CN109943549B - 一种超高速扩增型Taq DNA聚合酶 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种超高速扩增型Taq DNA聚合酶，其包含与SEQ ID No:1至少90％相同的氨基酸序列。该超高速扩增型Taq DNA聚合酶当扩增片段低于1kb,其延伸速度最快可达到1s/kb,其扩增延伸速率高于市场上普通的Taq DNA聚合酶，因此可以大大节约PCR的扩增时间。利用本发明建立的制备方法可以得到高纯度Taq DNA聚合酶。

Description

一种超高速扩增型Taq DNA聚合酶

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种超高速扩增型Taq DNA聚合酶及其应用。

背景技术

脱氧核糖核苷酸为绝大多数生物的重要遗传物质。DNA聚合酶是一种具有DNA结合和复制能力的热稳定性蛋白，其主要功能是进行DNA的半保留复制和修复。目前现有技术中已经成功克隆表达了多种生物物种的DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶1976年科学家A.Chien从水生嗜热菌(Thermus aquaticus)中分离出来的一种耐热的DNA聚合酶(Chien A，EdgarDB,Trela JM.Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophileThermus aquaticus.[J].Bacteriol,1976,127(3):1550-1557.)。1983年kary Mullis发明了PCR(polymerase chain reaction)，1988年Randall K.Saiki等首次将Taq DNA聚合酶应用于PCR技术，使得PCR过程实现了自动连续循环。

现有技术中Taq DNA聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶，属于DNA聚合酶I类，酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，分子量为94kD。在70℃～75℃时具有最高的生物学活性，在92.5℃酶活性可持续130min，95℃持续40min，97.5℃持续5-6min可保持约50％的酶活性。一般的最适反应温度为75℃，引物在50℃～60℃退火，72℃延伸，可防止引物与模板间的错配及DNA二级结构的形成，从而提高了扩增特异性，且有利于扩增较长的片段，70℃时延伸速率在60核苷酸/秒以上。

PCR技术目前广泛应用于生物学、农学和医学等领域，DNA聚合酶的研究和发展也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的主要原因，也成为目前分子生物学和基因工程中必不可少的工具酶。随着基因产业的发展，后基因时代(基因的应用时代)将进行深层次的产业变革，人们将设计和创造许多重要的新生物分子，广泛用于制药、农业、食品、化工、化妆品、环境、能源等领域。PCR技术作为基因研究和编辑的主要手段，对于新性能、高活性、低成本的DNA聚合酶的研究，对于人类的进步和发展都有重大意义。本发明因此而来。

发明内容

本发明旨在提供一种超高速扩增型Taq DNA聚合酶，以解决现有技术中的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种超高速扩增型Taq DNA聚合酶，其特征在于包含与SEQ ID No:1至少90％相同的氨基酸序列。

本发明的另一目的在于提供一种重组核酸，其特征在于所述重组核酸编码所述的DNA聚合酶。

优选的技术方案是所述重组核酸的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。

本发明的又一目的在于提供一种表达载体，其特征在于包含所述的重组核酸。

本发明的又一目的在于提供一种宿主细胞，其特征在于包含所述的表达载体。

本发明的又一目的在于提供一种制备DNA聚合酶的方法，其特征在于所述方法包括：在适合于表达编码DNA聚合酶的核酸的条件下培养所述的宿主细胞。

本发明的又一目的在于提供一种进行引物延伸的方法，其特征在于包括：在适合于引物延伸的条件下，使所述的DNA聚合酶与引物、核苷酸链模板和核苷三磷酸接触，产生延伸的引物。

本发明的又一目的在于提供一种产生延伸的引物的试剂盒，其特征在于包含：至少提供所述的DNA聚合酶。

本发明的又一目的在于提供一种反应混合物，其特征在于包含所述的DNA聚合酶、至少一对引物、核苷酸链模板和核苷三磷酸。

本发明的又一目的在于提供一种酶制剂，其特征在于包含所述的Taq DNA聚合酶。

本发明涉及一种Taq DNA聚合酶、基因、质粒、融合蛋白、用途和Taq DNA聚合酶的制备方法。所述Taq DNA聚合酶能够进行脱氧核糖核苷酸扩增反应，且令该反应更容易进行，检测灵敏度更高。所述的融合蛋白有利于嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶的纯化。

本发明所述的超高速扩增型Taq DNA聚合酶是从一种水生嗜热菌中分离得到，编码该快速Taq DNA聚合酶核苷酸序列由2499对碱基组成，编码833个氨基酸，分子量约为110KD的。当扩增片段低于1000bp,其延伸速度最快可达到1s/kb,其扩增延伸速率高于市场上普通的Taq DNA聚合酶，因此可以大大节约PCR的扩增时间。

本发明还提供一种新型快速Taq DNA聚合酶和适用于该酶特性的简单高效的纯化制备方法。所述方法具体步骤包括：

(1)合成Taq DNA聚合酶基因片段，并进行序列优化，得到SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

(2)将步骤(1)所得的核苷酸片段连接到基因表达载体中，构建重组质粒；

(3)将重组质粒转化到宿主细胞中，得到重组细胞；

(4)对步骤(3)中重组细胞进行诱导表达，收集菌体；

(5)破碎步骤(4)中菌体，过滤，收集裂解粗产物；

(6)利用镍柱亲和层析所述裂解粗产物，得到所述的Taq DNA聚合酶。

优选的技术方案中，所述方法还包括：(7)在步骤(6)利用镍柱亲和纯化后，继续进行离子交换纯化，得到所述的Taq DNA聚合酶进行蛋白定量和质检分装步骤。

优选的技术方案中，步骤(4)中诱导表达采用T7表达系统。

优选的技术方案中，所述步骤(2)中基因表达载体为pET-28a。

优选的技术方案中，所述步骤(3)中宿主细胞为原核细胞。

优选的技术方案中，所述步骤(3)中宿主细胞为大肠杆菌感受态细胞E.coliBL21。

优选的技术方案中，步骤(4)中诱导表达方法为：挑取步骤(3)中重组细胞阳性单克隆于含有20mM葡萄糖、0.5‰硫酸卡那霉素和0.3‰的氯霉素TB液体培养基，37℃，220rpm震荡培养5-8h，将培养物1％接种比例接种于含有20mM葡萄糖、0.5‰硫酸卡那霉素和0.3‰的氯霉素TB液体培养基，37℃震荡培养至OD600＝0.6-0.8左右，加入终浓度为0.5mM IPTG，和1％的无水乙醇，220rpm 16℃震荡培养16-18h。

优选的技术方案中，步骤(6)中采用三步层析纯化，第一次层析缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl₂ 1mM PMSF pH＝8.3；第二次层析缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，500mM KCl，1.5mM MgCl₂，1mM PMSF pH＝8.3；第三次层析缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，1mM PMSF，1M咪唑，pH＝8.3。

优选的技术方案中，步骤(7)中离子交换层析步骤中选用GE公司生产的HiPerp26/10Desalting进行缓冲液更换，选用GE公司生产的HiTrap Q Sepharose FF作离子交换。

采用上述方案后，本发明与现有技术相比较具有以下突出的优点和效果：

本发明的快速扩增型Taq DNA聚合酶当扩增片段低于500bp,其延伸速度最快可达到3s/kb,其扩增延伸速率高于市场上普通的Taq DNA聚合酶，因此可以大大节约PCR的扩增时间。利用本发明建立的制备方法可以得到高纯度Taq DNA聚合酶。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明DNA聚合酶不同浓度SDS-PAGE电泳结果；其中1-5分别为2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml；M为标记；

图2为各个品牌Taq DNA聚合酶扩增后进行凝胶电泳的结果，可以看到在1kbp有条带出现；其中1-5分别为TAKARA、Thermo、NEB、QIAGEN品牌和本发明的Taq 1kbp；M为分子量标记；

图3为不同来源的模板采用本发明Taq DNA聚合酶扩增后进行凝胶电泳的结果，其中1-4分别为细菌基因组、人基因组、2kb的λDNA、4kb的λDNA；M为分子量标记。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明提供了一种超高速扩增型Taq DNA聚合酶，其包含与SEQ ID No:1至少90％相同的氨基酸序列。

本发明的又一目的在于提供一种制备DNA聚合酶的方法，所述方法包括：在适合于表达编码DNA聚合酶的核酸的条件下培养所述的宿主细胞。

所述方法具体步骤包括：

(1)合成Taq DNA聚合酶基因片段，并进行序列优化，得到SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

(2)将步骤(1)所得的核苷酸片段连接到基因表达载体中，构建重组质粒；

(3)将重组质粒转化到宿主细胞中，得到重组细胞；

(4)对步骤(3)中重组细胞进行诱导表达，收集菌体；

(5)破碎步骤(4)中菌体，过滤，收集裂解粗产物；

(6)利用镍柱亲和纯化所述裂解粗产物，得到所述的超高速扩增型Taq DNA聚合酶。

定义

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。尽管基本上与本文所述的那些相似的任何方法和材料都可用于本发明的实践或试验，但是仅仅描述了示例性的方法和材料。对于本发明的目的，下列术语定义如下。

“氨基酸”是指可以并入肽、多肽或蛋白的任何单体单位。如本文所用，术语“氨基酸”包括下列20种天然或遗传编码的α-氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷胺酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。在其中“X”残基没有定义的情况下，这些应该定义为“任何氨基酸”。额外的氨基酸如硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸也能够被遗传编码。术语“氨基酸”还包括非天然氨基酸、修饰的氨基酸(例如，具有修饰的侧链和/或骨架)和氨基酸类似物。

氨基酸包括取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的羧基和一种或多种侧链或基团，或这些基团的任一种的类似物的有机酸。示例性的侧链包括，例如巯基、硒基、磺酰基、烷基、芳基、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤素、酰肼、链烯基、炔基、醚基、硼酸酯(borate)、硼酸盐(boronate)、二氧磷基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺或这些基团的任何组合。其他代表性的氨基酸包括但不限于，包含光敏交联剂的氨基酸、金属结合氨基酸、自旋标记的氨基酸、发荧光的氨基酸、包含金属的氨基酸、含新官能团的氨基酸、与其他分子共价或非共价相互作用的氨基酸、对光不稳(photocaged)和/或可光异构化的氨基酸、放射性氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化的氨基酸、其他碳水化合物修饰的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、化学可裂解的和/或光可裂解的氨基酸、包含碳连接糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、包含氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或多个毒性部分的氨基酸。

术语“生物样品”涵盖从生物体获得的各种各样的样品类型，且可以用于诊断或监测测定中。该术语涵盖尿液、尿液沉渣、血液、唾液、和其他生物来源的液体样品、实体组织样品，如活检样本或组织培养物或由其衍生的细胞和其后代。该术语涵盖在其获得后以任何方式操作，如通过用试剂处理、溶解、沉降、或针对某些成分进行富集的样品。该术语涵盖临床样品，还包括细胞培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解液、血清、血浆、生物体液和组织样品。

在本发明的术语“突变体”是指相对于对应的功能性的DNA聚合酶包含一个或多个氨基酸取代的多肽，典型为重组的。

未修饰的聚合酶(和因此还有具有增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性的修饰的形式)可以包含额外的突变以提供期望的功能性，例如双脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、核糖核苷酸类似物、染料标记的核苷酸的改进的掺入，调节5'-核酸酶活性，调节3'-核酸酶(或校正)活性等。在实施本文所述的本发明时，DNA聚合酶的未修饰的形式是预先确定的。DNA聚合酶的未修饰的形式可以是，例如野生型和/或天然存在的DNA聚合酶，或已经有意识地修饰过的DNA聚合酶。聚合酶的未修饰的形式优选热稳定DNA聚合酶，如来自各种嗜热菌的DNA聚合酶以及与野生型或天然存在的热稳定聚合酶具有基本上序列同一性的其功能性变体。这种变体可以包括，例如，嵌合DNA聚合酶。在某些实施方案中，聚合酶的未修饰的形式具有逆转录酶(RT)活性。

术语“热稳定性聚合酶”是指对热稳定的酶，其是耐热的，当经受升高的温度并持续影响双链核酸变性所必需的时间时，其保留足够的活性以影响随后的多核苷酸延伸反应，并且没有变得不可逆变性的(失活的)。核酸变性所需的加热条件是本领域熟知的。如本文所述，热稳定聚合酶适于在温度循环变化的反应如聚合酶链式反应(“PCR”)中使用。用于本文目的的不可逆变性指酶活性的永久且完全的损失。对于热稳定聚合酶，酶活性是指以适当的方式催化核苷酸的组合以形成与模板核酸链互补的多核苷酸延伸产物。来自嗜热菌的热稳定DNA聚合酶包括，例如来自海栖热袍菌，水生栖热菌，嗜热栖热菌，黄栖热菌，丝状栖热菌，栖热菌种sps17，栖热菌种Z05，Thermuscaldophilus，热坚芽孢杆菌，那不勒斯栖热袍菌和非洲栖热腔菌的DNA聚合酶。

术语“热活性的”是指在通常用于RT-PCR和/或PCR反应中逆转录或退火/延伸步骤的温度(即45-80℃)保持催化性能的酶。热稳定酶是当经受对于核酸变性所必需的高温时不会被不可逆地失活或变性的那些酶。热活性的酶可以是或可以不是热稳定的。热活性的DNA聚合酶可以是DNA或RNA依赖的来源于嗜热种或嗜常温种，包括但不限于，大肠杆菌，莫洛尼小鼠白血病病毒和禽成髓细胞瘤病毒。

如本文使用的，融合蛋白是指其氨基酸序列代表来自至少两种不同蛋白的氨基酸序列的子序列的融合产物的蛋白。融合蛋白典型地不是通过氨基酸序列的直接操作产生，而是从编码该嵌合氨基酸序列的“嵌合”基因表达的。在某些实施方案中，例如，本发明的突变型DNA聚合酶的未修饰形式是由来源于栖热菌种DNA聚合酶的氨基末端(N-末端)区域和来源于DNA聚合酶的羧基末端(C-末端)区域组成的融合蛋白。N-末端区域是指从N-末端(氨基酸位置1)延伸到内部氨基酸的区域。类似地，C-末端区域是指从内部氨基酸延伸到C-末端的区域。

在突变型DNA聚合酶与另一条序列(例如区域、片段、核苷酸或氨基酸位置等)的“对应”是基于根据核苷酸或氨基酸位置数编号并且然后以最大化序列同一性百分比的方式比对序列的规则。“对应于[特定序列]的[X]位”的氨基酸是指与指定的序列的等同氨基酸比对的目的多肽的氨基酸。通常，如本文中所述，对应于聚合酶的位置的氨基酸可以使用比对算法诸如如下所述的BLAST来确定。因为不是给定的“对应区域”内的所有位置都需要是相同的，所以对应区域内的非匹配位置可以被认为是“对应位置”。因此，如本文使用的，特定DNA聚合酶的“对应于氨基酸位置[X]的氨基酸位置”是指，基于比对，在其他DNA聚合酶和结构同源物和类中的等效位置。在本发明的一些实施方案中，氨基酸位置的“对应”是根据包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36、37或39的一个或多个基序的聚合酶区域来确定的。

“重组核酸”是指已经通过重组方法有意识地修饰过的氨基酸序列或核苷酸序列。通常通过限制性内切核酸酶的核酸操作，最初在体外形成的以自然中通常不存在的形式的核酸。因此，线性形式的分离的突变型DNA聚合酶核酸或通过连接通常不结合的DNA分子体外形成的表达载体都被认为是用于本发明的目的的重组体。可以理解的是，一旦重组核酸被制备并重新引入宿主细胞，它将非重组地复制，即，使用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操作；然而，这种核酸一旦重组产生，尽管随后非重组复制，仍然被认为是用于本发明的目的的重组体。“重组蛋白”是使用重组技术，即通过上述重组核酸的表达制备的蛋白。

核酸是“可连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么它是与编码序列可连接的；或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，那么它是与编码序列可连接的。

术语“宿主细胞”是指单细胞的原核生物和真核生物有机体(例如细菌、酵母和放线菌)以及当在细胞培养物中生长时来自高等植物或者动物的单个细胞。

术语“载体”指一条DNA，典型是双链的，它可以是其中已经插入了一条外源DNA的。载体可以是例如质粒来源的。载体包含在宿主细胞中促进载体的自主复制的“复制子”多核苷酸序列。外源DNA定义为异源的DNA，其是在宿主细胞中天然不存在的DNA，例如，其复制载体分子，编码可选择或可筛选的标记，或者编码转基因。载体用于转运外源的或异源的DNA进入合适的宿主细胞。一旦在宿主细胞中，载体可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA同时复制，可以产生数个拷贝的载体及其插入的DNA。另外，载体还可以包含容许插入的DNA转录为mRNA分子或者以其它方式使插入的DNA复制为多拷贝的RNA的必要元件。一些表达载体还包括插入的DNA附近的序列元件，其增加表达的mRNA的半衰期，和/或允许所述mRNA翻译为蛋白分子。因此，可以迅速地合成插入的DNA编码的mRNA和多肽的许多分子。

术语“核苷酸”，除了是指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体以外，本文中还应当理解为是指其相关的结构变体，包括衍生物和类似物。

术语“核酸”或“多核苷酸”是指聚合物，其可以对应于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物或其类似物。这包括核苷酸的聚合物如RNA和DNA，以及其合成形式、修饰(例如化学或生物化学修饰的)形式，和混合聚合物(例如包括RNA和DNA亚单位)。示例性的修饰包括甲基化，用类似物取代一个或更多个天然存在的核苷酸，核苷酸间的修饰如不带电的连接(例如磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸盐等)，侧面部分(例如多肽)，嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)，螯合剂，烷化剂，和修饰的连接(例如α异头核酸等)。还包括模拟多核苷酸通过氢键及其他化学相互作用与指定序列结合的能力的合成分子。虽然合成形式的核酸可以包括其他连接，典型地核苷酸单体通过磷酸二酯键连接。核酸可以是或可以包括，例如，染色体或染色体区段、载体(例如表达载体)、表达盒、裸DNA或RNA聚合物、聚合酶链式反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针和引物。核酸可以是，例如，单链、双链、或三链的，并且不限于任何特定的长度。除非另外指出，除任何明确指出的序列以外，特定的核酸序列还任选地包含或编码互补序列。

术语“寡核苷酸”是指包括至少2个核酸单体单位(例如核苷酸)的核酸。寡核苷酸典型地包括约6-约175个核酸单体单位，更典型地约8-约100个核酸单体单位，仍更典型地约10-约50个核酸单体单位(例如约15，约20，约25，约30，约35，或更多的核酸单体单位)。寡核苷酸的确切大小取决于许多因素，包括该寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸任选地通过任何合适的方法制备，包括但不限于现有或天然序列的分离，DNA复制或扩增，逆转录，适当序列的克隆和限制性消化，或通过例如，Narang等的磷酸三酯法(Meth.Enzymol.68:90-99,1979)；Brown等的磷酸二酯法(Meth.Enzymol.68:109-151,1979)；Beaucage等的二乙基亚磷酰胺法(TetrahedronLett.22:1859-1862,1981)；Matteucci等的三酯法(J.Am.Chem.Soc.103:3185-3191,1981)；自动合成法；或固相支持法，或本领域技术人员已知的其他方法的方法直接化学合成。

本文中使用的术语“引物”是指当置于起始多核苷酸延伸的条件下(例如，在包括存在所需的三磷酸核苷(在要拷贝的模板支配下)和聚合酶在适当的缓冲液中并以合适的温度或一个或多个温度的循环(例如在聚合酶链式反应中)的条件下)能够作为模板引导的核酸合成的起始点的多核苷酸。为了进一步说明，引物还可以用于多种其他寡核苷酸介导的合成过程，包括作为RNA从头合成和体外转录相关的过程(例如基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)等)的引发剂。引物典型是单链寡核苷酸(例如寡脱氧核糖核苷酸)。引物的适当长度取决于该引物预期的用途，但是典型地范围为6-40个核苷酸，更典型地为15-35个核苷酸。短的引物分子通常需要更低的温度以与模板形成足够稳定的杂合复合物。引物不需要反映模板的精确序列，但是必须是足够互补的以便与模板杂交来发生引物延伸。在某些实施方案中，术语“引物对”表示一组引物，其包括与待扩增的核酸序列的5'末端的互补序列杂交的5'有义引物(有时称为"正向")以及与待扩增的序列的3'末端杂交的3'反义引物(有时称为"反向")(例如，如果目标序列作为RNA表达或者是RNA)。如果需要，可以通过掺入通过光谱学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的或化学的方法可检测的标记来标记引物。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(通常用于ELISA测定中)、生物素、或者存在抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白。

当涉及核酸碱基、三磷酸核苷或核苷酸时，术语“天然的”是指描述的多核苷酸中天然存在的那些(即,对于DNA，这些是dATP、dGTP、dCTP和dTTP)。另外，在体外DNA合成反应如测序中，经常采用dITP和7-脱氮-dGTP来代替dGTP，且可以采用7-脱氮-dATP来代替dATP。共同地，这些称为dNTPs。

当涉及核酸碱基、核苷或核苷酸时，术语“非常规的”或“修饰的”包括在特定的多核苷酸中天然存在的常规的碱基、核苷或核苷酸的修饰物、衍生物或类似物。与常规的dNTPs相比，某些非常规核苷酸在核糖的2'位置修饰。因此，尽管对于RNA，天然存在的核苷酸是核糖核苷酸(即ATP、GTP、CTP、UTP，共称rNTPs)，因为这些核苷酸具有在糖的2'位的羟基，与之相比，dNTPs中没有所述羟基，如本文使用的，作为DNA聚合酶的底物的核糖核苷酸可以是非常规的核苷酸。如本文使用的，非常规的核苷酸包括但不限于在核酸测序中用作终止剂的化合物。示例性的终止剂化合物包括但不限于具有2',3'双脱氧结构的称为双脱氧核苷三磷酸的那些化合物。双脱氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP共同地称为ddNTPs。终止剂化合物的其他实例包括核糖核苷酸的2'-PO4类似物(参见，例如美国申请公开号2005/0037991和2005/0037398)。其他非常规的核苷酸包括硫代磷酸酯dNTPs([[α]-S]dNTPs)、5'-[α-硼烷(borano)]-dNTPs、[α]-磷酸甲酯dNTPs和核糖核苷三磷酸(rNTPs)。可以用放射性同位素如32P、33P或35S；荧光标记；化学发光标记；生物发光标记；半抗原标记如生物素；或者酶标记如链霉亲和素或亲和素来标记非常规的碱基。荧光标记可以包括带负电荷的染料，如荧光素染料，或者电荷中性的染料，如罗丹明染料，或者带正电荷的染料，如花菁类的染料。荧光素的染料包括，例如FAM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE。罗丹明类的染料包括TexasRed、ROX、R110、R6G和TAMRA。或用FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G、TexasRed和TAMRA标记的核苷酸。

通过在比较窗口比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性百分比”，其中对于两个序列的最佳比对，在比较窗口中的序列部分与参照序列(其不包括添加或缺失)相比可以包括添加或缺失(即缺口)。通过确定存在于两个序列中相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量以得到匹配位置的数量，用匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数并用100乘以该结果以得到序列同一性百分比来计算百分比。

在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中的术语“相同的”或百分比“同一性”是指相同的两个或更多个序列或子序列(subsequences)。当如使用下列序列比较算法中的一种或通过手工比对并目视检查所测量而在比较窗口或者指定的区域比较并比对最大对应时，如果它们具有特定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基(例如，在特定区域，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％同一性))，序列是彼此“基本上相同的”。如果序列是至少20％、至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％或至少55％相同，则该序列是彼此“基本上相同的”。这些定义也是指测试序列的互补序列。任选地，同一性存在于至少约50个核苷酸长度的区域中，或更典型地在100-500个或1000个或更多核苷酸长度的区域中。

在两个或更多多肽序列的上下文中，术语“相似性”或“百分比相似性”是指当如使用下列序列比较算法中的一种或通过手工比对并目视检查所测量而在比较窗口或者指定的区域比较并比对最大对应时，具有特定百分比相同的或通过保守氨基酸取代定义为相似的氨基酸残基(例如，在特定区域内60％相似性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相似的)的两个或更多个序列或子序列。如果序列至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，或者至少55％彼此相似，那么它们彼此是“基本上相似的”。任选地，这种相似性存在于至少约50个氨基酸长度的区域中，或更典型地在至少约100-500个或1000个或更多氨基酸长度的区域中。

对于序列比较，通常以一个序列作为参照序列，用测试序列与之比较。当使用序列比较算法时，将试验和参照序列输入电脑，指定子序列坐标(coordinate)，如果必要，还指定序列算法程序参数。通常使用默认程序参数，或者可以指定替代的参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性或相似性。

如本文使用的，“比较窗口”包括涉及选自20-600，通常约50-约200，更通常约100-约150的任一数量的连续位置的区段，其中在两个序列最佳比对后可以将序列与相同数量的连续位置的参照序列比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。适合用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别由Altschul等(Nuc.AcidsRes.25:3389-402,1977)和Altschul等(J.Mol.Biol.215:403-10,1990)描述。

术语“错配耐受性”是指当以模板依赖方式通过将一个或更多个核苷酸连接(例如共价地)于核酸而延伸核酸(例如，引物或其他寡核苷酸)时，聚合酶耐受包含错配的序列的能力。术语“3’错配耐受性”是指当被延伸的核酸(例如，引物或其他寡核苷酸)与其模板在引物的3’末端核苷酸处有错配时，聚合酶耐受包含错配(接近互补)的序列的能力。与模板的错配也可以位于引物的3’倒数第二个核苷酸处，或位于引物序列内的另一个位置处。术语“错配”是指在以其它形式互补的形成双链体(或可能形成双链体)的一段序列内一个或多个碱基错配(或“不互补碱基反向”)的存在。

术语“核酸延伸速率”指的是生物催化剂(例如酶，诸如聚合酶、连接酶等)以模板依赖或非模板依赖方式通过把一个或更多个核苷酸加到核酸上(例如共价地)来延伸该核酸(例如，引物或其他寡核苷酸)的速率。举例说明，此处描述的特定的突变型DNA聚合酶相对于这些DNA聚合酶的未修饰形式具有改进的核酸延伸速率，使得在一组给定的反应条件下它们可以以比这些未经修饰的形式更高的速率延伸引物。

实施例1重组表达载体的构建及转化

人工合成超高速扩增型Taq DNA聚合酶基因片段(JM1，如SEQ ID No:2所示)，并根据大肠杆菌的密码子偏好性进行序列优化，在N端加入6个组氨酸标签，使用XhoI和XbaI限制性内切酶对上述人工合成的片段进行双酶切，然后将其连入经过XhoI和XbaI限制性内切酶处理后的pET-28a载体中，得到重组表达载体pET-28a-JM1；将pET-28a-JM1转化至大肠杆菌BL21(DE3)PLySs中，挑取阳性克隆进行培养及鉴定，鉴定正确的阳性克隆即为表达TaqDNA聚合酶的重组细胞。

鉴定方法如下：挑取阳性克隆,使用T7通用引物进行菌落PCR，挑取可以扩增出2499bp的目的条带的克隆进行测序，测序结果可与目的序列比对吻合的则为正确的阳性克隆。

实施例2重组细胞的诱导表达

采用诱导T7表达系统，T7原是噬菌体的一种，用其侵染大肠杆菌后能够有效地自我复制。T7噬菌体早期转录使用E.coli的RNA聚合酶，其早期转录物包括一种使E.coli的RNA聚合酶失活的激酶以及T7RNA聚合酶；而到了晚期则只使用T7基因1编码的RNA聚合酶。T7RNA聚合酶具有超强启动其它基因转录的功能，T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，此外T7表达系统还有如下优点：

a.T7RNA聚合酶能特异性地识别T7启动子，开启下游基因的转录；

b.T7mRNA比较稳定；

c.T7mRNA带有较强的翻译信号

T7表达系统的高目的基因的表达，不可避免的也就是相对较高的本底转录。本发明中使用的BL21(DE3)pLysS菌株携带pLysS质粒，pLysS含有表达T7溶菌酶的基因。T7溶菌酶可以作用于大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖溶解大肠杆菌，还与T7 RNA聚合酶结合抑制其转录活性，可以有效降低目的基因的背景表达水平，但对IPTG诱导后目标基因的表达水平没有明显影响。

诱导表达方法如下：

a.挑取平板阳性单克隆于含有20mM葡萄糖、0.5‰硫酸卡那霉素和0.3‰的氯霉素TB液体培养基，37℃，220rpm震荡培养5-8h，

b.按a中的培养物1％接种比例接种于含有20mM葡萄糖、0.5‰硫酸卡那霉素和0.3‰的氯霉素TB液体培养基，37℃震荡培养至OD600＝0.6-0.8左右，加入终浓度为0.5mMIPTG，和1％的无水乙醇，220rpm 16℃震荡培养16-18h。

常用的大肠杆菌培养基都含有大量胰蛋白胨(tryptone)，胰蛋白胨是使用胰酶消化酪蛋白(casein)后的产物，酪蛋白一般由牛奶或大豆中提取，其中有微量的乳糖成分残留；宿主容易产生非目的性表达，这也就是在菌体自然生长的后期在不加诱导剂情况下目的蛋白也会有小量的表达的原因。有研究显示非目性表达影响菌体生长速率甚至使宿主丧失表达能力，同时非目的表达的蛋白稳定性和活性均较差。使用含有葡萄糖的非诱导培养基可以使表达更精确，由于代谢物阻遏效应(cataboliterepression)，培养基中加入葡萄糖，宿主在耗尽外源葡萄糖之前不会诱发lac操纵子而减少非目的性表达，使目的蛋白表达更准确高效。而培养基中加入1％无水乙醇，可在一定程度改变细胞膜的通透性，有效的降低包涵体的产生，使目的蛋白更多以可溶性蛋白形式存在，降低后续纯化的难度。

实施例3菌体收集破碎和粗提

具体步骤如下：

a.诱导培养结束菌液(1L)倒入离心杯，5000rpm,12min弃去上清，加入向菌体中加入60ml缓冲液A重悬菌体，5000rpm,12min弃去上清,获得菌体。

b.在是收获菌体中加入缓冲液B，重悬菌体，使用高压细胞破碎仪，15Kpsi,破碎菌体。

c.破碎液体，37℃水浴处理15min后，75℃水浴处理15min，4℃，12000rpm,60min，获得破碎上清。

上述缓冲液A的配方为：20mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，pH＝8.3；

上述缓冲液B的配方为：20mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl₂,1mM PMSF,1mg/LDNase I,1mg/L RNase A,pH＝8.3。

在破碎上清中加入DNase I，RNase A可以在一定程度上降低破碎也中残留的宿主核酸成分，同时可以有效的降低破碎液的粘度，有利于后续的亲和层析等纯化处理。

实施例4镍柱亲和层析

镍柱亲和层析步骤中介质配基为亚氨基二乙酸，选用GE公司生产的Ni SepharoseFF，该填料被广泛应用于组氨酸标签重组蛋白的纯化，螯合Ni离子脱落较少，选择性和分辨率较高。

使用镍柱层析缓冲液A平衡色谱柱约3-5CV，以约2.5ml/min速度上样，上样完成后用层析缓冲液A冲洗UV280至基线(约5-10CV)。

换用层析缓冲液B冲洗至至UV260出峰结束回到基线，再换用层析缓冲液A冲洗至电导率回到基线。

用5％层析缓冲液C洗脱杂蛋白(约5-10CV)。待UV280低于50mAu后使用20％层析缓冲液C洗脱目的蛋白(约15-25CV)，收集UV280大于50mAu组分。

由于Taq DNA聚合酶的酶学性能特殊，该类酶容易和DNA片段发生非特异性的结合，因此其宿主DNA的残留量较普通酶大，较高的宿主核酸残留，在PCR操作中会引起残留DNA和引物的非特异性杂交或者引物二聚体引起的非特异性的扩增，将对扩增速率和纯度产生较大的影响。由于核酸在缓冲液中带负电荷，因而本发明在目的蛋白和介质结合后，使用带有高盐离子的缓冲液冲洗镍柱，核酸和带正电盐离子大量结合而被洗脱，从而可以快速的去除绝大多数的残留核酸，也较小了后续离子交换过程中柱子载量的压力。该步骤和直接使用疏水层析一部纯化相比，有效减少了蛋白在高盐缓冲液中的时间，减少高盐离子对蛋白的损伤，同时更简单高效便捷。

上述层析缓冲液A的配方为：20mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl₂ 1mM PMSFpH＝8.3；上述层析缓冲液B的配方为：20mM Tris-HCl，500mM KCl，1.5mM MgCl₂，1mM PMSFpH＝8.3；上述层析缓冲液C的配方为：20mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，1mM PMSF，1M咪唑，pH＝8.3。

实施例5离子交换层析

离子交换色谱步骤中选用GE公司生产的HiPerp 26/10Desalting进行缓冲液更换，选用GE公司生产的HiTrap SP Sepharose FF作离子交换。该填料选择性和分辨率较高，且容易作方法工艺的放大开发。本发明中的目的蛋白等电点6.5左右，故使用阳离子交换，可有效去除残留核酸和杂蛋白。

具体步骤如下：

a.使用离子交换缓冲液A平衡HiPerp 26/10Desalting约3-5CV，以约2.5ml/min速度上样(镍柱亲和层析收集组分)，收集UV280大于50mAu组分。

b.使用离子交换缓冲液A平衡HiTrap SP Sepharose FF约3-5CV,2.5ml/min速度上样,上样完成后用离子交换缓冲液A冲洗UV280至基线(约5-10CV)。

c.离子交换缓冲液B作梯度洗脱，5-25CV约5-25min,按不同峰收集UV280大于50mAu组分，SDS-PAGE确定目的蛋白所在收集组分。

d.使用储存缓冲液平衡HiPerp 26/10Desalting约3-5CV，以约2.5ml/min速度上样(离子交换收集组分)，收集UV280大于50mAu组分。

上述离子交换缓冲液A的配方为：20mM磷酸钾，1mM PMSF,pH＝6.0；上述离子交换缓冲液B的配方为：20mM磷酸钾，1M NaCl,1mM PMSF,pH＝6.0；上述储存缓冲液的配方为：25mM Tris-HCl，25mM KCl，1.5mM MgCl₂，0.1mM EDTA(pH＝8.0)，50％甘油，0.5mM PMSF，1mM DTT，pH＝8.3。

实施例6蛋白定量和质检分装

使用BCA法测定蛋白浓度，使用琼脂糖凝胶电泳检测残留核酸，使用SDS-PAGE测定蛋白纯度，使用荧光定量PCR测定蛋白活性。目的蛋白样品稀释不同浓度电泳检测纯度，如图1所示。

使用0-10℃的储存缓冲液稀释蛋白样品至0.5mg/ml，稀释完成用无菌0.22μm滤膜过滤后分装到灭菌后的洁净离心管中，-20℃储存。稀释和分装过程维持温度为0-10℃。

上述荧光定量PCR测定蛋白活性原理方法为：

随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图。在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以进行定量分析。

具体方法是：

用不同浓度的质粒标准品建立实时荧光定量PCR标准曲线并检测该方法的灵敏性和重复性。

在相同体系将Taq酶热启动后在不同的温度下进行定时测试其反应扩增量及其灵敏度。

应用例应用本发明的Taq DNA聚合酶和多个不同品牌的Taq DNA聚合酶的PCR扩增比较

选取TAKARA、Thermo、NEB、QIAGEN品牌的Taq DNA聚合酶和本发明的Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增后的条带进行凝胶电泳测试，模板选取的是λDNA，扩增片段大小：962bp，扩增片段GC含量:53％，凝胶电泳结果如图2所示，扩增时间见表1，本发明的理论扩增时间和实际扩增时间远远低于其他品牌的扩增时间。

表1不同Taq DNA聚合酶的扩增活性结果

序号	1	2	3	4	5
						品牌	TAKARA	Thermo	NEB	QIAGEN	本发明Taq
理论扩增时间	50min	95.5min	53min	73min	25.5min
						实际扩增时间	100min	150min	85min	118min	58min

选取来源细菌基因组、人基因组、不同长度的λDNA，使用本发明的Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增后的条带进行凝胶电泳测试，条件是模板终浓度：0.5ng/ul；上样量：10ul；琼脂糖胶浓度：1.2％p，凝胶电泳结果如图3所示。

表2不同来源的模板片段长度

序号	1	2	3	4
					来源	细菌基因组	人基因组	λDNA	λDNA
片段长度	500bp	1kb	2kb	4kb

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州译酶生物科技有限公司

<120> 一种超高速扩增型Taq DNA聚合酶

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 844

<212> PRT

<213> Taq DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)

<400> 1

Met Arg Gly Met Leu Arg Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Arg Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Ala Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Met His Arg Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Gly Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Val Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

275 280 285

Val Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro His Glu Gly

290 295 300

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Glu Pro

325 330 335

Glu Pro Tyr Lys Asp Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Ala Lys Val Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro

355 360 365

Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn

370 375 380

Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Ala Glu Trp Thr Glu

385 390 395 400

Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu

405 410 415

Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu

420 425 430

Gly Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly

435 440 445

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala

450 455 460

Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His

465 470 475 480

Pro Phe Asn Leu Thr Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp

485 490 495

Glu His Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg

500 505 510

Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile

515 520 525

Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Asp Leu Thr Lys Leu Thr Ser Thr

530 535 540

Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu

545 550 555 560

His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser

565 570 575

Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln

580 585 590

Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala

595 600 605

Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly

610 615 620

Arg Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr

625 630 635 640

Glu Ile Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro

645 650 655

Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Glu Leu Tyr Gly

660 665 670

Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu

675 680 685

Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg

690 695 700

Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val

705 710 715 720

Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg

725 730 735

Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro

740 745 750

Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu

755 760 765

Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Arg Leu Gln Val His

770 775 780

Asp Glu Leu Val Leu Val Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala

785 790 795 800

Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Leu

805 810 815

Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Arg Glu

820 825 830

Gly Gly Gly His His His His His His His His His

835 840

<210> 2

<211> 2535

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

atgcgtggta tgttacgatt atttgaacca aaaggtcgtg ttttattggt tgatggtcat 60

catctggcct atcgtacctt tcatgcactg aagggattga caacctcccg tggcgaacgc 120

gtccaggcag tgtatggatt cgcaaagtcg ctgcttaaag cgcttaaaga agacggagat 180

gcagtcatcg tcgtattcga cgcaaaggcg ccgtcctttc gtcatgaagc atatggtggc 240

tataaggccg gtcgcgctcc aacgccggag gactttcctc gtcagcttgc ccttattaaa 300

gagttagtcg acctgctggg tttggctcgc cttgaagtgc caggctacga agcggacgct 360

gtattagcct cgttagcgaa aaaggcggaa aaggaggggt atgaagtgcg tatcctgaca 420

gccgacaagg acctttacca acttttatca gaccgcattc atgtcatgca ccgtgaaggc 480

tacttgatta cgccagcctg gctttgggaa aagtatgggt tgcgtccaga ccaatgggct 540

gattaccgtg cacttactgg cgacgaaagt gataatttgc cgggcgtcaa aggcattggt 600

gaaaagacgg cccgcaaatt acttgaggaa tggggtagct tagaggccct tttgaagaac 660

ctgggccgcc ttaaacctgc aatccgtgaa aaaatcttgg ctcacatgga tgatttaaaa 720

ttatcatggg atcttgctaa ggttcgcaca gacttgccac tggaagtcga tttcgcgaaa 780

cgtcgtgaac ctgatcgcgt gcgccttcgt gcgttcttag aacgtcttga atttggctcg 840

cttctgcatg agtttggact gttagtgtct ccaaaagcgc tggaggaggc gccatggcca 900

ccgcatgagg gagcatttgt gggttttgtt ttatcgcgta aagaaccaat gtgggcggat 960

cttctggcac tggctgctgc acgcggtggg cgtgtacacc gcgagccaga gccctataaa 1020

gacttgcgcg atttgaaaga ggcgcgcggc ttgcttgcca aggtcctttc cgtccttgca 1080

ttacgtgagg gtttgggttt accgcccgga gacgatccga tgctgttagc gtatttgtta 1140

gacccaagca acacgacacc agaaggagtg gcacgccgtt acggggcaga gtggactgaa 1200

gaagcaggcg agcgcgccgc attatctgaa cgtttgtttg ccaatctttg ggggcgcttg 1260

gagggtgagg agcgtctttt atggctgtat cgtgaaggcg aacgcccgtt gagtgctgta 1320

ttagcgcata tggaagcgac cggagtccgc cttgacgtag cttatttgcg cgccctttca 1380

ctggaagtgg ccgaggagat cgcacgtttg gaagcggagg tgtttcgtct ggccggtcac 1440

cccttcaatc tgactagtcg cgaccagttg gaacgcgtat tattcgatga gcatggtctt 1500

ccggccatcg gcaagactga gaagactgga aagcgtagca ccagtgccgc ggtgttggaa 1560

gccctgcgcg aagcacatcc tattgtcgaa aagattcttc aatatcgcga tttgaccaag 1620

ttgacgtcga cttacattga tccacttcct gaccttattc atcctcgcac aggccgtctt 1680

catactcgct ttaatcaaac cgcaacagcg accggacgtt tgagtagtag cgaccctaac 1740

cttcaaaata ttccggtacg tactccgtta ggtcaacgca ttcgtcgcgc attcatcgcc 1800

gaagaagggt ggttattagt agcattggac tatagccaaa ttgagttacg tgtattagct 1860

cacttaagtg gtcgcgaaaa cttaattcgc gtatttcagg agggtcgcga catccacact 1920

gagattgcgt cgtggatgtt tggggtaccg cgcgaggccg tggatccgct tatgcgtcgc 1980

gcggcaaaaa ccatcaattt tggggaatta tacggcatga gtgctcaccg cttaagccaa 2040

gaattagcta tcccttatga ggaggcccag gccttcattg agcgttattt ccagtcgttc 2100

ccgaaagtgc gcgcatggat cgagaaaaca ttggaggaag gtcgccgtcg tggttacgtc 2160

gagaccttat ttgggcgtcg ccgctatgtt cccgatctgg aagcccgtgt taagtcagtt 2220

cgtgaggcag cagagcgtat ggcattcaat atgcctgttc aaggaaccgc agcagatttg 2280

atgaaacttg ctatggtcaa gctgttcccg cgcttggaag aaatgggcgc acgtatgcgg 2340

cttcaggtcc atgacgagtt ggtcttggta gcgccaaagg agcgcgccga agcagtcgcg 2400

cgcctggcaa aggaagtgat ggagggagtc tatcccctgg ctgtcctttt ggaggttgaa 2460

gtagggattg gagaggactg gttaagcgca agagagggtg gtggtcacca tcaccatcac 2520

caccatcacc attaa 2535

Claims (10)

1.一种超高速扩增型Taq DNA聚合酶，其特征在于：所述超高速扩增型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

2.一种重组核酸，其特征在于：所述重组核酸编码根据权利要求1所述的超高速扩增型Taq DNA聚合酶。

3.根据权利要求2所述的重组核酸，其特征在于：所述重组核酸的核苷酸序列如SEQ IDNo:2所示。

4.一种表达载体，其特征在于包含权利要求2～3中任意一项所述的重组核酸。

5.一种宿主细胞，其特征在于包含权利要求4所述的表达载体。

6.一种制备DNA聚合酶的方法，其特征在于包括：在适合于表达编码DNA聚合酶的核酸的条件下培养权利要求5所述的宿主细胞。

7.一种进行引物延伸的方法，其特征在于包括：在适合于引物延伸的条件下，使权利要求1所述的超高速扩增型Taq DNA聚合酶与引物、核苷酸链模板和核苷三磷酸接触，产生延伸的引物。

8.产生延伸的引物的试剂盒，其特征在于至少提供权利要求1所述的超高速扩增型TaqDNA聚合酶。

9.一种反应混合物，其特征在于包含权利要求1所述的超高速扩增型Taq DNA聚合酶、至少一对引物、核苷酸链模板和核苷三磷酸。

10.一种酶制剂，其特征在于包括权利要求1所述的超高速扩增型Taq DNA聚合酶。

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