KR20080031255A - 변이형 ｐｃｎａ - Google Patents

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사토시 히하라
다카시 구도우
아키라 가와무라
히로후미 도이
요시즈미 이시노
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셀레스타 렉시코-사이언시즈 가부시키가이샤
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Abstract

범용성이 우수하고, 사용하기 쉬운 DNA 복제 반응계를 구축하는 것을 과제로 한다. DNA 복제에 관여하는 인자의 하나인 PCNA의 단량체의 아미노산 배열을, 단량체의 N 말단측 영역과 다른 단량체의 C 말단측 영역이 계면이 되어 다량체를 형성한 경우에, 각 단량체의 계면영역에서 단량체 상호의 분자가 상호작용을 형성하는 부위의 아미노산 잔기가 전하적으로 서로 반발하는 아미노산 잔기로 구성되도록 조제한다.

Description

변이형 ＰＣＮＡ{MUTANT PCNA}
본 발명은 DNA 복제인자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 DNA 복제를 보조하는 기능이 우수한 PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen, 증식 핵 항원)에 관한 것이다.
유전자 증폭기술과 PCR법
DNA나 RNA 등의 핵산을 증폭하는 기술은 유전자 공학 기술 등의 발전에 따라 기초연구부터 산업이용까지 널리 침투되어 오고 있다. 초기에는, 특정의 표적(標的) 핵산배열을 얻기 위해서는 효모나 대장균 숙주 내에서 증폭한 핵산으로부터 필요한 배열을 제한효소로 잘라내어 조제하는 방법이 일반적이었으나, 마리스 등의 PCR법의 개발과 보급에 의하여 표적으로 하는 특정의 핵산영역을 시험관 내에서 증폭하는 것이 가능하게 되었다. PCR법은 전용장치나 관련시약의 활발한 상품화, 판매와 평행하게 다양한 연구상, 산업상의 어플리케이션 개발이 행하여졌기 때문에, 실질적으로 유전자 증폭기술의 스탠타드가 되었다. DNA 복제의 연구가 진행됨에 따라 PCR이라는 원리를 달리하는 각종 기술이 고안·개발되고는 있으나, 조작성·비용·품질상의 관점에서 일반성은 부족하여 PCR법을 일축할 정도의 기술은 등장하고 있지 않다.
PCR법의 평가 포인트
PCR법의 원리는 세포 내에서의 DNA 복제를 최소한으로 모방한 형이라고 생각된다. 즉, 1) 표적이 되는 핵산 주형(鑄型)의 열변성에 의한 해리, 2) 표적 배열과 상보적인 1쌍의 프라이머와의 대합(對合), 3) DNA 폴리머라아제(polymerase)에 의한 프라이머의 주형 상보적인 신장반응이다. 이들 반응을 연속적으로 반복함으로써, 목적의 핵산 배열을 지수함수적으로 증폭한다. 일반적인 PCR의 프로토콜에서는 ng 오더의 주형의 수 kb의 표적 배열을 2시간 정도의 반응으로 ㎍ 오더까지 증폭하는 일이 많다.
PCR법에는 기술적 제약이 있고, 대표적으로는 다음의 4점을 들 수 있다. 1) 주형에 대한 충실성(주형에 대응한 정확한 배열을 증폭하는 성능), 2) 신장성(보다 긴 배열을 증폭하는 성능), 3) 표적 배열의 증폭효율, 4) 반응특이성의 4점이다. 동시에, 이들은 PCR 기술을 평가하는 포인트로서 받아들여지는 일도 많다. 이들 제약을 극복하는 것을 목표로 PCR용 시약·키트의 개발이 진행되고 있다.
PCR의 개선
초기의 PCR용 DNA 폴리머라아제로서는 호열균 Thermus·aquaticus 유래의 DNA 폴리머라아제(Taq DNA 폴리머라아제)가 일반적이었다(비특허문헌 1). 본 효소를 기본으로 하여, 그 후 여러가지 PCR용 효소 또는 시약·키트가 개발, 판매되고 있다. 이들은 상기 설명한 기술제약 포인트에 대하여 개량되는 일이 많고, 이들 특징을 가지는 시약·키트가 각 제조회사로부터 판매되고 있다. 이하에 PCR법의 개선의 일례를 소개한다.
주형에 대한 충실성을 향상시키는 예로서는, 고(高)충실도형의 DNA 폴리머라아제를 PCR법에 사용하는 것이 일반적이다. Taq DNA 폴리머라아제는 5'→3' 폴리머라아제 활성만을 가지고, 3'→5' 엑소뉴클리아제(exonuclease) 활성을 유지하지 않는 타입의 Pol I형 DNA 폴리머라아제이다. 이에 대하여 초호열성 고세균 Pyrococcus·furiosus 유래의 DNA 폴리머라아제는 5'→3' 폴리머라아제 활성과 3'→5' 엑소뉴클리아제 활성의 양자를 유지하는 α형 DNA 폴리머라아제이다. 3'→5' 엑소뉴클리아제 활성은 교정(校正)활성으로서 기능한다. 이 때문에, 이 DNA 폴리머라아제를 PCR 반응에 사용한 경우, 3'→5' 엑소뉴클리아제 활성을 유지하지 않는 Taq 폴리머라아제와 비교하여 증폭시의 주형 충실도가 비약적으로 향상한다(비특허문헌 2).
이와 같은 DNA 폴리머라아제 중 시판화되고 있는 제품의 예로서는, Pyrobest DNA 폴리머라아제(타카라바이오사), Pfu DNA 폴리머라아제(스트라타진사), KOD DNA 폴리머라아제(토요보사), DeepVent DNA 폴리머라아제(New England Biolabs(NEB)사), Vent DNA 폴리머라아제(NEB사), Pwo DNA 폴리머라아제(로셰 다이아그노스틱스사)가 있다.
Barns들은 교정기능을 유지하는 α형 DNA 폴리머라아제와 교정기능을 유지하지 않는 Pol I형 DNA 폴리머라아제를 적절한 비율로 혼합하여 PCR 반응에 사용하면, 신장 가능한 표적 배열이 길어지고, 증폭효율도 아울러 향상하는 것을 보고하고 있다(비특허문헌 3, 특허문헌 1). 이와 같은 혼합형 DNA 폴리머라아제로 시판화되고 있는 제품예로서는, TaKaRa EX Taq DNA 폴리머라아제(타카라바이오사), Taq Plus Long(스트라타진사) 등이 있다.
PCR의 반응특이성의 향상의 일례로서는 핫 스타트법이 알려져 있다. PCR 반응의 비특이성은 주로 주형 DNA에 프라이머가 비특이적으로 어닐링하는 것이 원인으로 일어나는 일이 많다. 이것을 방지하기 위해서는 고온하에서 PCR 반응액의 완전한 혼합을 행한 직후에 PCR 반응을 개시시키는 핫 스타트법이 효과적이다. 핫 스타트법에는 몇가지 방법이 보고되어 있으나, 현재의 주류는 DNA 폴리머라아제와 그 특이적 항체로 복합체를 형성시켜, 저온조건에서는 불활성형으로 해 두고, 핫 스타트시의 고온조건에서 처음으로 활성화시켜 PCR 반응을 행하는 것이다. 이 방법으로 PCR 반응의 특이성이 높아지는 것이 보고되어 있다(특허문헌 2). 이 핫 스타트법에 대응한 제품도 각 유전자 공학 제조회사로부터 판매되고, 일반적으로 이용되고 있다.
상기 설명한 PCR법의 개선법은 모두 실용성이 있어 제품화되고 일반적으로 이용되고 있으나, 모두 일장일단(一長一短)이 있고, 앞서 나타낸 PCR법의 모든 개선점을 동시에 만족시키는 것은 아니다. 예를 들면, 고충실도형의 α형 DNA 폴리머라아제는 Pol I형 DNA 폴리머라아제와 비교하여 신장성이 열화하는 일이 많고, 또 α형과 Pol I형 DNA 폴리머라아제를 혼합하는 PCR법에서는 고충실도형 DNA 폴리머라아제의 충실도에는 미치지 못한다. 모든 포인트에 우수한 DNA 폴리머라아제 또는 DNA 증폭계가 대망되고 있다.
DNA 복제과정
일반적으로 DNA 복제 개시에는, 먼저 복제 기점의 2개 사슬 구조가 풀려져 있을 필요가 있는데, 그것에는 DNA 헬리카아제(helicase)가 필요하다. 풀려진 DNA에는 1개 사슬 DNA 결합 단백질이 결합하여 1개 사슬이 안정화된다. 또한, 각각의 사슬 상에 프라이머를 합성하기 위한 프라이머제가 작용한다. 다음에 복제인자 Replication Factor C(RFC)가 프라이머를 인식하여 결합하여, 증식 핵 항원(PCNA)을 DNA 사슬 상으로 유도한다. PCNA는 DNA 폴리머라아제를 DNA 사슬 상에 멈춰 두기 위한 클램프의 역할을 한다. 그리고, PCNA와 복합한 DNA 폴리머라아제가 신생사슬을 합성한다. 연속합성에서는 그대로 긴 신생사슬이 합성되나, 불연속합성쪽에서는 각 Okazaki 단편에 부수하는 RNA 프라이머가 뉴클리아제로 분해되고, DNA 사슬로 치환된 후 DNA 리가아제가 단편 사이를 결합하여, 1개의 신생사슬이 완성된다(비특허문헌 4 및 5).
Pfu-PCNA와 RFC
Pyrococcus·furiosus PCNA(이하 「Pfu-PCNA」또는「PfuPCNA」라고도 표기함)는 분자량 28.0 kDa이고, Pfu-PCNA는 진핵생물의 PCNA과 마찬가지로 호모 삼량체를 형성하고, 폴리머라아제와 상호 작용하여 기능하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 6). 한편, Pyrococcus furiosus RFC(이하 「Pfu-RFC」또는「PfuRFC」라고도 표기함)는 RFCS와 RFCL의 서브 유닛 구조를 취한다. Pfu-RFCS의 오픈 리딩 프레임은 인테인을 1부분 코드하고, 성숙형 Pfu-RFCS의 분자량은 37.4 kDa이다. Pfu-RFCL의 분자량은 55.3 kDa이다. 프라이머 엑스텐션 시험에서 Pfu-RFC, Pfu-PCNA의 첨가는 Pfu DNA 폴리머라아제의 DNA 신장활성을 현저하게 촉진하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 7).
Pfu-PCNA의 구조와 성질
Pfu-PCNA는 결정구조 해석이 행하여져 있다(비특허문헌 8). 그것에 의하면, Pfu-PCNA 삼량체는 2개의 서브 유닛의 anti-parallel β strand(βI1과 βD2) 사이의 주사슬의 수소결합(T108-K178, T110-E176, R112-E174)에 의하여 형성되고, 또한 산성·염기성 아미노산 측쇄에 의한 분자간의 이온쌍 네트워크가 삼량체구조의 유지에 관여하고 있다. 또한 그 이온쌍 네트워크에 관여하는 잔기(N 말단측 영역의 R82, K84, R109와 C 말단측 영역의 E139, D143, D147) 중 D143, D147을, 중성 아미노산인 아라닌으로 치환한 변이체 2종〔PfuPCNA(D143A)와 PfuPCNA(D143A/D147A)〕에 관하여 조사한 논문이 있다(비특허문헌 9). 논문에는 PfuPCNA(D143A)과 PfuPCNA(D143A/D147A)가 겔 여과로 단량체의 위치에 용출하는 것, 결정에서는 삼량체가 아니라 V-shaped dimers로서 얻어지는 것 외, 프라이머 엑스텐션 시험에 있어서의 활성측정결과의 기술이 있다. 그것에 의하면, PfuPCNA(D143A/D147A)는 PCNA 단독시, RFC 병용시의 어느 쪽의 경우도 DNA 합성 촉진 활성을 나타내지 않으나, PfuPCNA(D143A)는 RFC의 유무에 관계없이 DNA 합성 촉진 활성을 나타내고, 또한 PCNA 단독시의 경우에는 야생형보다도 우수한 결과를 나타내었다고 되어 있다.
KOD-PCNA와 RFC
KOD-PCNA(이하, 「KOD-PCNA」 또는 「KODPCNA」라고도 표기함)와 KOD-RFC(이하, 「KOD-RFC」 또는 「KODRFC」라고도 표기함)는 Thermococcus·kodakaraensis KOD-1주로부터 얻어지는 PCNA와 RFC이다.
KOD-PCNA에 대해서는 비특허문헌 12에 의하여 보고되어 있다. 보고에 의하 면, KOD-PCNA는 249 잔기를 가지고, 계산상의 분자량은 28.2 kDa이다. 앞서 보고된 Pfu-PCNA도 249 잔기를 가지며, 양자의 아미노산 배열은 84.3%가 일치하고 있다. 또, KOD-PCNA는 Pfu-PCNA와 마찬가지로 PCNA에 특징적인 모든 보존영역을 유지하고 있고, KOD-PCNA의 결정구조 해석은 행하여져 있지는 않지만, Pfu-PCNA와의 높은 상동성(相同性)으로부터 추측하여 Pfu-PCNA 동일한 형태로 호모 삼량체를 형성할 가능성이 높은 것이 기록되어 있다.
KOD-RFC에 대해서는 비특허문헌 10에 의하여 보고되어 있다. 보고에 의하면, KOD-RFC는 다른 RFC와 마찬가지로 RFCL과 RFCS의 서브 유닛구조를 취한다. RFCL은 분자량 57.2 kDa 이다. RFCS 유전자는 오픈 리딩 프레임 중에 인테인을 1부분 코드하고, 성숙형 KOD-RFCS의 분자량은 37.2 kDa이다.
상기 설명한 2보고는 KOD-PCNA, KOD-RFC를 KOD-DNA 폴리머라아제에 의한 DNA 합성계에 첨가한 경우의 효과에 관해서도 보고하고 있다. 보고에 의하면, 프라이머 신장실험의 경우는 KOD-PCNA를 단독 첨가 또는 KOD-RFC와의 공존하에서 신장활성을 촉진하고, PCR 반응계에서는 KOD-PCNA 첨가시에는 「Sensitivity」가 향상한다고 기록되어 있다.
특허문헌 1 : 미국 특허 제5,436,149호 공보
특허문헌 2 : 미국 특허 제5,338,671호 공보
비특허문헌 1 : Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi. R., Horn, G.T., Mullis, K.B. and Erlich, H. A. Science 239, 487 내지491(1988)
비특허문헌 2 : Cline, JC Braman, and HH Hogrefe Nucl. Acids Res. 24, 3546 내지 3551(1996)
비특허문헌 3 : Barnes, W. M Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 2216 내지 2220(1994)
비특허문헌 4 : Waga, S. and Stillman, B, Annu. Rev. Biochem. 67, 721 내지 751(1998)
비특허문헌 5 : Kornberg, A. and Baker, T. A. DNA replication, 2nd ed. W. H. Freeman, New York.(1992)
비특허문헌 6 : Cann et al, J. Bacteriol, 181, 6591 내지 6599(1999)
비특허문헌 7 : Cann et al, J. Bacteriol, 183, 2614 내지 2623(2001)
비특허문헌 8 : Matsumiya et al. Protein Sci., 10, 17 내지 23(2001)
비특허문헌 9 : Matsumiya et al. Protein Sci., 12, 823 내지 831(2003)
비특허문헌 10 : Kitabayashi et al. Biosci Biotechnol Biochem. Nov; 67(11) : 2373 내지 2380(2003)
비특허문헌 11 : Takagi et al. Appl Environ Microbiol. Nov; 63(11) : 4504 내지 4510(1997)
비특허문헌 12 : Kitabayashi et al. Biosci Biotechnol Biochem. Oct; 66(10) : 2194 내지 2200(2002)
상기와 같은 상황 하에서, 범용성이 우수하고, 사용하기 쉬운 DNA 증폭계를 구축하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 설명한 DNA 복제과정에서 이용되는 제(諸)인자(이하, 「액세서리 단백질」, 「AP」라고도 표기함)와 DNA 폴리머라아제로 세포 내 DNA 복제계를 시험관 내에서 재구축함으로써, 기존의 PCR 기술의 결점을 극복하는 신규한 DNA 증폭계를 작성하는 것을 시도하여 왔다. 특히, 3'→5' 엑소뉴클리아제 활성을 가지고, 주형 충실도가 높은 초호열성 고세균 Pyrococcus·furiosus 유래의 DNA 폴리머라아제, 및 세포 내 DNA 복제계의 제인자(액세서리 단백질) 중 DNA 폴리머라아제와 직접적으로 상호 작용할 가능성이 높은 PCNA와 RFC에 착안하여 예의연구를 진행하였다.
그 결과, 한쪽의 단량체의 N 말단측 영역과 다른 단량체의 C 말단측 영역이 계면이 되어 다량체를 형성한 경우에, 계면영역에 있어서 단량체 상호의 분자간 상호작용을 형성하는 부위의 아미노산 잔기가, 다른쪽의 단량체의 계면영역 내의 아미노산 잔기와 상호 전하적 반발을 일으키는 아미노산 잔기로 구성되도록 조제함으로써, RFC의 유무에 거의 의존하지 않고, 신장성과 충실성의 밸런스 좋게 DNA의 신장반응을 촉진할 수 있는 작용을 구비한 PCNA가 얻어진다고 하는 지견을 얻고 본 발명을 완성시키기에 이르렀다. 본 발명은 이하의 PCNA 등을 제공하는 것이다.
[1] PCNA 단량체에 있어서
단량체의 N 말단측 영역과 다른 단량체의 C 말단측 영역이 계면이 되어 다량체를 형성한 경우에, 각 단량체의 계면영역에서 단량체 상호의 분자간 상호작용을 형성하는 부위의 아미노산 잔기가 전하적으로 서로 반발하는 아미노산 잔기로 구성되고, 또한 단량체 그대로 또는 다량체를 형성하여 DNA 복제를 촉진하는 활성을 구비하는 변이형 PCNA 단량체.
[2] 상기 PCNA 단량체가 배열번호 2 또는 32에 기재된 아미노산 배열인 경우에 있어서의 제 82번째, 제 84번째, 제 109번째, 제 139번째, 제 143번째 및 제 147번째로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 위치의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 바꾼 아미노산 배열을 가지며,
하기 (i)군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기와, 하기 (ii)군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 전하적으로 서로 반발하는 아미노산 잔기에 의하여 구성되는 상기 [1]에 기재된 변이형 PCNA 단량체.
(i) 제 82번째, 제 84번째 및 제 109번째의 아미노산 잔기군
(ii) 제 139번째, 제 143번째 및 제 147번째의 아미노산 잔기군
[3] 또한, 제 82번째, 제 84번째, 제 109번째, 제 139번째, 제 143번째 및 제 147번째 이외의 부위에 부가, 삽입, 치환 및 결실(缺失)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 포함하는 상기 [2]에 기재된 변이형 PCNA 단량체.
[4] 배열번호 2 또는 32에 기재된 아미노산 배열에 있어서, 제 73번째의 아미노산 잔기를 로이신으로 바꾼 배열을 가지는 상기 [3]에 기재된 변이형 PCNA 단량체.
[5] 상기 (i)군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산과 상기 (ii)군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산이 양쪽 모두 산성 아미노산, 또는 양쪽 모두 염기성 아미노산인 상기 [2] 내지 [4] 중 어느 한 항에 기재된 변이형 PCNA 단량체.
[6] 배열번호 2 또는 32에 기재된 아미노산 배열에 있어서, 제 143번째의 아미노산 잔기를 아르기닌으로 바꾼 배열을 가지는 상기 [2] 내지 [5] 중 어느 한 항에 기재된 변이형 PCNA 단량체.
[7] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 한 항에 기재된 PCNA 단량체가 구비하는 아미노산 배열을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
[8] 상기 [7]에 기재된 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질전환체.
[9] 상기 [8]에 기재된 형질전환체를 배지에서 배양하고, 상기 형질전환체 및/또는 배지 중에 PCNA 단량체 및/또는 상기 단량체로 구성된 다량체를 축적시키는 것을 특징으로 하는 변이형 PCNA의 제조방법.
[10] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 한 항에 기재된 PCNA 단량체 및/또는 상기 단량체로 구성된 다량체를 포함하는 DNA 복제용 시약.
[11] 상기 [10]에 기재된 시약을 구비한 DNA 복제용 키트.
[12] PCR용 시약을 구비한 상기 [11]에 기재된 DNA 복제용 키트.
[13] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 한 항에 기재된 PCNA 단량체 및/또는 상기 단량체로 구성된 다량체 및 DNA 폴리머라아제의 존재하에서 DNA의 합성반응을 행하는 것을 특징으로 하는 DNA의 복제방법.
[14] 상기 DNA의 합성이 PCR인 상기 [13]에 기재된 DNA의 복제방법.
본 발명은 DNA 복제반응을 보다 촉진할 수 있도록 PCNA 단량체의 계면영역의 아미노산 배열을 특정한 것이다. 본 발명의 PCNA는 균주가 다른 다수의 DNA 폴리머라아제에도 적용성이 있고, 범용성이 높다. 또, 본 발명의 PCNA는 RFC를 병용하지 않는 경우에도 우수한 DNA 신장 촉진 활성을 발휘하는 점에 있어서 종래에 비하여 매우 특이한 성능을 발휘할 수 있는 것이다.
[발명의 효과]
본 발명에 의하여 DNA의 신장반응을 촉진하는 범용성이 높은 DNA 복제촉진인자가 제공된다. 본 발명에 의하여 신장성 및 반응속도 등의 제(諸)특성이 우수한 DNA의 신장반응을 행할 수 있다.
도 1은 PCNA의 삼량체를 모식적으로 나타내는 도,
도 2는 PCNA 단량체가 다량체를 형성하는 경우에, 단량체끼리의 접합부가 되는 계면영역에 있어서 형성되는 단량체 상호의 분자간 상호작용 부위의 일례를 나타내는 도,
도 3은 PCNA, RFC 유전자 발현 벡터의 조제 플로우를 나타내는 도,
도 4는 PCNA 유전자 발현 플라스미드(plasmid)를 나타내는 도,
도 5는 PCNA(단백질)의 조제 플로우를 나타내는 도,
도 6은 PCNA 단백질 표품(標品)의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(電氣泳動)의 결과를 나타내는 도,
도 7은 RFCL 발현 플라스미드를 나타내는 도,
도 8은 RFCSm 발현 플라스미드를 나타내는 도,
도 9는 RFC(단백질)의 조제 플로우를 나타내는 도,
도 10은 RFC 표품의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동의 결과를 나타내는 도,
도 11은 Pyrobest에 대한 각종 PCNA 변이체 및 RFC의 첨가효과(2 kb 증폭의 경우)를 나타내는 도,
도 12는 Pyrobest에 대한 각종 PCNA 변이체 및 RFC의 첨가효과(8.4 kb 증폭의 경우)를 나타내는 도,
도 13은 Pyrobest에 대한 각종 PCNA 변이체 및 RFC의 첨가효과(15.8 kb 증폭의 경우)를 나타내는 도,
도 14는 증폭길이 2 kb의 경우에 있어서의 Pyrobest에 대한 PCNA13 첨가효과를 신장시간별로 나타내는 도,
도 15는 증폭길이 8.4 kb의 경우에 있어서의 Pyrobest에 대한 PCNA13 첨가효과를 신장시간별로 나타내는 도,
도 16은 증폭길이 15.8 kb의 경우에 있어서의 Pyrobest에 대한 PCNA13 첨가효과를 신장시간별로 나타내는 도,
도 17은 증폭길이 2 kb의 경우에 있어서의 ExTaq에 대한 PCNA13 첨가효과를 신장시간별로 나타내는 도,
도 18은 증폭길이 8.4 kb의 경우에 있어서의 ExTaq에 대한 PCNA13 첨가효과를 신장시간별로 나타내는 도,
도 19는 증폭길이 15.8 kb의 경우에 있어서의 ExTaq에 대한 PCNA13 첨가효과를 신장시간별로 나타내는 도,
도 20은 증폭길이 2 kb의 경우에 있어서의 Vent DNA Polymerase에 대한 PCNA13 첨가효과를 신장시간별로 나타내는 도,
도 21은 증폭길이 8.4 kb의 경우에 있어서의 Vent DNA Polymerase에 대한 PCNA13 첨가효과를 신장시간별로 나타내는 도,
도 22는 증폭길이 2 kb의 경우에 있어서의 Deep Vent DNA Polymerase에 대한 PCNA13 첨가효과를 신장시간별로 나타내는 도,
도 23은 증폭길이 8.4 kb의 경우에 있어서의 Deep Vent DNA Polymerase에 대한 PCNA13 첨가효과를 신장시간별로 나타내는 도,
도 24는 Pfu Turbo DNA Polymerase에 대한 PCNA13 첨가효과를 나타내는 도,
도 25는 KOD DNA Polymerase에 대한 PCNA13 첨가효과를 나타내는 도,
도 26은 Pwo DNA Polymerase에 대한 PCNA13 첨가효과를 나타내는 도,
도 27은 KOD-PCNA 유전자 발현 벡터의 조제 플로우를 나타내는 도,
도 28은 KOD-PCNA 유전자 발현 플라스미드를 나타내는 도,
도 29는 KOD-PCNA 단백질의 조제 플로우를 나타내는 도,
도 30은 KOD-PCNA 단백질 표품의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동의 결과를 나타내는 도,
도 31은 KOD-RFCL 유전자 발현 벡터의 조제 플로우를 나타내는 도,
도 32는 KOD-RFCL 유전자 발현 플라스미드를 나타내는 도,
도 33은 KOD-RFCSm(성숙형 RFCS) 유전자 발현 벡터의 조제 플로우를 나타내는 도,
도 34는 KOD-RFCS 유전자 발현 플라스미드를 나타내는 도,
도 35는 KOD-RFC 단백질의 조제 플로우를 나타내는 도,
도 36은 KOD-RFC 단백질 표품의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동의 결과를 나타내는 도,
도 37은 KOD DNA 폴리머라아제에 대한 KOD-PCNA 변이체 및 KOD-RFC 첨가효과를 나타내는 도,
도 38은 Pyrobest에 대한 KOD-PCNA 변이체 및 KOD-RFC 첨가효과를 나타내는 도,
도 39는 PCR 주형 충실성의 측정 플로우를 나타내는 도,
도 40은 PCNA 단백질 표품의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동의 결과를 나타내는 도,
도 41은 Pyrobest에 대한 각종 PCNA 변이체 및 RFC의 첨가효과(2 kb 증폭의 경우)를 나타내는 도,
도 42은 Pyrobest에 대한 각종 PCNA 변이체 및 RFC의 첨가효과(8.4 kb 증폭의 경우)를 나타내는 도,
도 43은 Pyrobest에 대한 각종 PCNA 변이체 및 RFC의 첨가효과(15.8 kb 증폭의 경우)를 나타내는 도,
도 44는 Pyrobest에 대한 각종 PCNA 변이체 및 RFC의 첨가효과(2 kb 증폭의 경우)를 나타내는 도,
도 45는 Pyrobest에 대한 각종 PCNA 변이체 및 RFC의 첨가효과(8.4 kb 증폭 의 경우)를 나타내는 도,
도 46은 Pyrobest에 대한 각종 PCNA 변이체 및 RFC의 첨가효과(15.8 kb 증폭의 경우)를 나타내는 도면이다.
※ 도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명
1 : PCNA 삼량체
10a, 10b, 10c : PCNA 단량체
20 : PCNA 단량체끼리의 접합부
PCNA gene : PCNA 유전자 ORF
T7promoter : T7프로모터
rbs : 리보솜 결합 부위
T7terminator : T7터미네이터
Amp : 암피실린 내성 유전자
Ori : 복제 기점
RFCL gene : RFCL 유전자 ORF
RFCSm gene : 성숙형 RFCS 유전자 ORF
Kan : 카나마이신 내성 유전자
이하, 본 발명의 실시형태를 나타내면서, 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명한다. 또한 본 발명에 있어서의 생물화학적인 또는 유전자 공학적인 수법을 실시함에 있어서는, 예를 들면 Molecular Cloning : A LABORATORY MANUAL, 제3판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(2001), 신유전자공학 핸드북(무라마츠 마사미 등 편, 요도샤, 실험의학별책, 제3판, 1999년), 단백질 실험의 진행편(오카다 마사토, 미야자키 카오리 편, 요도샤, 제1판, 1998년), 단백질 실험 노트(오카다 마사토, 미야자키 카오리 편, 요도샤, 제2판, 1999년), 단백질 실험 핸드북(다케나와 타다오미 편집, 실험의학별책, 초판, 2003년 8월 15일), PCR 실험 노트(타니구치 타케토시 편집, 요도샤, 제1판, 1997년) 등의 여러 실험 매뉴얼의 기재가 참조된다.
본 명세서에 있어서는, 염기 배열, 아미노산 배열 및 그 개개의 구성인자에 대해서는 알파벳 표기에 의한 간략화한 기호를 사용하는 경우가 있으나, 모두 분자생물학·유전자공학 분야에 있어서의 관행에 따른다. 또, 본 명세서에 있어서는 아미노산 배열의 변이를 간소하게 나타내기 때문에, 예를 들면 「D143A」등의 표기를 사용한다. 「D143A」는 제 143번째의 아스파라긴산을 아라닌으로 치환한 것을 나타내고 있고, 즉 치환 전의 아미노산 잔기의 종류, 그 장소, 치환 후의 아미노산 잔기의 종류를 나타내고 있다. 또, 배열번호는 특별히 한정하지 않는 한 배열표에 기재된 배열번호에 대응한다.
1. 본 발명의 PCNA
본 발명의 PCNA 단량체는 다량체 형성에 기여하는 계면영역 내에 있어서의 소정 위치의 아미노산 잔기를 특정한 것이다. 즉, 본 발명의 PCNA 단량체는 계면영역 내에서 분자간 상호작용을 형성하는 부위가 단량체 상호에 전하적으로 서로 반발하는 아미노산 잔기로 구성된다. 여기서 「분자간 상호작용」이란, 분자간에 일 어나는 물리적, 화학적 또는 전기적인 상호작용을 말하고, 예를 들면 입체배좌·입체구조 등의 분자구조에 기인하는 작용, 및 이온결합, 수소결합, 소수성 상호작용 등의 각종 분자간 작용이 포함된다. PCNA 단량체가 다량체를 형성하는 경우, 단량체 상호의 계면영역이 서로 끌어당기거나 또는 접합하는 등의 분자간 상호작용에 의하여 다량체가 형성된다. 하나의 바람직한 형태로서는 분자간 이온쌍, 또는 이온쌍 네트워크를 형성하는 아미노산 잔기끼리가 전하적으로 서로 반발하도록 아미노산 잔기가 구성된다. 그리고, 본 발명의 PCNA 단량체는 단량체 그대로 또는 다량체를 형성하여 DNA 복제를 촉진하는 활성을 구비한다. 또한, 본 명세서에 있어서 「변이형 PCNA」라는 경우의 「변이형」이란, 종래 알려진 PCNA와는 다른 아미노산 배열을 구비하는 것을 의미하는 것이고, 인위적 변이에 의하는지 자연계에 있어서의 변이에 의하는지를 구별하는 것은 아니다.
DNA 복제반응에 관여하는 인자의 하나인 PCNA의 다량체는 한쪽의 단량체의 N 말단측 영역과 다른쪽의 단량체의 C 말단측 영역이 계면이 되어 접합하여 형성된다. 또한. 본 명세서에 있어서 N 말단측 영역이란 단백질을 한개의 사슬로 봤을 때에 그 중앙보다 N 말단쪽의 부위를 의미하고, C 말단측 영역이란 중앙보다 C 말단쪽의 부위를 의미한다. 진핵세포 및 고세균에 있어서, 많은 경우 PCNA는 삼량체를 형성한다. 도 1에 PCNA 삼량체의 모델을 도시하였다. 도 1에 나타내는 바와 같이, PCNA 단량체(10a, 10b, 10c)가 각 말단영역에 있어서 다른 단량체와 접합하고, 고리구조상의 다량체(1)를 형성한다. 접합부(20)는 각 단량체의 말단영역이 계면이 되고, 그 내부에 단량체를 결합시키는 분자간 상호작용이 형성된다. 도 2에 Pyrococcus furiosus PCNA의 분자간 상호작용의 모델도를 나타낸다. 도 2에서는 배열번호 2에 기재된 아미노산 배열(야생형 Pfu-PCNA의 아미노산 배열)을 가지는 PCNA에 대하여 설명한다. 한쪽의 단량체(10a)의 N 말단측 영역 내에 포함되는 아미노산 잔기와, 다른쪽의 단량체(10c)의 C 말단측 영역 내에 포함되는 아미노산 잔기가 분자간 쌍을 형성한다. 도 2에 나타내는 바와 같이, 배열번호 2에 기재된 아미노산 배열에 있어서의 제 139번째, 제 143번째 및 제 147번째의 아미노산 잔기군과, 제 82번째, 제 84번째, 제 109번째의 아미노산 잔기군이 상호 서로 영향하는 네트워크를 형성한다고 생각된다.
이에 대하여 본 발명에서는 분자간 상호작용을 일으키는 부위의 아미노산 잔기의 적어도 일부가 적극적으로 상호 서로 반발하도록 구성된다. 여기서 말하는 「전하적으로 서로 반발하는」이란, 계면영역에 포함되는 아미노산 잔기가 가지는 전하에 의하여 서로 반발하는 것을 말한다. 따라서, 그와 같은 조합으로서는 계면에 포함되는 아미노산 잔기가 양쪽 모두 플러스로 충전(charge)되어 있는 분자로 구성되는 경우와 양쪽 모두 마이너스로 충전되는 분자로 구성되는 경우가 포함된다. 보다 구체적으로는, 아미노산 잔기가 양쪽 모두 산성 아미노산, 또는 양쪽 모두 염기성 아미노산에 의하여 구성되는 것이 바람직하다. 산성 아미노산으로서는, 예를 들면 아스파라긴산〔약호: Asp 또는 D〕, 글루타민산〔약호: Glu 또는 E〕등을 들 수 있다. 또, 염기성 아미노산으로서는, 예를 들면 리신〔약호: Lys 또는 K〕, 아르기닌〔약호: Arg 또는 R〕, 히스티딘〔약호: His 또는 H〕등을 들 수 있다.
따라서, 예를 들면 배열번호 2 또는 32에 기재된 아미노산 배열을 가지는 PCNA를 베이스로 한 경우, 본 발명의 PCNA를 얻기 위해서는 배열번호 2 또는 32에 기재된 아미노산 배열에 있어서 제 82번째, 제 84번째, 제 109번째, 제 139번째, 제 143번째 및 제 147번째로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 위치의 아미노산 잔기가 변경된다. 본 발명의 바람직한 형태로서는, 하기 (i)군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기와, 하기 (ii)군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상호 전하적으로 서로 반발하는 아미노산 잔기에 의하여 구성되는 형태가 예시된다.
(i) 제 82번째, 제 84번째 및 제 109번째의 아미노산 잔기군
(ii) 제 139번째, 제 143번째 및 제 147번째의 아미노산 잔기군
보다 구체적으로는 상기 (i)로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기와, 상기 (ii)로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 조합이 양쪽 모두 산성 아미노산끼리의 조합이거나, 양쪽 모두 염기성 아미노산의 조합인 것이 적합하다. 즉, (i)군 및 (ii)군의 각 군으로부터 적어도 하나 선택되는 아미노산 잔기가 양쪽 모두 아스파라긴산 및 글루타민산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 산성 아미노산인 형태, 및 (i)군 및 (ii)군의 각 군으로부터 적어도 하나 선택되는 아미노산 잔기가 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기성 아미노산인 형태 등을 바람직한 예로서 들 수 있다.
DNA 복제를 촉진하는 활성(DNA 복제 촉진 활성)은 기초가 되는 야생형 PCNA에 비하여 DNA 복제가 촉진되는 것을 의미한다. 구체적으로는 배열번호 2 또는 32에 기재된 아미노산 배열을 가지는 PCNA 단량체 또는 그 다량체보다도 DNA 복제 촉 진 활성이 우수한 것이 보다 바람직하다. 또한, 다른 구체적 지표로서는 하기 실시예에 나타낸 DNA 복제의 활성 측정방법에 따라 신장성, 반응속도 등을 측정한 경우에, 신장성 및 반응속도에서는 Taq 폴리머라아제에 비하여 동일 정도에서 10배 이상까지 활성을 상승시키는 DNA 복제 촉진 활성을 구비하는 것이 적합하다.
또, 본 발명의 PCNA로서는 상기 변이를 포함하는 아미노산 배열을 가지는 PCNA와 실질적으로 동일한 PCNA도 포함된다. 구체적으로는, 본 발명의 PCNA로서 예를 들면 상기와 같은 바람직한 DNA 복제 촉진 활성을 가지고, 또한 제 82번째, 제 84번째, 제 109번째, 제 139번째, 제 143번째 및 제 147번째 이외의 부위에 본 발명의 효과를 저해하지 않는 범위에 있어서 부가, 삽입, 치환 및 결실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 포함하는 변이형 PCNA 를 들 수 있다. 여기서 「수개」란, 구체적으로는 2 내지 50개, 바람직하게는 2 내지 30개, 더욱 바람직하게는 2 내지 10개, 특히 바람직하게는 2 내지 5개이다. 이와 같은 단백질에 있어서도 배열번호 2 또는 32에 나타내는 아미노산 배열에 있어서의 (i)군과 (ii)군으로부터 선택되는 위치에 대응하는 아미노산 잔기는 전하적으로 서로 반발하도록 구성된다. 즉, (i) 군 및/또는 (ii)군의 위치에 관련되는 소정의 아미노산 잔기 이외에 있어서도 그 활성이 현저하게 손상되지 않는 범위에 있어서 다른 변이가 허용된다. 그와 같은 변이로서는, 예를 들면 아미노산 잔기의 소위 보존적인 치환도 포함될 수 있다. 또한, 제 82번째, 제 84번째, 제 109번째, 제 139번째, 제 143번째 및 제 147번째 이외의 부위에 결실, 삽입, 부가라는 변이가 도입된 경우, 변이도입 후의 아미노산 잔기의 번호는 변이도입 전의 아미노산 잔기 의 번호와는 다를 수도 있으나, 다량체를 형성하는 경우의 계면 내에 위치하고 분자간 상호작용을 서로 미치는 상기 (i) 및 (ii)에 나타내는 위치에 상당하는 한에 있어서, 번호가 전후하여도 본 발명의 PCNA에 포함된다. 상기 변이형 PCNA 중 특히 제 73번째의 아미노산 잔기를 로이신으로 바꾼 치환만을 포함하는 것, 또는 그것에 더하여 다른 변이를 포함하는 것은 용이하게 조제 및 정제할 수 있기 때문에 바람직하다.
본 발명의 PCNA가 DNA 복제반응을 촉진할 수 있는 작용·기서(機序)는 반드시 명확하지는 않으나, 다량체에 의하여 형성되는 고리구조가 온도상승시에 해제되는 구조를 가짐으로써, DNA 복제반응의 반복이 원활하게 행하여지고, 그 결과 DNA 복제반응을 보다 촉진한다고 하는 것이 추측된다. 종래 PCNA는 단량체끼리가 견고하게 접합하여 다량체를 형성함으로써 안정된 클램프로서의 역할을 발휘하고, DNA 복제촉진인자로서 기능한다고 하는 생각이 주류였으나, 이 점에 있어서 본 발명은 종래와는 다른 지견을 제공하는 것이다. RFC를 병용하지 않는 경우의 PCNA의 활성에는 다량체의 결합이 너무 견고한 것은 좋지 않고, 특히 PCR과 같은 복제반응의 반복시에는 고리구조가 온도상승시에 해제되도록 약해져 있음으로써, 야생형 PCNA의 RFC 병용시보다도 더 우수한 촉진 활성을 발휘한다고 하는 것이다.
본 발명의 바람직한 PCNA의 구체예로서는, 배열번호 2 또는 32에 기재된 아미노산 배열에 있어서, 제 143번째의 아미노산 잔기를 아스파라긴산으로부터 아르기닌으로 바꾼 배열(D143R)을 가지는 PCNA 단량체를 들 수 있다. 제 143번째의 아미노산 잔기는 (ii)군에 속한다. 이 경우, (i)군에 속하는 제 82번째, 제 84번째, 제 109번째의 아미노산 잔기는 순서대로 아르기닌, 리신, 아르기닌이고, 이 분자간 상호작용은 계면영역이 통상보다도 서로 상반하는 상태를 형성할 수 있다. 본 형태의 PCNA는 하기 실시예에 나타나는 바와 같이 DNA 복제반응의 신장성 및 반응속도 등에 대하여 밸런스 좋게 특히 우수한 보조작용을 발휘한다.
또, 본 발명은 상기 본 발명의 PCNA를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 염기배열은 코돈 표에 의하여 아미노산에 연역(演繹)되나, 코돈의 결합에 의하여 하나의 아미노산 배열은 복수의 염기배열종에 의하여 코드될 수 있다. 예를 들면, 배열번호 2 또는 32에 기재된 아미노산 배열은, 예를 들면 배열번호 1 또는 31에 기재된 염기배열에 의하여 코드된다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 일 형태로서는 하기 (a)의 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
(a) 배열번호 2 또는 32에 기재된 아미노산 배열에 있어서 (i)군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기와 (ii)군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 전하적으로 반발하도록 아미노산 잔기가 치환된 아미노산 배열을 코드하는 염기배열을 가지는 폴리뉴클레오티드.
(a)와 같은 염기배열을 가지는 폴리뉴클레오티드는 배열번호 1 또는 31에 기재된 염기배열에 있어서 상기 소정 위치의 아미노산 잔기가 대응하는 부위의 염기배열을 개변(改變)함으로써 용이하게 제작 가능하다. 또, 아미노산의 종류에 의거하는 염기배열의 변환은 코돈 표에 의거하여 용이하게 변환 가능하다. 또한, 본 명세서에서 말하는 폴리뉴클레오티드에는 DNA, RNA가 포함되고, 1개 사슬이어도 2개 사슬이어도 좋으며, 또한 DNA 및 RNA의 키메라체, 또는 DNA 및 RNA의 하이브리드 등이 포함된다.
또, 하기 (b)와 같은 폴리뉴클레오티드도 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함할 수 있다.
(b) 상기 (a)의 폴리뉴클레오티드를 가지는 염기배열과 상보적인 염기배열을 가지는 폴리뉴클레오티드와 엄격한(stringent) 조건 하에 있어서 하이브리다이즈(hybridize)하고;
(i)군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기와 (ii)군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 전하적으로 서로 반발하는 아미노산 잔기의 조합이 되는 아미노산 배열을 코드하는 염기배열을 가지고; 또한
상기 소정의 DNA 복제 촉진 활성을 가지는 PCNA를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
하이브리다이즈하는 유전자를 얻기 위하여 사용할 수 있는 프로브는, 예를 들면 배열번호 1 또는 31에 기재된 염기배열에 의거하여 정법에 의하여 제작할 수 있다. 또, 프로브를 사용하여 이것과 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드를 매달아 올려, 목적으로 하는 폴리뉴클레오티드를 단리(單離)하는 방법도 정법에 따라 행하면 좋다. 예를 들면, DNA 프로브는 플라스미드나 퍼지벡터에 크로닝된 염기배열을 증폭하고, 프로브로서 사용하고 싶은 염기배열을 제한효소에 의하여 잘라내고, 추출하여 조제할 수 있다. 잘라내는 부분은 목적으로 하는 DNA에 따라 조절할 수 있다.
또, 「엄격한 조건」이란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적 인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 통상의 서던 하이브리다이제이션(hybridization)의 세정조건인 60℃, 1×SSC, 0.1 % SDS, 바람직하게는 0.1×SSC, 0.1 % SDS에 상당하는 염농도에서 하이브리다이즈하는 조건을 들 수 있다. 또, 「엄격한 조건에서」하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 (b)의 폴리뉴클레오티드는 (a)의 폴리뉴클레오티드에 대하여 바람직하게는 50 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 더더욱 바람직하게는 95 %이상의 상동성(homology)을 가지는 것이 적합하다. 또한, 상동성의 계산방법으로서는, 예를 들면 BLAST, FASTA, ClustalW 등을 사용할 수 있다.
상기 (b)에 나타내는 폴리뉴클레오티드는 그 염기배열이 번역된 아미노산 배열을 구비하는 단백질이 DNA 복제 촉진 활성을 가진다. 보다 구체적으로는 상기 본 발명의 단백질에 대하여 설명한 것과 동일한 DNA 복제 촉진 활성을 가진다.
상기 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 적당한 벡터에 조립하고, 재조합 폴리뉴클레오티드로서 사용할 수 있다. 본 명세서에 있어서 재조합 폴리뉴클레오티드란, 2종 이상의 폴리뉴클레오티드끼리가 연결된 하이브리드 분자를 말한다. 본 발명의 재조합 폴리뉴클레오티드의 바람직한 형태로서는 발현 벡터를 들 수 있다. 발현 벡터는 다양한 형태의 것이 이미 알려져 있고, 또 시판되고 있는 것도 있다. 본 발명에서는 재조합 폴리뉴클레오티드의 형태는 용도 등에 따라 적절히 선택해서 좋고, 시판의 발현 벡터 등 공지의 발현 벡터를 사용할 수 있다. 하기에 한정되는 것은 아니나, 발현 벡터에 관련되는 구체예를 나타낸다.
벡터로서는 대장균 유래의 플라스미드〔예, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, 시판품으로서 pBT Vector, pTRG Vector(Stratagene사제)등〕, 효모 유래의 플라스미드(예, YEp24, YCp50 등), λ퍼지 등의 박테리오 퍼지, 레트로 바이러스, 왁시니아 바이러스, 바큐로 바이러스 등의 동물 바이러스, 고초균(枯草菌)에 적합하게 사용되는 플라스미드(예, pUB110, pTP5, pC194 등) 등 외, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo 등을 들 수 있다.
프로모터로서는 유전자 발현에 사용하는 숙주세포에 대응하여 적절한 프로머터이면 어떠한 것이어도 좋다. 예를 들면, 숙주세포가 에세리키아속균인 경우는 trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터, T7 프로모터 등이, 숙주세포가 바틸스속균인 경우는 SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등을 들 수 있다. 또, 숙주세포가 효모인 경우는 PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등을 들 수 있다. 숙주세포가 곤충세포인 경우는 폴리헤드린 프로모터, P10 프로모터 등을 들 수 있다. 또, 동물세포를 숙주세포로서 사용하는 경우는 SRα 프로모터, SV40 프로모터, HIV·LTR 프로모터, CMV(사이트메가로바이러스) 프로모터, HSV-TK 프로모터 등을 들 수 있다.
발현 벡터는 재편성 조작에 대한 취급 용이의 관점에서 멀티크로닝사이트를 가지는 것이 바람직하다. 또, 이상 외에 발현 벡터에는 소망에 의하여 선택 마커, 인핸서(enhancer), 스플라이싱 시그널, 폴리A부가 시그널, SV40 복제 오리진(이하, SV40 ori라고 약칭하는 경우가 있음), 터미네이터 등을 조립할 수 있다. 선택 마커로서는, 예를 들면 암피실린 내성 유전자(카르베니실린 내성 유전자라고도 불림. 이하 Amp라고 약칭하는 경우가 있음), 카나마이신 내성 유전자(이하, Kam이라고 약 칭하는 경우가 있음), 테트라사이클린 내성 유전자(이하, Tet라고 약칭하는 경우가 있음), 디히드로엽산환원효소(이하, dhfr이라고 약칭하는 경우가 있음) 유전자〔메소트렉세이트(MTX)내성〕, 네오마이신 내성 유전자(이하, Neo라고 약칭하는 경우가 있음, G418 내성 등)를 들 수 있다. 또, 필요에 따라 숙주세포에 맞는 시그널 배열을 본 발명의 랜덤 올리고뉴클레오티드 또는 카세트의 N 말단측에 부가한다. 숙주세포가 에세리키아속균인 경우는 PhoA·시그널 배열, OmpA·시그널 배열 등이, 숙주세포가 바틸스속균인 경우는 α-아밀라아제·시그널 배열, 서브틸리신·시그널 배열 등이, 숙주세포가 효모인 경우는 MFα·시그널 배열, SUC2·시그널 배열 등, 숙주세포가 동물세포인 경우에는 인슐린·시그널 배열, α-인터페론·시그널 배열, Ras 파르네실화·시그널 배열 등을 각각 이용할 수 있다.
상기와 같이 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제작하고, 이것을 숙주세포에 도입하고, 본 발명의 DNA 폴리머라아제를 발현하는 형질전환체를 제작할 수 있다.
숙주세포로서는, 예를 들면 연쇄구균(streptococci), 브도우구균(staphylococci), 에세리키아속균(Escherichia coil), 스트렙토마이세스속균(Streptomyces) 및 고초균(Bacillus subtilis) 등의 세균세포; 효모, 아스페르길루스속(Aspergillus) 등의 진균세포; 드로소필라 S2(Drosophila S2) 및 스포돕테라 Sf9(Spodoptera Sf9) 등의 곤충세포; CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, 보우즈(Bows) 흑색종 세포 및 혈구계 세포 등의 동물세포; 및 식물세포를 들 수 있다.
발현벡터의 숙주세포로의 도입은 Davis 등, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1986); Sambrook 등, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 제3판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)과 같은 많은 표준적인 실험 메뉴얼에 기재되는 방법에 의하여 행할 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들면 인산칼슘 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 마이크로인젝션, 양이온지질 매개 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 트랜스덕션, 바이오리스틱스 도입(biolistics법) 또는 감염 등이 있다.
형질전환체의 배양은 숙주의 종류 등에 따라 조절하여 행하면 좋다. 숙주의 종류는 다수가 있으나, 몇가지의 구체예를 들면 다음과 같다. 예를 들면, 숙주가 에세리키아속균, 바틸스속균인 형질전환체를 배양하는 경우, 배양에 사용되는 배지는 액체배지이어도 한천배지(寒天培地)이어도 좋고, 그 중에는 형질전환체의 생육에 필요한 탄소원, 질소원, 무기물, 그 외를 배합한다. 탄소원으로서는, 예를 들면 클루코스, 텍스트린, 가용성 전분, 수크로스 등, 질소원으로서는, 예를 들면 암모늄염류, 질산염류, 콘 스티프 리커(corn steep liquor), 펙톤, 카제인, 고기(肉) 엑기스, 콩 지게미, 감자추출액 등의 무기 또는 유기물질, 무기염으로서는, 예를 들면 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘 등을 들 수 있다. 또, 효모 엑기스, 비타민류, 성장촉진인자 등을 첨가하여도 좋다. 배지의 pH는 약 5 내지 8이 바람직하다. 에세리키아속균을 배양할 때의 적합한 배지로서, 구체적으로는 효모 엑기스, 트립톤, 염(NaCl)을 포함하는 LB 배지 등이 예시된다. 여기에 필요에 따라 프로모터를 효율 좋게 움직이게 하기 위하여, 예를 들면 이소프로필 1-티오-β-D- 갈락토시드(IPTG)와 같은 유도제를 첨가하여도 좋다. 숙주가 에세리키아속균인 경우, 배양은 통상적 15 내지 43℃에서 약 3 내지 24시간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반을 더한다. 숙주가 바틸스속균인 경우, 배양은 통상적 30 내지 40℃에서 약 6 내지 24시간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반을 더한다.
숙주가 효모인 경우 형질전환체를 배양할 때, 배지로서는 예를 들면 Burkholder 최소배지, 0.5 % 카사미노산을 함유하는 SD 배지 등을 들 수 있다. 배지의 pH는 약 5 내지 8로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상적 20℃ 내지 35℃에서 약 24 내지 72시간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반을 더한다.
또, 숙주가 곤충세포 또는 곤충인 형질전환체를 배양할 때, 배지로서는 Grace's Insect Medium〔Grace, T. C. C., Nature, 195, 788(1962)〕에 비동화한 10 % 우혈청 등의 첨가물을 적절히 더한 것 등이 사용된다. 배지의 pH는 약 6.2 내지 6.4로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상적 27℃에서 약 3 내지 5일간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반을 더한다.
숙주가 동물세포인 형질전환체를 배양할 때, 배지로서는 예를 들면 약 5 내지 20 %의 태아우혈청을 포함하는 MEM 배지, DMEM 배지, RPMI 1640 배지〔The Journal of the American Medical Association, 199권, 519(1967)〕, 199 배지〔Proceeding ofthe Society for the Biological Medicine, 73권, 1(1950)〕등이 사용된다. pH는 약 6 내지 8인 것이 바람직하다. 배양은 통상적 약 30 내지 40℃에서 약 15 내지 60시간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반을 더한다. 또, 필요에 따라 CO2 농도의 조절을 행한다.
형질전환체에 생성시킨 본 발명의 단백질은 필요에 따라 단백질 정제의 정법에 의하여 정제(精製), 단리(單離)할 수 있다. 이상과 같이 하여 형질전환체를 사용하여 본 발명의 PCNA를 얻을 수 있다.
2. 본 발명의 PCNA를 사용한 DNA 복제방법
본 발명의 DNA 복제방법은 PCNA 단량체 및/또는 상기 단량체로 구성된 다량체 및 DNA 폴리머라아제의 존재하에서 DNA의 합성반응을 행하는 것을 특징으로 한다. DNA의 합성방법으로서는 PCR, 프라이머엑스텐션, 닉트랜스레이션, 역전사효소에 의한 First strand cDNA 합성 등을 들 수 있다.
본 발명의 DNA 복제방법으로서는 PCR에 의한 DNA 증폭을 적합한 형태로서 들 수 있다. PCR에 있어서는 프라이머와 주형 DNA를 사용하여 DNA 복제를 반복하고, 기하급수적으로 DNA를 증폭시킨다. 그 때문에 PCNA는 DNA 폴리머라아제에 대한 크램프로서의 기능을 다함과 함께, DNA 폴리머라아제가 주형상에서 안정된 후 또는 소정 영역의 증폭 후에는 주형으로부터 신속하게 빠지는 것이 바람직하고, 본 발명의 PCNA가 이와 같은 특성을 구비하고 있는 것으로 추찰(推察)된다.
본 발명의 PCNA는 다양한 DNA 폴리머라아제와 상성(相性)이 좋고, 범용성이 높다. DNA 폴리머라아제는 통상 신장성 또는 충실성 중 어느 한 쪽이 우수하여, 일장일단이 있는 것이 일반적이다. 그러나, 본 발명의 PCNA와 조합함으로써 충실성을 저하시키지 않고 신장성을 향상시킬 수 있기 때문에, DNA 폴리머라아제의 단점을 보강하면서 DNA 복제활성이 증강될 수 있다. 본 발명의 DNA 복제방법에 있어서 사용하는 DNA 폴리머라아제로서, 바람직하게는 예를 들면 Pyrobest DNA Polymerase(타카라바이오사), TaKaRa EX Taq(타카라바이오사), Vent DNA Polymerase(New ENGLAND Bio Labs사), Deep VentR DNA Polymerase(New England Biolabs사), Pfu Turbo DNA Polymerase(스트라타진사), KOD DNA Polymerase(토요보사), 및 Pwo DNA Polymerase(로셰 다이아그노스틱스사) 등 현재 주요 사용되고 있는 DNA 폴리머라아제의 대부분에 적용할 수 있다. 또, 본 발명의 PCNA는 특히 신장성 향상에 유효하고, 충실성에는 우수하나, 신장성에 열화한 타입의 α형 폴리머라아제의 조합에 있어서 특히 유용하다.
본 발명의 DNA 복제방법에 있어서는, 본 발명의 PCNA가 RFC를 필요로 하지 않는 것이기 때문에, 반응계에 RFC를 첨가하지 않아서 좋다. RFC 표품은 일반적으로는 시판되고 있지 않고, 그 조제는 수고를 요한다. RFC 표품을 이용할 수 있다고 하여도 첨가하여 사용할 경우에는 RFC 이외의 DNA 복제계의 제인자와의 적절한 양비(量比) 등의 조건설정이 필요하나, 본 발명에 있어서는 이들을 고려하지 않아서 좋다고 하는 장점이 있다. 또, 특히 PCR에서의 사용인 경우에는 본 발명의 PCNA는 RFC를 병용하지 않고도 야생형 PCNA와 RFC의 병용시보다도 우수한 촉진 활성을 발휘한다.
또, PCR의 구체적인 조건에 관해서는 이미 많은 해설서가 발행되어 있고, 본 발명의 방법에 있어서도 그들 문헌을 참고로 하여 적절히 반응조건 등을 조정해도된다. PCR의 조건으로서는, 예를 들면 DNA 폴리머라아제의 첨가량, PCR의 반응시 간, 반응용액의 온도의 설정, 반응용액의 성분, 반응용액의 pH, 투입하는 주형 폴리뉴클레오티드의 양 등의 여러 조건이 조정된다.
3. 시약 키트
본 발명의 시약 키트는 상기 본 발명의 PCNA 및 필요에 따라 그 외의 시약류를 포함하는 DNA 복제용 시약 키트이다. 본 발명의 PCNA는 단량체 및/또는 상기 단량체로 구성된 다량체를 포함하는 형태로, DNA 복제용 시약의 일성분으로서 바람직하게 사용할 수 있다. 본 발명의 시약 키트는 본 발명의 PCNA를 PCR에 있어서 특히 적합하게 사용할 수 있기 때문에, PCR용의 시약 키트로서 특히 적합하다.
본 발명의 시약 키트에 구비되는 PCNA는 어떤 형태이어도 좋고, 정제 단백질, 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 조립된 재조합 폴리뉴클레오티드, 또는 이 재조합 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질전환체 등의 형태가 예시된다. 재조합 폴리뉴클레오티드나 형질전환제의 바람직한 형태에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또, 본 발명의 PCNA과 다른 PCNA를 조합하여도 좋다. 또, 본 발명의 PCNA가 재편성 DNA 또는 형질전환체의 형태로 제공되는 경우에는 본 발명의 PCNA를 발현시키기 위하여 사용되는 시약류 등을 구비하여도 좋다. 또, 본 발명의 PCNA를 포함하는 시약에는 필요에 따라 바이오테크놀로지 시약으로서 일반적으로 사용되는 다른 성분이나 매체를 배합하여도 좋다.
<실시예>
이하 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 조금도 한정되는 것은 아니다.
1 : Pfu-PCNA·RFC 단백질의 조제
PCNA 변이체 단백질 표품과 RFC 단백질 표품은 대장균 내에서 이들 유전자를 대량 발현시키고, 발현균체로부터 단백질을 정제함으로써 조제하였다.
1.1 : 균체 입수·게놈 DNA 조제
1.1.1. : Pfu 균체 입수·게놈 DNA 조제
Pyrococcus·furiosus DSM3638주를 Deutsche Sammlung von Mikroo ganismen und Zelkuluren GmbH(영문명 : German Collection of Microor ganisms and Cell Cultures, 주소 : Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany)로부터 입수하였다. DSM3638주를 문헌〔Uemori et al., Nucl Acids Res. 21:259 내지 265(1993)〕에 기재된 방법에 따라 배양하였다. 500 mL의 배양액으로부터 약 1.2 g의 균체를 얻었다. 이것을 버퍼(10 mMTris-Cl pH 8.0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl)10 mL에 현탁하고, 10 % SDS를 1 mL 더하였다. 교반 후 프로테이나아제(proteinase)K(20 mg/mL)를 50μL 더하고, 55 ℃에서 60분 정치(靜置)하였다. 그 후 반응액을 순차 페놀 추출, 페놀/클로로포름 추출, 클로로포름 추출한 후, 에탄올을 더하여 DNA를 불용화하였다. 회수한 DNA를 1 mL의 TE액(10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA)에 용해하고, 0.75 mg의 RnaseA를 더하여 37℃에서 60분 반응시켰다. 그 후 반응액을 다시 한번 페놀 추출, 페놀/클로로포름 추출, 클로로포름 추출한 후, 에탄올을 더하여 DNA를 회수하였다.
1.2 : PCNA 유전자 크로닝
Pfu-PCNA 유전자는 NCBI 데이터베이스에 등록되어 있는 염기배열정보 ABO17486(배열번호 1 및 2)를 참고로 하여, PCR을 이용한 크로닝(도 3)에 의하여 획득하였다. 이하에 상세를 설명한다.
1.2.1 : PCR 프라이머
Pfu-PCNA 유전자의 증폭용으로는 Pfu-PCNA-F, Pfu-PCNA-R을 사용하였다. 이들 배열은 PCNA 유전자의 개시 메티오닌으로부터 종지 코돈에 상당하는 영역을 증폭하고, 또한 5'측에 제한효소 NdeI 인식부위, 제한효소 XhoI 인식부위가 부가되도록 설계되어 있다. 각각의 프라이머의 배열은 표 1(배열번호 3 및 4)에 나타내었다.
Figure 112008000596956-PCT00001
1.2.2 : 주형 DNA
PCR의 주형으로서는 상기 1.1.1에서 조제한 Pfu 게놈 DNA를 사용하였다.
1.2.3 : PCR 반응액 조성
PCR 반응액은 다음의 조성으로 행하였다(50μL 반응액계에의 첨가량).
주형 DNA : 100 ng
프라이머 : 각 10 pmol
dNTP : 각 10 nmol
EX Taq* : 1.25 U
10xExTaq 버퍼 : 5 μL
이상에 멸균수를 첨가하여 50 μL로 하였다.
(* 타카라바이오사제)
1.2.4 : PCR 반응조건
상기에서 조제한 반응액을 PCR 장치를 사용하여 95℃·30 sec → 55℃·30 sec → 72℃ 1 min을 30 사이클 반복하는 프로그램으로 PCR 반응을 행하였다.
1.2.5 : PCR 산물의 정제
상기 PCR 반응 산물을 1 % 아가로스 겔(Agarose gel) 전기영동에 제공하고, 에티듐브로마이드 염색을 행한 후 자외선 조사하에서 800 bp 부근의 밴드를 포함하는 겔을 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용하여 동 조작 메뉴얼에 따라 겔 중의 PCR 산물의 정제를 행하였다.
1.2.6 : PCR 산물의 서브크로닝
정제한 PCR 산물은 pUC118-HincⅡ/BAP, TaKaRa BKL Kit(모두 타카라바이오사)를 이용하여 조작 메뉴얼에 준하여 라이게이션반응을 행하였다. 이 라이게이션 산물에서 대장균 E.coli DH5α(타카라바이오사)를 형질전환하고, LB 한천 플레이트(100 ㎍/mL 암피실린, IPTG, X-GAL 각 40 ㎍/mL 함유)상에 파종하고, 37℃에서 하룻밤 정치 배양하여 PCR 산물을 유지하는 대장균 클론을 얻었다.
한천 플레이트상의 백색을 보이는 대장균 콜로니를 LB 액체배지(100 ㎍/mL 암피실린 함유) 3 mL, 37℃에서 밤새껏 진탕배양하고, 정법에 따라 플라스미드 DNA를 조제하였다.
1.2.7 : 시퀀싱에 의한 배열 확인
상기 플라스미드 DNA에 대하여 DNA 시퀀서를 사용하여 플라스미드 벡터 pUC118의 제한효소 HincⅡ 인식부위에 삽입된 DNA 배열을 조사하였다. 그 결과, 삽입부분에는 Pfu-PCNA 유전자의 오픈 리딩 프레임을 유지하고 5'단에 제한효소 NdeI인식배열, 3'단에 제한효소 XhoI 인식배열이 부가되어 있는 것이 확인되었다. Pfu-PCNA 유전자의 오픈 리딩 프레임을 유지한 본 플라스미드 벡터를 pUC/PPC라고 명명하기로 하였다.
1.3 : PCNA 발현 플라스미드 제작
pUC/PPC를 제한효소 NdeI와 XhoI로 이중절단하여 PCNA 유전자 단편을 조제하였다. 유전자 단편은 발현 벡터에 삽입하고, Pfu-PCNA의 발현 벡터를 제작하였다.
1.3.1 : PCNA DNA 단편 조제
pUC/PPC를 이하의 반응계에서 제한효소 NdeI와 XhoI로 이중절단하였다.
플라스미드 DNA : 5 ㎍
10X 제한효소 버퍼 : 5μL
제한효소 NdeI : 5 유닛
제한효소 XhoI : 5 유닛
이상에 멸균수를 첨가하여 50 μL로 하고, 37℃에서 30분간 제한효소 절단을 행하였다. 반응종료 후 2 % 아가로스 겔 전기영동을 행한 Pfu-PCNA 유전자에 상당하는 밴드(약 800 bp 부근)를 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용, 동 조작 메뉴얼에 따라 겔로부터 PCNA DNA 단편의 정제를 행하였다.
1.3.2 : pET-21a 발현 벡터
pET-21a 벡터 DNA(미국 노바젠사)를 이하의 반응에 의하여 제한효소 NdeI와 XhoI로 이중절단하였다.
플라스미드 DNA : 2 ㎍
10X 제한효소 버퍼 : 5μL
제한효소 NdeI : 5 유닛
제한효소 XhoI : 5 유닛
이상에 멸균수를 첨가하여 50 μL로 하고, 37℃에서 2시간 정치하였다. 반응종료 후 1 % 아가로스 겔 전기영동을 행한 pET-21a 벡터 DNA의 직선폼에 상당하는 밴드(약 5.4 kb 부근)를 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용, 동 조작 메뉴얼에 따라 겔로부터 pET-21a DNA 단편의 정제를 행하였다.
1.3.3. : 라이게이션반응과 형질전환
상기에서 얻은 Pfu-PCNA DNA 단편(100 ng)과 pET-21a DNA 단편(50 ng)을 DNA Ligation Kit V2(타카라바이오사)를 이용하여 이하와 같이 반응하였다.
PCNA DNA 단편 : 100 ng
pET-21a DNA 단편 : 50 ng
DNA Ligation kit V2 효소액 : 5μL
이상에 멸균수를 더하여 10 μL로 하고, 16℃에서 30분간 반응하였다.
이 라이게이션 산물(3 μL)에 의하여 100 μL 대장균 E.coli BL21(DE3)(노바젠사)을 형질전환하고, 대장균액을 LB 한천 플레이트(100 ㎍/mL 암피실린)상에 파종하고, 37℃에서 하룻밤 정치 배양하였다. 한천 플레이트상에 형성된 대장균 콜로니 중 3개를 LB 액체배지(100 ㎍/mL 암피실린 함유) 3 mL, 37℃에서 밤새껏 진탕배양하고, 정법에 따라 플라스미드 DNA를 조제하였다.
1.3.4 : 시퀀싱에 의한 배열 확인
상기 재편성 플라스미드에 대하여 DNA 시퀀서를 사용하여 플라스미드 벡터 pET-21a에 삽입된 DNA 배열과 삽입부위 근방의 배열을 조사하였다. 그 결과, 멀티크로닝 부위의 NdeI와 XhoI 부분에 Pfu-PCNA 유전자의 ORF(오픈 리딩 프레임)가 완전히 삽입되어 있었다. 이 Pfu-PCNA 유전자를 유지하는 플라스미드를 pPPCNA라고 부르기로 하였다(도 4).
도 4에 나타내는 바와 같이 pPPCNA에서는 pET-21a가 유지하는 T7프로모터로부터 rbs(리보솜 결합부위), PCNA 유전자 ORF(오픈 리딩 프레임), T7터미네이터의 순서로 나열되어 있는 것이 확인되었다. 본 플라스미드가 PCNA 유전자를 대량 발현하는 것이 기대되었다.
1.4 : PCNA 유전자에의 변이 도입
보다 고기능의 PCNA를 제작할 목적으로 Pfu-PCNA에 대하여 아미노산 치환을 행하였다. 아미노산 치환은 상기 아미노산을 코드하는 코돈의 염기를 치환함으로써 행하였다. 표 2에 나타내는 변이부위에 아미노산 변이를 도입하였다.
Figure 112008000596956-PCT00002
1.4.1 : 치환 변이 도입
PCNA 유전자에의 변이 도입은 변이를 도입하는 플라스미드와 변이 도입용 올리고 페어(표 3, 배열번호 5 내지 12), Quik Change Ⅱ Site-Directed Mutagenesis Kit(스트라타진사)를 이용하여 동 조작 메뉴얼에 따라 행하였다.
Figure 112008000596956-PCT00003
변이 도입 후에는 시퀀싱에 의하여 DNA 배열확인하고, 목적 부위에 변이 도입되고, 목적 이외의 부위에는 변이가 없는 점을 확인하였다. 이하에 각 PCNA 변이체 설계에 대하여 설명한다.
1.4.1.1 : Pfu-PCNA01
Pfu-PCNA에 대한 보고(비특허문헌 6)에 의하면, 천연형 Pfu-PCNA를 대장균을 숙주로 한 재편성 단백질로서 조제한 경우, 본래의 개시 Met로부터의 번역 단백질 이외에 N 말단이 73 잔기째로부터 스타트하는 약 20 kDa의 단백질이 부산물로서 생성되고, 73 잔기째의 Met를 Leu에 유전자공학적수법을 사용하여 1 잔기 치환한 경우, 이 약 20 kDa의 단백질이 생성이 억제되는 것이 보고되어 있다. 또, 이와 같이 제작된 Pfu-PCNA는 야생형 PCNA 단백질인지 알 수 없는 성질을 가지고 있는 것이 아울러 보고되어 있다. 이들 사실로부터 Pfu_M73L의 변이를 준야생형으로서 본 명세서에서는 다룬다.
이 Pfu_M73L의 변이체를 Pfu-PCNA01로 하고, 변이체를 제작하였다. Pfu-PCNA01의 제작은 주형 플라스미드를 pPPCNA로 하고 변이 도입용 올리고 페어(Pfu_M73L-F와 Pfu_M73L-R)를 사용하여 행하였다.
1.4.1.2 : Pfu-PCNA10
Pfu-PCNA10은 Pfu-PCNA01의 143 잔기째의 아미노산을 D로부터 A로 1 잔기 치환한 변이로서, Matsumiya(비특허문헌 9)에 의하여 구조와 성질이 보고되어 있다.보고에 의하면, 143 잔기째의 아스파라긴산은 Pfu-PCNA가 호모 삼량체를 형성할 때에 계면에 위치하고, 삼량체 형성에 관여하는 아미노산의 일부이고, 이 143 잔기째의 아스파라긴산을 아라닌으로 변환한 결과, 삼량체 형성은 저해되기는 하나 DNA 폴리머라아제 활성 자극 자체는 유지되는 것이 보고되어 있다.
이 D143A와 M73L의 이중 변이를 가지는 PCNA 변이체를 Pfu-PCNA10으로 하고, 제작에 있어서는 Pfu-PCNA01 산생 플라스미드를 주형으로 하여 Pfu_D143A-F와 Pfu_D143A-R의 변이 도입용 올리고를 사용하였다.
1.4.1.3 : Pfu-PCNA12
Pfu-PCNA12는 82 잔기째의 아미노산을 R로부터 C로 1 잔기 치환한 변이로서, Matsumiya(비특허문헌 9)에 의하면, 82 잔기째의 아르기닌은 Pfu-PCNA가 호모 삼량체를 형성할 때에 계면에 위치하는 것이 보고되어 있다.
이 R82C와 M73L의 이중 변이를 가지는 PCNA 변이체를 Pfu-PCNA12로 하고, 제작에 있어서는 Pfu-PCNA01 산생 플라스미드를 주형으로 하여 Pfu_R82C-F와 Pfu_R82C-R의 변이 도입용 올리고를 사용하였다.
1.4.1.4 : Pfu-PCNA13
143 잔기째를 아르기닌(염기성 아미노산)으로 바꾼 것으로, 준야생형(Pfu-PCNA01)의 아스파라긴산(산성 아미노산)이나 Pfu-PCNA10의 아라닌(중성 아미노산)과 전기적 성질을 완전히 바꿈으로써, PCNA의 삼량체 형성능을 적극적으로 저해한 경우의 DNA 복제에의 영향을 조사할 목적으로 제작하였다. 구제적으로는 Pfu-PCNA01 산생 플라스미드를 주형으로 하여 Pfu_D143R-F와 Pfu_D143R-R의 변이 도입용 올리고를 사용하여 제작하였다.
1.4.1.5 : Pfu-PCNA16
삼량체에 형성에 관여 가능성이 높은 2종의 아미노산, 82 잔기째의 아르기닌과 143 잔기째의 아스파라긴산의 2개의 아미노산을 동시에 변이시키는 것에서의 효과를 조사할 목적으로 제작하였다. 구체적으로는 Pfu-PCNA12 산생 플라스미드를 주형으로 하여 Pfu_D143R-F와 Pfu_D143R-R의 변이 도입용 올리고를 사용하여 제작하였다.
1.4.1.6 : Pfu-PCNA70
143 잔기째에 치환 도입하는 아미노산에 의한 활성의 비교를 목적으로서, 143 잔기째의 아미노산을 리신(염기성 아미노산)으로 치환한 변이체를 제작하였다. 동일한 염기성 아미노산에서도 아르기닌의 측쇄의 구아니디늄기의 pKR값은 12.48, 리신의 측쇄의 부틸암모늄기의 pKR값은 10.54이고, 리신쪽이 염기성이 낮다. 발현 플라스미드는 Pfu-PCNA01 산생 플라스미드를 주형으로 하여 Pfu_D143K-F와 Pfu_D143K-R의 변이 도입용 올리고를 사용하여 제작하였다.
1.4.1.7 : Pfu-PCNA71
143 잔기째에 치환 도입하는 아미노산에 의한 활성의 비교를 목적으로서, 143 잔기째의 아미노산을 히스티딘(염기성 아미노산)으로 치환한 변이체를 제작하였다. 히스티딘의 측쇄의 pKR값은 6.0이고, 생리적 pH에서 해리한다. 히스티딘은 pH 6.0에서 이미다졸기의 50 %가 전하를 가지는 형, 남은 50 %가 전하를 가지지 않는 형이기 때문에, 생기적 pH 범위에서도 pH가 높은 쪽에서는 중성이 된다. 따라서, 치환 도입하는 아미노산으로서 아르기닌이나 리신과는 다른 성질이 예상된다. 발현 플라스미드는 Pfu-PCNA01 산생 플라스미드를 주형으로 하여 Pfu_D143H-F와 Pfu_D143H-R의 변이 도입용 올리고를 사용하여 제작하였다.
1.4.1.8 : Pfu-PCNA72
Pfu-PCNA가 호모 삼량체를 형성할 때에 계면에 위치하고, 삼량체 형성에 관여하는 아미노산의 일부인 109 잔기째의 아르기닌(염기성 아미노산)을 글루타민산(산성 아미노산)으로 치환한 변이체를 제작하였다. 발현 플라스미드는 Pfu-PCNA01 산생 플라스미드를 주형으로 하여 Pfu_R109E-F와 Pfu_R109E-R의 변이 도입용 올리고를 사용하여 제작하였다.
1.4.1.9 : Pfu-PCNA77
Pfu-PCNA가 호모 삼량체를 형성할 때에 계면에 위치하고, 삼량체 형성에 관여하는 아미노산의 일부인 147 잔기째의 아스파라긴산(산성 아미노산)을 아르기닌(염기성 아미노산)으로 치환한 변이체를 제작하였다. 발현 플라스미드는 Pfu-PCNA01 산생 플라스미드를 주형으로 하여 Pfu_D147R-F와 Pfu_D147R-R의 변이 도입용 올리고를 사용하여 제작하였다.
1.4.1.10 : Pfu-PCNA78
Pfu-PCNA가 호모 삼량체를 형성할 때에 계면에 위치하고, 삼량체 형성에 관여하는 아미노산의 일부인 139 잔기째의 글루타민산(산성 아미노산)을 아라닌(중성 아미노산)으로 치환한 변이체를 제작하였다. 발현 플라스미드는 Pfu-PCNA01 산생 플라스미드를 주형으로 하여 Pfu_E139A-F와 Pfu_E139A-R의 변이 도입용 올리고를 사용하여 제작하였다.
1.4.1.11 : Pfu-PCNA79
Pfu-PCNA가 호모 삼량체를 형성할 때에 계면에 위치하고, 삼량체 형성에 관여하는 아미노산의 일부인 139 잔기째의 글루타민산(산성 아미노산)을 아르기닌(염기성 아미노산)으로 치환한 변이체를 제작하였다. 발현 플라스미드는 Pfu-PCNA01 산생 플라스미드를 주형으로 하여 Pfu_E139R-F와 Pfu_E139R-R의 변이 도입용 올리고를 사용하여 제작하였다.
1.4.2 : 발현주의 제작
이상과 같이 취득한 변이형 PCNA 발현 플라스미드 벡터에 의하여 대장균 BL21 CodonPlus(DE3)RIL(스트라타진사)을 형질전환하고, 각 변이유전자의 발현 대장균주를 얻었다.
1.4.3 : 균체 배양과 발현유도
각 변이 PCNA 발현주를 1.5 리터 LB 배지(50 ㎍/mL 암피실린 함유)에서 37℃에서 진탕배양을 행하였다. 대수증식기의 OD600이 0.3 내지 0.5의 시기에 최종농도 0.1 mM이 되도록 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 발현유도를 행하고, 유도 후 배양을 약 3시간 행하였다. 배양 후의 균체는 원심분리(4℃, 6,000xg, 6분)에 의하여 회수하였다.
1.4.4. : PCNA 단백질 정제(도 5)
도 5에 나타내는 바와 같이 균체를 원심회수하고(S51), 균체파쇄(초음파파쇄, S52), 5분간 끓여, 폴리에틸렌이민 침전을 행하고(S54), 다시 유안침전을 행하고(S55), 이온 교환 크로마토그래피(S56, 칼럼으로서 HiTrap Q를 사용), 겔 여과 크로마토그래피(S57, Superdex 200을 사용)라는 처리에 의하여 표품을 조제하였다. SDS-PAGE에 의하여 양호하게 정제된 것을 확인하였다.
1.4.4.1 : 균체파쇄
원심분리에 의하여 침전된 균체는 25 mL의 버퍼(A)(50 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1 M NaCl, 2 mM 2-메르캅토에탄올, 10 % 글리세롤) 또는 버퍼(B)(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 M NaCl, 0.1 mM EDTA, 10 % 글리세롤, 05 mM DTT) 에 의하여 현탁하였다. 초음파처리에 의하여 균체를 파쇄하였다.
1.4.4.2 : 가열처리
균체파쇄액을 5분간 끓인 후, 원심분리(18, 500xg, 4℃, 25분)를 행하여 상청(上淸)을 회수하였다.
1.4.4.3 : 폴리에틸렌이민 침전
상청액에 대하여 폴리에틸렌이민(SIGMA P-3143)과 NaCl을 각각 최종농도 0.2 %(w/v), 0.58 M이 되도록 첨가하고, 빙상에서 30분간 교반하였다. 이 용액을 원심분리(18,500×g, 25분, 4℃)하여 상청을 회수하였다.
1.4.4.4. : 유안침전(硫安沈澱)
상청 10 mL 당 황산암모늄 5.61 g을 첨가하고(최종농도 80 %), 빙상에서 30분 교반하고 단백질을 침전시켰다. 이 용액에 유안을 80 % 포화시킨 50 mM Tris-HCL(pH 8.5) 버퍼 80 mL을 첨가하여 원심분리(30,000×g, 25분, 4℃)에 의하여 침전을 회수한 후, 이 침전을 버퍼(C)(50 mM Tris-HCL pH 8.0, 0.1 M NaCl)에 용해하고, 동일하게 버퍼(C)에 대하여 투석(透析)을 행하였다.
1.4.4.5 : 이온 교환 크로마토그래피
투석한 샘플은 Pfu-PCNA01, 10, 12, 13, 16에 관해서는 FPLC 단백질 정제 시스템(아마샴바이오사이언스사)을, 그 외의 Pfu-PCNA70, 71, 72, 77, 78, 79에 관해서는 AKTAexplorer 10S(아마샴바이오사이언스사)를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피(HiTrap Q; 아마샴바이오사이언스사)를 실시하였다. 용리조건은 0.1 내지 0.8 M NaCl/17.5 mL의 리니어그라디엔트로 하고, 유속은 1 mL/min으로 하였다.
1.4.4.6 : 겔 여과 크로마토그래피
HiTrap Q 이온 교환 크로마토그래피의 피크화분(畵分)을 각각 Superdex 200(아마샴바이오사이언스사)을 사용한 겔 여과 크로마토그래피에 의하여 다시 정제하고, 이후 어세이용 표품으로 하였다.
얻어진 표품을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 하여 표품의 분자의 크기 및 양호하게 정제된 것이 확인되었다(도 6 및 도 40).
1.5 : Pfu-RFC 유전자 크로닝
RFC는 2개의 서브유닛 RFCL과 RFCS로 구성되어 있고, Pyrococcus·furiosus 게놈 상에서는 탠덤으로 위치하고 있다. RFC 단백질 표품의 조제에 있어서는 RFCL과 RFCS 유전자는 개별로 발현 벡터 상에 실리고, 동일 숙주 내에 각각의 발현 벡터를 도입하고, 동시에 발현시키는 방법을 사용하였다. 발현 플라스미드의 제작에 있어서는 비특허문헌 7을 참조하였다. 이하에 상세를 나타낸다.
1.5.1 : RFCL의 유전자 크로닝과 발현 플라스미드 제작
Pfu-RFCL 유전자(NCBI GeneID1467921)는 Pfu 게놈을 주형으로 한 PCR에 의하여 얻었다(염기배열, 배열번호 13; 아미노산 배열, 배열번호 14). PCR용 프라이머로서 RFCL-F프라이머와 RFCL-R프라이머를 사용하였다(표 4; 배열번호 15 및 16). 크로닝 조작의 형편상, RFCL-F프라이머에는 제한효소 NdeI 인식부위, RFCL-R프라이머에는 제한효소 XhoI 인식부위를 각각 부가하였다.
Figure 112008000596956-PCT00004
PCR의 주형으로서는 상기 1.1에서 조제한 Pfu 게놈 DNA를 사용하였다.
PCR 반응은 다음의 조성으로 행하였다.(50 μL 반응계에의 첨가량)
주형 DNA ; 100 ng
프라이머 ; 각 10 pmol
dNTP ; 각 10 nmol
EX Taq* ; 1.25 U
10X EX Taq 버퍼 ; 5 μL
이상에 멸균증류수를 첨가하여 50 μL로 하였다.
(* 타카라바이오사제)
1.5.1.1 : PCR 반응조건
상기에서 조제한 반응액을 PCR 장치를 사용하여 95℃·30 sec → 55℃·30 sec → 72℃ 1 min을 30 사이클 반복하는 프로그램으로 PCR 반응을 행하였다.
1.5.1.2 : PCR 산물의 정제
상기 PCR 반응 산물을 1 % 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, 에티듐브로마이드 염색을 행한 후 자외선 조사하에서 1.4 kb 부근의 밴드를 포함하는 겔을 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용하여 동 조작 메뉴얼에 따라 겔 중의 PCR 산물의 정제를 행하였다.
1.5.1.3 : PCR 산물의 서브크로닝
정제한 PCR 산물은 pUC118-HincⅡ/BAP, TaKaRa BKL Kit(모두 타카라바이오사)를 이용하여 조작 메뉴얼에 준하여 라이게이션반응을 행하였다. 이 라이게이션 산물에서 대장균 E.coli DH5α(타카라바이오사)를 형질전환하고, LB 한천 플레이트(100 ㎍/mL 암피실린, IPTG, X-GAL 각 40 ㎍/mL 함유)상에 파종하고, 37℃에서 하룻밤 정치 배양하여 PCR 산물을 유지하는 대장균 클론을 얻었다.
한천 플레이트상의 백색을 보이는 대장균 콜로니를 LB 액체배지(100 ㎍/mL 암피실린 함유) 3 mL, 37℃에서 밤새껏 진탕배양하고, 정법에 따라 플라스미드 DNA를 조제하였다.
1.5.1.4 : 시퀀싱에 의한 배열 확인
상기 플라스미드 DNA에 대하여 DNA 시퀀서를 사용하여 플라스미드 벡터 pUC118의 제한효소 HincⅡ 인식부위에 삽입된 DNA 배열을 조사하였다. 그 결과, 삽입부분에는 Pfu-RFCL 유전자의 오픈 리딩 프레임을 유지하고 5'단에 제한효소 NdeI인식배열, 3'단에 제한효소 XhoI 인식배열이 부가되어 있는 것이 확인되었다. 이 플라스미드를 pUC118/RFCL이라고 하였다.
1.5.1.5 : RFCL 발현 플라스미드 제작
pUC118/RFCL을 제한효소 NdeI와 XhoI로 이중절단하여 RFCL 유전자 단편을 조제하였다. 유전자 단편은 발현 벡터에 삽입하고, Pfu-RFCL의 발현 벡터를 제작하였다.
1.5.1.6 : RFCL DNA 단편 조제
pUC118/RFCL을 이하의 반응계에서 제한효소 NdeI와 XhoI로 이중절단하였다.
플라스미드 DNA : 5 ㎍
10X 제한효소 버퍼 : 5μL
제한효소 NdeI : 5 유닛
제한효소 XhoI : 5 유닛
이상에 멸균수를 첨가하여 50 μL로 하고, 37℃에서 2시간 제한효소 절단을 행하였다. 반응종료 후 1 % 아가로스 겔 전기영동을 행한 Pfu-RFCL 유전자에 상당하는 밴드(약 1.4 kb 부근)를 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용, 동 조작 메뉴얼에 따라 겔로부터 RFCL DNA 단편의 정제를 행하였다.
1.5.1.7 : pET-29a 발현 벡터
pET-29a 벡터 DNA(노바젠사)를 이하의 반응에 의하여 제한효소 NdeI와 XhoI로 이중절단하였다.
플라스미드 DNA : 2 ㎍
10X 제한효소 버퍼 : 5μL
제한효소 NdeI : 5 유닛
제한효소 XhoI : 5 유닛
이상에 멸균수를 첨가하여 50 μL로 하고, 37℃에서 2시간 정치하였다. 반응종료 후 1 % 아가로스 겔 전기영동을 행한 pET-29a 벡터 DNA의 직선폼에 상당하는 밴드(약 5.4 kb 부근)를 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용, 동 조작 메뉴얼에 따라 겔로부터 pET-29a DNA 단편의 정제를 행하였다.
1.5.1.8 : 라이게이션반응과 형질전환
상기에서 얻은 Pfu-RFCL DNA 단편(100 ng)과 pET-29a DNA 단편(50 ng)을 DNA Ligation Kit V2(타카라바이오사)를 이용하여 이하와 같이 반응하였다.
RFCL DNA 단편 : 100 ng
pET-29a DNA 단편 : 50 ng
DNA Ligation kit V2 효소액 : 5μL
이상에 멸균수를 더하여 10 μL로 하고, 16℃에서 30분간 반응하였다.
이 라이게이션 산물(3 μL)에 의하여 100 μL 대장균 E.coli BL21(DE3)(노바젠사)을 형질전환하고, 대장균액을 LB 한천 플레이트(30 ㎍/mL 카나마이신 함유)상에 파종하고, 37℃에서 하룻밤 정치 배양하였다. 한천 플레이트상에 형성된 대장균 콜로니 중 3개를 LB 액체배지(30 ㎍/mL 카나마이신 함유) 3 mL, 37℃에서 밤새껏 진탕배양하고, 정법에 따라 플라스미드 DNA를 조제하였다.
1.5.1.9 : 시퀀싱에 의한 배열 확인
상기 플라스미드 DNA에 대하여 DNA 시퀀서를 사용하여 플라스미드 벡터 pET-29a에 삽입된 DNA 배열과 삽입부위 근방의 배열을 조사하였다. 그 결과, 어느 플라스미드 DNA에 대해서도 멀티크로닝 부위의 NdeI와 XhoI 부분에 Pfu-RFCL 유전자의 ORF(오픈 리딩 프레임)이 완전히 삽입되어 있었다. 이 Pfu-RFCL 유전자를 유지하는 플라스미드를 pRFCL이라고 부르기로 하였다(도 7).
도 7에 나타내는 바와 같이 pRFCL에서는 pET-29a가 유지하는 T7프로모터로부터 rbs(리보솜 결합부위), RFCL 유전자 ORF(오픈 리딩 프레임), T7터미네이터의 순서로 나열되어 있는 것이 확인되었다. 본 플라스미드가 RFCL 유전자를 대량 발현하는 것이 기대되었다.
1.5.2 : RFCS 유전자의 크로닝과 발현 플라스미드 제작
Pfu-RFCS 유전자(GeneID:1467922)는 비특허문헌에 의하면 인테인(1.575 염기에 의하여 코드)을 1부분 유지하고, N단의 엑스테인은 177 염기, C단의 엑스테인은 804 염기에 코드되어 있는 것이 보고되어 있다(종시코돈은 포함하지 않음). 배열번호 17 및 18에 Pfu-RFCS의 염기배열 및 아미노산 배열(모두 인테인부분을 포함함)을 나타낸다.
RFCS 발현 벡터 제작에 있어서는, 먼저 인테인을 포함하는 Pfu-RFCS 유전자 전체 길이를 PCR 반응을 이용하여 증폭하고, 그 후 인테인을 제거한 성숙형 RFCS(RFCSm이라고도 부름)를 조제하였다. 인테인 제거는 N단측과 C단측의 엑스테인을 개별로 PCR로 증폭한 후에 2종의 엑스테인 단편을 PCR 반응에 의하여 융합함으로써 실시하였다.
1.5.2.1 : 인테인을 포함하는 RFCS 유전자의 PCR 반응
Pfu 게놈(상기 1.1에서 조제), RFCS-F, RFCS-R 프라이머(표 5; 배열번호 19, 20)의 조합으로 PCR 반응을 행하였다.
PCR 반응액은 다음의 조성으로 행하였다.(50 μL 반응액계에의 첨가량)
주형 DNA ; 100 ng
프라이머 ; 각 10 pmol
dNTP ; 각 10 nmol
EX Taq* ; 1.25 U
10x EX Taq 버퍼 ; 5 μL
이상에 멸균수를 첨가하여 50 μL로 하였다.
(* 타카라바이오사제)
1.5.2.2 : PCR 반응조건
상기에서 조제한 반응액을 PCR 장치를 사용하여 95℃·30 sec → 55℃·30 sec → 72℃·1 min을 30 사이클 반복하는 프로그램으로 PCR 반응을 행하였다.
1.5.2.3 : PCR 산물의 정제
상기 PCR 반응 산물을 1 % 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, 에티듐브로마이드 염색을 행한 후 자외선 조사하에서 2.6 kb 부근의 밴드를 포함하는 겔을 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용하여 동 조작 메뉴얼에 따라 겔 중의 PCR 산물의 정제를 행하였다.
1.5.2.4 : PCR 산물의 서브크로닝
정제한 PCR 산물은 pUC118-HincⅡ/BAP, TaKaRa BKL Kit(모두 타카라바이오사)를 이용하여 조작 메뉴얼에 준하여 라이게이션반응을 행하였다. 이 라이게이션 산물에서 대장균 E.coli DH5α(타카라바이오사)를 형질전환하고, LB 한천 플레이트(100 ㎍/mL 암피실린, IPTG, X-GAL 각 40 ㎍/mL 함유)상에 파종하고, 37℃에서 하룻밤 정치 배양하여 PCR 산물을 유지하는 대장균 클론을 얻었다.
한천 플레이트상의 백색을 보이는 대장균 콜로니를 LB 액체배지(100 ㎍/mL 암피실린 함유) 3 mL, 37℃에서 밤새껏 진탕배양하고, 정법에 따라 플라스미드 DNA를 조제하였다.
1.5.2.5 : 시퀀싱에 의한 배열 확인
상기 플라스미드 DNA에 대하여 DNA 시퀀서를 사용하여 플라스미드 벡터 pUC118의 제한효소 HincⅡ 인식부위에 삽입된 DNA 배열을 조사하였다. 그 결과, 삽입부분은 인테인을 포함하는 RFCS 유전자와 일치하였다. 이 플라스미드를 pUC/RFCS라고 하였다.
1.5.2.6. : 엑스테인 증폭용 프라이머
N단측 엑스테인용 PCR 프라이머로서 RFCSF1 프라이머, RFCSR2 프라이머(표 5; 배열번호 21, 23)를 준비하였다. 또, C단측 엑스테인용 PCR 프라이머로서 RFCSF2 프라이머, RFCSR1 프라이머(표 5; 배열번호 22, 24)를 준비하였다. 크로닝을 용이하게 할 목적으로 RFCSF1 프라이머에는 제한효소 NdeI 배열, RFCSR1 프라이머에는 제한효소 SalI 배열을 5'단에 부가하고 있다. 또, 2종의 엑스테인 단편을 PCR 반응에 의하여 융합할 때에 이용하는 상보적인 배열을 RFCSF2 프라이머와 RFCSR2 프라이머로 마련하였다.
2종의 엑스테인 증폭을 위한 PCR 반응은 다음의 조성으로 행하였다. (50 μL 반응액계에의 첨가량)
pUC/RFCS DNA ; 50 ng
프라이머 ; 각 10 pmol
dNTP ; 각 10 nmol
EX Taq* ; 1.25 U
10x EX Taq 버퍼 ; 5 μL
이상에 멸균수를 첨가하여 50 μL로 하였다.
(* 타카라바이오사제)
1.5.2.7 : PCR 반응조건
상기에서 조제한 반응액을 PCR 장치를 사용하여 95℃·30 sec → 55℃·30 sec → 72℃·1 min을 30 사이클 반복하는 프로그램으로 PCR 반응을 행하였다.
1.5.2.8 : PCR 산물의 정제
상기 PCR 반응 산물을 2 % 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, 에티듐브로마이드 염색을 행하였다. RFCSF1 프라이머와 RFCSR2 프라이머 세트의 PCR 산물에서는 약 180 염기의 밴드가, RFCSF2 프라이머와 RFCSR1 프라이머 세트의 PCR 산물에서는 약 800 염기의 밴드가 관찰되었다. 자외선 조사하에서 각각의 밴드를 포함하는 겔을 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용하여 동 조작 메뉴얼에 따라 겔 중의 PCR 산물의 정제를 행하였다.
1.5.2.9 : PCR 융합반응
2종의 엑스테인 PCR 산물을 1 튜브 내에서 1 세트의 프라이머 세트로 PCR 반응에 제공함으로써 2종의 단편을 융합하고, 성숙형 RFCS를 코드하는 유전자 단편을 얻었다. 이하에 상세를 나타낸다.
2종의 엑스테인 PCR 산물의 어닐링 반응을 다음의 조성으로 행하였다.
N단 엑스테인 단편 : 2 μL(50 ng 상당)
C단 엑스테인 단편 : 2 μL(50 ng 상당)
10x EX Taq 버퍼 ; 5 μL
이상에 멸균수를 첨가하여 44.5 μL로 하였다.
상기를 95℃·3 min 가열하고, 37℃까지 30분간 천천히 냉각하였다.
상기 반응액에 이하를 첨가한다.
dNTP : 5 μL(각 10 nmol)
EX Taq* ; 5 μL(2.5 U)
이것을 72℃·10 min 반응시켰다.
(* 타카라바이오사제)
상기에 RFCSF1 프라이머와 RFCSR1 프라이머를 각 10 pmol 첨가하고, 95℃·30 sec → 55℃·30 sec → 72℃·1 min을 30 사이클 반복하는 프로그램으로 PCR 반응을 행하였다.
1.5.2.10 : PCR 산물의 제한효소 절단·정제
상기 PCR 반응 산물을 정법에 따라 에탄올 침전 정제하였다. 정제한 DNA 단편은 제한효소 NdeI와 SalI로 이중 절단하였다.
PCR 산물 : 1 ㎍ 상당
10X 제한효소 버퍼 : 5 μL
제한효소 NdeI : 5 유닛
제한효소 SalI : 5 유닛
이상에 멸균수를 첨가하여 50 μL로 하고, 37℃에서 2시간 제한효소 절단을 행하였다. 반응종료 후 2 % 아가로스 겔 전기영동을 행한 2종의 인테인의 융합단편(성숙형 RFCS 코드 배열)으로 상정되는 밴드(약 1 kb 부근)를 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용하여 정제하였다.
1.5.2.11 : pET-21a 발현 벡터의 제한효소 절단
pET-21a 벡터 DNA(노바젠사)를 이하의 반응에 의하여 제한효소 NdeI와 SalI로 이중절단하였다.
플라스미드 DNA : 2 ㎍
10X 제한효소 버퍼 : 5μL
제한효소 NdeI : 5 유닛
제한효소 SalI : 5 유닛
이상에 멸균수를 첨가하여 50 μL로 하고, 37℃에서 2시간 정치하였다. 반응종료 후 1 % 아가로스 겔 전기영동을 행한 pET-21a 벡터 DNA의 직선폼에 상당하는 밴드(약 5.4 kb 부근)를 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용, 동 조작 메뉴얼에 따라 겔로부터 pET-21a DNA 단편의 정제를 행하였다.
1.5.2.12 : 라이게이션반응과 형질전환
상기에서 얻은 2종의 인테인의 융합단편(성숙형 RFCS 코드 배열)으로 예측되는 약 1 kb의 DNA 단편(100 ng)과 pET-21a DNA 단편(50 ng)을 DNA Ligation Kit V2(타카라바이오사)를 이용하여 이하와 같이 반응하였다.
1 kb DNA 단편 : 100 ng
pET-21a DNA 단편 : 50 ng
DNA Ligation kit V2 효소액 : 5μL
이상에 멸균수를 더하여 10 μL로 하고, 16℃에서 30분간 반응하였다.
이 라이게이션 산물(3 μL)에 의하여 100 μL 대장균 E.coli BL21(DE3)(노바젠사)을 형질전환하고, 대장균액을 LB 한천 플레이트(100 ㎍/mL 암피실린 함유)상에 파종하고, 37℃에서 하룻밤 정치 배양하였다. 한천 플레이트상에 형성된 대장균 콜로니 중 3개를 LB 액체배지(100 ㎍/mL 암피실린 함유) 3 mL, 37℃에서 밤새껏 진탕배양하고, 정법에 따라 플라스미드 DNA를 조제하였다.
1.5.2.13 : 시퀀싱에 의한 배열 확인
상기 플라스미드 DNA에 대하여 DNA 시퀀서를 사용하여 플라스미드 벡터 pET-21a에 삽입된 DNA 배열과 삽입부위 근방의 배열을 조사하였다. 그 결과, 멀티크로닝 부위의 NdeI와 SalI 부분에 인테인을 제거한 성숙형 RFCSm의 배열(984 염기)가 확인되었다(pRFCSm이라고 명명).
도 8에 나타내는 바와 같이 pRFCSm에서는 pET-21a가 유지하는 T7프로모터로부터 rbs(리보솜 결합부위), 성숙형 RFCS 유전자 PRF(오픈 리딩 프레임), T7터미네이터의 순서로 나열되어 있는 것이 확인되었다. 본 플라스미드가 성숙형 RFCS 유전자를 대량 발현하는 것이 기대되었다.
1.6 : Pfu-RFC 유전자 발현주의 제작
pRFCL과 pRFCSm으로 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL을 동시에 형질전환하고, 암피실린과 카나마이신의 이중 선택으로 양쪽의 플라스미드를 유지하는 형질전환체를 선택하여 발현주를 얻었다.
1.7 : Pfu-RFC 유전자 발현
상기 발현주를 1.5 리터 LB 배지(50 ㎍/mL 암피실린 및 30 ㎍/mL 카나마이신함유)에서, 37℃에서 진탕배양을 행하였다. 대수증식기의 OD600이 0.3 내지 0.5의 시기에 최종농도 0.1 mM이 되도록 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopy ranoside)를 첨가하여 발현유도를 행하고, 유도 후 배양을 약 3시간 행하였다. 배양 후의 균체는 원심분리(4℃, 6,000xg, 6분)에 의하여 회수하였다.
1.8 : Pfu-RFC 단백질 정제
도 9에 나타내는 바와 같이 균체를 원심회수하고(S91), 초음파파쇄에 의하여 균체를 파쇄하고(S92), 5분간 끓여 처리하고(S93), 폴리에틸렌이민 침전을 행하고(S94), 유안침전을 행하고(S95), 아피니티 크로마토그래피(S96, HiTrap Heparin을 사용), 겔 여과 크로마토그래피(S97, Superdex 200을 사용) 처리로 표품을 조제하였다. SDS-PAGE에 의한 확인에서는 90 % 이상의 순도를 확보할 수 있었다.
1.8.1 : 균체파쇄
원심분리에 의하여 침전된 균체는 25 mL의 버퍼(B)(전술)에 의하여 현탁하였다. 초음파처리에 의하여 균체를 파쇄하였다.
1.8.2 : 가열처리
균체파쇄액을 5분간 끓인 후, 원심분리(18, 500xg, 4℃, 25분)를 행하여 상청을 회수하였다.
1.8.3 : 폴리에틸렌이민 침전
상청액에 대하여 폴리에틸렌이민(SIGMA P-3143)을 최종농도 0.18 %(w/v)가 되도록 첨가하고, 빙상에서 30분간 교반하였다. 이 용액을 원심분리(18,500×g, 25분, 4℃)하여 상청을 회수하였다.
1.8.4 : 유안침전
상청 10 mL 당 황산암모늄 5.61 g을 첨가하고(최종농도 80 %), 빙상에서 30분 교반하여 단백질을 침전시켰다. 원심분리(18,500xg, 4℃, 25분)에 의하여 침전을 회수한 후, 이 침전을 버퍼(C)(전술)에 용해하고, 동일하게 버퍼(C)에 대하여 투석을 행하였다.
1.8.5 : 아피니티 크로마토크로마토그래피
투석한 샘플은 HiTrap Heparin HP 칼럼(아마샴바이오사이언스사)을 사용하여 정제하였다.
용리조건은 0.1 내지 0.8 M NaCl/17.5 mL의 리니어그라디엔트로 하고, 유속은 1 mL/min으로 하였다.
1.8.6 : 겔 여과 크로마토그래피
HiTrap Heparin 아피니티 크로마토그래피에서의 피크화분을 각각 Superdex 200(전술)을 사용한 겔 여과 크로마토그래피에 의하여 다시 정제하고, 어세이용 표품으로 하였다. 얻어진 표품을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 하여 표품의 분자의 크기 및 양호하게 정제된 것이 확인되었다(도 10).
2 : PCNA 변이체의 평가
상기에서 조제한 각종 PCNA 변이체의 DNA 증폭계에의 효과, 특히 PCR 반응계에의 효과를 조사하였다. 구제적으로는 PCR 반응계에 PCNA 변이체, RFC를 단독 또는 병용하여 첨가한 경우, 미첨가의 경우에서 PCR 반응을 행하고, 그 반응 산물을 전기영동에 제공하아 표적(標的) 영역의 증폭상태를 비교함으로써 행하였다.
2.1 : 각종 PCNA 변이체의 평가
Pyrococcus속 유래의 DNA 합성효소로서 시판되고 있는 Pyrobest DNA Polymerase(타카라바이오사)를 대상으로 하여 각종 PCNA 변이체의 첨가효과를 PCR 반응의 계를 이용하여 조사하였다. Pyrobest DNA Polymerase는 Pyrococcus·sp. 유래의 3'→5' exonuclease 활성(proof reading 활성)을 가지는 내열성 α형 DNA 폴리머라아제이다. Pyrococcus·furiosus 유래의 Pfu DNA 폴리머라아제나 Vent DNA 폴리머라아제와 동등한 정확성이 높은 증폭을 행하는 것이 특징이다.
2.1.1 : 반응액 조성
액세서리 단백질(AP라고도 함)을 첨가하는 점을 제외하고는 표준적인 PCR 반응액의 조성으로 하고, 버퍼로서는 첨부반응 버퍼(10x Pyrobest Buffer Ⅱ; 조성은 미공표, 타카라바이오사)를 사용하였다. 이하에 PCR 반응액의 조성을 나타낸다. 또한, 주형 DNA로서는 람다 DNA(GenBank accession 02459)를 사용하였다.
Figure 112008000596956-PCT00006
Figure 112008000596956-PCT00007
2.1.2 :PCR 반응 프로그램
2 kb 증폭의 경우
94℃·1 min → (98℃·5 sec → 68℃·1 min)30 cycles → 4℃에서 유지
8.4 kb 증폭의 경우
94℃·1 min → (98℃·5 sec → 68℃·3.5 min)30 cycles → 4℃에서 유지
15.8 kb 증폭의 경우
94℃·1 min → (98℃·5 sec → 68℃·7 min)30 cycles → 4℃에서 유지
2.1.3 : 전기영동
PCR 반응종료 후, 50 μL의 PCR 반응용액에 대하여 10x 로딩 버퍼(Glycerol 50 %, Bromphenol Blue 0.4 %, Xylene Cyanol 0.4 %)를 5 μL 첨가, 혼합한 후, 1 % 아가로스 겔 전기영동을 행하였다. 전기영동 마커로서 람다/StyI 마커(토요보사)를 사용하였다. 결과를 증폭한 단편의 크기별로 각각 도 11 내지 도 13(PCNA01, 10, 12, 13, 16), 도 41 내지 43(PCNA01, 10, 13, 70, 71) 및 도 44 내지 도 46(PCNA13, 72, 77, 78, 79)에 나타낸다.
Figure 112008000596956-PCT00008
Figure 112008000596956-PCT00009
2.1.4 : 결과 1
도 11 내지 도 13의 결과에 대하여 설명한다.
PCNA01
증폭 사이즈가 2 kb, 8.4 kb일 때는 RFC를 400 ng 첨가하였을 때에만 증폭이 보여지나, 그 외의 경우에는 PCNA01의 첨가는 미첨가(no AP)의 경우와 비교하여 저해적으로 작용하고 있다. 이는 야생형 PCNA를 사용할 때에는 RFC를 적당량 병용하지 않으면 증폭을 할 수 없다고 하는 결과이고, 단독 첨가로 DNA 합성 촉진 활성을 나타내는 프라이머 엑스텐션 시험결과(비특허문헌 6 및 9)와 다르고, PCR에 있어서는 야생형 PCNA의 단독 첨가는 반응을 명확하게 저해하는 것을 나타내고 있다.
PCNA10
증폭 사이즈가 2 kb, 8.4 kb일 때는 RFC를 200 ng, 400 ng 첨가하였을 때에 증폭이 보여지나, 15.8 kb의 경우에는 RFC 400 ng 첨가시만 증폭이 관찰된다. 증폭량은 PCNA01의 경우보다 우수하나, PCNA01과 동일하게 RFC의 존재가 필요하고, 증폭 사이즈에 따라 RFC의 지적(至適) 첨가량이 다른 것이 시사된다.
PCNA12
증폭 사이즈 2 kb, 8.4 kb, 15.8 kb의 어느 경우에도 RFC를 첨가함으로써 증폭량이 촉진되는 것이 관찰되었다. 또 RFC 미첨가에 있어서도 증폭하였다. 단 PCR 효소단독에 비하여 약간의 증폭촉진밖에 관찰되지 않았다.
PCNA13
증폭 사이즈 2 kb, 8.4 kb, 15.8 kb의 어느 경우에도 대량의 증폭이 확인되고, 증폭량은 RFC의 첨가량에 의존하지 않는다. PCNA13의 첨가효과에는 RFC를 필요로 하지 않고, PCR에 의한 증폭을 현저하게 촉진하고 있다고 생각된다.
PCNA16
증폭 사이즈 2 kb, 8.4 kb, 15.8 kb의 어느 경우에도 증폭이 확인된다. RFC 미첨가에 있어서도 증폭하였으나, PCR 효소 단독과 동등한 증폭레벨이다. 또 RFC 첨가의 효과가 그다지 관찰되지 않는다.
5종의 PCNA에 대하여 Pyrobest DNA polymerase를 사용하는 PCR 반응계에의 첨가효과의 확인을 행하였으나, PCNA13에 대해서는 미첨가시와 비교하여 압도적으로 첨가시의 증폭효과가 높고, 또 RFC의 첨가를 필요로 하지 않는 것이 판명되었다.
2.1.5 : 결과 2
도 41 내지 43의 결과에 대하여 설명한다.
PCNA01(준야생형)
2.1.4에서의 결과와 마찬가지로, RFC를 400 ng 첨가한 경우 이외는 어느 사이즈에 있어서도 증폭이 확인되지 않고, PCNA 미첨가(no AP)의 경우와 비교하여 저해적으로 작용하였다.
PCNA10(D143A)
증폭 사이즈가 2 kb의 경우는 RFC를 200 내지 400 ng, 8.4 kb의 경우는 400 ng 첨가하였을 때에 명료한 증폭이 보여지고, 15.8 kb일 때는 RFC 400 ng 첨가에서도 증폭은 확인되지 않았다. 2.1.4에서의 결과와 마찬가지로 증폭량으로서는 PCNA01보다도 우수하나, 증폭에는 RFC의 존재가 필수이고, 증폭 사이즈에 따라 RFC의 지적 첨가량이 다른 것이 시사되었다.
PCNA71(D143H)
RFC 미첨가에서는 증폭이 확인되지 않았으나, 증폭 사이즈가 2 kb와 8.4 kb의 경우는 RFC 200 내지400 ng, 15.8 kb의 경우는 400 ng 첨가한 경우에 증폭이 확인되었다. PCNA10에 비하여 증폭량은 더 많아지고는 있으나, 증폭에는 RFC의 첨가가 필요하였다.
PCNA70(D143K)
RFC의 유무, 첨가량에 의존하지 않고, 어느 사이즈에 있어서도 대량의 증폭이 관찰되었다.
PCNA13(D143R)
2.1.4에서의 결과와 마찬가지로 어느 사이즈에 있어서도 RFC에 의존하지 않고 대량의 증폭이 관찰되고, 증폭 레벨은 PCNA70보다도 양호하였다.
PCNA의 143 잔기째에 변이를 도입한 변이체 4종(PCNA10, 13, 70, 71)에 대해서 PCR 반응계에의 첨가효과를 검증하였으나, RFC에 의존하지 않는 촉진효과를 나타낸 것은 PCNA70(D143K)와 PCNA13(D143R)뿐이고, 보다 염기성도가 높은 아르기닌 잔기로 치환한 PCNA13이 가장 강한 촉진효과를 나타내었다. 따라서, D143 잔기에의 변이도입에 의하여 PCNA 단독에서의 PCR 촉진효과를 가져오기 위해서는 염기성을 나타내는 아미노산 잔기에의 치환이 필요하고, 그 치환한 잔기가 PCR 반응조건 하(pH 8.0 내지)에서 가지는 정전하가 단량체 계면의 이온쌍 네트워크에 대하여 전하적 반발을 일으키는 것이 중요한 것이라고 생각된다.
2.1.6 : 결과 3
도 44 내지 46의 결과에 대하여 설명한다.
PCNA13(D143R)
2.1.4, 2.1.5에서의 결과와 마찬가지로, 어느 사이즈에 있어서도 RFC에 의존하지 않고 대량의 증폭이 관찰되었다.
PCNA77(D147R)
RFC의 유무, 첨가량에 의존하지 않고, 어느 사이즈에 있어서도 대량의 증폭이 관찰되었으나, 그 증폭량은 PCNA13보다도 열화되어 있었다.
PCNA72(R109E)
어느 사이즈의 증폭의 경우에도 RFC의 유무, 첨가량에 의존하지 않고, 미첨가(no AP)의 경우와 비교하여 거의 변화가 확인되지 않았다.
PCNA79(E139R)
어느 사이즈의 증폭의 경우에도 RFC를 200 내지 400 ng 동시 첨가함으로써 촉진효과가 확인되었으나, 증폭에는 RFC의 의존이 필수이고, PCNA79의 단독 첨가에서는 반응을 저해하였다.
PCNA78(E139A)
어느 사이즈의 증폭의 경우에도 RFC를 200 내지 400 ng 동시 첨가함으로써 촉진효과가 확인되었으나, 증폭에는 RFC의 존재가 필수이고, PCNA78의 단독 첨가에서는 반응을 저해하였다. 또, PCNA79와의 비교에서는 RFC를 200 ng 동시 첨가하는 경우에는 증폭 사이즈에 따라 열화가 달랐으나, RFC를 400 ng 동시 첨가하는 경우에는 그 증폭량은 PCNA79보다도 열화되어 있었다. E139로 치환도입하는 경우에도 중성 아미노산(아라닌)보다도 염기성 아미노산(아르기닌)으로 치환하는 쪽이 효과가 크다고 생각된다.
Pfu-PCNA가 호모 삼량체를 형성할 때에 계면에 위치하고, 삼량체 형성에 관여하는 아미노산 중 4종으로 치환 변이 도입한 변이체의 PCR 반응계에의 첨가효과를 검증하였으나, 3개의 타입으로 분류되었다. 단독 첨가에서는 반응을 저해하나, RFC를 동시에 첨가하면 RFC의 첨가량 의존적으로 반응이 회복하고, 첨가량에 따라서는 미첨가(no AP)의 경우보다 우수한 증폭이 확인된다는 것. 단독 첨가, RFC 동시 첨가 모두 미첨가(no AP)의 경우와 거의 변화가 확인되지 않는, 반응에 관여하고 있지 않다고 추측되는 것. RFC의 유무에 관계없이 반응을 촉진하는 것이다. 포인트는 삼량체의 형성능에 있고, 이온쌍 네트워크를 약하게 하는 가감에 의한 현상이라고 생각된다. 즉, 삼량체 구조가 너무 견고하면 RFC의 도움이 없으면 반응이 진행되지 않는다. 삼량체 형성능을 잃으면 크램프로서 기능할 수 없다. 그 중간의 적도(適度)에 삼량체 구조가 약해진 상태가 PCR에서의 효소활성촉진에 중요한 것이라고 추측된다.
단량체 계면의 이온쌍 네트워크에 대하여 전하적 반발을 일으킴으로써 PCR에서의 효소활성촉진에 유효한 삼량체 형성능을 실현하고 있는 것으로 생각된다. 또, 열안정성에도 기여하고 있다고 추측되는 이온쌍 네트워크를 약하게 함으로써, 고온하에서 삼량체가 해리하기 쉬워진다고 생각된다. PCR에서의 다음 사이클로의 온도상승시, 또는 사이클 최초의 변성 단계의 고온시에 삼량체가 해리함으로써 복제반응이 반복된다고 하는 반응기구가 추찰된다.
11종의 변이체에 대하여 PCR 반응계에의 첨가효과의 확인을 행하였으나, RFC에 의존하지 않는 촉진효과를 나타낸 것은 PCNA13(D143R), PCNA70(D143K), PCNA77(D147R)의 3종으로, 그 중에서도 PCNA13이 가장 강한 압도적인 증폭효과를 나타내었다. 또, RFC를 동시 첨가함으로써 오히려 증폭량이 감소하는 경향도 볼 수 있었다.
2.2 : PCNA13의 각종 PCR용 DNA 폴리머라아제에 대한 효과
상기 결과를 받아, 각종 PCNA 변이체 중 특히 성질이 우수한 PCNA13에 대하여 시판의 7종의 PCR용 DNA 폴리머라아제를 사용한 PCR 반응계를 대상으로 첨가효과를 조사하였다. 구체적으로는 2 내지 3 종류의 증폭사슬 길이가 다른 표적 배열에 대하여 신장시간이 다른 PCR 반응을 행하고, 첨가효과를 확인하였다.
2.2.1 : Pyrobest DNA Polymerase에 대한 PCNA13 첨가효과
Pyrobest DNA Polymerase는 Pyrococcus·sp. 유래의 3'→5' exonuclease 활성(proof reading 활성)을 가지는 내열성 α형 DNA 폴리머라아제이다.
PCNA13의 첨가를 제외하고는 제조회사가 취급하는 설명서에서 추장하는 PCR 반응액의 조성으로 하고, 버퍼로서는 제품 첨부반응 버퍼(10x Pyrobest Buffer Ⅱ; 조성은 미공표, 타카라바이오사)를 사용하였다. 이하에 PCR 반응액의 조성을 나타낸다.
Figure 112008000596956-PCT00010
PCR 반응 프로그램:
2 kb 증폭의 경우
94℃·1 min → (98℃·5 sec → 68℃·0.5, 1, 2 min)30 cycles → 4℃에서 유지
8.4 kb 증폭의 경우
94℃·1 min → (98℃·5 sec → 68℃·2, 3.5, 5 min)30 cycles → 4℃에서 유지
15.8 kb 증폭의 경우
94℃·1 min → (98℃·5 sec → 68℃·2, 5, 6, 7 min)30 cycles → 4℃에서 유지
전기영동:
PCR 반응종료 후, 50 μL의 PCR 반응용액에 대하여 10x 로딩 버퍼(Glycerol 50 %, Bromphenol Blue 0.4 %, Xylene Cyanol 0.4 %)를 5 μL 첨가, 혼합한 후, PCR 반응액의 10 μL 상당량을 1 % 아가로스 겔 전기영동에 제공하았다. 전기영동 마커로서 람다/StyI 마커(토요보사)를 사용하였다. 결과를 증폭한 단편의 크기별로 각각 도 14 내지 16에 나타낸다.
정리
2 kb 증폭의 경우
도 14에 나타내는 바와 같이 신장시간(Extension time) 0.5 min, 1 min에서 PCNA13 첨가에 의한 반응촉진이 명확하게 관찰된다. 신장시간(Extension time) 2 min에서는 반응이 포화에 가까운 상태이나, 역시 PCNA13 첨가시의 쪽이 약간 증폭량이 많은 것이 관찰된다.
8.4 kb 증폭의 경우
도 15에 나타내는 바와 같이 신장시간(Extension time) 2 min에서는 첨가효과는 보여지지 않으나, 3.5 min, 5 min에서는 첨가에 의한 촉진효과가 관찰된다.
15.8 kb 증폭의 경우
도 16에 나타내는 바와 같이 신장시간(Extension time) 2 min에서는 첨가효과는 보여지지 않으나, 5 min, 6 min, 7 min에서는 첨가에 의한 촉진효과가 관찰된다.
2.2.2 : TaKaRa EX Taq에 대한 PCNA13 첨가효과
TaKaRa EX Taq(타카라바이오사)는 3'→5' exonuclease 활성(proof reading 활성)을 가지는 내열성 DNA Polymerase이다. 통상의 PCR 조건 하에 있어서, 종래의 Taq DNA Polymerase에 비하여 높은 증폭효율, 낮은 에러율로 고감도의 PCR을 실현할 수 있다.
PCNA13의 첨가를 제외하고는 제조회사가 취급하는 설명서에서 추장하는 PCR 반응액의 조성으로 하고, 버퍼로서는 제품 첨부반응 버퍼 10x Ex Taq buffer〔20 mM, Mg2+ plus); 조성은 미공표, 타카라바이오사〕를 사용하였다. 이하에 PCR 반응액의 조성을 나타낸다.
Figure 112008000596956-PCT00011
PCR 반응 프로그램:
2 kb 증폭의 경우
94℃·1 min → (98℃·5 sec → 68℃·30 sec, 40 sec, 1 min)30 cycles → 72℃·10 min → 4℃에서 유지
8.4 kb 증폭의 경우
94℃·1 min → (98℃·5 sec → 68℃·1.5 min, 2 min, 3 min)30 cycles → 72℃·10 min → 4℃에서 유지
15.8 kb 증폭의 경우
94℃·1 min → (98℃·5 sec → 68℃·3.5 min, 4 min, 5 min)30 cycles → 72℃·10 min → 4℃에서 유지
전기영동:
PCR 반응종료 후, 50 μL의 PCR 반응용액에 대하여 10x 로딩 버퍼(Glycerol 50 %, Bromphenol Blue 0.4 %, Xylene Cyanol 0.4 %)를 5 μL 첨가, 혼합한 후, PCR 반응액의 10 μL 상당량을 1 % 아가로스 겔 전기영동에 제공하았다. 전기영동 마커로서 람다/StyI 마커(토요보사)를 사용하였다. 결과를 증폭한 단편의 크기별로 각각 도 17 내지 도 19에 나타낸다.
정리 :
2 kb 증폭의 경우
도 17에 나타내는 바와 같이 신장시간(Extension time) 30 sec, 40 sec에서 PCNA13 첨가에 의한 증폭량과 반응속도의 증대가 명확하게 관찰된다. 신장시간(Extension time) 1 min에서는 첨가, 미첨가에 의하지 않고 반응이 포화에 달하고 있으나, 40 sec의 PCNA13 첨가시의 증폭량이 대략 반응의 포화상태에 가까운 것을 알 수 있다.
8.4 kb 증폭의 경우
도 18에 나타내는 바와 같이 신장시간(Extension time) 1.5 min, 2 min에서는 PCNA13 첨가에 의한 증폭량과 반응속도의 증대가 명확하게 관찰된다. 신장시간(Extension time) 3 min에서는 첨가, 미첨가에 의하지 않고 반응이 포화에 달하고 있으나, 2 min의 PCNA13 첨가시의 증폭량이 대략 반응의 포화상태에 가까운 것을 알 수 있다.
15.8 kb 증폭의 경우
도 19에 나타내는 바와 같이 신장시간(Extension time) 3.5 min, 4 min에서 PCNA13 첨가에 의한 증폭량과 반응속도의 증대가 명확하게 관찰된다. 신장시간(Extension time) 5 min에서는 첨가, 미첨가에 의하지 않고 반응이 포화에 달하고 있으나, 4 min의 PCNA13 첨가시의 증폭량이 대략 반응의 포화상태에 가까운 것을 알 수 있다.
2.2.3 : Vent DNA polymerase에 대한 PCNA13 첨가효과
Vent DNA polymerase는 호열균 Thermococcus litoralis 유래의 DNA polymerase에서 NEW ENGLAND Bio Labs사로부터 시판되고 있는 PCR용 효소이다.
평가에 있어서는, PCNA13의 첨가를 제외하고는 표준적인 PCR 반응액의 조성으로 하고, 버퍼로서는 제품 첨부 반응 버퍼〔(10x ThermoPol Reaction Buffer; 200 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 100 mM KCl, 20 mM MgSO4, 1 % Triton X-100, pH 8.8 @ 25℃〕를 사용하였다. 이하에 PCR 반응액의 조성을 나타낸다.
Figure 112008000596956-PCT00012
PCR 반응 프로그램:
2 kb 증폭의 경우
95℃·2 min → (95℃·30 sec → 55℃·30 sec → 72℃·5 sec, 15 sec, 30 sec)30 cycles → 72℃·10 min → 4℃에서 유지
8.4 kb 증폭의 경우
95℃·2 min → (95℃·30 sec → 55℃·30 sec → 72℃·1 min, 3 min, 5 min)30 cycles → 72℃·10 min → 4℃에서 유지
전기영동:
PCR 반응종료 후, 50 μL의 PCR 반응용액에 대하여 10x 로딩 버퍼(Glycerol 50 %, Bromphenol Blue 0.4 %, Xylene Cyanol 0.4 %)를 5 μL 첨가, 혼합한 후, PCR 반응액의 10 μL 상당량을 1 % 아가로스 겔 전기영동에 제공하았다. 전기영동 마커로서 람다/StyI 마커(토요보사)를 사용하였다. 결과를 증폭한 단편의 크기별로 각각 도 20, 도 21에 나타낸다.
정리 :
2 kb 증폭의 경우
도 2O에 나타내는 바와 같이 신장시간(Extension time) 5 sec, 15 sec에서 PCNA13 첨가에 의한 반응촉진이 명확하게 관찰된다. 신장시간(Extension time) 30 sec에서는 반응이 포화에 가까운 상태이나, 역시 PCNA13 첨가시의 쪽이 약간 증폭량이 많은 것이 관찰된다.
8.4 kb 증폭의 경우
도 21에 나타내는 바와 같이 신장시간(Extension time) 1 min, 3 min, 5 min에서 첨가에 의한 촉진효과(증폭량, 반응속도)가 관찰된다.
2.2.4 : Deep Vent DNA polymerase에 대한 PCNA13 첨가효과
Deep Vent DNA polymerase(NEW England Biolabs사)는 Pyrococcus species GB-D1 유래의 내열성 DNA 폴리머라아제이고, 3'→5' 엑소뉴클리아제 활성을 유지한다.
평가에 있어서는, PCNA13의 첨가를 제외하고는 표준적인 PCR 반응액의 조성으로 하고, 버퍼로서는 제품 첨부 반응 버퍼〔(10x ThermoPol Reaction Buffer; 200 mM Tris-HCl, 10 mM(NH4)2SO4, 100 mM KCl, 20 mM MgSO4, 1 % Triton X-100, pH 8.8 @ 25℃〕를 사용하였다. 이하에 PCR 반응액의 조성을 나타낸다.
Figure 112008000596956-PCT00013
PCR 반응 프로그램:
2 kb 증폭의 경우
95℃·2 min → (95℃·30 sec → 55℃·30 sec → 72℃·0.5 min, 1 min, 2 min, 3 min)30 cycles → 72℃·10 min → 4℃에서 유지
8.4 kb 증폭의 경우
95℃·2 min → (95℃·30 sec → 55℃·30 sec → 72℃·5 min, 7 min, 9 min)30 cycles → 72℃·10 min → 4℃에서 유지
전기영동:
PCR 반응종료 후, 50 μL의 PCR 반응용액에 대하여 10x 로딩 버퍼(Glycerol 50 %, Bromphenol Blue 0.4 %, Xylene Cyanol 0.4 %)를 5 μL 첨가, 혼합한 후, PCR 반응액의 10 μL 상당량을 1 % 아가로스 겔 전기영동에 제공하았다. 전기영동 마커로서 람다/StyI 마커(토요보사)를 사용하였다. 결과를 증폭한 단편의 크기별로 각각 도 22, 도 23에 나타낸다.
정리 :
2 kb 증폭의 경우
도 22에 나타내는 바와 같이 신장시간(Extension time) 0.5 min, 1 min, 2 min에서 PCNA13 첨가에 의한 반응촉진이 명확하게 관찰된다. 신장시간(Extension time) 3 min에서는 첨가, 미첨가에 의하지 않고 반응이 포화에 달하고 있으나, 2 min 의 PCNA13 첨가시의 증폭량이 거의 반응의 포화상태에 가까운 것을 알 수 있다.
8.4 kb 증폭의 경우
도 23에 나타내는 바와 같이 어느 신장시간(Extension time) 5 min, 7 min, 9 min에 있어서도 첨가에 의한 촉진효과(증폭량, 반응속도)가 관찰된다.
2.2.5 : Pfu Turbo DNA Polymerase에 대한 PCNA13 첨가효과
Pfu Turbo DNA Polymerase(스트라타진사)는 Pyrococcus·furiosus 유래의 내열성 DNA 폴리머라아제에 ArchaeMaxx(R)((R)은 등록상표인 것을 나타냄) Factor라고 불리우는 PCR 반응촉진제를 첨가한 제품이다. PCR 반응과정에서 부차적으로 산생되는 dUTP는 PCR 반응을 저해하는 것이 알려져 있으나, ArchaeMaxx(R)Factor는 dUTP를 분해하는 인자이고, 이것을 첨가함으로써 PCR 반응의 저해를 방지하고, 결과적으로 PCR 반응효율을 높이고 있다.
평가에 있어서는, PCNA13의 첨가를 제외하고는 표준적인 PCR 반응액의 조성으로 하고, 버퍼로서는 제품 첨부 반응 버퍼〔(10x Cloned Pfu DNA polymerase reaction buffer; 200 mM Tris-HCl(pH 8.8), 100 mM(NH4)2SO4, 100 mM KCl, 20 mM MgSO4, 1 % Triton X-100, 1 mg/ml BSA〕를 사용하였다. 이하에 PCR 반응액의 조성을 나타낸다.
Figure 112008000596956-PCT00014
PCR 반응 프로그램:
2 kb 증폭의 경우
95℃·2 min → (95℃·30 sec → 55℃·30 sec → 72℃·1 min)30 cycles → 72℃·10 min → 4℃에서 유지
8.4 kb 증폭의 경우
92℃·2 min → (92℃·10 sec → 55℃·30 sec → 68℃·8 min)10 cycles → (92℃·10 sec → 55℃·30 sec → 68℃·8 min + 10 sec/cycle) 20 cycles → 4℃에서 유지
15.8 kb 증폭의 경우
92℃·2 min → (92℃·10 sec → 55℃·30 sec → 68℃·15 min)10 cycles → (92℃·10 sec → 55℃·30 sec → 68℃·15 min + 10 sec/cycle) 20 cycles → 4℃에서 유지
전기영동:
PCR 반응종료 후, 50 μL의 PCR 반응용액에 대하여 10x 로딩 버퍼(Glycerol 50 %, Bromphenol Blue 0.4 %, Xylene Cyanol 0.4 %)를 5 μL 첨가, 혼합한 후, PCR 반응액의 10 μL 상당량을 1 % 아가로스 겔 전기영동에 제공하았다. 전기영동 마커로서 람다/StyI 마커(토요보사)를 사용하였다.
정리 :
도 24에 나타내는 바와 같이 어느 사이즈의 PCR 반응에 있어서도 PCNA13의 첨가에 의하여 반응속도의 촉진, 증폭량의 증대의 효과가 관찰되었다.
2.2.6 : KOD DNA Polymerase에 대한 PCNA13 첨가효과
KOD DNA Polymerase(토요보사)는 초호열 시원균 Thermococcus·kodakaraensis KOD1주 유래의 DNA Polymerase이다. Polymerase 활성 외, 강한 3'→5' Exonuclease 활성(Proofreading 활성)을 가지기 때문에, Taq DNA Polymerase보다 약 50배의 높은 PCR Fidelity를 나타낸다. 시판되고 있는 Pyrococcus속 유래를 주로 한 다른 고정확성 PCR용 효소는 신장속도가 늦는 것이 많으나, 본 효소는 신장속도가 매우 빠르고, Taq DNA Polymerase의 약 2배의 신장속도를 가진다. 그 때문에 정확성이 높은 PCR을 단시간에 행하는 것이 가능하다.
평가에 있어서는, PCNA13의 첨가를 제외하고는 표준적인 PCR 반응액의 조성으로 하고, 버퍼로서는 제품 첨부 반응 버퍼〔10x PCR buffer #1; 1.2 M Tris-HCl(pH 8.0, 60 mM (NH4)2SO4, 100 mM KCl, 1 % TritonX-100, 0.01 % BSA 또는 10x PCR buffer #2; 1.2 M Tris-HCl pH 8.8, 60 mM (NH4)2SO4, 100 mM KCl, 1 % TritonX-100, 0.01 % BSA〕를 사용하였다. 이하에 PCR 반응액의 조성을 나타낸다.
Figure 112008000596956-PCT00015
PCR 반응 프로그램:
2 kb 증폭의 경우
94℃·1 min → (98℃·10 sec → 68℃·12 sec)30 cycles → 72℃·3 min → 4℃에서 유지
8.4 kb, 15.8 kb 증폭의 경우
94℃·1 min → (98℃·10 sec → 68℃·2 min)30 cycles → 72℃·3 min → 4℃에서 유지
전기영동:
PCR 반응종료 후, 50 μL의 PCR 반응용액에 대하여 10x 로딩 버퍼(Glycerol 50 %, Bromphenol Blue 0.4 %, Xylene Cyanol 0.4 %)를 5 μL 첨가, 혼합한 후, PCR 반응액의 10 μL 상당량을 1 % 아가로스 겔 전기영동에 제공하았다. 전기영동 마커로서 람다/StyI 마커(토요보사)를 사용하였다.
정리:
도 25에 나타내는 바와 같이 어느 사이즈의 PCR 반응에 있어서도 PCNA13의 첨가에 의하여 반응속도의 촉진, 증폭량의 증대의 효과가 관찰되었다.
2.2.7 : Pwo DNA Polymerase에 대한 PCNA13 첨가효과
Pwo DNA Polymerase(로셰 다이아그노스틱스사)는 호열성 고세균 Pyrococcus·woesei주 유래의 DNA Polymerase이다. Polymerase 활성 외, 강한 3'→5' Exonuclease 활성(Proofreading 활성)을 가지기 때문에, Taq DNA Polymerase보다 높은 PCR Fidelity를 나타낸다. 그 때문에 정확성이 높은 PCR을 단시간에 행하는 것이 가능하다.
평가에 있어서는, PCNA13의 첨가를 제외하고는 제조회사가 취급하는 설명서에서 추장하는 PCR 반응액의 조성으로 하고, 버퍼로서는 제품 첨부 반응 버퍼〔10x PCR buffer; 100 mM Tris-HCl pH 8.85, 50 mM (NH4)2SO4, 250 mM KCl, 20 mM MgSO)〕를 사용하였다. 이하에 PCR 반응액 조성을 나타낸다.
Figure 112008000596956-PCT00016
PCR 반응 프로그램:
2 kb 증폭의 경우
94℃·1 min → (98℃·10 sec → 68℃·30 sec 또는 1 min)30 cycles → 72℃·3 min → 4℃에서 유지
8.4 kb 증폭의 경우
95℃·2 min → (95℃·30 sec → 60℃·30 sec → 72℃·2 min 또는 4 min)30 cycles → 72℃·3 min → 4℃에서 유지
전기영동:
PCR 반응종료 후, 50 μL의 PCR 반응용액에 대하여 10x 로딩 버퍼(Glycerol 50 %, Bromphenol Blue 0.4 %, Xylene Cyanol 0.4 %)를 5 μL 첨가, 혼합한 후, PCR 반응액의 10 μL 상당량을 1 % 아가로스 겔 전기영동에 제공하았다. 전기영동 마커로서 람다/StyI 마커(토요보사)를 사용하였다.
정리:
도 26에 나타내는 바와 같이 어느 사이즈의 PCR 반응, 신장시간에 있어서도 PCNA13의 첨가에 의하여 반응속도의 촉진, 증폭량의 증대의 효과가 관찰되었다.
이상의 실시예에 나타낸 바와 같이, PCNA13은 대표적인 시판의 7종의 PCR용 DNA 폴리머라아제에 대하여 우수한 신장 촉진 활성을 발휘하는 것이 증명되었다. 또, 사용한 PCNA13은 Pyrococcus furiosus 유래의 PCNA 변이개량체이나, Pyrococcus furiosus 유래의 DNA 폴리머라아제뿐만 아니라 균종이 다른 DNA 폴리머라아제에 대해서도 유효한 것이 나타났다.
3 : KOD-PCNA·RFC 단백질의 조제
Thermococcus kodakaraensis KOD1주 유래의 PCNA 변이체 단백질 표품과 RFC 단백질 표품은 대장균 내에서 이들 유전자를 대량 발현시키고, 발현균체로부터 단백질을 정제함으로써 조제하였다.
3.1 : 균체 입수· 게놈 DNA 조제
Thermococcus kodakaraensis KOD1주는 JCM(JAPAN COLLECTION OF MICROORGANISMS)로부터 10 mL의 배양액으로서 입수하였다(JCM NO.12, 380). 이 배양액을6,000xg, 15 min, 4℃에서 원심하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체는 1 mL의 TBS 버퍼(50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl)에 현탁, 세정하고, 15,000xg, 5 min, 4℃의 원심조작으로 회수하였다.
침전물을 100 μL의 용균 버퍼(50 mM Tris-HCl·pH 8.0, 50 mM EDTA·pH 8.0, 0.5 % SDS)에 용해하고, 50℃에서 3시간의 인큐베이션 반응을 행하였다. 그 후 이 반응액에 10 μL 페놀/클로로포름용액을 첨가하였다. 또한 이 용액을 15,000xg, 5 min, 실온에서 원심분리 조작을 행하고, 상청 약 100 μL을 회수하였다. 이 상청용액을 Mag Extractor Genome 키트(토요보)를 이용하고, 동 조작 메뉴얼에 따라 게놈 DNA를 회수하였다.
3.2 : KOD-PCNA의 조제
3.2.1 : KOD-PCNA 유전자 크로닝
KOD-PCNA 유전자는 Genbank ID BD182828(배열번호 31 및 배열번호 32)를 참고로 하여, PCR을 이용한 크로닝(도 27)에 의하여 획득하였다. 이하에 상세를 설명한다.
3.2.1.1 : PCR 프라이머
KOD-PCNA 유전자 증폭용에는 KOD-PCNA-F, KOD-PCNA-R을 사용하였다. 이 프라이머 세트는 PCNA 유전자의 개시 메티오닌으로부터 종지 코돈에 상당하는 영역을 증폭하고, 또한 5'측에 제한효소 NdeI 인식부위, 제한효소 XhoI 인식부위가 부가되도록 설계되어 있다. 각각의 프라이머의 배열은 표 17(배열번호 33 및 34)에 나타내었다.
Figure 112008000596956-PCT00017
3.2.1.2 : PCR 반응액 조성
PCR 반응액은 다음의 조성으로 행하였다. (50 μL 반응액계에의 첨가량)
주형 DNA* : 100 ng
프라이머 : 각 10 pmol
dNTP : 각 10 nmol
EX Taq** : 1.25 U
10xExTaq 버퍼 : 5 μL
이상에 멸균수를 첨가하여 5 μL로 하였다.
(*주형 DNA : 3.1에서 조제한 게놈 DNA, **EX Taq : 타카라바이오사제)
3.2.1.3 : PCR 반응조건
상기에서 조제한 반응액을 PCR 장치를 사용하여 95℃·30 sec → 55℃·30 sec → 72℃ 1 min을 30 사이클 반복하는 프로그램으로 PCR 반응을 행하였다.
3.2.1.4 : PCR 산물의 정제
상기 PCR 반응 산물을 1 % 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, 에티듐브로마이드 염색을 행한 후 자외선 조사하에서 750 bp 부근의 밴드를 포함하는 겔을 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용하여 동 조작 메뉴얼에 따라 겔 중의 PCR 산물의 정제를 행하였다.
3.2.1.5 : PCR 산물의 서브크로닝
정제한 PCR 산물은 pUC118-HincⅡ/BAP, TaKaRa BKL Kit(모두 타카라바이오사)를 이용하여 조작 메뉴얼에 준하여 라이게이션반응을 행하였다. 이 라이게이션 산물에서 대장균 E.coli DH5α(타카라바이오사)를 형질전환하고, LB 한천 플레이트(100 ㎍/mL 암피실린, IPTG, X-GAL 각 40 ㎍/mL 함유)상에 파종하고, 37℃에서 하룻밤 정치 배양하여 PCR 산물을 유지하는 대장균 클론을 얻었다.
한천 플레이트상의 백색을 보이는 대장균 콜로니를 LB 액체배지(100 ㎍/mL 암피실린 함유) 3 mL, 37℃에서 밤새껏 진탕배양하고, 정법에 따라 플라스미드 DNA를 조제하였다.
3.2.1.6 : 시퀀싱에 의한 배열 확인
상기 플라스미드 DNA에 대하여 DNA 시퀀서를 사용하여 플라스미드 벡터 pUC118의 제한효소 HincⅡ 인식부위에 삽입된 DNA 배열을 조사하였다. 그 결과, 삽입부분에는 KOD-PCNA 유전자의 오픈 리딩 프레임을 유지하고 5'단에 제한효소 NdeI인식배열, 3'단에 제한효소 XhoI 인식배열이 부가되어 있는 것이 확인되었다. KOD-PCNA 유전자의 오픈 리딩 프레임을 유지한 본 플라스미드 벡터를 pUC/KPC라고 명명하기로 하였다.
3.2.2 : KOD-PCNA 유전자 발현 플라스미드 구축
pUC/KPC를 제한효소 NdeI와 XhoI로 이중절단하여 PCNA 유전자 단편을 조제하였다. 유전자 단편은 발현 벡터에 삽입하고, KOD-PCNA의 발현 벡터를 제작하였다.
3.2.2.1 : PCNA DNA 단편 조제
pUC/KPC를 이하의 반응계에서 제한효소 NdeI와 XhoI로 이중절단하였다.
플라스미드 DNA : 5 ㎍
10X 제한효소 버퍼 : 5μL
제한효소 NdeI : 5 유닛
제한효소 XhoI : 5 유닛
이상에 멸균수를 첨가하여 50 μL로 하고, 37℃에서 2시간 제한효소 절단을 행하였다. 반응종료 후 2 % 아가로스 겔 전기영동을 행한 KOD-PCNA 유전자에 상당하는 밴드(약 750 bp 부근)를 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용, 동 조작 메뉴얼에 따라 겔로부터 PCNA DNA 단편의 정제를 행하였다.
3.2.2.2. : pET-21a 발현 벡터
pET-21a 벡터 DNA(미국 노바젠사)를 이하의 반응에 의하여 제한효소 NdeI와 XhoI로 이중절단하였다.
플라스미드 DNA : 2 ㎍
10X 제한효소 버퍼 : 5μL
제한효소 NdeI : 5 유닛
제한효소 XhoI : 5 유닛
이상에 멸균수를 첨가하여 50 μL로 하고, 37℃에서 2시간 정치하였다. 반응종료 후 1 % 아가로스 겔 전기영동을 행한 pET-21a 벡터 DNA의 직선폼에 상당하는 밴드(약 5.4 kb 부근)를 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용, 동 조작 메뉴얼에 따라 겔로부터 pET-21a DNA 단편의 정제를 행하였다.
3.2.2.3 : 라이게이션반응과 형질전환
상기에서 얻은 KOD-PCNA DNA 단편(100 ng)과 pET-21a DNA 단편(50 ng)을 DNA Ligation kit V2(타카라바이오사)를 이용하여 이하와 같이 반응하였다.
PCNA DNA 단편 : 100 ng
pET-21a DNA 단편 : 50 ng
DNA Ligation kit V2 효소액 : 5μL
이상에 멸균수를 더하여 10 μL로 하고, 16℃에서 30분간 반응하였다.
이 라이게이션 산물(3 μL)에 의하여 100 μL 대장균 E.coli BL21(DE3)(노바젠사)을 형질전환하고, 대장균액을 LB 한천 플레이트(100 ㎍/mL 암피실린)상에 파종하고, 37℃에서 하룻밤 정치 배양하였다. 한천 플레이트상에 형성된 대장균 콜로니 중 3개를 LB 액체배지(100 ㎍/mL 암피실린 함유) 3 mL, 37℃에서 밤새껏 진탕배양하고, 정법에 따라 플라스미드 DNA를 조제하였다.
3.2.2.4 : 시퀀싱에 의한 배열 확인
상기 재편성 플라스미드에 대하여 DNA 시퀀서를 사용하여 플라스미드 벡터 pET-21a에 삽입된 DNA 배열과 삽입부위 근방의 배열을 조사하였다. 그 결과, 멀티크로닝 부위의 NdeI와 XhoI 부분에 KOD-PCNA 유전자의 오픈 리딩 프레임이 완전히 삽입되어 있었다. 이 KOD-PCNA 유전자를 유지하는 플라스미드를 pKPCNA라고 부르기로 하였다(도 28).
도 28에 나타내는 바와 같이 pKPCNA에서는 pET-21a가 유지하는 T7프로모터로부터 rbs(리보솜 결합부위), PCNA 유전자 ORF(오픈 리딩 프레임), T7터미네이터의 순서로 나열되어 있는 것이 확인되었다. 본 플라스미드가 PCNA 유전자를 대량 발현하는 것이 기대되었다.
3.2.3 : KOD-PCNA 유전자에의 변이 도입
보다 고기능의 PCNA를 제작할 목적으로 KOD-PCNA에 대하여 아미노산 치환을 행하였다. 아미노산 치환은 상기 아미노산을 코드하는 염기를 치환함으로써 행하였다. 표 18에 나타내는 변이부위에 아미노산 변이를 도입하였다.
Figure 112008000596956-PCT00018
3.2.3.1 : 치환 변이 도입
PCNA 유전자에의 변이 도입은 변이를 도입하는 플라스미드와 변이 도입용 올리고 페어(표 19, 배열번호 35 내지 38), Quik Change Ⅱ Site-Directed Mutagenesis Kit(스트라타진사)를 이용하여 동 조작 메뉴얼에 따라 행하였다.
Figure 112008000596956-PCT00019
변이 도입 후에는 시퀀싱에 의하여 DNA 배열을 확인하고, 목적 부위에 변이가 도입되고, 목적 이외의 부위에는 변이가 없는 점을 확인하였다. 이하에 각 PCNA 변이체 설계에 대하여 설명한다.
KOD-PCNA01
Pyrococcus friosus의 PCNA에 대한 보고(비특허문헌 6)에 의하면, 야생형 Pfu-PCNA를 대장균을 숙주로 한 재편성 단백질로서 조제한 경우, 본래의 개시 Met로부터의 번역 단백질 이외에 N 말단이 73 잔기째로부터 번역이 개시되는 약 20 kDa의 단백질이 부산물로서 생성되고, 목적 단백질 생산의 효율을 떨어뜨리는 것이 보고되어 있다. 이 약 20 kDa의 단백질은 73 잔기째의 Met를 Leu로 1 잔기 치환한 경우, 생성이 억제되고, 제작된 Pfu-PCNA는 야생형 PCNA 단백질인지 알 수 없는 성질을 가지고 있는 것이 아울러 보고되어 있다. KOD-PCNA와 Pfu-PCNA는 모두 전체 길이가 249 아미노산 잔기로, 완전 일치하는 아미노산은 84.3 %, 또한 성질이 유사한 아미노산을 가미하면 매우 높은 상동성을 가진다. 이와 같은 상황을 토대로 KOD-PCNA에 대하여 73 잔기째의 Met를 Leu로 1 잔기 치환한 KOD-PCNA의 M73L의 변이를 준야생형으로서 본 명세서에서는 다룬다.
이 KOD_M73L의 변이체를 KOD-PCNA01로 명명하고, 변이체를 제작하였다. KOD-PCNA01의 제작은 주형 플라스미드를 pKPCNA로 하고 변이 도입용 올리고 페어(KOD_M73L-F와 KOD_M73L-R)를 사용하여 행하였다(표 19 참조, 배열 35, 배열 36).
KOD-PCNA13
Pyrococcus friosus의 PCNA의 경우, 143 잔기째의 아미노산 잔기는 단량체끼리가 삼량체를 형성할 때에 이온 페어 네트워크 형성에 관계되는 것이 알려져 있다(비특허문헌 9). 우리 그룹은 상기 실시예 1 내지 2와 같이 이 위치의 아미노산 잔기의 전기적 성질을 반대로 바꾼 변이형 PCNA가 DNA 합성에 있어서 DNA 폴리머라아제의 반응을 비약적으로 촉진하는 것을 발견하였다. Thermococcus kodakaraensis의 경우, 이 위치에 상당하는 아미노산은 야생형에서는 글루타민산(산성 아미노산)이나, 이것을 아르기닌(염기성 아미노산)으로 치환함으로써 이 부위의 아미노산의 전기적인 성질을 완전히 바꾸는 것이 가능하다. DNA 합성시에 첨가한 경우의 영향을 조사할 목적으로 이 변이체를 제작하였다. 구체적으로는, KOD-PCNA01 산생 플라스미드를 주형으로 하여 KOD_E143R-F와 KOD_E143R-R의 변이 도입용 올리고를 사용하여 제작하였다(표 19, 배열 38, 38).
3.2.3.2 : KOD-PCNA 발현주의 제작
이상과 같이 취득한 변이형 PCNA 발현 플라스미드 벡터에 의하여 대장균 BL21 CodonPlus(DE3)RIL(스트라타진사)을 형질전환하고, 각 변이유전자의 발현 대장균주를 얻었다.
3.2.4 : KOD-PCNA 단백질 정제
도 29에 나타내는 바와 같이 균체를 원심회수하고(S291), 균체파쇄(초음파파쇄, S292), 5분간 끓여(S293), 폴리에틸렌이민 침전을 행하고(S294), 다시 유안침전을 행하고(S295), 이온 교환 크로마토그래피(S296, 칼럼으로서 HiTrap Q를 사용), 겔 여과 크로마토그래피(S297, Superdex 200을 사용)라는 처리에 의하여 표품을 조제하였다. SDS-PAGE에 의한 확인에서는 어느 표품에 대해서도 90 % 이상 순도를 확보할 수 있었다.
3.2.4.1 : 균체 배양과 KOD-PCNA 발현 유도
각 변이 PCNA 발현주를 1.5 리터 LB 배지(50 ㎍/mL 암피실린 함유)에서, 37℃에서 진탕배양을 행하였다. 대수증식기의 OD600이 0.3 내지 0.5의 시기에 최종농도 0.1 mM이 되도록 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 발현유도를 행하고, 유도 후의 배양을 약 3시간 행하였다. 배양 후의 균체는 원심분리(4℃, 6,000xg, 6분)에 의하여 회수하였다.
3.2.4.2 : 균체파쇄
원심분리에 의하여 침전된 균체는 25 mL의 버퍼(B)(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 M NaCl, 0.1 mM EDTA, 10 % 글리세롤, 0.5 mM DTT)에 의하여 현탁하였다. 초음파처리에 의하여 균체를 파쇄하였다.
3.2.4.3 : 가열처리
균체파쇄액을 5분간 끓인 후, 원심분리(18, 500xg, 4℃, 25분)를 행하여 상청을 회수하였다.
3.2.4.4 : 폴리에틸렌이민 침전
상청액에 대하여 폴리에틸렌이민(SIGMA P-3143)과 NaCl을 각각 최종농도 0.2 %(w/v), 0.58 M이 되도록 첨가하고, 빙상에서 30분간 교반하였다. 이 용액을 원심분리(18,500×g, 25분, 4℃)하여 상청을 회수하였다.
3.2.4.5 : 유안침전
상청 10 mL 당 황산암모늄 5.61 g을 첨가하고(최종농도 80 %), 빙상에서 30분 교반하여 단백질을 침전시켰다. 이 용액에 유안을 80 % 포화시킨 50 mM Tris-HCL(pH 8.5) 버퍼 80 mL을 첨가하여 원심분리(30,000xg, 25분, 4℃)에 의하여 침전을 회수한 후, 이 침전을 버퍼(C)(50 mM Tris-HCL pH 8.0, 0.1 M NaCl)에 용해하고, 동일하게 버퍼(C)에 대하여 투석을 행하였다.
3.2.4.6 : 이온 교환 크로마토크로마토그래피
투석한 샘플은 AKTAexplorer 10S(아마샴바이오사이언스사)를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피(HiTrap Q; 아마샴바이오사이언스사)를 실시하였다. 용리조건은 0.1 내지 0.8 M NaCl/17.5 mL의 리니어그라디엔트로 하고, 유속은 1 mL/min으로 하고, KOD-PCNA01과 KOD-PCNA13의 피크화분을 얻었다.
3.2.4.7 : 겔 여과 크로마토그래피
HiTrap Q 이온 교환 크로마토그래피에서의 피크화분을 각각 Superdex 200(아마샴바이오사이언스사)을 사용한 겔 여과 크로마토그래피에 의하여 다시 정제하고, 이후의 어세이용 표품으로 하였다.
얻어진 표품을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 하여 표품의 분자의 크기 및 양호하게 정제된 것이 확인되었다(도 30).
3.3 : KOD-RFC의 조제
Thermococcus kodakaraensis KOD의 RFC는 2개의 서브유닛 RFCL과 RFCS로 구성되어 있고, 게놈 상에서는 탠덤으로 위치하고 있다. RFC 단백질 표품의 조제에 있어서는 RFCL과 RFCS 유전자는 개별로 발현 벡터 상에 실리고, 동일 숙주 내에 각각의 발현 벡터를 도입하고, 동시에 발현시키는 방법을 사용하였다. 발현 플라스미드의 제작에 있어서는 비특허문헌 10을 참조하였다. 이하에 상세를 나타낸다.
3.3.1 : KOD-RFCL의 유전자 크로닝과 발현 플라스미드 구축(도 31)
KOD-RFCL 유전자(Genbank ID ; 182,830)는 KOD 게놈을 주형으로 한 PCR에 의하여 얻었다(배열번호 39).
3.3.1.1 : PCR 프라이머
PCR용 프라이머로서, KOD-RFCL-F 프라이머와 KOD-RFCL-R 프라이머를 사용하였다(표 20; 배열번호 40 및 41). 크로닝 조작의 형편상, KOD-RFCL-F 프라이머에는 제한효소 NdeI 인식부위, KOD-RFCL-R 프라이머에는 제한효소 XhoI 인식부위를 각각 부가하였다.
Figure 112008000596956-PCT00020
3.3.1.2 : PCR 반응액 조성
PCR의 주형으로서는 상기 3.1에서 조제한 KOD 게놈 DNA를 사용하였다.
PCR 반응은 다음의 조성으로 행하였다.(50 μL 반응계에의 첨가량)
주형 DNA ; 100 ng
프라이머 ; 각 10 pmol
dNTP ; 각 10 nmol
EX Taq* ; 1.25 U
10X EX Taq 버퍼 ; 5 μL
이상에 멸균증류수를 첨가하여 50 μL로 하였다.
(* 타카라바이오사제)
3.3.1.3 : PCR 반응조건
상기에서 조제한 반응액을 PCR 장치를 사용하여 95℃·30 sec → 55℃·30 sec → 72℃ 1 min을 30 사이클 반복하는 프로그램으로 PCR 반응을 행하였다.
3.3.1.4 : PCR 산물의 정제
상기 PCR 반응 산물을 1 % 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, 에티듐브로마이드 염색을 행한 후 자외선 조사하에서 1.5 kb 부근의 밴드를 포함하는 겔을 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용하여 동 조작 메뉴얼에 따라 겔 중의 PCR 산물의 정제를 행하였다.
3.3.1.5 : PCR 산물의 서브크로닝
정제한 PCR 산물은 pUC118-HincⅡ/BAP, TaKaRa BKL Kit(모두 타카라바이오사)를 이용하여 조작 메뉴얼에 준하여 라이게이션반응을 행하였다. 이 라이게이션 산물에서 대장균 E.coli DH5α(타카라바이오사)를 형질전환하고, LB 한천 플레이트(100 ㎍/mL 암피실린, IPTG, X-GAL 각 40 ㎍/mL 함유)상에 파종하고, 37℃에서 하룻밤 정치 배양하여 PCR 산물을 유지하는 대장균 클론을 얻었다.
한천 플레이트상의 백색을 보이는 대장균 콜로니를 LB 액체배지(100 ㎍/mL 암피실린 함유) 3 mL, 37℃에서 밤새껏 진탕배양하고, 정법에 따라 플라스미드 DNA를 조제하였다.
3.3.1.6 : 시퀀싱에 의한 배열 확인
상기 플라스미드 DNA에 대하여 DNA 시퀀서를 사용하여 플라스미드 벡터 pUC118의 제한효소 HincⅡ 인식부위에 삽입된 DNA 배열을 조사하였다. 그 결과, 삽입부분에는 KOD-RFCL 유전자의 오픈 리딩 프레임을 유지하고 5'단에 제한효소 NdeI인식배열, 3'단에 제한효소 XhoI 인식배열이 부가되어 있는 것이 확인되었다. 이 플라스미드를 pUC118/KRFCL라고 하였다.
3.3.1.7 : KOD-RFCL 발현 플라스미드 제작
pUC118/KRFCL을 제한효소 NdeI와 XhoI로 이중절단하여 RFCL 유전자 단편을 조제하였다. 유전자 단편은 발현 벡터에 삽입하고, KOD-RFCL의 발현 벡터를 제작하였다.
3.3.1.8 : RFCL DNA 단편 조제
pUC118/KRFCL을 이하의 반응계에서 제한효소 NdeI와 XhoI로 이중절단하였다.
플라스미드 DNA : 5 ㎍
10X 제한효소 버퍼 : 5μL
제한효소 NdeI : 5 유닛
제한효소 XhoI : 5 유닛
이상에 멸균수를 첨가하여 50 μL로 하고, 37℃에서 2시간 제한효소 절단을 행하였다. 반응종료 후 1 % 아가로스 겔 전기영동을 행한 KOD-RFCL 유전자에 상당하는 밴드(약 1.5 kb 부근)를 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용, 동 조작 메뉴얼에 따라 겔로부터 RFCL DNA 단편의 정제를 행하였다.
3.3.1.9 : pET-29a 발현 벡터
pET-29a 벡터 DNA(노바젠사)를 이하의 반응에 의하여 제한효소 NdeI와 XhoI로 이중절단하였다.
플라스미드 DNA : 2 ㎍
10X 제한효소 버퍼 : 5μL
제한효소 NdeI : 5 유닛
제한효소 XhoI : 5 유닛
이상에 멸균수를 첨가하여 50 μL로 하고, 37℃에서 2시간 정치하였다. 반응종료 후 1 % 아가로스 겔 전기영동을 행한 pET-29a 벡터 DNA의 직선폼에 상당하는 밴드(약 5.4 kb 부근)를 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용, 동 조작 메뉴얼에 따라 겔로부터 pET-29a DNA 단편의 정제를 행하였다.
3.3.1.10 : 라이게이션반응과 형질전환
상기에서 얻은 KOD-RFCL DNA 단편(100 ng)과 pET-29a DNA 단편(50 ng)을 DNA Ligation Kit V2(타카라바이오사)를 이용하여 이하와 같이 반응하였다.
RFCL DNA 단편 : 100 ng
pET-29a DNA 단편 : 50 ng
DNA Ligation kit V2 효소액 : 5μL
이상에 멸균수를 더하여 10 μL로 하고, 16℃에서 30분간 반응하였다.
이 라이게이션 산물(3 μL)에 의하여 100 μL 대장균 E.coli BL21(DE3)(노바젠사)을 형질전환하고, 대장균액을 LB 한천 플레이트(30 ㎍/mL 카나마이신)상에 파종하고, 37℃에서 하룻밤 정치 배양하였다. 한천 플레이트상에 형성된 대장균 콜로니 중 3개를 LB 액체배지(30 ㎍/mL 카나마이신 함유) 3 mL, 37℃에서 밤새껏 진탕배양하고, 정법에 따라 플라스미드 DNA를 조제하였다.
3.3.1.11 : 시퀀싱에 의한 배열 확인
상기 플라스미드 DNA에 대하여 DNA 시퀀서를 사용하여 플라스미드 벡터 pET-29a에 삽입된 DNA 배열과 삽입부위 근방의 배열을 조사하였다. 그 결과, 어느 플라스미드 DNA에 대해서도 멀티크로닝 부위의 NdeI와 XhoI 부분에 KOD-RFCL 유전자의 ORF(오픈 리딩 프레임)이 완전히 삽입되어 있었다. KOD-RFCL 유전자를 유지하는 플라스미드를 pKRFCL이라고 부르기로 하였다(도 32).
도 32에 나타내는 바와 같이 pKRFCL에서는 pET-29a가 유지하는 T7프로모터로부터 rbs(리보솜 결합부위), RFCL 유전자의 오픈 리딩 프레임, T7터미네이터의 순서로 나열되어 있는 것이 확인되었다. 본 플라스미드가 RFCL 유전자를 대량 발현하는 것이 기대되었다.
3.3.2 : KOD-RFCS의 유전자 크로닝과 발현 플라스미드 구축
비특허문헌 10에 의하면, KOD-RFCS 유전자(Genebank ID : BD182, 829)는 전체길이 2,601 염기에 의하여 코드되고, 인테인을 1부분 유지하고, N단의 엑스테인은 177 염기, C단의 엑스테인은 804 염기에 코드되어 있는 것이 보고되어 있다(종시코돈은 포함하지 않음). 배열표의 배열번호 42에 KOD-RFCS의 염기배열(인텐인부분을 제거한 성숙형 배열)을 나타낸다.
도 33에 나타낸 바와 같이 RFCS 발현 벡터 제작에 있어서는, 먼저 인테인을 포함하는 KOD-RFCS 유전자의 전체 길이를 PCR 반응을 이용하여 크로닝하고(S331 내지 S334), 그 후 2종의 엑스테인 단편을 개별로 PCR 반응에 의하여 증폭한 후(S335 내지 S336), 인테인을 제거하고, 2종의 엑스테인을 결합한 성숙형 RFCS(RFCSm이라고도 부름)를 조제하고, 발현 벡터에 조립하였다(S337 내지 S339).
3.3.2.1 : 인테인을 포함하는 RFCS 유전자 전체 길이의 크로닝
3.3.2.1.1 : PCR 프라이머
PCR 프라이머는 KOD-RFCS-F, KOD-RFCS-R 프라이머(표 21; 배열번호 43 및 44)를 사용하였다.
Figure 112008000596956-PCT00021
3.3.2.1.2 : PCR 반응조성
PCR의 주형으로서는 상기 3.1에서 조제한 KOD 게놈 DNA를 사용하였다.
PCR 반응액은 다음의 조성으로 행하였다.(50 μL 반응액계에의 첨가량)
주형 DNA ; 100 ng
프라이머 ; 각 10 pmol
dNTP ; 각 10 nmol
EX Taq* ; 1.25 U
10x EX Taq 버퍼 ; 5 μL
이상에 멸균수를 첨가하여 50 μL로 하였다.
(* 타카라바이오사제)
3.3.2.1.3 : PCR 반응조건
상기에서 조제한 반응액을 PCR 장치를 사용하여 95℃·30 sec → 55℃·30 sec → 72℃·1 min을 30 사이클 반복하는 프로그램으로 PCR 반응을 행하였다.
3.3.2.1.4 : PCR 산물의 정제
상기 PCR 반응 산물을 1 % 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, 에티듐브로마이드 염색을 행한 후 자외선 조사하에서 2.6 kb 부근의 밴드를 포함하는 겔을 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용하여 동 조작 메뉴얼에 따라 겔 중의 PCR 산물의 정제를 행하였다.
3.3.2.1.5 : PCR 산물의 서브크로닝
정제한 PCR 산물은 pUC118-HincⅡ/BAP, TaKaRa BKL Kit(모두 타카라바이오사)를 이용하여 조작 메뉴얼에 준하여 라이게이션반응을 행하였다. 이 라이게이션 산물에서 대장균 E.coli DH5α(타카라바이오사)를 형질전환하고, LB 한천 플레이트(100 ㎍/mL 암피실린, IPTG, X-GAL 각 40 ㎍/mL 함유)상에 파종하고, 37℃에서 하룻밤 정치 배양하여 PCR 산물을 유지하는 대장균 클론을 얻었다.
한천 플레이트상의 백색을 보이는 대장균 콜로니를 LB 액체배지(100 ㎍/mL 암피실린 함유) 3 mL, 37℃에서 밤새껏 진탕배양하고, 정법에 따라 플라스미드 DNA를 조제하였다.
3.3.2.1.6 : 시퀀싱에 의한 배열 확인
상기 플라스미드 DNA에 대하여 DNA 시퀀서를 사용하여 플라스미드 벡터 pUC118의 제한효소 HincⅡ 인식부위에 삽입된 DNA 배열을 조사하였다. 그 결과, 삽입부분은 RFCS 유전자의 2종의 엑스테인의 염기배열을 완전히 포함하고 있었다. 이 플라스미드를 pUC/KRFCS라고 하였다.
3.3.2.2 : 엑스테인 결합조작(인테인 제거조작)
3.3.2.2.1 : 엑스테인 결합용 프라이머
N단측 엑스테인용 PCR 프라이머로서 RFCS-Nde-F 프라이머, RFCS-Ex1-R 프라이머(표 22; 배열번호 45 및 48)를 준비하였다. 또, C단측 엑스테인용 PCR 프라이머로서 RFCS-Ex2-F 프라이머, RFCS-Sal-R 프라이머(표 22; 배열번호 47 및 46)를 준비하였다. 크로닝을 용이하게 할 목적으로 RFCS-Nde-F 프라이머에는 제한효소 NdeI 배열, RFCS-Sal-R 프라이머에는 제한효소 SalI 배열을 5'단에 부가하고 있다. 또, 2종의 엑스테인 단편을 PCR 반응에 의하여 융합할 때에 이용하는 상보적인 배열을 RFCS-Ex1-R 프라이머와 RFCS-Ex2-F 프라이머에 마련하였다.
Figure 112008000596956-PCT00022
3.3.2.2.2 : PCR 반응액 조성
2종의 엑스테인 증폭을 위한 PCR 반응은 다음의 조성으로 행하였다. (50 μL 반응액계에의 첨가량)
pUC/KRFCS DNA ; 50 ng
프라이머 ; 각 10 pmol
dNTP ; 각 10 nmol
EX Taq* ; 1.25 U
10x EX Taq 버퍼 ; 5 μL
이상에 멸균수를 첨가하여 50 μL로 하였다.
(* 타카라바이오사제)
3.3.2.2.3 : PCR 반응조건
상기에서 조제한 반응액을 PCR 장치를 사용하여 95℃·30 sec → 55℃·30 sec → 72℃·1 min을 30 사이클 반복하는 프로그램으로 PCR 반응을 행하였다.
3.3.2.2.4 : PCR 산물의 정제
상기 PCR 반응 산물을 2 % 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, 에티듐브로마이드 염색을 행하였다. RFCS-Nde-F 프라이머, RFCS-Ex1-R 프라이머 세트의 PCR 산물에서는 약 180 염기의 밴드가, RFCS-Ex2-F 프라이머, RFCS-Sal-R 프라이머 세트의 PCR 산물에서는 약 800 염기의 밴드가 관찰되었다. 자외선 조사하에서 각각의 밴드를 포함하는 겔을 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용하여 동 조작 메뉴얼에 따라 겔 중의 PCR 산물의 정제를 행하였다.
3.3.2.2.5 : PCR 융합반응
2종의 엑스테인 PCR 산물을 1 튜브 내에서 1세트의 프라이머 세트로 PCR 반응에 제공함으로써 2종의 단편을 융합하고, 성숙형 RFCS를 코드하는 유전자 단편을 얻었다. 이하에 상세를 나타낸다.
2종의 엑스테인 PCR 산물의 어닐링 반응을 다음의 조성으로 행하였다.
N단 엑스테인 단편 : 2 μL(50 ng 상당)
C단 엑스테인 단편 : 2 μL(50 ng 상당)
10x EX Taq 버퍼 ; 5 μL
이상에 멸균수를 첨가하여 44.5 μL로 하였다.
상기를 95℃·3 min 가열하고, 37℃까지 30분간 천천히 냉각하였다.
상기 반응액에 이하를 첨가한다.
dNTP : 5 μL(각 10 nmol)
EX Taq* ; 0.5 μL(2.5 U)
이것을 72℃·10 min 반응시킨다.
(* 타카라바이오사제)
상기에 RFCS-Nde-F 프라이머와 RFCS-Sal-R 프라이머를 각 10 pmol 첨가하고, 95℃·30 sec → 55℃·30 sec → 72℃·1 min을 30 사이클 반복하는 프로그램으로 PCR 반응을 행하였다.
3.3.2.2.6 : PCR 산물의 제한효소 절단·정제
상기 PCR 반응 산물을 정법에 따라 에탄올 침전 정제하였다. 정제한 DNA 단편은 제한효소 NdeI와 SalI로 이중 절단하였다.
PCR 산물 : 1 ㎍ 상당
10X 제한효소 버퍼 : 5 μL
제한효소 NdeI : 5 유닛
제한효소 SalI : 5 유닛
이상에 멸균수를 첨가하여 50 μL로 하고, 37℃에서 2시간 제한효소 절단을 행하였다. 반응종료 후 2 % 아가로스 겔 전기영동을 행한 2종의 인테인의 융합단편(성숙형 RFCS를 코드하는 배열)으로 상정되는 밴드(약 1 kb 부근)를 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용하여 정제하였다.
3.3.2.2.7 : pET-21a 발현 벡터의 제한효소 절단
pET-21a 벡터 DNA(노바젠사)를 이하의 반응에 의하여 제한효소 NdeI와 SalI로 이중절단하였다.
플라스미드 DNA : 2 ㎍
10X 제한효소 버퍼 : 5μL
제한효소 NdeI : 5 유닛
제한효소 SalI : 5 유닛
이상에 멸균수를 첨가하여 50 μL로 하고, 37℃에서 2시간 정치하였다. 반응종료 후 1 % 아가로스 겔 전기영동을 행한, pET-21a 벡터 DNA의 직선폼에 상당하는 밴드(약 5.4 kb 부근)를 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용, 동 조작 메뉴얼에 따라 겔로부터 pET-21a DNA 단편의 정제를 행하였다.
3.3.2.2.8 : 라이게이션반응과 형질전환
상기에서 얻은 2종의 인테인의 융합단편(성숙형 RFCS 코드 배열)으로 예측되는 약 1 kb의 DNA 단편(100 ng)과 pET-21a DNA 단편(50 ng)을 DNA Ligation Kit V2(타카라바이오사)를 이용하여 이하와 같이 반응하였다.
1 kb DNA 단편 : 100 ng
pET-21a DNA 단편 : 50 ng
DNA Ligation kit V2 효소액 : 5μL
이상에 멸균수를 더하여 10 μL로 하고, 16℃에서 30분간 반응하였다.
이 라이게이션 산물(3 μL)에 의하여 100 μL 대장균 E.coli BL21(DE3)(노바젠사)을 형질전환하고, 대장균액을 LB 한천 플레이트(100 ㎍/mL 암피실린)상에 파종하고, 37℃에서 하룻밤 정치 배양하였다. 한천 플레이트상에 형성된 대장균 콜로니 중 3개를 LB 액체배지(100 ㎍/mL 암피실린) 3 mL, 37℃에서 밤새껏 진탕배양하고, 정법에 따라 플라스미드 DNA를 조제하였다.
3.3.2.2.9 : 시퀀싱에 의한 배열 확인
상기 플라스미드 DNA에 대하여 DNA 시퀀서를 사용하여 플라스미드 벡터 pET-21a에 삽입된 DNA 배열과 삽입부위 근방의 배열을 조사하였다. 그 결과, 멀티크로닝 부위의 NdeI와 SalI 부분에 2종의 엑스테인이 결합한(인테인을 제거하였음) 성숙형 RFCSm의 배열(984 염기)가 확인되었다(pKRFCSm이라고 명명).
도 34에 나타내는 바와 같이 pKRFCSm에서는 pET-21a가 유지하는 T7프로모터로부터 rbs(리보솜 결합부위), 성숙형 RFCS 유전자의 오픈 리딩 프레임, T7터미네이터의 순서로 나열되어 있는 것이 확인되었다. 본 플라스미드가 성숙형 RFCS 유전자를 대량 발현하는 것이 기대되었다.
3.3.3 : KOD-RFC 유전자 발현주의 제작
pKRFCL과 pKRFCSm으로 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL을 동시에 형질전환하고, 암피실린과 카나마이신의 이중 선택으로 양쪽의 플라스미드를 유지하는 형질전환체를 선택하여 발현주를 얻었다.
3.3.4 : KOD-RFC 단백질 정제
도 35에 나타내는 바와 같이 균체를 원심회수하고(S351), 균체파쇄(초음파파쇄, S352), 5분간 끓이고(S353), 폴리에틸렌이민 침전을 행하고(S354), 다시 유안침전을 행하고(S355), 아피니티 크로마토그래피(S356, 칼럼으로서 HiTrap Heparin HP를 사용), 겔 여과 크로마토그래피(S357, Superdex 200을 사용)라는 처리에 의하여 표품을 조제하였다. SDS-PAGE에 의한 확인에서는 어느 표품에 대해서도 90 % 이상의 순도를 확보할 수 있었다.
3.3.4.1 : 균체 배양과 발현유도
상기 발현주를 1.5 리터 LB 배지(50 ㎍/mL 암피실린 및 30 ㎍/mL 카나마이신함유), 37℃에서 진탕배양을 행하였다. 대수증식기의 OD600이 0.3 내지 0.5의 시기에 최종농도 0.1 mM이 되도록 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopy ranoside)를 첨가하여 발현유도를 행하고, 유도 후의 배양을 약 3시간 행하였다. 배양 후의 균체는 원심분리(4℃, 6,000xg, 6분)에 의하여 회수하였다.
3.3.4.2 : 균체파쇄
원심분리에 의하여 침전된 균체는 25 mL의 버퍼(B)(전술)에 의하여 현탁하였다. 이것을 초음파처리에 의하여 균체를 파쇄하였다.
3.3.4.3 : 가열처리
균체파쇄액을 5분간 끓인 후, 원심분리(18, 500xg, 4℃, 25분)를 행하여 상청을 회수하였다.
3.3.4.4 : 폴리에틸렌이민 침전
상청액에 대하여 폴리에틸렌이민(SIGMA P-3143)을 최종농도 0.18 %(w/v)가 되도록 첨가하고, 빙상에서 30분간 교반하였다. 이 용액을 원심분리(18,500×g, 25분, 4℃)하여 상청을 회수하였다.
3.3.4.5 : 유안침전
상청 10 mL 당 황산암모늄 5.61 g을 첨가하고(최종농도 80 %), 빙상에서 30분 교반하여 단백질을 침전시켰다. 원심분리(18,500xg, 4℃, 25분)에 의하여 침전을 회수한 후, 이 침전을 버퍼(C)(전술)에 용해하고, 동일하게 버퍼(C)에 대하여 투석을 행하였다.
3.3.4.6 : 아피니티 크로마토크로마토그래피
투석한 샘플은 HiTrap Heparin HP 칼럼(아마샴바이오사이언스사)을 사용하여 정제하였다.
용리조건은 0.1 내지 0.8 M NaCl/17.5 mL의 리니어그라디엔트로 하고, 유속은 1 mL/min으로 하고, 피크화분을 얻었다.
3.3.4.7 : 겔 여과 크로마토그래피
HiTrap Heparin 아피니티 크로마토그래피에서의 피크화분을 각각 Superdex 200(전술)을 사용한 겔 여과 크로마토그래피에 의하여 다시 정제하고, 어세이용 표품으로 하였다. 얻어진 표품을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 하여 표품의 분자의 크기 및 양호하게 정제된 것이 확인되었다(도 36).
4 : KOD-PCNA 변이체의 평가
상기에서 조제한 PCNA 변이체의 DNA 증폭계에의 효과, 특히 PCR 반응계에의 효과를 조사하였다. 구제적으로는 PCR 반응계에 PCNA 변이체, RFC를 단독 또는 병용하여 첨가한 경우, 미첨가의 경우에서 PCR 반응을 행하고, 그 반응 산물을 전기영동에 제공하아 표적 영역의 증폭상태를 비교함으로써 행하였다. PCR 반응에 사용하는 폴리머라아제로서는 시판되고 있는 2종의 PCR용 DNA 폴리머라아제, KOD DNA Polymerase(토요보사), Pyrobest DNA Polymerase(타카라바이오사)를 사용하였다.
4.1 : KOD DNA 폴리머라아제에 대한 KOD-PCNA의 첨가효과
KOD DNA 폴리머라아제는 호열성 고세균 Thermococcus kodakaraensis KOD-1주 유래의 DNA 폴리머라아제이다. KOD DNA 폴리머라아제는 폴리머라아제 활성 외, 강한 3'→5' Exonuclease 활성(Proofreading 활성)을 가지고 소위 알파형 DNA 폴리머라아제이다. 3'→5' Exonuclease 활성을 유지하기 때문에, 일반적으로 사용되고 있는 Taq DNA Polymerase보다 높은 PCR Fidelity를 나타낸다. 또, Pyrococcus속 유래를 주로 한 다른 알파형 고정확성 PCR용 효소는 신장속도가 늦는 것이 많으나, 본 효소는 신장속도가 매우 빠른 것이 보고되어 있다(비특허문헌 11).
4.1.1 : 주형 DNA와 반응 프라이머
주형 DNA로서는 람다 DNA(GenBank accession 02459)를 사용하였다. PCR 증폭의 표적 배열로서는 람다 DNA의 23, 119번보다 25, 142번의 배열로 하였다. 이 때 사용한 PCR 프라이머 배열은 표 8에 기재되어 있으나, 별도 표 23에 나타내었다.
Figure 112008000596956-PCT00023
4.1.2 : 반응액 조성
반응액의 조성을 표 24 및 25에 나타내었다.
Figure 112008000596956-PCT00024
Figure 112008000596956-PCT00025
4.1.3 : PCR 프로그램
상기 반응액을 이하의 PCR 프로그램으로 반응시켰다.
94℃·1 min → (98℃·5 sec → 68℃·15 sec)30 cycles → 4℃에서 유지
4.1.4 : 전기영동
PCR 반응종료 후, 50 μL의 PCR 반응용액에 대하여 10x 로딩 버퍼(Glycerol 50 %, Bromphenol Blue 0.4 %, Xylene Cyanol 0.4 %)를 5 μL 첨가, 혼합한 후, 50 μL 반응액 중 10 μL를 1 % 아가로스 겔 전기영동에 제공하았다. 전기영동 마커로서 람다/StyI 마커(토요보사)를 사용하였다. 결과를 도 37에 나타낸다.
4.1.5 : 결과
결과를 도 37에 나타내었다. 이 실험조건에서는 KOD DNA 폴리머라아제만으로도 양호한 신장증폭을 확인할 수 있다(레인 1). 준야생형 KOD-PCNA01을 첨가한 경우에 반응저해가 관찰되나(레인 2), RFC의 첨가량을 증가하면 저해가 회복하고 미첨가의 경우와 동일 정도의 신장증폭이 관찰된다(레인 3, 4). 한편, KOD-PCNA13을 첨가한 경우 KOD-RFC의 첨가에 의존하지 않는 양호한 신장증폭이 관찰되고, 이 효과는 그럼에도 불구하고 액세서리 단백질 미첨가의 경우나 KOD-PCNA01에 KOD-RFC를 첨가한 경우보다 우수하였다.
4.2 : Pyrobest DNA 폴리머라아제에 대한 KOD-PCNA의 첨가효과
Pyrococcus속 유래의 DNA 합성효소로서 시판되고 있는 Pyrobest DNA Polymerase(타카라바이오사)를 대상으로 하여 각종 PCNA 변이체의 첨가효과를 PCR 반응계를 이용하여 조사하였다. Pyrobest DNA Polymerase는 Pyrococcus·sp. 유래의 3'→5' exonuclease 활성(proof reading 활성)을 가지는 내열성 α형 DNA 폴리머라아제이다. Pyrococcus·furiosus 유래의 Pfu DNA 폴리머라아제나 Vent DNA 폴리머라아제와 동등한 정확성이 높은 증폭을 행하는 것이 특징이다.
4.2.1 : 주형 DNA와 반응 프라이머
상기 KOD DNA 폴리머라아제의 평가와 동일한 주형 DNA, 프라이머를 사용하였따.
4.2.2 : 반응액 조성
반응액의 조성을 표 26 및 27에 나타내었다.
Figure 112008000596956-PCT00026
Figure 112008000596956-PCT00027
4.2.3 : PCR 프로그램
상기 반응액을 이하의 PCR 프로그램에 반응시켰다.
94℃·1 min → (98℃·5 sec → 68℃·1.5 min)30 cycles → 4℃에서 유지
4.2.4 : 전기영동
PCR 반응종료 후, 50 μL의 PCR 반응용액에 대하여 10x 로딩 버퍼(Glycerol 50 %, Bromphenol Blue 0.4 %, Xylene Cyanol 0.4 %)를 5 μL 첨가, 혼합한 후, 50 μL 반응액 중 10 μL를 1 % 아가로스 겔 전기영동에 제공하았다. 전기영동 마커로서 람다/StyI 마커(토요보사)를 사용하였다. 결과를 도 38에 나타낸다.
4.2.5 : 결과
결과를 도 38에 나타내었다. 이 실험조건에서는 Pyrobest DNA 폴리머라아제만으로도 신장증폭을 확인할 수 있다(레인 1). 준야생형 KOD-PCNA01을 첨가한 경우에 반응저해가 관찰되고 밴드를 확인할 수 없으나(레인 2), RFC의 첨가량을 증가하면 저해가 회복하고 미첨가의 경우와 동일 정도의 신장증폭이 관찰된다(레인 3, 4). 한편, KOD-PCNA13을 첨가한 경우는 KOD-RFC 미첨가시에도 양호한 신장증폭이 관찰되고, 이 효과는 다른 4종의 조건보다도 우수한 신장증폭을 나타내었다(레인 5).
4.3 : 정리
상기 설명한 실험으로부터 KOD-PCNA13은 대표적인 2종의 PCR 효소에 대하여 PCR 반응을 촉진하는 것을 알 수 있었다. 또, 이 반응은 RFC를 필요로 하지 않을 뿐만 아니라, 야생형과 RFC를 동시 첨가한 경우보다도 촉진 활성이 우수하였다. 이상의 결과로부터 Pyrococcus furiosus 유래의 PCNA 뿐만 아니라, Thermococcus kodakaraensis KOD1주 유래의 PCNA에서도 동일한 변이도입에 의하여 우수한 효과가 얻어지는 것이 증명되었다. 본 발명의 PCNA 단량체의 계면영역의 아미노산 잔기의 특정은 Pyrococcus furiosus 유래의 PCNA에만 한정하여 유효한 것이 아니고, 동일한 구조적 배경을 가지는 PCNA에 응용할 수 있는 발명인 것이 나타났다.
5. Pfu-PCNA13 첨가반응시의 충실성 측정
Pfu-PCNA13을 PCR 반응에 첨가하였을 때의 주형 충실성에 주는 영향에 대하여 시판의 고충실도형 PCR 효소인 Pyrobest DNA Polymerase(타카라바이오사제, 이하, 단지「Pyrobest」라고 약기하는 일이 있음)를 대상으로 하여 검토하였다. Pyrobest는 Pyrococcus속 고세균 유래의 DNA 폴리머라아제로, 3'→5' 엑소뉴클리아제 활성을 가지고, 이것이 프루프리딩 활성으로서 기능하고 있다.
충실성은 PCR 산물의 시퀀스를 조사하여 주형 시퀀스와 비교함으로써 구하였다. 개략을 도 39에 나타내었다. 먼저, Pyrobest 단독 또는 Pfu-PCNA13을 첨가하여 PCR 반응을 행하고(S511), 증폭된 DNA 단편의 말단을 평활화·인산화하고(S512), 이 단편을 플라스미드 벡터에 크로닝하고(S513), 대장균에 도입하여 콜로니를 단리, 플라스미드를 추출한다(S514, S515). 각 플라스미드의 삽입배열의 일부(500 bp)을 DNA 시퀀서로 조사하고(S516), 결과를 주형 시퀀스와 비교하여 에러발생빈도를 조사하였다(S517).
5.1 : PCR 반응
5.1.1 : PCR 효소와 Pfu-PCNA13의 조합
Pyrobest 단독으로 PCR 반응을 실시한 경우와 Pyrobest에 Pfu-PCNA13을 첨가하여 PCR 반응을 실시한 경우에 대하여 조사하였다. 이들에 대한 대조의 목적으로 TaKaRa Taq(타카라바이오사제, 이하 단지 「Taq」라고 약기하는 일이 있음) 단독에서의 PCR 반응에 대해서도 조사하였다. Taq는 일반적으로 이용되는 PolI형의 PCR 효소이나, 3'→5' 엑소뉴클리아제 활성을 가지지 않고, 동 활성을 유지하는 α형 PCR 효소와 비교하여 충실성은 낮다고 되어 있다.
5.1.2 : 주형·표적 영역
PCR 반응의 주형으로서 람다 DNA(Genbank accession 02459)를 사용하여 7종의 영역을 조사대상으로 하였다. 각 영역의 람다 DNA상의 위치, 사이즈, 각 영역을 증폭하기 위하여 사용한 프라이머의 조합을 표 28에, 또 각 프라이머 배열은 표 29에 나타내었다.
Figure 112008000596956-PCT00028
Figure 112008000596956-PCT00029
5.1.3 : PCR 반응액 조성
PCR 반응액은 일반적인 PCR 반응액 조성으로 하였다(표 30). PCR 효소로서 Pyrobest를 사용할 때에는 첨부 버퍼인 10xPyrobest buffer Ⅱ(조성미공표)를, TaKaRa Taq를 사용할 때에는 첨부 버퍼인 10xPCR Buffer(100 mM Tris·Cl(pH 8.3), 500 mM KCl, 15 mM MgCl2)을 사용하였다. Pfu-PCNA13 첨가시의 최종농도는 0.6 ng/μL(0.3 μL)로 하고, 미첨가의 경우는 멸균수를 동 체적(0.3 μL) 첨가하였다.
Figure 112008000596956-PCT00030
5.1.4 : PCR 프로프램
Pyrobest 단독의 경우
(98℃·10 sec → 68℃·2.5 min)30 cycles → 4℃에서 유지
Pyrobest + Pfu-PCNA13의 경우
(98℃·10 sec → 68℃·1.5 min)30 cycles → 4℃에서 유지
Taq 단독의 경우
(94℃·30 sec → 55℃·30 sec → 72℃·1.5 min)30 cycles → 4℃에서 유지
5.2 : PCR 산물의 말단평활화 반응·정제
상기 PCR 반응에 의하여 얻어진 각 PCR 산물을 1 % 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, 에티듐브로마이드 염색을 행한 후, 목적 사이즈의 DNA 단편을 포함하는 겔을 잘라내고, GFX PCR DNA and Gel Band Purification 키트(아마샴바이오사이언스사)를 사용하여 동 조작 메뉴얼에 따라 겔 중의 DNA 단편의 정제를 행하였다. 정제한 DNA 단편은 TaKaRa BKL Kit(Blunting Kination Ligation Kit)(타카라바이오사제)를 이용하고, 동 키트 메뉴얼에 따라 말단 평활화·인산화 반응에 제공하였다.
5.3 : PCR 산물의 크로닝 벡터에의 삽입
말단평활화·인산화 처리한 DNA 단편(50 ng)과 제한효소 HincⅡ 절단 BAP 처리가 끝난 DNA(pUC118 Hinc Ⅱ/BAP·타카라바이오사제)(50 ng)를 이하와 같이 라이게이션반응에 제공하였다.
말단평활화·인산화 처리가 끝난 DNA 단편: 50 ng
pUC118 Hinc Ⅱ/BAP : 50 ng
DNA Ligation kit V2 효소액 : 5 μL
이상에 멸균수를 더하여 10 μL로 하고, 16℃에서 60분간 반응하였다.
5.4 : 대장균 콜로니 단리·플라스미드 추출
상기 라이게이션산물(3 μL)에 의하여 100 μL 대장균 E. coli JM109(타카라바이오사)를 형질전환하고, 대장균액을 LB 한천 플레이트(100 ㎍/mL 암피실린, IPTG, X-GAL 각 40 ㎍/mL 함유)상에 파종하고, 37℃에서 하룻밤 정치 배양하였다. 한천 플레이트상의 백색을 보이는 대장균 콜로니를 TB 액체배지(100 ㎍/mL 암피실린 함유) 1.5 mL, 37℃에서 밤새껏 진탕배양하고, 정법에 따라 플라스미드 DNA를 조제하였다.
5.5 : 삽입배열의 시퀀스
추출한 플라스미드를 주형으로 하고, DNA 시퀀서를 사용하여 DNA 배열을 해석하였다.
삽입된 DNA 단편(PCR 증폭단편) 중 500 bp의 배열을 해석 대상으로 하였다.
5.6 : 오리지날 배열과 비교
결과를 표 31에 나타내었다. 표 중의 각 용어는 이하와 같다.
「프레그먼트 ID」; PCR 반응 표적 영역의 식별번호
「Enzyme, AP」; PCR 반응시의 효소와 Pfu-PCNA13의 조합
「람다 DNA Position」; 7종의 PCR 증폭 단편 중 해석 대상이 된 염기배열의 위치를 나타낸다.
「Sample」; 시퀀스 해석 대상이 된 플라스미드 수(즉, PCR 증폭 단편수)를 표시한다.
「Base」; 시퀀스 해석의 대상이 된 염기수
「ND」; 시퀀싱 데이터의 노이즈 등으로 해독 불가능하였던 염기수
「All」;「ND」이외의 해독 가능하였던 총 염기수
「Error」; 총 염기수 중 복제 에러가 확인된 염기수
「Error rates」; 해독할 수 있었던 총 염기수「All」에 대한 복제 에러가 확인된 염기수「Error」의 비율
Figure 112008000596956-PCT00031
Pyrobest 단독의 경우, 592 샘플을 해석한 바, 총계 295,901 bases에 대하여 복제 에러는 4 bases라는 결과(Error rates는 74 kb 당 1 base)가 얻어졌다. Pyrobest에 Pfu-PCNA13을 첨가한 경우, 489 샘플을 해석한 바, 총계 244,351 bases에 대하여 복제 에러는 5 bases라는 결과가 얻어졌다(Error rates는 49 kb당 1 base). Taq의 경우 538 샘플을 해석한 바, 총계 268,856 bases에 대하여 복제 에러는 120 bases 라는 결과(Error rates는 2.2 kb에 1 base)가 얻어졌다.
상기 3종의 시험군에서 비교하면, Taq에 비하여 Pyrobest 단독, Pyrobest + PCNA13 첨가의 2종은 Error rates가 1 자릿수 낮고, 양 그룹 사이의 복제 충실도에 명확한 차가 있는 것이 관찰되었다.
한편, 후자의 2종의 반응(Pyrobest 단독과 Pyrobest + PCNA13 첨가) 사이에서의 비교에 관해서는 Error rates에 1.5배의 차는 있기는 하나, 복제 에러수가 4(Pyrobest 단독)와 5(Pyrobest + PCNA13 첨가)이고, 유의(有意)한 차는 검출되지 않있다. 이 데이터로부터는 PCNA13의 첨가에 의하여 충실도에 명확한 차가 생기는지는 불명확하나, 그 차는 작고, 적어도 극단적으로 악화하는 것은 아니라고 생각된다. 도 14 내지 도 16의 실시예에 나타내는 바와 같이, 고충실도형 PCR 효소인 Pyrobest의 신장능을 비약적으로 향상시키는 한편, 충실도면에서도 Pol I형 PCR 효소인 Taq보다도 훨씬 좋은 레벨을 유지하고 있는 것은 확실하고, 본 발명의 PCNA의 우수성이 증명되었다.
본 발명은 바이오테크놀로지 관련 산업에 있어서 유용하고, 특히 DNA 합성에 관계되는 기술관련에 있어서 유용하다.
<배열표 프리 텍스트>
배열번호 1 : Pfu-PCNA
배열번호 2 : Pfu-PCNA
배열번호 3 : primer : Pfu-PCNA-F
배열번호 4 : primer : Pfu-PCNA-R
배열번호 5 : primer : Pfu_M73L-F
배열번호 6 : primer : Pfu_M73L-R
배열번호 7 : primer : Pfu_D143A-F
배열번호 8 : primer : Pfu_D143A-R
배열번호 9 : primer : Pfu_R82C-F
배열번호 10 : primer : Pfu_R82C-R
배열번호 11 : primer : Pfu_D143R-F
배열번호 12 : primer : Pfu_D143R-R
배열번호 13 : Pfu-RFCL
배열번호 14 : Pfu-RFCL
배열번호 15 : primer : RFCL-F primer
배열번호 16 : primer : RFCL-R primer
배열번호 17 : Pfu-RFCS
배열번호 18 : Pfu-RFCS
배열번호 19 : primer : RFCS-F primer
배열번호 20 : primer : RFCS-R primer
배열번호 21 : primer : RFCSF1 primer
배열번호 22 : primer : RFCSF2 primer
배열번호 23 : primer : RFCSR2 primer
배열번호 24 : primer : RFCSR1 primer
배열번호 25 : primer : F02
배열번호 26 : primer : F11
배열번호 27 : primer : F24
배열번호 28 : primer : R03
배열번호 29 : primer : R14
배열번호 30 : primer : R16
배열번호 31 : KOD-PCNA
배열번호 32 : KOD-PCNA
배열번호 33 : primer : KOD-PCNA-F
배열번호 34 : primer : KOD-PCNA-R
배열번호 35 : primer : KOD_M73L-F
배열번호 36 : primer : KOD_M73L-R
배열번호 37 : primer : KOD_E143R-F
배열번호 38 : primer : KOD_E143R-R
배열번호 39 : KOD-RFCL
배열번호 40 : primer : KOD-RFCL-F
배열번호 41 : primer : KOD-RFCL-R
배열번호 42 : KOD-RFCS
배열번호 43 : primer : KOD-RFCS-F
배열번호 44 : primer : KOD-RFCS-R
배열번호 45 : primer : RFCS-Nde-F
배열번호 46 : primer : RFCS-Sal-R
배열번호 47 : primer : RFCS-Ex2-F
배열번호 48 : primer : RFCS-Ex1-R
배열번호 49 : primer F09
배열번호 50 : primer F14
배열번호 51 : primer F16
배열번호 52 : primer F19
배열번호 53 : primer F23
배열번호 54 : primer F25
배열번호 55 : primer R04
배열번호 56 : primer R11
배열번호 57 : primer R15
배열번호 58 : primer R17
배열번호 59 : primer R21
배열번호 60 : primer R25
배열번호 61 : primer R27
배열번호 62 : primer : Pfu_D143K-F
배열번호 63 : primer : Pfu_D143K-R
배열번호 64 : primer : Pfu_D143H-F
배열번호 65 : primer : Pfu_D143H-R
배열번호 66 : primer : Pfu_R109E-F
배열번호 67 : primer : Pfu_R109E-R
배열번호 68 : primer : Pfu_D147R-F
배열번호 69 : primer : Pfu_D147R-R
배열번호 70 : primer : Pfu_E139A-F
배열번호 71 : primer : Pfu_E139A-R
배열번호 72 : primer : Pfu_E139R-F
배열번호 73 : primer : Pfu_E139R-R
SEQUENCE LISTING <110> Celestar Lexico-Sciences, Inc <120> Modified PCNA <130> PCLA-17638 <150> JP2005-195530 <151> 2005-07-04 <160> 73 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 750 <212> DNA <213> Pyrococcus furiosus <220> <221> CDS <222> (1)..(750) <223> Pfu-PCNA <400> 1 atg cca ttt gaa atc gta ttt gaa ggt gca aaa gag ttt gcc caa ctt 48 Met Pro Phe Glu Ile Val Phe Glu Gly Ala Lys Glu Phe Ala Gln Leu 1 5 10 15 ata gac acc gca agt aag tta ata gat gag gcc gcg ttt aaa gtt aca 96 Ile Asp Thr Ala Ser Lys Leu Ile Asp Glu Ala Ala Phe Lys Val Thr 20 25 30 gaa gat ggg ata agc atg agg gcc atg gat cca agt aga gtt gtc ctg 144 Glu Asp Gly Ile Ser Met Arg Ala Met Asp Pro Ser Arg Val Val Leu 35 40 45 att gac cta aat ctc ccg tca agc ata ttt agc aaa tat gaa gtt gtt 192 Ile Asp Leu Asn Leu Pro Ser Ser Ile Phe Ser Lys Tyr Glu Val Val 50 55 60 gaa cca gaa aca att gga gtt aac atg gac cac cta aag aag atc cta 240 Glu Pro Glu Thr Ile Gly Val Asn Met Asp His Leu Lys Lys Ile Leu 65 70 75 80 aag aga ggt aaa gca aag gac acc tta ata ctc aag aaa gga gag gaa 288 Lys Arg Gly Lys Ala Lys Asp Thr Leu Ile Leu Lys Lys Gly Glu Glu 85 90 95 aac ttc tta gag ata aca att caa gga act gca aca aga aca ttt aga 336 Asn Phe Leu Glu Ile Thr Ile Gln Gly Thr Ala Thr Arg Thr Phe Arg 100 105 110 gtt ccc cta ata gat gta gaa gag atg gaa gtt gac ctc cca gaa ctt 384 Val Pro Leu Ile Asp Val Glu Glu Met Glu Val Asp Leu Pro Glu Leu 115 120 125 cca ttc act gca aag gtt gta gtt ctt gga gaa gtc cta aaa gat gct 432 Pro Phe Thr Ala Lys Val Val Val Leu Gly Glu Val Leu Lys Asp Ala 130 135 140 gtt aaa gat gcc tct cta gtg agt gac agc ata aaa ttt att gcc agg 480 Val Lys Asp Ala Ser Leu Val Ser Asp Ser Ile Lys Phe Ile Ala Arg 145 150 155 160 gaa aat gaa ttt ata atg aag gca gag gga gaa acc cag gaa gtt gag 528 Glu Asn Glu Phe Ile Met Lys Ala Glu Gly Glu Thr Gln Glu Val Glu 165 170 175 ata aag cta act ctt gaa gat gag gga tta ttg gac atc gag gtt caa 576 Ile Lys Leu Thr Leu Glu Asp Glu Gly Leu Leu Asp Ile Glu Val Gln 180 185 190 gag gag aca aag agc gca tat gga gtc agc tat ctc tcc gac atg gtt 624 Glu Glu Thr Lys Ser Ala Tyr Gly Val Ser Tyr Leu Ser Asp Met Val 195 200 205 aaa gga ctt gga aag gcc gat gaa gtt aca ata aag ttt gga aat gaa 672 Lys Gly Leu Gly Lys Ala Asp Glu Val Thr Ile Lys Phe Gly Asn Glu 210 215 220 atg ccc atg caa atg gag tat tac att aga gat gaa gga aga ctt aca 720 Met Pro Met Gln Met Glu Tyr Tyr Ile Arg Asp Glu Gly Arg Leu Thr 225 230 235 240 ttc ctg ctg gct cca aga gtt gaa gag tga 750 Phe Leu Leu Ala Pro Arg Val Glu Glu 245 <210> 2 <211> 249 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 2 Met Pro Phe Glu Ile Val Phe Glu Gly Ala Lys Glu Phe Ala Gln Leu 1 5 10 15 Ile Asp Thr Ala Ser Lys Leu Ile Asp Glu Ala Ala Phe Lys Val Thr 20 25 30 Glu Asp Gly Ile Ser Met Arg Ala Met Asp Pro Ser Arg Val Val Leu 35 40 45 Ile Asp Leu Asn Leu Pro Ser Ser Ile Phe Ser Lys Tyr Glu Val Val 50 55 60 Glu Pro Glu Thr Ile Gly Val Asn Met Asp His Leu Lys Lys Ile Leu 65 70 75 80 Lys Arg Gly Lys Ala Lys Asp Thr Leu Ile Leu Lys Lys Gly Glu Glu 85 90 95 Asn Phe Leu Glu Ile Thr Ile Gln Gly Thr Ala Thr Arg Thr Phe Arg 100 105 110 Val Pro Leu Ile Asp Val Glu Glu Met Glu Val Asp Leu Pro Glu Leu 115 120 125 Pro Phe Thr Ala Lys Val Val Val Leu Gly Glu Val Leu Lys Asp Ala 130 135 140 Val Lys Asp Ala Ser Leu Val Ser Asp Ser Ile Lys Phe Ile Ala Arg 145 150 155 160 Glu Asn Glu Phe Ile Met Lys Ala Glu Gly Glu Thr Gln Glu Val Glu 165 170 175 Ile Lys Leu Thr Leu Glu Asp Glu Gly Leu Leu Asp Ile Glu Val Gln 180 185 190 Glu Glu Thr Lys Ser Ala Tyr Gly Val Ser Tyr Leu Ser Asp Met Val 195 200 205 Lys Gly Leu Gly Lys Ala Asp Glu Val Thr Ile Lys Phe Gly Asn Glu 210 215 220 Met Pro Met Gln Met Glu Tyr Tyr Ile Arg Asp Glu Gly Arg Leu Thr 225 230 235 240 Phe Leu Leu Ala Pro Arg Val Glu Glu 245 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: Pfu_PCNA-F <400> 3 catatgccat ttgaaatcgt att 23 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer: Pfu_PCNA-R <400> 4 ctcgagtcac tcttcaactc t 21 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: Pfu_M73L-F <400> 5 caattggagt taacctggac cacctaaag 29 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Pfu_M73L-R <400> 6 ctttaggtgg tccaggttaa ctccaattg 29 <210> 7 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Pfu_D143A-F <400> 7 ttcttggaga agtcctaaaa gctgctgtta aagatgcctc tctagtgagt gacag 55 <210> 8 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: Pfu_D143A-R <400> 8 ctgtcactca ctagagaggc atctttaaca gcagctttta ggacttctcc aagaa 55 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: Pfu_R82C-F <400> 9 cctaaagaag atcctaaagt gcggtaaagc aaagg 35 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: Pfu_R82C-R <400> 10 cctttgcttt accgcacttt aggatcttct ttagg 35 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: Pfu_D143R-F <400> 11 ggagaagtcc taaaacgtgc tgttaaagat gcc 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: Pfu_D143R-R <400> 12 ggcatcttta acagcacgtt ttaggacttc tcc 33 <210> 13 <211> 1440 <212> DNA <213> Pyrococcus furiosus <220> <221> CDS <222> (1)..(1440) <223> Pfu-RFCL <400> 13 atg cca gag ctt ccc tgg gta gaa aaa tac agg cca aaa aag tta agt 48 Met Pro Glu Leu Pro Trp Val Glu Lys Tyr Arg Pro Lys Lys Leu Ser 1 5 10 15 gaa att gta aac caa gaa gag gct ata gag aaa gtt aga gcg tgg ata 96 Glu Ile Val Asn Gln Glu Glu Ala Ile Glu Lys Val Arg Ala Trp Ile 20 25 30 gag agc tgg ttg cat ggc cac ccc cct aag aaa aaa gcc cta tta tta 144 Glu Ser Trp Leu His Gly His Pro Pro Lys Lys Lys Ala Leu Leu Leu 35 40 45 gca gga ccc cca ggg agc gga aag aca acc aca gtc tac gct cta gca 192 Ala Gly Pro Pro Gly Ser Gly Lys Thr Thr Thr Val Tyr Ala Leu Ala 50 55 60 aat gag tac aac ttt gaa gtc att gag ctc aac gcg agt gat gag aga 240 Asn Glu Tyr Asn Phe Glu Val Ile Glu Leu Asn Ala Ser Asp Glu Arg 65 70 75 80 act tat gaa aaa atc tcc agg tat gtt caa gca gca tac act atg gat 288 Thr Tyr Glu Lys Ile Ser Arg Tyr Val Gln Ala Ala Tyr Thr Met Asp 85 90 95 atc ctc gga aag agg agg aag ata atc ttc ctc gat gaa gca gat aat 336 Ile Leu Gly Lys Arg Arg Lys Ile Ile Phe Leu Asp Glu Ala Asp Asn 100 105 110 ata gag ccc agc gga gct aag gaa atc gca aaa cta att gat aag gcc 384 Ile Glu Pro Ser Gly Ala Lys Glu Ile Ala Lys Leu Ile Asp Lys Ala 115 120 125 aaa aat cca ata ata atg gct gca aat aag tac tgg gaa gtt cca aaa 432 Lys Asn Pro Ile Ile Met Ala Ala Asn Lys Tyr Trp Glu Val Pro Lys 130 135 140 gag atc cga gaa aaa gct gag cta gta gag tac aag agg tta acc cag 480 Glu Ile Arg Glu Lys Ala Glu Leu Val Glu Tyr Lys Arg Leu Thr Gln 145 150 155 160 aga gat gta atg aat gcc tta ata agg atc cta aag agg gaa ggt ata 528 Arg Asp Val Met Asn Ala Leu Ile Arg Ile Leu Lys Arg Glu Gly Ile 165 170 175 aca gtt cca aaa gaa atc ctc cta gaa ata gca aaa aga tct agt gga 576 Thr Val Pro Lys Glu Ile Leu Leu Glu Ile Ala Lys Arg Ser Ser Gly 180 185 190 gat cta aga gca gct ata aat gat cta cag acc gtt gta gtg ggt ggt 624 Asp Leu Arg Ala Ala Ile Asn Asp Leu Gln Thr Val Val Val Gly Gly 195 200 205 tac gaa gat gct acg caa gtt ttg gca tat aga gat gta gaa aag aca 672 Tyr Glu Asp Ala Thr Gln Val Leu Ala Tyr Arg Asp Val Glu Lys Thr 210 215 220 gtc ttt caa gcc cta gga ctc gtc ttt gga agt gac aac gcc aag agg 720 Val Phe Gln Ala Leu Gly Leu Val Phe Gly Ser Asp Asn Ala Lys Arg 225 230 235 240 gca aag atg gca atg tgg aac ttg gac atg tcc cct gat gaa ttc ctg 768 Ala Lys Met Ala Met Trp Asn Leu Asp Met Ser Pro Asp Glu Phe Leu 245 250 255 cta tgg gta gat gag aac att cct cac ctc tac cta aat cca gag gag 816 Leu Trp Val Asp Glu Asn Ile Pro His Leu Tyr Leu Asn Pro Glu Glu 260 265 270 att gcc cag gcg tat gat gca att agt aga gcc gac ata tac ctc gga 864 Ile Ala Gln Ala Tyr Asp Ala Ile Ser Arg Ala Asp Ile Tyr Leu Gly 275 280 285 agg gcc gcc aga act gga aac tat tca ctc tgg aag tac gca ata gat 912 Arg Ala Ala Arg Thr Gly Asn Tyr Ser Leu Trp Lys Tyr Ala Ile Asp 290 295 300 atg atg act gca gga gtt gcc gtg gca ggg aga aag aga agg gga ttt 960 Met Met Thr Ala Gly Val Ala Val Ala Gly Arg Lys Arg Arg Gly Phe 305 310 315 320 gtc aag ttt tat cct ccc aac acc cta aag att tta gcg gaa agc aaa 1008 Val Lys Phe Tyr Pro Pro Asn Thr Leu Lys Ile Leu Ala Glu Ser Lys 325 330 335 gaa gaa aga gag atc aga gag tca ata att aaa aag ata ata cga gag 1056 Glu Glu Arg Glu Ile Arg Glu Ser Ile Ile Lys Lys Ile Ile Arg Glu 340 345 350 atg cac atg agt agg cta cag gca ata gaa acg atg aaa ata att aga 1104 Met His Met Ser Arg Leu Gln Ala Ile Glu Thr Met Lys Ile Ile Arg 355 360 365 gag att ttc gag aac aat cta gac ctt gct gcg cac ttt aca gtg ttc 1152 Glu Ile Phe Glu Asn Asn Leu Asp Leu Ala Ala His Phe Thr Val Phe 370 375 380 ctt ggt ctg tct gaa aaa gaa gtt gag ttt cta gct gga aag gaa aaa 1200 Leu Gly Leu Ser Glu Lys Glu Val Glu Phe Leu Ala Gly Lys Glu Lys 385 390 395 400 gct ggt acc att tgg ggc aaa gcc tta gca tta aga agg aaa ctt aag 1248 Ala Gly Thr Ile Trp Gly Lys Ala Leu Ala Leu Arg Arg Lys Leu Lys 405 410 415 gag ctt gga ata aga gag gag gag aag cct aaa gtt gaa att gaa gaa 1296 Glu Leu Gly Ile Arg Glu Glu Glu Lys Pro Lys Val Glu Ile Glu Glu 420 425 430 gag gaa gaa gag gaa gaa aag acc gaa gaa gaa aaa gag gaa ata gaa 1344 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Glu Lys Glu Glu Ile Glu 435 440 445 gaa aaa ccc gaa gaa gag aaa gaa gag gag aag aaa gaa aag gaa aag 1392 Glu Lys Pro Glu Glu Glu Lys Glu Glu Glu Lys Lys Glu Lys Glu Lys 450 455 460 cca aag aaa ggc aaa caa gca act ctc ttt gac ttt ctt aaa aag tga 1440 Pro Lys Lys Gly Lys Gln Ala Thr Leu Phe Asp Phe Leu Lys Lys 465 470 475 <210> 14 <211> 479 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 14 Met Pro Glu Leu Pro Trp Val Glu Lys Tyr Arg Pro Lys Lys Leu Ser 1 5 10 15 Glu Ile Val Asn Gln Glu Glu Ala Ile Glu Lys Val Arg Ala Trp Ile 20 25 30 Glu Ser Trp Leu His Gly His Pro Pro Lys Lys Lys Ala Leu Leu Leu 35 40 45 Ala Gly Pro Pro Gly Ser Gly Lys Thr Thr Thr Val Tyr Ala Leu Ala 50 55 60 Asn Glu Tyr Asn Phe Glu Val Ile Glu Leu Asn Ala Ser Asp Glu Arg 65 70 75 80 Thr Tyr Glu Lys Ile Ser Arg Tyr Val Gln Ala Ala Tyr Thr Met Asp 85 90 95 Ile Leu Gly Lys Arg Arg Lys Ile Ile Phe Leu Asp Glu Ala Asp Asn 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actttttaag aaagtcaaag agag 34 <210> 17 <211> 2559 <212> DNA <213> Pyrococcus furiosus <220> <221> CDS <222> (1)..(2559) <223> Pfu-RFCS <400> 17 atg agc gaa gag att aga gaa gtt aag gtt cta gaa aaa ccc tgg gtt 48 Met Ser Glu Glu Ile Arg Glu Val Lys Val Leu Glu Lys Pro Trp Val 1 5 10 15 gag aag tat aga cct caa aga ctt gac gac att gta gga caa gag cac 96 Glu Lys Tyr Arg Pro Gln Arg Leu Asp Asp Ile Val Gly Gln Glu His 20 25 30 ata gtg aaa agg ctc aag cac tac gtc aaa act gga tca atg ccc cac 144 Ile Val Lys Arg Leu Lys His Tyr Val Lys Thr Gly Ser Met Pro His 35 40 45 cta ctc ttc gca ggc ccc cct ggt gtc gga aag tgt ctt act gga gat 192 Leu Leu Phe Ala Gly Pro Pro Gly Val Gly Lys Cys Leu Thr Gly Asp 50 55 60 acc aaa gtt ata gct aat ggc caa ctc ttt gaa ctt gga gaa ctt gtt 240 Thr Lys Val Ile Ala Asn Gly Gln Leu Phe Glu Leu Gly Glu Leu Val 65 70 75 80 gaa aag ctt tct ggg ggg aga ttt gga cca act cca gtt aaa ggg ctc 288 Glu Lys Leu Ser Gly Gly Arg Phe Gly Pro Thr Pro Val Lys Gly Leu 85 90 95 aaa gtt ctt gga ata gat gag gat gga aag ctt aga gag ttt gaa gtc 336 Lys Val Leu Gly Ile Asp Glu Asp Gly Lys Leu Arg Glu Phe Glu Val 100 105 110 caa tac gtc tac aaa gat aga act gat agg ttg ata aag ata aaa act 384 Gln Tyr Val Tyr Lys Asp Arg Thr Asp Arg Leu Ile Lys Ile Lys Thr 115 120 125 cag ctt ggc agg gag ctt aaa gta act ccg tat cac cca ctt cta gtg 432 Gln Leu Gly Arg Glu Leu Lys Val Thr Pro Tyr His Pro Leu Leu Val 130 135 140 aat aga gag aat ggc gaa ata aag tgg att aag gct gaa gaa ctc aaa 480 Asn Arg Glu Asn Gly Glu Ile Lys Trp Ile Lys Ala Glu Glu Leu Lys 145 150 155 160 cct ggc gac aag ctt gca ata ccg agc ttt ctc cca ctt ata act gga 528 Pro Gly Asp Lys Leu Ala Ile Pro Ser Phe Leu Pro Leu Ile Thr Gly 165 170 175 gaa aat ccc ctt gca gag tgg ctt ggt tac ttt atg gga agt ggc tat 576 Glu Asn Pro Leu Ala Glu Trp Leu Gly Tyr Phe Met Gly Ser Gly Tyr 180 185 190 gct tat cca agt aat tct gtc atc acg ttc act aac gaa gat cca ctc 624 Ala Tyr Pro Ser Asn Ser Val Ile Thr Phe Thr Asn Glu Asp Pro Leu 195 200 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Ser 305 310 315 320 gac aac ata gag agg ttc cta aat gag att ggc ttt agc acc caa agc 1008 Asp Asn Ile Glu Arg Phe Leu Asn Glu Ile Gly Phe Ser Thr Gln Ser 325 330 335 aaa ctt aaa gaa gcc cag aag ctc att aga aaa acc aat gta aga tcc 1056 Lys Leu Lys Glu Ala Gln Lys Leu Ile Arg Lys Thr Asn Val Arg Ser 340 345 350 gat gga cta aag att aac tat gag cta atc tcc tat gta aaa gac agg 1104 Asp Gly Leu Lys Ile Asn Tyr Glu Leu Ile Ser Tyr Val Lys Asp Arg 355 360 365 ctt agg tta aat gtc aat gat aaa aga aat ttg agc tac aga aat gca 1152 Leu Arg Leu Asn Val Asn Asp Lys Arg Asn Leu Ser Tyr Arg Asn Ala 370 375 380 aag gag ctt tct tgg gaa ctc atg aaa gaa att tat tat cgc ctt gag 1200 Lys Glu Leu Ser Trp Glu Leu Met Lys Glu Ile Tyr Tyr Arg Leu Glu 385 390 395 400 gaa ctg gag aga cta aag aag gtc tta tca gaa ccc atc ttg atc gac 1248 Glu Leu Glu Arg Leu Lys Lys Val Leu Ser Glu Pro Ile Leu Ile Asp 405 410 415 tgg aat gaa gta gca aag aag agt gat gaa gta ata gaa aaa gct aaa 1296 Trp Asn Glu Val Ala Lys Lys Ser Asp 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aga 1968 Leu Asp Glu Ala Asp Ala Leu Thr Gln Asp Ala Gln Gln Ala Leu Arg 645 650 655 aga acc atg gaa atg ttc tcg agt aac gtt cgc ttt atc ttg agc tgt 2016 Arg Thr Met Glu Met Phe Ser Ser Asn Val Arg Phe Ile Leu Ser Cys 660 665 670 aac tac tcc tcc aag ata att gaa ccc ata cag tct aga tgt gca ata 2064 Asn Tyr Ser Ser Lys Ile Ile Glu Pro Ile Gln Ser Arg Cys Ala Ile 675 680 685 ttc cgc ttc aga cct ctc cgc gat gag gat ata gcg aag aga cta agg 2112 Phe Arg Phe Arg Pro Leu Arg Asp Glu Asp Ile Ala Lys Arg Leu Arg 690 695 700 tac att gcc gaa aat gag ggc tta gag cta act gaa gaa ggt ctc caa 2160 Tyr Ile Ala Glu Asn Glu Gly Leu Glu Leu Thr Glu Glu Gly Leu Gln 705 710 715 720 gca ata ctt tac ata gca gaa gga gat atg aga aga gca ata aac att 2208 Ala Ile Leu Tyr Ile Ala Glu Gly Asp Met Arg Arg Ala Ile Asn Ile 725 730 735 ctg caa gct gca gca gct cta gac aag aag atc acc gac gaa aac gta 2256 Leu Gln Ala Ala Ala Ala Leu Asp Lys Lys Ile Thr Asp Glu Asn Val 740 745 750 ttc atg gta gcg agt aga gct aga cct gaa gat ata aga gag atg atg 2304 Phe Met Val Ala Ser Arg Ala Arg Pro Glu Asp Ile Arg Glu Met Met 755 760 765 ctt ctt gct ctc aaa ggc aac ttc ttg aag gcc aga gaa aag ctt agg 2352 Leu Leu Ala Leu Lys Gly Asn Phe Leu Lys Ala Arg Glu Lys Leu Arg 770 775 780 gag ata ctt ctc aag caa gga ctt agt gga gaa gat gta cta gtt cag 2400 Glu Ile Leu Leu Lys Gln Gly Leu Ser Gly Glu Asp Val Leu Val Gln 785 790 795 800 atg cac aaa gaa gtc ttc aac ctg cca ata gag gag cca aag aag gtt 2448 Met His Lys Glu Val Phe Asn Leu Pro Ile Glu Glu Pro Lys Lys Val 805 810 815 ctg ctt gct gat aag ata gga gag tat aac ttc aga ctc gtt gaa ggg 2496 Leu Leu Ala Asp Lys Ile Gly Glu Tyr Asn Phe Arg Leu Val Glu Gly 820 825 830 gct aat gaa ata att cag ctt gaa gca ctc tta gca cag ttc acc cta 2544 Ala Asn Glu Ile Ile Gln Leu Glu Ala Leu Leu Ala Gln Phe Thr Leu 835 840 845 att ggg aag aag tga 2559 Ile Gly Lys Lys 850 <210> 18 <211> 852 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 18 Met Ser Glu Glu Ile Arg Glu Val Lys Val Leu Glu Lys Pro Trp Val 1 5 10 15 Glu Lys Tyr Arg Pro Gln Arg Leu Asp Asp Ile Val Gly Gln Glu His 20 25 30 Ile Val Lys Arg Leu Lys His Tyr Val Lys Thr Gly Ser Met Pro His 35 40 45 Leu Leu Phe Ala Gly Pro Pro Gly Val Gly Lys Cys Leu Thr Gly Asp 50 55 60 Thr Lys Val Ile Ala Asn Gly Gln Leu Phe Glu Leu Gly Glu Leu Val 65 70 75 80 Glu Lys Leu Ser Gly Gly Arg Phe Gly Pro Thr Pro Val Lys Gly Leu 85 90 95 Lys Val Leu Gly Ile Asp Glu Asp Gly Lys Leu Arg Glu Phe Glu Val 100 105 110 Gln Tyr Val Tyr Lys Asp Arg Thr Asp Arg Leu Ile Lys Ile Lys Thr 115 120 125 Gln Leu Gly Arg Glu Leu Lys Val Thr Pro Tyr His Pro Leu Leu Val 130 135 140 Asn Arg Glu Asn Gly Glu Ile Lys Trp Ile Lys Ala Glu Glu Leu Lys 145 150 155 160 Pro Gly Asp Lys Leu Ala Ile Pro Ser Phe Leu Pro Leu Ile Thr Gly 165 170 175 Glu Asn Pro Leu Ala Glu Trp Leu Gly Tyr Phe Met Gly Ser Gly Tyr 180 185 190 Ala Tyr Pro Ser Asn Ser Val Ile Thr Phe Thr Asn Glu Asp Pro Leu 195 200 205 Ile Arg Gln Arg Phe Met Glu Leu Thr Glu Lys Leu Phe Pro Asp Ala 210 215 220 Lys Ile Arg Glu Arg Ile His Ala Asp Gly Thr Pro Glu Val Tyr Val 225 230 235 240 Val Ser Arg Lys Ala Trp Ser Leu Val Asn Ser Ile Ser Leu Thr Leu 245 250 255 Ile Pro Arg Glu Gly Trp Lys Gly Ile Arg Ser Phe Leu Arg Ala Tyr 260 265 270 Ser Asp Cys Asn Gly Arg Ile Glu Ser Asp Ala Ile Val Leu Ser Thr 275 280 285 Asp Asn Asn Asp Met Ala Gln Gln Ile Ala Tyr Ala Leu Ala Ser Phe 290 295 300 Gly Ile Ile Ala Lys Met Asp Gly Glu Asp Val Ile Ile Ser Gly Ser 305 310 315 320 Asp Asn Ile Glu Arg Phe Leu Asn Glu Ile Gly Phe Ser Thr Gln Ser 325 330 335 Lys Leu Lys Glu Ala Gln Lys Leu Ile Arg Lys Thr Asn Val Arg Ser 340 345 350 Asp Gly Leu Lys Ile Asn Tyr Glu Leu Ile Ser Tyr Val Lys Asp Arg 355 360 365 Leu Arg Leu Asn Val Asn Asp Lys Arg Asn Leu Ser Tyr Arg Asn Ala 370 375 380 Lys Glu Leu Ser Trp Glu Leu Met Lys Glu Ile Tyr Tyr Arg Leu Glu 385 390 395 400 Glu Leu Glu Arg Leu Lys Lys Val Leu Ser Glu Pro Ile Leu Ile Asp 405 410 415 Trp Asn Glu Val Ala Lys Lys Ser Asp Glu Val Ile Glu Lys Ala Lys 420 425 430 Ile Arg Ala Glu Lys Leu Leu Glu Tyr Ile Lys Gly Glu Arg Lys Pro 435 440 445 Ser Phe Lys Glu Tyr Ile Glu Ile Ala Lys Val Leu Gly Ile Asn Val 450 455 460 Glu Arg Thr Ile Glu Ala Met Lys Ile Phe Ala Lys Arg Tyr Ser Ser 465 470 475 480 Tyr Ala Glu Ile Gly Arg Lys Leu Gly Thr Trp Asn Phe Asn Val Lys 485 490 495 Thr Ile Leu Glu Ser Asp Thr Val Asp Asn Val Glu Ile Leu Glu Lys 500 505 510 Ile Arg Lys Ile Glu Leu Glu Leu Ile Glu Glu Ile Leu Ser Asp Gly 515 520 525 Lys Leu Lys Glu Gly Ile Ala Tyr Leu Ile Phe Leu Phe Gln Asn Glu 530 535 540 Leu Tyr Trp Asp Glu Ile Thr Glu Val Lys Glu Leu Arg Gly Asp Phe 545 550 555 560 Ile Ile Tyr Asp Leu His Val Pro Gly Tyr His Asn Phe Ile Ala Gly 565 570 575 Asn Met Pro Thr Val Val His Asn Thr Thr Ala Ala Leu Ala Leu Ala 580 585 590 Arg Glu Leu Phe Gly Glu Asn Trp Arg His Asn Phe Leu Glu Leu Asn 595 600 605 Ala Ser Asp Glu Arg Gly Ile Asn Val Ile Arg Glu Lys Val Lys Glu 610 615 620 Phe Ala Arg Thr Lys Pro Ile Gly Gly Ala Ser Phe Lys Ile Ile Phe 625 630 635 640 Leu Asp Glu Ala Asp Ala Leu Thr Gln Asp Ala Gln Gln Ala Leu Arg 645 650 655 Arg Thr Met Glu Met Phe Ser Ser Asn Val Arg Phe Ile Leu Ser Cys 660 665 670 Asn Tyr Ser Ser Lys Ile Ile Glu Pro Ile Gln Ser Arg Cys Ala Ile 675 680 685 Phe Arg Phe Arg Pro Leu Arg Asp Glu Asp Ile Ala Lys Arg Leu Arg 690 695 700 Tyr Ile Ala Glu Asn Glu Gly Leu Glu Leu Thr Glu Glu Gly Leu Gln 705 710 715 720 Ala Ile Leu Tyr Ile Ala Glu Gly Asp Met Arg Arg Ala Ile Asn Ile 725 730 735 Leu Gln Ala Ala Ala Ala Leu Asp Lys Lys Ile Thr Asp Glu Asn Val 740 745 750 Phe Met Val Ala Ser Arg Ala Arg Pro Glu Asp Ile Arg Glu Met Met 755 760 765 Leu Leu Ala Leu Lys Gly Asn Phe Leu Lys Ala Arg Glu Lys Leu Arg 770 775 780 Glu Ile Leu Leu Lys Gln Gly Leu Ser Gly Glu Asp Val Leu Val Gln 785 790 795 800 Met His Lys Glu Val Phe Asn Leu Pro Ile Glu Glu Pro Lys Lys Val 805 810 815 Leu Leu Ala Asp Lys Ile Gly Glu Tyr Asn Phe Arg Leu Val Glu Gly 820 825 830 Ala Asn Glu Ile Ile Gln Leu Glu Ala Leu Leu Ala Gln Phe Thr Leu 835 840 845 Ile Gly Lys Lys 850 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: RFCS-F primer <400> 19 atgagcgaag agattagaga agtt 24 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: RFCS-R primer <400> 20 atcacttctt cccaattagg gtgaac 26 <210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: RFCSF1 primer <400> 21 tcatatgagc gaagagatta gagaagttaa g 31 <210> 22 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: RFCSF2 primer <400> 22 gcaggccccc ctggtgtcgg aaagactaca gcggctttgg cccttg 46 <210> 23 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: RFCSR2 primer <400> 23 caagggccaa agccgctgta gtctttccga caccaggggg gcctg 45 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: RFCSR1 primer <400> 24 aggtcgacca tcacttcttc ccaattaggg tgaac 35 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: F02 <400> 25 gtcgtttctg caagcttggc 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: F11 <400> 26 gctgctgaaa cgttgcggtt g 21 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: F24 <400> 27 cgtcggggac attgtaaagg cg 22 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: R03 <400> 28 ccgagataaa aacaaacccg c 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: R14 <400> 29 ggcattccta cgagcagatg g 21 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: R16 <400> 30 tcccgttctt ccctggtagc 20 <210> 31 <211> 750 <212> DNA <213> Thermococcus kodakaraensis <400> 31 atgccgttcg aagttgtttt tgacggggcc aaggagtttg cagacctgat agcgaccgca 60 agcaacctca tcgacgaggc cgcctttaag ttcactgagg aaggcataag catgcgcgca 120 atggacccga gcagggtcgt tctcattgac ctcaacctgc ccgaaagcat cttctccaag 180 tacgaggtcg aagagcccga gacaatcggc atcaacatgg accagttcaa gaaaatcctc 240 aagcgcggca aggcgaaaga caccctcata ctcaggaagg gcgacgagaa cttccttgag 300 ataacttttg agggaaccgc caagaggaca ttcaggctcc ctctgataga tgtggaagag 360 cttgagctgg agcttcccga gctcccgttc acggctaagg tagtcctcct cggtgaggtt 420 ctcaaggagg gcataaagga cgcttccctc gtcagcgacg ccatcaagtt catagcaaag 480 gagaacgagt tcacaatgaa ggccgagggc gagaccaacg aggtcgagat aaggcttacc 540 cttgaggacg agggccttct cgaccttgaa gtcgaggaag agaccaagag tgcctacggc 600 ataagctacc tcagcgacat ggtcaagggc atcgggaagg ccgacgaagt tatcctccgc 660 ttcggcaacg agatgccgct ccagatggag tacatgatca gagacgaggg cagactgacc 720 ttcctgctcg ctccgcgcgt tgaggagtga 750 <210> 32 <211> 249 <212> PRT <213> Thermococcus kodakaraensis <400> 32 Met Pro Phe Glu Val Val Phe Asp Gly Ala Lys Glu Phe Ala Asp Leu 1 5 10 15 Ile Ala Thr Ala Ser Asn Leu Ile Asp Glu Ala Ala Phe Lys Phe Thr 20 25 30 Glu Glu Gly Ile Ser Met Arg Ala Met Asp Pro Ser Arg Val Val Leu 35 40 45 Ile Asp Leu Asn Leu Pro Glu Ser Ile Phe Ser Lys Tyr Glu Val Glu 50 55 60 Glu Pro Glu Thr Ile Gly Ile Asn Met Asp Gln Phe Lys Lys Ile Leu 65 70 75 80 Lys Arg Gly Lys Ala Lys Asp Thr Leu Ile Leu Arg Lys Gly Asp Glu 85 90 95 Asn Phe Leu Glu Ile Thr Phe Glu Gly Thr Ala Lys Arg Thr Phe Arg 100 105 110 Leu Pro Leu Ile Asp Val Glu Glu Leu Glu Leu Glu Leu Pro Glu Leu 115 120 125 Pro Phe Thr Ala Lys Val Val Leu Leu Gly Glu Val Leu Lys Glu Gly 130 135 140 Ile Lys Asp Ala Ser Leu Val Ser Asp Ala Ile Lys Phe Ile Ala Lys 145 150 155 160 Glu Asn Glu Phe Thr Met Lys Ala Glu Gly Glu Thr Asn Glu Val Glu 165 170 175 Ile Arg Leu Thr Leu Glu Asp Glu Gly Leu Leu Asp Leu Glu Val Glu 180 185 190 Glu Glu Thr Lys Ser Ala Tyr Gly Ile Ser Tyr Leu Ser Asp Met Val 195 200 205 Lys Gly Ile Gly Lys Ala Asp Glu Val Ile Leu Arg Phe Gly Asn Glu 210 215 220 Met Pro Leu Gln Met Glu Tyr Met Ile Arg Asp Glu Gly Arg Leu Thr 225 230 235 240 Phe Leu Leu Ala Pro Arg Val Glu Glu 245 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> KOD-PCNA-F primer <400> 33 ccatatgccg ttcgaagttg tttttga 27 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> KOD-PCNA-R primer <400> 34 ctcgagtcac tcctcaacgc gcgg 24 <210> 35 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> KOD_M73L-F primer <400> 35 cgagacaatc ggcatcaacc tggaccagtt caag 34 <210> 36 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> KOD_M73L-R primer <400> 36 cttgaactgg tccaggttga tgccgattgt ctcg 34 <210> 37 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> KOD_E143R-F primer <400> 37 ctcggtgagg ttctcaagcg tggcataaag gacgcttc 38 <210> 38 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> KOD_E143R-R primer <400> 38 gaagcgtcct ttatgccacg cttgagaacc tcaccgag 38 <210> 39 <211> 1500 <212> DNA <213> Thermococcus kodakaraensis <400> 39 atgacggaag tcccatgggt tgaaaaatac agacctagga agctcagcga gatagtaaac 60 caggagaaag cgttagagca ggttagggcg tgggtcgaag cctggctcca cggaaatccg 120 ccgaagaaga aggccctcct tctagcaggc ccccctggag tcggcaaaac gaccaccgtc 180 tatgccctgg ccaacgagta cggcttcgag gtcatcgagc tcaacgcaag cgacgagagg 240 acgtatgaaa agatagagcg ctacgttcaa gctgcataca ctatggatat tctcggaaag 300 aggaggaagc tgatattcct tgacgaggct gacaacatcg agccctctgg ggcgagggag 360 atagcgaagc tcatcgacaa ggccagaaac ccgataataa tgagcgccaa ccactactgg 420 gaggttccca gggagatacg caacaaagcc cagatagtcg agtacaagag gttgacgcag 480 agggacatca taaaggccct cgtgagaatc ctcaagcgtg agggactcga agttcccaag 540 gaggttctct acgagatagc gaagagggct aacggcgacc tgagggcagc tgtaaacgat 600 cttcagaccg ttgttaccgg tggagtcgag gatgccgttg aagtcctggc ttaccgcgac 660 actgagaaga gcgttttcca ggcgcttgcc cagctgttcg caacggacaa cgccaagagg 720 gcaaagttag ctgttcttgg agttgacatg atgcctaacg agcttctcca gtggatagac 780 gagaacgtcc cgtatgtcta ctacaggcct gaagacatag cgagggccta cgaggcgctc 840 agcagggctg acatatacct cggtagggca cagaggactg gaaactacgg cctctggaag 900 tacgcgaccg acatgatgac ggctggggtg gcggtcgctg gcatcaagaa gaagggcttc 960 gttaagatct acccacctaa gacgataaag ctcctcaccg agagcaagga ggagcgttcg 1020 ctcagggact cagtaatcaa gaagataatg agcgagatgc acatggctaa gcttgaggcc 1080 atagagaccc tccgctacct tagagttatc ttcgagaaca accccgattt ggcggcccac 1140 tttgtcgttt tcctcgacct cagcgagaag gaagttgagt tcataactgg agacaaggag 1200 aaggcgaaga cgatatgggc aaagagcatg aacattgaga agaaactcaa aaaagaaggc 1260 gagcttgagg cgagagcaaa ggaagccgaa agaagggtgg aagcggctga ggaagaggaa 1320 actatggaag ctggggaacc tgaagaagaa cttgaagaag tcgaggagga agagttaacc 1380 gaggaggagc ttgaggaagc ggaggaagag atagagaccg ttgggaagaa ggagaagccc 1440 gagaaggaga aaaccaagaa gggcaagcag gcgacgctgt tcgacttcct caagaagtga 1500 <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> KOD-RFCL-F primer <400> 40 ccatatgacg gaagtcccat gggttg 26 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> KOD-RFCL-R primer <400> 41 ctcgagtcac ttcttgagga agtcgaacag 30 <210> 42 <211> 981 <212> DNA <213> Thermococcus kodakaraensis <400> 42 atgtccgagg aagtgaagga agttaaaatt ctcgaaaagc cgtgggtcga gaagtacaga 60 ccccagaggc tcgaggacat agtaggtcag gatcacatag tcaagaggct gaagcactac 120 gttaaaaccg gctcgatgcc gcaccttcta ttcgcagggc cacccggcgt cgggaagaca 180 accgctgcac tggctttagc tagagaactc ttcggtgaga actggaggca caacttccta 240 gagctgaacg cgagcgatga gaggggtata aacgtcatcc gtgaaaaggt aaaggagttc 300 gcgaggacga agccgatagg cggtgcgagc tttaagataa tcttccttga tgaggcagat 360 gccctcacac aggacgctca gcaggccctc agaaggacga tggagatgtt ctcgaacaac 420 gtccgcttta tcctgagctg taactactcc tcaaagatca tcgaacccat acagtcgagg 480 tgtgccatct tccgcttcag accgctccgc gatgaggaca tagcgaagcg catcaggtac 540 atagccgaaa atgagggtct cgagctcacc gaggaaggcc tgcaggcgat actctacgtc 600 gctgagggcg atctcaggag ggcaatcaac gtccttcagg cggcagcagc cctcgacacg 660 aagataaccg acgagaacgt cttcctcgtg gccagcaggg cgaggcctga agacgtacgt 720 gaaatgatga cccttgctct ggaaggcaac ttcctgaagg ccagagagaa gctgagggat 780 atcctgttaa ggcagggcct cagcggtgaa gatgtcctca tccagatgca caaggaggtc 840 ttcaacctcc cgattcccga ggacaagaag gtggccctgg cggacaagat aggagagtac 900 aacttccgcc tggttgaagg ggctaacgag atgatacagc tcgaggcact ccttgcccag 960 ttcacgatta tgggtaagtg a 981 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> KOD-RFCS-F primer <400> 43 atgtccgagg aagtgaagga ag 22 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> KOD-RFCS-R primer <400> 44 tcacttaccc ataatcgtga actg 24 <210> 45 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RFCS-Nde-F primer <400> 45 ccatatgtcc gaggaagtga aggaag 26 <210> 46 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RFCS-Sal-R primer <400> 46 gtcgactcac ttacccataa tcgtgaactg 30 <210> 47 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RFCS-Ex2-F <400> 47 cgtcgggaag acaaccgctg cactggcttt ag 32 <210> 48 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RFCS-Ex1-R primer <400> 48 cagcggttgt cttcccgacg ccgggtggc 29 <210> 49 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer F09 <400> 49 agcctttgcc tcgctatac 19 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer F14 <400> 50 ccatctgctc gtaggaatgc c 21 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer F16 <400> 51 gctaccaggg aagaacggga 20 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer F19 <400> 52 ccaagatagc actcgaacga cg 22 <210> 53 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer F23 <400> 53 cgaatcccat ctcggcaagg ag 22 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer F25 <400> 54 gcacttgcgg tgacagtcac tc 22 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer R04 <400> 55 ccagtgcaaa gctttgtgtg c 21 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer R11 <400> 56 caaccgcaac gtttcagcag c 21 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer R15 <400> 57 cccagtagta ctgcaagagg 20 <210> 58 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer R17 <400> 58 cgtggtgtaa ttccctcgc 19 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer R21 <400> 59 gctcaccagt tcgatgatta acgg 24 <210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer R25 <400> 60 gagtgactgt caccgcaagt gc 22 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer R27 <400> 61 gcatcgccgg ctgatttctt cg 22 <210> 62 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: Pfu_D143K-F <400> 62 ggagaagtcc taaaacatgc tgttaaagat 30 <210> 63 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: Pfu_D143K-R <400> 63 atctttaaca gcttttttta ggacttctcc 30 <210> 64 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: Pfu_D143H-F <400> 64 ggagaagtcc taaaacatgc tgttaaagat 30 <210> 65 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: Pfu_D143H-R <400> 65 atctttaaca gcatgtttta ggacttctcc 30 <210> 66 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: Pfu_R109E-F <400> 66 caaggaactg caacagaaac atttagagtt cccc 34 <210> 67 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: Pfu_R109E-R <400> 67 ggggaactct aaatgtttct gttgcagttc cttg 34 <210> 68 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: Pfu_D147R-F <400> 68 cctaaaagat gctgttaaaa gagcctctct agtgagtgac 40 <210> 69 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: Pfu_D147R-R <400> 69 gtcactcact agagaggctc ttttaacagc atcttttagg 40 <210> 70 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: Pfu_E139A-F <400> 70 ggttgtagtt cttggagcag tcctaaaaga tgctg 35 <210> 71 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: Pfu_E139A-R <400> 71 cagcatcttt taggactgct ccaagaacta caacc 35 <210> 72 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: Pfu_E139R-F <400> 72 ggttgtagtt cttggaagag tcctaaaaga tgctg 35 <210> 73 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer: Pfu_E139R-R <400> 73 cagcatcttt taggactctt ccaagaacta caacc 35

Claims (14)

  1. PCNA 단량체에 있어서,
    단량체의 N 말단측 영역과 다른 단량체의 C 말단측 영역이 계면이 되어 다량체를 형성한 경우에, 각 단량체의 계면영역에서 단량체 상호의 분자간 상호작용을 형성하는 부위의 아미노산 잔기가 전하적으로 서로 반발하는 아미노산 잔기로 구성되고, 또한 단량체 그대로 또는 다량체를 형성하여 DNA 복제를 촉진하는 활성을 구비하는 변이형 PCNA 단량체.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 PCNA 단량체가 배열번호 2 또는 32에 기재된 아미노산 배열인 경우에 있어서의 제 82번째, 제 84번째, 제 109번째, 제 139번째, 제 143번째 및 제 147번째로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 위치의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 바꾼 아미노산 배열을 가지며,
    하기 (i)군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기와, 하기 (ii)군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 전하적으로 서로 반발하는 아미노산 잔기에 의하여 구성되는 변이형 PCNA 단량체.
    (i) 제 82번째, 제 84번째 및 제 109번째의 아미노산 잔기군
    (ii) 제 139번째, 제 143번째 및 제 147번째의 아미노산 잔기군
  3. 제 2항에 있어서,
    제 82번째, 제 84번째, 제 109번째, 제 139번째, 제 143번째 및 제 147번째 이외의 부위에 부가, 삽입, 치환 및 결실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 수개의 아미노산 잔기의 변이를 포함하는 변이형 PCNA 단량체.
  4. 제 3항에 있어서,
    배열번호 2 또는 32에 기재된 아미노산 배열에 있어서, 제 73번째의 아미노산 잔기를 로이신으로 바꾼 배열을 가지는 변이형 PCNA 단량체.
  5. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (i)군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산과 (ii)군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산이 양쪽 모두 산성 아미노산, 또는 양쪽 모두 염기성 아미노산인 변이형 PCNA 단량체.
  6. 제 2항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    배열번호 2 또는 32에 기재된 아미노산 배열에 있어서, 제 143번째의 아미노산 잔기를 아르기닌으로 바꾼 배열을 가지는 변이형 PCNA 단량체.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 기재된 PCNA 단량체가 구비하는 아미노산 배열을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제 7항에 기재된 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질전환체.
  9. 제 8항에 기재된 형질전환체를 배지에서 배양하고, 상기 형질전환체 및/또는 배지 중에 PCNA 단량체 및/또는 상기 단량체로 구성된 다량체를 축적시키는 것을 특징으로 하는 변이형 PCNA의 제조방법.
  10. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 기재된 PCNA 단량체 및/또는 상기 단량체로 구성된 다량체를 포함하는 DNA 복제용 시약.
  11. 제 10항에 기재된 시약을 구비한 DNA 복제용 키트.
  12. 제 11항에 있어서,
    PCR용 시약을 구비한 DNA 복제용 키트.
  13. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 기재된 PCNA 단량체 및/또는 상기 단량체로 구성된 다량체 및 DNA 폴리머라아제의 존재하에서 DNA의 합성반응을 행하는 것을 특징으로 하는 DNA의 복제방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 DNA의 합성반응이 PCR인 DNA의 복제방법.
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