JP2010104304A - エキソヌクレアーゼ活性増強dnaポリメラーゼ変異体 - Google Patents
エキソヌクレアーゼ活性増強dnaポリメラーゼ変異体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010104304A JP2010104304A JP2008280392A JP2008280392A JP2010104304A JP 2010104304 A JP2010104304 A JP 2010104304A JP 2008280392 A JP2008280392 A JP 2008280392A JP 2008280392 A JP2008280392 A JP 2008280392A JP 2010104304 A JP2010104304 A JP 2010104304A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- dna polymerase
- amino acid
- clamp
- derived
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】DNAクランプと協働させた場合に増強された3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼ変異体であって、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型DNAポリメラーゼのアミノ酸配列の706位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されていることを特徴とするDNAポリメラーゼ変異体。
【選択図】なし
Description
(1)DNAクランプと協働させた場合に増強された3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼ変異体であって、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型DNAポリメラーゼのアミノ酸配列の706位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されていることを特徴とするDNAポリメラーゼ変異体。
(2)706位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、中性アミノ酸、親水性アミノ酸、または酸性アミノ酸に置換されている、(1)に記載のDNAポリメラーゼ変異体。
(3)中性アミノ酸がアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンおよびシステインから選択され、親水性アミノ酸がセリン、アスパラギン、グルタミンおよびトレオニンから選択され、酸性アミノ酸がチロシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される、(2)に記載のDNAポリメラーゼ変異体。
(4)706位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、アラニンまたはグルタミン酸に置換されている、(1)に記載のDNAポリメラーゼ変異体。
(5)706位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、アスパラギン酸に置換されている、(1)に記載のDNAポリメラーゼ変異体。
(6)ピロコッカス・フリオサス由来の野生型DNAポリメラーゼのアミノ酸配列の706位のアルギニンが正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されている、(1)〜(5)のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ変異体。
(7)好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来の野生型DNAポリメラーゼのDNAポリメラーゼ変異体である、(1)〜(5)のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ変異体。
(8)(1)〜(7)のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ変異体をコードするDNA。
(9)(8)記載のDNAを組み込んだ組換えベクター。
(10)(1)〜(7)のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするPCR法。
(11)(1)〜(7)のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ変異体を含むPCR用キット。
(12)(1)〜(7)のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするDNAシーケンシング法。
(13)(1)〜(7)のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ変異体を含むDNAシーケンシング用キット。
(14)(1)〜(7)のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ変異体と同生物種由来のDNAクランプ(PCNA)を用いることを特徴とするPCR法。
(15)(1)〜(7)のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ変異体と同生物種由来のDNAクランプ(PCNA)を含むPCR用キット。
(16)(1)〜(7)のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ変異体と同生物種由来のDNAクランプ(PCNA)を用いることを特徴とするDNAシーケンシング法。
(17)(1)〜(7)のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ変異体と同生物種由来のDNAクランプ(PCNA)を含むDNAシーケンシング用キット。
本発明は、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)由来の野生型DNAポリメラーゼとDNAクランプの相互作用部位に存するアルギニン、もしくは他のポリメラーゼの相当するアミノ酸を正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換することによって得られるDNAポリメラーゼ変異体を提供するものである。この相互作用部位は複合体の構造を堅固にしていると考えられるが、その反面、3’→5’エキソヌクレアーゼ反応に関しては抑制的に機能しており、そのことによりDNA複製における忠実度が低減されている。そこで、この相互作用部位に存するDNAポリメラーゼの正電荷アミノ酸に上記の変異を導入し、DNAクランプと併用することにより、酵素の3’→5’エキソヌクレアーゼ活性および忠実度を向上させることができる。
本発明は、本発明のDNAポリメラーゼ変異体をコードするDNAを提供する。このDNAの塩基配列では、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型DNAポリメラーゼのアミノ酸配列の706位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸をコードする塩基配列が別のアミノ酸をコードする塩基配列に置換されている。具体的には、ピロコッカス・フリオサス由来の野生型DNAポリメラーゼをコードするDNAにおいて、当該野生型DNAポリメラーゼのアミノ酸配列の706位のアルギニンをコードする塩基配列が、正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸をコードする塩基配列に置換されている。
本発明は、前記DNAポリメラーゼ変異体DNAをプラスミドDNAやファージDNAなどのベクターDNAに挿入した組換えベクターを提供する。
次いで、前記ベクターをDNAポリメラーゼが発現しうるように宿主中に導入し、DNAポリメラーゼ変異体発現系を作製する。ここで宿主としては、本発明のDNAを発現できるものであれば特に限定されず、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞など既知の宿主のいずれでも発現ベクターのシステムを適合させることにより利用できる。
合成したDNAポリメラーゼ変異体を精製回収するためには透析、限外ろ過、各種のカラムクロマトグラフィーなど既存の精製システムが利用できる。合成したDNAポリメラーゼ変異体の量が少量(500ng程度)の場合、DNAポリメラーゼ変異体蛋白質にタグ配列を導入し、このタグ配列に対するアフィニティーを利用してDNAポリメラーゼ変異体を回収する方法が望ましい。例えば、無細胞蛋白質合成系であるPURE SYSTEMでDNAポリメラーゼを合成した場合、タグ配列としてStrep−tag配列やFlag−tag配列などを導入すればDNAポリメラーゼ変異体を回収することができる。回収されたDNAポリメラーゼ変異体の3’→5’エキソヌクレアーゼ活性は、DNAクランプと協働させて(DNAクランプの存在下で)測定することにより評価することができる。
本発明は、さらなる態様において、本発明のDNAポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするPCR法、および本発明のDNAポリメラーゼ変異体を含むPCR用キットを提供する。上述のごとく、本発明のDNAポリメラーゼ変異体、特に耐熱性に優れたものはPCR法に用いることにより威力を発揮する。すなわち、耐熱性ならびにDNA複製における忠実度が優れた本発明のDNAポリメラーゼ変異体をDNAクランプと併用すれば、より迅速かつ信頼性に富むPCR法を行うことができ、効率的な遺伝子増幅、点突然変異の検出等を行うことができる。DNAポリメラーゼ変異体と併用するDNAクランプは、用いるDNAポリメラーゼ変異体と同生物種由来のものであることが好ましい。同生物種由来とは、DNAポリメラーゼ変異体のもととなったDNAポリメラーゼが由来する生物種と同じ生物種に由来することをさす。
(1)ピロコッカス・フリオサス(P.furiosus)ゲノムDNAの調製
P.furiosus DSM3638はDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen GmbHより入手し、文献(Nucleic Acids Research、第21巻、259−265ページ)の方法に従って培養した。500mlの培養液から約1.2gの菌体を得た。これを緩衝液L(10mMトリス−塩酸(pH8.0)、1mM EDTA、100mM NaCl)10mlに懸濁し、10% SDSを1ml加えた。撹拌の後、プロテイナーゼK(20mg/ml)を50ml加えて、55℃で60分静置した。その後反応液を順次フェノール抽出、フェノール/クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノールを加えてDNAを不溶化した。回収したDNAを1mlのTE液(10mMトリス−塩酸(pH8.0)、1mM EDTA)に溶解し、0.75mgのRNase Aを加えて37℃で60分反応させた。その後反応液をもう一度フェノール抽出、フェノール/クロロホルム抽出、クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿によりDNAを回収した。0.75mgのDNAが得られた。
P.furiosusのゲノムDNAからpol遺伝子と予想される領域をPCRで増幅した。pol遺伝子の翻訳開始コドンと予想されるATGに合わせてNcoI認識配列をフォワードプライマー内に組込んだ。リバースプライマーには終止コドンの直後にSphI認識配列を導入した。PyroBEST DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社)を用いて、熱変性95℃、アニーリング55℃、伸長反応72℃を30サイクル行うPCR条件で目的の遺伝子を増幅した。1st PCR産物を鋳型として、同じ条件で2nd PCRを行い、その産物をpGEM−T easyベクター(プロメガ社)に組み込み、DNAシークエンサー(Beckman Coultar社)を用いてその挿入断片領域の塩基配列の確認を行った。その後、NcoI−SphIで切断してpGEM−T easyベクターから切り出したpol遺伝子をpET15bベクター(EMD Bioscience社)に挿入し、プラスミドpET15b−polを得た。
以下、無処理(野生型)ポリメラーゼについての大量発現系の構築および精製について記すが、706位のアルギニンに変異を導入したポリメラーゼ(R706A、R706E)についても、最初に用いるプラスミドがpET15b−polR706AおよびpET15b−polR706Aになるだけで他の手順は全く同じで、同様に大量発現させ、精製することができた。
プラスミドpET21a−pcnaによってコンピータントセルSTRATAGENE社BL21 コドンプラスRILを形質転換して、100μg・mL−1のアンピシリンおよび20μg・mL−1のクロラムフェニコール存在下のLuria−Bertani培地を用いて37℃にて培養を行った。培養液濁度(660nm吸光度)が0.6に到達した時点で、終濃度1mMになるようイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシドを添加し、蛋白質の発現を誘導した。さらに6時間培養を行った後、遠心分離器で菌体を回収した。菌体はトリス塩酸緩衝液(pH8)に懸濁して超音波破砕を行い、遠心分離した。上清を80℃、20分間加熱処理を行い遠心分離した。上清に終濃度0.10%(w/v)になるようポリエチレンイミンを添加し、遠心分離にて核酸成分を除去した。この溶液に80%飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加した後、遠心分離し、沈殿を採取した。
野生型DNAポリメラーゼと変異体のプライマー伸長活性をDNAクランプ存在・非存在下で比較した。M13mp18一本鎖DNAを鋳型とし、これに20merのオリゴDNAをハイブリダイズさせたものを基質として用いた。反応溶液は20mM TrisHCl(pH8.8)、100mM NaCl、2mM MgSO4、10mM (NH4)2SO4、50mM KCl、0.1% Triton X−100、200μM deoxyribonucleoside triphosphates(5μCi of [α32P]dTTP}])を含み、70℃、1分間予め熱しておいて、10nM DNAポリメラーゼを添加して反応を開始した。70℃、2分間反応を行った後、アガロースゲルを用いて泳動し、オートラジオグラフィーにより泳動パターンの解析を行った。
実施例2で使用したDNAポリメラーゼおよびDNAクランプは、野生型、変異体共に精製の初期段階において、非耐熱性蛋白質を故意に変性させ、その後の精製操作を簡便化することを目的として、85℃、20分間の加熱処理を行ったものである。かかる加熱処理において、変異体は野生型に遜色のない耐熱性を示した。
配列番号1は野生型のPyrococcus furiosusのDNAポリメラーゼをコードする塩基配列である。
配列番号2は野生型のPyrococcus furiosusのDNAポリメラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号3は実施例1で得られた野生型のPyrococcus furiosusのDNAポリメラーゼをコードする塩基配列である。
配列番号4は実施例1で得られた野生型のPyrococcus furiosusのDNAポリメラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号5は実施例1で得られたPyrococcus furiosusのDNAポリメラーゼ変異体(R706A)をコードする塩基配列である。
配列番号6は実施例1で得られたPyrococcus furiosusのDNAポリメラーゼ変異体(R706A)のアミノ酸配列である。
配列番号7は実施例1で得られたPyrococcus furiosusのDNAポリメラーゼ変異体(R706E)をコードする塩基配列である。
配列番号8は実施例1で得られたPyrococcus furiosusのDNAポリメラーゼ変異体(R706E)のアミノ酸配列である。
配列番号9は野生型のPyrococcus furiosusのDNAクランプ(PCNA)をコードする塩基配列である。
配列番号10は野生型のPyrococcus furiosusのDNAクランプ(PCNA)のアミノ酸配列である。
配列番号11は実施例1で得られた野生型のPyrococcus furiosusのDNAクランプ(PCNA)をコードする塩基配列である。
配列番号12は実施例1で得られた野生型のPyrococcus furiosusのDNAクランプ(PCNA)のアミノ酸配列である。
配列番号13はPyrococcus furiosusのDNAポリメラーゼ変異体(R706A)をコードするDNAを増幅するためのプライマーである。
配列番号14はPyrococcus furiosusのDNAポリメラーゼ変異体(R706A)をコードするDNAを増幅するためのプライマーである。
配列番号15はPyrococcus furiosusのDNAポリメラーゼ変異体(R706E)をコードするDNAを増幅するためのプライマーである。
配列番号16はPyrococcus furiosusのDNAポリメラーゼ変異体(R706E)をコードするDNAを増幅するためのプライマーである。
Claims (17)
- DNAクランプと協働させた場合に増強された3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼ変異体であって、ホモロジー解析によりピロコッカス・フリオサス由来の野生型DNAポリメラーゼのアミノ酸配列の706位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されていることを特徴とするDNAポリメラーゼ変異体。
- 706位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、中性アミノ酸、親水性アミノ酸、または酸性アミノ酸に置換されている、請求項1に記載のDNAポリメラーゼ変異体。
- 中性アミノ酸がアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンおよびシステインから選択され、親水性アミノ酸がセリン、アスパラギン、グルタミンおよびトレオニンから選択され、酸性アミノ酸がチロシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される、請求項2に記載のDNAポリメラーゼ変異体。
- 706位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、アラニンまたはグルタミン酸に置換されている、請求項1に記載のDNAポリメラーゼ変異体。
- 706位のアルギニンに相当すると特定されるアミノ酸が、アスパラギン酸に置換されている、請求項1に記載のDNAポリメラーゼ変異体。
- ピロコッカス・フリオサス由来の野生型DNAポリメラーゼのアミノ酸配列の706位のアルギニンが正電荷を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されている、請求項1〜5のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼ変異体。
- 好熱性細菌、超好熱性細菌、好熱性古細菌または超好熱性古細菌由来の野生型DNAポリメラーゼのDNAポリメラーゼ変異体である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼ変異体。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼ変異体をコードするDNA。
- 請求項8記載のDNAを組み込んだ組換えベクター。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするPCR法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼ変異体を含むPCR用キット。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼ変異体を用いることを特徴とするDNAシーケンシング法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼ変異体を含むDNAシーケンシング用キット。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼ変異体と同生物種由来のDNAクランプ(PCNA)を用いることを特徴とするPCR法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼ変異体と同生物種由来のDNAクランプ(PCNA)を含むPCR用キット。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼ変異体と同生物種由来のDNAクランプ(PCNA)を用いることを特徴とするDNAシーケンシング法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のDNAポリメラーゼ変異体と同生物種由来のDNAクランプ(PCNA)を含むDNAシーケンシング用キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008280392A JP5258512B2 (ja) | 2008-10-30 | 2008-10-30 | エキソヌクレアーゼ活性増強dnaポリメラーゼ変異体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008280392A JP5258512B2 (ja) | 2008-10-30 | 2008-10-30 | エキソヌクレアーゼ活性増強dnaポリメラーゼ変異体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010104304A true JP2010104304A (ja) | 2010-05-13 |
JP5258512B2 JP5258512B2 (ja) | 2013-08-07 |
Family
ID=42294385
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008280392A Expired - Fee Related JP5258512B2 (ja) | 2008-10-30 | 2008-10-30 | エキソヌクレアーゼ活性増強dnaポリメラーゼ変異体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5258512B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015053293A1 (ja) * | 2013-10-07 | 2015-04-16 | 三井化学株式会社 | 細菌dna増幅用のpcr用プライマーセット、細菌種の検出及び/または同定用キット及び細菌種の検出及び/または同定方法 |
WO2016104272A1 (ja) * | 2014-12-25 | 2016-06-30 | 東洋紡株式会社 | Pcr方法 |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5489523A (en) * | 1990-12-03 | 1996-02-06 | Stratagene | Exonuclease-deficient thermostable Pyrococcus furiosus DNA polymerase I |
US6489150B1 (en) * | 1990-12-03 | 2002-12-03 | Stratagene | Purified thermostable Pyrococcus furiosus DNA polymerase I |
JP2003534796A (ja) * | 2000-05-26 | 2003-11-25 | エムジェイ バイオワークス,インコーポレイティド | 改良された核酸修飾酵素 |
JP2005514072A (ja) * | 2001-12-21 | 2005-05-19 | ストラタジーン カリフォルニア | 高忠実度dnaポリメラーゼ組成物およびその使用 |
JP2005526510A (ja) * | 2002-04-17 | 2005-09-08 | ニューキャッスル アポン タイン大学 | 古細菌からのdnaポリメラーゼの変異 |
JP2006507012A (ja) * | 2002-10-25 | 2006-03-02 | ストラタジーン カリフォルニア | 減少した塩基類似体検出活性を有するdnaポリメラーゼ |
WO2007004654A1 (ja) * | 2005-07-04 | 2007-01-11 | Celestar Lexico-Sciences, Inc. | 変異型pcna |
JP2007300899A (ja) * | 2006-05-15 | 2007-11-22 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 新規dna複製因子 |
-
2008
- 2008-10-30 JP JP2008280392A patent/JP5258512B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5489523A (en) * | 1990-12-03 | 1996-02-06 | Stratagene | Exonuclease-deficient thermostable Pyrococcus furiosus DNA polymerase I |
US6489150B1 (en) * | 1990-12-03 | 2002-12-03 | Stratagene | Purified thermostable Pyrococcus furiosus DNA polymerase I |
JP2003534796A (ja) * | 2000-05-26 | 2003-11-25 | エムジェイ バイオワークス,インコーポレイティド | 改良された核酸修飾酵素 |
JP2005514072A (ja) * | 2001-12-21 | 2005-05-19 | ストラタジーン カリフォルニア | 高忠実度dnaポリメラーゼ組成物およびその使用 |
JP2005526510A (ja) * | 2002-04-17 | 2005-09-08 | ニューキャッスル アポン タイン大学 | 古細菌からのdnaポリメラーゼの変異 |
JP2006507012A (ja) * | 2002-10-25 | 2006-03-02 | ストラタジーン カリフォルニア | 減少した塩基類似体検出活性を有するdnaポリメラーゼ |
WO2007004654A1 (ja) * | 2005-07-04 | 2007-01-11 | Celestar Lexico-Sciences, Inc. | 変異型pcna |
JP2007300899A (ja) * | 2006-05-15 | 2007-11-22 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 新規dna複製因子 |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015053293A1 (ja) * | 2013-10-07 | 2015-04-16 | 三井化学株式会社 | 細菌dna増幅用のpcr用プライマーセット、細菌種の検出及び/または同定用キット及び細菌種の検出及び/または同定方法 |
CN105612254A (zh) * | 2013-10-07 | 2016-05-25 | 三井化学株式会社 | 用于扩增细菌dna的pcr中使用的引物组、用于检出及/或鉴定细菌菌种的试剂盒及检出及/或鉴定细菌菌种的方法 |
JPWO2015053293A1 (ja) * | 2013-10-07 | 2017-03-09 | 三井化学株式会社 | 細菌dna増幅用のpcr用プライマーセット、細菌種の検出及び/または同定用キット及び細菌種の検出及び/または同定方法 |
WO2016104272A1 (ja) * | 2014-12-25 | 2016-06-30 | 東洋紡株式会社 | Pcr方法 |
JPWO2016104272A1 (ja) * | 2014-12-25 | 2017-10-05 | 東洋紡株式会社 | Pcr方法 |
JP2021006061A (ja) * | 2014-12-25 | 2021-01-21 | 東洋紡株式会社 | Pcr方法 |
JP7107345B2 (ja) | 2014-12-25 | 2022-07-27 | 東洋紡株式会社 | Pcr方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP5258512B2 (ja) | 2013-08-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11718836B2 (en) | Exonuclease deficient polymerases | |
Borukhov et al. | Recombinant Escherichia coli RNA polymerase: purification of individually overexpressed subunits and in vitro assembly | |
JP2021121221A (ja) | ポリメラーゼバリアントおよびその使用 | |
CN109022387B (zh) | 一种突变型Pfu DNA聚合酶及其制备方法和应用 | |
US11319531B2 (en) | Transglutaminase variants | |
JP2018508202A (ja) | ポリメラーゼバリアント | |
CN110938616B (zh) | 一种温泉热碱芽孢杆菌来源的腈水合酶的突变体 | |
JP6963238B2 (ja) | Dnaポリメラーゼ変異体 | |
CN112585264A (zh) | 重组型kod聚合酶 | |
JP4486009B2 (ja) | Dnaリガーゼ変異体 | |
CN108998462B (zh) | 含锰离子重组蛋白的大肠杆菌表达系统及其应用方法 | |
JP5258512B2 (ja) | エキソヌクレアーゼ活性増強dnaポリメラーゼ変異体 | |
CN112175980B (zh) | 通过定点突变提高聚合酶大片段活性的方法及应用 | |
JP7384906B2 (ja) | 非標準アミノ酸含有組成物とその使用 | |
CN112322606A (zh) | 一种腈水合酶突变体及其应用 | |
US7981653B2 (en) | Highly efficient hyperthermophilic DNA ligase | |
EP2843046A1 (en) | Practical method for enzymatically synthesizing cyclic di-gmp | |
JP5324083B2 (ja) | 高反応性耐熱性dnaリガーゼ | |
JPWO2016017774A1 (ja) | 改良型β−フルクトフラノシダーゼ | |
WO2016084879A1 (ja) | 核酸増幅試薬 | |
WO2014104094A1 (ja) | 熱安定性が向上したトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素 | |
CN109486784B (zh) | 一种能催化西他沙星五元环关键中间体的ω-转氨酶突变体 | |
CN109468297B (zh) | 一种能够催化西他沙星五元环中间体的ω-转氨酶突变体 | |
CN114381442A (zh) | 一种可快速延伸的高保真dna聚合酶及其制备方法和应用 | |
JP2020195375A (ja) | 5−アミノレブリン酸シンテターゼ変異体およびその宿主細胞と応用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110510 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130326 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130423 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160502 Year of fee payment: 3 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 5258512 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |