JP6741061B2 - 核酸増幅法 - Google Patents
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Description
数コピーといった微量サンプルからでも標的核酸を何十万倍に増幅することができ、研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられるようになってきている。
さらに本発明の他の目的は、上記の目的に適した試薬キットを提供することにある。要約すれば本発明の目的は、動植物組織、体液および排泄物中に存在する遺伝子の増幅に適したPCR改良法およびPCR反応試薬を提供することにある。
一方、DNA複製に関与する因子の一つである増殖核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen(PCNA))と呼ばれる一群の物質が存在する。PCNAをファミリーBに属するDNAポリメラーゼに添加すると核酸増幅の時間が短縮できること(特許文献1)や、プライマーエクステンション試験で伸長性が向上し、核酸増幅でも比較的長めのターゲットを増幅できること(特許文献2)が知られている。しかし、阻害物質が多く含まれた条件でPCNAがそのような効果を示した例は知られていない。
このように、PCNAが、阻害物質が多く含まれた条件で作用することは知られておらず、また、PCNAの添加がポリメラーゼの阻害物質への耐性(クルード耐性)を上げることは知られていなかった。そして、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼとPCNAを用い、生体試料中のDNAを精製工程を経ることなく増幅した例も知られていない。
[項1]
精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する方法であって、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼとProliferating Cell Nuclear Antigen(PCNA)を反応液中に含んでいることを特徴とする核酸増幅法。
[項2]
生体試料が、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルスのいずれかである、項1に記載の核酸増幅法。
[項3]
ファミリーBに属するDNAポリメラーゼが、古細菌(Archea)由来のDNAポリメラーゼである、項1または項2に記載の核酸増幅法。
[項4]
ファミリーBに属するDNAポリメラーゼが、パイロコッカス(Pyrococcus)属またはサーモコッカス(Thermococcus)属の細菌から単離されるDNAポリメラーゼである、項1〜3のいずれかに記載の核酸増幅法。
[項5]
PCNAが単独でDNAにロードする変異体である、項1〜4のいずれかに記載の核酸増幅法。
[項6]
PCNAが、配列21または22における(a)82、84、109番目に相当するアミノ酸からなるN末端領域、および(b)139、143、147番目に相当するアミノ酸からなるC末端領域のうち、少なくともひとつの改変を有する変異体である、項1〜5のいずれかに記載の核酸増幅法。
[項7]
PCNAが、配列21または22における143番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したもの、または、82番目と143番目に相当するアミノ酸を共に中性アミノ酸に改変したもの、147番目に相当するアミノ酸を中性アミノ酸に改変したもの、109番目と143番目に相当するアミノ酸を共に中性アミノ酸に改変したもののいずれかの変異体である、項1〜6のいずれかに記載の核酸増幅法。
[項8]
ファミリーBに属するDNAポリメラーゼがさらに減少した塩基類似体検出活性を有する変異体である、項1〜7のいずれかに記載の核酸増幅法。
[項9]
減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーBに属するDNAポリメラーゼの変異体が、以下の(a)から(c)のいずれかで示されるものであることを特徴とする、項8に記載の核酸増幅法。
(a)配列番号1または配列番号2(Pfuの野生型配列に相当)で示されるアミノ酸配列の7、36、37、90〜97および112〜119番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列である。
(b)(a)で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも1つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が(a)で示されるアミノ酸配列と80%以上同一であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するDNAポリメラーゼをコードするアミノ酸配列である。
(c)(a)で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも1つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が(a)で示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するDNAポリメラーゼをコードするアミノ酸配列である。
[項10]
減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーBに属するDNAポリメラーゼの変異体が、配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列の7、36、93番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸の改変を有する変異体である、項8または9に記載の核酸増幅法。
[項11]
ファミリーBに属するDNAポリメラーゼがさらに3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域を構成するアミノ酸のいずれかに、少なくとも1つのアミノ酸の改変を有する変異体である、項1〜10のいずれかに記載の核酸増幅法。
[項12]
ファミリーBに属するDNAポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域への改変が配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列のD141、I142、E143、H147、N210及びY311に相当するアミノ酸のいずれかに、少なくとも1つのアミノ酸の改変である、項11に記載の核酸増幅法。
[項13]
項1〜12のいずれかに記載の、核酸増幅反応を行うための試薬。
[項14]
項1〜12のいずれかに記載の、核酸増幅反応を行うための試薬を含むキット。
本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子については、アルファベット表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「D143A」などの表記を用いる。「D143A」は、第143番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「/」でつなげて表す。たとえば「D143A/D147A」は、第143番目のアスパラギン酸をアラニンに置換し、かつ、第147番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示す。
また、本明細書において「変異型PCNA」という場合の「変異型」とは、従来知られたPCNAとは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。
本発明における核酸増幅法は、精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する方法であって、ファミリーBに属するポリメラーゼとProliferating Cell Nuclear Antigen(PCNA)を反応液中に含んでいることを特徴とする。
本発明における核酸増幅法においては、精製工程を経ていない生体試料内の核酸を精製することなく増幅する。精製とは、生体試料の組織、細胞壁などの夾雑物質と生体試料中のDNAを分離する方法であり、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、DNAを分離する方法や、イオン交換樹脂、ガラスフィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬によってDNAを分離する方法がある。
本発明において「精製工程を経ていない生体試料」とは、生体試料そのもの、あるいは液体の生体試料を水などの溶媒を用いて希釈したもの、固体の生体試料を水などの溶媒に添加し熱をかけて破砕させたものなどが挙げられる。
臓器や細胞など、増幅対象となる核酸が試料の組織内に存在する場合、前記核酸を抽出するために組織を破壊する行為(物理的な処理による破壊、界面活性剤などを使用した破壊など)は、本発明で言う精製に該当しない。また、前記方法で得られた試料、または、生体試料を、緩衝液などにより希釈する行為も本発明で言う精製に該当しない。
本発明の核酸増幅法に適用する生体試料は、生体から採取された試料であれば特に限定されない。例えば、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルス等をいう。体液には血液や唾液が含まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明の核酸増幅法に用いるDNAポリメラーゼは、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼである。前記ファミリーBに属するDNAポリメラーゼは、好ましくは古細菌(Archea)由来のDNAポリメラーゼである。
ファミリーBに属する古細菌由来のDNAポリメラーゼとしては、パイロコッカス(Pyrococcus)属およびサーモコッカス(Thermococcus)属の細菌から単離されるDNAポリメラーゼが挙げられる。
パイロコッカス属由来のDNAポリメラーゼとしては、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus sp.GB−D、Pyrococcus Woesei、Pyrococcus abyssi、Pyrococcus horikoshiiから単離されたDNAポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
サーモコッカス属に由来するDNAポリメラーゼとしては、Thermococcus kodakaraensis、Thermococcus gorgonarius、Thermococcus litoralis、Thermococcus sp.JDF−3、Thermococcus sp.9degrees North−7(Thermococcus sp.9°N−7)、Thermococcus sp.KS−1、Thermococcus celer、又はThermococcus siculiから単離されたDNAポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
これらのDNAポリメラーゼを用いたPCR酵素は市販されており、Pfu(Staragene社)、KOD(Toyobo社)、Pfx(Life Technologies社)、Vent(New England Biolabs社)、Deep Vent(New England Biolabs社)、Tgo(Roche社)、Pwo(Roche社)などがある。
本発明の核酸増幅法に用いるPCNA(本明細書では、Proliferating Cell Nuclear Antigenとも言う。)は、PCR増強因子の一種である。前記PCNAとしては、PCRの熱サイクルに耐えられる耐熱性のものが望ましく、好ましくはPCR後も活性が残るものが望まれる。さらに好ましくは80℃で30分の熱処理を行っても可溶性であり、活性が50%以上、さらに好ましくは70%以上、さらに好ましくは90%以上残っているものが望まれる。
(a)82、84、109番目に相当するアミノ酸からなるN末端領域、または
(b)139、143、147番目に相当するアミノ酸からなるC末端領域に少なくともひとつの改変を有し、RFCがなくともDNAにロードし、DNAポリメラーゼの伸長反応を促進する変異体があげられる。
本発明の中性アミノ酸としては、天然のものであれば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。好ましくは、置換部位の周辺部位の立体構造に与える影響がもっとも小さいアラニンである。塩基性アミノ酸としては、天然のものであれば、アルギニン、ヒスチジン、リシンが挙げられる。好ましくはアルギニンである。
KOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付の10×PCR Bufferを用い、1×PCR Buffer、および1.5mM MgSO4、dTTPの代わりにdUTPを含んだ0.2mM dNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP)、約1.3kbを増幅する15pmolの配列番号13及び14に記載のプライマー、10ngのヒトゲノムDNA(Roche製)、1U KOD DNAポリメラーゼ V93K変異体を含む50μlの反応液中に、評価するPCNAを250ng添加し、94℃、30秒の前反応の後、98℃、10秒→65℃、30秒→68℃、1分30秒を35サイクル繰り返すスケジュールでPCRを行う。反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約1.3kbの増幅DNA断片を野生型PCNAを添加したもの、またはPCNAを添加していないものと比較することで単独でDNAにロードできるPCNAかどうかを評価することができる。単独でDNAにロードできるPCNAは添加によって増幅量が増加する。
本発明の核酸増幅法は、精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する方法であって、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼを増幅に用い、PCNAを反応液中に含んでいることを除いて、特に限定されない。
精製していない生体試料から得た増幅対象DNAに、
(a)ファミリーBに属するDNAポリメラーゼ
(b)一方のプライマーが他方のプライマーのDNA伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
(c)DNA合成基質(デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP))
(d)マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び/又はカリウムイオンを含むバッファー溶液、および、
(e)PCNA
を、混合し、
サーマルサイクラー等を用いて反応液の温度を上下させることにより、(1)DNA変性、(2)プライマーのアニーリング、(3)プライマーの伸長の熱サイクルを繰り返し、特定のDNA断片を増幅させる。
上記PCR方法においては、必要に応じて、さらに、PCR増強因子(後述)、BSA、非イオン界面活性剤などを用いてもよい。
また、DNAポリメラーゼに、後述の、減少した塩基類似体検出活性を有するような改変を施した変異体を用いる場合は、dUTPなどの塩基類似体をDNA合成基質として用いることが可能である。
本発明の核酸増幅法を実行するための試薬、キットは、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼ、および、PCNAを反応液中に含み、それ以外の構成は特に限定されない。適用する核酸増幅法も特に限定されない。
(a)減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーBに属するDNAポリメラーゼの変異体
(b)一方のプライマーが他方のプライマーのDNA伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
(c)DNA合成基質(デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP))
(d)マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び/又はカリウムイオンを含むバッファー溶液、および、
(e)PCNA
本発明の核酸増幅法に用いる改変されたDNAポリメラーゼは、さらに3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列のいずれかに少なくとも1つのアミノ酸の改変を含んでいてもよい。
3‘−5’エキソアーゼ活性とは、取り込まれたヌクレオチドをDNA重合体の3’末端から除去する能力を指し、上記の3‘−5’エキソヌクレアーゼ領域とは、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼで高度に保存されている部位であり、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するDNAポリメラーゼ(配列番号1)、パイロコッカス・フリオサスに由来するDNAポリメラーゼ(配列番号2)、サーモコッカス・ゴルゴナリウスに由来するDNAポリメラーゼ(配列番号3)、サーモコッカス・リトラリスに由来するDNAポリメラーゼ(配列番号4)、パイロコッカス・エスピーGB−Dに由来するDNAポリメラーゼ(配列番号5)、サーモコッカス・エスピーJDF−3に由来するDNAポリメラーゼ(配列番号6)、サーモコッカス・エスピー9°N−7に由来するDNAポリメラーゼ(配列番号7)、サーモコッカス・エスピーKS−1に由来するDNAポリメラーゼ(配列番号8)、サーモコッカス・セラーに由来するDNAポリメラーゼ(配列番号9)、又はサーモコッカス・シクリに由来するDNAポリメラーゼ(配列番号10)においては、137〜147、206〜222、および308〜318番目のアミノ酸である。本発明は具体的に配列を提示したDNAポリメラーゼ以外のDNAポリメラーゼにも適用される。また、配列番号1〜10に示されるDNAポリメラーゼ以外のファミリーBに属する古細菌由来DNAポリメラーゼにおいては、配列番号1の137〜147、206〜222、および308〜318番目のアミノ酸からなる3‘−5’エキソヌクレアーゼ領域と対応する領域のことを示す。
より好ましくは、アミノ酸の改変がD141A/E143A、I142R、N210D、またはY311Fから選択されるいずれか一つである、3‘−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたDNAポリメラーゼである。
なお、3‘−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた(エキソ(−))DNAポリメラーゼとは、活性の完全な欠如を含み、例えば、親酵素と比較して0.03%、0.05%、0.1%、1%、5%、10%、20%、または最大でも50%以下のエキソヌクレアーゼ活性を有する改変されたDNAポリメラーゼを指す。
本発明の核酸増幅法に用いるファミリーBに属するDNAポリメラーゼは、減少した塩基類似体検出活性を有する変異体でもよい。塩基類似体とはアデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基を示し、ウラシルやイノシンなどが挙げられる。通常、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼは、塩基類似体であるウラシルやイノシンを検出すると強く結合し、ポリメラーゼ機能を阻害する。塩基類似体検出活性とは、塩基類似体と強く結合し、ポリメラーゼ機能を阻害する活性を示す。減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーBに属するDNAポリメラーゼ変異体とは、ウラシルやイノシンへの結合能力が低いことを特徴とするファミリーBに属するDNAポリメラーゼ変異体である。
具体的には、アミノ酸1〜40、およびアミノ酸78〜130によって形成されるウラシルの結合に関するアミノ酸配列(ウラシル結合ポケット)に改変を加え、野生型のDNAポリメラーゼと比較して、ウラシルやイノシンへの結合能力が低いことを特徴とする古細菌DNAポリメラーゼ変異体である。ウラシルやイノシンへの結合能力が低い古細菌DNAポリメラーゼ変異体は、dUTPの存在下のPCRでもファミリーBに属する古細菌由来のDNAポリメラーゼの機能低下があまり見られず、dUTPによるDNAポリメラーゼの伸長反応への影響が低減されている。
(b)(a)で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも1つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が(a)で示されるアミノ酸配列と80%以上同一(好ましくは85%以上同一であり、さらに好ましくは90%以上同一であり、さらに好ましくは95%以上同一であり、さらに好ましくは98%以上同一であり、さらに好ましくは99%以上同一である)であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するDNAポリメラーゼをコードするアミノ酸配列。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)の相同性アルゴリズムBLAST(Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてデフォルト(初期設定)のパラメーターを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。
(c)(a)で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも1つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が(a)で示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するDNAポリメラーゼをコードするアミノ酸配列。
配列の一次構造を比較する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線(インターネット)を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、DNA Databank of Japan(DDBJ)のClustalW(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php/lang=ja)においてデフォルト(初期設定)のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較する。
ここで、例えばY7とは、7番目のアミノ酸であるチロシン(Y)残基を意味しており、アルファベット1文字は通用されているアミノ酸の略号を表している。好ましい例において、Y7アミノ酸はチロシン(Y)が非極性アミノ酸に置換されており、具体的にはY7A、Y7G、Y7V、Y7L、Y7I、Y7P、Y7F、Y7M、Y7W、及びY7Cからなる群より選ばれるアミノ酸置換である。別の好ましい例において、P36アミノ酸はプロリン(P)が正電荷をもつ極性アミノ酸に置換されており、具体的にはP36H、P36K、またはP36Rのアミノ酸置換である。別の好ましい例において、V93アミノ酸はバリン(V)が正電荷をもち極性アミン酸に置換されており、具体的にはV93H、V93K、またはV93Rのアミノ酸置換である。
上記(8)および(9)に例示したDNAポリメラーゼの改変をもとに、本発明の核酸増幅法に用いる改変されたDNAポリメラーゼとして、種々の変異体が考えられる。そのような変異体として、以下の(1)−(4)のいずれかの改変を有するファミリーBに属するDNAポリメラーゼの変異体が例示されるが、これに限定されるわけではない。
(1)(A)H147Eと、(B)Y7A/V93K、Y7A/V93R、Y7A/V93Q、Y7A/P36H、Y7A/P36R、P36H/V93K、P36K、P36R、P36H、V93RまたはV93Qのいずれか
(2)(A)N210Dと、(B)Y7A/V93K、Y7A/P36H、Y7A/P36R、P36K、P36R、P36H、V93Q、V93KまたはV93Rのいずれか
(3)(A)I142Rと、(B)Y7A/V93K、Y7A/V93R、Y7A/V93Q、Y7A/P36H、Y7A/P36R、P36R、P36H、V93K、V93RまたはV93Qのいずれか
(4)(A)D141A/E143Aと、(B)Y7A/V93K、Y7A/P36H、Y7A/P36R、P36R、P36HまたはV93Kのいずれか
本発明における塩基類似体検出活性はPCRによって評価できる。塩基類似体は典型的にはウラシルである。例えば、鋳型となるDNA、緩衝材、マグネシウム、dNTPs、プライマー、および評価対象のDNAポリメラーゼを含む通常のPCR反応液に、dUTP溶液を、終濃度0.5μM〜200μMで添加し、熱サイクルを行う。反応後にエチジウムブロマイド染色アガロース電気泳動でPCR産物の有無を確認し、許容できたdUTP濃度によって、ウラシルの検出活性を評価することが出来る。ウラシル検出活性の高いDNAポリメラーゼは少しのdUTPの添加で伸長反応が阻害され、PCR産物が確認できない。またウラシルの検出活性の低いDNAポリメラーゼは高濃度のdUTPを添加しても問題なくPCRによる遺伝子増幅が確認できる。
KOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付の10×PCR Buffer、またはPfu DNA Polymerase(Agilent社製)添付の10×PCR Bufferを用い、1×PCR Buffer、および1.5mM MgSO4、0.2mM dNTPs(dATP、dTTP,dCTP、dGTP)、約1.3kbを増幅する15pmolの配列番号13及び14に記載のプライマー、10ngのヒトゲノムDNA(Roche製)、1Uの各酵素を含む50μlの反応液中に、dUTP(Roche製)を終濃度0.5、5、50、100、200μMになるよう添加する。94℃、30秒の前反応の後、98℃、10秒→65℃、30秒→68℃、1分30秒を30サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)にてPCRを行う。反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約1.3kbの増幅DNA断片を確認することで塩基類似体検出活性が減少しているかどうかが評価できる。
本発明の核酸増幅法に用いるDNAポリメラーゼを、改変する方法は、既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い改変を行うことが出来、その態様は特に制限されない。
本発明の核酸増幅法に用いるDNAポリメラーゼは以下のように活性を測定する。酵素活性が強い場合には、保存緩衝液(50mM Tris−HCl(pH8.0),50mM KCl,1mM ジチオスレイトール,0.1% Tween20,0.1% Nonidet P40,50% グリセリン)でサンプルを希釈して測定を行う。(1)下記のA液25μl、B液5μl、C液5μl、滅菌水10μl、及び酵素溶液5μlをマイクロチューブに加えて75℃にて10分間反応する。(2)その後氷冷し、E液50μl、D液100μlを加えて、攪拌後更に10分間氷冷する。(3)この液をガラスフィルター(ワットマン製GF/Cフィルター)で濾過し、0.1N 塩酸およびエタノールで十分洗浄する。(4)フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター(パッカード製)で計測し、鋳型DNAのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の1単位はこの条件で30分当りの10nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分(即ち、D液を添加したときに不溶化する画分)に取り込む酵素量とする。
A:40mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5)16mM 塩化マグネシウム15mM ジチオスレイトール100μg/mL BSA(牛血清アルブミン)
B:1.5μg/μl 活性化仔牛胸腺DNA
C:1.5mM dNTP(250cpm/pmol [3H]dTTP)
D:20% トリクロロ酢酸(2mMピロリン酸ナトリウム)
E:1mg/mL 仔牛胸腺DNA
KOD−PCNA変異体の作製
サーモコッカス・コダカラエンシス KOD1株由来の改変型耐熱性PCNA遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるDNA鋳型は、pBluescriptにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス KOD1株由来のPCNA(配列番号23)(pKODPCNA)を用いた。変異導入にはKOD −Plus− Mutagenesis Kit(Toyobo社製)を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリDH5αを形質転換し、酵素調製に用いた。
Pfu−PCNA変異体の作製
パイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性PCNA遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるDNA鋳型は、pBluescriptにクローニングされたパイロコッカス・フリオサス株由来のPCNA(配列番号24)(pPfuPCNA)を用いた。変異導入にはKOD −Plus− Mutagenesis Kit(Toyobo社製)を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリDH5αを形質転換し、酵素調製に用いた。
KOD DNAポリメラーゼ変異体の作製
後述の実施例におけるPCNAの評価に用いるために、KOD DNAポリメラーゼの種々の変異体を以下の方法で作製した。
サーモコッカス・コダカラエンシス KOD1株由来の改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるDNA鋳型は、pBluescriptにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス KOD1株由来の改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子(配列番号11)(pKOD)を用いた。変異導入にはKOD −Plus− Mutagenesis Kit(Toyobo社製)を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリJM109を形質転換し、酵素調製に用いた。
(実施例3−2)
Pfu DNAポリメラーゼ変異体の作製
後述の実施例におけるPCNAの評価に用いるために、Pfu DNAポリメラーゼの種々の変異体を以下の方法で作製した。
パイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるDNA鋳型は、pBluescriptにクローニングされたパイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子(配列番号12)(pPfu)を用いた。変異導入にはKOD −Plus− Mutagenesis Kit(Toyobo社製)を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリJM109を形質転換し、酵素調製に用いた。
実施例3−1、および3−2で作製したプラスミドは表2および表3に示す。
改変型耐熱性PCNAの作製
実施例1および2で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した100μg/mLのアンピシリンを含有するTB培地(Molecular cloning 2nd edition、p.A.2)80mLを500mL坂口フラスコに分注した。この培地に予め100μg/mLのアンピシリンを含有する3mLのLB培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム;ギブコ製)で37℃、16時間培養したエシェリシア・コリDH5α(プラスミド形質転換株)(試験管使用)を接種し、37℃にて16時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、50mLの破砕緩衝液(30mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、30mM NaCl、0.1mM EDTA)に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を80℃にて15分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Qセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液(50mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイトール、0.1% Tween20、0.1%ノニデットP40、50%グリセリン)に置換し、改変型耐熱性PCNAを得た。
改変型耐熱性DNAポリメラーゼの作製
実施例3−1および3−2で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した100μg/mLのアンピシリンを含有するTB培地(Molecular cloning 2nd edition、p.A.2)80mLを500mL坂口フラスコに分注した。この培地に予め100μg/mLのアンピシリンを含有する3mLのLB培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム;ギブコ製)で37℃、16時間培養したエシェリシア・コリJM109(プラスミド形質転換株)(試験管使用)を接種し、37℃にて16時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、50mLの破砕緩衝液(30mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、30mM NaCl、0.1mM EDTA)に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を80℃にて15分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液(50mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイトール、0.1% Tween20、0.1%ノニデットP40、50%グリセリン)に置換し、改変型耐熱性DNAポリメラーゼを得た。
PCNAの評価
PCNAが単独でDNAにロードできるかを確認するため、実施例1で作製したKOD−PCNA変異体(M73L、M73L/E143R、M73L/R109A/E143A、M73L/D147A、M73L/R82A/E143A、M73L/E143F、M73L/E143A)を用いてdUTP存在下PCRでの増幅量の違いを、上記(6)で示した増幅増強活性の測定方法に従い、Human β−グロビンの1.3kbを増幅することで比較した。この際、DNAポリメラーゼには、実施例3−1で作製したKOD V93K変異体を用いた。なお、上述のとおり、M73L変異を野生型に相当するものとみなす。
PCRにはKOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付のBuffer、MgSO4を用い、1×PCR Buffer、およびを0.2mM dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP)、1.5mM MgSO4、15pmolのプライマー(配列番号13及び14)、10ngのヒトゲノムDNA(Roche社製)、抗体と混合した1Uの酵素を含む50μlの反応液を94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→60℃、30秒→68℃、1分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いてPCRを行った。反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
今回用いたKOD V93K変異体はdUTPの阻害を受けて増幅量が少ない。PCNA添加なしやM73L変異体ではほとんどバンドが確認されなかったが、他のKOD−PCNA変異体の添加でしっかりとしたバンドが確認された。PCNAは多量体を形成し核酸の合成反応を促進するが、通常、RFCの働きなしではDNAにロードできず反応が進まない。M73L/E143R、M73L/R109A/E143A、M73L/D147A、M73L/R82A/E143A、M73L/E143F、M73L/E143Aの改変は、多量体形成に関わる部位への改変であり、適度に多量体形成が弱まったため、PCNAがDNAにロードでき、PCR増幅量を向上させたことが考えられる。
PCNA添加による血液からの増幅
反応液に添加する血液量を変えて、様々なPCNA変異体の添加でクルード(血液)耐性を評価した。比較には、PCNAの添加なしとKOD−PCNA変異体(M73L/E143R、M73L、M73L/D147A、M73L/R82A/E143A)を用い、HBgの3.6kbの増幅量の違いを比較した。DNAポリメラーゼには、KOD −Plus−を用いた。
反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
結果、PCNA添加なし、M73Lの変異体では4μg添加しても血液から直接増幅が確認されないところ、M73L/E143R、M73L/D147A、M73L/R82A/E143Aの変異体は0.5μg添加すれば血液が8%含まれていてもしっかりしたバンドが確認された(図2)。多量体形成に関わる部位に変異を入れ単独でDNAにロードするPCNA変異体は、PCR反応系に添加すればクルード耐性が上がることが示される。
市販(古細菌由来)酵素とPCNA添加による血液からの増幅
KOD DNAポリメラーゼ以外のファミリーBに属する酵素にもPCNAの添加でクルード(血液)耐性が向上するかを評価した。
比較には、KOD −Plus−(Toyobo社製)、PrimeSTAR HS(タカラバイオ製)、MightyAmp(タカラバイオ製)、PrimeSTAR GXL(タカラバイオ製)のポリメラーゼを用い、血液、反応液に対して8%存在下でHBgの3.6kbの増幅量の違いを比較した。PCNAにはKOD−PCNA M73L/D147Aを用いた。
反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
結果、KOD−Plus−、PrimeSTAR GXLではPCNA添加なしで血液16%から直接増幅が確認されないところ、PCNA M73L/D147Aを添加することでしっかりとしたバンドが確認された。PrimeSTAR HS、MightyAmpではPCNA添加なしで血液16%から直接増幅がみられたが、PCNA M73L/D147Aを添加することで増幅量が大幅に向上することが確認された(図3)。PCNA変異体を添加すればクルード(血液)耐性が上がり、増幅できなかったものが増幅できた。また、増幅量が血液の阻害によって抑えられていたものが、PCNA変異体の添加によって改善され増幅量が増えたことが示された。PrimeSTAR HS、MightyAmp、PrimeSTAR GXLはファミリーBに属する古細菌由来のポリメラーゼで調製されている。PCNA変異体はKODポリメラーゼだけでなく、様々なファミリーBに属するポリメラーゼに効果があることが示された。
PCNA添加による植物ライセートからの増幅
KOD DNAポリメラーゼの変異体にPCNAの添加でクルード(植物)耐性が向上するかを評価した。
比較には、KOD H147E変異体、KOD Y7A/V93K変異体、KOD Y7A/P36H/N210D変異体、Taqポリメラーゼを用い、rbcL 1.3kbの増幅量の違いを比較した。PCNAにはKOD−PCNA M73L/D147Aを用いた。
KOD変異体のPCRは、KOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付のBuffer、dNTPs、MgSO4を用い、1×PCR Buffer、および1.5mM MgSO4、15pmolのプライマー(配列番号15および16)、KOD抗体と混合した1Uの各酵素を含む50μlの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して2%、4%、8%、16%になるように加え、PCNAなしとKOD−PCNA M73L/D147Aを250ng加えたものを比較した。反応は94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→65℃ 30秒→68℃、1.5分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いて行った。
Taq DNAポリメラーゼはToyobo社製のものを用い、Anti−Taq High(Toyobo社製)と混合したものを用いた。反応は1×BlendTaqに添付のBuffer、2mM dNTPs、10pmolのプライマー(上記と同様)、抗体と混合した2.5Uの酵素を含む50μlの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して2%、4%、8%、16%になるように加え、PCNAなしとKOD−PCNA M73L/D147Aを250ng加えたものを比較した。反応は94℃、2分の前反応の後、94℃、30秒→65℃、30秒→68℃、1、5分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社製)を用いて行った。
反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
各写真の1、2、8、16は添加された植物ライセートの割合(%)を示し、−はPCNAなし、+はPCNAを添加したこと示す。
結果、PCNA添加なしのKOD H147E、KOD Y7A/P36H/N210Dでは植物ライセートを8%以上添加すると阻害がかかり増幅が確認されないところ、PCNAの変異体を添加したものは植物ライセートが8%含まれていてもしっかりしたバンドが確認された(図4)。同様にKOD Y7A/V93Kでも、PCNAなしでは4%の植物ライセートで阻害がかかり増幅が確認されないところ、PCNAの変異体を添加したものは植物ライセートが4%含まれていてもしっかりしたバンドが確認された。PCNA変異体はKOD DNAポリメラーゼの変異体にも効果があることが示された。
一方、ファミリーBに属するポリメラーゼではないTaqポリメラーゼではPCNAの添加でクルード(植物)耐性の変化は見られなかった。TaqポリメラーゼにはPCNA変異体を添加してもクルード耐性は変わらないことが示される。
市販のファミリーBに属する酵素とPCNA添加による植物ライセートからの増幅
市販されている様々なファミリーBに属する酵素にもPCNAの添加でクルード(植物)耐性が向上するかを評価した。
比較には、KOD−Plus−、KOD Dash、PrimeSTAR GXLを用い、rbcL 1.3kbの増幅量の違いを比較した。PCNAにはKOD−PCNA M73L/D147Aを用いた。
PCRは、それぞれ添付のBufferを用い、推奨の反応液中に15pmolのプライマー(配列番号15および16) と、植物ライセートを反応液に対して1%、2%、4%、6%になるように加え、PCNAなしとKOD−PCNA M73L/D147Aを250ng加えたものを比較した。反応は94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→65℃、30秒→68℃、1.5分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いて行った。
反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
各写真の1、2、4、6は添加された植物ライセートの割合(%)を示し、−はPCNAなし、+はPCNAを添加したことを示す。
結果、PCNA添加なしのKOD−Plus−では植物ライセートを1%以上で、KOD Dash、PrimeSTAR GXLでは2%以上で阻害がかかり増幅が確認されないところ、PCNAの変異体を添加したものは植物ライセートが4%含まれていてもしっかりしたバンドが確認された(図5)。
PCNA添加による糞便からの増幅
PCNAの添加でクルード(糞便)耐性が向上するかを評価した。
酵素には、KOD−Plus−を用い、HBgの3.6kbの増幅量の違いを比較した。PCNAにはKOD−PCNA M73L/D147Aを用いた。
PCRは、KOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付のBuffer、dNTPs、MgSO4、酵素(KOD −PLUS−)を用い、1×PCR Buffer、および1.0mM MgSO4、15pmolのプライマー(配列番号17および18)、5ngヒトゲノム、1Uの酵素を含む50μlの反応液中に、糞便を反応液に対して0.2%、0.4%、0.8%、1.6%になるように加え、PCNAなしとKOD PCNA M73L/D147Aを250ng加えたものを比較した。反応は94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→68℃、4分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いて行った。
反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
各写真の0、0.2、0.4、0.8、1.6は添加された糞便の割合(%)を示し、−はPCNAなし、+はPCNAを添加したことを示す。
結果、PCNA添加なしのKOD−Plus−では糞便を0.2%以上添加すると阻害がかかり増幅が確認されないところ、PCNAの変異体を添加したものは糞便が0.4%含まれていてもバンドが確認された(図6)。PCNA変異体は糞便の阻害にも耐性能を向上させる効果があることが示された。
dUTPを含む反応液を用いたPCNA添加による血液からの増幅
dUTPを含むPCR反応系でもPCNAの添加でクルード(血液)耐性が向上するかを評価した。
酵素には、KOD Y7A/V93K変異体を用い、HBgの482bpの増幅量の違いを比較した。PCNAにはKOD−PCNA M73L/D147Aを用いた。
反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
結果、PCNA添加なしのKOD Y7A/V93Kでは血液を10%添加すると阻害がかかり増幅が確認されないところ、PCNAの変異体を添加したものは血液が10%含まれていてもしっかりしたバンドが確認された(図7)。PCNA変異体はdUTP存在下のPCRでも効果があることが示された。
dUTPを含む反応液を用いたPCNA添加による血液からの増幅
図7と同様、dUTPを含むPCR反応系でもPCNAの添加でクルード(血液)耐性が向上するかを評価した。
酵素には、KOD Y7A/V93K変異体、KOD Y7A/P36H/N210Dを用い、HBgの1.3kbの増幅量の違いを比較した。PCNAにはPfu−PCNA M73L/D147Aを用いた。
反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
結果、PCNA添加なしでは阻害がかかり血液から増幅が確認されないところ、PCNAの変異体を添加したものは血液が10%含まれていてもしっかりしたバンドが確認された(図8)。図7と同様、PCNA変異体はdUTP存在下のPCRでも効果があることが示された。
PCNA添加による植物ライセートからの増幅
dUTPを含むPCR反応系でもPCNAの添加でクルード(植物)耐性が向上するかを評価した。
比較には、KOD Y7A/P36H/N210D変異体、Taqポリメラーゼを用い、rbcL 1.3kbの増幅量の違いを比較した。PCNAにはKOD−PCNA M73L/D147Aを用いた。
KOD Y7A/P36H/N210DのPCRは、KOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付のBuffer、MgSO4を用い、1×PCR Buffer、および1.5mM MgSO4、15pmolのプライマー(配列番号15および16)、2mM dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP) 、KOD抗体と混合した1Uの酵素を含む50μlの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して2%、4%、8%、16%になるように加え、PCNAなしとKOD−PCNA M73L/D147Aを250ng加えたものを比較した。反応は94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→65℃ 30秒→68℃、1.5分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いて行った。
Taq DNAポリメラーゼはToyobo社製のものを用い、Anti−Taq High(Toyobo社製)と混合したものを用いた。反応は1×BlendTaqに添付のBuffer、10pmolのプライマー(上記と同様)、2mM dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP)、抗体と混合した2.5Uの酵素を含む50μlの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して2%、4%、8%、16%になるように加え、PCNAなしとKOD−PCNA M73L/D147Aを250ng加えたものを比較した。反応は94℃、2分の前反応の後、94℃、30秒→65℃、30秒→68℃、1、5分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社製)を用いて行った。
反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
各写真の1、2、8、16は添加された植物ライセートの割合(%)を示し、−はPCNAなし、+はPCNAを添加したことを示す。
結果、PCNA添加なしのKOD Y7A/P36H/N210Dでは植物ライセートを4%以上添加すると阻害がかかり増幅が確認されないところ、PCNAの変異体を添加したものは植物ライセートが8%含まれていてもしっかりしたバンドが確認された(図9)。PCNA変異体はdUTPを含む反応液でも効果があることが示された。
一方、ファミリーBに属するポリメラーゼではないTaqポリメラーゼではPCNAの添加でクルード(植物)耐性の変化は見られなかった。TaqポリメラーゼにはPCNA変異体を添加してもクルード耐性は変わらないことが示される。
体組織(爪、髪、口腔粘膜)からのPCR
爪や髪、口腔粘膜を鋳型に、PCRができるかを検討した。爪は爪きりで切断した一片を、髪は1本を、50mM NaOH180μlに添加し、95℃10分の熱処理で破砕を行い、その後、1M Tris−HCl(pH8.0)20μlを加え中和した上清を鋳型として用いた。口腔粘膜は綿棒で採取した粘膜を200μlの水に懸濁したものを鋳型として用いた。
酵素には1Uあたり0.8μgのKOD抗体と混合したKOD(野生型)とKOD Y7A/V93K変異体とKOD Y7A/P36H/N210D変異体を用い、HBgの482bpのPCRを行い増幅の違いを比較した。
上記と同様、PCRは、KOD −Plus− Ver.2(Toyobo社製)添付のBuffer、MgSO4を用い、1×PCR Buffer、および1.5mM MgSO4、15pmolのプライマー(配列番号19および20)、抗体と混合した1Uの各酵素を含む50μlの反応液中に、通常のdNTPs(dATP、dTTP,dCTP、dGTP)を0.2mM添加したものと、dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP)を0.2mMになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には上記サンプル1μlを用いた。また、各反応液にPCR増強因子であるKOD−PCNA M73L/E143R変異体を250ng添加したものも実施した。94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→65℃、10秒→68℃、1分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いてPCRを行った。
反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
結果、野生型のKOD DNAポリメラーゼはdUTP存在下で増幅が確認されないところ、減少した塩基類似体検出活性を持つKOD Y7A/V93KやKOD Y7A/P36H/N210D変異体ではdUTP存在下でもバンドが確認された(図10)。そこにPCNAを添加した結果、添加していないものと比べ増幅量が向上していることが確認された。
糞便からの増幅
dUTP、糞便存在下で遺伝子増幅ができるかを評価した。
酵素には、KOD Y7A/P36H/N210D変異体、Taqポリメラーゼを用い、サルモネラのinvA遺伝子約700bpの増幅の違いをSYBR GREEN Iを用いたリアルタイムPCR、および融解曲線で比較した。KOD Y7A/P36H/N210D変異体にはPCR増強因子としてKOD−PCNA M73L/D147Aを添加したものも実施した。
KOD Y7A/P36H/N210DのPCRは、KOD Dash(Toyobo社製)添付のBufferを用い、1×PCR Buffer、50コピーのサルモネラゲノム、4pmolのプライマー(配列番号25および26)、2mM dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP) 、1/30000 SYBR GREEN I、KOD抗体と混合した0.4Uの酵素を含む20μlの反応液中に、糞便を反応液に対して0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5%になるように加え、95℃、30秒の前反応の後、98℃、10秒→60℃ 10秒→68℃、30秒を50サイクル繰り返すスケジュールでLightCycler2.0(Roche社)を用いて行った。KOD−PCNA M73L/D147Aは上記反応系に100ng加え、PCNAなしのものと比較した。
Taq DNAポリメラーゼはToyobo社製のものを用い、Anti−Taq High(Toyobo社製)と混合したものを用いた。反応は1×Taqに添付のBuffer(Mg別添タイプ)、50コピーのサルモネラゲノム、4pmolのプライマー(上記と同様)、2mM dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、4mM MgSO4、1/30000 SYBR GREEN I、抗体と混合した1Uの酵素を含む20μlの反応液中に、糞便を反応液に対して0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5%になるように加え、95℃、30秒の前反応の後、98℃、10秒→60℃ 10秒→68℃、30秒を50サイクル繰り返すスケジュールでLightCycler2.0(Roche社)を用いて行った。
それぞれ、反応終了後、融解曲線解析にて、80℃後半に出現する目的ピークを確認した。
結果、Taqポリメラーゼでは0.5%の糞便を添加すると増幅が見られなくなるところ、KOD Y7A/P36H/N210Dでは2.5%の糞便を添加しても増幅が確認された。また、PCNAありなしを比較すると、PCNAを添加したものの方が、Cq値が小さく、優れたPCR効率を示していることがわかった。
1はKOD Y7A/P36H/N210Dの結果を、2はKOD Y7A/P36H/N210DにKOD−PCNA M73L/D147Aを添加したものの結果を、3はTaqポリメラーゼの結果を示す。
結果、KOD Y7A/P36H/N210DではdUTP、糞便存在下からでも増幅が確認され、糞便の添加でピークは低くなるものの、2.5%を添加しても、目的ピークを確認することができた。PCNAを添加したものでも同様に、2.5%の添加でも目的ピークを確認することができた。しかし、Taqポリメラーゼでは0.25%の添加で目的ピークが消失しており、糞便の影響で阻害を受けたことが示唆された(図12)。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (13)
- 精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する方法であって、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼとProliferating Cell Nuclear Antigen(PCNA)を反応液中に含み、
ここで、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼが、以下の(a)〜(c)のいずれかで示されるものであり、かつ、PCNAが、配列番号21または22における(x)82、84、109番目に相当するアミノ酸からなるN末端領域、および(y)139、143、147番目に相当するアミノ酸からなるC末端領域のうち、少なくともひとつの改変を有し、かつ、増幅増強活性を示すポリペプチドからなるPCNA変異体であることを特徴とする、核酸増幅法。
(a)配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列の7、36、37、90〜97及び112〜119番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するDNAポリメラーゼをコードするアミノ酸配列である。
(b)(a)で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも1つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が(a)で示されるアミノ酸配列と98%以上同一であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するDNAポリメラーゼをコードするアミノ酸配列である。
(c)(a)で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも1つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が(a)で示されるアミノ酸配列において1〜5個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するDNAポリメラーゼをコードするアミノ酸配列である。 - ファミリーBに属するDNAポリメラーゼの変異体が、配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列の7、36、93番目に相当するアミノ酸のうち少なくとも1つのアミノ酸の改変を有する変異体である、請求項1に記載の核酸増幅法。
- ファミリーBに属するDNAポリメラーゼの変異体が、配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列の7、36、93番目に相当するアミノ酸のうち少なくとも1つのアミノ酸の改変を有する変異体であり、該改変が(i)〜(iii)に示すものである、請求項1又は2に記載の核酸増幅法。
(i)7番目に相当するアミノ酸の改変が、Y7A、Y7G、Y7V、Y7L、又はY7Iのアミノ酸置換である。
(ii)36番目に相当するアミノ酸の改変がP36H、P36K、又はP36Rのアミノ酸置換である。
(iii)93番目に相当するアミノ酸の改変がV93H、V93K、又はV93Rのアミノ酸置換である。 - ファミリーBに属するDNAポリメラーゼがさらに3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域を構成するアミノ酸のいずれかに、少なくとも1つのアミノ酸の改変を有する変異体である、請求項1〜3のいずれかに記載の核酸増幅法。
- ファミリーBに属するDNAポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性領域への改変が、配列番号1または配列番号2で示されるアミノ酸配列のD141、I142、E143、H147、N210及びY311に相当するアミノ酸のいずれかにおける少なくとも1つのアミノ酸の改変である、請求項4に記載の核酸増幅法。
- ファミリーBに属するDNAポリメラーゼが、古細菌(Archea)由来のDNAポリメラーゼである請求項1〜5のいずれかに記載の核酸増幅法。
- ファミリーBに属するDNAポリメラーゼが、パイロコッカス(Pyrococcus)属またはサーモコッカス(Thermococcus)属の細菌から単離されるDNAポリメラーゼである請求項1〜6のいずれかに記載の核酸増幅法。
- ファミリーBに属するDNAポリメラーゼがさらに減少した塩基類似体検出活性を有する変異体である、請求項1〜7のいずれかに記載の核酸増幅法。
- PCNAが単独でDNAにロードする変異体である、請求項1〜8のいずれかに記載の核酸増幅法。
- PCNAが、配列番号21または22における143番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したもの、または、82番目と143番目に相当するアミノ酸を共に中性アミノ酸に改変したもの、147番目に相当するアミノ酸を中性アミノ酸に改変したもの、109番目と143番目に相当するアミノ酸を共に中性アミノ酸に改変したもののいずれかの変異体である、請求項1〜9のいずれかに記載の核酸増幅法。
- PCNA変異体が、配列番号21または配列番号22で示されるアミノ酸配列において、以下の(y1)又は(y2)のいずれかのアミノ酸に置換された変異体である請求項1〜10のいずれかに記載の核酸増幅法。
(y1)143番目のアミノ酸がアラニン又はアルギニンに置換された変異体。
(y2)147番目のアミノ酸がアラニン又はアルギニンに置換された変異体。 - 生体試料が、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、及びウイルスからなる群から選択されるいずれかである請求項1〜11のいずれかに記載の核酸増幅法。
- 生体試料が、血液、唾液、白血球、植物ライセート、糞便、爪、髪、及び口腔粘膜からなる群から選択されるいずれかである請求項1〜12のいずれかに記載の核酸増幅法。
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