JP7107345B2 - Ｐｃｒ方法 - Google Patents

Description

本発明は、核酸増幅、特にＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）の分野に関する。さらに詳しくは、ＰＣＲ反応時間を短縮させる方法に関する。

ＰＣＲ法とは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。この方法により、数コピーといった極微量サンプルから標的核酸を何十万倍に増幅することができるため、研究用途のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。

ＰＣＲは高い検出感度を持つものの、反応に熱サイクルを実施する必要があり、反応時間が長いことが問題となっている。最近では高速で温度変化を実施するサーマルサイクラーが販売され、より短時間で反応を終了させるための装置の検討が行われている。また、反応の面においても、高速サイクルに対応すべく、ＰＣＲの組成、方法の検討が行われている。

反応の面において、高速ＰＣＲにはＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼの性能が重要となる。我々は、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどのファミリーＡに属するポリメラーゼより高速ＰＣＲに向いていることを見出している（特許文献１）。またＤＮＡポリメラーゼの補助因子、特にＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ；増殖細胞核抗原）の添加によって、反応時間を短縮できることも報告されている（特許文献２）。

しかしながら、これらの検討が進められているに関わらず、極端な高速サイクルではＤＮＡポリメラーゼがうまく作用せず、増幅不良が散見されていた。また診断用途では測定サンプルにＰＣＲを阻害する物質が含まれている場合があり、このような阻害物質が含まれる条件では高速ＰＣＲができなかった。特に、診断用途では迅速な結果報告が要求されており、高速にかつ高効率にＤＮＡ合成する方法が強く求められていた。

特開２０１０－２３９８８０号公報 国際公開第２００７／００４６５４号パンフレット

ＰＣＲを用いたＤＮＡ合成において、反応時間を短縮させる方法、及び試薬組成を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究を行った結果、反応時間の短い高速ＰＣＲにおいて、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ及びＰＣＮＡを用い、さらにプライマー濃度を高くすることで、より効率的な核酸増幅が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
代表的な本発明は、以下の通りである。

項１．ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ；増殖細胞核抗原）、および及び０．６μＭ以上の濃度でプライマーを含み、かつ、３０サイクルから５０サイクルを４０分以内で実施するための組成であることを特徴とするＰＣＲ方法組成。
項２．３０サイクルから５０サイクルを２０分以内で実施するための組成である項1に記載のＰＣＲ方法組成。
項３．３０サイクルから５０サイクルを１２分以内で実施するための組成である項１又は２に記載のＰＣＲ方法組成。
項４．プライマーの濃度が０．８μＭ以上である項１から３のいずれかに記載のＰＣＲ組成方法。
項５．プライマーの濃度が１．０μＭ以上である項１から４のいずれかに記載のＰＣＲ組成方法。
項６．昇温又は降温の速度が０．１℃／秒から２０℃／秒の範囲でＰＣＲを実施するための組成であることを特徴とする項１から５のいずれかに記載のＰＣＲ方法組成。
項７．昇温又は降温の速度が５℃／秒から２０℃／秒の範囲でＰＣＲを実施するための組成である項１から６のいずれかに記載のＰＣＲ方法組成。
項８．昇温又は降温の速度が１０℃／秒から２０℃／秒の範囲でＰＣＲを実施するための組成である項１から７のいずれかに記載のＰＣＲ方法組成。
項９．ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである項１から８のいずれかに記載のＰＣＲ組成。
項１０．ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である項１から９のいずれかに記載のＰＣＲ組成。
項１１．ＰＣＮＡが古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＰＣＮＡである項１から１０のいずれかに記載のＰＣＲ組成。
項１２．ＰＣＮＡがＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性をもつ変異型ＰＣＮＡである項１から１１のいずれかに記載のＰＣＲ組成。
項１３．項１から１２のいずれかに記載のＰＣＲ組成を含むことを特徴とするＰＣＲ用試薬。
項１４．項１３に記載のＰＣＲ用試薬を含むことを特徴とするＰＣＲ用試薬キット
項１５．項１から１２のいずれかに記載のＰＣＲ組成により、１５回から５０回の熱サイクルによるＰＣＲ方法であって、かつ、ＰＣＲの反応時間が６０分以内であることを特徴とするＰＣＲ方法。
項１６．ＰＣＲの反応時間が３０分以内である項１５に記載のＰＣＲ方法。
項１７．項１から１２のいずれかに記載のＰＣＲ組成を含む反応液中に、生体試料を直接添加することを特徴とする項１５又は１６に記載のＰＣＲ方法。

本発明により、ＰＣＲの反応時間の短縮ができる。本発明における及び組成は血液などの阻害物質が含まれる条件でも、高速ＰＣＲを可能にし、特に迅速性が求められる診断用途において非常に有用である。

プライマー濃度、マグネシウム濃度の検討 Ｃｔ値 プライマー濃度、マグネシウム濃度の検討 融解曲線 プライマー濃度の検討 融解曲線 ＰＣＮＡと高濃度プライマーの相乗効果の確認 ＰＣＲ阻害物質存在下での高速ＰＣＲの検討 ＰＣＲ阻害物質・ｄＵＴＰ存在下での高速ＰＣＲの検討 ＰＣＮＡの配列比較

以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
本発明におけるＰＣＲ方法は、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＮＡ及び高濃度プライマーを反応液中に含み、高速でＰＣＲを行うことを特徴とする。

（１）アミノ酸の表記
本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列及びその個々の構成因子については、アルファベット表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「Ｄ１４３Ａ」などの表記を用いる。「Ｄ１４３Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「／」でつなげて表す。例えば「Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換し、かつ、第１４７番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示す。
また、本明細書において「変異体」、「変異型」とは、従来知られたタンパク質とは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。

なお、「配列番号１に記載のアミノ酸配列における、１４２番目に『相当する』アミノ酸」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＰＣＮＡにおいて、配列番号１の１４２番目に対応するアミノ酸配列を含む表現である。本明細書において、前記と同じ形式の表記における「相当する」の意味は、前記の例示と同じである。

本願明細書において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号１上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号１の当該位置と対応する位置とする。本明細書において、前記と同じ形式の表記における「対応する位置」の意味は、前記の例示と同じである。

配列の一次構造を比較する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本明細書では、ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ｌａｎｇ＝ｊａ）においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、配列の一次構造を比較する。

（２）高速ＰＣＲ
本発明におけるＰＣＲは、３０回の熱サイクルを行う場合に、反応時間が４０分以内である高速ＰＣＲであり、好ましくは３０分以内、さらに好ましくは２０分以内、さらに好ましくは反応時間が１０分以内である高速ＰＣＲが挙げられる。反応時間とは変性、アニーリング、伸長を繰り返す熱サイクルの時間を示す。通常のサーマルサイクラーの熱サイクル設定では反応時間が６０分以内になることはほとんどない。例えば、ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ製）で６０分以内に反応を終わらせるには熱サイクルの各ステップの時間を極端に短くする必要がある。実際、各ステップの時間を極端に短くし、９４℃、２分の前反応の後、９８℃、０秒→６０℃、０秒→６８℃、０秒を４０サイクル実施すると反応時間は約６０分となる。また、３０分以内の反応時間を達成するには、高速で温度変化を実施するサーマルサイクラーを使用し、さらに熱サイクルの各ステップの時間を短くする必要がある。例えば高速での温度変化が可能なＬｉｇｈｔ ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）２．０（Ｒｏｃｈｅ）を用いた場合、９４℃、２分の前反応の後、９８℃、０秒→５５℃、０秒→６８℃、０分を５０サイクル実施すると反応時間は約２０分となる。本発明におけるＰＣＲの熱サイクル数は、１５回から５０回の範囲で設定して実施することができる。好ましくは２５回から４５回であり、より好ましくは３０回から４０回である。

本発明における高速の熱サイクル設定においては、アニーリングステップを短くすることが好ましい。なぜなら、ＰＣＲ反応速度を上げるためにはプライマーの濃度を高くする必要があるが、一般に、プライマーの濃度を高くすると非特異やプライマーダイマーが生じやすい。アニーリングステップを短くすることにより、高濃度のプライマーでも非特異やプライマーダイマーが生じにくくなると考えられる。好ましいアニーリングステップの時間は１０秒である。さらに好ましくは５秒、特に好ましくは０秒である。

（３）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである。本発明においてファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとは、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼをいう。好ましくは古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである。

（３．１）古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ
ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属及びサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ－Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ Ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＤＦ－３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ Ｎｏｒｔｈ－７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９°Ｎ－７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＳ－１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ、又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｃｕｌｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ酵素は市販されており、Ｐｆｕ（Ｓｔａｒａｇｅｎｅ社）、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｐｗｏ（Ｒｏｃｈｅ）などがある。

なかでもＰＣＲ効率の観点から、伸長性や熱安定性の優れたＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。

また、前記ＤＮＡポリメラーゼに、後述の３‘－５’エキソヌクレアーゼ領域の改変、及び／又は、減少した塩基類似体検出活性を有するような改変を施した変異体を用いても良い。

（３．２）ＤＮＡポリメラーゼの改変（Ｉ）３‘－５’エキソヌクレアーゼ領域の改変
本発明に用いる改変されたＤＮＡポリメラーゼは、さらに３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列のいずれかに少なくとも１つのアミノ酸の改変を含んでいてもよい。３‘－５’ エキソヌクレアーゼ活性とは、取り込まれたヌクレオチドをＤＮＡ重合体の３’末端から除去する能力を指し、上記の３‘－５’エキソヌクレアーゼ領域とは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼで高度に保存されている部位であり、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）、パイロコッカス・フリオサスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２）、サーモコッカス・ゴルゴナリウスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号３）、サーモコッカス・リトラリスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号４）、パイロコッカス・エスピーＧＢ－Ｄに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号５）、サーモコッカス・エスピーＪＤＦ－３に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号６）、サーモコッカス・エスピー９°Ｎ－７に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号７）、サーモコッカス・エスピーＫＳ－１に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号８）、サーモコッカス・セラーに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号９）、又はサーモコッカス・シクリに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１０）においては、１３７～１４７、２０６～２２２、及び３０８～３１８番目のアミノ酸である。本発明は、具体的に配列を提示したＤＮＡポリメラーゼ以外のＤＮＡポリメラーゼにも適用される。また、配列番号１～１０に示されるＤＮＡポリメラーゼ以外のファミリーＢに属する古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼにおいては、配列番号１の１３７～１４７、２０６～２２２、及び３０８～３１８番目のアミノ酸からなる３‘－５’エキソヌクレアーゼ領域と対応する領域のことを示す。

なお、「配列番号１に示される１３７～１４７、２０６～２２２、及び３０８～３１８番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号１の１３７～１４７、２０６～２２２、及び３０８～３１８番目に対応するアミノ酸配列を含む表現である。本発明において、前記と同じ形式の表記における「相当する」の意味は、前記の例示と同じである。

本発明において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列における、配列番号１上のある位置（順番）と対応するアミノ酸の位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号１の当該位置と対応する位置とする。本発明において、前記と同じ形式の表記における「対応する位置」の意味は、前記の例示と同じである。

配列の一次構造を比較する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本発明においては、ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ｌａｎｇ＝ｊａ）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較する。

上記の３‘－５’エキソヌクレアーゼ領域の改変とは、置換、欠失、又は付加からなり得るが特に限定されない。例えば、配列番号１における１３７～１４７、２０６～２２２、及び３０８～３１８番目に対応するアミノ酸への改変を示す。

前記３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域を改変したＤＮＡポリメラーゼとしては、配列番号１又は配列番号２における１４１、１４２、１４３、２１０、３１１番目に対応するアミノ酸の少なくとも一つを改変したものが好ましい。これらの改変型ＤＮＡポリメラーゼは、３‘－５’エキソヌクレアーゼ活性が欠損している。より好ましくは、アミノ酸の改変がＤ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｉ１４２Ｒ、Ｎ２１０Ｄ、又はＹ３１１Ｆから選択されるいずれか一つである、３‘－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＤＮＡポリメラーゼである。なお、３‘－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた（エキソ（－））ＤＮＡポリメラーゼとは、活性の完全な欠如を含み、例えば、親酵素と比較して０．０３％、０．０５％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、又は最大でも５０％以下のエキソヌクレアーゼ活性を有する改変されたＤＮＡポリメラーゼを指す。

前記３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域を改変したＤＮＡポリメラーゼとして、別の好ましい形態は、配列番号１又は配列番号２におけるＨ１４７Ｅ、又はＨ１４７Ｄから選択されるいずれか一つである。これらの改変型ＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を維持したまま、ＰＣＲ効率が向上している。

なお、３‘－５’エキソヌクレアーゼ活性領域を改変したＤＮＡポリメラーゼを生成する方法や、３‘－５’エキソヌクレアーゼ活性を解析する方法は公知であり、例えば、米国特許第６９４６２７３号公報に開示されている。ＰＣＲ効率を向上させたＤＮＡポリメラーゼとは、ＰＣＲ産物の量が親酵素と比較して増加している改変されたＤＮＡポリメラーゼを示す。ＰＣＲ産物の量が親酵素と比較して増加しているかどうかを解析するための方法は、特許第３８９１３３０号公報等に記載されている。

（３．３）ＤＮＡポリメラーゼの改変（ＩＩ）減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体を作製する改変
（３．３．１）
本発明に用いるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、減少した塩基類似体検出活性を有する変異体でもよい。塩基類似体とはアデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基を示し、ウラシルやイノシンなどが挙げられる。通常、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、塩基類似体であるウラシルやイノシンを検出すると強く結合し、ＤＮＡポリメラーゼ機能を阻害する。塩基類似体検出活性とは、塩基類似体と強く結合し、ＤＮＡポリメラーゼ機能を阻害する活性を示す。減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体とは、ウラシルやイノシンへの結合能力が低いことを特徴とするファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体である。

このような変異体は、ウラシルの結合に関するアミノ酸配列（ウラシル結合ポケット）の少なくとも１か所に改変を加えることにより作製できる。具体的には、ファミリーＢに属する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）の１～４０番目、及び７８～１３０番目によって形成されるウラシル結合ポケットの少なくとも１か所に改変を加え、野生型のＤＮＡポリメラーゼと比較してウラシルやイノシンへの結合能力を低下させたＤＮＡポリメラーゼ変異体が例示される。ウラシルやイノシンへの結合能力が低いＤＮＡポリメラーゼ変異体は、ｄＵＴＰの存在下のＰＣＲでもＤＮＡポリメラーゼの機能低下があまり見られず、ｄＵＴＰによるＤＮＡポリメラーゼの伸長反応への影響が低減されている。

ウラシルの結合に関するアミノ酸配列はパイロコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼ及びサーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼにおいて高度に保存されている。サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）においては、アミノ酸１～４０及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。パイロコッカス・フリオサス（配列番号２）においては、アミノ酸１～４０、及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・ゴルゴナリウス（配列番号３）においては、アミノ酸１～４０、及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・リトラリス（配列番号４）においては、アミノ酸１～４０、及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。パイロコッカス・エスピーＧＢ－Ｄ（配列番号５）においては、アミノ酸１～４０及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＪＤＦ－３（配列番号６）のおいては、アミノ酸１～４０、及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピー９°Ｎ－７（配列番号７）においては、アミノ酸１～４０及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＫＳ－１（配列番号８）においては、アミノ酸１～４０、及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・セラー（配列番号９）においては、アミノ酸１～４０及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・シクリ（配列番号１０）においては、アミノ酸１～４０及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。

（３．３．２）
本発明に用いる減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体として、より好ましいのは、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている７、３６、３７、９０～９７及び１１２～１１９番目のアミノ酸のうち少なくとも１つに改変を加えた古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体、例えば、（ａ）配列番号１又は配列番号２で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０～９７及び１１２～１１９番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列で示される古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である。

上記の古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、以下の（ｂ）のアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
（ｂ）（ａ）で示されるアミノ酸配列においてさらに７、３６、３７、９０～９７及び１１２～１１９番目以外の部位において少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列と配列番号１との同一性又はそのアミノ酸配列と配列番号２との同一性が８０％以上（好ましくは８５％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、特に好ましくは９８％以上であり、最も好ましくは９９％以上である）であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列。

アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本発明においては、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。

上記の古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、以下の（ｃ）のアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
（ｃ）（ａ）で示されるアミノ酸配列において、さらに７、３６、３７、９０～９７及び１１２～１１９番目以外の部位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列。

ここで「数個」とは、「減少した塩基類似体検出活性」が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、変異されるアミノ酸残基の個数は、例えば、２～１６０個、好ましくは２～１２０個、より好ましくは２～８０個、更に好ましくは２～４０個であり、特に好ましくは２～５個である。

なお、「配列番号１に示されるアミノ酸配列における７、３６、３７、９０～９７及び１１２～１１９番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号１の７、３６、３７、９０～９７及び１１２～１１９番目に対応するウラシルの結合に関するアミノ酸配列を含む表現である。

本発明において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号１上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号１の当該位置と対応する位置とする。本明細書において、前記と同じ形式の表記における「相当する」の意味は、前記の例示と同じである。

本発明において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号１上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号１の当該位置と対応する位置とする。本明細書において、前記と同じ形式の表記における「対応する位置」の意味は、前記の例示と同じである。

配列の一次構造を比較する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本発明においては、ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ｌａｎｇ＝ｊａ）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較する。

（３．３．３）
本発明に用いる減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、より好ましくは、配列番号１又は配列番号２におけるアミノ酸Ｙ７、Ｐ３６、又はＶ９３に相当するアミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する。ここで、例えばＹ７とは、７番目のアミノ酸であるチロシン（Ｙ）残基を意味しており、アルファベット１文字は通用されているアミノ酸の略号を表している。好ましい例において、Ｙ７アミノ酸はチロシン（Ｙ）が非極性アミノ酸に置換されており、具体的にはＹ７Ａ、Ｙ７Ｇ、Ｙ７Ｖ、Ｙ７Ｌ、Ｙ７Ｉ、Ｙ７Ｐ、Ｙ７Ｆ、Ｙ７Ｍ、Ｙ７Ｗ、及びＹ７Ｃからなる群より選ばれるアミノ酸置換である。別の好ましい例において、Ｐ３６アミノ酸はプロリン（Ｐ）が正電荷をもつ極性アミノ酸に置換されており、具体的にはＰ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、又はＰ３６Ｒのアミノ酸置換である。別の好ましい例において、Ｖ９３アミノ酸はバリン（Ｖ）が、正電荷をもち極性アミン酸に置換されており、具体的にはＶ９３Ｈ、Ｖ９３Ｋ、又はＶ９３Ｒのアミノ酸置換である。

より好ましくは、改変がＹ７Ａ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、及びＶ９３Ｒからなる群より選ばれる、少なくとも１つのアミノ酸の改変である。さらに好ましくはＰ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ又はＰ３６Ｈである。特に好ましくはＰ３６Ｈである。

本発明において用いられる減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号１又は配列番号２におけるアミノ酸Ｙ７、Ｐ３６、又はＶ９３に相当するアミノ酸から選択される２つ以上のアミノ酸を改変したものでも良い。具体的には、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ又はＰ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられ、好ましくは、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ又はＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

上記に例示したＤＮＡポリメラーゼの改変をもとに、本発明に用いる改変されたＤＮＡポリメラーゼとして、種々の変異体が考えられる。そのような変異体として、以下の（１）－（４）のいずれかの改変を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼの変異体が例示されるが、これに限定されるわけではない。
（１）（Ａ）Ｈ１４７Ｅと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｒ又はＶ９３Ｑのいずれか
（２）（Ａ）Ｎ２１０Ｄと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ又はＶ９３Ｒのいずれか
（３）（Ａ）Ｉ１４２Ｒと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒ又はＶ９３Ｑのいずれか
（４）（Ａ）Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ又はＶ９３Ｋのいずれか

（３．３．４）塩基類似体検出活性の評価方法
本発明における塩基類似体検出活性はＰＣＲによって評価できる。塩基類似体は、典型的にはウラシルである。本発明においては、鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、及び評価対象のＤＮＡポリメラーゼを含む通常のＰＣＲ反応液に、ｄＵＴＰ溶液を、終濃度０．５μＭ～２００μＭで添加し、熱サイクルを行う。反応後に、エチジウムブロマイド染色１％アガロース電気泳動でＰＣＲ産物の有無を確認し、許容できたｄＵＴＰ濃度によって、ウラシルの検出活性を評価することが出来る。ウラシル検出活性の高いＤＮＡポリメラーゼは少しのｄＵＴＰの添加で伸長反応が阻害され、ＰＣＲ産物が確認できない。また、ウラシルの検出活性の低いＤＮＡポリメラーゼは、高濃度のｄＵＴＰを添加しても問題なくＰＣＲによる遺伝子増幅が確認できる。

減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体とは、酵素至適の反応Ｂｕｆｆｅｒ中で、任意のプライマー、及び鋳型となるＤＮＡを用い、至適の熱サイクルを行った結果、変異がない野生型と比較し、高濃度のｄＵＴＰを添加しても伸長反応が阻害されず、ＰＣＲ産物が確認できるＤＮＡポリメラーゼのことをいう。ただし、野生型との比較が困難な場合は、ｄＵＴＰを０．５μＭの濃度で添加してもＰＣＲの増幅ができる古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体については、当該変異体が野生型と比較して減少した塩基類似体検出活性を有すると推定する。

本発明における塩基類似体検出活性の評価は、以下の方法に従う。
ＫＯＤ －Ｐｌｕｓ－ Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、又はＰｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、及び１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、約１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号１１及び１２に記載のプライマー、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製）、１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、ｄＵＴＰ(Ｒｏｃｈｅ製)を終濃度０．５、５、５０、１００、２００μＭになるよう添加する。９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）にてＰＣＲを行う。反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約１．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を確認することで、塩基類似体検出活性が減少しているかどうかが評価できる。

（３．４）アミノ酸改変の導入方法
本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼを改変する方法は、既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い改変を行うことが出来、その態様は特に制限されない。

アミノ酸の改変を導入する方法の一態様として、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法に基づく部位特異的変異導入法を用いることができる。例えば、ＫＯＤ －Ｐｌｕｓ－ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ製）は、（１）目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、（２）（１）のサイクルを１５回繰り返す、（３）制限酵素ＤｐｎＩを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、（４）新たに合成された遺伝子をリン酸化、Ｌｉｇａｔｉｏｎを実施し環化させる、（５）環化した遺伝子を大腸菌に形質転換し、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットである。

（３．５）
上記改変ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２～２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、宿主由来のＤＮＡポリメラーゼを失活させ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。

上記方法により選抜された菌株から精製ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的又は物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＤＮＡポリメラーゼ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ－２５（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ－ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。

（３．５．１）ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法
本発明に用いるＤＮＡポリメラーゼは、以下のように活性を測定する。酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ジチオスレイトール，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０，５０％ グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ 塩酸及びエタノールで十分洗浄する。（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パーキンエルマー製ＴｒｉＣａｒｂ ２８１０ＴＲ）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ液：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１６ｍＭ 塩化マグネシウム、１５ｍＭ ジチオスレイトール、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ液：１．５μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ液：１．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ液：２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭ ピロリン酸ナトリウム）
Ｅ液：１ｍｇ／ｍＬ仔牛胸腺ＤＮＡ

（４）ＰＣＮＡ
（４．１）
本発明に用いるＰＣＮＡは、ＰＣＲ増強因子の一種である。前記ＰＣＮＡとしては、特に限定されないが、ＰＣＲの熱サイクルに耐えられる耐熱性のものが望ましく、好ましくはＰＣＲ後も活性が残るものが望まれる。さらに好ましくは８０℃で３０分の熱処理を行っても可溶性であり、活性が５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上残っているものが望まれる。

そのようなＰＣＮＡとしては、例えばパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属及びサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されたＰＣＮＡが挙げられる。パイロコッカス属由来のＰＣＮＡとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（配列番号１３）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ－Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ Ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＰＣＮＡを含むが、これらに限定されない。サーモコッカス属に由来するＰＣＮＡとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（配列番号１４）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＤＦ－３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ Ｎｏｒｔｈ－７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９°Ｎ－７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＳ－１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ、又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｃｕｌｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍｊａ）又はＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ）から単離されたＰＣＮＡを含むが、これらに限定されない。

ＰＣＮＡをコードする遺伝子は、ＰＣＮＡをもつ生物からクローニングすることができる。また、アミノ酸の配列情報や核酸の配列情報をもとに人工的に合成することもできる。

さらに、本発明に用いるＰＣＮＡは単独でＤＮＡにロードする（ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性のある）変異体であってもよい。ＰＣＮＡは通常、多量体を形成し輪のような構造をとる。ＤＮＡにロードするとは、ＰＣＮＡ多量体の輪の構造内部にＤＮＡを通すことを示し、通常はＲＦＣと呼ばれる因子と共同して初めてＰＣＮＡはＤＮＡにロードすることができる。単独でＤＮＡにロードする変異体とは、ＰＣＮＡの多量体形成に関わる部位を改変し、多量体形成を不安定化することで、ＲＦＣなしでもＤＮＡをＰＣＮＡ多量体内部に通しやすくした変異体を示す。

（４．１．１）ＫＯＤ－ＰＣＮＡ及びＰｆｕ－ＰＣＮＡ
ＰＣＮＡが多量体形成に関する部位は、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＰＣＮＡ（ＫＯＤ－ＰＣＮＡとも記載）（配列番号１３）、パイロコッカス・フリオサスのＰＣＮＡ（Ｐｆｕ－ＰＣＮＡとも記載）（配列番号１４）においては、８２、８４、１０９番目のアミノ酸からなるＮ末端領域と１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸からなるＣ末端領域が挙げられる。Ｎ末端領域はプラスに帯電し、Ｃ末端領域はマイナスに帯電し、相互作用することで多量体形成を行う。

上記及び下記において、配列番号１３又は配列番号１４を例にして説明したことは、本明細書で具体的に配列を提示したＰＣＮＡ以外のＰＣＮＡにも適用される。例えば、図７で示したように配列番号１３及び１４に示されるＰＣＮＡ以外のＰＣＮＡにおいては、配列番号１３の８２、８４、１０９、１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸からなる多量体形成に関する領域と対応する領域のことを示す。ここで、異なる２つのアミノ酸配列があるとき、基準となる一方のアミノ酸配列においてアミノ酸や領域が「対応する」とは、アミノ酸配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、基準となる配列の当該位置と対応する位置とする。

単独でＤＮＡにロードするＰＣＮＡ変異体は、より好ましくは、ＰＣＮＡの多量体形成に関わる、
（ａ）８２、８４、１０９番目に相当するアミノ酸からなるＮ末端領域、又は、
（ｂ）１３９、１４３、１４７番目に相当するアミノ酸からなるＣ末端領域に少なくともひとつの改変を有し、ＲＦＣがなくともＤＮＡにロードし、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応を促進する変異体が挙げられる。

例えば、配列番号１３の１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したもの、８２番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、１４７番目を中性アミノ酸に改変したもの、又は、１０９番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したものなどが挙げられる。
本発明の中性アミノ酸としては、天然のものであれば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。好ましくは、置換部位の周辺部位の立体構造に与える影響が最も小さいアラニンである。塩基性アミノ酸としては、天然のものであれば、アルギニン、ヒスチジン、リシン及びトリプトファンが挙げられる。好ましくはアルギニン又はリジンである。

より好ましくは、ＷＯ２００７／００４６５４に記載のＰＣＮＡ変異体が例示されるほか、第１４７番目のアミノ酸残基をアラニンに換えた配列（Ｄ１４７Ａ）、第８２番目、及び第１４３番目のアミノ酸残基をアラニンに変えた配列（Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、もしくはＲ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ）、第１０９番目、及び第１４３番目のアミノ酸残基をアラニンに変えた配列（Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、もしくはＲ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

また、本発明に用いるＰＣＮＡは発現量を増やすため、配列番号１３又は配列番号１４の７３番目に相当するメチオニンを改変したものでもよい。より好ましくはＭ７３Ｌに改変したものが挙げられるが、これに限定されない。

（４．１．２）Ｍｊａ－ＰＣＮＡ
また、本発明に用いるＰＣＮＡは、以下の（Ａ）から（Ｅ）のうちいずれかに示されるＰＣＮＡ単量体である。
（Ａ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列における１４２番目のアミノ酸残基を、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファンからなる群がら選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドからなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド。
（Ｂ）（Ａ）で示されるＰＣＮＡ単量体において、さらに、配列番号２３に記載のアミノ酸配列における１４２番目のアミノ酸残基を、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファンからなる群がら選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドからなり、以下の（ａ）から（ｅ）のいずれかの置換、欠失、挿入及び／又は付加（これらを纏めて「変異」とも表す。）を含んでなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド。
（ａ）８０番目のアミノ酸残基をリジン、ヒスチジン及びトリプトファンからなる群から選択されるいずれかに置換
（ｂ）８２番目のアミノ酸残基をアルギニン、ヒスチジン及びトリプトファンからなる群から選択されるいずれかに置換
（ｃ）１０８番目のアミノ酸残基をリジン、ヒスチジン及びトリプトファンからなる群から選択されるいずれかに置換
（ｄ）１３８番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換
（ｅ）１４６番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換
（Ｃ）（Ａ）で示されるＰＣＮＡ単量体において、さらに、配列番号２３に記載のアミノ酸配列における１４２番目のアミノ酸残基を、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファンからなる群がら選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドからなり、、８０番目、８２番目、１０８番目、１３８番目、１４２番目及び第１４６番目に相当するアミノ酸残基以外の、１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されているアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド。
（Ｄ）（Ａ）で示されるＰＣＮＡ単量体において、さらに、配列番号２３に記載のアミノ酸配列の１４２番目のアミノ酸残基のみを、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファンからなる群がら選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｅ）（Ａ）で示されるＰＣＮＡ単量体において、さらに、配列番号２３で示されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド。

配列番号２３において、１４２番目のアミノ酸残基はＰＣＮＡの多量体形成に関わるアミノ酸残基のうちの１つである。ＰＣＮＡの多量体形成に関わるアミノ酸残基は、各単量体のＮ末端側領域とＣ末端側領域とに存在する。ＰＣＮＡ多量体は、一方の単量体のＮ末端側領域と他方の単量体のＣ末端側領域とが界面となって接合することにより形成される。真核細胞及び古細菌においては、多くの場合ＰＣＮＡは三量体を形成する。配列番号２３で示されるアミノ酸配列においては、Ｎ末端領域が下記の（ａ）で示される群の位置に該当し、Ｃ末端領域が下記の（ｂ）で示される群の位置に該当する。
（ａ）８０、８２、１０８番目のアミノ酸残基群
（ｂ）１３８、１４２、１４６番目のアミノ酸残基群

上記（２）のポリペプチドは、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を保持する限度で、配列番号２３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加（以下、これらを纏めて「変異」とも表す。）されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。一又は数個の変異は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法やランダム突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）など公知の手法を利用して、後述する本発明のＰＣＮＡ単量体をコードするＤＮＡに変異を導入することによって実施することが可能である。また、紫外線照射など他の方法によってもバリアントＰＣＮＡ単量体を得ることができる。バリアントＰＣＮＡ単量体には、ＰＣＮＡを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型）も含まれる。

上記［３］のポリペプチドは、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を保持することを限度で、配列番号２３に示されるアミノ酸配列と比較した同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。好ましくは、本発明のＰＣＮＡ単量体が有するアミノ酸配列と配列番号２３に示されるアミノ酸配列との同一性は、８５％以上であり、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。このような一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作成することができる。

上記の［２］又は［３］に記載したようなＰＣＮＡとして、好ましくは、ＰＣＮＡの精製を簡便にすべくＮ末端に挿入したＨｉｓタグなどのアフィニティタグを付加するものが挙げられるが、特にこれに限定されない。

上記のＰＣＮＡ単量体においては、配列番号２３における１４２番目のアミノ酸残基が塩基性アミノ酸残基に置換されるが、置換する塩基性アミノ酸の種類は特に限定されない。塩基性アミノ酸としては、天然のものであれば、アルギニン、ヒスチジン、リシン及びトリプトファンが挙げられる。好ましくはアルギニン又はリジンである。

（４．２）
上記ＰＣＮＡを得る方法はＰＣＮＡ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２～２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、遠心することで宿主由来のタンパクを除去し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供することで、目的タンパク質の発現を確認することができる。

上記方法により選抜された菌株から精製ＰＣＮＡを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的又は物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＰＣＮＡ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ－２５（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、Ｑセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。

（４．３）ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性
上記ＰＣＮＡ変異体が単独でＤＮＡにロードできるか（ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性があるか）どうかは、ＰＣＲによって評価できる。鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、及びファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ反応液に、評価するＰＣＮＡを添加し、ＰＣＮＡ添加なしのもの、また野生型ＰＣＮＡ添加のものと増幅量を比較することで、単独でＤＮＡにロードできるかを確認することができる。野生型のＰＣＮＡをはじめ、単独でＤＮＡにロードできないＰＣＮＡは添加しても、ＰＣＲの増幅量は変化せず、むしろ増幅量を減らす傾向がある。一方、単独でＤＮＡにロードできる変異体は、ＰＣＮＡ添加なしのものと比較することでＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を評価することができる。

本発明において「ＰＣＮＡ変異体が単独でＤＮＡにロードできるかどうか」の評価（ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性の評価）は、以下の方法に従う。
ＫＯＤ Ｄａｓｈ（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（反応に用いる濃度の１０倍に濃縮されている）を用いて、
１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、
約３．６ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号１５及び１６に記載のプライマー、
１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ；型番１１６９１１１２００１）、
１Ｕ ＫＯＤ －Ｐｌｕｓ－ ポリメラーゼ
を含むよう反応液を調製し、
５０μｌの反応液中に、評価するＰＣＮＡを２５０ｎｇ添加し、
９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６８℃、３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲを行う。反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約３．６ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を、野生型ＰＣＮＡを添加したものと比較することで、単独でＤＮＡにロードできるＰＣＮＡかどうかを評価することができる。単独でＤＮＡにロードできるＰＣＮＡは添加によって増幅量が増加する。

増幅量の増加を定量的に評価するためには、本発明においては、Ｇｅｌ Ｐｒｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）という解析ソフトウェアを利用することにより、増幅量を数値化することにより行う。このような方法で増幅量を比較したとき、ＰＣＮＡを添加した場合の増幅量が、ＰＣＮＡを添加しなかった場合の増幅量の１．０倍（好ましくは１．２倍、さらに好ましくは１．５倍、さらに好ましくは２倍、３倍）を超える。もしくは増幅していなかったターゲットが増幅すれば、そのＰＣＮＡが「ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有する」と判断する。

ＰＣＮＡの改変についても、ＤＮＡポリメラーゼの改変と同様に行うことができる。

（５）高濃度プライマー
本発明におけるプライマー濃度は、０．６μＭ以上である。一般に、高濃度のプライマーは非特異やプライマーダイマーの原因になるため、通常のＰＣＲでは０．１～０．５μＭで使用するのが一般的といわれている。本発明における高速ＰＣＲ条件では、サイクルのアニーリングステップが短いため、高い濃度でないとプライミングの効率が低下することがわかっている。逆に、高速ＰＣＲ条件ではアニーリングステップが短いため、高濃度のプライマーでも非特異やプライマーダイマーが生じにくい。本発明におけるプライマー濃度は、より好ましくは０．８μＭ以上、さらに好ましくは１．０μＭ以上である。なお、４．０μＭ、好ましくは２．０μＭ、さらに好ましくは１．４μＭを超えないことが好ましい。

本明細書において、「プライマー濃度０．６μＭ以上」と言う場合、一組のプライマー対におけるフォワード（Ｆ）、リバース（Ｒ）それぞれのプライマー濃度が同じであってもよいし、どちらか一方のプライマー濃度が他方の濃度を超えていても（プライマー濃度が非対称であっても）よい。また、マルチプレックスＰＣＲの場合は、前記のほか、すべてのプライマー対間の濃度が同じであってもよいし、各プライマー対間で濃度が異なっていてもよい。

（６）熱サイクルの速度
本発明におけるＰＣＲにおいては、熱サイクルにおける昇温又は降温の速度が０．１℃／秒から２０℃／秒で実施することが好ましい。より好ましくは５℃／秒から２０℃／秒の範囲、さらに好ましくは１０℃／秒から２０℃／秒の範囲である。このような昇温又は降温の速度の熱サイクルを実施するためには、空気による加熱及び冷却により温度制御することができるようなサーマルサイクラーを用いることが特に好ましい。

（７）阻害物質を含んだ状態でのＰＣＲ
本発明のＰＣＲ方法は、阻害物質を含んだ状態で実施することに適している。本発明における阻害物質とは、例えば生体試料を示すが、ＰＣＲを阻害する物質であれば特に限定されない。生体試料は、生体から採取された試料であれば特に限定されない。例えば、体毛、爪、口腔粘膜などの動植物組織、血液などの体液、糞便や尿などの排泄物、細胞、細菌、ウイルス等をいう。体液には血液や唾液が含まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、これらに限定されるものではない。

（８）抗体
本発明においては、必要に応じて、さらに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を用いても良い。前記抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。本反応組成は、ＰＣＲの感度上昇、非特異的増幅の軽減に特に有効である。

（９）核酸増幅法を実行するための試薬
本発明のＰＣＲを実行するための試薬は、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、及びＰＣＮＡ及び０．６μＭ以上の濃度のプライマーを反応液中に含み、それ以外の構成は特に限定されない。なお、前記試薬にはキットの形態も含まれる。

以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例により、特に限定されるものではない。

（実施例１）
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体の作製
後述の実施例に用いるために、サーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体）遺伝子を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号１７）（ｐＫＯＤ）を用いた。
変異導入にはＫＯＤ －Ｐｌｕｓ－ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。

（実施例２）
改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作製
実施例１で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを、５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に、予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に、細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ ノニデットＰ４０、５０％ グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを得た。
上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は、上記のＤＮＡポリメラーゼ活性測定法に従い行った。また、酵素活性が高い場合はサンプルを希釈して測定を行った。

（実施例３）
ＫＯＤ－ＰＣＮＡ変異体の作製
サーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ変異体）遺伝子を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来のＰＣＮＡ（配列番号１８）（ｐＫＯＤＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ －Ｐｌｕｓ－ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、酵素調製に用いた。

（実施例４）
改変型耐熱性ＰＣＮＡの作製
実施例３で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを、５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％ バクトトリプトン、０．５％ 酵母エキス、０．５％ 塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＤＨ５α（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Ｑセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ ノニデットＰ４０、５０％ グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＰＣＮＡを得た。

（実施例５）
プライマー濃度、マグネシウム濃度の検討
上記で得られたＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、及びＫＯＤ ＰＣＮＡ Ｄ１４７Ａを用いて、高速ＰＣＲを実施し、プライマー濃度の影響、及びマグネシウム濃度の影響を確認した。
ＰＣＲにはＫＯＤ Ｄａｓｈ（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒを１０倍希釈した １×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（１．２ｍＭ ＭｇＳＯ_４を含む）に、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１Ｕ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体、２５０ｎｇ ＫＯＤ ＰＣＮＡ変異体、及び、１／３０，０００に希釈したＳＹＢＲ（登録商標） ＧｒｅｅｎＩを含む５０μｌの反応液中に、以下の（ａ）又は（ｂ）を添加し、それぞれでＣｔ値を比較した。
（ａ）サルモネラのｉｎｖＡ遺伝子（約７００ｂｐ）を増幅する配列番号１９及び２０に記載のプライマー、及び、５０コピー相当のサルモネラ菌ゲノム
（ｂ）アクチン遺伝子（約５５０ｂｐ）を増幅する配列番号２１及び２２に記載のプライマー、及び、５０コピー相当のヒトゲノム
プライマー濃度は０．２、０．４、０．６μＭの３水準を設定した。また、ＭｇＳＯ_４を添加して、Ｍｇ濃度を１．２、２、４、６、８ｍＭの５水準で設定し、前記プライマー濃度３水準との組合せをそれぞれ検討した。
ＰＣＲは、９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、０秒→５５℃、０秒→６８℃、０秒の高速サイクルを５０サイクル繰り返すスケジュールでＬｉｇｈｔ ｃｙｃｌｅｒ２．０を用いて、昇温及び降温の速度を２０℃／秒で行った。反応時間は約２０分で実施された。

図１は、プライマー濃度、Ｍｇ濃度を変えて、５０コピー相当のサルモネラ菌ゲノム又はヒトゲノムから高速ＰＣＲで増幅を比較した場合のＣｔ値、図２はそれらの融解曲線を示す。プライマー濃度は、０．２、０．４、０．６μＭ、Ｍｇ濃度は１．２、２、４、６、８ｍＭで実施し、融解曲線で非特異的な増幅が見られる場合、Ｃｔ値は非特異増幅の量に応じて、丸で囲いマーキング（目的増幅もあるが非特異的増幅もある）、四角で囲いマーキングした（非特異的増幅のみ見られる）。

サルモネラ菌ｉｎｖＡ遺伝子の増幅は、プライマー、Ｍｇ濃度をそれぞれ高めることで、Ｃｔが改善される傾向が見られた。
これに対して、アクチン遺伝子の増幅は、Ｍｇ濃度が低い場合は、プライマー濃度を高めることでＣｔが改善されたが、Ｍｇ濃度を上げると非特異増幅が出現する結果となった。プライマー、Ｍｇは濃度を上げると、それぞれＰＣＲの効率を高める働きがある、一方、あまり上げすぎると非特異的増幅につながることが知らている。しかし、今回のような高速ＰＣＲにおいては、高濃度のＭｇは通常のＰＣＲと同様、非特異的増幅を増やす可能性が高まるものの、高濃度のプライマーでは非特異的増幅は生じにくくする結果になった。
高速ＰＣＲ条件では、サイクルのアニーリングステップが短いため、高濃度のプライマーを用いても非特異的増幅やプライマーダイマーが生じにくく、特異性を保ったまま、ＰＣＲ効率のみを向上させる働きがあることが考えられる。

（実施例６）
プライマー濃度の検討
実施例５と同様、上記で得られたＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、及びＫＯＤ ＰＣＮＡ Ｄ１４７Ａを用いて、高速ＰＣＲを実施し、プライマー濃度の影響を確認した。
ここでは。ｄＵＴＰ存在下の高速ＰＣＲでもプライマー濃度の影響があるかについても確認した。

ＰＣＲにはＫＯＤ Ｄａｓｈ（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒを１０倍希釈した １×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（１．２ｍＭ ＭｇＳＯ_４を含む）に、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、又はｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換した２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１Ｕ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体、２５０ｎｇ ＫＯＤ ＰＣＮＡ変異体、及び、１／３０，０００に希釈したＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩを含む５０μｌの反応液中に、アクチン遺伝子 約５５０ｂｐを増幅する配列番号２１及び２２に記載のプライマー、ならびに５０コピー相当のヒトゲノムを添加し、それぞれでＣｔ値を比較した。プライマー濃度はそれぞれ０．２、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４μＭで実施した。ＰＣＲは、９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、０秒→５５℃、０秒→６８℃、０秒の高速サイクルを５０サイクル繰り返すスケジュールでＬｉｇｈｔ ｃｙｃｌｅｒ２．０を用いて、昇温及び降温の速度を２０℃／秒で行った。反応時間は約２０分で実施された。

表１は、プライマー濃度を変えて、高速ＰＣＲによる５０コピーからの増幅を比較した場合のＣｔ値、図３は融解曲線を示す。ｄＴＴＰ存在下（通常のｄＮＴＰｓ）とｄＵＴＰ存在下（ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ）で、プライマー濃度は、０．２、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４μＭで実施した。

結果、ｄＴＴＰ存在下、ｄＵＴＰ存在下共にプライマー濃度を０．６μＭ以上に上げることで、Ｃｔ値が改善することが示された。また、この実験では非特異的増幅やプライマーダイマーはまったく見られなかった。

（実施例７）
ＰＣＮＡと高濃度プライマーの相乗効果の確認
上記で得られたＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ及びＫＯＤ ＰＣＮＡ Ｄ１４７Ａを用いて、高速ＰＣＲを実施し、ＰＣＮＡと高濃度プライマーの相乗効果を確認した。
ＰＣＲにはＫＯＤ Ｄａｓｈ（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒを１０倍希釈した １×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（１．２ｍＭ ＭｇＳＯ_４を含む）に、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１Ｕ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体、２５０ｎｇ ＫＯＤ ＰＣＮＡ変異体、及び、１／３０，０００に希釈したＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩを含む５０μｌの反応液中に、アクチン遺伝子、約５５０ｂｐを増幅する配列番号２１及び２２に記載のプライマー、ならびに様々な濃度のヒトゲノムを添加し、それぞれでＣｔ値を比較した。
ヒトゲノムは、１０^４、１０^３、１０^２、１０^１コピー、ノンテンプレートコントロール（ＮＴＣ）の５サンプルで行った。今回、ＰＣＮＡ変異体を含まない組成でもＰＣＲを実施し、比較した。プライマー濃度はそれぞれ０．２、１．０μＭで実施し、ＰＣＲは、９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、０秒→５５℃、０秒→６８℃、０秒のサイクルを５０サイクル繰り返す高速ＰＣＲスケジュールと、９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、１０秒→６８℃、３０秒のサイクルを５０サイクル繰り返す通常ＰＣＲスケジュールの２種類で比較した。サーマルサイクラーにはＬｉｇｈｔ ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）２．０を用いて、昇温及び降温の速度を２０℃／秒で行った。

図４は、プライマー濃度とＰＣＮＡ変異体の相乗効果を確認するため、様々なコピー数のヒトゲノムから高速ＰＣＲで増幅を比較し、Ｃｔ値を示したものになる。プライマー濃度は、０．２、１．０μＭで実施し、ＰＣＮＡがある場合とない場合とのそれぞれにおけるＣｔを示した。またプライマー０．２μＭにおいて、通常のサイクルでのＰＣＮＡがある場合とない場合とのそれぞれにおけるＣｔも示した。ここでは融解曲線で非特異的な増幅が見られる場合、非特異的増幅の量に応じて、丸で囲いマーキング（目的遺伝子の増幅もあるが非特異的増幅もある）、四角で囲いマーキングした（非特異的増幅のみ見られる）。

プライマー濃度が０．２μＭの場合、通常のサイクルではＰＣＮＡの添加で大きな差は見られなかった。通常のサイクルでは、ＰＣＮＡの添加の大きな効果は見られないことが示される。一方、高速サイクルでは、ＰＣＮＡの添加なしでは大きくＣｔが遅れるものの、ＰＣＮＡの添加でＣｔが改善する結果となった。しかし、プライマー濃度が０．２μＭではＰＣＮＡを添加しても通常サイクルに比べ、Ｃｔは劣る結果となっている。プライマー濃度が１．０μＭの場合、ＰＣＮＡなしでもＣｔは改善するものの、やはり通常サイクルにはＣｔが１程度遅れている。そこへＰＣＮＡを添加した場合は通常サイクルほぼ同等のＣｔが得られた。高速サイクルを通常サイクルと同等の効率にするには、プライマー濃度を上げることと、ＰＣＮＡを添加することの両方が必要であることが示された。

（実施例８）
ＰＣＲ阻害物質存在下での高速ＰＣＲの検討
上記で得られたＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、及びＫＯＤ ＰＣＮＡ Ｄ１４７Ａを用いて、阻害物質を含む条件で高速ＰＣＲを実施した。
阻害物質は以下のように調製した。
糞便：８ｍｌの水に２ｇの糞便を懸濁し、２０％糞便懸濁液を作製する。９５℃、５分熱処理し、１２，０００ｒｐｍ、１分の遠心後、上清を２０％糞便とした。
尿：ヒトから採取した尿を１００％尿とした。
口腔粘膜：２００μｌの水に綿棒で採取した口腔粘膜を落とし、１００％口腔粘膜液とした。
血液：ＥＤＴＡ採血管で採取した血液を１００％血液とした。

ＰＣＲにはＫＯＤ Ｄａｓｈ（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒを１０倍希釈した１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（１．２ｍＭ ＭｇＳＯ_４を含む）に、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１Ｕ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体、２５０ｎｇ ＫＯＤ ＰＣＮＡ変異体、及び、１／３０，０００に希釈したＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩを含む５０μｌの反応液中に、サルモネラ菌ｉｎｖＡ遺伝子、約７００ｂｐを増幅する配列番号１９及び２０に記載のプライマー、ならびに５０コピー相当のサルモネラ菌ゲノムを添加し、それぞれでＣｔ値を比較した。
プライマー濃度は０．２、１．０μＭで実施した。阻害物質には上記で調製したサンプルを用い、２．５、０．５、０．１％ 糞便、５、１、０．２、０．０４％ 尿、２５、５、１、０．２％ 口腔粘膜、１．６、０．３２、０．０６％ 血液を添加した。ＰＣＲは、９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、０秒→５５℃、０秒→６８℃、０秒の高速サイクルを５０サイクル繰り返すスケジュールでＬｉｇｈｔ ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）２．０を用いて、昇温及び降温の速度を２０℃／秒で行った。反応時間は約２０分で実施された。

図５は、阻害物質を含む組成から高速ＰＣＲを実施し、サルモネラ菌５０コピーを増幅した場合のＣｔを示す。プライマー濃度は０．２、１．０μＭで実施し、阻害物質がない場合と、２．５、０．５、０．１％糞便、５、１、０．２、０．０４％尿、２５、５、１、０．２％口腔粘膜液、又は１．６、０．３２、０．０６％血液をそれぞれ添加した場合の影響を確認した。融解曲線で非特異的な増幅が見られる場合、非特異的増幅の量に応じて、丸で囲いマーキング（目的遺伝子の増幅もあるが非特異的増幅もある）、四角で囲いマーキングした（非特異的増幅のみ見られる）。また、まったく増幅しないサンプルはＮ．Ｄ．と表記した。

この系は、阻害物質がなくてもＰＣＮＡなしでは増幅しない系となる。
糞便に関しては、プライマー濃度が０．２μＭでは０．５％までしか増幅しないところ、プライマー濃度を１．０μＭに上げることで、２．５％含まれていても増幅が確認できた。
尿に関しては、プライマー濃度が０．２μＭでは立ち上がりが遅れるものの、プライマー濃度を１．０μＭに上げることで、立ち上がりが改善され、５％の持込でも増幅が確認された。口腔粘膜に関しては、プライマー濃度が０．２μＭでは５％までしか増幅しないところ、プライマー濃度を１．０μＭに上げることで、２５％含まれていても増幅が確認できた。
血液に関しては、プライマー濃度が０．２μＭでは０．３２％までしか増幅しないところ、プライマー濃度を１．０μＭに上げることで、１．６％含まれていても増幅が確認できた。
ＰＣＮＡの添加に加え、プライマー濃度を高めることで阻害物質が含まれていても高速ＰＣＲが可能になったと考えられる。

（実施例９）
ＰＣＲ阻害物質・ｄＵＴＰ存在下での高速ＰＣＲの検討
上記で得られたＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、及びＫＯＤ ＰＣＮＡ Ｄ１４７Ａを用いて、阻害物質及びｄＵＴＰを含む条件で高速ＰＣＲを実施した。
阻害物質は以下のように調製した。
糞便：８ｍｌの水に２ｇの糞便を懸濁し、２０％糞便懸濁液を作製した。９５℃、５分熱処理し、１２，０００ｒｐｍ、１分の遠心後、上清を２０％糞便とした。

ＰＣＲにはＫＯＤ Ｄａｓｈ（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒを１０倍希釈した １×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（１．２ｍＭ ＭｇＳＯ_４を含む）に、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換した２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１Ｕ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体、２５０ｎｇ ＫＯＤ ＰＣＮＡ変異体、及び、１／３０，０００に希釈したＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩを含む５０μｌの反応液中にアクチン遺伝子、１．０μＭ 約５５０ｂｐを増幅する配列番号２１及び２２に記載のプライマー、ならびに、５０コピー相当のヒトゲノムを添加し、２．５、２、１．５、１、０．５、０．２５、０．１％ 糞便存在下でのＣｔ値を比較した。
コントロールにＴａｑの反応系でも同様の検討を実施した。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはＴｏｙｏｂｏ製のものを用い、Ａｎｔｉ－Ｔａｑ Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ製）と混合したものを用いた。反応は１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ、２ｍＭ ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、０．２、及び１．０μＭのプライマー（上記と同様）、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液に５０コピー相当のヒトゲノム、２．５、２、１．５、１、０．５、０．２５、０．１％糞便を添加し、Ｃｔ値を比較した。ＰＣＲはそれぞれ、９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、０秒→５５℃、０秒→６８℃、０秒の高速サイクルを５０サイクル繰り返すスケジュールでＬｉｇｈｔ ｃｙｃｌｅｒ２．０を用いて、昇温及び降温の速度を２０℃／秒で行った。反応時間は約２０分で実施された。

図６は、糞便・ｄＵＴＰを含む組成から高速ＰＣＲを実施し、ヒトゲノム５０コピーを増幅した場合のＣｔを示す。ＫＯＤ変異体を用いた系ではプライマー濃度は１．０μＭで実施し、ＰＣＮＡ変異体がある場合とない場合とのそれぞれで実施した。阻害物質がない場合と２．５、２、１．５、１、０．５、０．２５、０．１％糞便でのＣｔを確認した。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いた系では０．２、１．０μＭのプライマー濃度で、同様に阻害物質がない場合と２．５、２、１．５、１、０．５、０．２５、０．１％ 糞便でのＣｔを確認した。融解曲線で非特異的な増幅が見られる場合、非特異的増幅の量に応じて、丸で囲いマーキング（目的遺伝子の増幅もあるが非特異的増幅もある）、四角で囲いマーキングした（非特異的増幅のみ見られる）。また、まったく増幅しないサンプルは「Ｎ．Ｄ．」と表記した。

検査の現場では、糞便１％存在下で増幅を確認することが必要になる。Ｔａｑの系での結果、糞便１％存在下では、プライマー濃度が高くても、そもそも高速ＰＣＲで増幅が見られなかった。一方、ＫＯＤの系では、ＰＣＮＡを添加しなくても、０．５％まで増幅は確認できたが、０．５％で阻害が生じ始め、非特異的増幅が出現することが示された。ＰＣＮＡを入れた系では１．５％糞便を入れても増幅が確認された。これらの結果から、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが高速ＰＣＲに向いていることがわかる。しかし、高濃度プライマーとファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いてもＣｔの立ち上がりはあまりよくなく、１％以下の糞便でも大きく影響を受ける結果となった。やはり高濃度プライマーとファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＮＡを組み合わせた系が最も効率的であり、１％糞便を含んだ高速ＰＣＲにおいては、この組み合わせでないと増幅ができない結果が得られた。

本発明は、ＤＮＡ合成に関わるバイオテクノロジー関連産業において有用であり、特に診断用途において有用である。

Claims (13)

1. 動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、及びウイルスからなる群より選択される少なくとも一種の阻害物質を含む生体試料を含んだ状態でＰＣＲを行うための組成物であって、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ；増殖細胞核抗原）、及び０．８μＭ以上の濃度でプライマーを含み、かつ、３０サイクルから５０サイクルを４０分以内で実施するための組成物であることを特徴とするＰＣＲ用の組成物。
2. ３０サイクルから５０サイクルを３０分以内で実施するための組成物である請求項１に記載の組成物。
3. ３０サイクルから５０サイクルを１２分以内で実施するための組成物である請求項１又は２に記載の組成物。
4. プライマーの濃度が１．０μＭ以上である請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
5. 昇温又は降温の速度が１０℃／秒以上となる速度でＰＣＲを実施するための組成物である請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
6. ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
7. ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
8. ＰＣＮＡが古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＰＣＮＡである請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
9. ＰＣＮＡがＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性をもつ変異型ＰＣＮＡである請求項１から８のいずれかに記載の組成物。
10. 請求項１から９のいずれかに記載の組成物を反応液中に含むように構成されていることを特徴とするＰＣＲ用試薬。
11. 請求項１０に記載のＰＣＲ用試薬を含むことを特徴とするＰＣＲ用試薬キット。
12. 請求項１から９のいずれかに記載の組成物を用いる、１５回から５０回の熱サイクルによるＰＣＲ方法であって、前記組成物を含む反応液中に動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、及びウイルスからなる群より選択される少なくとも一種の阻害物質を含む生体試料を添加し、かつ、ＰＣＲの反応時間が６０分以内であることを特徴とするＰＣＲ方法。
13. ＰＣＲの反応時間が３０分以内である請求項１２に記載のＰＣＲ方法。

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