、チャイニーズハ
ムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣｒａｎｄｅｌｌネコ腎臓細胞のような哺乳
動物細胞である。
【００２６】 従って、本発明によるＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子と好適な発現制
御配列とを含む発現ベクターは、それで形質転換された宿主細胞と同様に、同様
に本発明の一部である。
御配列とを含む発現ベクターは、それで形質転換された宿主細胞と同様に、同様
に本発明の一部である。
【００２７】 本発明による変異型ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼが通常使用さ
れ、そしてそのＲＮＡポリメラーゼが、例えば、高い温度で使用され、従って、
改善された安定性が好都合であるすべてのプロセスにおいて使用される。
れ、そしてそのＲＮＡポリメラーゼが、例えば、高い温度で使用され、従って、
改善された安定性が好都合であるすべてのプロセスにおいて使用される。
【００２８】 本発明による変異型ＲＮＡポリメラーゼは、核酸の増幅に関する等温的な転写
に基づく増幅プロセスにおいて特に有用である。従って、等温的な転写に基づく
増幅方法における本発明によるＲＮＡポリメラーゼの使用もまた本発明の一部で
ある。
に基づく増幅プロセスにおいて特に有用である。従って、等温的な転写に基づく
増幅方法における本発明によるＲＮＡポリメラーゼの使用もまた本発明の一部で
ある。
【００２９】 転写に基づく増幅技術には、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモー
ターを含むテンプレートから多数のＲＮＡコピーを転写することが含まれる。こ
のような方法の場合、多数のＲＮＡコピーが、ＲＮＡポリメラーゼによって認識
される機能的なプロモーターを含むＤＮＡテンプレートから転写される。そのよ
うなコピー体は、新たな量のＤＮＡテンプレートが得られる標的などとして再び
使用される。そのような方法は、Ｇｉｎｇｅｒａｓ他による国際特許公開ＷＯ８
８／１０３１５、およびＢｕｒｇ他による国際特許公開ＷＯ８９／１０５０に記
載されている。等温的な転写に基づく増幅技術は、Ｄａｖｅｙ他による欧州特許
ＥＰ第３２３８２２号（ＮＡＳＢＡ法に関連する）、Ｇｉｎｇｅｒａｓ他による
欧州特許ＥＰ第３７３９６０号、およびＫａｃｉａｎ他による欧州特許ＥＰ第４
０８２９５号に記載されている。転写に基づく増幅反応はまた、熱に安定な酵素
を用いて行うことができる。転写に基づく増幅は、通常、約３７℃〜４１℃の温
度で行われる。このような熱に安定な酵素により、反応をより高い温度（＞４１
℃）で行うことができる。そのような熱に安定な酵素は、Ｔｏｙｏ Ｂｏｓｅｋ
ｉ ＫＫの名で出願された欧州特許ＥＰ第６８２１２１号に記載されている。
ターを含むテンプレートから多数のＲＮＡコピーを転写することが含まれる。こ
のような方法の場合、多数のＲＮＡコピーが、ＲＮＡポリメラーゼによって認識
される機能的なプロモーターを含むＤＮＡテンプレートから転写される。そのよ
うなコピー体は、新たな量のＤＮＡテンプレートが得られる標的などとして再び
使用される。そのような方法は、Ｇｉｎｇｅｒａｓ他による国際特許公開ＷＯ８
８／１０３１５、およびＢｕｒｇ他による国際特許公開ＷＯ８９／１０５０に記
載されている。等温的な転写に基づく増幅技術は、Ｄａｖｅｙ他による欧州特許
ＥＰ第３２３８２２号（ＮＡＳＢＡ法に関連する）、Ｇｉｎｇｅｒａｓ他による
欧州特許ＥＰ第３７３９６０号、およびＫａｃｉａｎ他による欧州特許ＥＰ第４
０８２９５号に記載されている。転写に基づく増幅反応はまた、熱に安定な酵素
を用いて行うことができる。転写に基づく増幅は、通常、約３７℃〜４１℃の温
度で行われる。このような熱に安定な酵素により、反応をより高い温度（＞４１
℃）で行うことができる。そのような熱に安定な酵素は、Ｔｏｙｏ Ｂｏｓｅｋ
ｉ ＫＫの名で出願された欧州特許ＥＰ第６８２１２１号に記載されている。
【００３０】 欧州特許ＥＰ第３２３８２２号、同第３７３９６０号および同第４０８２９５
号に記載されている方法は等温的な連続方法である。これらの方法の場合、４つ
の酵素活性が、増幅を達成するために必要である：ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラ
ーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ（Ｈ）活性、およ
びＲＮＡポリメラーゼ活性。これらの活性のいくつかは１つの酵素で併せ持つこ
とができ、従って、通常的には２つまたは３つの酵素が必要になるだけである。
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、ＤＮＡをＲＮＡテンプレ
ートから合成する酵素である。従って、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより
、ＤＮＡがＤＮＡテンプレートから合成される。転写に基づく増幅反応では、Ａ
ＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素またはＭＭＬＶ（モロニーネズミ白
血病ウイルス）逆転写酵素などの逆転写酵素がこれらの活性のために使用され得
る。そのような酵素は、ＲＮＡ依存性およびＤＮＡ依存性の両方のＤＮＡポリメ
ラーゼ活性を有するが、固有のＲＮａｓｅＨ活性をも有する。さらに、大腸菌の
ＲＮａｓｅＨなどのＲＮａｓｅＨを転写に基づく増幅反応の反応混合物に加える
ことができる。
号に記載されている方法は等温的な連続方法である。これらの方法の場合、４つ
の酵素活性が、増幅を達成するために必要である：ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラ
ーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ（Ｈ）活性、およ
びＲＮＡポリメラーゼ活性。これらの活性のいくつかは１つの酵素で併せ持つこ
とができ、従って、通常的には２つまたは３つの酵素が必要になるだけである。
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、ＤＮＡをＲＮＡテンプレ
ートから合成する酵素である。従って、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより
、ＤＮＡがＤＮＡテンプレートから合成される。転写に基づく増幅反応では、Ａ
ＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素またはＭＭＬＶ（モロニーネズミ白
血病ウイルス）逆転写酵素などの逆転写酵素がこれらの活性のために使用され得
る。そのような酵素は、ＲＮＡ依存性およびＤＮＡ依存性の両方のＤＮＡポリメ
ラーゼ活性を有するが、固有のＲＮａｓｅＨ活性をも有する。さらに、大腸菌の
ＲＮａｓｅＨなどのＲＮａｓｅＨを転写に基づく増幅反応の反応混合物に加える
ことができる。
【００３１】 転写に基づく増幅方法とともに広く使用されているＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ
７ＲＮＡポリメラーゼである。従って、ＲＮＡの多数のコピーを転写するために
使用されるテンプレートに組み込まれるプロモーターは、むしろＴ７プロモータ
ーである。プロモーターを含むテンプレートは、通常、標的配列を含む核酸から
出発して作出しなければならない。そのような核酸は、増幅反応の情報源として
使用される出発材料に存在し得る。出発材料に存在する核酸には、通常、標的配
列がはるかにより長い配列の一部として含まれる。さらなる核酸配列が、標的配
列の３’末端および５’末端の両方に存在し得る。増幅反応は、出発材料に由来
するこのような核酸、上記の活性をともに提供する適切な酵素、および少なくと
も１つ（通常的には２つ）のオリゴヌクレオチドを一緒にすることによって開始
させることができる。このようなオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、プロ
モーターの配列を含まなければならない。
７ＲＮＡポリメラーゼである。従って、ＲＮＡの多数のコピーを転写するために
使用されるテンプレートに組み込まれるプロモーターは、むしろＴ７プロモータ
ーである。プロモーターを含むテンプレートは、通常、標的配列を含む核酸から
出発して作出しなければならない。そのような核酸は、増幅反応の情報源として
使用される出発材料に存在し得る。出発材料に存在する核酸には、通常、標的配
列がはるかにより長い配列の一部として含まれる。さらなる核酸配列が、標的配
列の３’末端および５’末端の両方に存在し得る。増幅反応は、出発材料に由来
するこのような核酸、上記の活性をともに提供する適切な酵素、および少なくと
も１つ（通常的には２つ）のオリゴヌクレオチドを一緒にすることによって開始
させることができる。このようなオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、プロ
モーターの配列を含まなければならない。
【００３２】 転写に基づく増幅方法は、情報源物質が単鎖ＲＮＡである場合には特に有用で
ある。しかし、単鎖または二本鎖のＤＮＡを情報源物質として同様に使用するこ
とができる。転写に基づく増幅方法が、標的配列の３’末端および５’末端の両
方に存在するさらなる配列とともに、（「プラス」センスの）単鎖ＲＮＡを有す
るサンプルに対して実施される場合、先行技術に記載されている方法とともに都
合よく使用される１対のオリゴヌクレオチドは、下記のオリゴヌクレオチドから
なる： ・標的配列の３’末端にハイブリダイゼーションし得る第１のオリゴヌクレオ
チド（これは、通常、「プロモーターオリゴヌクレオチド」と呼ばれる）。その
ようなオリゴヌクレオチドは、その５’末端に結合させたプロモーター（好まし
くは、Ｔ７プロモーター）の配列を有する（このオリゴヌクレオチドのハイブリ
ダイゼーション部分は、情報源物質として使用されたプラスＲＮＡと逆の極性を
有する）。
ある。しかし、単鎖または二本鎖のＤＮＡを情報源物質として同様に使用するこ
とができる。転写に基づく増幅方法が、標的配列の３’末端および５’末端の両
方に存在するさらなる配列とともに、（「プラス」センスの）単鎖ＲＮＡを有す
るサンプルに対して実施される場合、先行技術に記載されている方法とともに都
合よく使用される１対のオリゴヌクレオチドは、下記のオリゴヌクレオチドから
なる： ・標的配列の３’末端にハイブリダイゼーションし得る第１のオリゴヌクレオ
チド（これは、通常、「プロモーターオリゴヌクレオチド」と呼ばれる）。その
ようなオリゴヌクレオチドは、その５’末端に結合させたプロモーター（好まし
くは、Ｔ７プロモーター）の配列を有する（このオリゴヌクレオチドのハイブリ
ダイゼーション部分は、情報源物質として使用されたプラスＲＮＡと逆の極性を
有する）。
【００３３】 ・標的配列の３’末端を含む第２のオリゴヌクレオチド（「プライマー」）（
このオリゴヌクレオチドはプラスＲＮＡと同じ極性を有する）。
このオリゴヌクレオチドはプラスＲＮＡと同じ極性を有する）。
【００３４】 そのような１対のオリゴヌクレオチドが、適切な活性を有するすべての酵素と
、必要なリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの十分な供給量と一
緒に１つの反応混合物に入れられ、適切な条件（すなわち、適切な緩衝剤条件お
よび適切な温度）のもとで十分な時間にわたって保たれた場合、等温的な連続増
幅反応が生じる。
、必要なリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの十分な供給量と一
緒に１つの反応混合物に入れられ、適切な条件（すなわち、適切な緩衝剤条件お
よび適切な温度）のもとで十分な時間にわたって保たれた場合、等温的な連続増
幅反応が生じる。
【００３５】 本発明によるＲＮＡポリメラーゼはまた、他の核酸増幅プロセスと一緒に使用
することができる。ポリメラーゼ連鎖反応の場合、バクテリオファージのＲＮＡ
ポリメラーゼに対するプロモーター配列、特に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに対す
るプロモーター配列が組み込まれているプライマーが使用されることがある。こ
れにより、ＲＮＡをＰＣＲ反応のＤＮＡ産物から転写させることができる。再度
ではあるが、本発明によるＲＮＡポリメラーゼは同様に適用することができる。
することができる。ポリメラーゼ連鎖反応の場合、バクテリオファージのＲＮＡ
ポリメラーゼに対するプロモーター配列、特に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに対す
るプロモーター配列が組み込まれているプライマーが使用されることがある。こ
れにより、ＲＮＡをＰＣＲ反応のＤＮＡ産物から転写させることができる。再度
ではあるが、本発明によるＲＮＡポリメラーゼは同様に適用することができる。
【００３６】 従って、等温的な転写に基づく増幅反応において使用される酵素混合物であっ
て、本発明によって提供されるＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素活性を有する酵
素、およびＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を含む酵素混合物は、同様に本発明の
一部である。
て、本発明によって提供されるＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素活性を有する酵
素、およびＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を含む酵素混合物は、同様に本発明の
一部である。
【００３７】 図面の簡単な説明 図１は、野生型酵素および変異型酵素を比較する４６℃におけるＴ７ＲＮＡポ
リメラーゼ転写反応を示す。ＲＮＡ産生は、反応のＲＮＡ産物に対する特異的な
分子ビーコンを用いてリアルタイムで測定される。 図２は、４１℃、４３℃または４５℃で野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたは
変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのいずれかを用いた反応のＮＡＳＢＡ増幅結果を
示す。
リメラーゼ転写反応を示す。ＲＮＡ産生は、反応のＲＮＡ産物に対する特異的な
分子ビーコンを用いてリアルタイムで測定される。 図２は、４１℃、４３℃または４５℃で野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたは
変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのいずれかを用いた反応のＮＡＳＢＡ増幅結果を
示す。
【００３８】 本発明を下記の実施例によりさらに説明する。
【００３９】 実施例１ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸位置６３３におけるセリンからプロリンへ
の置換を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（ＳＴＲＡＴＡＧ
ＥＮＥ）を使用して部位特異的変異誘発によって行った。全手順を、キットに同
封された製造者のプロトコルに従って行った。変異を導入するために使用された
オリゴプライマーを下記に示す。
の置換を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（ＳＴＲＡＴＡＧ
ＥＮＥ）を使用して部位特異的変異誘発によって行った。全手順を、キットに同
封された製造者のプロトコルに従って行った。変異を導入するために使用された
オリゴプライマーを下記に示す。
【００４０】 Ａ：５’−ＧＴＧ−ＴＧＡ−ＣＴＡ−ＡＧＣ−ＧＴＣ−ＣＧＧ−ＴＣＡ−ＴＧ
Ａ−ＣＧＣ−ＴＧＧ−３’ Ｂ：５’−ＣＣＡ−ＧＣＧ−ＴＣＡ−ＴＧＡ−ＣＣＧ−ＧＡＣ−ＧＣＴ−ＴＡ
Ｇ−ＴＣＡ−ＣＡＣ−３’ オリゴヌクレオチドＢはオリゴヌクレオチドＡに対して相補的である。下線部の
配列はＭｓｐＩの制限部位を示す。この制限部位は、ＴからＣへの変異をＴ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列の１８９７位に有するオリゴヌクレオチド
配列を得るために変異体クローンをスクリーニングするために使用される。
Ａ−ＣＧＣ−ＴＧＧ−３’ Ｂ：５’−ＣＣＡ−ＧＣＧ−ＴＣＡ−ＴＧＡ−ＣＣＧ−ＧＡＣ−ＧＣＴ−ＴＡ
Ｇ−ＴＣＡ−ＣＡＣ−３’ オリゴヌクレオチドＢはオリゴヌクレオチドＡに対して相補的である。下線部の
配列はＭｓｐＩの制限部位を示す。この制限部位は、ＴからＣへの変異をＴ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列の１８９７位に有するオリゴヌクレオチド
配列を得るために変異体クローンをスクリーニングするために使用される。
【００４１】 ＰＣＲ反応混合物および反応条件は下記の通りであった。 １０ｘＰｆｕ緩衝液 ５μｌ オリゴヌクレオチドＡ（１００ｎｇ／ｕｌ） １．２５μｌ オリゴＢ １．２５μｌ ２ｍＭ ｄＮＴＰｓ １．２５μｌ プラスミドテンプレート＊ １μｌＨ２Ｏ ４１μｌ 合計 ５０μｌ。
【００４２】 プラスミドテンプレートは、その後の手順における簡便な精製を行うためのヒ
スチジン標識に融合させた、データベースに発表されている完全なＴ７ＲＮＡポ
リメラーゼの野生型の遺伝子配列（Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．およびＳｔｕｄｉｅｒ，
Ｆ．Ｗ．（１９８３）バクテリオファージＴ７ＤＮＡの完全なヌクレオチド配列
およびＴ７遺伝子エレメントの位置、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６（４）、４
７７〜５３５）を含む。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、Ｔ７ＤＮＡ（Ｓｉｇ
ｍａ Ｄ４９３１）をテンプレートとして使用するＰＣＲによってクローニング
された。次いで、ＰＣＲ増幅したＴ７ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡを、ｐＵＣ１
８のマルチクローニング部位（ＭＣＳ）内に標識配列を挿入することによって事
前に作製されたｐＵＣ１８（ｔａｇ）プラスミドの適切な制限部位にクローニン
グした。Ｔ７ＲＮＡＰ遺伝子のＤＮＡ配列を配列決定によって確認した後、Ｔａ
ｇ−Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの融合遺伝子をｐＫＫ２２３−３発現プラスミド（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２７−４９３５−０１）の適切な部位に
サブクローニングして、Ｔａｇ−Ｔ７ＲＮＡＰ／ｐＫＫ２２３−３を作製した。
スチジン標識に融合させた、データベースに発表されている完全なＴ７ＲＮＡポ
リメラーゼの野生型の遺伝子配列（Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．およびＳｔｕｄｉｅｒ，
Ｆ．Ｗ．（１９８３）バクテリオファージＴ７ＤＮＡの完全なヌクレオチド配列
およびＴ７遺伝子エレメントの位置、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６（４）、４
７７〜５３５）を含む。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、Ｔ７ＤＮＡ（Ｓｉｇ
ｍａ Ｄ４９３１）をテンプレートとして使用するＰＣＲによってクローニング
された。次いで、ＰＣＲ増幅したＴ７ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡを、ｐＵＣ１
８のマルチクローニング部位（ＭＣＳ）内に標識配列を挿入することによって事
前に作製されたｐＵＣ１８（ｔａｇ）プラスミドの適切な制限部位にクローニン
グした。Ｔ７ＲＮＡＰ遺伝子のＤＮＡ配列を配列決定によって確認した後、Ｔａ
ｇ−Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの融合遺伝子をｐＫＫ２２３−３発現プラスミド（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２７−４９３５−０１）の適切な部位に
サブクローニングして、Ｔａｇ−Ｔ７ＲＮＡＰ／ｐＫＫ２２３−３を作製した。
【００４３】 ＰＣＲ反応を、下記の温度サイクルプロトコルを用いて行った： ９５℃ ３０秒 ５５℃ １分 ６８℃ １４分 ／１８サイクル ＰＣＲ反応後、１０ユニットのＤｐｎＩ制限酵素を加え、３７℃で１時間イン
キュベーションした。次いで、ＤｐｎＩ処理したＤＮＡの１μｌを大腸菌ＪＭ１
０９の形質転換に使用した。最後に、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのクローン
を、ＭｓｐＩ制限酵素を使用してプラスミドＤＮＡをスクリーニングし、制限部
位、従ってＴからＣへの変異をＴ７ＲＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列の１
８９７位に含むそのようなプラスミドを選択することによって単離した。
キュベーションした。次いで、ＤｐｎＩ処理したＤＮＡの１μｌを大腸菌ＪＭ１
０９の形質転換に使用した。最後に、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのクローン
を、ＭｓｐＩ制限酵素を使用してプラスミドＤＮＡをスクリーニングし、制限部
位、従ってＴからＣへの変異をＴ７ＲＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列の１
８９７位に含むそのようなプラスミドを選択することによって単離した。
【００４４】 実施例２ 変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを、下記のプロトコルを用いて単離した： １．ＴからＣへの変異をＴ７ＲＮＡポリメラーゼのヌクレオチド配列の１８９７
位に有するＴａｇ−Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ／ｐＫＫ２２３−３プラスミドを有
する大腸菌ＪＭ１０９を、５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する３．５ｍｌ
の２ｘＹＴブロス（１６ｇ／Ｌのバクトトリプトン、１０ｇ／Ｌのバクト酵母抽
出物、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）において３７℃で１６時間〜２４時間培養する。
２．細胞を遠心分離によって１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに集め、ペレ
ットを一旦凍結する。 ３．１ｍｌの氷冷した精製緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
、１ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ）を加える。 ４．細胞を４℃で１．５分間の超音波処理を行うことによって溶解する。 ５．チューブを１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清（細胞抽出物）
を新しいチューブに移す。 ６．１００ｕｌのアフィニティー樹脂懸濁物（ＴＡＬＯＮ：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
を加え、ヒスチジン標識物を結合させる。 ７．チューブを回転式振とう器によって４℃で３０分間穏やかに攪拌する。 ８．樹脂を遠心分離によって集め、樹脂ペレットを０．５ｍｌの精製緩衝液で２
回洗浄する。 ９．３００ｕｌの溶出緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、
１ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ、１００ｍＭのイミダゾール）を加え
、樹脂を穏やかなボルテックスによって懸濁する。 １０．チューブを室温で３０秒間インキュベーションして、１５，０００ｒｐｍ
で３分間遠心分離する。 １１．上清を新しいチューブに移す。 １２．限外ろ過メンブラン（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使
用することによって酵素を濃縮し、同時に緩衝液を２ｘ保存緩衝液（２０ｍＭの
ＫＰＯ４（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍ
ＭのＤＴＴ）に置換する。 １３．Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬を使用することによってタンパク
質濃度を測定し、濃度を２ｘ保存緩衝液で０．５ｍｇ／ｍｌに調節する。 １４．等量のグリセロールを加える。 １５．酵素溶液を−２０℃で保存する。
位に有するＴａｇ−Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ／ｐＫＫ２２３−３プラスミドを有
する大腸菌ＪＭ１０９を、５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する３．５ｍｌ
の２ｘＹＴブロス（１６ｇ／Ｌのバクトトリプトン、１０ｇ／Ｌのバクト酵母抽
出物、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）において３７℃で１６時間〜２４時間培養する。
２．細胞を遠心分離によって１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに集め、ペレ
ットを一旦凍結する。 ３．１ｍｌの氷冷した精製緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
、１ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ）を加える。 ４．細胞を４℃で１．５分間の超音波処理を行うことによって溶解する。 ５．チューブを１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清（細胞抽出物）
を新しいチューブに移す。 ６．１００ｕｌのアフィニティー樹脂懸濁物（ＴＡＬＯＮ：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
を加え、ヒスチジン標識物を結合させる。 ７．チューブを回転式振とう器によって４℃で３０分間穏やかに攪拌する。 ８．樹脂を遠心分離によって集め、樹脂ペレットを０．５ｍｌの精製緩衝液で２
回洗浄する。 ９．３００ｕｌの溶出緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、
１ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ、１００ｍＭのイミダゾール）を加え
、樹脂を穏やかなボルテックスによって懸濁する。 １０．チューブを室温で３０秒間インキュベーションして、１５，０００ｒｐｍ
で３分間遠心分離する。 １１．上清を新しいチューブに移す。 １２．限外ろ過メンブラン（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使
用することによって酵素を濃縮し、同時に緩衝液を２ｘ保存緩衝液（２０ｍＭの
ＫＰＯ４（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍ
ＭのＤＴＴ）に置換する。 １３．Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬を使用することによってタンパク
質濃度を測定し、濃度を２ｘ保存緩衝液で０．５ｍｇ／ｍｌに調節する。 １４．等量のグリセロールを加える。 １５．酵素溶液を−２０℃で保存する。
【００４５】 実施例３ 下記のプロトコルを使用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの酵素的転写活性を測
定する。 １．下記の反応混合物を調製する。
定する。 １．下記の反応混合物を調製する。
【００４６】 （１アッセイ分） （１０アッセイ分） １０ｘ転写緩衝液（＊２） ５μｌ ５０μｌ １００ｍＭのｒＮＴＰ混合物（２５ｍＭの各ｒＮＴＰ） ０．８μｌ ８μｌ Ｔ７ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ Ｄ４９３１）（０．５ｕｇ／ｕｌ） ２μｌ ２０μｌ ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ） ２．５μｌ ２５μｌ Ｈ２Ｏ ３４．２μｌ ３４２μｌ ［３Ｈ］ｒＵＴＰ（ＮＥＮ：ＮＥＴ−２８７） ０．５μｌ ５μｌ 合計 ４５μｌ ４５０μｌ ２．４５μｌの上記反応混物を２ｍｌのエッペンドルフチューブに分注する。 ３．混合物を３７℃で３分間インキュベーションする（プレインキュベーション
）。 ４．アッセイする酵素溶液の５μｌを加え、簡潔かつ十分に混合する。 ５．３７℃で１０分間インキュベーションする。 ６．反応を停止させるために１．５ｍｌの３．６％ＰＣＡ溶液（３．６％の過塩
素酸、０．１ＭのＮａ４Ｐ２Ｏ７）を加え、氷上で１０分間インキュベーション
する。 ７．ろ過し、標準的な方法に従って［３Ｈ］を測定する。
）。 ４．アッセイする酵素溶液の５μｌを加え、簡潔かつ十分に混合する。 ５．３７℃で１０分間インキュベーションする。 ６．反応を停止させるために１．５ｍｌの３．６％ＰＣＡ溶液（３．６％の過塩
素酸、０．１ＭのＮａ４Ｐ２Ｏ７）を加え、氷上で１０分間インキュベーション
する。 ７．ろ過し、標準的な方法に従って［３Ｈ］を測定する。
【００４７】 このアッセイでは、転写活性は、下記の式を使用することにより計算される：
活性（ユニット／μｌ）＝［ｃｐｍ（サンプル）−ｃｐｍ（ブランク）］ｘ２４
／ｃｐｍ（全体） （１ユニットは、１ｎｍｏｌの標識されたヌクレオチド三リン酸が６０分間で酸
不溶物に取り込まれることを触媒する活性として定義される）。
活性（ユニット／μｌ）＝［ｃｐｍ（サンプル）−ｃｐｍ（ブランク）］ｘ２４
／ｃｐｍ（全体） （１ユニットは、１ｎｍｏｌの標識されたヌクレオチド三リン酸が６０分間で酸
不溶物に取り込まれることを触媒する活性として定義される）。
【００４８】 実施例４ この実施例では、種々のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの半減期Ｔ１／２が、下記の
プロトコルを使用することによって測定される。 １．下記の反応混合物を調製する。 （１アッセイ分） １０ｘ転写緩衝液 １０μｌ ０．５Ｍ ＫＣｌ １４μｌ ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ） １０μｌＨ２Ｏ ５６μｌ 合計 ９０μｌ （転写緩衝液：４００ｍＭのｔｒｉｓ（ｐＨ＝８．０）、２００ｍＭのＭｇＣｌ ２ 、および５０ｍＭのＤＴＴ） ２．アッセイする酵素溶液の１０μｌを加え、十分に混合する。 ３．適切な温度でインキュベーションする。 ４．５分毎または１０分毎に５μｌを取り出し、直ちに転写活性アッセイの反応
混合物（実施例３）に移して（残存）活性を測定する。 ５．ｌｎ［［ｃｐｍ（ｔ＝Ｔ）−ｃｐｍ（ブランク）］／［ｃｐｍ（ｔ＝０）−
ｃｐｍ（ブランク）］］をＴ（インキュベーション時間）に対してプロットする
。 ６．Ｔ１／２（分）をｅ（＝２．７１８）／傾きとして求める。
プロトコルを使用することによって測定される。 １．下記の反応混合物を調製する。 （１アッセイ分） １０ｘ転写緩衝液 １０μｌ ０．５Ｍ ＫＣｌ １４μｌ ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ） １０μｌＨ２Ｏ ５６μｌ 合計 ９０μｌ （転写緩衝液：４００ｍＭのｔｒｉｓ（ｐＨ＝８．０）、２００ｍＭのＭｇＣｌ ２ 、および５０ｍＭのＤＴＴ） ２．アッセイする酵素溶液の１０μｌを加え、十分に混合する。 ３．適切な温度でインキュベーションする。 ４．５分毎または１０分毎に５μｌを取り出し、直ちに転写活性アッセイの反応
混合物（実施例３）に移して（残存）活性を測定する。 ５．ｌｎ［［ｃｐｍ（ｔ＝Ｔ）−ｃｐｍ（ブランク）］／［ｃｐｍ（ｔ＝０）−
ｃｐｍ（ブランク）］］をＴ（インキュベーション時間）に対してプロットする
。 ６．Ｔ１／２（分）をｅ（＝２．７１８）／傾きとして求める。
【００４９】 野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと変異型（１８９７位におけるＴからＣへの変
異）との比較結果を下記の表２に示す。
異）との比較結果を下記の表２に示す。
【００５０】
【表２】
【００５１】 実施例５ この実施例では、インビトロ転写反応を、反応時におけるリアルタイム蛍光に
よってＲＮＡ合成量を測定するために分子ビーコン（Ｔｙａｇｉ＆Ｋｒａｍｅｒ
［１９９５］、分子ビーコン：ハイブリダイゼーションしたときに蛍光を発する
プローブ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３０３〜３０８
）を加えることによって分析した。この反応におけるテンプレートＤＮＡは、Ｔ
７プロモーターの下流にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期抗原（ＩＥＡ
）配列を含むプラスミドであり、分子ビーコン（５’フルオレセイン−ＣＣＴ
ＣＧＣ ＡＴＧ ＡＧＡ ＡＣＴ ＡＣＡ ＴＴＧ ＴＡＣ ＣＴＧ ＣＧＡ
ＧＧ−ダブシル３’）は、ＣＭＶ ＲＮＡが形成されるとすぐにＣＭＶ ＲＮＡ
にハイブリダイゼーションする。反応物（４０ｍＭのｔｒｉｓ（ｐＨ＝８．５）
、１２ｍＭのＭｇＣｌ２、７０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの各ｄＮ
ＴＰ、２ｍＭのｒＡＴＰ、２ｍＭのｒＣＴＰ、２ｍＭのｒＵＴＰ、１．５ｍＭの
ｒＧＴＰ、０．５ｍＭのＩＴＰ、０．１μｇのプラスミドＤＮＡ、および０．１
μＭの分子ビーコン）を６５℃で５分間インキュベーションし、その後、適量の
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを加え、反応物を４５℃でさらにインキュベーションし
た。蛍光量を５分毎に蛍光計で測定した。この結果を図１に示す。結果は、変異
体７−７のＴ７ＲＮＡポリメラーゼが、野生型酵素と比較して、４６℃でより大
きな酵素活性を有していることを明瞭に示している。
よってＲＮＡ合成量を測定するために分子ビーコン（Ｔｙａｇｉ＆Ｋｒａｍｅｒ
［１９９５］、分子ビーコン：ハイブリダイゼーションしたときに蛍光を発する
プローブ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３０３〜３０８
）を加えることによって分析した。この反応におけるテンプレートＤＮＡは、Ｔ
７プロモーターの下流にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期抗原（ＩＥＡ
）配列を含むプラスミドであり、分子ビーコン（５’フルオレセイン−ＣＣＴ
ＣＧＣ ＡＴＧ ＡＧＡ ＡＣＴ ＡＣＡ ＴＴＧ ＴＡＣ ＣＴＧ ＣＧＡ
ＧＧ−ダブシル３’）は、ＣＭＶ ＲＮＡが形成されるとすぐにＣＭＶ ＲＮＡ
にハイブリダイゼーションする。反応物（４０ｍＭのｔｒｉｓ（ｐＨ＝８．５）
、１２ｍＭのＭｇＣｌ２、７０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの各ｄＮ
ＴＰ、２ｍＭのｒＡＴＰ、２ｍＭのｒＣＴＰ、２ｍＭのｒＵＴＰ、１．５ｍＭの
ｒＧＴＰ、０．５ｍＭのＩＴＰ、０．１μｇのプラスミドＤＮＡ、および０．１
μＭの分子ビーコン）を６５℃で５分間インキュベーションし、その後、適量の
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを加え、反応物を４５℃でさらにインキュベーションし
た。蛍光量を５分毎に蛍光計で測定した。この結果を図１に示す。結果は、変異
体７−７のＴ７ＲＮＡポリメラーゼが、野生型酵素と比較して、４６℃でより大
きな酵素活性を有していることを明瞭に示している。
【００５２】 実施例６ 変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはまた、高温でのＮＡＳＢＡ増幅反応の一部と
して使用された。ＮＡＳＢＡ反応では、ＨＣＶ配列の一部を、アンプリコン領域
に対する２つの特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。Ｎ
ＡＳＢＡ反応物（４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．５）、１２ｍＭのＭ
ｇＣｌ２、７０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、２ｍＭの
ｒＡＴＰ、２ｍＭのｒＵＴＰ、２ｍＭのｒＣＴＰ、１．５ｍＭのｒＧＴＰ、０．
５ｍＭのＩＴＰ、０．７５ｍＭのＥＤＴＡ、１５％ｖ／ｖのＤＭＳＯ、０．２ｍ
ＭのオリゴヌクレオチドＨＣＰ１、０．２ｍＭのオリゴヌクレオチドＨＣＰ２、
０．３７５Ｍのソルビトール）を６５℃で５分間インキュベーションし、続いて
、４１℃、４３℃または４５℃で５分間インキュベーションした。次いで、酵素
混合物（２．１ｍｇのＢＳＡ、０．０１ユニットのＲＮａｓｅＨ、１０ユニット
〜５０ユニットの適切なＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、７．５ユニットのＡＭＶ−Ｒ
Ｔ）を加え、反応物を、軽くたたくことによって穏やかに混合した後、４１℃、
４３℃または４５℃で９０分間インキュベーションした。適切なプローブとハイ
ブリダイゼーションさせた後、増幅反応物の１０倍希釈物をＭａｒｋＩ装置（東
洋紡（株）、大阪、日本）で分析することによって増幅産物を検出した。図２に
示される結果は、変異体７−７のＴ７ＲＮＡポリメラーゼが、野生型Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラーゼを含有する標準的な反応と比較して４５℃ではるかに良好に増幅し
たことを明瞭に示している。
して使用された。ＮＡＳＢＡ反応では、ＨＣＶ配列の一部を、アンプリコン領域
に対する２つの特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。Ｎ
ＡＳＢＡ反応物（４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．５）、１２ｍＭのＭ
ｇＣｌ２、７０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、２ｍＭの
ｒＡＴＰ、２ｍＭのｒＵＴＰ、２ｍＭのｒＣＴＰ、１．５ｍＭのｒＧＴＰ、０．
５ｍＭのＩＴＰ、０．７５ｍＭのＥＤＴＡ、１５％ｖ／ｖのＤＭＳＯ、０．２ｍ
ＭのオリゴヌクレオチドＨＣＰ１、０．２ｍＭのオリゴヌクレオチドＨＣＰ２、
０．３７５Ｍのソルビトール）を６５℃で５分間インキュベーションし、続いて
、４１℃、４３℃または４５℃で５分間インキュベーションした。次いで、酵素
混合物（２．１ｍｇのＢＳＡ、０．０１ユニットのＲＮａｓｅＨ、１０ユニット
〜５０ユニットの適切なＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、７．５ユニットのＡＭＶ−Ｒ
Ｔ）を加え、反応物を、軽くたたくことによって穏やかに混合した後、４１℃、
４３℃または４５℃で９０分間インキュベーションした。適切なプローブとハイ
ブリダイゼーションさせた後、増幅反応物の１０倍希釈物をＭａｒｋＩ装置（東
洋紡（株）、大阪、日本）で分析することによって増幅産物を検出した。図２に
示される結果は、変異体７−７のＴ７ＲＮＡポリメラーゼが、野生型Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラーゼを含有する標準的な反応と比較して４５℃ではるかに良好に増幅し
たことを明瞭に示している。
【配列表】
【図１】 野生型酵素および変異型酵素を比較する４６℃におけるＴ７ＲＮＡポリメラー
ゼ転写反応を示す。ＲＮＡ産生は、反応のＲＮＡ産物に対する特異的な分子ビー
コンを用いてリアルタイムで測定される。
ゼ転写反応を示す。ＲＮＡ産生は、反応のＲＮＡ産物に対する特異的な分子ビー
コンを用いてリアルタイムで測定される。
【図２】 ４１℃、４３℃または４５℃で野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたは変異型Ｔ
７ＲＮＡポリメラーゼのいずれかを用いた反応のＮＡＳＢＡ増幅結果を示す。
７ＲＮＡポリメラーゼのいずれかを用いた反応のＮＡＳＢＡ増幅結果を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１１月１５日（２０００．１１．１５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 杉山 明生 福井県敦賀市呉羽町７−１ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA10 CA02 CA07 CA20 DA06 EA04 GA11 GA19 GA25 HA03 HA08 4B050 CC01 CC04 CC05 DD01 EE01 FF05E FF14E GG01 HH02 KK18 LL03 LL05 4B065 AA26X AA58X AA72X AA87X AA98Y AB01 AC14 BA02 BA16 BB01 BC03 BD01 BD14 CA29 CA46 【要約の続き】 は、タンパク質におけるセリンからプロリンへのアミノ 酸変化をアミノ酸配列の６３３位に有するＴ７ＲＮＡポ リメラーゼである。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとＴ３ＲＮ Ａポリメラーゼとの相同性は８０％であるので、Ｔ７遺 伝子における６３３位のセリンからプロリンへの変異の 同じ効果が、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼにおける６３４位 のセリンからプロリンへのアミノ酸の変異について予想 され得る。
Claims (11)
- 【請求項１】 野生型の配列と比較して変異しているＲＮＡポリメラーゼで
あって、改善された安定性を有するＲＮＡポリメラーゼ。 - 【請求項２】 バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼである、請求項１に
記載のＲＮＡポリメラーゼ。 - 【請求項３】 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼまたはＳ
Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載のＲＮＡポリメラーゼ。 - 【請求項４】 少なくとも、アミノ酸配列の６３３位においてセリンからプ
ロリンへのアミノ酸変化を有するように変異しているＴ７ＲＮＡポリメラーゼ。 - 【請求項５】 ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子であって、野生型の
タンパク質と比較したときに、コードされるＲＮＡポリメラーゼが増大した安定
性を有する１つまたは２つ以上の変異を含む遺伝子。 - 【請求項６】 前記遺伝子が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメ
ラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼをコードする、請求項５に記載の遺伝子
。 - 【請求項７】 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子であって、Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の６３３位におけるセリンからプロリンへの
アミノ酸変化をもたらすＴからＣへの変異をＴ７ＲＮＡポリメラーゼヌクレオチ
ド配列の１８９７位に有する遺伝子。 - 【請求項８】 請求項６または７に記載される遺伝子および好適な発現制御
配列を含む発現ベクター。 - 【請求項９】 請求項８に記載されるベクターで形質転換され、かつその変
異型ＲＮＡポリメラーゼを発現し得る細胞。 - 【請求項１０】 等温的な転写に基づく核酸増幅反応における請求項１〜４
のいずれかに記載されるＲＮＡポリメラーゼの使用。 - 【請求項１１】 等温的な転写に基づく核酸増幅反応において使用される酵
素混合物であって、 ・請求項１〜４のいずれかに記載されるＲＮＡポリメラーゼ、 ・逆転写酵素活性を有し、かつ必要に応じてＲｎａｓｅＨ活性を有する酵素 を含む酵素混合物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98204185.7 | 1998-12-11 | ||
| EP98204185 | 1998-12-11 | ||
| PCT/EP1999/009716 WO2000036112A1 (en) | 1998-12-11 | 1999-12-07 | Mutants of rna polymerases with increased stability |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
ID=8234452
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000588361A Expired - Lifetime JP4485066B2 (ja) | 1998-12-11 | 1999-12-07 | 安定性を増大させたｒｎａポリメラーゼ変異体 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1137781B1 (ja) |
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| AU (1) | AU1975200A (ja) |
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| DE (1) | DE69917322T2 (ja) |
| ES (1) | ES2221757T3 (ja) |
| WO (1) | WO2000036112A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003525627A (ja) * | 2000-03-07 | 2003-09-02 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | 増加した熱安定性を有するｒｎａポリメラーゼ変異体 |
| JP2009136153A (ja) * | 2007-12-03 | 2009-06-25 | Tosoh Corp | 変異型ｒｎａポリメラーゼ |
| WO2009113718A1 (ja) * | 2008-03-11 | 2009-09-17 | 東ソー株式会社 | 機能改善したｒｎａポリメラーゼ変異体 |
| WO2010016621A1 (ja) * | 2008-08-08 | 2010-02-11 | 東ソー株式会社 | 機能改善したｒｎａポリメラーゼ変異体 |
| JP2011224002A (ja) * | 2010-04-16 | 2011-11-10 | F Hoffmann La Roche Ag | 増強された熱安定性を有する新規なｔ７ｒｎａポリメラーゼ変異体 |
| JP2015502154A (ja) * | 2011-12-16 | 2015-01-22 | ビオメリューＢｉｏｍｅｒｉｅｕｘ | 異なる温度ステップを組み合わせた、核酸の転写増幅方法 |
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