JP6798594B2 - 核酸増幅の正確性を向上させる方法 - Google Patents
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Description
さらに本発明の他の目的は、上記の目的に適した試薬キットを提供することにある。要約すれば本発明の目的は、PCRの正確性が向上し、クローニングやシークエンス解析のためのライブラリー調製時のPCR増幅などに適したPCR改良法およびPCR反応試薬を提供することである。
[1]核酸増幅の正確性を向上させる方法であって、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼとProliferating Cell Nuclear Antigen(PCNA)を反応液中に含んでいることを特徴とする核酸増幅法。
(ここで、核酸増幅の正確性向上が、ミスマッチエラーの低減、および/または、リピート配列を増幅する際のスリッページエラーの低減であってもよい。)
[2]PCNAが単独でDNAにロードする変異体である[1]に記載の方法。
[3]PCNAが、(a)82、84、109番目に相当するアミノ酸からなるN末端領域、および(b)139、143、147番目に相当するアミノ酸からなるC末端領域のうち、少なくともひとつの改変を有する変異体である、[1]または[2]に記載の核酸増幅法。
[4]PCNAが配列番号1または2に記載のアミノ酸配列において、143番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸あるいは中性アミノ酸に改変したもの、または、82番目と143番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、147番目を中性アミノ酸に改変したもの、109番目と143番目を共に中性アミノ酸に改変したもののいずれかの変異体である、[1]−[3]のいずれかに記載の核酸増幅法。
[5]PCNAが配列番号21に記載のアミノ酸配列において、142番目(配列番号1または2に記載のアミノ酸配列において、143番目に相当)のアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変した変異体である[1]−[3]のいずれかに記載の核酸増幅方法。
[6]ファミリーBに属するDNAポリメラーゼが、古細菌(Archea)由来のDNAポリメラーゼである[1]−[5]のいずれかに記載の核酸増幅法。
[7]ファミリーBに属するDNAポリメラーゼが、パイロコッカス(Pyrococcus)属またはサーモコッカス(Thermococcus)属の細菌から単離されるDNAポリメラーゼである[1]−[5]のいずれかに記載の核酸増幅法。
[8]ファミリーBに属するDNAポリメラーゼが減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌DNAポリメラーゼ変異体である[1]−[5]のいずれかに記載の核酸増幅法。
[9][1]−[8]のいずれかに記載の核酸増幅法を行うための試薬。
[10][1]−[8]のいずれかに記載の核酸増幅法を行うための試薬を含むキット。
本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子については、アルファベット表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「D143A」などの表記を用いる。「D143A」は、第143番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「/」でつなげて表す。たとえば「D143A/D147A」は、第143番目のアスパラギン酸をアラニンに置換し、かつ、第147番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示す。
また、本明細書において「変異型PCNA」、「PCNA変異体」という場合の「変異型」、「変異体」とは、従来知られたPCNAとは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。さらに、DNAポリメラーゼの変異体についても同様である。
本発明におけるDNAポリメラーゼの正確性の評価には、増幅産物をクローニングし、シークエンスする方法を用いている。方法は、まず、ゲノムDNAを鋳型として、任意に選択した領域を増幅できるプライマーにてPCR増幅を実施する。その後、増幅産物をベクターにクローニングし、複数クローンをピックアップ、シークエンスにより塩基配列を確認し、増幅塩基数に対するエラーの割合を求めることにより算出する。一方、鋳型がリピート配列を含むゲノムDNAである場合は、リピート配列に生じた欠失や挿入のエラーの割合を求めることにより算出する。
(1)ミスマッチエラーの観点から
まず、PCRをPCNA添加の有り、無しそれぞれについて実施する。PCRの反応組成については、プライマー対として、15pmolのプライマー対(配列番号18及び19)、鋳型として50ngのヒトゲノムDNA(ロッシュ・アプライド・サイエンス)を使用する以外は、増幅が可能な組成であれば限定されない。また、PCRサイクルについても各DNA ポリメラーゼに適した条件で実施すればよい。PCNA添加の有無で増幅量を揃えるために、PCNA添加あり、無しのそれぞれについてサイクル数を設定する。増幅量が揃っているかの確認は、PCR反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下約2.4kbの増幅DNA断片の強度を確認することで評価できる。
次にPCNA添加有り、無しのそれぞれの増幅産物についてクローニングを実施する。本PCR産物は、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有するファミリーBに属するDNAポリメラーゼにより増幅しているため3’末端が平滑化されている。そのため、PCR産物の平滑末端へのアデニン付加後、TAクローニングを実施する必要性がある。具体的には、アデニン付加、TAクローニングには、TArget Clone −Plus−(TOYOBO)を用いて、方法は取扱説明書に準じて行えばよい。クローニング方法については、上記方法に限定されず、公知の方法を使用することが可能である。
シークエンス後、複数ピックアップしたコロニーそれぞれについて、シークエンスが完了した塩基数と、間違えて取り込まれた塩基数(エラー塩基数)のカウントを実施する。その後、複数ピックアップしたコロニーについて算出した値を合計し、シークエンスが完了した塩基数の合計値に対する間違えて取り込まれた塩基数(エラー塩基数)の合計値の割合を算出し、この値をエラー率とする。このエラー率について、PCNA添加有り、無しで比較することによりPCNA添加効果を確認することができる。この際、シークエンスを実施するプラスミド数は、最低30クローン、好ましくは50クローン以上で実施する。また、計算値の分母となるシークエンスが完了した塩基数は10000塩基以上が望ましく、より好ましくは20000塩基以上である。
さらに、間違えて取り込まれた塩基数を評価するにあたり、リピート配列に対するエラー(スリッページエラー)は除外する。これは、塩基の取り込み間違い(エラー)とリピート配列に対するエラー(スリッページエラー)は異なる原因で発生するからである。
一方、鋳型がリピート配列を含むゲノムDNAである場合は、リピート配列を含む領域の解析(シークエンス解析)までの工程を前記(1)と同様に実施した後、(A)12のリピート配列領域のAの数を各コロニーから抽出したプラスミドごとに集計する。シークエンスを実施したプラスミド数に対するAの数が12個であるプラスミドの割合をエラーのない割合とし、シークエンスを実施したプラスミド数に対するAの数が12個ではないプラスミドの割合をエラー率とし、PCNA添加有り・無しで比較する。この際、シークエンスを実施するプラスミド数は、最低30クローン、好ましくは50クローン以上で実施する。
パイロコッカス属由来のDNAポリメラーゼとしては、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus sp.GB−D、Pyrococcus Woesei、Pyrococcus abyssi、Pyrococcus horikoshiiから単離されたDNAポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
サーモコッカス属に由来するDNAポリメラーゼとしては、Thermococcus kodakaraensis(KODと略称することもある)、Thermococcus gorgonarius、Thermococcus litoralis、Thermococcus sp.JDF−3、Thermococcus sp.9degrees North−7(Thermococcus sp.9°N−7)、Thermococcus sp.KS−1、Thermococcus celer、 またはThermococcus siculiから単離されたDNAポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
具体的には、アミノ酸1〜40、およびアミノ酸78〜130によって形成されるウラシルの結合に関するアミノ酸配列(ウラシル結合ポケット)に改変を加え、野生型のDNAポリメラーゼと比較して、ウラシルやイノシンへの結合能力が低いことを特徴とする古細菌DNAポリメラーゼ変異体である。ウラシルやイノシンへの結合能力が低い古細菌DNAポリメラーゼ変異体は、dUTPの存在下のPCRでもファミリーBに属する古細菌由来のDNAポリメラーゼの機能低下があまり見られず、dUTPによるDNAポリメラーゼの伸長反応への影響が低減されている。
(a)配列番号3または配列番号4で示されるアミノ酸配列の7、36、37、90〜97および112〜119番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列。
(b)(a)で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも1つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が(a)で示されるアミノ酸配列と80%以上同一(好ましくは85%以上同一であり、さらに好ましくは90%以上同一であり、さらに好ましくは95%以上同一であり、さらに好ましくは98%以上同一であり、さらに好ましくは99%以上同一である)であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するDNAポリメラーゼをコードするアミノ酸配列。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)の相同性アルゴリズムBLAST(Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてデフォルト(初期設定)のパラメーターを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。
(c)(a)で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも1つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が(a)で示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するDNAポリメラーゼをコードするアミノ酸配列。
例えば、上記の(a)から(c)に示される古細菌DNAポリメラーゼ変異体において、改変前のアミノ酸配列は、配列番号3または配列番号4に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列であってもよい。
本明細書では、DNA Databank of Japan(DDBJ)のClustalW(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php/lang=ja)においてデフォルト(初期設定)のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較する。
ここで、例えばY7とは、7番目のアミノ酸であるチロシン(Y)残基を意味しており、アルファベット1文字は通用されているアミノ酸の略号を表している。好ましい例において、Y7アミノ酸はチロシン(Y)が非極性アミノ酸に置換されており、具体的にはY7A、Y7G、Y7V、Y7L、Y7I、Y7P、Y7F、Y7M、Y7W、及びY7Cからなる群より選ばれるアミノ酸置換である。別の好ましい例において、P36アミノ酸はプロリン(P)が正電荷をもつ極性アミノ酸に置換されており、具体的にはP36H、P36K、またはP36Rのアミノ酸置換である。別の好ましい例において、V93アミノ酸はバリン(V)が正電荷をもち極性アミン酸に置換されており、具体的にはV93H、V93K、またはV93Rのアミノ酸置換である。
(1)(A)H147Eと、(B)Y7A/V93K、Y7A/V93R、Y7A/V93Q、Y7A/P36H、Y7A/P36R、P36H/V93K、P36K、P36R、P36H、V93RまたはV93Qのいずれか
(2)(A)N210Dと、(B)Y7A/V93K、Y7A/P36H、Y7A/P36R、P36K、P36R、P36H、V93Q、V93KまたはV93Rのいずれか
(3)(A)I142Rと、(B)Y7A/V93K、Y7A/V93R、Y7A/V93Q、Y7A/P36H、Y7A/P36R、P36R、P36H、V93K、V93RまたはV93Qのいずれか
(4)(A)D141A/E143Aと、(B)Y7A/V93K、Y7A/P36H、Y7A/P36R、P36R、P36HまたはV93Kのいずれか
KOD −Plus− Ver.2(TOYOBO)添付の10×PCR Buffer、またはPfu DNA Polymerase(アジレント・テクノロジー)添付の10×PCR Bufferを用い、1×PCR Buffer、および1.5mM MgSO4、0.2mM dNTPs(dATP、dTTP,dCTP、dGTP)、約1.3kbを増幅する15pmolの配列番号13及び14に記載のプライマー(対)、10ngのヒトゲノムDNA(ロッシュ・アプライド・サイエンス)、1Uの各酵素を含む50μlの反応液中に、dUTP(ロッシュ・アプライド・サイエンス)を終濃度0.5、5、50、100、200μMになるように添加した反応液を調製する。94℃、30秒の前反応の後、98℃、10秒→65℃、30秒→68℃、1分30秒を30サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(アプライドバイオシステムズ)にてPCRを行う。反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約1.3kbの増幅DNA断片を確認することで塩基類似体検出活性が減少しているかどうかが評価できる。
本明細書において、DNAポリメラーゼ活性は、以下の方法で測定することにより定義される。なお酵素活性が強い場合には、保存緩衝液(50mM Tris−HCl(pH8.0),50mM KCl,1mM ジチオスレイトール,0.1% Tween20,0.1% Nonidet P40,50% グリセリン)でサンプルを希釈して測定を行う。
(1)下記のA液25μl、B液5μl、C液5μl、滅菌水10μl、及び酵素溶液5μlをマイクロチューブに加えて75℃にて10分間反応する。(2)その後氷冷し、E液50μl、D液100μlを加えて、攪拌後更に10分間氷冷する。(3)この液をガラスフィルター(ワットマン製GF/Cフィルター)で濾過し、0.1N 塩酸およびエタノールで十分洗浄する。(4)フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター(パッカード製)で計測し、鋳型DNAのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の1単位はこの条件で30分当りの10nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分(即ち、D液を添加したときに不溶化する画分)に取り込む酵素量とする。
A:40mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5)16mM 塩化マグネシウム15mM ジチオスレイトール100μg/mL BSA(牛血清アルブミン)
B:1.5μg/μl 活性化仔牛胸腺DNA
C:1.5mM dNTP(250cpm/pmol [3H]dTTP)
D:20% トリクロロ酢酸(2mMピロリン酸ナトリウム)
E:1mg/mL仔牛胸腺DNA
この操作の後、ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はSDS−PAGEによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。
例えば、下記のPCNA変異体において、改変前のアミノ酸配列は、配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列であってもよい。
本明細書では、DNA Databank of Japan(DDBJ)のClustalW(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php/lang=ja)においてデフォルト(初期設定)のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較する。
(a)82、84、109番目に相当するアミノ酸からなるN末端領域、または
(b)139、143、147番目に相当するアミノ酸からなるC末端領域に少なくともひとつの改変を有し、RFCがなくともDNAにロードし、DNAポリメラーゼの伸長反応を促進する変異体があげられる。
本明細書において、置換する塩基性アミノ酸、中性アミノ酸の種類は特に限定されない。塩基性アミノ酸としては、天然のものであれば、アルギニン、ヒスチジン、リシン、中性アミノ酸としては、天然のものであれば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。
増幅対象DNAに、
(a)ファミリーBに属するDNAポリメラーゼ
(b)一方のプライマーが他方のプライマーのDNA伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
(c)DNA合成基質(デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP))
(d)マグネシウムイオン、及び/またはアンモニウムイオン及び/または、カリウムイオンを含むバッファー溶液、および、
(e)PCNA
を、混合し、サーマルサイクラー等を用いて反応液の温度を上下させることにより、(1)DNA変性、(2)プライマーのアニーリング、(3)プライマーの伸長の熱サイクルを繰り返し、特定のDNA断片を増幅させる。
上記PCR法においては、必要に応じて、さらに、PCR増強因子、BSA、非イオン界面活性剤などを用いてもよい。また、DNAポリメラーゼに、減少した塩基類似体検出活性を有するような改変を施した変異体を用いる場合は、dUTPなどの塩基類似体をDNA合成基質として用いることが可能である。
(a)ファミリーBに属するDNAポリメラーゼ
(b)一方のプライマーが他方のプライマーのDNA伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
(c)DNA合成基質(デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP))
(d)マグネシウムイオン、及び/またはアンモニウムイオン、及び/またはカリウムイオンを含むバッファー溶液、および、
(e)PCNA
サーモコッカス・コダカラエンシス KOD1株由来の改変型耐熱性PCNA遺伝子を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるDNA鋳型は、pBluescriptにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス KOD1株由来のPCNA(配列番号15)(pKOD PCNA)を用いた。変異導入にはKOD −Plus− Mutagenesis Kit(TOYOBO)を用いて、方法は取扱説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリDH5αを形質転換し、酵素調製に用いた。
パイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性PCNA遺伝子を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるDNA鋳型は、pBluescriptにクローニングされたパイロコッカス・フリオサス株由来のPCNA(配列番号16)(pPfu PCNA)を用いた。変異導入にはKOD −Plus− Mutagenesis Kit(TOYOBO)を用いて、方法は取扱説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリDH5αを形質転換し、酵素調製に用いた。
後述の実施例におけるPCNAの評価に用いるために、KOD DNAポリメラーゼの種々の変異体を以下の方法で作製した。
サーモコッカス・コダカラエンシス KOD1株由来の改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるDNA鋳型は、pBluescriptにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス KOD1株由来の改変型耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子(配列番号17)(pKOD)を用いた。変異導入にはKOD −Plus− Mutagenesis Kit(TOYOBO)を用いて、方法は取扱説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリJM109を形質転換し、酵素調製に用いた。作製したプラスミドは表2に示す。
実施例1または2で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した100μg/mLのアンピシリンを含有するTB培地(Molecular cloning 2nd edition、p.A.2)80mLを500mL坂口フラスコに分注した。この培地に予め100μg/mLのアンピシリンを含有する3mLのLB培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム;ギブコ)で37℃、16時間培養したエシェリシア・コリDH5α(プラスミド形質転換株)(試験管使用)を接種し、37℃にて16時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、50mLの破砕緩衝液(30mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、30mM NaCl、0.1mM EDTA)に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を80℃にて15分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Qセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液(50mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイトール、0.1% Tween20、0.1%ノニデットP40、50%グリセリン)に置換し、改変型耐熱性PCNAを得た。
実施例3で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した100μg/mLのアンピシリンを含有するTB培地(Molecular cloning 2nd edition、p.A.2)80mLを500mL坂口フラスコに分注した。この培地に予め100μg/mLのアンピシリンを含有する3mLのLB培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム;ギブコ)で37℃、16時間培養したエシェリシア・コリJM109(プラスミド形質転換株)(試験管使用)を接種し、37℃にて16時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、50mLの破砕緩衝液(30mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、30mM NaCl、0.1mM EDTA)に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を80℃にて15分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液(50mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイトール、0.1% Tween20、0.1%ノニデットP40、50%グリセリン)に置換し、改変型耐熱性DNAポリメラーゼを得た。これら精製工程のDNAポリメラーゼ活性測定は、上述のDNAポリメラーゼ活性測定法にしたがって測定した。
PCNAが単独でDNAにロードできるかを確認するため、KOD−PCNA変異体(M73L、M73L/E143R、M73L/R109A/E143A、M73L/D147A、M73L/R82A/E143A、M73L/E143F、M73L/E143A)を用いてdUTP存在下PCRでの増幅量の違いを、増幅増強活性の測定方法に従い、Human β−グロビンの1.3kbを増幅することで比較した。この際、DNAポリメラーゼには、実施例3および5で作製したKOD V93K変異体を用いた。なお、上述のとおり、M73L変異を野生型に相当するものとみなす。
PCRにはKOD −Plus− Ver.2(TOYOBO)添付のBuffer、MgSO4を用い、1×PCR Buffer、および0.2mM dTTPをdUTPに置換したdNTPs(dATP、dUTP,dCTP、dGTP)、1.5mM MgSO4、15pmolのプライマー(対)(配列番号13及び14)、10ngのヒトゲノムDNA(ロッシュ・アプライド・サイエンス)、抗体と混合した1Uの酵素を含む50μlの反応液を調製し、94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→60℃、30秒→68℃、1分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(アプライドバイオシステムズ)を用いてPCRを行った。反応終了後、5μlの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
今回用いたKOD V93K変異体はdUTPの阻害を受けて増幅量が少ない。PCNA添加なしやM73L変異体ではほとんどバンドが確認されなかったが、他のKOD−PCNA変異体の添加でしっかりとしたバンドが確認された。PCNAは多量体を形成し核酸の合成反応を促進するが、通常、RFCの働きなしではDNAにロードできず反応が進まない。M73L/E143R、M73L/R109A/E143A、M73L/D147A、M73L/R82A/E143A、M73L/E143F、M73L/E143Aの改変は、多量体形成に関わる部位への改変であり、適度に多量体形成が弱まったため、PCNAが単独でDNAにロードでき、PCR増幅量を向上させたことが考えられる。
PCNAが、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼの正確性に影響を及ぼすか検証した。ファミリーBに属するDNAポリメラーゼとして、KOD −Plus− DNAポリメラーゼ(TOYOBO)、PrimeSTAR DNAポリメラーゼ(タカラバイオ)を使用した。また、PCNAは単独でDNAにロードする変異体の例として、KOD −Plus− DNAポリメラーゼに対しては、KOD−PCNA変異体(M73L/D147A)、PrimeSTAR DNAポリメラーゼに対しては、Pfu−PCNA変異体(M73L/D143R)を使用した。
(1)ミスマッチエラーの頻度
まず、PCRにはKOD −Plus− Ver.2(TOYOBO)添付のBuffer、MgSO4、dNTPsを用い、1×PCR Buffer、および0.2mM dNTPs(dATP、dTTP,dCTP、dGTP)、1.5mM MgSO4、15pmolのプライマー(配列番号18及び19)、50ngのヒトゲノムDNA(ロッシュ・アプライド・サイエンス)、1U KOD −Plus−、100ng KOD−PCNA変異体(M73L/D147A)と混合し、50μlの反応液を調製した。
この反応液を94℃、2分の前反応の後、94℃、15秒→60℃、30秒→68℃、2.5分を21サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(アプライドバイオシステムズ)を用いてPCRを行った。本PCR産物は、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有するファミリーBに属するDNAポリメラーゼを使用しているため3’末端が平滑化されている。そのため、PCR産物の平滑末端へのアデニン付加後、TAクローニングを実施した。具体的には、アデニン付加、TAクローニングには、TArget Clone −Plus−(TOYOBO)を用いて、方法は取扱説明書に準じて行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリDH5αを形質転換し、アンピシリンを含むLB寒天培地に播種後、37度で一晩培養した。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むLB培地にて培養し、プラスミドを抽出後、シークエンスを実施した。シークエンス反応は、BigDye Termination v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ)を用い、製品の取扱説明書に準じてシークエンス反応を行った。解析には、Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer(アプライドバイオシステムズ)を使用し、配列番号20のプライマーをシークエンスプライマーとして用いて解析を実施した。
KOD−PCNAがKOD −Plus− DNAポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、PCNA添加有り、無しのエラー率を比較することにより実施した。エラー率は、解析が完了した塩基数に対する間違えて取り込まれた塩基数(エラー塩基数)の割合を算出することで求めた。
前記(1)の方法に従って、PCRを行い、得られたPCR産物のTAクローニングを実施した後、得られたプラスミドによりエシェリシア・コリDH5αを形質転換し、アンピシリンを含むLB寒天培地に播種後、37度で一晩培養した。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むLB培地にて培養し、プラスミドを抽出、(A)12のリピート配列を含む領域のシークエンスを実施した。シークエンス反応は、配列番号20のプライマーをシークエンスプライマーとして用いて、前記(1)と同様に実施した。KOD−PCNAがKOD −Plus− DNAポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、シークエンス結果より、(A)12のリピート配列に対して、挿入や欠損に関するエラーの割合を求めることで実施した。
上記解析は、PCRをN=2で実施し、その後、独立してシークエンス解析まで実施した。
(1)ミスマッチエラーの頻度
まず、PCRにはPrimeSTAR HS DNA Polymerase(タカラバイオ)添付のBufferである5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+ plus)、dNTP Mixtureを用い、1×PCR Buffer(Mg含有)、および0.2mM dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、15pmolのプライマー対(配列番号18及び19)、50ngのヒトゲノムDNA(ロッシュ・アプライド・サイエンス)、1,25U PrimeSTAR HS DNA Polymerase、100ng Pfu−PCNA変異体(M73L/D143R)と混合し、50μlの反応液を調製した。
この反応液を、98℃、10秒→55℃、5秒→72℃、2.5分を23サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(アプライドバイオシステムズ)を用いてPCRを行った。本PCR産物は、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有するファミリーBに属するDNAポリメラーゼを使用しているため3’末端が平滑化されている。そのため、PCR産物の平滑末端へのアデニン付加後、TAクローニングを実施した。具体的には、アデニン付加、TAクローニングには、TArget Clone −Plus−(TOYOBO)を用いて、方法は取扱説明書に準じて行った。
得られたプラスミドによりエシェリシア・コリDH5αを形質転換し、アンピシリンを含むLB寒天培地に播種後、37度で一晩培養した。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むLB培地にて培養し、プラスミドを抽出後、シークエンスを実施した。シークエンス反応は、BigDye Termination v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ)を用い、製品の取扱説明書に準じてシークエンス反応を行った。解析には、Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer(アプライドバイオシステムズ)を使用し、配列番号20のプライマーをシークエンスプライマーとして用い、解析を実施した。
Pfu−PCNAがPrimeSTAR DNAポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、PCNA添加有り、無しのエラー率を比較することにより実施した。
前記(1)の方法に従って、PCRを行い、得られたPCR産物のTAクローニングを実施した後、得られたプラスミドによりエシェリシア・コリDH5αを形質転換し、アンピシリンを含むLB寒天培地に播種後、37度で一晩培養した。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むLB培地にて培養し、プラスミドを抽出、(A)12のリピート配列を含む領域のシークエンスを実施した。シークエンス反応は、BigDye Termination v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ)を用い、製品の取扱説明書に準じてシークエンス反応を行った。解析には、Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer(アプライドバイオシステムズ)を使用し、リピート配列を含む領域の解析を実施するために、配列番号20のプライマーをシークエンスプライマーとして用いた。
Pfu−PCNAがPrimeSTAR DNAポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、シークエンス結果より、(A)12のリピート配列に対して、挿入や欠損に関するエラーの割合を求めることで実施した。
KOD −Plus− DNAポリメラーゼを用いてPCNA添加なしで増幅した場合のエラー率とPCNA添加ありで増幅した場合のエラー率を求めた結果を表3に記す。PCNA添加なしでは、エラー塩基数が、33450塩基あたり3個であるのに対し、PCNAを添加することで、33598塩基あたり0個に減少することが示された。エラー割合としては、8.97×10−5から0に減少しており、PCNA添加により正確性が向上することが示された。
KOD −Plus− DNAポリメラーゼをPCNA添加なしで増幅した場合のリピート配列部分の塩基数とPCNA添加ありで増幅した場合のリピート配列部分の塩基数をカウントした結果を図2に記す。PCNA添加なしでは、エラーのないクローン数が60%以下であるのに対し、PCNAを添加することで、10%もエラー率が低減し、70%程度まで正確性が向上することが示された。
KOD−PCNAが、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーBに属するDNAポリメラーゼの正確性に影響を及ぼすか検証した。減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーBに属するDNAポリメラーゼの例として、実施例3および5で作製したKOD H147E/P36H/Y7A変異体、KOD H147E/V93K/Y7A変異体を使用し、またPCNAは、KOD−PCNA変異体(M73L/D147A)を使用した。
減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーBに属するDNAポリメラーゼを用いてPCNA添加なしで増幅した場合のエラー率とKOD−PCNA添加ありで増幅した場合のエラー率を求めた結果を表5に記す。KOD−PCNA添加なしでは、エラー塩基数が、28787塩基あたり5個であるのに対し、KOD−PCNAを添加することで、28787塩基あたり2個に減少することが示された。エラー割合としては、1.74×10−4から5.97×10−5に減少しており、PCNA添加により正確性が向上することが示された。この結果より、PCNAは、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーBに属するDNAポリメラーゼに対しても効果があり、正確性が必要なPCRにおいて利用が期待される。
(A)12のリピート配列に対して、挿入や欠損に関するエラーの割合を図4に示す。2種類の減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーBに属するDNAポリメラーゼに対して評価を実施した結果、PCNA添加なしでは、エラーのないクローン数が60%程度であるのに対し、PCNA添加によりエラー率が、10〜20%低減することが示された。この結果より、PCNAは、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーBに属するDNAポリメラーゼに対しても効果があり、正確性が必要なPCRにおいて利用が期待される。
Methanocaldococcus_jannaschii株由来の改変型耐熱性PCNA遺伝子を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるDNA鋳型は、pET23bにクローニングされたMethanocaldococcus_jannaschii株由来のPCNA(配列番号22)(pMja PCNA)を用いた。変異導入にはKOD −Plus− Mutagenesis Kit(TOYOBO)を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリBL21(DE3)pLysSを形質転換し、酵素調製に用いた。作製したプラスミドは表6に示す。
実施例9で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した100μg/mLのアンピシリンを含有するLB培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム;ギブコ製)80mLを500mL坂口フラスコに分注した。この培地に予め100μg/mLのアンピシリンを含有する3mLのLB培地で37℃、16時間培養したエシェリシア・コリBL21(DE3)pLysS(プラスミド形質転換株)(試験管使用)を接種し、37℃にてOD600が0.3〜0.6になるまで通気培養した。その後、IPTGを終濃度0.5mMになるように添加し、4時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、50mLの破砕緩衝液(30mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、30mM NaCl、0.1mM EDTA)に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を80℃にて15分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Qセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液(50mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイトール、0.1% Tween20、0.1%ノニデットP40、50%グリセリン)に置換し、Mja−PCNA変異体を得た。
Mja−PCNAが、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーBに属するDNAポリメラーゼの正確性に影響を及ぼすか検証した。減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーBに属するDNAポリメラーゼの例として、実施例3および5で作製したKOD H147E/V93K/Y7A変異体を使用し、またPCNAは、実施例9および10で作製したMja−PCNA変異体(E142R)を使用した。
(1)ミスマッチエラーの頻度
まず、PCRにはKOD FX(TOYOBO)添付のBuffer、dNTPsを用い、1×PCR Buffer、および0.2mM dNTPs(dATP、dTTP,dCTP、dGTP)、15pmolのプライマー(配列番号18及び19)、50ngのヒトゲノムDNA(ロッシュ・アプライド・サイエンス)、1.5U KOD H147E/V93K/Y7A変異体、1000ng Mja−PCNA変異体(E142R)と混合し、50μlの反応液を調製した。
この反応液を94℃、2分の前反応の後、94℃、15秒→60℃、30秒→68℃、2.5分を21サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(アプライドバイオシステムズ)を用いてPCRを行った。本PCR産物は、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有するファミリーBに属するDNAポリメラーゼを使用しているため3’末端が平滑化されている。そのため、PCR産物の平滑末端へのアデニン付加後、TAクローニングを実施した。具体的には、アデニン付加、TAクローニングには、TArget Clone −Plus−(TOYOBO)を用いて、方法は取扱説明書に準じて行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリDH5αを形質転換し、アンピシリンを含むLB寒天培地に播種後、37度で一晩培養した。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むLB培地にて培養し、プラスミドを抽出後、シークエンスを実施した。シークエンス反応は、BigDye Termination v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ)を用い、製品の取扱説明書に準じてシークエンス反応を行った。解析には、Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer(アプライドバイオシステムズ)を使用し、配列番号20のプライマーをシークエンスプライマーとして用いて解析を実施した。
KOD−PCNAが減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーBに属するDNAポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、PCNA添加有り、無しのエラー率を比較することにより実施した。エラー率は、解析が完了した塩基数に対する間違えて取り込まれた塩基数(エラー塩基数)の割合を算出することで求めた。
前記(1)の方法に従って、PCRを行い、得られたPCR産物のTAクローニングを実施した後、得られたプラスミドによりエシェリシア・コリDH5αを形質転換し、アンピシリンを含むLB寒天培地に播種後、37度で一晩培養した。得られたコロニーを複数ピックアップし、アンピシリンを含むLB培地にて培養し、プラスミドを抽出、(A)12のリピート配列を含む領域のシークエンスを実施した。シークエンス反応は、配列番号20のプライマーをシークエンスプライマーとして用いて、前記(1)と同様に実施した。KOD−PCNAがKOD −Plus− DNAポリメラーゼに与える正確性への影響評価は、シークエンス結果より、(A)12のリピート配列に対して、挿入や欠損に関するエラーの割合を求めることで実施した。
減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーBに属するDNAポリメラーゼを用いてPCNA添加なしで増幅した場合のエラー率とMja−PCNA添加ありで増幅した場合のエラー率を求めた結果を表7に記す。Mja−PCNA添加なしでは、エラー塩基数が、44529塩基あたり8個であるのに対し、Mja−PCNAを添加することで、42100塩基あたり3個に減少することが示された。エラー割合としては、1.79×10−4から7.13×10−5に減少しており、PCNA添加により正確性が向上することが示された。
この結果より、PCNAは、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーBに属するDNAポリメラーゼに対しても効果があり、正確性が必要なPCRにおいて利用が期待される。
減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーBに属するDNAポリメラーゼを用いてPCNA添加なしで増幅した場合のリピート配列部分の塩基数とMja−PCNA添加ありで増幅した場合のリピート配列部分の塩基数をカウントした結果を図5に記す。PCNA添加なしでは65%以下であるのに対し、Mja−PCNAを添加することで、6%もエラーが低減し、70%程度まで正確性が向上することが示された。
この結果より、Mja−PCNAについても、減少した塩基類似体検出活性を持つファミリーBに属するDNAポリメラーゼに対しても効果があり、正確性が必要なPCRにおいて利用が期待される。
Claims (12)
- ファミリーBに属するDNAポリメラーゼ及びProliferating Cell Nuclear Antigen(PCNA)を反応液中で共存させることにより、核酸増幅におけるスリッページエラーを低減させる方法。
- PCNAが単独でDNAにロードする変異体である請求項1に記載の方法。
- PCNAが、(a)82、84、109番目に相当するアミノ酸からなるN末端領域、および(b)139、143、147番目に相当するアミノ酸からなるC末端領域のうち、少なくともひとつの改変を有する変異体である、請求項1または2に記載の方法。
- PCNAが配列番号1または2に記載のアミノ酸配列において、143番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸あるいは中性アミノ酸に改変したもの、または、82番目と143番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、147番目を中性アミノ酸に改変したもの、109番目と143番目を共に中性アミノ酸に改変したもののいずれかの変異体である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- PCNAが配列番号21に記載のアミノ酸配列において、142番目のアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変した変異体である請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- ファミリーBに属するDNAポリメラーゼが、古細菌(Archea)由来のDNAポリメラーゼである請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- ファミリーBに属するDNAポリメラーゼが、パイロコッカス(Pyrococcus)属またはサーモコッカス(Thermococcus)属の細菌から単離されるDNAポリメラーゼである請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- ファミリーBに属するDNAポリメラーゼが減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌DNAポリメラーゼ変異体である請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 更に、核酸増幅におけるミスマッチエラーを低減することを特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- リピート配列を含む核酸を鋳型として用いる場合のスリッページエラーを低減することを特徴とする請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の方法を行うための試薬であって、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼ及びProliferating Cell Nuclear Antigen(PCNA)を含む試薬。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の方法を行うための試薬を含むキットであって、少なくとも以下の(a)及び(b)を含むように構成されているキット:
(a)ファミリーBに属するDNAポリメラーゼ、
(b)Proliferating Cell Nuclear Antigen(PCNA)。
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