JP5051423B2 - 改変型の耐熱性RecAタンパク質、及び該タンパク質を用いた核酸増幅方法 - Google Patents
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Description
〔2〕野生型の耐熱性RecAタンパク質に比べて高い相同組換え活性を有する上記〔1〕の改変型の耐熱性RecAタンパク質。
〔3〕前記野生型の耐熱性RecAタンパク質がサーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)、又は、サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus)に由来する上記〔1〕又は〔2〕の改変型の耐熱性RecAタンパク質。
〔4〕前記改変が、野生型の耐熱性RecAタンパク質のC末端から1〜13個のアミノ酸について生じている上記〔1〕〜〔3〕のいずれかの改変型の耐熱性RecAタンパク質。
〔5〕前記改変が、酸性アミノ酸について生じている上記〔1〕〜〔4〕のいずれかの改変型の耐熱性RecAタンパク質。
〔6〕前記改変が欠失である上記〔1〕〜〔5〕のいずれかの改変型の耐熱性RecAタンパク質。
〔7〕配列表の配列認識番号4に記載されるアミノ酸配列の228番目〜240番目の少なくとも1つのアミノ酸が欠失又は置換により改変されている上記〔1〕〜〔6〕のいずれかの改変型の耐熱性RecAタンパク質。
〔8〕配列表の配列認識番号2に記載されるアミノ酸配列からなる上記〔1〕〜〔7〕のいずれかの改変型の耐熱性RecAタンパク質。
〔10〕配列表の配列認識番号1に記載される塩基配列を含む上記〔9〕の改変型の耐熱性RecAタンパク質をコードする核酸分子。
〔11〕上記〔9〕又は〔10〕の核酸分子を導入した形質転換体を培養し、得られた培養物からの抽出液を熱処理に付した後、疎水性クロマトグラフィー、陽イオン交換セルロースクロマトグラフィー、陽イオン交換リン酸セルロースクロマトグラフィーにて順次処理してRecA活性を有するタンパク質を回収する改変型の耐熱性RecAタンパク質の製造方法。
〔13〕前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応に基づく反応である上記〔12〕に記載の核酸増幅方法。
以上の通り、本発明の改変型耐熱性RecAタンパク質は、野生型耐熱性RecAタンパク質の酸性領域のアミノ酸が欠失、若しくは置換して得られる。好ましくは、野生型耐熱性RecAタンパク質のC末端から1〜16個のアミノ酸が欠失、若しくは置換されて得られ、更に好ましくは、C末端から1〜16番目までのアミノ酸からなるアミノ酸配列が任意の箇所で切断され欠失したものである。特にC末端から1〜13番目のアミノ酸までが欠失したものが好ましく例示される。
(1)鋳型核酸の熱変性
(2)プライマーのアニーリング
(3)耐熱性ポリメラーゼによる伸長反応
(1)鋳型核酸の熱変性
二本鎖核酸を加熱により、変性させ一本鎖に解離させる。好ましくは、92〜98℃で10〜60秒行われる。また、長いDNA領域を増幅する場合には、鋳型DNAの分解を防止するため、一番初めの熱変性のみを低温度(例えば、92℃程度)に設定することができる。
温度を下げることにより上記(1)において熱変性され一本鎖となった鋳型核酸とプライマーとのハイブリッドを形成する。アニーリングは、好ましくは30〜60秒間行われる。また、アニーリング温度はプライマーに用いるオリゴヌクレオチドのTmを推定し、このTmをアニーリング温度として設定することが好ましい。アニーリング温度が高いとプライマーの鋳型特異的な結合能が向上するが、アニーリング温度が高すぎるとプライマーが鋳型核酸に結合しなくなることが知られている。通常は、50〜70℃で行われるが、実施例7で確認したように、本発明の改変型耐熱性RecAタンパク質の添加により高いアニーリング温度の適用が可能である。例えば、アニーリング温度を5℃高く設定したPCR条件の適用が可能である。したがって、更に特異的な核酸増幅が可能となる。
耐熱性ポリメラーゼによりプライマーからの核酸鎖の伸長反応が3´末端において行われる。伸長反応温度は、耐熱性ポリメラーゼの種類に応じて、適宜設定されるものであるが、65〜75℃で行うことが好ましい。また、伸長時間は、標的配列が1kb以下のときは1分程度で十分であり、それより長い場合には、1kbにつき1分の割合で長くすることが好ましい。
1.本発明の改変型耐熱性RecAタンパク質は、DNAライブラリーからの標的cDNAクローンの濃縮又は単離に適用することができる。詳細には、濃縮又は単離を所望する標的cDNAの一部の配列をプライマーとして使用し、DNAライブラリーを鋳型として増幅反応を行う際に、本発明の改変型耐熱性RecAタンパク質を適用できる。ここで、増幅反応に際しては、PCR他、公知の核酸増幅反応系等を利用することが可能である。これにより、標的cDNAと関連のない非特異的な増幅を抑制でき、標的cDNAのみを特異的に増幅可能となる。したがって、本発明の改変型耐熱性RecAタンパク質の、DNAライブラリーからの標的DNAクローンのクローニング系への適用により、所望の標的cDNAクローンを特異的、かつ、効率的に濃縮、単離することが可能となる。特異的かつ効率的なcDNAクローニングは、遺伝子発現、発生、分化等の解析、並びに有用物質の産生の分野において大いに貢献し得る。
野生型TthRecAタンパク質のC末端の酸性アミノ酸残基が欠失した改変型TthRecAタンパク質を構築した。
(1)遺伝子クローニング
野生型TthRecAタンパク質のC末端の13個の酸性アミノ酸残基を欠失した改変型TthRecAタンパク質(以下、「Hyper-TthRecAタンパク質」と称する。)を構築した。かかるHyper-TthRecAタンパク質の設計について図3に示す。まず、Hyper-TthRecAタンパク質をコードする遺伝子のクローニングを行った。まず、野生型TthRecAタンパク質の既知の配列情報(GenBank:ACCESSION U03058)に基づいて、以下の2つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。これは、野生型TthRecAタンパク質のC末端の13個の酸性アミノ酸残基を欠失させるために設計されたプライマーである。
5'−gctcatatggacgagagcaagcgcaa−3'
(配列認識番号5)
プライマー2
5'−cgcaagcttagcccgcggccaggacca−3'
(配列認識番号6)
(GenBank:ACCESSION U03058:
Thermus thermophilus RecA protein (recA) geneを参照。)
上記で得たHyper-TthRecA発現クローンを、100μg/mlのアンピシリンを含むLB液体培地中で37℃にてOD600=0.6に達するまで培養した。さらに、1mMのIPTGを添加して4時間培養した。このとき、培養は大腸菌の一般的な培養方法に従って行なった。
実施例1で取得したHyper-TthRecAタンパク質が、PCRの反応精度に与える影響を、野生型TthRecAと比較検討した。具体的には、PCRにおける増幅産物量を比較することにより行った。
PCR反応液(25 μl)は、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを25 ng、Hyper-TthRecAタンパク質[Storage buffer : 50 mM Tris-HCl (pH7.5)、1.0 mM EDTA、0.5 mM DTT、50% w/v Glycerol]を0.4μg、プライマーを各0.8 μM(最終濃度)、DNAポリメラーゼを2.0 unit、dNTP混合液0.2 mM(最終濃度)を、10 mM Tris-HCl Buffer (pH8.3)、50 mM KCl、1.5 mM MgCl2に混合することにより調製した。
プライマー3
5'−acaatgggctcactcaccc−3' (配列認識番号7)
プライマー4
5'−ctaagaccaatggatagctg−3' (配列認識番号8)
プライマーセットB
プライマー5
5'−gctcagcatggtggtggcataa−3' (配列認識番号9)
プライマー6
5'−cctcataccttcccccccattt−3' (配列認識番号10)
プライマーセットC
プライマー7
5'−gactactctagcgactgtccatctc−3' (配列認識番号11)
プライマー8
5'−gacagccaccagatccaatc−3' (配列認識番号12)
プライマーセットD
プライマー9
5'−aacctcacaaccttggctga−3' (配列認識番号13)
プライマー10
5'−ttcacaacttaagatttggc−3' (配列認識番号14)
結果を図4に示す。
図4中、レーン1〜4は、コントロールであり、夫々、プライマーセットA、B、C、Dでの増幅結果を示す。
図4中、レーン5〜8は、野生型TthRecAタンパク質存在下での増幅結果を示し、夫々、プライマーセットA、B、C、Dでの結果を示す。
図4中、レーン9〜12は、Hyper-TthRecAタンパク質存在下での増幅結果を示し、夫々、プライマーセットA、B、C、Dでの結果を示す。
実施例1で取得したHyper-TthRecAタンパク質の相同組換え活性を、D-Loop形成反応により野生型TthRecAタンパク質と比較検討した。
二本鎖標的DNAとしてpBR322 DNA(Takara-Bio社製)と、その部分配列を有する150-merのオリゴヌクレオチド(5'_tgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagt?3':配列認識番号15)を準備した。200ngの標的DNA、各1pmolの標識オリゴヌクレオチド1と標識オリゴヌクレオチド2、3.0 μgのHyper-TthRecAタンパク質、4.8 mMのATP-γSとを、30 mMの酢酸トリス(pH7.2)、20 mMの酢酸マグネシウム中で、37℃で0〜90分間保温した。反応後に、0.5 % (W/Vol)のSDS、及び0.7 mg/mlのプロティナーゼKを加え、37℃で30分間保温することにより、除タンパク処理を行った。その半量を1%アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後のゲルをエチジウムブロミドで染色しDNAのバンドを可視化し、D-Loopの形成を確認した。
結果を図5に示す。矢印によりD-Loop生成物のバンドを示す。
図5中、レーン1〜7は、コントロールの結果を示し、高度好熱菌由来でないRecAタンパク質の相同組換え活性を、夫々、0、5、10、15、30、60、90分間のD-Loop形成反応により確認したものである。
図5中、レーン8〜14は、野生型TthRecAタンパク質の相同組換え活性を、夫々、0、5、10、15、30、60、90分間のD-Loop形成反応により確認したものである。
図5中、レーン15〜21は、Hyper-TthRecAタンパク質の相同組換え活性を、夫々、0、5、10、15、30、60、90分間のD-Loop形成反応により確認したものである。
実施例1で取得したHyper-TthRecAタンパク質のPCRにおけるDNAポリメラーゼへの影響を、野生型TthRecAタンパク質と比較検討した。本実施例においては、Thermus aquaticus由来のDNAポリメラーゼについて検討した。
2.0、1.0、0.5、0.25、0.13unitの各濃度のThermus aquaticus由来のDNAポリメラーゼであるrTaq DNA polymerase(Takara-Bio社製)にてPCRを行うことにより検討した。具体的には、PCR反応液(25 μl)を、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを25 ng、Hyper-TthRecAタンパク質を0.4 μg、プライマーを各0.8 μM(最終濃度)、2.0、1.0、0.5、0.25、0.13unitに調製したrTaq DNAポリメラーゼ(Takara-Bio社製)、dNTP混合液を0.2 mM(最終濃度)を、10 mM Tris-HCl Buffer (pH8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2に混合することにより調製した。ここで、ヒトゲノムDNAは実施例2で使用したものと同じヒトゲノムDNAを使用した。
プライマーセットA
プライマー3
5‘−acaatgggctcactcaccc−3' (配列認識番号7)
プライマー4
5'−ctaagaccaatggatagctg−3' (配列認識番号8)
結果を図6に示す。
図6中、レーン1〜5は、コントロールの結果を示し、夫々、rTaq DNA polymeraseを2.0、1.0、0.5、0.25、0.13 unitによりPCRを行った結果である。
図6中、レーン6〜10は、野生型TthRecAタンパク質添加下で、夫々、rTaq DNA polymeraseポリメラーゼ2.0、1.0、0.5、0.25、0.13 unitによりPCRを行った結果を示す。
図6中、レーン11〜15は、Hyper-TthRecAタンパク質添加下で、夫々、rTaq DNA polymeraseを2.0、1.0、0.5、0.25、0.13 unitによりPCRを行った結果を示す。
実施例4に続いて、Hyper-TthRecAタンパク質のPCRにおけるDNAポリメラーゼへの影響を、野生型TthRecAタンパク質と比較検討した。本実施例においては、サーモコッカス・コダカラエンシス由来のDNAポリメラーゼについて検討した。
PCRは、2.0、1.0、0.5、0.25、0.13unitの各濃度のサーモコッカス・コダカラエンシス由来のDNAポリメラーゼであるr KOD DNA polymerase(TOYOBO社製)にてPCRを行うことにより検討した。具体的には、PCR反応液(25 μl)を、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを25 ng、実施例1で取得したHyper-TthRecAタンパク質を0.4 μg、プライマーを各0.8 μM(最終濃度)、2.0、1.0、0.5、0.25、0.13unitに調製したrKOD DNAポリメラーゼ(TOYOBO社製)、dNTP混合液を0.2 mM(最終濃度)を、1×PCR反応緩衝液(TOYOBO社製)に混合することにより調製した。ここで、プライマーは実施例4で使用したプライマーセットA(プライマー3、4:配列認識番号7、8)を、ヒトゲノムDNAは実施例2、4で使用したものと同じヒトゲノムDNAを使用した。
結果を図7に示す。
図7中、レーン1〜5は、コントロールの結果を示し、夫々、r KOD DNA polymeraseを2.0、1.0、0.5、0.25、0.13 unitによりPCRを行った結果である。
図7中、レーン6〜10は、野生型TthRecAタンパク質添加下で、夫々、r KOD DNA polymeraseを2.0、1.0、0.5、0.25、0.13 unitによりPCRを行った結果を示す。
図7中、レーン11〜15は、Hyper-TthRecAタンパク質添加下で、夫々、r KOD DNA polymeraseを2.0、1.0、0.5、0.25、0.13 unitによりPCRを行った結果を示す。
実施例4、5に続いて、Hyper-TthRecAタンパク質のPCRにおけるDNAポリメラーゼへの影響を、野生型TthRecAと比較検討した。本実施例においては、実施例5と同様、サーモコッカス・コダカラエンシス由来のDNAポリメラーゼについて検討を行い、特にプライマー濃度に関して検討した。
1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02μMの各濃度のプライマーにより検討を行った。具体的には、PCR反応液(25 μl)を、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを25 ng、実施例1で取得したHyper-TthRecAタンパク質を0.4 μg、1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02μM(最終濃度)の各濃度に夫々調製したプライマー、r KOD DNA polymerase(TOYOBO社製)を2.0 unit、dNTP混合液を0.2 mM(最終濃度)を、1×PCR反応緩衝液(TOYOBO社製)に混合することにより調製した。ここで、ヒトゲノムDNAは実施例2、4〜5で使用したものと同じヒトゲノムDNAを使用した。
プライマーセットD
プライマー9
5'−aacctcacaaccttggctga−3' (配列認識番号13)
プライマー10
5'−ttcacaacttaagatttggc−3' (配列認識番号14)
結果を図8に示す。
図8中、レーン1〜7は、野生型TthRecAタンパク質の添加下で、夫々、1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02μMの各濃度のプライマーによりPCRを行った結果を示す。
図8中、レーン8〜16は、Hyper-TthRecAタンパク質の添加下で、夫々、1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02μMの各濃度のプライマーにより行った結果を示す。
Hyper-TthRecAタンパク質のPCRにおけるDNAポリメラーゼのアニーリング温度への影響を、野生型TthRecAと比較検討した。
PCR反応液(25 μl)は、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNAを25 ng、実施例1で取得したHyper-TthRecAタンパク質を0.4 μg、プライマーを各0.6 μM(最終濃度)、r KOD DNA Porymerase(TOYOBO社製)を2.0 unit、dNTP混合液0.2 mM(最終濃度)を、1×KOD-Plus-反応緩衝液(TOYOBO社製)に混合することにより調製した。ここで、ヒトゲノムDNAは実施例2、4〜6で使用したものと同じヒトゲノムDNAを使用した。
プライマー11
5'−taataaacttgttcccagat−3' (配列認識番号16)
プライマー12
5'−aggagaaagagcagtgggag−3' (配列認識番号17)
プライマーセットF
プライマー13
5'−gataagtggaactttagtgt−3' (配列認識番号18)
プライマー14
5'−cataagcattacactgcgca−3' (配列認識番号19)
プライマーセットG
プライマー15
5'−atacctaaggctctactgca−3' (配列認識番号20)
プライマー16
5'−aggcaatggcggcacccatc−3' (配列認識番号21)
プライマーセットH
プライマー17
5'−atttctggcctccaacgtta−3' (配列認識番号22)
プライマー18
5'−ccagaaatgcaggcaattgt−3' (配列認識番号23)
プライマーセットI
プライマー19
5'−tgagccccatcctgaattcc−3' (配列認識番号24)
プライマー20
5'−cagaatggttgtgtagcgca−3' (配列認識番号25)
アニーリング温度が63℃である点で相違する。
(92℃にて30秒)×1サイクル
(94℃にて10秒−58℃にて30秒−68℃にて60秒)×35サイクル
(68℃にて3分)×1サイクル
反応条件II
(92℃にて30秒)×1サイクル
(94℃にて10秒−63℃にて30秒−68℃にて60秒)×35サイクル
(68℃にて3分)×1サイクル
結果を図9に示す。
図9中、レーン1〜5は、野生型TthRecAタンパク質存在下でアニーリング温度58℃での結果を示し、夫々プライマーセットE、F、G、H、IにてPCRを行った結果である。
図9中、レーン6〜10は、Hyper-TthRecAタンパク質存在下でアニーリング温度58℃での結果を示し、夫々プライマーセットE、F、G、H、IにてPCRを行った結果である。
図9中、レーン11〜15は、野生型TthRecAタンパク質存在下でアニーリング温度63℃での結果を示し、夫々プライマーセットE、F、G、H、IにてPCRを行った結果である。
図9中、レーン16〜20は、Hyper-TthRecAタンパク質存在下でアニーリング温度63℃での結果を示し、夫々プライマーセットE、F、G、H、IにてPCRを行った結果である。
したがって、本発明の改変型RecAタンパク質の添加により、アニーリング温度を高く設定できることから、プライマーのミスアニーニング反応が低減し、PCRの精度を向上できることが理解される。
Claims (9)
- 改変型の耐熱性RecAタンパク質であって、
配列認識番号4のアミノ酸配列のうち、配列認識番号4の328番目〜340番目の少なくとも1つのアミノ酸が欠失又は他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含み、
ここで、ポリメラ−ゼ連鎖反応(PCR)DNA増幅条件下において、配列認識番号4の野生型の耐熱性RecAタンパク質に比べて、鋳型核酸に対するヌクレオチドのミスアニーリングを低減させる機能を有する、改変型の耐熱性RecAタンパク質。 - 配列認識番号4の328番目〜340番目のアミノ酸が欠失されている請求項1に記載の改変型の耐熱性RecAタンパク質。
- 配列認識番号4の328番目〜340番目の1の酸性アミノ酸が置換、又は欠失されている請求項1に記載の改変型の耐熱性RecAタンパク質。
- 配列認識番号2のポリペプチドからなる請求項1に記載の改変型の耐熱性RecAタンパク質。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の改変型の耐熱性RecAタンパク質をコードする核酸分子。
- 配列認識番号1の塩基配列を含む請求項5に記載の改変型の耐熱性RecAタンパク質をコードする核酸分子。
- 請求項5又は6に記載の核酸分子を導入した形質転換体を培養し、得られた培養物からの抽出液を熱処理に付した後、疎水性クロマトグラフィー、陽イオン交換セルロースクロマトグラフィー、陽イオン交換リン酸セルロースクロマトグラフィーにて処理してRecA活性を有するタンパク質を回収する改変型の耐熱性RecAタンパク質の製造方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の改変型の耐熱性RecAタンパク質を添加してポリメラ−ゼ連鎖反応(PCR)DNA増幅反応を行う核酸増幅方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の改変型の耐熱性RecAタンパク質と、耐熱性DNAポリメラ−ゼとを含む、核酸増幅を増幅するための核酸増幅キット。
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