JP2016119868A - Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来変異型ＰＣＮＡ - Google Patents

Abstract

【課題】ＤＮＡ複製の増幅増強活性に優れた増殖核抗原（ＰＣＮＡ）変異体の提供。
【解決手段】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓのＰＣＮＡ２由来の特定のアミノ酸配列の第１０７番目に相当するアミノ酸を中性アミノ酸残基に改変した変異型ＰＣＮＡ。前記で示されるＰＣＮＡ単量体において、更に、前記配列のアミノ酸配列における、１０７番目に相当するアミノ酸残基以外の、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されているアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。前記特定のアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。該変異型ＰＣＮＡを用いれば、ＰＣＲの伸長時間を大幅に短縮でき、診断などの遺伝子増幅において非常に有用である。
【選択図】なし

Description

本発明は、ＤＮＡ複製因子に関し、より詳しくは、ＤＮＡ複製を補助する機能に優れたＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ（増殖核抗原）（本明細書では、ＰＣＮＡとも記載する。）に関する。

ＤＮＡ複製は、ＤＮＡヘリカーゼで複製起点の二本鎖構造が解かれることにより開始される。解かれたＤＮＡには、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が結合して一本鎖が安定化され、さらに、それぞれの鎖上にプライマーを合成するためのプライマーゼが働く。次に複製因子Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｃ（本明細書では、ＲＦＣとも記載する。）がプライマーを認識して結合し、ＰＣＮＡをＤＮＡ鎖上に誘導する。ＰＣＮＡはＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡ鎖上に留めておくためのクランプの役目をし、ＰＣＮＡと複合したＤＮＡポリメラーゼが新生鎖を合成する。

ここで挙げたＰＣＮＡは生体内での重要な複製因子であり、ＤＮＡ合成系においてもＰＣＮＡの添加は、ポリメラーゼのＤＮＡ伸長活性（プライマー伸長活性）および増幅増強活性を促進することが知られている。ＤＮＡ合成系で用いられるＰＣＮＡとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のもの（以下、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡとも表記する）、および、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ−１株由来のもの（以下、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１とも表記する）が知られている。

真核細胞および古細菌において、多くの場合ＰＣＮＡは三量体を形成する。特許文献１によれば、ＰＣＮＡの多量体は、一方の単量体のＮ末端側領域と他方の単量体のＣ末端側領域とが界面となって接合し形成される。野生型Ｐｆｕ−ＰＣＮＡでは、配列番号２に記載のアミノ酸配列における、１３９番目、第１４３番目および第１４７番目のアミノ酸残基群と、第８２番目、第８４番目、第１０９番目のアミノ酸残基群とが、接合し、相互に影響しあうネットワークを形成すると考えられている。

また特許文献１では、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡの変異体についても検討されている。野生型のＰｆｕ−ＰＣＮＡにおいては、多量体形成に寄与する界面領域内で分子間相互作用を形成する部位が、単量体相互に、電荷的に引き合うようなアミノ酸残基で構成されている。これに対し、変異体では分子間相互作用を形成するアミノ酸残基どうしが電荷的に反発しあうようにアミノ酸残基が構成されており、単量体のまま又は多量体を形成して、野生型より優れた増幅増強活性を備えているとされている。これは変異を加えることで多量体形成能が弱まり、ＲＦＣなどのクランプローダーがなくても核酸にロードしやすくなったためと考えられる。

また、我々はＫＯＤ−ＰＣＮＡ１についても上記、界面の部位に変異を入れた変異体を評価し、界面領域への変異が増幅増強活性に大きく関わることを示している（特許文献２、および３）。
これら特許文献１〜３のＰＣＮＡ変異体を用いればＤＮＡ合成における増幅量の改善につながることがわかっている。

一方、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓは、上記に示したＫＯＤ−ＰＣＮＡ１のほかに、もうひとつのＰＣＮＡ（ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２）を持つことが知られている（非特許文献１）。このＫＯＤ−ＰＣＮＡ２はＫＯＤ−ＰＣＮＡ１とタンパク相同性が低く、上記に記載した界面とは異なるアミノ酸で多量体形成を行っていることが示されている。
構造解析の結果からは配列番号１に記載のアミノ酸における、第１４３番目、第１７７番目のアミノ酸残基群と、第８２番目、第８７番目、第１０７、第１０９番目のアミノ酸残基群とが、また第７５番目のアミノ酸と第１７２番目のアミノ酸とが接合し、相互に影響しあうネットワークを形成すると考えられている。

しかしながら、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２について、多量体形成部位に変異を入れた例はなく、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２がＰＣＲで働くかは知られていなかった。また、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ、およびＫＯＤ−ＰＣＮＡ１のＰＣＮＡを用いても、ＰＣＲでうまく増幅しないことが散見されており、別のＰＣＮＡでの評価が求められていた。

ＷＯ２００７／００４６５４（国際公開、再公表） 特願２０１３−１６２９９０ 特願２０１３−１６２９９１

ＰＮＡＳ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １５，２０１１ ｖｏｌ. １０８ ｎｏ. ７ ２７１１-２７１６

本発明が解決しようとする課題は、ＤＮＡ複製において、増幅増強活性に優れたＰＣＮＡ変異体を得ることである。

本発明者らは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＰＣＮＡ（ＫＯＤ―ＰＣＮＡ２）の多量体形成に関わるアミノ酸残基（配列番号１）の第１０７番目に相当するアミノ酸を中性アミノ酸残基に改変した変異型ＰＣＮＡを作製することにより、ＤＮＡ複製において、増幅増強活性を示すという知見を得、本発明を完成した。代表的な本発明は、以下の通りである。

［項１］
以下の（１）から（３）のうちいずれかで示されるＰＣＮＡ単量体。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の第１０７番目のアミノ酸残基を中性アミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）（１）で示されるＰＣＮＡ単量体において、さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列における、１０７番目に相当するアミノ酸残基以外の、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
［項２］
項１に記載のＰＣＮＡ単量体が備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
［項３］
項２に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
［項４］
項３に記載のベクターを含む形質転換体。
［項５］
項４に記載の形質転換体を培地で培養し、前記形質転換体中または培地中に、ＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体を蓄積させ、蓄積したＰＣＮＡの単量体または多量体を回収する工程を含む、ＰＣＮＡの製造方法。
［項６］
項１に記載のＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体を含むＤＮＡ複製用試薬。
［項７］
項６に記載の試薬を備えた、ＤＮＡ複製用キット。
［項８］
ＰＣＲ用の試薬を備えた、項７に記載のＤＮＡ複製用キット。
［項９］
項１に記載のＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体と、ＤＮＡポリメラーゼとの存在下でＤＮＡの合成反応を行う、ＤＮＡの複製方法。
［項１０］
前記ＤＮＡの合成反応がＰＣＲである、項９に記載のＤＮＡの複製方法。

本発明により、ＤＮＡ複製における増幅増強活性に優れた汎用性の高いＤＮＡ複製促進因子が提供される。

本発明のＰＣＮＡの増幅増強活性の確認

以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子については、アルファベット表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「Ｄ１４３Ａ」などの表記を用いる。「Ｄ１４３Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。欠損はΔで表記する。
また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「／」でつなげて表す。たとえば「Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換し、かつ、第１４７番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示す。三重変異体以上の多重変異体については、さらに「／」の記号のあとに「Ｐ３６Ｈ」などの変異箇所についての情報を追記する。
また、本明細書において「変異型ＰＣＮＡ」という場合の「変異型」とは、従来知られたＰＣＮＡとは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。

（１）本発明のＰＣＮＡ
本発明の実施形態の一つは、以下の（１）から（３）のうちいずれかで示されるＰＣＮＡ単量体である。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１０７番目のアミノ酸残基を中性アミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）（１）で示されるＰＣＮＡ単量体において、さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列における、１０７番目に相当するアミノ酸残基以外の、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加（これらを纏めて「変異」とも表す。）されているアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。

（１．１）アミノ酸配列
配列番号１は、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＰＣＮＡ（以下、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２とも記載する。）のアミノ酸配列である。

配列番号１において、１０７番目のアミノ酸残基はＰＣＮＡの多量体形成に関わるアミノ酸残基のうちの１つである。ＰＣＮＡの多量体形成に関わるアミノ酸残基は、構造解析により解明されており、配列番号１に記載のアミノ酸における、第１４３番目、第１７７番目のアミノ酸残基群と、第８２番目、第８７番目、第１０７、第１０９番目のアミノ酸残基群とが、また第７５番目のアミノ酸と第１７２番目のアミノ酸とが接合することにより形成される。真核細胞および古細菌においては、多くの場合ＰＣＮＡは三量体を形成する。

上記（２）のポリペプチドは、増幅増強活性を保持する限度で、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配残基が置換、欠失、挿入および／または付加（以下、これらを纏めて「変異」とも表す。）されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
一又は数個の変異は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法やランダム突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）など公知の手法を利用して、後述する本発明のＰＣＮＡ単量体をコードするＤＮＡに変異を導入することによって実施することが可能である。また、紫外線照射など他の方法によってもバリアントＰＣＮＡ単量体を得ることができる。バリアントＰＣＮＡ単量体には、ＰＣＮＡを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型）も含まれる。

上記（３）のポリペプチドは、増幅増強活性を保持することを限度で、配列番号１に示されるアミノ酸配列と比較した同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。好ましくは、本発明のＰＣＮＡ単量体が有するアミノ酸配列と配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性は、８５％以上であり、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。このような一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作成することができる。

アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。

上記の（２）または（３）に記載したようなＰＣＮＡとして、好ましくは、ＰＣＮＡの精製を簡便にすべくＮ末に挿入したＨｉｓタグなどが挙げられるが、これに限定されない。

（１．２）中性アミノ酸残基
本発明のＰＣＮＡ単量体においては、配列番号１における１０７番目のアミノ酸残基が中性アミノ酸残基に置換されるが、置換する塩基性アミノ酸の種類は特に限定されない。本発明の中性アミノ酸としては、天然のものであれば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。好ましくは、置換部位の周辺部位の立体構造に与える影響がもっとも小さいアラニンである。

（１．３）増幅増強活性
増幅増強活性はＰＣＲによって評価できる。鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、およびファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ反応液に、評価するＰＣＮＡを添加し、ＰＣＮＡ添加なしのものと増幅量を比較することで、増幅増強活性を確認することができる。好ましくは、増幅量が少ないＰＣＲ反応系でＰＣＮＡの増幅増強活性は評価しやすく、さらに好ましくは、ｄＵＴＰを含む反応系や伸長時間が短い反応条件などでＰＣＮＡの増幅増強活性を評価することが望ましい。

（１．３．１）増幅増強活性の測定方法
ＰＣＮＡの増幅増強活性を評価しやすくするため、伸長時間を短くし、増幅量を少なくした反応系でＰＣＮＡの増幅増強活性を比較する。
本明細書においては、増幅増強活性は以下の方法で評価する。
（ｉ）ＰＣＲ
ＫＯＤ Ｄａｓｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（反応に用いる濃度の１０倍に濃縮されている。）を用いて、
１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、
１ｐｍｏｌのプライマー（配列番号３及び４）、
５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製）、
１Ｕの ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− ポリメラーゼ
を含むよう反応液を調製する。
５０μｌの前記反応液中に、評価するＰＣＮＡを２５０ｎｇ添加し、
９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６８℃、３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲを行う。
（ｉｉ）ＰＣＲ産物の分析
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片を、ＰＣＮＡを添加していないものと比較することで増幅増強活性を評価することができる。増幅増強活性の高いＰＣＮＡは添加によって増幅量が増加する。

増幅量の増加を定量的に評価する方法としては、Ｇｅｌ Ｐｒｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）などソフトを利用することが挙げられるが増幅量を数値化できるソフトであれば、これに限定されない。
このような方法で増幅量を比較したとき、ＰＣＮＡを添加した場合の増幅量が、ＰＣＮＡを添加しなかった場合の増幅量の１．０倍（好ましくは１．２倍、さらに好ましくは１．５倍、さらに好ましくは２倍、３倍）を超える。もしくは増幅していなかったターゲットが増幅すれば、そのＰＣＮＡが「増幅増強活性を有する」と判断する。

（１．４）
ＰＣＲにおいては、プライマーと鋳型ＤＮＡを用いてＤＮＡ複製を繰り返し、幾何級数的にＤＮＡを増幅させる。そのため、ＰＣＮＡはＤＮＡポリメラーゼに対するクランプとしての機能を果たすと共に、ＤＮＡポリメラーゼが鋳型上で安定した後または所定領域の増幅後には鋳型から速やかに外れることが望ましい。
本発明のＰＣＮＡ変異体が従来のＰＣＮＡ変異体よりＤＮＡの複製反応を促進し得る作用・機序は必ずしも明確ではないが、多量体により形成される環構造が温度上昇時に解除されるような構造を有することにより、ＤＮＡの複製反応の繰り返しが円滑に行われ、その結果、ＤＮＡ複製反応をより促進するということが推測される。

（１．５）
本発明のＰＣＮＡ単量体は、単離されたもの又は精製されたものであることが好ましい。また、本発明のＰＣＮＡ単量体は、上記保存に適した溶液中に溶解した状態又は凍結乾燥された状態（例えば、粉末状）で存在してもよい。本発明のＰＣＮＡ単量体に関して使用する場合の「単離された」とは、当該酵素以外の成分（例えば、宿主細胞に由来する夾雑タンパク質、他の成分、培養液等）を実質的に含まない）状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離されたＰＣＮＡ単量体は、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満である。一方で、本発明のＰＣＮＡ単量体は、保存又は酵素活性の測定に適した溶液（例えば、バッファー）中に存在してもよい。また、一部または全部が三量体などの多量体を形成していてもよい。

（２）本発明のＰＣＮＡの製造方法等
（２．１）本発明のＰＣＮＡをコードするＤＮＡ
ＰＣＮＡをコードする遺伝子は、ＰＣＮＡをもつ微生物からクローニングすることができる。またアミノ酸の配列情報や核酸の配列情報をもとに人工的に合成することもできる。
本発明の実施形態の一つは、上記の本発明の変異型ＰＣＮＡ単量体が備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡである。具体的には以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかである。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１０７番目のアミノ酸残基を中性アミノ酸残基に置換したアミノ酸配列をコードする塩基配列を示すＤＮＡ
（Ｂ）配列番号５に記載の塩基配列において、第３１９〜３２１番目が中性アミノ酸残基をコードするトリプレットに対応するヌクレオチドで置き換えられたＤＮＡ
（Ｃ）前記（Ｂ）に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、第３１９〜３２１番目が中性アミノ酸残基をコードするトリプレットに対応するヌクレオチドで置き換えられ、かつ、増幅増強活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｄ）配列番号５のポリヌクレオチドの有する塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、
配列番号１における１０７番目に相当するアミノ酸残基が中性アミノ酸残基で置き換えられたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつ、増幅増強活性を有するＰＣＮＡをコードするポリヌクレオチド

本明細書において「タンパク質をコードするＤＮＡ」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるＤＮＡ、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡのことをいう。従ってコドンの縮重によって相違するＤＮＡも含まれる。

本発明のＤＮＡは、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質が、増幅増強活性を備える限り、配列番号５に示される塩基配列との相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である塩基配列を有する。

塩基配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＡｄｖａｎｃｅｄ ＢＬＡＳＴ ２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（％）を算出する。

本発明のＤＮＡは、それがコードするタンパク質が増幅増強活性を有する限り、配列番号５に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであっても良い。

「ストリンジェントな条件」とは、一般には、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照して設定することができる。
本明細書では、「ストリンジェントな条件」とは、以下に示す条件を言う。
ハイブリダイゼーション液として５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ， １５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ， ｐＨ ７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いる。

（２．２）ベクター
本発明の実施形態の一つは、上記の本発明の変異型ＰＣＮＡが備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを組み込んだベクターである。

本発明のベクターは、上記（２．１）で説明する本発明の変異型ＰＣＮＡをコードするＤＮＡが組み込まれたベクターである。ここで「ベクター」とは、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子（キャリアー）であり、適当な宿主細胞内で本発明のＤＮＡを複製可能であり、且つ、その発現が可能である限り、その種類や構造は特に限定されない。即ち、本発明のベクターは発現ベクターである。ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。
ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。また、糸状菌を宿主とする場合に適したベクターや、セルフクローニングに適したベクターを使用することも可能である。

大腸菌を宿主とする場合は、例えば、Ｍ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ又はその改変体、ｐＢＲ３２２又はその改変体（ｐＢ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８など）など）を使用することができる。酵母を宿主とする場合は、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＹＥＳ２等を使用することができる。昆虫細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＡｃ、ｐＶＬ等が使用でき、哺乳類細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣ等を使用することができるが、これらに限定される訳ではない。

発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。本発明のＤＮＡのベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １．８４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照することができる、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。

（２．３）形質転換体
本発明の実施形態の一つは、上記の本発明の変異型ＰＣＮＡが備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを組み込んだベクターを含む形質転換体である。
ＤＮＡの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、上記（２．２）で説明するベクターに組み込まれた状態で宿主に導入される。宿主細胞は、本発明のＤＮＡを発現して変異型ＰＣＮＡを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、植物培養細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。

宿主が原核細胞の場合は、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属などが例として挙げられ、それぞれ、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｃ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＤＨ５α、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などが例として挙げられる。また、ベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔなどが例として挙げられる。

宿主が酵母の場合は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、キャンデイダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属などが例として挙げられ、それぞれ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、キャンデイダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリプトコッカス・エスピー（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）などが例として挙げられる。ベクターとしてはｐＡＵＲ１０１、ｐＡＵＲ２２４、ｐＹＥ３２などが挙げられる。

宿主が糸状菌細胞である場合は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属などが例として挙げられ、それぞれ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、コレトトリカム・ヒエマリス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｅｍａｌｉｓ）等を例示することができる。即ち、形質転換体では、通常、外来性のＤＮＡが宿主細胞中に存在するが、ＤＮＡが由来する微生物を宿主とするいわゆるセルフクローニングによって得られる形質転換体も好適な実施形態である。

本発明の形質転換体は、好ましくは、上記（２．２）に示される発現ベクターを用いたトランスフェクションまたはトランスフォーメーションによって調製される。形質転換は、一過性であっても安定的な形質転換であってもよい。トランスフェクション及びトランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、Ｈａｎａｈａｎの方法、酢酸リチウム法、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法、等を利用して実施することができる。

形質転換体に生成させた本発明のＰＣＮＡは、必要に応じて、タンパク質精製の定法により、精製、単離することができる。

（２．４）ＰＣＮＡの製造方法
本発明の実施形態の一つは、前記の形質転換体を培地で培養し、前記形質転換体中または培地中に、ＰＣＮＡ単量体または前記単量体で構成された多量体を蓄積させ、蓄積したＰＣＮＡの単量体または多量体を回収する工程を含む、変異型ＰＣＮＡの製造方法である。

上記改変ＰＣＮＡ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、遠心することで宿主由来のタンパクを除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供することで、目的タンパクの発現を確認することができる。

上記方法により選抜された菌株から精製ＰＣＮＡを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＰＣＮＡ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ−２５（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、Ｑセファロースカラムクロマトグラフィーに供することで、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。

組換えタンパク質として本ＰＣＮＡを得る場合は、精製を容易にするため、配列番号１のＮ末もしくはＣ末にＨｉｓタグを挿入しても良い。

組換えタンパク質として本ＰＣＮＡを得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、本ＰＣＮＡをコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本ＰＣＮＡを得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出・精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。

なお、ＰＣＮＡの単量体は、一方の単量体のＮ末端側領域と他方の単量体のＣ末端側領域とが界面となって接合し多量体を形成する。その接合は可逆的であるため、ＰＣＮＡ単量体として発現させたものの少なくとも一部が多量体を形成することがある。

（３）本発明の変異型ＰＣＮＡの利用法等
（３．１）ＤＮＡの複製方法
本発明の実施形態の一つは、上記の本発明のＰＣＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でＤＮＡの合成反応を行う、ＤＮＡの複製方法である。前記方法において、ＰＣＮＡは単量体であっても前記単量体で構成された多量体のいずれであってもかまわないし、その両方の形態が混在していても良い。

ＤＮＡの複製方法は特に限定されない。ＰＣＲ、プライマーエクステンション、ニックトランスレーション、逆転写酵素によるＦｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成、などが挙げられるが、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅が好適な形態として挙げられる。

ＤＮＡの複製方法の条件も特に限定されない。たとえばＰＣＲの場合の代表的な条件を以下に示す。
増幅対象ＤＮＡに、
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）ＰＣＮＡ
（ｃ）一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
（ｄ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））、および、
（ｅ）マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンを含むバッファー溶液
を、混合し、
サーマルサイクラー等を用いて反応液の温度を以下の（Ｉ）から（ＩＶ）で示されるサイクルで上下させることにより、（１）ＤＮＡ変性、（２）プライマーのアニーリング、（３）プライマーの伸長の熱サイクルを繰り返し、特定のＤＮＡ断片を増幅させる。
（Ｉ）反応液を９４°Ｃ程度に加熱し、３０秒から１分間温度を保ち、２本鎖ＤＮＡを１本鎖に分かれさせる。
（ＩＩ）６０°Ｃ程度（プライマーによって若干異なる）にまで急速冷却し、その１本鎖ＤＮＡとプライマーをアニーリングさせる。
（ＩＩＩ）プライマーの分離がおきずＤＮＡポリメラーゼの活性に至適な温度帯まで、再び加熱する。実験目的により、その温度は６０−７２℃程度に設定される。ＤＮＡが合成されるのに必要な時間、増幅する長さによるが通常１分から２分、この温度を保つ。
（ＩＶ）ここまでが１つのサイクルで、以後、（Ｉ）から（ＩＩＩ）までの手順を繰り返していく事で特定のＤＮＡ断片を増幅させる。

上記ＰＣＲ方法においては、必要に応じて、さらに、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤を用いてもよい。また、さらに、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を用いても良い。前記抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。本反応組成は、ＰＣＲの感度上昇、非特異増幅の軽減に特に有効である。

本発明のＰＣＮＡは、様々なＤＮＡポリメラーゼと相性がよく、汎用性が高い。ＤＮＡポリメラーゼは、通常、伸長性または忠実性のいずれか一方に優れ、一長一短があるのが一般的である。しかし、本発明のＰＣＮＡと組み合わせることにより、忠実性を低下させずに、伸長性を向上し得るため、ＤＮＡポリメラーゼの短所を補強しつつＤＮＡ複製活性が増強され得る。

（３．１．１）α型ポリメラーゼとの組み合わせ
本発明のＰＣＮＡは特に伸長性向上に有効であり、忠実性には優れるが伸長性に劣るタイプのα型ポリメラーゼとの組み合わせにおいて特に有用である。典型的なα型ポリメラーゼとしては、ファミリーＢに属するものが挙げられる。なかでもＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓやＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓなど古細菌に由来するものが好ましい。
例えば、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）、ＴａＫａＲａ ＥＸ Ｔａｑ（タカラバイオ社）、Ｖｅｎｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ社）、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン社）、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、およびＰｗｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）など、現在主要に用いられているＤＮＡポリメラーゼのほとんどに適用し得るが、これらに限定されるものではない。

（３．１．２）
上記のα型ポリメラーゼは、さらに、減少した塩基類似体検出活性を有する変異体であっても良い。塩基類似体とはアデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基を示し、ウラシルやイノシンなどが挙げられる。通常、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、塩基類似体であるウラシルやイノシンを検出すると強く結合し、ポリメラーゼ機能を阻害する。塩基類似体検出活性とは、塩基類似体と強く結合し、ポリメラーゼ機能を阻害する活性を示す。減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体とは、ウラシルやイノシンへの結合能力が低いことを特徴とするファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体である。
このような変異体は、ウラシルの結合に関するアミノ酸配列（ウラシル結合ポケット）の少なくとも１か所に改変を加えることにより作製できる。具体的には、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号６）の１〜４０番目、および７８〜１３０番目によって形成されるウラシルの結合に関するアミノ酸配列（ウラシル結合ポケット）の少なくとも１か所に改変を加え、野生型のＤＮＡポリメラーゼと比較してウラシルやイノシンへの結合能力を低下させたＤＮＡポリメラーゼ変異体が例示される。

ウラシルの結合に関するアミノ酸配列はパイロコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼ及びサーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼにおいて高度に保存されている。サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号６）においては、上述の通り、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。パイロコッカス・フリオサス（配列番号７）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・ゴルゴナリウス（配列番号８）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・リトラリス（配列番号９）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。パイロコッカス・エスピーＧＢ−Ｄ（配列番号１０）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＪＤＦ−３（配列番号１１）のおいては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピー９°Ｎ−７（配列番号１２）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＫＳ−１（配列番号１３）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・セラー（配列番号１４）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・シクリ（配列番号１５）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。

（３．１．３）
本発明の核酸増幅法に用いる減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体として、より好ましいのは、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている、配列番号６または配列番号７で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目のうち少なくとも１つに改変を加えた古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体、たとえば、
（ａ１）配列番号６または配列番号７で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
である。

（３．１．４）
上記のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、以下の（ａ２）で示されるものであってもよい。
（ａ２）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目以外の部位において少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列と配列番号６との同一性またはそのアミノ酸配列と配列番号７との同一性が８０％以上（好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。

アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。

（３．１．５）
上記のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、以下の（ａ３）で示されるものであってもよい。
（ａ３）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目以外の部位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。

ここで「数個」とは、「減少した塩基類似体検出活性」が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、変異されるアミノ酸残基の個数は、例えば、２〜１６０個、好ましくは２〜１２０個、より好ましくは２〜８０個、更に好ましくは２〜４０個であり、より更に好ましくは２〜５個である。

なお、「配列番号６に示されるアミノ酸配列における７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号６に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号６の７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目に対応するウラシルの結合に関するアミノ酸配列を含む表現である。本明細書において、前記と同じ形式の表記における「相当する」の意味は、前記の例示と同じである。

本願明細書において、配列番号６に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号６上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号６の当該位置と対応する位置とする。本明細書において、前記と同じ形式の表記における「対応する位置」の意味は、前記の例示と同じである。

配列の一次構造を比較する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｌａｎｇ＝ｊａ）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較する。

なお、特許４３９５３７７号または特表２００６−５０７０１２号には、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目のアミノ酸のいずれかに改変を加えた古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体がいくつか例示されているが、その全ての改変体が本願の課題にかなう良好な特性を有しているわけではなく、中には活性を失っているものも見られる。

（３．１．６）
本発明の核酸増幅法に用いる減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、より好ましくは、配列番号６または配列番号７で示されるアミノ酸配列の７、３６、または９３番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。

前記ポリペプチドにおいて、アミノ酸の改変が１か所である場合、７番目のアミノ酸であるチロシン（Ｙ）が非極性アミノ酸に置換されていることが好ましく、具体的にはＹ７Ａ、Ｙ７Ｇ、Ｙ７Ｖ、Ｙ７Ｌ、Ｙ７Ｉ、Ｙ７Ｐ、Ｙ７Ｆ、Ｙ７Ｍ、Ｙ７Ｗ、及びＹ７Ｃからなる群より選ばれるアミノ酸置換が例示される。別の例としては、３６番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐ）が正電荷をもつ極性アミノ酸に置換されていることが好ましく、具体的にはＰ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、またはＰ３６Ｒのアミノ酸置換が例示される。別の例としては、９３番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）が正電荷をもつ極性アミン酸に置換されていることが好ましく、具体的にはＶ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、またはＶ９３Ｒのアミノ酸置換が例示される。

より好ましくは、Ｙ７Ａ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、及びＶ９３Ｒからなる群より選ばれるいずれかである。さらに好ましくはＰ３６Ｋ、Ｐ３６ＲまたはＰ３６Ｈである。さらに好ましくはＰ３６Ｈである。

前記ポリペプチドにおいて、アミノ酸の改変が２か所である場合、好ましい変異体として、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３ＱまたはＰ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられる。好ましくは、Ｙ７Ａ／Ｐ３６ＨまたはＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明における塩基類似体検出活性の評価は、以下の方法に従う。
ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、またはＰｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、約１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号１６及び１７に記載のプライマー、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製）、１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、ｄＵＴＰ(Ｒｏｃｈｅ製)を終濃度０．５、５、５０、１００、２００μＭになるよう添加する。９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にてＰＣＲを行う。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約１．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を確認することで塩基類似体検出活性が減少しているかどうかが評価できる。

（３．１．７）
本発明の核酸増幅法に用いる改変されたＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列のいずれかに少なくとも１つのアミノ酸の改変を含んでいてもよい。
３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、取り込まれたヌクレオチドをＤＮＡ重合体の３’末端から除去する能力を指し、上記の３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域とは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼで高度に保存されている部位であり、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号６）、パイロコッカス・フリオサスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号７）、サーモコッカス・ゴルゴナリウスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号８）、サーモコッカス・リトラリスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号９）、パイロコッカス・エスピーＧＢ−Ｄに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１０）、サーモコッカス・エスピーＪＤＦ−３に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１１）、サーモコッカス・エスピー９°Ｎ−７に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１２）、サーモコッカス・エスピーＫＳ−１に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１３）、サーモコッカス・セラーに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１４）、又はサーモコッカス・シクリに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１５）においては、１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目のアミノ酸である。
本発明は具体的に配列を提示したＤＮＡポリメラーゼ以外のＤＮＡポリメラーゼにも適用される。また、配列番号６〜１５に示されるＤＮＡポリメラーゼ以外のファミリーＢに属する古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼにおいては、配列番号６の１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目のアミノ酸からなる３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域と対応する領域のことを示す。

なお、「配列番号６に示される１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号６に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号６の１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に対応するアミノ酸配列を含む表現である。

上記の３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域への改変とは、置換、欠失、または付加からなり得る。配列番号６における１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に対応するアミノ酸への改変を示す。

前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域を改変したＤＮＡポリメラーゼとしては、配列番号６または配列番号７における１４１、１４２、１４３、２１０、３１１番目に対応するアミノ酸の少なくとも一つを改変したものが好ましい。これらの改変型ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠損している。
より好ましくは、アミノ酸の改変がＤ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｉ１４２Ｒ、Ｎ２１０Ｄ、またはＹ３１１Ｆから選択されるいずれか一つである、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＤＮＡポリメラーゼである。
なお、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた（エキソ（−））ＤＮＡポリメラーゼとは、活性の完全な欠如を含み、例えば、親酵素と比較して０．０３％、０．０５％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、または最大でも５０％以下のエキソヌクレアーゼ活性を有する改変されたＤＮＡポリメラーゼを指す。

前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域を改変したＤＮＡポリメラーゼとして、別の好ましい形態は、配列番号６または配列番号７における１４７番目に対応するアミノ酸を改変したものである。より好ましくは、Ｈ１４７Ｅ、またはＨ１４７Ｄから選択されるいずれか一つである。これらの改変型ＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を維持したまま、ＰＣＲ効率が向上している。

（３．１．８）
本発明のＤＮＡ複製方法においては，本発明のＰＣＮＡがＲＦＣを必要としないことから、反応系にＲＦＣを添加しなくてよい。ＲＦＣ標品は一般には市販されておらず、その調製は手間を要する。ＲＦＣ標品が利用できるとしても、添加して使用する場合には、ＲＦＣ以外のＤＮＡ複製系の諸因子との適切な量比等の条件設定が必要であるが、本発明においてはこれらを考慮しなくてよいというメリットがある。また、特にＰＣＲでの使用の場合には、本発明のＰＣＮＡはＲＦＣを併用しなくとも、野生型ＰＣＮＡとＲＦＣの併用時よりも優れた促進活性を発揮する。

また、ＰＣＲの具体的な条件に関しては、既に多くの解説書が発行されており、本発明の方法においてもそれらの文献を参考にして適宜反応条件等を調整してよい。ＰＣＲの条件としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの添加量、ＰＣＲの反応時間、反応溶液の温度の設定、反応溶液の成分、反応溶液のｐＨ、投入する鋳型ポリヌクレオチドの量などの種々の条件が調整される。

（３．２）ＤＮＡ複製用試薬、ＤＮＡ複製用キット
本発明の試薬キットは、上記本発明のＰＣＮＡおよび必要に応じその他の試薬類を含むＤＮＡ複製用の試薬キットである。本発明のＰＣＮＡは、単量体および／または前記単量体で構成された多量体を含む形態で、ＤＮＡ複製用試薬の一成分として好適に用い得る。本発明の試薬キットは、本発明のＰＣＮＡがＰＣＲにおいて特に好適に用い得るため、ＰＣＲ用の試薬キットとして特に好適である。

本発明の試薬キットに備えられるＰＣＮＡはどのような形態であってもよく、精製タンパク質、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド、あるいはこの組換えポリヌクレオチドが導入された形質転換体などの形態が例示される。組換えポリヌクレオチドや形質転換体の好ましい形態については、上記で説明したとおりである。また、本発明のＰＣＮＡと他のＰＣＮＡを組み合わせてもよい。また、本発明のＰＣＮＡが、組換えＤＮＡまたは形質転換体の形態で提供される場合には、本発明のＰＣＮＡを発現させるために用いられる試薬類等を備えてもよい。また、本発明のＰＣＮＡを含む試薬には、必要に応じてバイオテクノロジー試薬として一般に用いられる他の成分や媒体を配合してもよい。

（４）
（４．１）ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法
酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ジチオスレイトール，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０，５０％ グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ 塩酸およびエタノールで十分洗浄する。（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ 塩化マグネシウム１５
ｍＭ ジチオスレイトール１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ：１．５μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ：２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：１ｍｇ／ｍＬ仔牛胸腺ＤＮＡ

以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。

（実施例１）
ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２変異体のプラスミド作製
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来のＰＣＮＡ２（配列番号５）（ｐＫＯＤＰＣＮＡ２）を参考にし、人工合成にて作成した。人工合成した核酸を、ｐＥＴ２３ｂにクローニングし、変異導入のＤＮＡ鋳型（ｐＭｊａＰＣＮＡ）として利用した。変異導入にはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、酵素調製に用いた。
実施例１で作製したプラスミドを表１に示す。

（実施例２）
ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２変異体の作製
実施例１で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＤＨ５α（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Ｑセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２変異体を得た。

（実施例３）
ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２のスクリーニング
ＰＣＲで増幅増強活性がある変異体を取得するため、上記で作製したＫＯＤ−ＰＣＮＡ２変異体を用いて、上記（１．３．１）で示した増幅増強活性の測定方法に従い、ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＨｕｍａｎ β−グロビンの３．６ｋｂを増幅することで比較した。ＰＣＮＡは２５、５０、１００、２００、４００、８００ｎｇを反応系に添加した。

表２は各ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２変異体の増幅増強活性を調べた結果になる。縦軸は各ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２の変異箇所を示し、横軸が添加したＰＣＮＡ量を示す。
増幅量を以下の０〜２の３段階で示した。
０：増幅なし（増幅増強活性なし）
１：薄く増幅している（微弱な増幅増強活性あり）
２：増幅している（増幅増強活性あり）

結果、Ｅ１０７位をＡ、Ｇ、Ｗに置換した変異体で増幅増強活性が確認された。図１は、増幅増強活性のあったＥ１０７Ａ、およびコントロールとして増幅増強活性のなかったＤ８７Ａの電気泳動結果である。

今回用いたＫＯＤ−ＰＣＮＡ２ではＥ１０７位以外のアミノ酸の置換ではＰＣＲでの増幅増強活性は確認できなかった。構造解析で知られている部位に単純に変異を入れるだけでは増幅増強活性のあるものが得られるわけではないことがわかる。このＫＯＤ−ＰＣＮＡ２変異体を用いれば、ＰＣＲの伸長時間を大幅に短縮でき、診断などの遺伝子増幅において非常に有用だと考えられる。

本発明は、バイオテクノロジー関連産業において有用であり、特にＤＮＡ合成に関わる技術関連において有用である。

Claims (10)

1. 以下の（１）から（３）のうちいずれかで示されるＰＣＮＡ単量体。
   （１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の第１０７番目のアミノ酸残基を中性アミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
   （２）（１）で示されるＰＣＮＡ単量体において、さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列における、１０７番目に相当するアミノ酸残基以外の、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
   （３）配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
2. 請求項１に記載のＰＣＮＡ単量体が備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
3. 請求項２に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
4. 請求項３に記載のベクターを含む形質転換体。
5. 請求項４に記載の形質転換体を培地で培養し、前記形質転換体中または培地中に、ＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体を蓄積させ、蓄積したＰＣＮＡの単量体または多量体を回収する工程を含む、ＰＣＮＡの製造方法。
6. 請求項１に記載のＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体を含むＤＮＡ複製用試薬。
7. 請求項６に記載の試薬を備えた、ＤＮＡ複製用キット。
8. ＰＣＲ用の試薬を備えた、請求項７に記載のＤＮＡ複製用キット。
9. 請求項１に記載のＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体と、ＤＮＡポリメラーゼとの存在下でＤＮＡの合成反応を行う、ＤＮＡの複製方法。
10. 前記ＤＮＡの合成反応がＰＣＲである、請求項９に記載のＤＮＡの複製方法。