JP6963238B2 - Dnaポリメラーゼ変異体 - Google Patents
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Description
ファミリーAに属するDNAポリメラーゼの特徴として、DNA鎖伸長活性が強い、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性(プルーフリーディング活性、以下、3’→5’エキソ活性と記載することがある)を持たない酵素が多い、TdT(末端デオキシヌクレオチド転移)活性を有すること等が挙げられる。また、鎖置換活性を有する酵素と有さない酵素があり、Taqポリメラーゼは鎖置換活性を有さないが、Bstポリメラーゼのラージフラグメントは該活性を有する。Tthポリメラーゼは、逆転写活性を併せ持つDNAポリメラーゼとして知られている。
(1)685番目のプロリンに相当するアミノ酸のアルギニンまたはセリンへの置換、
(2)686番目のチロシンに相当するアミノ酸のアルギニンへの置換、および
(3)687番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸のアルギニン、リジンまたはアラニンへの置換、
からなる群より選択される1以上の置換を有するDNAポリメラーゼである。具体的には、配列表の配列番号40〜48のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むDNAポリメラーゼが挙げられる。
本発明の第一の態様は、DNAポリメラーゼに関し、これは、ファミリーAに属するDNAポリメラーゼのアミノ酸配列において、鋳型DNA結合部位にその電荷の総和が増加するようなアミノ酸置換を有し、かつ5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有さないDNAポリメラーゼ、ならびに前記DNAポリメラーゼのアミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有し、かつ同等の活性を有するDNAポリメラーゼである。該DNAポリメラーゼは鎖置換活性を有することが好ましい。なお、本明細書において、「配列同一性」とは、DNAポリメラーゼのアミノ酸配列において、鋳型DNA結合部位以外のアミノ酸配列を100%とする場合の配列同一性のことであり、好ましくはDNAポリメラーゼのアミノ酸配列と95%以上、より好ましくは100%の配列同一性を有する。
(1)685番目のプロリンに相当するアミノ酸のアルギニンまたはセリンへの置換、
(2)686番目のチロシンに相当するアミノ酸のアルギニンへの置換、および
(3)687番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸のアルギニン、リジンまたはアラニンへの置換、
からなる群より選択される1以上の置換を有する、好ましくは鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼである。
また、これらのPIPボックスは、本発明の融合ポリペプチド内に複数個存在してもよい。融合ポリペプチドに含まれるPIPボックスの数は、特に限定はないが、1〜6個、好ましくは2〜4個が例示される。これら複数のPIPボックスは、その機能を果たす限りにおいては、それぞれのアミノ酸配列が異なっていてもよい。また、複数のPIPボックス同士の間には、例えば後述のリンカーペプチドなど、別のアミノ酸配列が挟まっていてもよい。
本発明のDNAポリメラーゼを用いた核酸増幅方法は、DNA分子の製造に利用可能である。本発明を何ら限定するものではないが、前記本発明の核酸増幅方法の例としては、本発明のDNAポリメラーゼおよび鋳型DNAを共にインキュベートする工程を含むDNA分子の製造方法である。ここで、該DNAポリメラーゼは鎖置換活性を有することが好ましい。該方法は、さらにプライマーを含んでいてもよい。当該プライマーは、一種でも複数種でもよい。また、当該プライマーは、特異的プライマーでもランダムプライマーあるいはそれらの混合物でもよい。当該プライマーの種類は、目的に応じて適宜選択することができる。当該DNA分子の製造方法は、本分野において通常使用されている方法であればよい。本発明を何ら限定するものではないが、前記本発明の核酸増幅方法は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応または等温核酸増幅反応に使用できる。
本発明のキットは、本発明のDNAポリメラーゼを含むキットである。ここで、該DNAポリメラーゼは鎖置換活性を有することが好ましい。本発明を何ら限定するものではないが、当該キットには、本発明のDNAポリメラーゼに加えて、上記反応に使用するプライマー、二価金属塩、dNTP、緩衝液、滅菌水等反応に必要な試薬類、陽性コントロール用の天然のまたは人工の鋳型DNAおよび容器である滅菌チューブをさらに含んでいてもよい。さらに、本発明のDNAポリメラーゼ、二価金属塩、dNTP、緩衝成分などを混合し、使用時に鋳型DNAと水(滅菌水等)を添加するのみで使用可能な組成物を含むキットも本発明に包含される。
(1)ポリメラーゼ変異体プラスミドの調製
Taqポリメラーゼ(GenBank No.:AAA27507のアミノ酸配列中のP685〜E687の領域に注目し、以下に示す変異体を作製した。すなわち、配列表の配列番号4記載の塩基配列を有するTaq large fragment(N末端から289残基までのアミノ酸を欠失したTaq DNAポリメラーゼ;以下、TaqLFと表記することがある)が挿入されたpET24aプラスミド(Merck Millipore社製)を調製した。当該プラスミドを、pET−TaqLFプラスミドと称す。このプラスミドをもとに、QuickChange site−directed mutagenesis kit(アジレント・バイオテクノロジー社製)を用いて部位特異的変異を導入した。
変異Taqポリメラーゼの産生は、以下の様に行った。実施例1(2)で調製した変異体プラスミドを用いて取扱説明書に沿ってE. coli BL21−CodonPlus−RIL株(アジレント・バイオテクノロジー社製)を形質転換した。
この培養液のOD600が0.2〜0.3となったところでIPTG(和光純薬社製)を終濃度1mMとなるよう添加した。目的タンパク質遺伝子の発現を誘導するために25℃で14時間振とう培養し、培養液を遠心分離(5000×g、10分間)して集菌した。得られた菌体をPBS溶液(150mM NaCl、20mM Na2HPO4、2mM NaH2PO4、pH 7.5)で洗浄した。菌体を溶液A[50mM Tris−HCl,pH 8.0、1mM EDTA、1mM フッ化フェニルメチルスルホニル(phenylmethylsulfonyl fluoride、PMSF(和光純薬社製)]に懸濁し、氷上で超音波により菌体を破砕した。破砕液を遠心分離(23,700×g、4℃、10分間)し、その上清を80℃、20分間熱処理し、遠心分離(23,700×g、4℃、10分間)した。得られた上清に塩化ナトリウムを終濃度1Mとなるように添加し、その液へ終濃度が0.15%(w/v)となるように5%ポリエチレンイミン(polyethyleneimine、Sigma−Aldrich社製)溶液を添加後、氷上に30分間静置した。遠心分離(23,700×g、4℃、10分間)により得られた上清に硫酸アンモニウムを80%飽和溶液となるように添加した。遠心分離(23,700×g、4℃、10分間)後、沈殿を溶液B[50mM Tris−HCl,pH 8.0、1M (NH4)2SO4]に溶解し、溶液Bで平衡化した疎水性カラム HiTrap Butyl FF(GEヘルスケア社製) 5mlに供し、1Mから0Mまでの硫酸アンモニウム濃度勾配によってタンパク質を溶出させた。溶出画分を溶液C[50mM Tris−HCl,pH 8.0、50mM NaCl]で透析用セルロースチューブを用いて透析し、溶液Cで平衡化したアフィニティカラム HiTrap Heparin HP(GEヘルスケア社製) 1mlに供し、50mMから1Mまでの塩化ナトリウム濃度勾配によってタンパク質を溶出させた。溶出画分を溶液Cで透析し、最後に陰イオン交換カラムHiTrap Q HP(GEヘルスケア社製) 1mlに供し、50mMから0.5Mまでの塩化ナトリウム濃度勾配によってタンパク質を溶出させた。得られたタンパク質は、12%SDS−PAGEに供し、定法に従ってCBB染色を行い、純度を検定した。Taq55〜Taq59およびTaq62〜65を上記方法にて、タンパク質を産生および精製した。その結果を図1に示した。
野生型および変異型のTaqLFのプライマー伸長活性測定には、5’末端を[γ−32P]ATPを用いて放射性標識させた55ntのオリゴヌクレオチド(M13−pri55、配列番号49)を2,961ntの環状一本鎖DNA[pBlueScript II SK(+)(アジレント・バイオテクノロジー社製)]にアニールさせたプライムドDNA(primed−DNA)を基質DNAとして用いた。
反応液D 20μl[20mM Tris−HCl,pH 8.8、10mM KCl、3.5mM MgCl2、0.1mg/ml BSA、0.1%Tween 20、5nM primed−DNAおよび0.25mM dNTP]中で10nMになるように野生型TaqLFまたは変異型TaqLFを混合し、72℃で2.5分間または10分間反応させた。各反応混合液8μlあたり反応停止液[300mM NaOH、6mM EDTA、18%Ficoll 400、0.15%bromocresol greenおよび0.24%xylene cyanol] 2μlを加えることで反応を停止させた。これを0.8%アルカリアガロースゲルに供し、アルカリ溶液[50mM NaOHおよび1mM EDTA]中で電気泳動した。電気泳動後、ゲルを乾燥させ、乾燥ゲルをイメージングプレート(FUJIFILM社製)に露光させた。Typhoon TRIO+(GEヘルスケア社)を用いて、合成されたDNAを検出した。野生型及び各変異Taqポリメラーゼのプライマー伸長活性の結果を図2−1および図2−2に示した。
一方、Taq55は2.5分の反応で、3.4kbまで伸長した。10分では4.3kbの位置まで濃いバンドが、7kbの位置まで薄いバンドが見られた。
Taq56は2.5分の反応で、4.3kbまで伸長した。10分では6.5kbの位置まで濃いバンドが、9kbの位置まで薄いバンドが見られた。
Taq57は2.5分の反応で、6.5kbまで伸長した。10分では10kb以上の位置まで濃いバンドが見られた。
Taq58は2.5分の反応で、7.0kbまで伸長した。10分では10kb以上の位置まで濃いバンドが見られた。
Taq59は2.5分の反応で、8.0kbまで伸長した。10分では10kb以上の位置まで濃いバンドが見られた。
ゲルシフトアッセイを用いて変異TaqポリメラーゼとプライムドDNAとの親和性を調べた。測定は以下のようにして行った。
まず、DNA結合能測定の基質は、5’末端を32Pで放射性標識させた27ntの一本鎖DNA(d27、配列番号50)と非標識の49ntの一本鎖DNA(49N、配列番号51)をアニールさせたDNAを基質DNAとして使用した。2nM 基質DNAを含む溶液E [20mM Tris−HCl,pH 8.8、10mM NaCl、5mM MgCl2、14mM 2−mercaptoethanol、0.1mg/ml BSAおよび5%(v/v)glycerol]10μl中でDNAポリメラーゼタンパク質を0.6〜400nMになるよう加え、40℃で5分間恒温させた。DNA−酵素混合液を1%アガロースゲルに供し、0.1×TAE溶液[4mM Tris base、2mM acetic acidおよび0.1mM EDTA]中で電気泳動した。電気泳動終了後、ゲルを乾燥させ、乾燥させたゲルをイメージングプレートに露光させた。Typhoon TRIO+を用いて、標識DNAを検出した。
以前の結果[フロンティアーズ イン マイクロバイオロジー(Front Microbiol.)、第5巻、461ページ(2014年)、doi: 10.3389/fmicb.2014.00461]から、野生型TaqポリメラーゼとプライムドDNAとの見かけの解離定数Kd値は、400nMであった。
一方、Taq55〜Taq59変異体では、領域内の荷電が+2のTaq57およびTaq58は、Taq57のシフトバンドはみられないものの、400nMのタンパク質の添加ではプライムドDNAの量が減少していた。Taq58では、25nMのタンパク質量でシフトバンドが現れ、見かけのKd値は100nMであった。
次に、荷電が+3のTaq59では、25nMのタンパク質で、明らかなシフトバンドがあらわれ、400nMでは2段階のシフトが見られた。見かけのKd値は、40nMであった。
以上の結果から、プライマー伸長活性とゲルシフトには相関があった。
(1)既知Taq DNAポリメラーゼとの比較
実施例1で調製したTaq59を用いてPfu ゲノムDNAを鋳型としてDNA増幅をおこなった。反応液組成は、8nM Taq59ポリメラーゼ、x1 SD buffer、0.5mM dNTPs、10ng Pfu ゲノムDNA、10μM pd(N)6、0.25mg/ml BSAである。反応は、(A)50℃;6時間または(B)30℃;60秒、68℃;60秒を99サイクル行った。また、対照サンプルとして、配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列を有する野生型Taq DNAポリメラーゼ、配列表の配列番号3記載のアミノ酸配列を有するTaq DNAポリメラーゼ Large Fragmentおよび市販品のSD活性を有するSD−ポリメラーゼ(BIORON社製)も使用した。
まず、伸長温度を(A)50℃および(B)70℃の2通りで行った。反応は、32nM ポリメラーゼ、20mM Tris−HCl,pH8.8、10mM KCl、3.5mM MgCl2、0.1%Tween20、0.5mM dNTPs、10ng Pfu genome DNA、10μM pd(N)6、0.25mg/ml BSAを含む液量20μlの反応液で40℃;10秒、50℃;1分、50℃または70℃;5分を60サイクル行った。得られた生成物を0.8%アルカリアガロースゲル電気泳動に供し、SYBR(登録商標) Green II Nucleic Acid Gel Stain(タカラバイオ社製)により染色した。結果を図5に示した。
70℃の伸長温度では、野生型Taq DNAポリメラーゼでは23kbまでの広範囲にDNAが増幅された。一方、Taq large fragmentではDNAは増幅されなかった。Taq59では、23.1kbのマーカーとウェルの間に高分子DNAの増幅が見られた。このように、本発明のDNAポリメラーゼは高い耐熱性を有することが分かった。さらに、本発明のDNAポリメラーゼは23kb以上という長鎖長のDNAであっても効率良く複製できることが分かった。
反応組成は、20mM Tris−HCl, pH8.8、10mM KCl、3.5mM MgCl2、0.1%Tween20、0.5mM dNTPs、10ng Pfu genome DNA、10μM pd(N)6、0.25mg/ml BSAである。反応は、50℃で6時間行った。生成物([0082])を0.8% アルカリアガロースゲル電気泳動に供し、SYBR(登録商標) Green II Nucleic Acid Gel Stainにより染色した。その結果を図6に示した。
本発明のTaq59と市販のphi29 DNAポリメラーゼについて比較した。本実験で使用したphi29 DNAポリメラーゼはニュー・イングランド・バイオラボ社製(商品名:phi29 DNA Polymerase)であり、非常に強い鎖置換活性を有することが知られている。
反応は、50mM Tris−HCl, pH7.5、10mM (NH4)2SO4、10mM MgCl2、4mM DTT、0.5mM dNTPs、10ng Pfu genome DNA、10μM pd(N)6、0.25mg/ml BSAを含む容量20μlの反応液を用いた。反応液に10Uの前記市販ポリメラーゼを加え、反応は30℃で18時間行った。生成物および[0082]の生成物を0.8%アルカリアガロースゲル電気泳動に供し、SYBR(登録商標) Green II Nucleic Acid Gel Stainにより染色した。その結果を図6に示した。
配列番号2:Nucleotide sequence of Taq DNA polymerase wild type
配列番号3:Amino acid sequence of Taq DNA polymerase large fragment
配列番号4:Nucleotide sequence of Taq DNA polymerase large fragment
配列番号5:Nucleotide sequence of DNA polymerase variant Taq55
配列番号6:Nucleotide sequence of DNA polymerase variant Taq56
配列番号7:Nucleotide sequence of DNA polymerase variant Taq57
配列番号8:Nucleotide sequence of DNA polymerase variant Taq58
配列番号9:Nucleotide sequence of DNA polymerase variant Taq59
配列番号10:Mutagenesis primer TaqPYA−5
配列番号11:Mutagenesis primer TaqPYA−3
配列番号12:Mutagenesis primer TaqPYK−5
配列番号13:Mutagenesis primer TaqPYK−3
配列番号14:Mutagenesis primer TaqPRK−5
配列番号15:Mutagenesis primer TaqPRK−3
配列番号16:Mutagenesis primer TaqSRK−5
配列番号17:Mutagenesis primer TaqSRK−3
配列番号18:Mutagenesis primer TaqRRR−5
配列番号19:Mutagenesis primer TaqRRR−3
配列番号20:Nucleotide sequence of DNA polymerase variant Taq62
配列番号21:Nucleotide sequence of DNA polymerase variant Taq63
配列番号22:Nucleotide sequence of DNA polymerase variant Taq64
配列番号23:Nucleotide sequence of DNA polymerase variant Taq65
配列番号24:Mutagenesis primer TaqAYR−5
配列番号25:Mutagenesis primer TaqAYR−3
配列番号26:Mutagenesis primer TaqRRR−5
配列番号27:Mutagenesis primer TaqRRR−3
配列番号28:Mutagenesis primer aa5
配列番号29:Mutagenesis primer aa3
配列番号30:Mutagenesis primer TaqAYR−5
配列番号31:Mutagenesis primer TaqAYR−3
配列番号32:Mutagenesis primer TaqRRR−5
配列番号33:Mutagenesis primer TaqRRR−3
配列番号34:Mutagenesis primer ha5
配列番号35:Mutagenesis primer ha3
配列番号36:Mutagenesis primer hk5
配列番号37:Mutagenesis primer hk3
配列番号38:Mutagenesis primer rr5
配列番号39:Mutagenesis primer rr3
配列番号40:Amino acid sequence of DNA polymerase variant Taq55
配列番号41:Amino acid sequence of DNA polymerase variant Taq56
配列番号42:Amino acid sequence of DNA polymerase variant Taq57
配列番号43:Amino acid sequence of DNA polymerase variant Taq58
配列番号44:Amino acid sequence of DNA polymerase variant Taq59
配列番号45:Amino acid sequence of DNA polymerase variant Taq62
配列番号46:Amino acid sequence of DNA polymerase variant Taq63
配列番号47:Amino acid sequence of DNA polymerase variant Taq64
配列番号48:Amino acid sequence of DNA polymerase variant Taq65
配列番号49:55nt Oligonucleotides M13−pri55
配列番号50:27nt Oligonucleotides d27
配列番号51:49nt Oligonucleotides 49N
配列番号52:Amino acid sequence of Pyrococcus furiosus RFC−L PIP−box
Claims (17)
- ファミリーAに属するDNAポリメラーゼのアミノ酸配列において、鋳型DNA結合部位にその電荷の総和が増加するようなアミノ酸置換を有し、70℃の伸長温度でDNA増幅した際に23kbのDNAを増幅する活性を有し、かつ5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有さないDNAポリメラーゼ、または該DNAポリメラーゼのアミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有し、70℃の伸長温度でDNA増幅した際に23kbのDNAを増幅する活性を有するDNAポリメラーゼであって、
該鋳型DNA結合部位が、配列表の配列番号1で示されるThermus aquaticus (Taq) DNAポリメラーゼのアミノ酸配列の685〜687番目のアミノ酸に相当する部位であり、かつ
該Taq DNAポリメラーゼのアミノ酸配列において
(1)685番目のプロリンに相当するアミノ酸のアルギニンまたはセリンへの置換、
(2)686番目のチロシンに相当するアミノ酸のアルギニンへの置換、および
(3)687番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸のアルギニン、リジンまたはアラニンへの置換、
からなる群より選択される1以上の置換を有する、DNAポリメラーゼ。 - 前記DNA増幅を、32nM DNAポリメラーゼ、20mM Tris−HCl,pH8.8、10mM KCl、3.5mM MgCl 2 、0.1%Tween20(登録商標)、0.5mM dNTPs、10ng Pfu genome DNA、10μM pd(N)6、0.25mg/ml BSAを含む反応液で実施する、請求項1記載のDNAポリメラーゼ。
- さらに鎖置換活性を有する請求項1又は2記載のDNAポリメラーゼ。
- ファミリーAに属するDNAポリメラーゼが、耐熱性のDNAポリメラーゼである、ここで、耐熱性のDNAポリメラーゼとは、90℃にて30分間保持した場合のDNA鎖伸長活性の残存活性が100%のDNAポリメラーゼ、又は95℃にて30分間保持した場合のDNA鎖伸長活性の残存活性75%以上のDNAポリメラーゼである、請求項1記載のDNAポリメラーゼ。
- 前記ファミリーAに属するDNAポリメラーゼが、Thermus属細菌のDNAポリメラーゼである請求項4記載のDNAポリメラーゼ。
- 前記ファミリーAに属するDNAポリメラーゼが、野生型のファミリーAに属するDNAポリメラーゼのN末端側配列が欠失したDNAポリメラーゼである請求項4または5記載のDNAポリメラーゼ。
- 前記ファミリーAに属するDNAポリメラーゼが、N末端側配列が欠失したTaq DNAポリメラーゼである請求項6記載のDNAポリメラーゼ。
- 前記ファミリーAに属するDNAポリメラーゼが、N末端から289残基までのアミノ酸を欠失したTaq DNAポリメラーゼである請求項7記載のDNAポリメラーゼ。
- 配列表の配列番号40〜48のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む請求項1記載のDNAポリメラーゼ。
- 請求項1〜9いずれか1項に記載のDNAポリメラーゼをコードする塩基配列を含む核酸。
- 配列表の配列番号5〜9および20〜23のいずれかに示される塩基配列を含む請求項1記載のDNAポリメラーゼをコードする核酸。
- 請求項10または11記載の核酸を含むベクター。
- 請求項12記載のベクター、または請求項10または11記載の核酸を含む形質転換体。
- 請求項13記載の形質転換体を培養し、培養物からDNAポリメラーゼを採取することを特徴とするDNAポリメラーゼの製造方法。
- 請求項1〜9いずれか1項に記載のDNAポリメラーゼおよび鋳型DNAを共にインキュベートする工程を含むDNA分子の製造方法。
- 前記製造方法がポリメラーゼ連鎖反応または等温核酸増幅反応で実施される請求項15記載の製造方法。
- 請求項1〜9いずれか1項に記載のDNAポリメラーゼを含むキット。
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