JP3891330B2 - 改変された耐熱性ｄｎａポリメラーゼ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ）における増幅効率及び／又は正確性の向上した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びその製法に関する。更には、該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の増幅方法、並びに該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有する試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ＰＣＲは生化学、分子生物学および臨床病理分野における研究、検査において必須の技術の一つとなっている。ＰＣＲの特徴は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いるところにあり、現在最も頻繁に利用されているＤＮＡポリメラーゼは主として、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNA polymerase）やサーマス・サーモティカス(Thermus thermophilus)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(Tth DNA polymerase)などのPolＩ型と呼ばれる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。PolＩ型ＤＮＡポリメラーゼの特徴は、増幅効率が良く、条件設定が容易であるところにある。しかしながら、該酵素には、増幅の際に核酸の取り込みの正確性(fidelity)が悪いという問題があり、増幅された遺伝子をクローニングするような場合には適していないとされている。
【０００３】
一方、超好熱始原菌由来のα型と呼ばれるＤＮＡポリメラーゼ、例えばパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(Pfu ＤＮＡポリメラーゼ；ＷＯ９２／９６８９号公報、特開平５−３２８９６９号公報)、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｉ(Vent)ポリメラーゼ、特開平６−７１６０号公報）、パイロコッカス・コダカラエンシス (Pyrococcus kodakaraensis) ＫＯＤ１（旧名：Pyrococcus sp. KOD1）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ；特開平７−２９８８７９号公報)なども知られている。また、最近の報告でパイロコッカス・コダカラエンシスはサーモコッカス属に分類されることがある。これら、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性(Proof reading活性)を有し、核酸の取り込み際の正確性は、Taq ＤＮＡポリメラーゼなどのpolI型ＤＮＡポリメラーゼに比べて優れているという特徴を有する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅においては、その増幅効率が十分でないなどの問題が存在している。また、これらα型ＤＮＡポリメラーゼには、ＰＣＲの反応時間、酵素量及びプライマー濃度等の至適条件の幅が狭いものが多い。
α型ＤＮＡポリメラーゼにおけるＰＣＲ増幅における上記問題点の原因として、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の強さが関与していることが考えられる。すなわち、ＰＣＲ時にプライマーなどがその３’−５’エキソヌクレアーゼ活性によって削られることにより、ＰＣＲにおける増幅効率が低下すると考えられている。また、α型ＤＮＡポリメラーゼは単一タンパク質内に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す領域と、ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す領域が存在するため、両活性はお互いに相互作用しており、それぞれの領域の核酸への親和性などの違いなどもＰＣＲ増幅に影響を及ぼしていると考えられる。
【０００５】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の発現を担っているＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中には、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性発現に関与していると思われる高度に保存されたアミノ酸領域（EXOI（図１）, EXOII, EXOIII）が存在していることが知られている（Gene, 100, 27-38 (1991), Gene, 112, 139-144 (1992)）。EXO I領域にはXDXEXモチーフ(D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、X:任意のアミノ酸)が存在し、アスパラギン酸とグルタミン酸はエキソヌクレアーゼ活性の発現に必須であることが知られている（Kongら(1993)、Journal of Biological Chemistry, vol. 268,1965-1975）。これらのアミノ酸配列におけるアスパラギン酸とグルタミン酸を中性のアミノ酸であるアラニンに置換することによって、エキソヌクレアーゼ活性を欠失または１万分の１以下に低減できることが報告されている（Kongら(1993)、Journal of Biological Chemistry, vol. 268,1965-1975）。しかしながら、エキソヌクレアーゼ活性を欠失又は1万分の1以下に低減させることにより、α型ＤＮＡポリメラーゼの特徴であるＤＮＡ複製時の正確性も同時に失われるという問題が存在した。
【０００６】
さらに、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼにおける上記XDXEXモチーフのXで示されるアミノ酸を任意のアミノ酸に置換することにより、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を段階的に減衰させる試みも行われている（特開平１０−４２８７１号公報）。この方法によると、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低下するにつれてＰＣＲ効率の上昇と増幅における正確性(fidelity)の低下が同時に観察される。したがって、この部分を置換する場合には正確性が損なわれない程度に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下した改変体酵素を作製することが重要となる。しかしながら、この方法によって得られた酵素、例えばＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの５’末端から第１４２番目のイソロイシンをグルタミンに置換した変異体(ＩＱ)や、リジンに置換した変異体(ＩＫ)は、必ずしもコピー数の低いＤＮＡからの増幅率が必ずしも良いとは言えず、優れたＰＣＲ効率を有する変異体とはいえなかった（図３）。
また特開平１０−４２８７１号公報によれば、この方法を用いる限りにおいて３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（proof reading活性）の上昇した変異体を得ることは困難である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは本課題を解決するためＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの種々の変異体を作製し、鋭意検討を重ねた結果、EXOI領域中のXDXEXモチーフのグルタミン酸から数えて４つ目のヒスチジン残基（１４７番目；以下、Ｈとも示す)を種々のアミノ酸に置換することにより、様々な強さの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性、ＰＣＲ効率及び正確性を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの取得が可能であることを見出し、本発明に到達した（以下、このヒスチジンを含むモチーフをDXEXXXHモチーフと呼ぶ。DX1EX2X3X4Hモチ-フ、および配列DX1EX2X3X4Hなどの表記も同義である。）。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
１． ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのエキソＩ (EXOＩ) 領域のDXE配列及び該配列のEに隣接する４アミノ酸長のペプチドからなるDX1EX2X3X4H（D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、H:ヒスチジン、X1,X2,X3及びX4：任意のアミノ酸）配列において、ヒスチジンが他のアミノ酸に置換された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
２． DX1EX2X3X4H 配列中のヒスチジンがアスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、アラニン、リジン、及びアルギニンからなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸に置換された請求項１記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
３． 下記の理化学的性質を有する請求項１記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも２０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８(２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、１０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する
４． 下記の理化学的性質を有する請求項３記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも３０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８(２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、４０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する
（３）アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号１４１〜１４７に位置するDIETLYH（D:アスパラギン酸、I:イソロイシン、E:グルタミン酸、T:スレオニン、L:ロイシン、Y:チロシン、H:ヒスチジン）配列のうち、ヒスチジンを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する。
５． 下記理化学的性質を有する請求項４記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも３０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８(２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、６０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する
（３）アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号１４１〜１４７に位置するDIETLYH（D:アスパラギン酸、I:イソロイシン、E:グルタミン酸、T:スレオニン、L:ロイシン、Y:チロシン、H:ヒスチジン）配列のうち、ヒスチジンを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する。
６． 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをアスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、アラニン、リジン、及びアルギニンのいずれかのアミノ酸に置換した請求項５記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
７． 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをアスパラギン酸に置換した請求項６記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
８． 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをグルタミン酸に置換した請求項６記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
９． 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをチロシンに置換した請求項６記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
１０． 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをアラニンに置換した請求項６記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
１１． 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをリジンに置換した請求項６記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
１２． 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをアルギニンに置換した請求項６記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
１３． ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのエキソＩ (EXOＩ) 領域のDXE配列及び該配列のEに隣接する４アミノ酸長のペプチドからなるDX1EX2X3X4H（D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、H:ヒスチジン、X1,X2,X3及びX4：任意のアミノ酸）配列において、ヒスチジンが他のアミノ酸に置換された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子。
１４． 下記の理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする請求項１３記載の遺伝子。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも２０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８(２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、１０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する
１５． 下記の理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする請求項１３記載の遺伝子。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも３０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８(２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、４０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する
（３）アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号１４１〜１４７に位置するDIETLYH（D:アスパラギン酸、I:イソロイシン、E:グルタミン酸、T:スレオニン、L:ロイシン、Y:チロシン、H:ヒスチジン）配列のうち、ヒスチジンを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する。
１６． 下記の理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする請求項１３記載の遺伝子。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも３０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８(２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、６０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する
（３）アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号１４１〜１４７に位置するDIETLYH（D:アスパラギン酸、I:イソロイシン、E:グルタミン酸、T:スレオニン、L:ロイシン、Y:チロシン、H:ヒスチジン）配列のうち、ヒスチジンを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する。
１７． 請求項１３〜１６のいずれかに記載の遺伝子を発現ベクターに挿入されてなる遺伝子組換えベクター。
１８． ベクターがpLED-MIもしくはpBluescript由来のベクターである請求項１７記載の遺伝子組換えベクター。
１９． 請求項１７又は１８に記載の遺伝子組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換した形質転換体。
２０． 宿主細胞がエシェリシア・コリ（Escherichia coli）である請求項１９記載の形質転換体。
２１． 請求項２０記載の形質転換体を培養し、培養物から耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造方法。
２２． 鋳型としてのＤＮＡ、少なくとも１種のプライマー、ｄＮＴＰ、及び請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させることにより、プライマーを伸長させてＤＮＡプライマー伸長物を合成することを含む核酸増幅ないし伸長方法。
２３． プライマーが２種のオリゴヌクレオチドであって、一方は他方のＤＮＡ伸長物に互いに相補的である請求項２２記載の核酸増幅方法。
２４． 加熱および冷却を繰り返す請求項２２記載の核酸増幅方法。
２５・ 一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ、および請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン及び緩衝液を含むことを特徴とする核酸増幅用試薬。
２６． 一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ、請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及びカリウムイオンからなる群から選ばれる少なくとも１種、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、非イオン性界面活性剤、及び緩衝液を含有することを特徴とする核酸増幅用試薬。
２７． 一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ、請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及びカリウムイオンからなる群から選ばれる少なくとも１種、ＢＳＡ、非イオン性界面活性剤、緩衝液、及び該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の少なくとも１つの活性を抑制する活性を有する抗体を含有する核酸増幅用試薬。
２８． 請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを１種以上混合されたことを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ組成物。
２９． 鋳型としてのＤＮＡ、変異導入プライマー、ｄＮＴＰ及び請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させることにより、プライマーを伸長させてＤＮＡプライマー伸長物を合成することを含む遺伝子変異導入方法。
３０．変異導入プライマー、ｄＮＴＰ、及び請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなることを特徴とする遺伝子変異導入用試薬。
【０００９】
本発明においては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの該DXEXXXHモチーフのＨをグルタミン酸やアスパラギン酸などの酸性アミノ酸に置換することにより、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下させることができる。
実際、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼＨＥ変異体(１４７番目のヒスチジンをグルタミン酸に置換)およびＨＤ変異体（１４７番目のヒスチジンをアスパラギン酸に置換）は野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに比べて３’−５’エキソヌクレアーゼ活性がそれぞれ２５％、６．２５％程度と低下した（図２）。
また、本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの該DXEXXXHモチーフのヒスチジンをグルタミン酸やアスパラギン酸などの酸性アミノ酸や、チロシンやアラニンなどの中性アミノ酸に置換することによって、特に低いコピー数のＤＮＡからのＰＣＲ増幅における効率を向上させることができる。
実際、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼＨＥ変異体(１４７番目のヒスチジンをグルタミン酸に置換)、ＨＤ変異体（１４７番目のヒスチジンをアスパラギン酸に置換）、ＨＹ変異体（１４７番目のヒスチジンをチロシンに置換）及びＨＡ変異体(１４７番目のヒスチジンをアラニンに置換）においては、ＰＣＲ効率の上昇を認めることが可能であった（図３，図４）。これら変異体のうち、特にＨＹにおいてはエキソヌクレアーゼ活性の顕著な低下は見られなかったことから（図２）、該DXEXXXHモチーフの第１４７番目のヒスチジンはエキソヌクレアーゼ活性の強弱とは独立してＰＣＲ効率を左右する役割も担っていることを示唆している。また、長いサイズのＤＮＡの増幅においては、特に酸性アミノ酸に置換したＨＥ変異体、ＨＤ変異体においてＰＣＲ効率が向上していることが確認された（図４）。
【００１０】
更に、本発明においては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ポリメラーゼの該DXEXXXHモチーフのＨをリジンやアルギニンなどの塩基性アミノ酸に置換することにより、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性及び／又はＰＣＲ時における正確性を向上させることができる。
実際、本発明の検討において得られたＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼＨＫ変異体（１４７番目のヒスチジンをリジンに置換）およびＨＲ変異体(１４７番目のヒスチジンをアルギニンに置換）においては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の顕著な上昇を確認することができた（図２）。また、両変異体ともに野生型酵素に比べてＰＣＲ時の正確性の向上を確認することが可能であった（図５）。
また、１４７番目のヒスチジンを上記以外のアミノ酸に置換することによっても新たな機能を付加することができる可能性のあることは容易に予想しうる。
【００１１】
【発明の実施態様】
本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソＩ (EXOＩ) 領域のDXE配列及び該配列のEに隣接する４アミノ酸長のペプチドからなるDX1EX2X3X4H（D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、H:ヒスチジン、X1,X2,X3及びX4：任意のアミノ酸）配列において、Ｈを他のアミノ酸に置換したことを特徴とする酵素である。当該配列をDX1EX2X3X4Hとしたときには、エキソＩ(EXOＩ)領域は、種々の報告によりその領域の幅が若干異なっているが、必ずDXE配列を含み、該領域のＣ末端はX2,X3,X4のいずれかとされている。エキソＩ(EXOＩ)領域の一部及び隣接するアミノ酸配列からなるDX1EX2X3X4H モチーフを有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはその起源を問わないが、例えば、パイロコッカス・コダカラエンシスKOD1株由来のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及びサーモコッカス・リトラリス由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどが例示される。
該DX1EX2X3X4H モチーフの具体的な配列としては「DIETLYH」を挙げることができる。この配列はパイロコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１株及び、パイロコッカス・フリオサス由来のＤＮＡポリメラーゼにおいて完全に保存されており、サーモコッカス・リトラリス由来のＤＮＡポリメラーゼにおいても「DIETFYH」であり、F以外は同様に保存されている（図１）。
また、該DX1EX2X3X4H モチーフのうち、アスパラギン酸及びグルタミン酸を故意に他のアミノ酸に置換した変異体についても本発明の効果は同様に及ぶことは容易に予想することができ、本発明の範疇に入るものであるといえる。
「他のアミノ酸」としては、特に限定されることなく、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸、チロシン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン等の中性アミノ酸、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸等を例示することができる。好ましくは、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、アラニン、リジン、アルギニンが挙げられる。
【００１２】
本発明の一実施態様としては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソＩ (EXOＩ) 領域を含有するアミノ酸配列DX1EX2X3X4H （D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、H:ヒスチジン、X1,X2,X3及びX4：任意のアミノ酸）配列のうち、Ｈをグルタミン酸やアスパラギン酸などの酸性アミノ酸に置換することにより、改変前の酵素に比べて有意に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下した耐熱性ポリメラーゼを挙げることができる。
また、本発明の一実施態様としては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソＩ(EXOＩ) 領域を含有するアミノ酸配列DX1EX2X3X4H のうち、Ｈをアスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、アラニンに置換することにより、核酸増幅能に優れるように改変した耐熱性ポリメラーゼを挙げることができる。
さらに、本発明の一実施態様としては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソＩ (EXOＩ) 領域のDXE配列及び該配列のEに隣接する４アミノ酸長のペプチドからなるDX1EX2X3X4H（D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、H:ヒスチジン、X1,X2,X3及びX4：任意のアミノ酸）配列において、Ｈをリジンやアルギニンなどの塩基性アミノ酸に置換することにより、有意に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性及び／又は正確性を上昇させた耐熱性ポリメラーゼを挙げることができる。
具体的には、本発明においては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの該DX1EX2X3X4H モチーフのＨをグルタミン酸やアスパラギン酸などの酸性アミノ酸に置換することにより、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低下させることができる。
実際、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼＨＥ変異体(１４７番目のヒスチジンをグルタミン酸に置換)およびＨＤ変異体（１４７番目のヒスチジンをアスパラギン酸に置換）は、野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに比べて３’−５’エキソヌクレアーゼ活性がそれぞれ２５％、６．２５％程度と低下した（図２）。
【００１３】
本発明の一実施態様としては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソＩ (EXOＩ) 領域のDXE配列及び該配列のEに隣接する４アミノ酸長のペプチドからなるDX1EX2X3X4H（D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、H:ヒスチジン、X1,X2,X3及びX4：任意のアミノ酸）配列のうち、Ｈを他のアミノ酸に置換した酵素であり、更に下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに関する。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも２０塩基／秒
（２）熱安定性：p Ｈ８．８(２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理で１０％以上の残存活性を保持することができる（即ち、ｐＨ８．８(２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、１０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する。）
【００１４】
また、本発明の別な実施態様としては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソＩ (EXOＩ) 領域のDXE配列及び該配列のEに隣接する４アミノ酸長のペプチドからなるDX1EX2X3X4H（D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、H:ヒスチジン、X1,X2,X3及びX4：任意のアミノ酸）配列のうち、Ｈを他のアミノ酸に置換した酵素であり、更に下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに関する。
（１）ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８ (２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理で４０％
以上の残存活性を保持することができる。
【００１５】
また、本発明の別な実施態様としては、下記性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがある。
（１）ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる
（３）至適温度：約６５〜７５℃（熱安定性測定と同じ組成下で温度を変えて測定。）
（４）分子量：８８〜９０ＫＤａ（計算値）であり、下記（５）のヒスチジン以外の部位において、糖鎖や欠失、挿入、又は１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加があってもよい。
（５）アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号１４１〜１４７に位置するＤＩＥＴＬＹＨ（Ｄ：アスパラギン酸、Ｉ：イソロイシン、Ｅ：グルタミン酸、Ｔ：スレオニン、Ｌ：ロイシン、Ｙ：チロシン、Ｈ：ヒスチジン）配列のうち、Ｈを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する。
【００１６】
また、本発明の別な実施態様としては、下記性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがある。
（１）ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８(２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる
（３）アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のアミノ酸（即ち、ヒスチジン）を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する。
【００１７】
本発明の更に具体的な例としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをグルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アラニン、リジン及びアルギニンのいずれかに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを挙げることができる。ここで、本願発明において、配列番号２に記載のアミノ酸配列とは、第１４７番目のヒスチジン残基以外のアミノ酸のうちの１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有するものも含むものである。好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有する範囲で、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、且つＤＮＡポリメラーゼ活性を有するものも含むものが挙げられる。
【００１８】
本発明において、ＤＮＡポリメラーゼ活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシヌクレオチド５’−トリホスフェートのα-ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオチド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
その活性測定法は、酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ジチオスレイトール，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０，５０％ グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記に記載のＡ液２５μl、Ｂ液５μl、Ｃ液５μl、滅菌水１０μl、及び酵素溶液５μlをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。その後氷冷し、Ｅ液５０μl、Ｄ液１００μlを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ７．５)
１６mM 塩化マグネシウム
１５mM ジチオスレイトール
１００μg/ml ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ：２μg/μl 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５mM ｄＮＴＰ(２５０cpm/pmol [３Ｈ]ｄＴＴＰ)
Ｄ：２０％ トリクロロ酢酸(２mMピロリン酸ナトリウム)
Ｅ：１mg/ml サケ精子ＤＮＡ
【００１９】
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とはＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。その活性測定は、以下の通りである。５０μlの反応液（１２０mM Tris-塩酸緩衝液(ｐＨ８．８、２５℃)、１０mM ＫＣｌ、６mM 硫酸アンモニウム、１mM ＭｇＣｌ2、０．１％Triton X-100、０．００１％ ＢＳＡ、５μgトリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５mlのマイクロチューブに分注しＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして０．１％のＢＳＡ ５０μlを加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液１００μlを加えて混合する。氷上で１５分放置した後、１２０００回転にて１０分間遠心分離し沈殿を分離する。上清１００μlの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
【００２０】
本発明において、ＤＮＡ伸長速度とは単位時間あたりのＤＮＡ合成数をいう。その測定法はＤＮＡポリメラーゼの反応液(２０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ７．５)、８mM 塩化マグネシウム、７．５mM ジチオスレイトール、１００μg/ml ＢＳＡ、０．１mM ｄＮＴＰ、０．２μCi[α-32Ｐ]ｄＣＴＰ)を、プライマーをアニーリングさせたＭ１３ｍｐ１８ 1本鎖ＤＮＡと７５℃で反応させる。反応停止は等量の反応停止液(５０mM 水酸化ナトリウム、１０mM ＥＤＴＡ、５％フィコール、０．０５％ブロモフェノールブルー)を加えることにより行う。上記反応にて合成されたＤＮＡをアルカリアガロースゲル電気泳動にて分画した後、ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行う。ＤＮＡサイズマーカーとしてはラベルされたλ/HindIIIを用いる。このマーカーのバンドを指標として合成されたＤＮＡのサイズを測定することによってＤＮＡ伸長速度を求める。
【００２１】
本発明において、熱安定性（熱処理後のＤＮＡポリメラーゼ残存活性）とはポリメラーゼ５単位を１００μｌの緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８；２５℃での測定値）、１０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、２ｍＭ 硫酸マグネシウム、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に混合し、９５℃、６時間の処理での残存活性を意味する。具体的には、上記熱処理後、上記ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定し、熱処理前の該活性と比較することによって算出する。
【００２２】
また、本発明において、ＤＮＡポリメラーゼの正確性とはＤＮＡ複製時における塩基の取り込みの正確性をいう。本発明におけるＤＮＡポリメラーゼの正確性の評価には、ストレプトマイシン耐性に関与するリボゾーマルタンパク質Ｓ１２（rpsL）遺伝子を指標として行う。ストレプトマイシンは原核細胞のタンパク質合成を阻害する抗生物質であり、細菌の３０ＳリボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に結合してタンパク質合成の開始複合体形成反応を阻害し、また遺伝子暗号の誤読を引き起こす。ストレプトマイシン耐性変異株ではリボゾームタンパク質Ｓ１２に変異が見られる。この変異はリボゾームの翻訳忠実度を上げるため、サプレッサーｔＲＮＡによる終始コドンの読み取りを抑制するなど多面的効果(pleiotropic effect）を示すことが知られている。したがって、rpsL遺伝子を鋳型としてＰＣＲにより増幅を行うと、ある確率で変異が導入され、それがアミノ酸レベルの変異であった場合、rpsLタンパク質の構造が変化し、ストレプトマイシンが３０ＳリボゾーマルＲＮＡに作用できなくなるようなことが起こる。したがって、菌を増幅したプラスミドＤＮＡによって形質転換した場合、変異が多く導入されるほどストレプトマイシン耐性菌の出現頻度が増すこととなる。
【００２３】
プラスミドpMol 21(Journal of Molecular Biology(1999)289,835-850に記載)は、rpsL遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドである。このプラスミドのアンピシリン耐性遺伝子上にＰＣＲ増幅用プライマーセット（片方をビオチン化、MluI制限酵素サイトを導入）を設計し、プラスミドの全長を耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにてＰＣＲ増幅し、ストレプトアビジンビーズを用いて精製し、制限酵素MluIを用いて切り出した後、ＤＮＡリガーゼを用いて結合して大腸菌を形質転換して、アンピシリンとアンピシリン及びストレプトマイシンを含有する２種類のプレートに接種し、それぞれのプレートに出現したコロニーの比を算出することにより遺伝子複製の正確性を求めることができる。
【００２４】
これらの改変された酵素を製造する方法としては、従来の公知の方法が使用できる。例えば、野生型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、タンパク質工学的手法により新たな機能を有する変異型ＤＮＡポリメラーゼを製造する方法がある（J. Biol. Chem., 264(11), 6447-6458(1989)）。
変異を導入するＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は特に限定されないが、例えば、パイロコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１株由来の配列表・配列番号３に記載の遺伝子が挙げられる。また同様に、パイロコッカス・フリオサス（Nucleic Acid Res., 21 (2), 259-265(1993)）、サーモコッカス・リトラリス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5577-5581(1992)）なども例示することができる。
野生型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に変異を導入する方法は既知のいかなる方法を用いてもよい。例えば、野生型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と変異原となる薬剤を接触させる方法や紫外線照射による方法などからタンパク質工学的手法、例えばＰＣＲや部位特異的変異などの方法を用いることができる。
【００２５】
本発明で使用したQuickChange site-directed mutagenesisキット（ストラタジーン製）は、（１）目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてPfu ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、（２）（１）のサイクルを１５回繰り返す、（３）例えば、制限酵素DpnIを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、（４）新たに合成されたプラスミドにより大腸菌を形質転換し、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットである。
【００２６】
上記改変ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、pLED-MIもしくはpBluescript由来のものが好ましい。
菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。 この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、宿主由来のポリメラーゼを失活させ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。個々のＤＮＡポリメラーゼ活性をそろえた後に３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性を測定し、野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較することで、各mutantの３’−５ ’エキソヌクレアーゼ活性の変化を測定することができる。
【００２７】
上記方法により選抜された菌株から精製ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＤＮＡポリメラーゼ画分を回収する。
この粗酵素液をセファデックスG-25（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、Ｑセファロース、ヘパリンセファロースなどのカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。
【００２８】
また、得られた酵素を用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、その増幅の有無もしくは強度からＰＣＲ効率の評価を行うことができ、また同じくＤＮＡ複製の正確性も評価することができる。
本発明の改変されたＤＮＡポリメラーゼは、遺伝子の増幅効率及び増幅の正確性の点で優れており、ＰＣＲに利用できる。
【００２９】
また、本発明の核酸増幅ないし伸長方法は、本発明の改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＤＮＡを鋳型とし、少なくとも１種のプライマー、ｄＮＴＰ（即ち、４種類のデオキシリボヌクレオチド３リン酸）を反応させることによりプライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成する方法を含む。該方法は、１種のプライマーを用いて、核酸を伸長する方法を含む。具体的には、プライマーエクステンション法、シークエンス法、従来の温度サイクルを行わない方法およびサイクルシーケンス法を含む。
また、本発明の方法は、２種以上のプライマーを用いてＰＣＲ法により核酸を増幅させる方法も含む。好ましくは、プライマーは２種のオリゴヌクレオチドであって、互いに一方は他方のＤＮＡ生成物に相補的であるプライマーであることが好ましい。また、加熱および冷却を繰り返すのが好ましい。
具体的には、ＰＣＲ法に基づく遺伝子増幅方法は、標的核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプライマー及び本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる標的核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である（Nature, 324 (6093), 13-19(1986)）。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各プライマーと、それぞれに相補的な一本鎖標的核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖標的核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２n倍に増幅される。
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、その活性を維持するために、例えばマグネシウムイオンのような２価のイオン、及び例えばアンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンのような１価のイオンを共存させることが好ましい。また、ＰＣＲ反応液には、緩衝液及びこれらのイオンを含むと共に、ＢＳＡ、例えばTriton X-100のような非イオン性界面活性剤、及び緩衝液が存在してもよい。緩衝剤としては、トリスやヘペスなどのグッドバッファーおよび、リン酸緩衝液などが用いられる。
本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いたときのＰＣＲの具体的一態様としては、反応緩衝液（120mM Tris-HCl(pH8.0), 10mM KCl, 6mM (NH4)2SO4, 0.1% TritonX-100, 10μg/ml BSA）,プライマー各0.4pmol/μl, dNTPs 0.2mM, 鋳型ＤＮＡ0.2ng/μl及び本発明のＤＮＡポリメラーゼ0.05u/μlを含有する溶液を９４℃；１５秒、６５℃；２秒、７４℃；３０秒の温度サイクルを２５回程度行う。
【００３０】
本発明の核酸増幅用試薬は、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ、及び上記のような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン、及び緩衝液を含み、さらに具体的には、一方のプライマーが他方のプライマーＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ及び上記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオン、ＢＳＡ、上述のような非イオン界面活性剤及び緩衝液を含む。
【００３１】
本発明の核酸増幅用試薬の別な態様としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ及び上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン、緩衝液、及び必要に応じて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を含む核酸増幅用試薬がある。該抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。本核酸増幅用試薬は、ＰＣＲの感度上昇、非特異増幅の軽減に特に有効である。
【００３２】
本発明の遺伝子変異導入用試薬は、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である変異導入プライマー、ｄＮＴＰ、及び上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む。さらに上述したような２価イオン、１価イオン、緩衝液を含んでもよい。
本発明における変異導入プライマーは、その長さが２０〜１５０塩基程度であり、共にその配列のほぼ中央あたりに変異部分、即ち、鋳型のなるＤＮＡ配列と異なる部分（例えば、挿入、欠失、置換）を含み、互いに相補的である。
本発明の遺伝子増幅用試薬及び遺伝子変異用試薬において、緩衝液としては、トリスやヘペスなどのグッドバッファーおよび、リン酸緩衝液などが用いられるが、具体的には、１０〜２００mMの各種バッファー（ｐＨ７．５〜９．０（at 25℃））が例示できる。
また、マグネシウムイオンやマンガンイオンのような２価のイオンの濃度は、反応段階で０．５〜２ｍＭ、及び例えばアンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンのような１価のイオンの濃度は、反応の段階で１０〜１００ｍＭ程度となるようなものがよい。
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、反応の段階で０．０１〜０．１単位／μｌ程度となるようなものがよい。また、プライマーの濃度は、０．２〜２pmol/μl程度である。
【００３３】
また、本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性を化学的もしくは遺伝子工学的手法を用いて減衰もしくは失活させ、様々な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、専ら３‘−５’エキソヌクレアーゼとして使用するものであってもよい。
【００３４】
また、本発明の実施態様としては、上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを１種又は２種以上混合したことを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ組成物がある。具体的には、上述のような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと別なＤＮＡポリメラーゼ、例えば３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低いＤＮＡポリメラーゼなどを混合せしめることによって、長鎖核酸を増幅する場合（例えばｌｏｎｇＰＣＲ）に有用な組成物を得ることができる。実際、長鎖核酸を増幅する方法として、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼと３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＰｆｕポリメラーゼまたはＴｉポリメラーゼまたはこれらの変異酵素を混合したＤＮＡポリメラーゼ組成物を用いて、ＰＣＲを行う方法が報告されている（Barns, W.M.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2216-2220）。
本発明においては、本発明のＤＮＡポリメラーゼとＴａｑポリメラーゼとの組み合わせや、本発明のＤＮＡポリメラーゼとＴｔｈポリメラーゼとの組み合わせや、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低い本発明のＤＮＡポリメラーゼと本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性の高い本発明のＤＮＡポリメラーゼとの見合わせが例示できる。
本発明のＤＮＡポリメラーゼ組成物に添加することができる他の成分は、該ＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制する抗体などが例示できる。
【００３５】
【実施例】
以下に、実施例を用いて本発明をより具体的に説明する。
【００３６】
参考例１ 超好熱始原菌ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング
鹿児島県子宝島において単離した超好熱始原菌パイロコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１株を９５℃にて培養後、菌体を回収した。得られた菌体から常法に従ってＫＯＤ１株の染色体ＤＮＡを調製した。パイロコッカス・フリオサス由来のＤＮＡポリメラーゼ(Pfu ＤＮＡポリメラーゼ)の保存領域アミノ酸配列に基づいて、２種のプライマー(5'-GGATTAGTATAGTGCCAATGGSSGGCGA-3' 及び5'-GAGGGCAGAAGTTTATTCCGAGCTT-3') （配列番号２６および２７、”ｓ”はＣとＧの混合物を意味する。）を合成した。この２種のプライマーを使用して調製したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
【００３７】
ＰＣＲ増幅断片の塩基配列を決定し、アミノ酸配列を決定した後、この増幅ＤＮＡをプローブとして、ＫＯＤ１株染色体ＤＮＡ制限酵素処理産物に対してサザンハイブリダイゼーションを行い、ＤＮＡポリメラーゼをコードする断片のサイズを求めた（約４〜７Kbp）。更に、この大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収し、プラスミドpBluescript（ストラタジーン製）に挿入し、これらの混合物よりエシェリシア・コリ(Escherichia coli) JM109を形質転換してライブラリーを作製した。サザンハイブリダイゼーションに使用したプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーションを行い、上記ライブラリーからＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有すると考えられるクローン株(エシェリシア・コリJM109/pBSKOD1)を取得した。
取得した上記クローン株よりプラスミド、pBSKOD1を回収し、定法に従い、塩基配列を決定した。さらに求められた塩基配列からアミノ酸配列を推定した。ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は５０１０塩基からなり、１６７０個のアミノ酸がコードされていた（配列番号１)。
【００３８】
完全なポリメラーゼ遺伝子を作製するために、２箇所の介在配列(１３７４〜２４５３bp及び２７０９〜４３１６bp）をＰＣＲ融合法により取り除いた。
このようにして得られた２種の断片を用いて再度ＰＣＲを行い、介在配列が取り除かれ、Ｎ末端側にEcoRV、Ｃ末端側にBamHIサイトを有するＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼをコードする完全な形の遺伝子断片を取得した（配列番号３）。更に、同遺伝子をＴ７プロモーターで誘導可能な発現ベクターpET-8cのNcoI/BamHIサイト、先に創出した制限酵素サイトを利用してサブクローニングを行い、組換え発現ベクター、pET-pol）を得た。なお、エシェリシア・コリ BL21(DE3)/pET-polは生命工学工業研究所へ寄託されている(FERM BP-5513)。
【００３９】
実施例１
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを改変するために、プラスミドpET-polからＫＯＤポリメラーゼ遺伝子を切り出し、pBluescriptにサブクローニングを行った。すなわち、pET-polを制限酵素XbaIとBamHI（東洋紡績製）にて切断し、約２．３kbのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を切り出した。次にこのＤＮＡ断片をライゲーションキット(東洋紡績製 Ligation high）を用いて、XbaIとBamHIで切断したプラスミドpBluescript SK(-)と連結し、コンピテントセル（東洋紡績製 competent high JM109）を形質転換した。１００μg/mlのアンピシリンを含んだＬＢ寒天培地(１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、１．５％寒天；ギブコ製）で３５℃、１６時間培養し、得られたコロニーからプラスミドを調製した。更に、部分塩基配列を確認してＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミドpKOD1を得た。
【００４０】
実施例２ 改変型遺伝子(ＨＥ）の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例１で得られたプラスミドpKOD1を用いてＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４７番目のヒスチジンをグルタミン酸に置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をもつプラスミドを作製した(pKOD HE)。該プラスミドの作製はQuickChange site directed mutagenesis kit（ストラタジーン製）を用いた。方法は取扱い説明書に準じて行った。変異作製用プライマーとしては、配列番号４及び５に記載されるプライマーを使用した。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリJM109を形質転換し、エシェリシア・コリJM109(pKOD HE)を得た。
【００４１】
得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μg/mlのアンピシリンを含有するＴＢ培地(Molecular cloning 2nd edition、p.A.2）６Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに分注した。この培地に予め１００μg/mlのアンピシリンを含有する５０mlのＬＢ培地(１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリJM109(pKOD HE）(５００ml坂口フラスコ使用）を接種し、３５℃にて１２時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、４００mlの破砕緩衝液(１０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ８．０)、８０mM ＫＣｌ、５mM ２−メルカプトエタノール、１mM ＥＤＴＡ）に懸濁後、フレンチプレス処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８５℃にて３０分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液(５０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ８．０)、５０mM 塩化カリウム、１mM ジチオスレイトール、０．１％ Tween20、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、変異型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＨＥ)を得た。上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は以下の操作で行った。また、酵素活性が高い場合はサンプルを希釈して測定を行った。
【００４２】
【００４３】
（方法）
Ａ液２５μl、Ｂ液５μl、Ｃ液５μl及び滅菌水１０μlをマイクロチューブに加えて攪拌混合後、上記精製酵素希釈液５μlを加えて７５℃で１０分間反応する。その後冷却し、Ｅ液５０μl、Ｄ液１００μlを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）を用いて計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分当り１０nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
【００４４】
実施例３ 変異体(ＨＤ)遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例2と同様の方法にて、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４７番目のヒスチジンをアスパラギン酸に置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した(pKOD HD)。変異プライマーとしては、配列番号６及び７に記載されるプライマーを使用した。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＨＤ)を得た。
【００４５】
実施例４ 変異体(ＨＹ)遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にて、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４７番目のヒスチジンをチロシンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した(pKOD HY)。変異プライマーとしては、配列番号８及び９に記載されるプライマーを使用した。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＨＹ)を得た。
【００４６】
実施例５ 変異体(ＨＡ)遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にて、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４７番目のヒスチジンをアラニンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した(pKOD HA)。変異プライマーとしては、配列番号１０及び１１に記載されるプライマーを使用した。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＨＡ)を得た。
【００４７】
実施例６ 変異体(ＨＫ)遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にて、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４７番目のヒスチジンをリジンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した(pKODHK)。変異プライマーとしては、配列番号１２及び１３に記載されるプライマーを使用した。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＨＫ)を得た。
【００４８】
実施例７ 変異体(ＨＲ)遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にて、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４７番目のヒスチジンをアルギニンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した(pKOD HR)。変異プライマーとしては、配列番号１４及び１５に記載されるプライマーを使用した。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＨＲ)を得た。
【００４９】
実施例８ 変異体(ＨＳ)遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にて、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４７番目のヒスチジンをセリンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した(pKODHS)。変異プライマーとしては、配列番号１６及び１７に記載されるプライマーを使用した。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＨＳ)を得た。
【００５０】
実施例９ 変異体(ＨＱ)遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にて、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４７番目のヒスチジンをグルタミンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した(pKOD HQ)。変異プライマーとしては、配列番号１８及び１９に記載されるプライマーを使用した。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＨＱ)を得た。
【００５１】
実施例１０
上記実施例２〜９で得られた改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに加え、ＩＫ及びＩＱのエキソヌクレアーゼ活性を以下の方法にて測定した。変異体ＩＫ、ＩＱは特開平１０−４２８７１号公報に記載されるＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４２番目のイソロイシンをリジンおよびグルタミンに置換した変異体であり、特開平１０−４２８７１号公報に記載の方法に準じて作製した。対照として、野生型ＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡績製）を用いた。５０μlの反応液（１２０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ８．８ 、２５℃)、１０mM ＫＣｌ、６mM 硫酸アンモニウム、１mM ＭｇＣｌ2、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ ＢＳＡ、５μgトリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５mlのマイクロチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼをそれぞれ０．０６Ｕ、０．０２５Ｕを加え、７５℃にて１０分間反応させた。氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして０．１％のＢＳＡ５０μlを加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μl加えて混合した。その後氷上で１５分放置した後、１２０００回転にて１０分間遠心分離し沈殿を分離し、上清１００μlの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定した。個々の３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性の比較は、０．０６および０．０２５ポリメラーゼＵｎｉｔを用いたときの上記の放射活性値をもとに行った。図２に各ＤＮＡポリメラーゼの相対エキソヌクレアーゼ活性を示した。
【００５２】
本実施例から、本発明によれば、様々な強さのエキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが得られることが証明された。得られた変異型ＫＯＤポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、野生型のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ(１００％)に対して、ＨＤは約６．２５％、ＨＥは約２５％、ＨＹは約９０％、ＨＡは約３０％、ＨＳは約５０％、ＨＱは約５０％、ＨＫは約４００％、ＨＲは約３００％、ＩＫは約６．２５％、ＩＱは約２５％の活性を有していた。
【００５３】
実施例１１
熱安定性の確認
実施例２、３及び６で得られた改変型ＤＮＡポリメラーゼの熱安定性を以下の方法にて測定した。各ＤＮＡポリメラーゼ５単位を１００μｌの緩衝液（20mM Tris-HCl pH8.8 at 25℃、10mM塩化カリウム，10mM 硫酸アンモニウム，2mM 硫酸マグネシウム, 0.1% Triton X-100, 0.1mg/ml BSA, 5mM 2- メルカプトエタノール）に混合し、９５℃でプレインキュベートとした。この混合液から経時的に試料を採取し、実施例２記載の方法にてポリメラーゼ活性を測定した。比較として、天然型ＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡製）も同様の操作を行った。表１に示すように、いずれの改変型ポリメラーゼも天然型ＫＯＤポリメラーゼと同様に、９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を示した。
【００５４】
【表１】
【００５５】
実施例１２
ＤＮＡ伸長速度測定
実施例２、３、６および７で得られた改変型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ伸長速度を以下の方法で測定した。精製した改変型ＤＮＡポリメラーゼ１単位を１０μｌの反応液(20mM Tris-HCl(pH7.5), 8mM塩化マグネシウム, 7.5mM ジチオスレイトール, 100 μg/ml BSA, 0.1mM dNTP, 0.2 μCi [α-32P]dCTP)で０．２μｇの配列番号１５のプライマーをアニーリングさせたＭ１３ｍｐ１８１本鎖ＤＮＡと７５℃で２０秒、４０秒、６０秒間反応させた。反応停止は等量の反応停止液（50mM 水酸化ナトリウム，10mM EDTA, 5% フィコール, 0.05% ブロモフェノールブルー) を加えることにより行った。比較としてＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン社製）および天然型のＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡製）も同様の操作を行った。
上記反応にて合成されたＤＮＡをアルカリアガロースゲル電気泳動にて分画した後、ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行った。ＤＮＡサイズマーカーとしてはラベルしたλ/HindIIIを用いた。このマーカーのバンドを指標として合成されたＤＮＡのサイズを測定することによって、ＤＮＡ合成速度を求めた。その結果を表２に示す。いずれの改変型ポリメラーゼも天然型のＫＯＤポリメラーゼと同様に、約１２０塩基／秒の合成速度を有していた。それに対してＰｆｕポリメラーゼは約２０塩基／秒の合成速度であった。
【００５６】
【表２】
【００５７】
本実施例から、本発明によれば、様々な強さのエキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが得られることが証明された。得られた変異型ＫＯＤポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、野生型のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ(１００％)に対して、ＨＤは約６．２５％、ＨＥは約２５％、ＨＹは約９０％、ＨＡは約６５％、ＨＳは約５０％、ＨＱは約５０％、ＨＫは約４００％、ＨＲは約３００％、ＩＫは約６．２５％、ＩＱは約２５％の活性を有していた。
【００５８】
実施例１３ 改変型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ例（１）
野生型(ＷＴ)ＫＯＤポリメラーゼ、並びに改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＨＥ、ＨＤ、ＨＹ、ＨＡ、ＨＫ、ＨＲ、ＩＫ及びＩＱを用いてＰＣＲを行った。変異体ＩＫ、ＩＱは、それぞれ特開平１０−４２８７１号公報に記載のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼにおける第１４２番目のイソロイシンをリジン及びグルタミンに置換した変異体である。ＨＥとＩＱ、 ＨＤとＩＫは、それぞれ同程度の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示すことが分かっている。ＰＣＲは４９μlの反応液（１×KOD-Plus-buffer(東洋紡績製）、１mM ＭｇＳＯ4、０．２mM ｄＮＴＰ、１００ng 及び１０ngのＫ５６２ ＤＮＡ（ライフテクノロジー社製）、１０pmolの配列表２０及び２１に記載のプライマー）に各酵素(１Ｕ/μl)を１μlを加えてＰＣＲを実施した。サーマルサイクラーはPerkin-Elmer社 PCR system GeneAmp2400を用いて、以下のように行った。すなわち、９４℃、２分反応を行った後、９４℃、１５秒→６０℃、３０秒→６８℃、３分３０秒を３０サイクル行った。反応終了後１０μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約３．６kbの増幅ＤＮＡ断片を確認した。図３にアガロースゲル電気泳動の写真を示した。この結果より、変異体ＨＥ、ＨＤ、ＨＹ、ＨＡを用いた場合、特に低いコピー数の鋳型ＤＮＡ(１０ng)からの増幅において、野生型のＫＯＤポリメラーゼを用いるよりも良好な増幅を示すことが証明された。
【００５９】
実施例１４ 改変型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ例（２）
実施例１で良好な結果の得られた改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＨＥ、ＨＤ、ＨＹ、ＨＡについて更にサイズの大きな遺伝子の増幅を試みた。４９μlの反応液（1×KOD -Plus- buffer(東洋紡績製）、１mM ＭｇＳＯ4、０．２mM ｄＮＴＰ、１００ng 及び５０ng Ｋ５６２ ＤＮＡ（ライフテクノロジー製）、１０pmolの配列番号２２及び２３に記載のプライマー）に各酵素(１Ｕ/μl)を１μl加えてＰＣＲを実施した。サーマルサイクラーはPerkin-Elmer製PCR system GeneAmp2400を用いて以下のように行った。すなわち、９４℃、２分反応を行った後、９４℃、１５秒→６０℃、３０秒→６８℃、６分を３０サイクル行った。反応終了後、１０μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色して紫外線照射下約６．２kbの増幅断片を確認した。その結果、特にＨＤ及びＨＥにおいて良好な増幅を確認することができた（図４）。なお、ここには示していないが、野生型(ＷＴ)ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼにおいては増幅は全く確認することができなかった。
【００６０】
実施例１５ 改変型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの正確性の測定
野生型のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼについて正確性を以下の方法にて測定した。４９μlの反応液（1×KOD-Plus-buffer(東洋紡績製）、１mM ＭｇＳＯ4、０．２mM ｄＮＴＰ、２．５ng プラスミドpMol 21(Journal of Molecular Biology(1999)289,835-850）、１０pmolの配列番号２４及び２５に記載のプライマー）に酵素(１Ｕ/μl)を１μl加えてＰＣＲを実施した。ここでは、今回取得した変異体のうちＨＤ、ＨＥ、ＨＹ、ＨＡ、ＨＫ、ＨＲ、及び特開平１０−４２８７１号公報記載のＩＫ、ＩＱを用いて実施した。サーマルサイクラーはPerkin-Elmer製 PCR system GeneAmp2400を用いて以下のように行った。すなわち、９４℃、２分行った後、９４℃、１５秒→６０℃、３０秒→６８℃、４分を２５サイクル行った。また、同時にrTaq ＤＮＡポリメラーゼについても増幅反応を実施した。反応条件としては、４９μlの反応液（１×rTaq buffer(東洋紡績製）、１．５mM ＭｇＣｌ2、０．２mM ｄＮＴＰ、２．５ng プラスミドpMol 21(Journal of Molecular Biology(1999)289,835-850）、１０pmolの配列番号２４及び２５に記載のプライマー）に各酵素(５Ｕ/μl)を０．５μl添加して、９４℃、２分反応を行った後、９４℃、１５秒→６０℃、３０秒→６８℃、５分を２５サイクル行った。
【００６１】
ＰＣＲ終了後フェノール／クロロホルム処理し、次いでエタノール沈澱法によりＤＮＡを沈澱させた。沈澱を１００μlの蒸留水に溶解し、アビジン磁性ビーズ（DYNAL製）を１０μl添加して３０分間転倒混和し、磁性分離用スタンド（Magical Trapper；東洋紡績製）を用いて磁性ビーズを濃縮した。続いて、磁性ビーズに１００μlの洗浄液Ａ(１０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ８．０),１mM ＥＤＴＡ)、１Ｍ ＮａＣｌ）を添加して１０秒間攪拌し、再び磁性分離用スタンドにて濃縮した（洗浄）。上記洗浄工程をもう一度繰り返した後、洗浄液Ｂ(１０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ８．０),１mM ＥＤＴＡ)）を用いて磁性ビーズを洗浄し、磁性分離用スタンドにて磁性ビーズのみを回収した。次いで、この回収した磁性ビーズに蒸留水４０μl、制限酵素緩衝液５μl及び制限酵素Mlu I（東洋紡績製）５０Ｕを添加し、３７℃にて転倒混和しながら３時間処理した。その後、再び磁性分離用スタンドを用いて磁性ビーズを濃縮し、その上清のみを回収した。回収したＤＮＡ溶液をエタノール沈澱法にて脱塩を行い、そのうちの１０ng相当をライゲーション試薬(Ligation high（東洋紡績製）を添加し、１６℃で１６時間ライゲーション反応を行った。次に、Molecular cloning 2nd edition 1.74〜1.81に記載される方法により調製したエシェリシア・コリMF-101株(Journal of Molecular Biology(1999)289,835-850）のコンピテントセルを用いて形質転換を行った。
【００６２】
形質転換を行った大腸菌溶液を２つにに分割し、一方を２００μg/mlのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地(０．６％)＜Ａプレート＞に、もう片一方を２００μg/mlのアンピシリンおよび４００μg/mlのストレプトマイシンを含有するＬＢ寒天培地(０．６％)＜Ｂプレート＞で３０℃で２４時間培養し、出現したコロニー数を計測し、Ｂプレートに出現したコロニーをＡプレートに出現したコロニーで割り、パーセント表示した値を変異率(Mutation frequency）とした。この変異率が低いほど、ＤＮＡ複製時のＤＮＡポリメラーゼの正確性が良いことを示している。
【００６３】
結果を、図５に示した。rTaqは３’−５’エキソヌクレアーゼ（Proof readign）活性を有さないため、７．９１％という高い変異率を示したのに対し、ＷＴ及び今回得られた変異体においては、変異率が全て１％以下であった。また、その中でもＷＴに対して３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の高進していたＨＫ、ＨＲにおいてはそれぞれ変異率が０．１２％、０．１７％とＷＴ０．４７％に対して明らかに良好な値を示すことが証明された。
【００６４】
【発明の効果】
上述したように、本発明により、様々なＤＮＡ増幅効率及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および正確性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作製が可能となった。この方法を用いることにより、従来の始原菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを様々な用途、すなわち長い領域の増幅や、更に正確性の高い増幅など様々な用途に使用できるように、改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを創出することが可能とするものである。
【００６５】
【配列表】
【００６６】
【００６７】
【００６８】
【００６９】
【００７０】
【００７１】
【００７２】
【００７３】
【００７４】
【００７５】
【００７６】
【００７７】
【００７８】
【００７９】
【００８０】
【００８１】
【００８２】
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【図面の簡単な説明】
【図１】様々なＤＮＡポリメラーゼのエキソＩ領域（下線）及びそれに隣接するアミノ酸配列を示す図である。
【図２】各ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体の相対３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す図（ＷＴの活性を１００とした）である。
【図３】各ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体のヒトゲノムＤＮＡを鋳型としたβ-globin遺伝子(３．６kb)のＰＣＲによる増幅を示す図である。
Ａ:１００ngのヒト細胞株Ｋ５６２由来ＤＮＡを反応に使用
Ｂ:１０ngのヒト細胞株Ｋ５６２由来ＤＮＡを反応に使用
１: ＷＴ ２:ＨＤ ３:ＨＥ ４:ＨＹ ５:ＨＡ ６:ＨＫ ７:ＨＲ ８:ＩＫ ９:ＩＱ
【図４】各ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体のヒトゲノムＤＮＡを鋳型としたMyosinheavey chain遺伝子(６．２kb）のＰＣＲによる増幅を示す図である。
５０ngのヒト細胞株Ｋ５６２より抽出したＤＮＡを使用
１:ＨＤ、 ２:ＨＥ、３:ＨＹ、４:ＨＡ
【図５】各ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体のＰＣＲ増幅における変異率（Mutationfrequency）を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ）における増幅効率及び／又は正確性の向上した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びその製法に関する。更には、該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の増幅方法、並びに該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有する試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ＰＣＲは生化学、分子生物学および臨床病理分野における研究、検査において必須の技術の一つとなっている。ＰＣＲの特徴は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いるところにあり、現在最も頻繁に利用されているＤＮＡポリメラーゼは主として、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNA polymerase）やサーマス・サーモティカス(Thermus thermophilus)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(Tth DNA polymerase)などのPolＩ型と呼ばれる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。PolＩ型ＤＮＡポリメラーゼの特徴は、増幅効率が良く、条件設定が容易であるところにある。しかしながら、該酵素には、増幅の際に核酸の取り込みの正確性(fidelity)が悪いという問題があり、増幅された遺伝子をクローニングするような場合には適していないとされている。
【０００３】
一方、超好熱始原菌由来のα型と呼ばれるＤＮＡポリメラーゼ、例えばパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(Pfu ＤＮＡポリメラーゼ；ＷＯ９２／９６８９号公報、特開平５−３２８９６９号公報)、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｉ(Vent)ポリメラーゼ、特開平６−７１６０号公報）、パイロコッカス・コダカラエンシス (Pyrococcus kodakaraensis) ＫＯＤ１（旧名：Pyrococcus sp. KOD1）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ；特開平７−２９８８７９号公報)なども知られている。また、最近の報告でパイロコッカス・コダカラエンシスはサーモコッカス属に分類されることがある。これら、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性(Proof reading活性)を有し、核酸の取り込み際の正確性は、Taq ＤＮＡポリメラーゼなどのpolI型ＤＮＡポリメラーゼに比べて優れているという特徴を有する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅においては、その増幅効率が十分でないなどの問題が存在している。また、これらα型ＤＮＡポリメラーゼには、ＰＣＲの反応時間、酵素量及びプライマー濃度等の至適条件の幅が狭いものが多い。
α型ＤＮＡポリメラーゼにおけるＰＣＲ増幅における上記問題点の原因として、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の強さが関与していることが考えられる。すなわち、ＰＣＲ時にプライマーなどがその３’−５’エキソヌクレアーゼ活性によって削られることにより、ＰＣＲにおける増幅効率が低下すると考えられている。また、α型ＤＮＡポリメラーゼは単一タンパク質内に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す領域と、ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す領域が存在するため、両活性はお互いに相互作用しており、それぞれの領域の核酸への親和性などの違いなどもＰＣＲ増幅に影響を及ぼしていると考えられる。
【０００５】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の発現を担っているＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中には、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性発現に関与していると思われる高度に保存されたアミノ酸領域（EXOI（図１）, EXOII, EXOIII）が存在していることが知られている（Gene, 100, 27-38 (1991), Gene, 112, 139-144 (1992)）。EXO I領域にはXDXEXモチーフ(D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、X:任意のアミノ酸)が存在し、アスパラギン酸とグルタミン酸はエキソヌクレアーゼ活性の発現に必須であることが知られている（Kongら(1993)、Journal of Biological Chemistry, vol. 268,1965-1975）。これらのアミノ酸配列におけるアスパラギン酸とグルタミン酸を中性のアミノ酸であるアラニンに置換することによって、エキソヌクレアーゼ活性を欠失または１万分の１以下に低減できることが報告されている（Kongら(1993)、Journal of Biological Chemistry, vol. 268,1965-1975）。しかしながら、エキソヌクレアーゼ活性を欠失又は1万分の1以下に低減させることにより、α型ＤＮＡポリメラーゼの特徴であるＤＮＡ複製時の正確性も同時に失われるという問題が存在した。
【０００６】
さらに、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼにおける上記XDXEXモチーフのXで示されるアミノ酸を任意のアミノ酸に置換することにより、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を段階的に減衰させる試みも行われている（特開平１０−４２８７１号公報）。この方法によると、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低下するにつれてＰＣＲ効率の上昇と増幅における正確性(fidelity)の低下が同時に観察される。したがって、この部分を置換する場合には正確性が損なわれない程度に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下した改変体酵素を作製することが重要となる。しかしながら、この方法によって得られた酵素、例えばＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの５’末端から第１４２番目のイソロイシンをグルタミンに置換した変異体(ＩＱ)や、リジンに置換した変異体(ＩＫ)は、必ずしもコピー数の低いＤＮＡからの増幅率が必ずしも良いとは言えず、優れたＰＣＲ効率を有する変異体とはいえなかった（図３）。
また特開平１０−４２８７１号公報によれば、この方法を用いる限りにおいて３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（proof reading活性）の上昇した変異体を得ることは困難である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは本課題を解決するためＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの種々の変異体を作製し、鋭意検討を重ねた結果、EXOI領域中のXDXEXモチーフのグルタミン酸から数えて４つ目のヒスチジン残基（１４７番目；以下、Ｈとも示す)を種々のアミノ酸に置換することにより、様々な強さの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性、ＰＣＲ効率及び正確性を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの取得が可能であることを見出し、本発明に到達した（以下、このヒスチジンを含むモチーフをDXEXXXHモチーフと呼ぶ。DX1EX2X3X4Hモチ-フ、および配列DX1EX2X3X4Hなどの表記も同義である。）。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
１． ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのエキソＩ (EXOＩ) 領域のDXE配列及び該配列のEに隣接する４アミノ酸長のペプチドからなるDX1EX2X3X4H（D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、H:ヒスチジン、X1,X2,X3及びX4：任意のアミノ酸）配列において、ヒスチジンが他のアミノ酸に置換された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
２． DX1EX2X3X4H 配列中のヒスチジンがアスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、アラニン、リジン、及びアルギニンからなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸に置換された請求項１記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
３． 下記の理化学的性質を有する請求項１記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも２０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８(２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、１０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する
４． 下記の理化学的性質を有する請求項３記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも３０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８(２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、４０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する
（３）アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号１４１〜１４７に位置するDIETLYH（D:アスパラギン酸、I:イソロイシン、E:グルタミン酸、T:スレオニン、L:ロイシン、Y:チロシン、H:ヒスチジン）配列のうち、ヒスチジンを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する。
５． 下記理化学的性質を有する請求項４記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも３０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８(２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、６０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する
（３）アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号１４１〜１４７に位置するDIETLYH（D:アスパラギン酸、I:イソロイシン、E:グルタミン酸、T:スレオニン、L:ロイシン、Y:チロシン、H:ヒスチジン）配列のうち、ヒスチジンを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する。
６． 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをアスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、アラニン、リジン、及びアルギニンのいずれかのアミノ酸に置換した請求項５記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
７． 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをアスパラギン酸に置換した請求項６記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
８． 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをグルタミン酸に置換した請求項６記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
９． 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをチロシンに置換した請求項６記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
１０． 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをアラニンに置換した請求項６記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
１１． 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをリジンに置換した請求項６記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
１２． 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをアルギニンに置換した請求項６記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
１３． ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのエキソＩ (EXOＩ) 領域のDXE配列及び該配列のEに隣接する４アミノ酸長のペプチドからなるDX1EX2X3X4H（D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、H:ヒスチジン、X1,X2,X3及びX4：任意のアミノ酸）配列において、ヒスチジンが他のアミノ酸に置換された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子。
１４． 下記の理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする請求項１３記載の遺伝子。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも２０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８(２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、１０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する
１５． 下記の理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする請求項１３記載の遺伝子。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも３０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８(２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、４０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する
（３）アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号１４１〜１４７に位置するDIETLYH（D:アスパラギン酸、I:イソロイシン、E:グルタミン酸、T:スレオニン、L:ロイシン、Y:チロシン、H:ヒスチジン）配列のうち、ヒスチジンを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する。
１６． 下記の理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする請求項１３記載の遺伝子。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも３０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８(２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、６０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する
（３）アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号１４１〜１４７に位置するDIETLYH（D:アスパラギン酸、I:イソロイシン、E:グルタミン酸、T:スレオニン、L:ロイシン、Y:チロシン、H:ヒスチジン）配列のうち、ヒスチジンを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する。
１７． 請求項１３〜１６のいずれかに記載の遺伝子を発現ベクターに挿入されてなる遺伝子組換えベクター。
１８． ベクターがpLED-MIもしくはpBluescript由来のベクターである請求項１７記載の遺伝子組換えベクター。
１９． 請求項１７又は１８に記載の遺伝子組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換した形質転換体。
２０． 宿主細胞がエシェリシア・コリ（Escherichia coli）である請求項１９記載の形質転換体。
２１． 請求項２０記載の形質転換体を培養し、培養物から耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造方法。
２２． 鋳型としてのＤＮＡ、少なくとも１種のプライマー、ｄＮＴＰ、及び請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させることにより、プライマーを伸長させてＤＮＡプライマー伸長物を合成することを含む核酸増幅ないし伸長方法。
２３． プライマーが２種のオリゴヌクレオチドであって、一方は他方のＤＮＡ伸長物に互いに相補的である請求項２２記載の核酸増幅方法。
２４． 加熱および冷却を繰り返す請求項２２記載の核酸増幅方法。
２５・ 一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ、および請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン及び緩衝液を含むことを特徴とする核酸増幅用試薬。
２６． 一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ、請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及びカリウムイオンからなる群から選ばれる少なくとも１種、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、非イオン性界面活性剤、及び緩衝液を含有することを特徴とする核酸増幅用試薬。
２７． 一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ、請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及びカリウムイオンからなる群から選ばれる少なくとも１種、ＢＳＡ、非イオン性界面活性剤、緩衝液、及び該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の少なくとも１つの活性を抑制する活性を有する抗体を含有する核酸増幅用試薬。
２８． 請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを１種以上混合されたことを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ組成物。
２９． 鋳型としてのＤＮＡ、変異導入プライマー、ｄＮＴＰ及び請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させることにより、プライマーを伸長させてＤＮＡプライマー伸長物を合成することを含む遺伝子変異導入方法。
３０．変異導入プライマー、ｄＮＴＰ、及び請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなることを特徴とする遺伝子変異導入用試薬。
【０００９】
本発明においては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの該DXEXXXHモチーフのＨをグルタミン酸やアスパラギン酸などの酸性アミノ酸に置換することにより、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下させることができる。
実際、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼＨＥ変異体(１４７番目のヒスチジンをグルタミン酸に置換)およびＨＤ変異体（１４７番目のヒスチジンをアスパラギン酸に置換）は野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに比べて３’−５’エキソヌクレアーゼ活性がそれぞれ２５％、６．２５％程度と低下した（図２）。
また、本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの該DXEXXXHモチーフのヒスチジンをグルタミン酸やアスパラギン酸などの酸性アミノ酸や、チロシンやアラニンなどの中性アミノ酸に置換することによって、特に低いコピー数のＤＮＡからのＰＣＲ増幅における効率を向上させることができる。
実際、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼＨＥ変異体(１４７番目のヒスチジンをグルタミン酸に置換)、ＨＤ変異体（１４７番目のヒスチジンをアスパラギン酸に置換）、ＨＹ変異体（１４７番目のヒスチジンをチロシンに置換）及びＨＡ変異体(１４７番目のヒスチジンをアラニンに置換）においては、ＰＣＲ効率の上昇を認めることが可能であった（図３，図４）。これら変異体のうち、特にＨＹにおいてはエキソヌクレアーゼ活性の顕著な低下は見られなかったことから（図２）、該DXEXXXHモチーフの第１４７番目のヒスチジンはエキソヌクレアーゼ活性の強弱とは独立してＰＣＲ効率を左右する役割も担っていることを示唆している。また、長いサイズのＤＮＡの増幅においては、特に酸性アミノ酸に置換したＨＥ変異体、ＨＤ変異体においてＰＣＲ効率が向上していることが確認された（図４）。
【００１０】
更に、本発明においては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ポリメラーゼの該DXEXXXHモチーフのＨをリジンやアルギニンなどの塩基性アミノ酸に置換することにより、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性及び／又はＰＣＲ時における正確性を向上させることができる。
実際、本発明の検討において得られたＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼＨＫ変異体（１４７番目のヒスチジンをリジンに置換）およびＨＲ変異体(１４７番目のヒスチジンをアルギニンに置換）においては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の顕著な上昇を確認することができた（図２）。また、両変異体ともに野生型酵素に比べてＰＣＲ時の正確性の向上を確認することが可能であった（図５）。
また、１４７番目のヒスチジンを上記以外のアミノ酸に置換することによっても新たな機能を付加することができる可能性のあることは容易に予想しうる。
【００１１】
【発明の実施態様】
本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソＩ (EXOＩ) 領域のDXE配列及び該配列のEに隣接する４アミノ酸長のペプチドからなるDX1EX2X3X4H（D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、H:ヒスチジン、X1,X2,X3及びX4：任意のアミノ酸）配列において、Ｈを他のアミノ酸に置換したことを特徴とする酵素である。当該配列をDX1EX2X3X4Hとしたときには、エキソＩ(EXOＩ)領域は、種々の報告によりその領域の幅が若干異なっているが、必ずDXE配列を含み、該領域のＣ末端はX2,X3,X4のいずれかとされている。エキソＩ(EXOＩ)領域の一部及び隣接するアミノ酸配列からなるDX1EX2X3X4H モチーフを有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはその起源を問わないが、例えば、パイロコッカス・コダカラエンシスKOD1株由来のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及びサーモコッカス・リトラリス由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどが例示される。
該DX1EX2X3X4H モチーフの具体的な配列としては「DIETLYH」を挙げることができる。この配列はパイロコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１株及び、パイロコッカス・フリオサス由来のＤＮＡポリメラーゼにおいて完全に保存されており、サーモコッカス・リトラリス由来のＤＮＡポリメラーゼにおいても「DIETFYH」であり、F以外は同様に保存されている（図１）。
また、該DX1EX2X3X4H モチーフのうち、アスパラギン酸及びグルタミン酸を故意に他のアミノ酸に置換した変異体についても本発明の効果は同様に及ぶことは容易に予想することができ、本発明の範疇に入るものであるといえる。
「他のアミノ酸」としては、特に限定されることなく、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸、チロシン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、システイン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン等の中性アミノ酸、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸等を例示することができる。好ましくは、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、アラニン、リジン、アルギニンが挙げられる。
【００１２】
本発明の一実施態様としては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソＩ (EXOＩ) 領域を含有するアミノ酸配列DX1EX2X3X4H （D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、H:ヒスチジン、X1,X2,X3及びX4：任意のアミノ酸）配列のうち、Ｈをグルタミン酸やアスパラギン酸などの酸性アミノ酸に置換することにより、改変前の酵素に比べて有意に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下した耐熱性ポリメラーゼを挙げることができる。
また、本発明の一実施態様としては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソＩ(EXOＩ) 領域を含有するアミノ酸配列DX1EX2X3X4H のうち、Ｈをアスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、アラニンに置換することにより、核酸増幅能に優れるように改変した耐熱性ポリメラーゼを挙げることができる。
さらに、本発明の一実施態様としては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソＩ (EXOＩ) 領域のDXE配列及び該配列のEに隣接する４アミノ酸長のペプチドからなるDX1EX2X3X4H（D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、H:ヒスチジン、X1,X2,X3及びX4：任意のアミノ酸）配列において、Ｈをリジンやアルギニンなどの塩基性アミノ酸に置換することにより、有意に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性及び／又は正確性を上昇させた耐熱性ポリメラーゼを挙げることができる。
具体的には、本発明においては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの該DX1EX2X3X4H モチーフのＨをグルタミン酸やアスパラギン酸などの酸性アミノ酸に置換することにより、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低下させることができる。
実際、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼＨＥ変異体(１４７番目のヒスチジンをグルタミン酸に置換)およびＨＤ変異体（１４７番目のヒスチジンをアスパラギン酸に置換）は、野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに比べて３’−５’エキソヌクレアーゼ活性がそれぞれ２５％、６．２５％程度と低下した（図２）。
【００１３】
本発明の一実施態様としては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソＩ (EXOＩ) 領域のDXE配列及び該配列のEに隣接する４アミノ酸長のペプチドからなるDX1EX2X3X4H（D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、H:ヒスチジン、X1,X2,X3及びX4：任意のアミノ酸）配列のうち、Ｈを他のアミノ酸に置換した酵素であり、更に下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに関する。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも２０塩基／秒
（２）熱安定性：p Ｈ８．８(２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理で１０％以上の残存活性を保持することができる（即ち、ｐＨ８．８(２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、１０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する。）
【００１４】
また、本発明の別な実施態様としては、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、エキソＩ (EXOＩ) 領域のDXE配列及び該配列のEに隣接する４アミノ酸長のペプチドからなるDX1EX2X3X4H（D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、H:ヒスチジン、X1,X2,X3及びX4：任意のアミノ酸）配列のうち、Ｈを他のアミノ酸に置換した酵素であり、更に下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに関する。
（１）ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８ (２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理で４０％
以上の残存活性を保持することができる。
【００１５】
また、本発明の別な実施態様としては、下記性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがある。
（１）ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる
（３）至適温度：約６５〜７５℃（熱安定性測定と同じ組成下で温度を変えて測定。）
（４）分子量：８８〜９０ＫＤａ（計算値）であり、下記（５）のヒスチジン以外の部位において、糖鎖や欠失、挿入、又は１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加があってもよい。
（５）アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号１４１〜１４７に位置するＤＩＥＴＬＹＨ（Ｄ：アスパラギン酸、Ｉ：イソロイシン、Ｅ：グルタミン酸、Ｔ：スレオニン、Ｌ：ロイシン、Ｙ：チロシン、Ｈ：ヒスチジン）配列のうち、Ｈを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する。
【００１６】
また、本発明の別な実施態様としては、下記性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがある。
（１）ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８(２５℃での測定値)にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる
（３）アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のアミノ酸（即ち、ヒスチジン）を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する。
【００１７】
本発明の更に具体的な例としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをグルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アラニン、リジン及びアルギニンのいずれかに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを挙げることができる。ここで、本願発明において、配列番号２に記載のアミノ酸配列とは、第１４７番目のヒスチジン残基以外のアミノ酸のうちの１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有するものも含むものである。好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有する範囲で、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、且つＤＮＡポリメラーゼ活性を有するものも含むものが挙げられる。
【００１８】
本発明において、ＤＮＡポリメラーゼ活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシヌクレオチド５’−トリホスフェートのα-ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオチド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
その活性測定法は、酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ジチオスレイトール，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０，５０％ グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記に記載のＡ液２５μl、Ｂ液５μl、Ｃ液５μl、滅菌水１０μl、及び酵素溶液５μlをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。その後氷冷し、Ｅ液５０μl、Ｄ液１００μlを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ７．５)
１６mM 塩化マグネシウム
１５mM ジチオスレイトール
１００μg/ml ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ：２μg/μl 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５mM ｄＮＴＰ(２５０cpm/pmol [３Ｈ]ｄＴＴＰ)
Ｄ：２０％ トリクロロ酢酸(２mMピロリン酸ナトリウム)
Ｅ：１mg/ml サケ精子ＤＮＡ
【００１９】
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とはＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。その活性測定は、以下の通りである。５０μlの反応液（１２０mM Tris-塩酸緩衝液(ｐＨ８．８、２５℃)、１０mM ＫＣｌ、６mM 硫酸アンモニウム、１mM ＭｇＣｌ2、０．１％Triton X-100、０．００１％ ＢＳＡ、５μgトリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５mlのマイクロチューブに分注しＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして０．１％のＢＳＡ ５０μlを加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液１００μlを加えて混合する。氷上で１５分放置した後、１２０００回転にて１０分間遠心分離し沈殿を分離する。上清１００μlの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
【００２０】
本発明において、ＤＮＡ伸長速度とは単位時間あたりのＤＮＡ合成数をいう。その測定法はＤＮＡポリメラーゼの反応液(２０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ７．５)、８mM 塩化マグネシウム、７．５mM ジチオスレイトール、１００μg/ml ＢＳＡ、０．１mM ｄＮＴＰ、０．２μCi[α-32Ｐ]ｄＣＴＰ)を、プライマーをアニーリングさせたＭ１３ｍｐ１８ 1本鎖ＤＮＡと７５℃で反応させる。反応停止は等量の反応停止液(５０mM 水酸化ナトリウム、１０mM ＥＤＴＡ、５％フィコール、０．０５％ブロモフェノールブルー)を加えることにより行う。上記反応にて合成されたＤＮＡをアルカリアガロースゲル電気泳動にて分画した後、ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行う。ＤＮＡサイズマーカーとしてはラベルされたλ/HindIIIを用いる。このマーカーのバンドを指標として合成されたＤＮＡのサイズを測定することによってＤＮＡ伸長速度を求める。
【００２１】
本発明において、熱安定性（熱処理後のＤＮＡポリメラーゼ残存活性）とはポリメラーゼ５単位を１００μｌの緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８；２５℃での測定値）、１０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、２ｍＭ 硫酸マグネシウム、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に混合し、９５℃、６時間の処理での残存活性を意味する。具体的には、上記熱処理後、上記ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定し、熱処理前の該活性と比較することによって算出する。
【００２２】
また、本発明において、ＤＮＡポリメラーゼの正確性とはＤＮＡ複製時における塩基の取り込みの正確性をいう。本発明におけるＤＮＡポリメラーゼの正確性の評価には、ストレプトマイシン耐性に関与するリボゾーマルタンパク質Ｓ１２（rpsL）遺伝子を指標として行う。ストレプトマイシンは原核細胞のタンパク質合成を阻害する抗生物質であり、細菌の３０ＳリボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に結合してタンパク質合成の開始複合体形成反応を阻害し、また遺伝子暗号の誤読を引き起こす。ストレプトマイシン耐性変異株ではリボゾームタンパク質Ｓ１２に変異が見られる。この変異はリボゾームの翻訳忠実度を上げるため、サプレッサーｔＲＮＡによる終始コドンの読み取りを抑制するなど多面的効果(pleiotropic effect）を示すことが知られている。したがって、rpsL遺伝子を鋳型としてＰＣＲにより増幅を行うと、ある確率で変異が導入され、それがアミノ酸レベルの変異であった場合、rpsLタンパク質の構造が変化し、ストレプトマイシンが３０ＳリボゾーマルＲＮＡに作用できなくなるようなことが起こる。したがって、菌を増幅したプラスミドＤＮＡによって形質転換した場合、変異が多く導入されるほどストレプトマイシン耐性菌の出現頻度が増すこととなる。
【００２３】
プラスミドpMol 21(Journal of Molecular Biology(1999)289,835-850に記載)は、rpsL遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドである。このプラスミドのアンピシリン耐性遺伝子上にＰＣＲ増幅用プライマーセット（片方をビオチン化、MluI制限酵素サイトを導入）を設計し、プラスミドの全長を耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにてＰＣＲ増幅し、ストレプトアビジンビーズを用いて精製し、制限酵素MluIを用いて切り出した後、ＤＮＡリガーゼを用いて結合して大腸菌を形質転換して、アンピシリンとアンピシリン及びストレプトマイシンを含有する２種類のプレートに接種し、それぞれのプレートに出現したコロニーの比を算出することにより遺伝子複製の正確性を求めることができる。
【００２４】
これらの改変された酵素を製造する方法としては、従来の公知の方法が使用できる。例えば、野生型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、タンパク質工学的手法により新たな機能を有する変異型ＤＮＡポリメラーゼを製造する方法がある（J. Biol. Chem., 264(11), 6447-6458(1989)）。
変異を導入するＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は特に限定されないが、例えば、パイロコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１株由来の配列表・配列番号３に記載の遺伝子が挙げられる。また同様に、パイロコッカス・フリオサス（Nucleic Acid Res., 21 (2), 259-265(1993)）、サーモコッカス・リトラリス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5577-5581(1992)）なども例示することができる。
野生型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に変異を導入する方法は既知のいかなる方法を用いてもよい。例えば、野生型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と変異原となる薬剤を接触させる方法や紫外線照射による方法などからタンパク質工学的手法、例えばＰＣＲや部位特異的変異などの方法を用いることができる。
【００２５】
本発明で使用したQuickChange site-directed mutagenesisキット（ストラタジーン製）は、（１）目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてPfu ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、（２）（１）のサイクルを１５回繰り返す、（３）例えば、制限酵素DpnIを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、（４）新たに合成されたプラスミドにより大腸菌を形質転換し、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットである。
【００２６】
上記改変ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、pLED-MIもしくはpBluescript由来のものが好ましい。
菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。 この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、宿主由来のポリメラーゼを失活させ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。個々のＤＮＡポリメラーゼ活性をそろえた後に３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性を測定し、野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較することで、各mutantの３’−５ ’エキソヌクレアーゼ活性の変化を測定することができる。
【００２７】
上記方法により選抜された菌株から精製ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＤＮＡポリメラーゼ画分を回収する。
この粗酵素液をセファデックスG-25（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、Ｑセファロース、ヘパリンセファロースなどのカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。
【００２８】
また、得られた酵素を用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、その増幅の有無もしくは強度からＰＣＲ効率の評価を行うことができ、また同じくＤＮＡ複製の正確性も評価することができる。
本発明の改変されたＤＮＡポリメラーゼは、遺伝子の増幅効率及び増幅の正確性の点で優れており、ＰＣＲに利用できる。
【００２９】
また、本発明の核酸増幅ないし伸長方法は、本発明の改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＤＮＡを鋳型とし、少なくとも１種のプライマー、ｄＮＴＰ（即ち、４種類のデオキシリボヌクレオチド３リン酸）を反応させることによりプライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成する方法を含む。該方法は、１種のプライマーを用いて、核酸を伸長する方法を含む。具体的には、プライマーエクステンション法、シークエンス法、従来の温度サイクルを行わない方法およびサイクルシーケンス法を含む。
また、本発明の方法は、２種以上のプライマーを用いてＰＣＲ法により核酸を増幅させる方法も含む。好ましくは、プライマーは２種のオリゴヌクレオチドであって、互いに一方は他方のＤＮＡ生成物に相補的であるプライマーであることが好ましい。また、加熱および冷却を繰り返すのが好ましい。
具体的には、ＰＣＲ法に基づく遺伝子増幅方法は、標的核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプライマー及び本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる標的核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である（Nature, 324 (6093), 13-19(1986)）。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各プライマーと、それぞれに相補的な一本鎖標的核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖標的核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２n倍に増幅される。
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、その活性を維持するために、例えばマグネシウムイオンのような２価のイオン、及び例えばアンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンのような１価のイオンを共存させることが好ましい。また、ＰＣＲ反応液には、緩衝液及びこれらのイオンを含むと共に、ＢＳＡ、例えばTriton X-100のような非イオン性界面活性剤、及び緩衝液が存在してもよい。緩衝剤としては、トリスやヘペスなどのグッドバッファーおよび、リン酸緩衝液などが用いられる。
本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いたときのＰＣＲの具体的一態様としては、反応緩衝液（120mM Tris-HCl(pH8.0), 10mM KCl, 6mM (NH4)2SO4, 0.1% TritonX-100, 10μg/ml BSA）,プライマー各0.4pmol/μl, dNTPs 0.2mM, 鋳型ＤＮＡ0.2ng/μl及び本発明のＤＮＡポリメラーゼ0.05u/μlを含有する溶液を９４℃；１５秒、６５℃；２秒、７４℃；３０秒の温度サイクルを２５回程度行う。
【００３０】
本発明の核酸増幅用試薬は、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ、及び上記のような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン、及び緩衝液を含み、さらに具体的には、一方のプライマーが他方のプライマーＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ及び上記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオン、ＢＳＡ、上述のような非イオン界面活性剤及び緩衝液を含む。
【００３１】
本発明の核酸増幅用試薬の別な態様としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ及び上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン、緩衝液、及び必要に応じて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を含む核酸増幅用試薬がある。該抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。本核酸増幅用試薬は、ＰＣＲの感度上昇、非特異増幅の軽減に特に有効である。
【００３２】
本発明の遺伝子変異導入用試薬は、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である変異導入プライマー、ｄＮＴＰ、及び上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む。さらに上述したような２価イオン、１価イオン、緩衝液を含んでもよい。
本発明における変異導入プライマーは、その長さが２０〜１５０塩基程度であり、共にその配列のほぼ中央あたりに変異部分、即ち、鋳型のなるＤＮＡ配列と異なる部分（例えば、挿入、欠失、置換）を含み、互いに相補的である。
本発明の遺伝子増幅用試薬及び遺伝子変異用試薬において、緩衝液としては、トリスやヘペスなどのグッドバッファーおよび、リン酸緩衝液などが用いられるが、具体的には、１０〜２００mMの各種バッファー（ｐＨ７．５〜９．０（at 25℃））が例示できる。
また、マグネシウムイオンやマンガンイオンのような２価のイオンの濃度は、反応段階で０．５〜２ｍＭ、及び例えばアンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンのような１価のイオンの濃度は、反応の段階で１０〜１００ｍＭ程度となるようなものがよい。
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、反応の段階で０．０１〜０．１単位／μｌ程度となるようなものがよい。また、プライマーの濃度は、０．２〜２pmol/μl程度である。
【００３３】
また、本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性を化学的もしくは遺伝子工学的手法を用いて減衰もしくは失活させ、様々な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、専ら３‘−５’エキソヌクレアーゼとして使用するものであってもよい。
【００３４】
また、本発明の実施態様としては、上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを１種又は２種以上混合したことを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ組成物がある。具体的には、上述のような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと別なＤＮＡポリメラーゼ、例えば３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低いＤＮＡポリメラーゼなどを混合せしめることによって、長鎖核酸を増幅する場合（例えばｌｏｎｇＰＣＲ）に有用な組成物を得ることができる。実際、長鎖核酸を増幅する方法として、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼと３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＰｆｕポリメラーゼまたはＴｉポリメラーゼまたはこれらの変異酵素を混合したＤＮＡポリメラーゼ組成物を用いて、ＰＣＲを行う方法が報告されている（Barns, W.M.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2216-2220）。
本発明においては、本発明のＤＮＡポリメラーゼとＴａｑポリメラーゼとの組み合わせや、本発明のＤＮＡポリメラーゼとＴｔｈポリメラーゼとの組み合わせや、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低い本発明のＤＮＡポリメラーゼと本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性の高い本発明のＤＮＡポリメラーゼとの見合わせが例示できる。
本発明のＤＮＡポリメラーゼ組成物に添加することができる他の成分は、該ＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制する抗体などが例示できる。
【００３５】
【実施例】
以下に、実施例を用いて本発明をより具体的に説明する。
【００３６】
参考例１ 超好熱始原菌ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング
鹿児島県子宝島において単離した超好熱始原菌パイロコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１株を９５℃にて培養後、菌体を回収した。得られた菌体から常法に従ってＫＯＤ１株の染色体ＤＮＡを調製した。パイロコッカス・フリオサス由来のＤＮＡポリメラーゼ(Pfu ＤＮＡポリメラーゼ)の保存領域アミノ酸配列に基づいて、２種のプライマー(5'-GGATTAGTATAGTGCCAATGGSSGGCGA-3' 及び5'-GAGGGCAGAAGTTTATTCCGAGCTT-3') （配列番号２６および２７、”ｓ”はＣとＧの混合物を意味する。）を合成した。この２種のプライマーを使用して調製したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
【００３７】
ＰＣＲ増幅断片の塩基配列を決定し、アミノ酸配列を決定した後、この増幅ＤＮＡをプローブとして、ＫＯＤ１株染色体ＤＮＡ制限酵素処理産物に対してサザンハイブリダイゼーションを行い、ＤＮＡポリメラーゼをコードする断片のサイズを求めた（約４〜７Kbp）。更に、この大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収し、プラスミドpBluescript（ストラタジーン製）に挿入し、これらの混合物よりエシェリシア・コリ(Escherichia coli) JM109を形質転換してライブラリーを作製した。サザンハイブリダイゼーションに使用したプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーションを行い、上記ライブラリーからＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有すると考えられるクローン株(エシェリシア・コリJM109/pBSKOD1)を取得した。
取得した上記クローン株よりプラスミド、pBSKOD1を回収し、定法に従い、塩基配列を決定した。さらに求められた塩基配列からアミノ酸配列を推定した。ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は５０１０塩基からなり、１６７０個のアミノ酸がコードされていた（配列番号１)。
【００３８】
完全なポリメラーゼ遺伝子を作製するために、２箇所の介在配列(１３７４〜２４５３bp及び２７０９〜４３１６bp）をＰＣＲ融合法により取り除いた。
このようにして得られた２種の断片を用いて再度ＰＣＲを行い、介在配列が取り除かれ、Ｎ末端側にEcoRV、Ｃ末端側にBamHIサイトを有するＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼをコードする完全な形の遺伝子断片を取得した（配列番号３）。更に、同遺伝子をＴ７プロモーターで誘導可能な発現ベクターpET-8cのNcoI/BamHIサイト、先に創出した制限酵素サイトを利用してサブクローニングを行い、組換え発現ベクター、pET-pol）を得た。なお、エシェリシア・コリ BL21(DE3)/pET-polは生命工学工業研究所へ寄託されている(FERM BP-5513)。
【００３９】
実施例１
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを改変するために、プラスミドpET-polからＫＯＤポリメラーゼ遺伝子を切り出し、pBluescriptにサブクローニングを行った。すなわち、pET-polを制限酵素XbaIとBamHI（東洋紡績製）にて切断し、約２．３kbのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を切り出した。次にこのＤＮＡ断片をライゲーションキット(東洋紡績製 Ligation high）を用いて、XbaIとBamHIで切断したプラスミドpBluescript SK(-)と連結し、コンピテントセル（東洋紡績製 competent high JM109）を形質転換した。１００μg/mlのアンピシリンを含んだＬＢ寒天培地(１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、１．５％寒天；ギブコ製）で３５℃、１６時間培養し、得られたコロニーからプラスミドを調製した。更に、部分塩基配列を確認してＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミドpKOD1を得た。
【００４０】
実施例２ 改変型遺伝子(ＨＥ）の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例１で得られたプラスミドpKOD1を用いてＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４７番目のヒスチジンをグルタミン酸に置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をもつプラスミドを作製した(pKOD HE)。該プラスミドの作製はQuickChange site directed mutagenesis kit（ストラタジーン製）を用いた。方法は取扱い説明書に準じて行った。変異作製用プライマーとしては、配列番号４及び５に記載されるプライマーを使用した。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリJM109を形質転換し、エシェリシア・コリJM109(pKOD HE)を得た。
【００４１】
得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μg/mlのアンピシリンを含有するＴＢ培地(Molecular cloning 2nd edition、p.A.2）６Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに分注した。この培地に予め１００μg/mlのアンピシリンを含有する５０mlのＬＢ培地(１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリJM109(pKOD HE）(５００ml坂口フラスコ使用）を接種し、３５℃にて１２時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、４００mlの破砕緩衝液(１０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ８．０)、８０mM ＫＣｌ、５mM ２−メルカプトエタノール、１mM ＥＤＴＡ）に懸濁後、フレンチプレス処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８５℃にて３０分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液(５０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ８．０)、５０mM 塩化カリウム、１mM ジチオスレイトール、０．１％ Tween20、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、変異型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＨＥ)を得た。上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は以下の操作で行った。また、酵素活性が高い場合はサンプルを希釈して測定を行った。
【００４２】
（方法）
Ａ液２５μl、Ｂ液５μl、Ｃ液５μl及び滅菌水１０μlをマイクロチューブに加えて攪拌混合後、上記精製酵素希釈液５μlを加えて７５℃で１０分間反応する。その後冷却し、Ｅ液５０μl、Ｄ液１００μlを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）を用いて計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分当り１０nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
【００４４】
実施例３ 変異体(ＨＤ)遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例2と同様の方法にて、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４７番目のヒスチジンをアスパラギン酸に置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した(pKOD HD)。変異プライマーとしては、配列番号６及び７に記載されるプライマーを使用した。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＨＤ)を得た。
【００４５】
実施例４ 変異体(ＨＹ)遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にて、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４７番目のヒスチジンをチロシンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した(pKOD HY)。変異プライマーとしては、配列番号８及び９に記載されるプライマーを使用した。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＨＹ)を得た。
【００４６】
実施例５ 変異体(ＨＡ)遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にて、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４７番目のヒスチジンをアラニンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した(pKOD HA)。変異プライマーとしては、配列番号１０及び１１に記載されるプライマーを使用した。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＨＡ)を得た。
【００４７】
実施例６ 変異体(ＨＫ)遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にて、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４７番目のヒスチジンをリジンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した(pKODHK)。変異プライマーとしては、配列番号１２及び１３に記載されるプライマーを使用した。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＨＫ)を得た。
【００４８】
実施例７ 変異体(ＨＲ)遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にて、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４７番目のヒスチジンをアルギニンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した(pKOD HR)。変異プライマーとしては、配列番号１４及び１５に記載されるプライマーを使用した。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＨＲ)を得た。
【００４９】
実施例８ 変異体(ＨＳ)遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にて、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４７番目のヒスチジンをセリンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した(pKODHS)。変異プライマーとしては、配列番号１６及び１７に記載されるプライマーを使用した。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＨＳ)を得た。
【００５０】
実施例９ 変異体(ＨＱ)遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例２と同様の方法にて、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４７番目のヒスチジンをグルタミンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した(pKOD HQ)。変異プライマーとしては、配列番号１８及び１９に記載されるプライマーを使用した。更に、実施例２と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＨＱ)を得た。
【００５１】
実施例１０
上記実施例２〜９で得られた改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに加え、ＩＫ及びＩＱのエキソヌクレアーゼ活性を以下の方法にて測定した。変異体ＩＫ、ＩＱは特開平１０−４２８７１号公報に記載されるＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４２番目のイソロイシンをリジンおよびグルタミンに置換した変異体であり、特開平１０−４２８７１号公報に記載の方法に準じて作製した。対照として、野生型ＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡績製）を用いた。５０μlの反応液（１２０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ８．８ 、２５℃)、１０mM ＫＣｌ、６mM 硫酸アンモニウム、１mM ＭｇＣｌ2、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．００１％ ＢＳＡ、５μgトリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５mlのマイクロチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼをそれぞれ０．０６Ｕ、０．０２５Ｕを加え、７５℃にて１０分間反応させた。氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして０．１％のＢＳＡ５０μlを加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μl加えて混合した。その後氷上で１５分放置した後、１２０００回転にて１０分間遠心分離し沈殿を分離し、上清１００μlの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定した。個々の３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性の比較は、０．０６および０．０２５ポリメラーゼＵｎｉｔを用いたときの上記の放射活性値をもとに行った。図２に各ＤＮＡポリメラーゼの相対エキソヌクレアーゼ活性を示した。
【００５２】
本実施例から、本発明によれば、様々な強さのエキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが得られることが証明された。得られた変異型ＫＯＤポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、野生型のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ(１００％)に対して、ＨＤは約６．２５％、ＨＥは約２５％、ＨＹは約９０％、ＨＡは約３０％、ＨＳは約５０％、ＨＱは約５０％、ＨＫは約４００％、ＨＲは約３００％、ＩＫは約６．２５％、ＩＱは約２５％の活性を有していた。
【００５３】
実施例１１
熱安定性の確認
実施例２、３及び６で得られた改変型ＤＮＡポリメラーゼの熱安定性を以下の方法にて測定した。各ＤＮＡポリメラーゼ５単位を１００μｌの緩衝液（20mM Tris-HCl pH8.8 at 25℃、10mM塩化カリウム，10mM 硫酸アンモニウム，2mM 硫酸マグネシウム, 0.1% Triton X-100, 0.1mg/ml BSA, 5mM 2- メルカプトエタノール）に混合し、９５℃でプレインキュベートとした。この混合液から経時的に試料を採取し、実施例２記載の方法にてポリメラーゼ活性を測定した。比較として、天然型ＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡製）も同様の操作を行った。表１に示すように、いずれの改変型ポリメラーゼも天然型ＫＯＤポリメラーゼと同様に、９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を示した。
【００５４】
【表１】
実施例１２
ＤＮＡ伸長速度測定
実施例２、３、６および７で得られた改変型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ伸長速度を以下の方法で測定した。精製した改変型ＤＮＡポリメラーゼ１単位を１０μｌの反応液(20mM Tris-HCl(pH7.5), 8mM塩化マグネシウム, 7.5mM ジチオスレイトール, 100 μg/ml BSA, 0.1mM dNTP, 0.2 μCi [α-32P]dCTP)で０．２μｇの配列番号１５のプライマーをアニーリングさせたＭ１３ｍｐ１８１本鎖ＤＮＡと７５℃で２０秒、４０秒、６０秒間反応させた。反応停止は等量の反応停止液（50mM 水酸化ナトリウム，10mM EDTA, 5% フィコール, 0.05% ブロモフェノールブルー) を加えることにより行った。比較としてＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン社製）および天然型のＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡製）も同様の操作を行った。
上記反応にて合成されたＤＮＡをアルカリアガロースゲル電気泳動にて分画した後、ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行った。ＤＮＡサイズマーカーとしてはラベルしたλ/HindIIIを用いた。このマーカーのバンドを指標として合成されたＤＮＡのサイズを測定することによって、ＤＮＡ合成速度を求めた。その結果を表２に示す。いずれの改変型ポリメラーゼも天然型のＫＯＤポリメラーゼと同様に、約１２０塩基／秒の合成速度を有していた。それに対してＰｆｕポリメラーゼは約２０塩基／秒の合成速度であった。
【００５６】
【表２】
本実施例から、本発明によれば、様々な強さのエキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが得られることが証明された。得られた変異型ＫＯＤポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、野生型のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ(１００％)に対して、ＨＤは約６．２５％、ＨＥは約２５％、ＨＹは約９０％、ＨＡは約６５％、ＨＳは約５０％、ＨＱは約５０％、ＨＫは約４００％、ＨＲは約３００％、ＩＫは約６．２５％、ＩＱは約２５％の活性を有していた。
【００５８】
実施例１３ 改変型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ例（１）
野生型(ＷＴ)ＫＯＤポリメラーゼ、並びに改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＨＥ、ＨＤ、ＨＹ、ＨＡ、ＨＫ、ＨＲ、ＩＫ及びＩＱを用いてＰＣＲを行った。変異体ＩＫ、ＩＱは、それぞれ特開平１０−４２８７１号公報に記載のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼにおける第１４２番目のイソロイシンをリジン及びグルタミンに置換した変異体である。ＨＥとＩＱ、 ＨＤとＩＫは、それぞれ同程度の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示すことが分かっている。ＰＣＲは４９μlの反応液（１×KOD-Plus-buffer(東洋紡績製）、１mM ＭｇＳＯ4、０．２mM ｄＮＴＰ、１００ng 及び１０ngのＫ５６２ ＤＮＡ（ライフテクノロジー社製）、１０pmolの配列表２０及び２１に記載のプライマー）に各酵素(１Ｕ/μl)を１μlを加えてＰＣＲを実施した。サーマルサイクラーはPerkin-Elmer社 PCR system GeneAmp2400を用いて、以下のように行った。すなわち、９４℃、２分反応を行った後、９４℃、１５秒→６０℃、３０秒→６８℃、３分３０秒を３０サイクル行った。反応終了後１０μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約３．６kbの増幅ＤＮＡ断片を確認した。図３にアガロースゲル電気泳動の写真を示した。この結果より、変異体ＨＥ、ＨＤ、ＨＹ、ＨＡを用いた場合、特に低いコピー数の鋳型ＤＮＡ(１０ng)からの増幅において、野生型のＫＯＤポリメラーゼを用いるよりも良好な増幅を示すことが証明された。
【００５９】
実施例１４ 改変型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ例（２）
実施例１で良好な結果の得られた改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＨＥ、ＨＤ、ＨＹ、ＨＡについて更にサイズの大きな遺伝子の増幅を試みた。４９μlの反応液（1×KOD -Plus- buffer(東洋紡績製）、１mM ＭｇＳＯ4、０．２mM ｄＮＴＰ、１００ng 及び５０ng Ｋ５６２ ＤＮＡ（ライフテクノロジー製）、１０pmolの配列番号２２及び２３に記載のプライマー）に各酵素(１Ｕ/μl)を１μl加えてＰＣＲを実施した。サーマルサイクラーはPerkin-Elmer製PCR system GeneAmp2400を用いて以下のように行った。すなわち、９４℃、２分反応を行った後、９４℃、１５秒→６０℃、３０秒→６８℃、６分を３０サイクル行った。反応終了後、１０μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色して紫外線照射下約６．２kbの増幅断片を確認した。その結果、特にＨＤ及びＨＥにおいて良好な増幅を確認することができた（図４）。なお、ここには示していないが、野生型(ＷＴ)ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼにおいては増幅は全く確認することができなかった。
【００６０】
実施例１５ 改変型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの正確性の測定
野生型のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼについて正確性を以下の方法にて測定した。４９μlの反応液（1×KOD-Plus-buffer(東洋紡績製）、１mM ＭｇＳＯ4、０．２mM ｄＮＴＰ、２．５ng プラスミドpMol 21(Journal of Molecular Biology(1999)289,835-850）、１０pmolの配列番号２４及び２５に記載のプライマー）に酵素(１Ｕ/μl)を１μl加えてＰＣＲを実施した。ここでは、今回取得した変異体のうちＨＤ、ＨＥ、ＨＹ、ＨＡ、ＨＫ、ＨＲ、及び特開平１０−４２８７１号公報記載のＩＫ、ＩＱを用いて実施した。サーマルサイクラーはPerkin-Elmer製 PCR system GeneAmp2400を用いて以下のように行った。すなわち、９４℃、２分行った後、９４℃、１５秒→６０℃、３０秒→６８℃、４分を２５サイクル行った。また、同時にrTaq ＤＮＡポリメラーゼについても増幅反応を実施した。反応条件としては、４９μlの反応液（１×rTaq buffer(東洋紡績製）、１．５mM ＭｇＣｌ2、０．２mM ｄＮＴＰ、２．５ng プラスミドpMol 21(Journal of Molecular Biology(1999)289,835-850）、１０pmolの配列番号２４及び２５に記載のプライマー）に各酵素(５Ｕ/μl)を０．５μl添加して、９４℃、２分反応を行った後、９４℃、１５秒→６０℃、３０秒→６８℃、５分を２５サイクル行った。
【００６１】
ＰＣＲ終了後フェノール／クロロホルム処理し、次いでエタノール沈澱法によりＤＮＡを沈澱させた。沈澱を１００μlの蒸留水に溶解し、アビジン磁性ビーズ（DYNAL製）を１０μl添加して３０分間転倒混和し、磁性分離用スタンド（Magical Trapper；東洋紡績製）を用いて磁性ビーズを濃縮した。続いて、磁性ビーズに１００μlの洗浄液Ａ(１０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ８．０),１mM ＥＤＴＡ)、１Ｍ ＮａＣｌ）を添加して１０秒間攪拌し、再び磁性分離用スタンドにて濃縮した（洗浄）。上記洗浄工程をもう一度繰り返した後、洗浄液Ｂ(１０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ８．０),１mM ＥＤＴＡ)）を用いて磁性ビーズを洗浄し、磁性分離用スタンドにて磁性ビーズのみを回収した。次いで、この回収した磁性ビーズに蒸留水４０μl、制限酵素緩衝液５μl及び制限酵素Mlu I（東洋紡績製）５０Ｕを添加し、３７℃にて転倒混和しながら３時間処理した。その後、再び磁性分離用スタンドを用いて磁性ビーズを濃縮し、その上清のみを回収した。回収したＤＮＡ溶液をエタノール沈澱法にて脱塩を行い、そのうちの１０ng相当をライゲーション試薬(Ligation high（東洋紡績製）を添加し、１６℃で１６時間ライゲーション反応を行った。次に、Molecular cloning 2nd edition 1.74〜1.81に記載される方法により調製したエシェリシア・コリMF-101株(Journal of Molecular Biology(1999)289,835-850）のコンピテントセルを用いて形質転換を行った。
【００６２】
形質転換を行った大腸菌溶液を２つにに分割し、一方を２００μg/mlのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地(０．６％)＜Ａプレート＞に、もう片一方を２００μg/mlのアンピシリンおよび４００μg/mlのストレプトマイシンを含有するＬＢ寒天培地(０．６％)＜Ｂプレート＞で３０℃で２４時間培養し、出現したコロニー数を計測し、Ｂプレートに出現したコロニーをＡプレートに出現したコロニーで割り、パーセント表示した値を変異率(Mutation frequency）とした。この変異率が低いほど、ＤＮＡ複製時のＤＮＡポリメラーゼの正確性が良いことを示している。
【００６３】
結果を、図５に示した。rTaqは３’−５’エキソヌクレアーゼ（Proof readign）活性を有さないため、７．９１％という高い変異率を示したのに対し、ＷＴ及び今回得られた変異体においては、変異率が全て１％以下であった。また、その中でもＷＴに対して３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の高進していたＨＫ、ＨＲにおいてはそれぞれ変異率が０．１２％、０．１７％とＷＴ０．４７％に対して明らかに良好な値を示すことが証明された。
【００６４】
【発明の効果】
上述したように、本発明により、様々なＤＮＡ増幅効率及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および正確性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作製が可能となった。この方法を用いることにより、従来の始原菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを様々な用途、すなわち長い領域の増幅や、更に正確性の高い増幅など様々な用途に使用できるように、改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを創出することが可能とするものである。
【００６５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】様々なＤＮＡポリメラーゼのエキソＩ領域（下線）及びそれに隣接するアミノ酸配列を示す図である。
【図２】各ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体の相対３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す図（ＷＴの活性を１００とした）である。
【図３】各ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体のヒトゲノムＤＮＡを鋳型としたβ-globin遺伝子(３．６kb)のＰＣＲによる増幅を示す図である。
Ａ:１００ngのヒト細胞株Ｋ５６２由来ＤＮＡを反応に使用
Ｂ:１０ngのヒト細胞株Ｋ５６２由来ＤＮＡを反応に使用
１: ＷＴ ２:ＨＤ ３:ＨＥ ４:ＨＹ ５:ＨＡ ６:ＨＫ ７:ＨＲ ８:ＩＫ ９:ＩＱ
【図４】各ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体のヒトゲノムＤＮＡを鋳型としたMyosinheavey chain遺伝子(６．２kb）のＰＣＲによる増幅を示す図である。
５０ngのヒト細胞株Ｋ５６２より抽出したＤＮＡを使用
１:ＨＤ、 ２:ＨＥ、３:ＨＹ、４:ＨＡ
【図５】各ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体のＰＣＲ増幅における変異率（Mutationfrequency）を示す図である。
Claims (29)
- パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｏｕｓ）属またはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属由来の改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであって、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのエキソＩ（ＥＸＯＩ）領域の、ＤＩＥＴＬＹＨまたはＤＩＥＴＦＹＨ（Ｄ：アスパラギン酸、Ｉ：イソロイシン、Ｅ：グルタミン酸、Ｔ：スレオニン、Ｌ：ロイシン、Ｆ：フェニルアラニン、Ｙ：チロシン、Ｈ：ヒスチジン）配列において、ヒスチジンが他のアミノ酸に置換された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
- ＤＩＥＴＬＹＨまたはＤＩＥＴＦＹＨ配列中のヒスチジンがアスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、アラニン、リジン、及びアルギニンからなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸に置換された請求項１記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
- 下記の理化学的性質を有する請求項１記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも２０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、１０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する - 下記の理化学的性質を有する請求項３記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも３０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、４０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する
（３）アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号１４１〜１４７に位置するＤＩＥＴＬＹＨ（Ｄ：アスパラギン酸、Ｉ：イソロイシン、Ｅ：グルタミン酸、Ｔ：スレオニン、Ｌ：ロイシン、Ｙ：チロシン、Ｈ：ヒスチジン）配列のうち、ヒスチジンを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を含む。 - 下記理化学的性質を有する請求項４記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも３０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、６０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する
（３）アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号１４１〜１４７に位置するＤＩＥＴＬＹＨ（Ｄ：アスパラギン酸、Ｉ：イソロイシン、Ｅ：グルタミン酸、Ｔ：スレオニン、Ｌ：ロイシン、Ｙ：チロシン、Ｈ：ヒスチジン）配列のうち、ヒスチジンを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を含む。 - 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをアスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、アラニン、リジン、及びアルギニンのいずれかのアミノ酸に置換した請求項５記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
- 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをアスパラギン酸に置換した請求項６記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
- 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをグルタミン酸に置換した請求項６記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
- 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをチロシンに置換した請求項６記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
- 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをアラニンに置換した請求項６記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
- 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをリジンに置換した請求項６記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
- 配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第１４７番目のヒスチジンをアルギニンに置換した請求項６記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
- パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｏｕｓ）属またはサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属由来の改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであって、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのエキソＩ（ＥＸＯＩ）領域の、ＤＩＥＴＬＹＨまたはＤＩＥＴＦＹＨ（Ｄ：アスパラギン酸、Ｉ：イソロイシン、Ｅ：グルタミン酸、Ｔ：スレオニン、Ｌ：ロイシン、Ｆ：フェニルアラニン、Ｙ：チロシン、Ｈ：ヒスチジン）配列において、ヒスチジンが他のアミノ酸に置換された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子。
- 下記の理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする請求項１３記載の遺伝子。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも２０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、１０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する - 下記の理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする請求項１３記載の遺伝子。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも３０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、４０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する
（３）アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号１４１〜１４７に位置するＤＩＥＴＬＹＨ（Ｄ：アスパラギン酸、Ｉ：イソロイシン、Ｅ：グルタミン酸、Ｔ：スレオニン、Ｌ：ロイシン、Ｙ：チロシン、Ｈ：ヒスチジン）配列のうち、ヒスチジンを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を含む。 - 下記の理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする請求項１３記載の遺伝子。
（１）ＤＮＡ伸長速度：少なくとも３０塩基／秒
（２）熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理後の該ＤＮＡポリメラーゼが、熱処理前のＤＮＡポリメラーゼに比して、６０％以上のＤＮＡポリメラーゼ残存活性を保持する
（３）アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列中、アミノ酸番号１４１〜１４７に位置するＤＩＥＴＬＹＨ（Ｄ：アスパラギン酸、Ｉ：イソロイシン、Ｅ：グルタミン酸、Ｔ：スレオニン、Ｌ：ロイシン、Ｙ：チロシン、Ｈ：ヒスチジン）配列のうち、ヒスチジンを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を含む。 - 請求項１３〜１６のいずれかに記載の遺伝子を発現ベクターに挿入されてなる遺伝子組換えベクター。
- ベクターがｐＬＥＤ−ＭＩもしくはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のベクターである請求項１７記載の遺伝子組換えベクター。
- 請求項１７又は１８に記載の遺伝子組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換した形質転換体。
- 宿主細胞がエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である請求項１９記載の形質転換体。
- 請求項２０記載の形質転換体を培養し、培養物から耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造方法。
- 鋳型としてのＤＮＡ、少なくとも１種のプライマー、ｄＮＴＰ、及び請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させることにより、プライマーを伸長させてＤＮＡプライマー伸長物を合成することを含む核酸増幅ないし伸長方法。
- プライマーが２種のオリゴヌクレオチドであって、一方は他方のＤＮＡ伸長物に互いに相補的である請求項２２記載の核酸増幅方法。
- 加熱および冷却を繰り返す請求項２２記載の核酸増幅方法。
- 一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ、および請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン及び緩衝液を含むことを特徴とする核酸増幅用試薬。
- 一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ、請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及びカリウムイオンからなる群から選ばれる少なくとも１種、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、非イオン性界面活性剤、及び緩衝液を含有することを特徴とする核酸増幅用試薬。
- 請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを１種以上混合されたことを特徴とする核酸増幅用ＤＮＡポリメラーゼ組成物。
- 鋳型としてのＤＮＡ、変異導入プライマー、ｄＮＴＰ及び請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させることにより、プライマーを伸長させてＤＮＡプライマー伸長物を合成することを含む遺伝子変異導入方法。
- 変異導入プライマー、ｄＮＴＰ、及び請求項１〜１２のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなることを特徴とする遺伝子変異導入用試薬。
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