JP2002360261A

JP2002360261A - Ｄｎａポリメラーゼ関連因子

Info

Publication number: JP2002360261A
Application number: JP2001176022A
Authority: JP
Inventors: Masao Kitabayashi; 北林　　雅夫; Toshihiro Kuroita; 黒板　　敏弘; Yoshikazu Ishida; 石田　　由和; Hidesuke Komatsubara; 小松原　　秀介; Yoshiaki Nishiya; 西矢　　芳昭; Masanori Oka; 岡　　正則; Yoshihisa Kawamura; 川村　　良久; Tadayuki Imanaka; 忠行今中
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2001-06-11
Filing date: 2001-06-11
Publication date: 2002-12-17

Abstract

(57)【要約】【課題】DNAポリメラーゼの有するDNA合成に関連する諸
性質を向上させる【解決手段】超好熱始菌原KOD1株からDNAポリメラーゼ
の有するDNA合成活性を促進する、或いはDNAポリメラー
ゼに結合する活性を有するDNAポリメラーゼ関連因子の
遺伝子をクローニングし、該遺伝子を用いて形質転換体
を作製する。次に、この形質転換体を培養し、該遺伝子
を発現した菌体から該因子を精製して評価用標品を取得
する。得られた該因子の添加効果によりDNAポリメラー
ゼのDNA合成に関する諸性質の向上が認められた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明により、DNAポリメラ
ーゼの有するDNA合成活性を高めるDNAポリメラーゼ関連
因子が提供される。該因子は各種のDNAポリメラーゼに
対して作用を示し、また、DNAポリメラーゼが使用され
る各種の工程に利用することが可能であり、遺伝子工学
研究用試薬として有用である。

【０００２】

【従来の技術】DNAポリメラーゼは遺伝子工学用試薬と
して有用な酵素であり、DNA塩基配列の決定、DNA標識、
部位特異的変異の導入など広く利用されている。また、
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの核酸増幅を用いる
組換えDNA技術に有用な耐熱性DNAポリメラーゼに関する
研究も多数なされている。PCR反応に用いる耐熱性DNAポ
リメラーゼとしては、真性細菌由来のPolI型酵素と始原
菌由来のα型酵素があり、これら２種類を混合した酵素
もよく使用されている。一般的にPolI型酵素は、DNA合
成速度が速く、プロセッシビティ（Processivity；DNA
ポリメラーゼが基質DNAに結合してから離れるまでに合
成されるヌクレオチドの数である）に優れる反面、3'-
5'エキソヌクレアーゼ活性が無いことからDNA合成時の
正確性が低く、熱安定性が低い。一方、α型酵素は、3'
-5'エキソヌクレアーゼ活性を持つことからDNA合成時の
正確性が高く、熱安定性に優れる反面、DNA合成速度が
遅く、プロセッシビティが低いと考えられていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】我々は、α型酵素であ
りながら、DNA合成速度が速く、プロセッシビティに優
れ、しかも、DNA合成時の正確性が高いKOD DNAポリメラ
ーゼを見出した。該酵素は、耐熱性DNAポリメラーゼと
して優れた性質を有しており、PCRにおいてもその長所
を発揮していた。しかしながら、更なるDNA合成活性の
向上、PCRパフォーマンスの向上が求められていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、PolI型酵
素の長所とα型酵素の長所を併せ持つKOD DNAポリメラ
ーゼを更に改良するため、超好熱始原菌KOD１株から該D
NAポリメラーゼ関連因子の遺伝子の取得を試み、これに
成功した。さらに、その遺伝子を大量発現させ、該DNA
ポリメラーゼ関連因子の工業的な生産を可能にした。ま
た、本発明で得られたDNAポリメラーゼ関連因子がDNAポ
リメラーゼの有するDNA合成反応を促進することを見出
した。

【０００５】すなわち本発明は、以下の構成からなる。（１）DNAポリメラーゼのDNA合成活性を促進するThermo
coccus sp.由来の耐熱性のDNAポリメラーゼ関連因子。（２）DNAポリメラーゼのDNA合成活性を促進する超好熱
始原菌KOD1株由来の耐熱性のDNAポリメラーゼ関連因
子。（３）DNAポリメラーゼのDNA合成活性を促進するThermo
coccus kodakaraensis由来の耐熱性のDNAポリメラーゼ
関連因子。（４）DNAポリメラーゼが耐熱性である（１）〜（３）
いずれか記載の耐熱性のDNAポリメラーゼ関連因子。（５）Thermococcus sp.由来DNAポリメラーゼのDNA合成
活性を促進する（１）〜（３）いずれか記載の耐熱性の
DNAポリメラーゼ関連因子。（６）超好熱始原菌KOD1株由来DNAポリメラーゼのDNA合
成活性を促進する（１）〜（３）いずれか記載の耐熱性
のDNAポリメラーゼ関連因子。（７）Thermococcus kodakaraensis由来DNAポリメラー
ゼのDNA合成活性を促進する（１）〜（３）いずれか記
載の耐熱性のDNAポリメラーゼ関連因子。（８）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するDNA
ポリメラーゼ構成タンパク質を含有するDNAポリメラー
ゼのDNA合成活性を促進する耐熱性のDNAポリメラーゼ関
連因子。（９）DNAポリメラーゼに結合する活性を有するThermoc
occus sp.由来の耐熱性のDNAポリメラーゼ関連因子。（1０）DNAポリメラーゼに結合する活性を有する超好熱
始原菌KOD1株由来の耐熱性のDNAポリメラーゼ関連因
子。（１１）DNAポリメラーゼに結合する活性を有するTherm
ococcus kodakaraensis由来の耐熱性のDNAポリメラーゼ
関連因子。（１２）DNAポリメラーゼが耐熱性である（９）〜（１
１）いずれか記載の耐熱性のDNAポリメラーゼ関連因
子。（１３）Thermococcus sp.由来DNAポリメラーゼに結合
する活性を有する（９）〜（１１）いずれか記載の耐熱
性のDNAポリメラーゼ関連因子。（１４）超好熱始原菌KOD1株由来DNAポリメラーゼに結
合する活性を有する（９）〜（１１）いずれか記載の耐
熱性のDNAポリメラーゼ関連因子。（１５）Thermococcus kodakaraensis由来DNAポリメラ
ーゼに結合する活性を有する（９）〜（１１）いずれか
記載の耐熱性のDNAポリメラーゼ関連因子。（１６）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するDN
Aポリメラーゼ構成タンパク質を含有するDNAポリメラー
ゼに結合する活性を有する耐熱性のDNAポリメラーゼ関
連因子。（1７）配列表の配列番号：２，４，6からなる群より選
択されたアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列におい
て、１個以上のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿
入されたアミノ酸配列を含有してなる（１）〜（1６）
いずれか記載のDNAポリメラーゼ関連因子。（１８）配列表の配列番号：２，４，6からなる群より
選択されたアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列におい
て、１個以上のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿
入されたアミノ酸配列を含有し、DNAポリメラーゼの有
するDNA合成活性を促進する活性を有するDNAポリメラー
ゼ関連因子をコードする遺伝子。（１９）配列表の配列番号：３，５，７からなる群より
選択された塩基配列、又は該塩基配列において、１個以
上の塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入された塩基配
列を含有してなる（１８）記載の遺伝子。（２０）（１８）又は（１９）記載の遺伝子とハイブリ
ダイズし、かつDNAポリメラーゼの有するDNA合成活性を
促進する活性を有するDNAポリメラーゼ関連因子をコー
ドする遺伝子。（２１）（１８）〜（２０）いずれか記載の遺伝子を含
有させた形質転換体を培養し、該培養物からDNAポリメ
ラーゼの有するDNA合成活性を促進する耐熱性のDNAポリ
メラーゼ関連因子を採取する工程を含むことを特徴とす
る、DNAポリメラーゼ関連因子の製造方法。（２２）（１）〜（１７）いずれか記載のDNAポリメラ
ーゼ関連因子の存在下にDNAを合成することを特徴とす
る、DNAポリメラーゼを使用するDNAの合成方法。（２３）２種以上のDNAポリメラーゼ関連因子の存在下
でDNAを合成する（２２）記載のDNAの合成方法。（２４）DNAポリメラーゼ関連因子として、KOD-PCNA (P
roliferating cell nuclear antigen)、KOD-RFCS(repli
cation factor C small subunit) 、KOD-RFCL(replicat
ion factor C large subunit)の存在下にDNAの合成を行
う（２３）記載のDNAの合成方法。（２５）DNAポリメラーゼが、耐熱性DNAポリメラーゼで
ある（２２）〜（２４）いずれか記載のDNA合成方法。（２６）PCR法により実施される（２５）記載のDNA合成
方法。（２７）試験管内DNA合成に使用されるキットであっ
て、（１）〜（１７）いずれかに記載のDNAポリメラー
ゼ関連因子及びDNAポリメラーゼを含有してなるキッ
ト。（２８）さらにDNA合成反応に必要な試薬を含有してな
る（２７）記載のキット。（２９）２種以上のDNAポリメラーゼ関連因子を含有し
てなる（２７）および（２８）記載のキット。（３０）DNAポリメラーゼ関連因子として、KOD-PCNA(Pr
oliferating cell nuclear antigen)、KOD-RFCS(replic
ation factor C small subunit) 、KOD-RFCL(replicati
on factor C large subunit)を含有してなる（２７）お
よび（２８）記載のキット。（３１）DNAポリメラーゼとして、耐熱性DNAポリメラー
ゼを含有してなる（２７）〜（３０）いずれか記載のキ
ット。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明のDNAポリメラーゼ関連因
子本明細書において、「DNAポリメラーゼ関連因子」と
は、DNAポリメラーゼと共存させることによって、DNAポ
リメラーゼの機能に影響を与える因子を意味し、具体的
にはDNAポリメラーゼの有するDNA合成活性を促進する作
用を有する因子、DNAポリメラーゼに結合する活性を有
する因子、更には、両活性を有するもの等を含む。DNA
ポリメラーゼの有するDNA合成活性を促進する活性を測
定する方法は、DNAポリメラーゼのDNA合成活性測定に通
常用いられるものであれば特に限定しないが、具体的に
は、「DNAポリメラーゼのDNA合成活性の促進」とは、DN
Aポリメラーゼのプロセッシビティ、DNA合成速度、dNTP
s取りこみ活性のいずれかの値を向上させるような作用
をいう。（好ましくは５０％以上増加、さらに好ましく
は１００％以上増加させる作用をいう。）

【０００７】なお、プロセッシビティとは、DNAポリメ
ラーゼが基質DNAに結合してから離れるまでに合成でき
るヌクレオチドの数として表される。次に、プロセッシ
ビティ測定法の一例を示す。5'末端を³²Ｐラベルしたプ
ライマーをアニーリングしたＭ１３ｍｐ１８ 1本鎖ＤＮ
Ａを基質DNAとして、ＤＮＡポリメラーゼの反応液(１２
０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ８．０)、1mM 塩化マグネシ
ウム、１０ｍM KCl、６ｍM (NH₄)₂SO₄、０．１％ Trito
nX-100、１０μg/ml ＢＳＡ、０．２mM ｄＮＴＰ)中
で、該基質をDNAポリメラーゼ1に対しモル比で数倍量過
剰に存在するような条件で、７５℃で反応させることに
より行う。上述のように、DNAポリメラーゼがターンオ
ーバーし難い条件とすることにより、基質DNAから離れ
ることなく一度に合成できるヌクレオチドの数を知るこ
とができる。一定時間反応後、等量の反応停止液(５０m
M 水酸化ナトリウム、１０mM ＥＤＴＡ、５％フィコー
ル、０．０５％ブロモフェノールブルー)を加えること
により反応停止を行う。上記反応にて合成されたＤＮＡ
をアルカリアガロースゲル電気泳動にて分画した後、ゲ
ルを乾燥させオートラジオグラフィーを行う。ＤＮＡサ
イズマーカーとしてはラベルされたλ/HindIIIを用い
る。このマーカーのバンドを指標として合成できたヌク
レオチドの数を測定することにより、プロセッシビティ
を求めることができる。

【０００８】DNA合成速度とは、単位時間あたりのＤＮ
Ａ合成数をいう。その測定法はＤＮＡポリメラーゼの反
応液(１２０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ８．０)、1mM 塩化
マグネシウム、１０ｍM KCl、６ｍM (NH₄)₂SO₄、０．１
％ TritonX-100、１０μg/mlＢＳＡ、０．２mM ｄＮＴ
Ｐ、０．２μCi[α-32Ｐ]ｄＣＴＰ)を、プライマーをア
ニーリングさせたＭ１３ｍｐ１８ 1本鎖ＤＮＡと７５℃
で反応させる。一定時間反応後、等量の反応停止液(５
０mM 水酸化ナトリウム、１０mM ＥＤＴＡ、５％フィコ
ール、０．０５％ブロモフェノールブルー)を加えるこ
とにより反応停止を行う。上記反応にて合成されたＤＮ
Ａをアルカリアガロースゲル電気泳動にて分画した後、
ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行う。ＤＮＡ
サイズマーカーとしてはラベルされたλ/HindIIIを用い
る。このマーカーのバンドを指標として合成されたＤＮ
Ａのサイズを測定することによってＤＮＡ合成速度を求
めることができる。

【０００９】また、dNTPs取りこみ活性とは、鋳型ＤＮ
Ａにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌク
レオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシヌクレオチ
ド５’−トリホスフェートのα-ホスフェートを共有結
合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリ
ボヌクレオチド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に
導入する反応を触媒する活性をいう。その活性測定法
は、酵素活性が高い場合は、保存緩衝液（５０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭＫＣｌ，１
ｍＭジチオスレイトール，０．１％Ｔｗｅｅｎ２
０，０．１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０，５０％グリ
セリン）でサンプルを希釈して測定を行う。本発明で
は、下記に記載のＡ液２５μl、Ｂ液５μl、Ｃ液５μ
l、滅菌水１０μl、及び酵素溶液５μlをマイクロチュ
ーブに加えて７５℃にて１０分間反応する。その後氷冷
し、Ｅ液５０μl、Ｄ液１００μlを加えて、攪拌後更に
１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワット
マン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノ
ールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチ
レーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型
ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性
の１単位はこの条件で３０分当りの１０nmolのヌクレオ
チドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶
化する画分）に取り込む酵素量とする。Ａ：４０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ７．５) １６mM 塩化マグネシウム１５mM ジチオスレイトール１００μg/ml ＢＳＡ（牛血清アルブミン）Ｂ：２μg/μl 活性化仔牛胸腺ＤＮＡＣ：１．５mM ｄＮＴＰ(２５０cpm/pmol [３Ｈ]ｄＴＴ
Ｐ) Ｄ：２０％トリクロロ酢酸(２mMピロリン酸ナトリウ
ム) Ｅ：１mg/ml サケ精子ＤＮＡ

【００１０】本発明のDNAポリメラーゼ関連因子は耐熱
性のタンパク質である。したがって、耐熱性DNAポリメ
ラーゼを使用した高温条件下でのDNA合成反応にも使用
することが可能である。本明細書において「耐熱性があ
る」とは、熱処理に対してもDNA合成活性を促進する能
力が維持されていることを意味し、具体的には、2nM以
上の本発明のDNAポリメラーゼ関連因子を、20mM Tris-H
Cl(pH7.5 at 75℃)緩衝液中に、6nMのDNAポリメラーゼ
と共存させたときのDNA合成活性を促進する能力が、80
℃，15分間の熱処理に対して、熱処理していないものと
比較して、５０％以上（好ましくは７５％以上、さらに
好ましくは９０％以上）維持されていることをいう。

【００１１】DNAポリメラーゼの有するDNA合成活性を促
進するDNAポリメラーゼ関連因子 DNAポリメラーゼの有するDNA合成活性を促進するDNAポ
リメラーゼ関連因子としては、DNAポリメラーゼの有す
るDNA合成活性を促進するものであれば特に限定される
ものではないが、例えば、配列番号２，４，６からなる
群より選ばれた少なくとも1種に示されるアミノ酸配列
の全部又は一部を含有するタンパク質、これらの配列に
1個以上のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入され
たアミノ酸配列を含有し、かつDNAポリメラーゼの有す
るDNA合成活性を促進する活性を有する機能的同等物が
挙げられる。本明細書における、「機能的同等物」と
は、構造的に差異があっても、その機能や活性につい
て、実質的に同等なものをいい、それらは、本発明のDN
Aポリメラーゼ関連因子の範囲内に含まれる。本発明のD
NAポリメラーゼ関連因子がその活性を促進するDNAポリ
メラーゼとしては特に限定がなく、例えば、イー.コリ
(E.coli)由来のPolIなどのDNAポリメラーゼ、サーマス
サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来のTth DN
Aポリメラーゼ、サーマスアクアティカス(Thermus aq
uaticus)由来のTaq DNAポリメラーゼ、ピロコッカス
フリオサス(Pyrococcus furiosus)由来のPfu DNAポリメ
ラーゼ、サーモコッカスコダカラエンシス（Thermoco
ccus kodakaraensis）由来のDNAポリメラーゼ(KOD DNA
ポリメラーゼ)などに代表される耐熱性DNAポリメラーゼ
などが挙げられる。好ましくは耐熱性のDNAポリメラー
ゼ、特に超好熱始原菌由来のDNAポリメラーゼが挙げら
れる。具体的には、Thermococcus kodakaraensis由来の
DNAポリメラーゼ(KOD DNAポリメラーゼ)が挙げられる。
KOD DNAポリメラーゼの１つは、配列表の配列番号1に記
載のアミノ酸配列を有するDNAポリメラーゼ構成タンパ
ク質を含有する酵素である。また、本発明のDNAポリメ
ラーゼ関連因子は、特定のDNAポリメラーゼの活性のみ
を促進するものであってもよいが、起源を異にする複数
種のDNAポリメラーゼに対してその活性を促進するもの
が好ましい。更に、本発明のDNAポリメラーゼ関連因子
は、複数のDNAポリメラーゼ関連因子を併用することに
より、単独使用に比べて、共存するDNAポリメラーゼ
に、より高いDNAポリメラーゼ活性を発揮させることも
可能である。

【００１２】DNAポリメラーゼに結合する活性を有するD
NAポリメラーゼ関連因子 DNAポリメラーゼに結合する活性を有するDNAポリメラー
ゼ関連因子としては、DNAポリメラーゼに結合する活性
を有するものであれば特に限定はない。なお、本明細書
におけるDNAポリメラーゼに結合する活性を有するDNAポ
リメラーゼ関連因子とは、DNAポリメラーゼに直接結合
する活性を有するものの他に、他の物質、例えば、他の
DNAポリメラーゼ関連因子を介して間接的にDNAポリメラ
ーゼに結合する活性を有するものも包含する。例えば、
配列番号２，４，６からなる群より選ばれた少なくとも
1種に示されるアミノ酸配列の全部又は一部を含有する
タンパク質、これらの配列に1個以上のアミノ酸が置
換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列を含有
し、かつDNAポリメラーゼの有するDNA合成活性を促進す
る活性を有する機能的同等物が挙げられる。本発明のDN
Aポリメラーゼ関連因子が結合するDNAポリメラーゼとし
ては特に限定がなく、例えば、イー.コリ(E.coli)由来
のPolIなどのDNAポリメラーゼ、サーマスサーモフィ
ラス(Thermus thermophilus)由来のTth DNAポリメラー
ゼ、サーマスアクアティカス(Thermus aquaticus)由
来のTaq DNAポリメラーゼ、ピロコッカスフリオサス
(Pyrococcus furiosus)由来のPfu DNAポリメラーゼ、サ
ーモコッカスコダカラエンシス（Thermococcus kodak
araensis）由来のDNAポリメラーゼ(KOD DNAポリメラー
ゼ)などに代表される耐熱性DNAポリメラーゼなどが挙げ
られる。好ましくは耐熱性のDNAポリメラーゼ、特に超
好熱始原菌由来のDNAポリメラーゼが挙げられる。具体
的には、Thermococcus kodakaraensis由来のDNAポリメ
ラーゼ(KOD DNAポリメラーゼ)が挙げられる。また、本
発明のDNAポリメラーゼ関連因子は、特定のDNAポリメラ
ーゼに結合するものであってもよいが、起源を異にする
複数種のDNAポリメラーゼに対して結合するものが好ま
しい。DNAポリメラーゼへの結合の測定方法としては、
該因子とDNAポリメラーゼとを混合し、未変性のゲル電
気泳動、ゲルろ過などによって分子量の変化を調べる方
法、DNAポリメラーゼを固定化した担体への該因子の吸
着を調べる方法などが挙げられる。なお、本発明のDNA
ポリメラーゼ関連因子の説明において、配列表の特定の
配列番号に示されるアミノ酸配列のそれぞれ全部、又は
一部を含有するタンパク質と表示したが、ここで「含有
するタンパク質」とは、次のようなタンパク質を意味
し、これらも本発明の範囲内に含まれる。即ち、遺伝子
工学的にタンパク質の生産を行う際には、融合タンパク
質として発現させることがしばしば行われる。例えば、
目的タンパク質の発現量を増加させるために、N末端に
他のタンパク質由来のN末端ペプチド鎖を付加したり、
目的タンパク質のN末端又はC末端に適当なペプチド鎖を
付加して発現させ、このペプチド鎖に親和性を持つ担体
を使用することにより目的タンパク質の精製を容易にし
たりする方法などが行われているが、本発明において
は、このような融合タンパク質も範囲内に含まれる。

【００１３】本発明のDNAポリメラーゼ関連因子をコー
ドする遺伝子の性質本発明のDNAポリメラーゼ関連因子をコードする遺伝子
としては、前記の本発明のDNAポリメラーゼ関連因子を
コードするものであり、DNAあるいはRNAを指す。具体的
には、配列表の配列番号２，４，６からなる群より選択
された少なくとも1種に示されるアミノ酸配列の全部又
は一部を含有するタンパク質、これらの配列に1個以上
のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ
酸配列を含有し、かつDNAポリメラーゼの有するDNA合成
活性を促進する活性、又はDNAポリメラーゼに結合する
活性を有するDNAポリメラーゼ関連因子をコードする遺
伝子が挙げられる。このような遺伝子としては、具体的
には、配列表の配列番号３，５，７からなる群より選択
された少なくとも１種に示される塩基配列の全部又はそ
の一部、あるいはそれらの配列において、1個以上の塩
基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列を含有
し、DNAポリメラーゼの有するDNA合成活性を促進する活
性又はDNAポリメラーゼに結合する活性を含有するDNAポ
リメラーゼ関連因子をコードする遺伝子が挙げられる。
本発明では、更に、これらの本発明の遺伝子のDNAとハ
イブリダイズし、かつDNAポリメラーゼの有するDNA合成
活性を促進する活性、又はDNAポリメラーゼに結合する
活性を有するDNAポリメラーゼ関連因子をコードする遺
伝子が挙げられる。本発明に記載の「（ある遺伝子に）
ハイブリダイズする遺伝子」とは、ある遺伝子のDNAに
ハイブリダイズすることが可能なDNAからなる遺伝子を
いい、該遺伝子に類似した塩基配列を有する遺伝子は、
そこにコードされているタンパク質のアミノ酸配列、更
に該タンパク質が有している機能も類似している可能性
が高い。遺伝子の塩基配列の類似性は、両遺伝子のDNA
又はその一部同士がストリンジェントな条件においてハ
イブリッドを形成するかどうかによって調べることがで
き、これを利用してある遺伝子がコードするタンパク質
と同様の機能を持つタンパク質をコードする遺伝子を取
得することができる。ここで、「ストリンジェントな条
件」とは、非特異的なハイブリダイゼーションが起こら
ない条件であり、具体的には、例えば、以下の条件が挙
げられる。すなわち、DNAを固定した膜を0.5％ＳＤＳ，
0.1％ウシ血清アルブミン（BSA），0.1％ポリビニルピ
ロリドン，0.1％フィコール400，0.01％変性サケ精子DN
Aを含む6xSSC（1xSSCは0.15M NaCl，0.015Mクエン酸ナ
トリウム，pH7.0を示す）中で、50℃で12〜20時間、標
識DNAプローブと共に反応する。反応終了後、0.5％SDS
を含む2xSSC中、37℃の条件での洗浄から始めて、SSC濃
度は、0.1xSSCまでの範囲で、また、温度は50℃までの
範囲で変化させ、固定された標識DNAプローブ由来のシ
グナルがバックグラウンドと区別できるようになるまで
膜を洗浄する。例に示したような条件で本特許記載のDN
A配列とハイブリダイズ可能なDNAは全て、本発明の請求
範囲に該当する。

【００１４】本発明のDNAポリメラーゼ関連因子をコー
ドする遺伝子のクローニング本発明のDNAポリメラーゼ関連因子をコードする遺伝子
を取得した事例を以下に示す。PCNA (Proliferating ce
ll nuclear antigen、以後PCNAと表記)は、RFC(replica
tion factor C、以後RFCと表記)と複合体を形成して、D
NA複製に関与すると報告されている[生化学、第8巻、第
1542〜1548頁(1996)]。したがって、Thermococcus koda
karaensisにおいてもPCNAとRFCに相当するタンパク質が
発現され、DNA合成反応に関与していることが期待され
た。Thermococcus kodakaraensisのPCNA、RFCホモログ
をコードする遺伝子は、以下に示す工程で取得した。始
原菌メタノコッカスジャナシ(Methanococcus jannasc
hii)及び、ピロコッカスホリコシイ (Pyrococcus hor
ikoshii)の染色体DNAの全塩基配列は既に解明されてお
り、該塩基配列にはPCNA及びRFC small subunit及びlar
ge subunitのホモログと考えられるタンパク質をコード
する遺伝子が含まれていると考えられた。これら菌株の
PCNA、RFC small subunit (以後、RFCSとも表記)及びla
rge subunit (以後、RFCLとも表記)のホモログの遺伝
子、ならびにそれぞれの既知遺伝子を比較して相同性の
高い塩基配列を調べ、これを参考にPCNA、RFC small su
bunit (RFCS)及びlarge subunit (RFCL)のそれぞれをコ
ードする遺伝子断片を取得するためのプライマー対をデ
ザインした。PCNA、RFC small subunit (RFCS)及びlarg
e subunit (RFCL)それぞれのプライマー対を用いて、超
好熱始原菌KOD1株の染色体DNAを鋳型にKOD-Plus-(東洋
紡績製)にてPCRを行い、DNA断片を増幅させた。増幅さ
れた断片のDNA配列を決定し、既知遺伝子との相同性比
較により目的遺伝子（KOD-PCNA遺伝子・KOD-RFCL遺伝子
およびKOD-RFCS遺伝子）が取得できたことを確認した。
次に、該断片をプローブとして、制限酵素で部分分解し
たKOD1株の染色体DNAを含有するファージDNAライブラリ
ーをプラークハイブリダイゼーションして、ファージク
ローンPCNA/λ、RFCS/λ、RFCL/λを取得した。本発明
においてクローン化したKOD-PCNA遺伝子(配列番号3)は7
50塩基からなり249個のアミノ酸がコードされていた。K
OD-RFCL遺伝子(配列番号5)は1500塩基からなり499個の
アミノ酸がコードされていた。KOD-RFCS遺伝子(配列番
号7)は2601塩基からなり、866個のアミノ酸がコードさ
れていた。KOD-RFCS遺伝子はRFCS保存領域IIIが分断さ
れた形になっており、この部分に1620塩基（539アミノ
酸）から成る介在配列(intein)が存在していた。そこ
で、この介在配列をPCR融合法により取り除き、981塩
基，326アミノ酸からなる成熟KOD-RFCS遺伝子を取得し
た。

【００１５】本発明のDNAポリメラーゼ関連因子の製造
方法本発明のDNAポリメラーゼ関連因子の製造方法は、本発
明の遺伝子を含有させた形質転換体を培養し、DNAポリ
メラーゼの有するDNA合成活性を促進する、又はDNAポリ
メラーゼに結合する活性を有する耐熱性のDNAポリメラ
ーゼ関連因子を該培養液から採取する工程を含むことを
特徴とする。本発明のDNAポリメラーゼ関連因子の製造
方法においては、タンパク質の精製に一般的に用いられ
る方法を適用することができる。例えば、本発明のDNA
ポリメラーゼ関連因子をコードするDNA（具体的には上
記方法により得られたKOD-PCNA遺伝子・KOD-RFCL遺伝子
またはKOD-RFCS遺伝子）を発現ベクターに連結し、発現
ベクターのプロモーターの制御下で過剰発現させること
ができる。また、本発明のDNAポリメラーゼ関連因子を
コードするDNAと、例えばヒスチジンタグをコードするD
NAとを連結させ、融合タンパク質として発現させること
により、本発明の遺伝子を保持する形質転換体からの該
DNAポリメラーゼ関連因子の採取を容易にすることがで
きる。前記融合タンパク質は、通常用いられるニッケル
カラムを用いることにより容易に分離することができ
る。

【００１６】DNAの合成方法本発明のDNAの合成方法は、前記本発明のDNAポリメラー
ゼ関連因子の存在下に、DNAポリメラーゼを用いてDNAを
合成することを1つの大きな特徴とする。本発明のDNA合
成方法においては、本発明のDNAポリメラーゼ関連因子
の存在下に、DNAポリメラーゼを用いてDNAを合成するこ
とによりPCR感度を数倍〜数十倍以上増加させることが
できる。本発明のDNA合成反応に用いられるDNAポリメラ
ーゼ関連因子としては、KOD-PCNA、KOD-RFCS、KOD-RFCL
が挙げられる。本発明のDNA合成方法においては、前記D
NAポリメラーゼ関連因子は、単独で又は2種以上を混合
して用いてもよい。本発明のDNA合成方法においては、
例えば、KOD-PCNAを用いることにより、KOD DNAポリメ
ラーゼ単独での反応と比べてDNA合成速度を数倍増大す
ることができる。本発明のDNA合成方法においては、前
記3種のDNAポリメラーゼ関連因子は、それぞれを単独で
混合して用いてもよく、KOD-RFCS，KOD-RFCLからなるKO
D-RFC複合体（RFCS:RFCL=1:4のheteropentamer）のみを
用いてもよく、KOD-PCNAとKOD-RFC複合体からなるPCNA-
RFC複合体を混合してもよい。本発明のDNA合成方法に用
いられるDNAポリメラーゼとしては、イー.コリ(E.coli)
由来のPolIなどのDNAポリメラーゼ、サーマスサーモ
フィラス(Thermus thermophilus)由来のTth DNAポリメ
ラーゼ、サーマスアクアティカス(Thermus aquaticu
s)由来のTaq DNAポリメラーゼ、ピロコッカスフリオ
サス(Pyrococcus furiosus)由来のPfu DNAポリメラー
ゼ、サーモコッカスコダカラエンシス（Thermococcus
kodakaraensis）由来のDNAポリメラーゼ(KOD DNAポリ
メラーゼ)などに代表される耐熱性DNAポリメラーゼが挙
げられる。好ましくは、耐熱性のDNAポリメラーゼであ
り、特に超好熱始原菌由来のDNAポリメラーゼ、具体的
にはThermococcus kodakaraensis由来のDNAポリメラー
ゼ(KOD DNAポリメラーゼ)と併用した場合、DNAポリメラ
ーゼと関連因子の由来が同じであることから、DNA合成
速度が速くプロセッシビティに優れ、しかも、DNA合成
時の正確性が高いKOD DNAポリメラーゼの特性が活かさ
れ、さらに良好な効果が期待できる。本発明のDNA合成
方法においては、前記DNAポリメラーゼは、単独で又は2
種以上を混合して用いてもよい。また、本発明のDNAの
合成方法において、前記DNAポリメラーゼを用い、PCR法
によりDNAを合成することができる。例えば、長鎖核酸
を増幅する方法のひとつとして、3'-5'エキソヌクレア
ーゼ活性を有するPfuポリメラーゼまたはTliポリメラー
ゼまたはこれらの変異酵素を混合したDNAポリメラーゼ
組成物を用いて、PCRを行う方法が報告されている（Bar
ns,W.M.(1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91， 2216-222
0）。また、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有しないTt
hポリメラーゼと3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する
PfuポリメラーゼまたはTliポリメラーゼ、サーモトガ・
マリチマ(Thermotaga maritima)由来の耐熱性DNAポリメ
ラーゼを混合したポリメラーゼ組成物を用いて、PCRを
行う方法が報告されている(特開平8-38198号公報)。し
かしながら、これらの組成物は１種類のDNAポリメラー
ゼを用いる場合と比べて、増幅効率は改善されるもの
の、熱安定性やDNA合成速度の異なる２種類のDNAポリメ
ラーゼを用いており、決して充分な増幅効率とは言えな
かった。そこで、我々は鋭意努力の結果、KOD DNAポリ
メラーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠失したKOD
(exo-) DNAポリメラーゼとKOD DNAポリメラーゼを混合
した新規な混合型耐熱性DNAポリメラーゼ（KOD Dash DN
Aポリメラーゼ、特開平10-42874号公報)を開発した。こ
のKOD Dash DNAポリメラーゼは、混合型酵素におけるひ
とつの最善の形態であり、これ以上の改善は不可能と思
われていた。しかしながら、該酵素においても、今回の
発明で得られた同じ起源となるDNAポリメラーゼ関連因
子を添加することにより、更なるＰＣＲパフォーマンス
の向上が認められた（実施例15参照）。これは、2種類D
NAポリメラーゼを用いた混合型酵素においても、該因子
を添加することにより効果が認められているが、KOD Da
shのように同じ起源のものを用いた混合型酵素において
は、更なる効果が得られている。本発明のDNA合成方法
において、本発明のDNAポリメラーゼ関連因子を存在さ
せるための使用量は、特に限定されず、DNAポリメラー
ゼの有する合成活性を促進させるのに十分な量を使用す
ればよい。

【００１７】本発明のDNAポリメラーゼ関連因子を含有
するキット本発明のDNAポリメラーゼ関連因子は、DNAポリメラーゼ
が使用される種々の反応に利用することができる。した
がって、試験管内でのDNA合成反応を行うためのキッ
ト、例えば、ジデオキシ法によるDNA塩基配列決定のた
めのキット、DNA標識用キット、PCRキットなどに本発明
のDNAポリメラーゼ関連因子を添付することにより、こ
れらのキットの性能を改善することができる。このよう
なキットとしては、DNAポリメラーゼと本発明のDNAポリ
メラーゼ関連因子を含むものの他、例えば、ｄNTP、MgC
l₂などのDNAポリメラーゼの反応に必要な試薬を含んで
もよい。本発明のキットに含有されるDNAポリメラーゼ
関連因子としては、KOD-PCNA、KOD-RFCS、KOD-RFCLが挙
げられる。本発明のキットにおいては、前記3種のDNAポ
リメラーゼ関連因子は、それぞれを単独で混合して用い
てもよく、KOD-RFCS，KOD-RFCLからなるKOD-RFC複合体
（RFCS:RFCL=1:4のheteropentamer）のみを用いてもよ
く、KOD-PCNAとKOD-RFC複合体からなるPCNA-RFC複合体
を混合してもよい。また、本発明のキットに含有される
DNAポリメラーゼとしては、イー.コリ(E.coli)由来のPo
lIなどのDNAポリメラーゼ、サーマスサーモフィラス
(Thermus thermophilus)由来のTth DNAポリメラーゼ、
サーマスアクアティカス(Thermus aquaticus)由来のT
aq DNAポリメラーゼ、ピロコッカスフリオサス(Pyroc
occus furiosus)由来のPfu DNAポリメラーゼ、サーモコ
ッカスコダカラエンシス（Thermococcus kodakaraens
is）由来のDNAポリメラーゼ(KOD DNAポリメラーゼ)など
に代表される耐熱性DNAポリメラーゼが挙げられる。本
発明のキットにおいては、耐熱性のDNAポリメラーゼを
含有させることが望ましい。特に超好熱始原菌由来のDN
Aポリメラーゼが挙げられる。具体的には、Thermococcu
s kodakaraensis由来のDNAポリメラーゼ(KOD DNAポリメ
ラーゼ)が挙げられる。本発明のキットを前記DNAの合成
方法に用いることにより、より簡便に、より短時間で、
高感度にDNAを合成することができる。

【００１８】

【実施例】以下実施例により本発明を更に詳しく説明す
るが、本発明はこれら実施例によりなんら限定されるも
のではない。

【００１９】実施例１超好熱始原菌KOD1株由来DNAポリメラーゼ関連因子をコ
ードする遺伝子のクローニング鹿児島県小宝島にて単離した超好熱始原菌KOD1株を95℃
にて培養後、菌体を回収した。得られた菌体から定法に
従い超好熱始原菌KOD1株の染色体DNAを調製した。DNAポ
リメラーゼ関連因子として知られるPCNA(Proliferating
-cell-nuclear-antigen)、RFCS(Replication C small s
ubunit)，及びRFCＬ(Replication C large subunit)の
各々の保存領域アミノ酸配列に基づき、プライマー対を
合成した。KOD-PCNA遺伝子のPCRではプライマー対PCNA-
f1(配列番号8)、PCNA-r1(配列番号9) を使用した。KOD-
RFCS遺伝子のPCRではプライマー対RFCS-f1(配列番号1
0)、RFCS-r1(配列番号11) を使用した。KOD-RFCL遺伝子
のPCRではプライマー対RFCL-f1(配列番号12)、RFCL-r1
(配列番号13)を使用した。これらプライマー対を使用
し、調製した染色体DNAを鋳型として、PCR反応を行なっ
た。なお、以後のすべてのPCR操作は、KOD-Plus-(東洋
紡績)を使用し、添付の使用例に基づき行なった。PCR増
幅DNA断片の塩基配列をジデオキシ法にて決定し、それ
ぞれのDNA断片が、各々の保存配列を有することを確か
めた(配列番号14、15、16)。超好熱始原菌KOD1株の染色
体DNAをEcoRIで消化したDNA断片とギガパックゴールド
（ストラタジーン社製）とを用いたin vitroパッケー
ジング法により、超好熱始原菌KOD1株の染色体DNAを有
するコスミドをラムダファージ粒子中にパッケージング
し、ファージDNAライブラリーを調製した。KOD-PCNAを
含むDNA断片をプローブとして、プラークハイブリダイ
ゼーションを行い、上記ライブラリーからKOD1株由来の
PCNA遺伝子を含有すると考えられるファージクローンPC
NA/λを取得した。同様の方法にて、RFCS、RFCLの各々
の遺伝子を含有すると考えられるファージクローンRFCS
/λ、RFCL/λを取得した（図1）。

【００２０】実施例2クローン断片の塩基配列の決定プライマー対PCNA-f1，PCNA-r1を用い、ファージクロー
ンPCNA/λを鋳型としたファージダイレクトPCRを行い、
DNA増幅断片を取得した。得られた増幅断片をダイレク
トシーケンシングして該遺伝子の内部の塩基配列を決定
した。該遺伝子の５'端、３'端に関しては、λベクター
left arm内の塩基配列からプライマーλL1(配列番号17)
を、λベクターright arm内の塩基配列からλR1(配列番
号18)を合成し、該遺伝子内部で新たに合成したプライ
マーPCNA-f2(配列番号19)、PCNA-r2(配列番号20)とを組
合せて、ファージクローンPCNA/λを鋳型としたファー
ジダイレクトPCRを行い、５'端、３'端を含むDAN増幅断
片を取得した。同様に、得られた５'端、３'端を含む増
幅断片をダイレクトシーケンシングして該遺伝子の５'
端、３'端の塩基配列を決定した。RFCS、RFCLの各遺伝
子に対しても上述と同様の操作を行い、プライマーλL1
(配列番号17)或いはλR1(配列番号18)と、新たに合成し
たプライマーRFCS-f2(配列番号21) RFCS-r2(配列番号2
2) 或いはRFCL-f2(配列番号23) RFCL-r2(配列番号24)を
合成してファージダイレクトPCRを行い、各々の５'端、
３'端を含むDNA断片を取得し、ダイレクトシーケンシン
グにより全塩基配列を決定した。KOD-PCNA遺伝子(配列
番号3)は750塩基からなり249個のアミノ酸(配列番号2)
がコードされていた。KOD-RFCL遺伝子(配列番号5)は150
0塩基からなり499個のアミノ酸(配列番号4)がコードさ
れていた。KOD-RFCS遺伝子(配列番号7)は2601塩基から
なり、866個のアミノ酸(配列番号6)がコードされてい
た。KOD-PCNA遺伝子の塩基配列およびタンパク質のアミ
ノ酸配列とArchaea由来のPCNAの相同性比較結果を表１
に示す。KOD-RFCS遺伝子の塩基配列およびタンパク質の
アミノ酸配列とArchaea由来のRFCSの相同性比較結果を
表2に示す。KOD-RFCL遺伝子の塩基配列およびタンパク
質のアミノ酸配列とArchaea由来のRFCLの相同性比較結
果を表3に示す。

【００２１】

【表１】

【００２２】

【表２】

【００２３】

【表３】

【００２４】実施例3成熟KOD-RFCS遺伝子の構築 KOD-RFCSはRFCS保存領域IIIが分断された形になってお
り、この部分に1620塩基（539アミノ酸）から成る介在
配列(KOD-RFCS Intein)が存在していた（図2,3）。そこ
で、この介在配列をArchaea由来で同様にRFCS内に介在
配列を持つArcaea由来のものと比較したところ、DNAレ
ベルで60〜75％、アミノ酸レベル58〜71％と高い相同性
が認められた（表４）。

【００２５】

【表４】

【００２６】そこで、この配列をPCR融合法により取り
除くこととした。PCR融合法では、ファージクローンを
鋳型として、2組のプライマーNdeI-ｍRFCSとΔRFCS-r、
ΔRFCS-fとmRFCS-XbaI(それぞれ配列番号25と26、27と2
8に相当)にて各々PCRを行い、介在配列を除いた2断片を
増幅した。この際、PCRに用いるプライマーは、他の断
片と結合する側に結合相手と同様な配列がくるように設
計した。また、RFCS遺伝子の5'端、３'端に相当する位
置を含むプライマー内に、それぞれ、制限酵素NdeI認識
部位とXbaI認識部位を付加したものを設計した。増幅し
た2つのDNA断片を混合して、再度PCRを行い、介在配列
が取り除かれ、5'端にNdeI認識部位と3'端にXbaI認識部
位を有する成熟型のKOD-RFCS(KOD-mRFCS)遺伝子を取得
した（図4）。

【００２７】実施例4PCNA、RFCS、RFCL組換え発現ベクターの構築塩基配列が決定したKOD-PCNA遺伝子の5'端、3'端に、そ
れぞれ、制限酵素NdeI認識部位とXbaＩ認識部位を付加
したプライマーNdeI-PCNA、PCNA-XbaIを設計した(配列
番号29と30)。また、同様にKOD-RFCL遺伝子の5'端、3'
端に、それぞれ、制限酵素NdeI認識部位とXbaI認識部位
を付加したプライマーNdeI-RFCL、RFCL-XbaIを設計した
(配列番号31と32)。これらプライマー対を用いて、それ
ぞれの、完全長を含むファージクローンを鋳型としてPC
Rを行い、5'端にNdeI認識部位と3'端にXbaI認識部位を
有するKOD-PCNA遺伝子とKOD-RFCL遺伝子を取得した。pE
TのNdeI/ NheI認識部位と、これらのDNA断片の制限酵素
認識部位を利用し、サブクローニングして、組換え発現
ベクター(pET-PCNA、pET-mRFCS、pET-RFCL)を取得し
た。なお、XbaI切断末端とNheI切断末端はcompatible s
iteを持ち、ライゲーション可能である。次に、プラス
ミドpET-PCNA、pET-mRFCS、pET-RFCL中の挿入DNA断片を
ジデオキシ法で塩基配列を確認して、PCRに起因する変
異の無いことを確認した（図5,6）。

【００２８】実施例5mRFCS-RFCL組換え共発現ベクターの構築 pET-RFCLを鋳型に、リン酸化プライマーpET-f (配列番
号33)とRFCL-SpeI (配列番号34)にてPCRを行い、得られ
たDNA断片を制限酵素SpeIで切断して、その遺伝子上流
にT7 promoter／ribosome binding siteを持つRFCL
遺伝子断片を取得した。また、pET-ｍRFCSを鋳型に、Nd
eI-ｍRFCS(配列番号25)とリン酸化プライマーmRFCS-Xba
I (配列番号28)にてPCRを行い、得られたDNA断片を制限
酵素NdeIで切断してRFCS遺伝子断片を取得した。pETのN
deI/ NheI認識部位と、上述により得られた２種の遺伝
子断片を同時にライゲーションして、共発現ベクター(p
ET-mRFCS-RFCL)を取得した。なお、SpeI切断末端とNheI
切断末端はcompatible siteを持ち、ライゲーション可
能である。次に、プラスミドpET-mRFCS-RFCL中の挿入DN
A断片をジデオキシ法で塩基配列を確認し、PCRに起因す
る変異の無いことを確認した（図7）。

【００２９】実施例6KOD-PCNAの発現と精製実施例４で取得した組換え発現ベクターpET-PCNAを用い
て、大腸菌（E.coli BL21(DE3)）を形質転換し、得られ
た形質転換体をLB培地（Molecular Cloning，p.A.2,198
9に記載）で培養し、集菌２時間前にT7プロモーターの
誘導処理をイソプロピオチド-β-D-ガラクトピラノシド
の添加により行なった。培養液より菌体を遠心分離によ
り回収した。緩衝液に再懸濁した後、菌体を加圧破砕
し、細胞抽出物を得た。更に、細胞破砕液を80℃，30分
間加温処理して、宿主細胞由来の不純タンパク質を不溶
化した。不溶画分を遠心分離して除去した後、上清を２
本のカラム（HiTrapQ Cr.、Superdex200 Cr.）に供して
KOD1株由来のPCAN精製標品を取得した（図8）。得られ
た精製標品をSDS-PAGEして、PVDF膜へ転写した後、所望
の部位を切り出し、プロテインシークエンサーに供して
標品のN末端の配列を決定した。シーケンシング結果
は、P-F-E-V-Vとなり、遺伝子の塩基配列から推定したM
-P-F-E-V-Vと一致した（表５）。

【００３０】

【表５】

【００３１】実施例7KOD-ｍRFCS、KOD-RFCLの発現実施例４で取得した組換え発現ベクターpET-mRFCS、pET
-RFCLを用いて、大腸菌（E.coli BL21(DE3)）を形質転
換し、得られた形質転換体をLB培地で培養し、集菌２時
間前にT7プロモーターの誘導処理をイソプロピオチド-
β-D-ガラクトピラノシドの添加により行なった。培養
液より菌体を遠心分離により回収した。緩衝液に再懸濁
した後、菌体を超音波破砕し、細胞抽出物を得た。更
に、細胞破砕液を80℃，30分間加温処理して、宿主細胞
由来の不純タンパク質を不溶化した。不溶画分を遠心分
離して除去して、RFCL, RFCSの粗精製標品を得た。

【００３２】実施例8KOD-RFC複合体(ｍRFCS-RFCL)の発現と精製実施例５で取得した組換え発現ベクターpET-mRFCS-RFCL
を用いて、大腸菌（E.coli BL21(DE3)）を形質転換し、
得られた形質転換体をLB培地で培養し、集菌２時間前に
T7プロモーターの誘導処理をイソプロピオチド-β-D-ガ
ラクトピラノシドの添加により行なった。培養液より菌
体を遠心分離により回収した。緩衝液に再懸濁した後、
菌体を加圧破砕し、細胞抽出物を得た。細胞破砕液を80
℃，30分間加温処理して、宿主細胞由来の不純タンパク
質を不溶化した後、遠心分離して破砕上清を回収した。
更に、ポリエチレンイミンにより除核酸して、不溶画分
を遠心分離して除去した後、上清を２本のカラム（Hydo
roxyapatite Cr.、HiTrapQCr.）に供してKOD1株由来のR
FC複合体（ｍRFCS-RFCL）の精製標品を取得した（図
9）。得られた精製標品をSDS-PAGEして、PVDF膜へ転写
した後、ｍRFCS、RFCLそれぞれ所望の部位を切り出し、
プロテインシークエンサーに供して標品のN末端の配列
を決定した。シーケンシング結果は、ｍRFCS：S-E-E-V-
K、RFCL：M-T-E-V-Pとなり、遺伝子の塩基配列から推定
したｍRFCS：M-S-E-E-V-K、RFCL：M-T-E-V-P-Wと一致し
た（表5）。

【００３３】実施例９KOD-PCNA、KOD-RFC複合体の会合比 KOD-PCNA、KOD-mRFCS、KOD-RFCLの遺伝子から推定した
モノマーあたりの分子量と、既報の超好熱菌Pyrococcus
furiosus由来のPfu-PCNA、Pfu-RFC複合体の会合比から
KOD-PCNA、KOD-RFC複合体の会合比を推定したところ、
それぞれ84.6kD、206kDであった。PCNA精製標品とRFC精
製標品を混合してTSKgel G3000SW（東ソー株式会社）に
供し分析したところ、図10のようなチャートが得られ、
分子量標準サンプルから計側した結果、PCNA：87.1 k
D、RFC複合体：227.4kDであった。それぞれ、遺伝子か
ら予想された推定値に近い値が得られた。PCNAはホモト
リマー構造、RFC複合体はヘテロペンタマー構造を有し
ており、RFC複合体は、mRFCSとRFCLが１：４の割合で会
合しているものと思われた（表６）。

【００３４】

【表６】

【００３５】実施例10DNAポリメラーゼに対するKOD-PCNAタンパク質の効果 KOD DNAポリメラーゼ150fmol と、M13mp18DNA(環状１本
鎖DNA)にM13P7プライマー（配列番号35）をアニーリン
グさせたDNA 1.5pmolと反応してプロセッシビティを測
定した。反応緩衝液[20mM Tris-HCl(pH7.5 at75℃)，10
mM KCl，6mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgCl₂，0.1％ TritonX-1
00，10μg/ml BSA]に実施例６で得たKOD-PCNAを450fmo
l、1.5pmol、4.5pmol、15pmol添加して、75℃で反応時
間30秒、60秒、120秒における伸長度を調べた。各反応
時間毎に伸長反応中のDNAサンプルの一部を抜き取り等
量の反応停止溶液(60mM EDTA，60μM NaOH，0.1％BPB，
30％グリセロール)に添加する。上記過程で得たDNAサン
プルを1％アルカリアガロース電気泳動法により分離分
析し、合成されたDNAの大きさを調べた（図11）。PCNA
無添加の時には、反応時間30秒で1.2kb、60秒で2.5kb、
120秒で5kbの伸長が認められ、特異的にDNAポリメラー
ゼと基質が解離するポイントは認められなかった。KOD
DNAポリメラーゼのProcessivityは5kb以上と思われる。
また、DNAポリメラーゼ150fmolに対し、基質DNA1.5pmol
という基質過剰な状態では、KOD DNAポリメラーゼのDNA
合成速度は約40塩基/秒であった。一方、PCNAを添加す
ることにより、DNA合成速度が増大する傾向が見られ、
モル比でDNAポリメラーゼの30倍量のPCNA添加したとき
にDNA合成速度が最高で、120塩基/秒となった。この値
は、PCNA無添加時の約３倍に相当する。なお、0.5kb〜2
kb付近にシグナルが認められたのは、KOD DNAポリメラ
ーゼ分子の一部がPCNAと結合して、DNA合成活性の促進
に寄与できなかったためと思われる。また、KOD DNAポ
リメラーゼの数十倍という過剰のPCNAが必要となったの
は、PCNAが環状構造をとるため、環状１本鎖DNAに作用
し難かったためと思われる。そこで、PCNAに更にPCNAの
開閉に関与すると考えられるRFCを添加して同様の検討
を行い、この低分子のシグナルが解消されるか確かめ
た。

【００３６】実施例11DNAポリメラーゼに対するKOD-PCNAタンパク質とKOD-RFC
複合体共存下での効果実施例10と同様の方法で、プライマーをアニーリングさ
せた環状１本鎖DNAを基質として、KOD-PCNA 存在下、あ
るいはKOD-PCNA,KOD-RFC共存下でKOD DNAポリメラーゼ
反応を行った。この結果を図２に示す。実施例10での結
果と同様で、PCNAのみを添加した場合、DNA合成速度の
増大も認められたが、0.5kb〜2kb付近にシグナルが認め
られた。一方、PCNAに更にRFCを共存させた場合、0.5kb
〜2kb付近のシグナルが減少した。これは、RFC複合体存
在下で、ほとんどのKOD DNAポリメラーゼ分子がPCNAと
作用できるようになったためと思われる。３種類のタン
パク質が協調的に働いていることを示唆している（図1
2）。また、図12で明らかなように、KOD DNAポリメラー
ゼ単独の反応と比べて、PCNA，RFC共存下でDNA合成速度
が増大している。また、PCNA，RFC共存下でDNA合成量も
2倍以上増大していた。

【００３７】実施例12PCRにおけるKOD-PCNAタンパク質の効果 human β-globinクラスター内の3.6kbを増幅するPCRに
てKOD-PCNAタンパク質の添加効果を確認した。PCR buff
erはKOD-Plus-（東洋紡績製）添付のものを用い、0.2mM
dNTPs、配列番号36、37記載のプライマー対0.3μM使用
した。耐熱性DNAポリメラーゼとしてKOD DNAポリメラー
ゼ１Uを用い、鋳型にはヒト培養細胞K562由来のGenomic
DNAを使用し、PCNAの有無におけるPCR結果の違いを調
べた。94℃,2分の前反応の後、94℃,20秒―60℃,30秒−
68℃,4分を35サイクル繰り返すスケジュールでGeneAmp2
400（PEアプライドバイオシステムズ社）にてPCRを行っ
た（図13）。PCNA無添加の場合、鋳型DNA3ng使用時にス
メアの中に微かに標的DNAの増幅が認められた。一方、
同じ鋳型量でもPCNA添加により、標的DNAの増幅がより
鮮明となり、反応系に30fmoles PCNAを添加した場合に
は鋳型DNA1ng使用でも標的DNAの増幅が認められた。PCN
A添加によりPCR感度が３倍以上増加していた。なお、添
加効果が見られるPCNA量は、使用酵素、標的DNA、PCR b
uffer等により異なるので、前記の濃度に限定されるも
のではない。

【００３８】実施例13PCRにおけるKOD-RFC複合体の効果実施例12と同じ標的DNA、反応系にてKOD-RFC複合体の添
加効果を確認した。鋳型となるヒト培養細胞K562由来の
Genomic DNA 1ng用いてPCRに効果のあるRFC添加量を調
べた。図14で、明らかなようにRFC無添加時には標的DNA
の増幅は認められないが、反応系に750fmoles RFCを添
加した場合には標的DNAの増幅が認められた。なお、添
加効果が見られるRFC量は、使用酵素、標的DNA、PCR bu
ffer等により異なるので、前記の濃度に限定されるもの
ではない。

【００３９】実施例14PCRにおけるKOD-PCNAタンパク質とKOD-RFC複合体共存下
での効果実施例12と同じ標的DNA、反応系にてKOD-PCNAタンパク
質とKOD-RFC複合体共存下における添加効果を調べた。
鋳型となるヒト培養細胞K562由来のGenomic DNAは、1ng
用い、それぞれの量比を調べた。図15で、明らかなよう
に反応系に10fmoles PCNAのみを添加した場合、スメア
の中に僅かに標的DNAの増幅が確認できる程度である
が、これに1.5pmoles RFCを添加することにより、十分
な増幅が確認できるようになった。なお、添加効果が見
られるKOD-PCNAタンパク質とKOD-RFC複合体の使用量比
は、使用酵素、標的DNA、PCR buffer等により異なるの
で、前記の濃度に限定されるものではない。

【００４０】実施例15混合型DNAポリメラーゼを用いたPCRにおけるKOD-PCNAタ
ンパク質とKOD-RFC複合体共存の効果実施例12と同じ標的DNA、反応系にて、２種のDNAポリメ
ラーゼを混合して使用するPCRにおける、KOD-PCNAタン
パク質とKOD-RFC複合体共存の効果を調べた。鋳型とな
るヒト培養細胞K562由来のGenomic DNA 1ngを用い、混
合型のDNAポリメラーゼとしてはKODの3'-5'エキソヌク
レアーゼ活性を欠失したKOD(exo-) DNAポリメラーゼとK
OD DNAポリメラーゼを混合したKOD Dash DNAポリメラー
ゼを使用した。図16で明らかなようにPCNA,RFC無添加の
場合、スメアの中に微かに標的DNAの増幅が認められ
た。一方、PCNA添加により標的DNAの増幅が若干鮮明と
なり、更にRFCを添加することにより鮮明な標的DNAの増
幅が認められた。なお、添加効果が見られるKOD-PCNAタ
ンパク質とKOD-RFC複合体の使用量比は、使用酵素、標
的DNA、PCR buffer等により異なるので、前記の濃度に
限定されるものではない。

【００４１】

【発明の効果】上述したように、本発明により、DNAポ
リメラーゼの有するDNA合成活性を高めるDNAポリメラー
ゼ関連因子の大量取得が可能となった。また、該因子の
促進効果は、単純なDNA合成反応だけでなく、PCR法にお
いでも有効であり、各々のDNAポリメラーゼで限界と思
われていたPCRパフォーマンスを超えて、今まで不可能
であったPCRを可能にした。

【００４２】

【配列表】 <110> Toyo Boseki Kabushiki Kaisya <120> DNA POLYMERASE-RELATED FACTORS <130> 01-0434 <141> 2001-06-11 <160> 37 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 774 <212> PRT <213> Thermococcus kodakaraensis KOD1 <223> KOD DNA polymerase <400> 1 Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile 1 5 10 15 Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg 20 25 30 Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile 35 40 45 Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Val Val Thr 50 55 60 Val Lys Arg Val Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val 65 70 75 80 Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile 85 90 95 Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr 100 105 110 Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro 115 120 125 Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr 130 135 140 Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Asn Val 165 170 175 Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Arg Glu Met Ile Lys 180 185 190 Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr 195 200 205 Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu 210 215 220 Lys Leu Gly Ile Asn Phe Ala Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile 245 250 255 His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr 260 265 270 Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Gln Pro Lys Glu 275 280 285 Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Thr Thr Ala Trp Glu Thr Gly Glu Asn 290 295 300 Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr 305 310 315 320 Glu Leu Gly Lys Glu Phe Leu Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu 325 330 335 Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350 Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala 355 360 365 Pro Asn Lys Pro Asp Glu Lys Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Ser Tyr 370 375 380 Glu Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile 385 390 395 400 Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His 405 410 415 Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp 420 425 430 Val Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe 435 440 445 Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys 450 455 460 Lys Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp 465 470 475 480 Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr 485 490 495 Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser 500 505 510 Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Lys Glu Ile 515 520 525 Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Ile Tyr Ser Asp Thr Asp Gly Phe 530 535 540 Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala 545 550 555 560 Met Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu 565 570 575 Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys 580 585 590 Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu 595 600 605 Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala 610 615 620 Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asp Val Glu Lys Ala Val 625 630 635 640 Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro 645 650 655 Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Lys Asp 660 665 670 Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala 675 680 685 Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu 690 695 700 Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe 705 710 715 720 Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln 725 730 735 Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys 740 745 750 Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Ser Ala Trp 755 760 765 Leu Lys Pro Lys Gly Thr 770

【００４３】 <210> 2 <211> 249 <212> PRT <213> Thermococcus kodakaraensis KOD1 <223> KOD-PCNA <400> 2 Met Pro Phe Glu Val Val Phe Asp Gly Ala Lys Glu Phe Ala Asp Leu 1 5 10 15 Ile Ala Thr Ala Ser Asn Leu Ile Asp Glu Ala Ala Phe Lys Phe Thr 20 25 30 Glu Glu Gly Ile Ser Met Arg Ala Met Asp Pro Ser Arg Val Val Leu 35 40 45 Ile Asp Leu Asn Leu Pro Glu Ser Ile Phe Ser Lys Tyr Glu Val Glu 50 55 60 Glu Pro Glu Thr Ile Gly Ile Asn Met Asp Gln Phe Lys Lys Ile Leu 65 70 75 80 Lys Arg Gly Lys Ala Lys Asp Thr Leu Ile Leu Arg Lys Gly Asp Glu 85 90 95 Asn Phe Leu Glu Ile Thr Phe Glu Gly Thr Ala Lys Arg Thr Phe Arg 100 105 110 Leu Pro Leu Ile Asp Val Glu Glu Leu Glu Leu Glu Leu Pro Glu Leu 115 120 125 Pro Phe Thr Ala Lys Val Val Leu Leu Gly Glu Val Leu Lys Glu Gly 130 135 140 Ile Lys Asp Ala Ser Leu Val Ser Asp Ala Ile Lys Phe Ile Ala Lys 145 150 155 160 Glu Asn Glu Phe Thr Met Lys Ala Glu Gly Glu Thr Asn Glu Val Glu 165 170 175 Ile Arg Leu Thr Leu Glu Asp Glu Gly Leu Leu Asp Leu Glu Val Glu 180 185 190 Glu Glu Thr Lys Ser Ala Tyr Gly Ile Ser Tyr Leu Ser Asp Met Val 195 200 205 Lys Gly Ile Gly Lys Ala Asp Glu Val Ile Leu Arg Phe Gly Asn Glu 210 215 220 Met Pro Leu Gln Met Glu Tyr Met Ile Arg Asp Glu Gly Arg Leu Thr 225 230 235 240 Phe Leu Leu Ala Pro Arg Val Glu Glu 245

【００４４】 <210> 3 <211> 750 <212> DNA <213> Thermococcus kodakaraensis KOD1 <223> KOD-PCNA <400> 3 atgccgttcg aagttgtttt tgacggggcc aaggagtttg cagacctgat agcgaccgca 60 agcaacctca tcgacgaggc cgcctttaag ttcactgagg aaggcataag catgcgcgca 1 20 atggacccga gcagggtcgt tctcattgac ctcaacctgc ccgaaagcat cttctccaag 1 80 tacgaggtcg aagagcccga gacaatcggc atcaacatgg accagttcaa gaaaatcctc 2 40 aagcgcggca aggcgaaaga caccctcata ctcaggaagg gcgacgagaa cttccttgag 3 00 ataacttttg agggaaccgc caagaggaca ttcaggctcc ctctgataga tgtggaagag 3 60 cttgagctgg agcttcccga gctcccgttc acggctaagg tagtcctcct cggtgaggtt 4 20 ctcaaggagg gcataaagga cgcttccctc gtcagcgacg ccatcaagtt catagcaaag 4 80 gagaacgagt tcacaatgaa ggccgagggc gagaccaacg aggtcgagat aaggcttacc 5 40 cttgaggacg agggccttct cgaccttgaa gtcgaggaag agaccaagag tgcctacggc 6 00 ataagctacc tcagcgacat ggtcaagggc atcgggaagg ccgacgaagt tatcctccgc 6 60 ttcggcaacg agatgccgct ccagatggag tacatgatca gagacgaggg cagactgacc 7 20 ttcctgctcg ctccgcgcgt tgaggagtga 75 0

【００４５】 <210> 4 <211> 326 <212> PRT <223> KOD-RFCS <213> Thermococcus kodakaraensis KOD1 <400> 4 Met Ser Glu Glu Val Lys Glu Val Lys Ile Leu Glu Lys Pro Trp Val 1 5 10 15 Glu Lys Tyr Arg Pro Gln Arg Leu Glu Asp Ile Val Gly Gln Asp His 20 25 30 Ile Val Lys Arg Leu Lys His Tyr Val Lys Thr Gly Ser Met Pro His 35 40 45 Leu Leu Phe Ala Gly Pro Pro Gly Val Gly Lys Thr Thr Ala Ala Leu 50 55 60 Ala Leu Ala Arg Glu Leu Phe Gly Glu Asn Trp Arg His Asn Phe Leu 65 70 75 80 Glu Leu Asn Ala Ser Asp Glu Arg Gly Ile Asn Val Ile Arg Glu Lys 85 90 95 Val Lys Glu Phe Ala Arg Thr Lys Pro Ile Gly Gly Ala Ser Phe Lys 100 105 110 Ile Ile Phe Leu Asp Glu Ala Asp Ala Leu Thr Gln Asp Ala Gln Gln 115 120 125 Ala Leu Arg Arg Thr Met Glu Met Phe Ser Asn Asn Val Arg Phe Ile 130 135 140 Leu Ser Cys Asn Tyr Ser Ser Lys Ile Ile Glu Pro Ile Gln Ser Arg 145 150 155 160 Cys Ala Ile Phe Arg Phe Arg Pro Leu Arg Asp Glu Asp Ile Ala Lys 165 170 175 Arg Ile Arg Tyr Ile Ala Glu Asn Glu Gly Leu Glu Leu Thr Glu Glu 180 185 190 Gly Leu Gln Ala Ile Leu Tyr Val Ala Glu Gly Asp Leu Arg Arg Ala 195 200 205 Ile Asn Val Leu Gln Ala Ala Ala Ala Leu Asp Thr Lys Ile Thr Asp 210 215 220 Glu Asn Val Phe Leu Val Ala Ser Arg Ala Arg Pro Glu Asp Val Arg 225 230 235 240 Glu Met Met Thr Leu Ala Leu Glu Gly Asn Phe Leu Lys Ala Arg Glu 245 250 255 Lys Leu Arg Asp Ile Leu Leu Arg Gln Gly Leu Ser Gly Glu Asp Val 260 265 270 Leu Ile Gln Met His Lys Glu Val Phe Asn Leu Pro Ile Pro Glu Asp 275 280 285 Lys Lys Val Ala Leu Ala Asp Lys Ile Gly Glu Tyr Asn Phe Arg Leu 290 295 300 Val Glu Gly Ala Asn Glu Met Ile Gln Leu Glu Ala Leu Leu Ala Gln 305 310 315 320 Phe Thr Ile Met Gly Lys 325

【００４６】 <210> 5 <211> 981 <212> DNA <213> Thermococcus kodakaraensis KOD1 <223> KOD-RFCS <400> 5 atgtccgagg aagtgaagga agttaaaatt ctcgaaaagc cgtgggtcga gaagtacaga 60 ccccagaggc tcgaggacat agtaggtcag gatcacatag tcaagaggct gaagcactac 12 0 gttaaaaccg gctcgatgcc gcaccttcta ttcgcagggc cacccggcgt cgggaagaca 1 80 accgctgcac tggctttagc tagagaactc ttcggtgaga actggaggca caacttccta 2 40 gagctgaacg cgagcgatga gaggggtata aacgtcatcc gtgaaaaggt aaaggagttc 3 00 gcgaggacga agccgatagg cggtgcgagc tttaagataa tcttccttga tgaggcagat 3 60 gccctcacac aggacgctca gcaggccctc agaaggacga tggagatgtt ctcgaacaac 4 20 gtccgcttta tcctgagctg taactactcc tcaaagatca tcgaacccat acagtcgagg 4 80 tgtgccatct tccgcttcag accgctccgc gatgaggaca tagcgaagcg catcaggtac 5 40 atagccgaaa atgagggtct cgagctcacc gaggaaggcc tgcaggcgat actctacgtc 6 00 gctgagggcg atctcaggag ggcaatcaac gtccttcagg cggcagcagc cctcgacacg 6 60 aagataaccg acgagaacgt cttcctcgtg gccagcaggg cgaggcctga agacgtacgt 7 20 gaaatgatga cccttgctct ggaaggcaac ttcctgaagg ccagagagaa gctgagggat 7 80 atcctgttaa ggcagggcct cagcggtgaa gatgtcctca tccagatgca caaggaggtc 8 40 ttcaacctcc cgattcccga ggacaagaag gtggccctgg cggacaagat aggagagtac 9 00 aacttccgcc tggttgaagg ggctaacgag atgatacagc tcgaggcact ccttgcccag 9 60 ttcacgatta tgggtaagtg a 98 1

【００４７】 <210> 6 <211> 499 <212> PRT <213> Thermococcus kodakaraensis KOD1 <223> KOD-RFCL <400> 6 Met Thr Glu Val Pro Trp Val Glu Lys Tyr Arg Pro Arg Lys Leu Ser 1 5 10 15 Glu Ile Val Asn Gln Glu Lys Ala Leu Glu Gln Val Arg Ala Trp Val 20 25 30 Glu Ala Trp Leu His Gly Asn Pro Pro Lys Lys Lys Ala Leu Leu Leu 35 40 45 Ala Gly Pro Pro Gly Val Gly Lys Thr Thr Thr Val Tyr Ala Leu Ala 50 55 60 Asn Glu Tyr Gly Phe Glu Val Ile Glu Leu Asn Ala Ser Asp Glu Arg 65 70 75 80 Thr Tyr Glu Lys Ile Glu Arg Tyr Val Gln Ala Ala Tyr Thr Met Asp 85 90 95 Ile Leu Gly Lys Arg Arg Lys Leu Ile Phe Leu Asp Glu Ala Asp Asn 100 105 110 Ile Glu Pro Ser Gly Ala Arg Glu Ile Ala Lys Leu Ile Asp Lys Ala 115 120 125 Arg Asn Pro Ile Ile Met Ser Ala Asn His Tyr Trp Glu Val Pro Arg 130 135 140 Glu Ile Arg Asn Lys Ala Gln Ile Val Glu Tyr Lys Arg Leu Thr Gln 145 150 155 160 Arg Asp Ile Ile Lys Ala Leu Val Arg Ile Leu Lys Arg Glu Gly Leu 165 170 175 Glu Val Pro Lys Glu Val Leu Tyr Glu Ile Ala Lys Arg Ala Asn Gly 180 185 190 Asp Leu Arg Ala Ala Val Asn Asp Leu Gln Thr Val Val Thr Gly Gly 195 200 205 Val Glu Asp Ala Val Glu Val Leu Ala Tyr Arg Asp Thr Glu Lys Ser 210 215 220 Val Phe Gln Ala Leu Ala Gln Leu Phe Ala Thr Asp Asn Ala Lys Arg 225 230 235 240 Ala Lys Leu Ala Val Leu Gly Val Asp Met Met Pro Asn Glu Leu Leu 245 250 255 Gln Trp Ile Asp Glu Asn Val Pro Tyr Val Tyr Tyr Arg Pro Glu Asp 260 265 270 Ile Ala Arg Ala Tyr Glu Ala Leu Ser Arg Ala Asp Ile Tyr Leu Gly 275 280 285 Arg Ala Gln Arg Thr Gly Asn Tyr Gly Leu Trp Lys Tyr Ala Thr Asp 290 295 300 Met Met Thr Ala Gly Val Ala Val Ala Gly Ile Lys Lys Lys Gly Phe 305 310 315 320 Val Lys Ile Tyr Pro Pro Lys Thr Ile Lys Leu Leu Thr Glu Ser Lys 325 330 335 Glu Glu Arg Ser Leu Arg Asp Ser Val Ile Lys Lys Ile Met Ser Glu 340 345 350 Met His Met Ala Lys Leu Glu Ala Ile Glu Thr Leu Arg Tyr Leu Arg 355 360 365 Val Ile Phe Glu Asn Asn Pro Asp Leu Ala Ala His Phe Val Val Phe 370 375 380 Leu Asp Leu Ser Glu Lys Glu Val Glu Phe Ile Thr Gly Asp Lys Glu 385 390 395 400 Lys Ala Lys Thr Ile Trp Ala Lys Ser Met Asn Ile Glu Lys Lys Leu 405 410 415 Lys Lys Glu Gly Glu Leu Glu Ala Arg Ala Lys Glu Ala Glu Arg Arg 420 425 430 Val Glu Ala Ala Glu Glu Glu Glu Thr Met Glu Ala Gly Glu Pro Glu 435 440 445 Glu Glu Leu Glu Glu Val Glu Glu Glu Glu Leu Thr Glu Glu Glu Leu 450 455 460 Glu Glu Ala Glu Glu Glu Ile Glu Thr Val Gly Lys Lys Glu Lys Pro 465 470 475 480 Glu Lys Glu Lys Thr Lys Lys Gly Lys Gln Ala Thr Leu Phe Asp Phe 485 490 495 Leu Lys Lys

【００４８】 <210> 7 <211> 1500 <212> DNA <213> Thermococcus kodakaraensis KOD1 <223> KOD-RFCL <400> 7 atgacggaag tcccatgggt tgaaaaatac agacctagga agctcagcga gatagtaaac 60 caggagaaag cgttagagca ggttagggcg tgggtcgaag cctggctcca cggaaatccg 1 20 ccgaagaaga aggccctcct tctagcaggc ccccctggag tcggcaaaac gaccaccgtc 1 80 tatgccctgg ccaacgagta cggcttcgag gtcatcgagc tcaacgcaag cgacgagagg 2 40 acgtatgaaa agatagagcg ctacgttcaa gctgcataca ctatggatat tctcggaaag 3 00 aggaggaagc tgatattcct tgacgaggct gacaacatcg agccctctgg ggcgagggag 3 60 atagcgaagc tcatcgacaa ggccagaaac ccgataataa tgagcgccaa ccactactgg 4 20 gaggttccca gggagatacg caacaaagcc cagatagtcg agtacaagag gttgacgcag 4 80 agggacatca taaaggccct cgtgagaatc ctcaagcgtg agggactcga agttcccaag 5 40 gaggttctct acgagatagc gaagagggct aacggcgacc tgagggcagc tgtaaacgat 6 00 cttcagaccg ttgttaccgg tggagtcgag gatgccgttg aagtcctggc ttaccgcgac 6 60 actgagaaga gcgttttcca ggcgcttgcc cagctgttcg caacggacaa cgccaagagg 7 20 gcaaagttag ctgttcttgg agttgacatg atgcctaacg agcttctcca gtggatagac 7 80 gagaacgtcc cgtatgtcta ctacaggcct gaagacatag cgagggccta cgaggcgctc 8 40 agcagggctg acatatacct cggtagggca cagaggactg gaaactacgg cctctggaag 9 00 tacgcgaccg acatgatgac ggctggggtg gcggtcgctg gcatcaagaa gaagggcttc 9 60 gttaagatct acccacctaa gacgataaag ctcctcaccg agagcaagga ggagcgttcg 10 20 ctcagggact cagtaatcaa gaagataatg agcgagatgc acatggctaa gcttgaggcc 10 80 atagagaccc tccgctacct tagagttatc ttcgagaaca accccgattt ggcggcccac 11 40 tttgtcgttt tcctcgacct cagcgagaag gaagttgagt tcataactgg agacaaggag 12 00 aaggcgaaga cgatatgggc aaagagcatg aacattgaga agaaactcaa aaaagaaggc 12 60 gagcttgagg cgagagcaaa ggaagccgaa agaagggtgg aagcggctga ggaagaggaa 13 20 actatggaag ctggggaacc tgaagaagaa cttgaagaag tcgaggagga agagttaacc 13 80 gaggaggagc ttgaggaagc ggaggaagag atagagaccg ttgggaagaa ggagaagccc 14 40 gagaaggaga aaaccaagaa gggcaagcag gcgacgctgt tcgacttcct caagaagtga 15 00

【００４９】 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.1 <400> 8 cggaattcat gmgsgcyatg gayccvagya grgt 34

【００５０】 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.1 <400> 9 gctctagata stccatytgs aksggcatyt c 31

【００５１】 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.1 <400> 10 gagctcaacg csagygatga gag 23

【００５２】 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.1 <400> 11 tcyctbgcct ccatgaastt acc 23

【００５３】 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.1 <400> 12 cggaattcga gctcaacgcs agygatgaga g 31

【００５４】 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.1 <400> 13 gctctagact skagcytact catgtgcatc tc 32

【００５５】 <210> 14 <211> 581 <212> DNA <213> Thermococcus kodakaraensis KOD1 <223> KOD-PCNA fragment, described in example No.1 <400> 14 atgcgggcta tggatccgag tagggtcgtt ctcattgacc tcaacctgcc cgaaagcatc 60 ttctccaagt acgaggtcga agagcccgag acaatcggca tcaacatgga ccagttcaag 1 20 aaaatcctca agcgcggcaa ggcgaaagac accctcatac tcaggaaggg cgacgagaac 1 80 ttccttgaga taacttttga gggaaccgcc aagaggacat tcaggctccc tctgatagat 2 40 gtggaagagc ttgagctgga gcttcccgag ctcccgttca cggctaaggt agtcctcctc 3 00 ggtgaggttc tcaaggaggg cataaaggac gcttccctcg tcagcgacgc catcaagttc 3 60 atagcaaagg agaacgagtt cacaatgaag gccgagggcg agaccaacga ggtcgagata 4 20 aggcttaccc ttgaggacga gggccttctc gaccttgaag tcgaggaaga gaccaagagt 4 80 gcctacggca taagctacct cagcgacatg gtcaagggca tcgggaaggc cgacgaagtt 5 40 atcctccgct tcggcaacga aatgcccctc caaatggagt a 5 81

【００５６】 <210> 15 <211> 526 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> KOD-RFCS fragment, described in example No.1 <400> 15 gagctcaacg cagagatgag aggggtataa acgtcatccg tgaaaaggta aaggagttcg 60 cgaggacgaa gccgataggc ggtgcgagct ttaagataat cttccttgat gaggcagatg 1 20 ccctcacaca ggacgctcag caggccctca gaaggacgat ggagatgttc tcgaacaacg 1 80 tccgctttat cctgagctgt aactactcct caaagatcat cgaacccata cagtcgaggt 2 40 gtgccatctt ccgcttcaga ccgctccgcg atgaggacat agcgaagcgc atcaggtaca 3 00 tagccgaaaa tgagggtctc gagctcaccg aggaaggcct gcaggcgata ctctacgtcg 3 60 ctgagggcga tctcaggagg gcaatcaacg tccttcaggc ggcagcagcc ctcgacacga 4 20 agataaccga cgagaacgtc ttcctcgtgg ccagcagggc gaggcctgaa gacgtacgtg 4 80 aaatgatgac ccttgctctg gaaggtaact tcatggaggc caggga 5 26

【００５７】 <210> 16 <211> 860 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> KOD-RFCL fragment, described in example No.1 <400> 16 gagctcaacg cagagatgag aggacgtatg aaaagataga gcgctacgtt caagctgcat 60 acactatgga tattctcgga aagaggagga agctgatatt ccttgacgag gctgacaaca 1 20 tcgagccctc tggggcgagg gagatagcga agctcatcga caaggccaga aacccgataa 1 80 taatgagcgc caaccactac tgggaggttc ccagggagat acgcaacaaa gcccagatag 2 40 tcgagtacaa gaggttgacg cagagggaca tcataaaggc cctcgtgaga atcctcaagc 3 00 gtgagggact cgaagttccc aaggaggttc tctacgagat agcgaagagg gctaacggcg 3 60 acctgagggc agctgtaaac gatcttcaga ccgttgttac cggtggagtc gaggatgccg 4 20 ttgaagtcct ggcttaccgc gacactgaga agagcgtttt ccaggcgctt gcccagctgt 4 80 tcgcaacgga caacgccaag agggcaaagt tagctgttct tggagttgac atgatgccta 5 40 acgagcttct ccagtggata gacgagaacg tcccgtatgt ctactacagg cctgaagaca 6 00 tagcgagggc ctacgaggcg ctcagcaggg ctgacatata cctcggtagg gcacagagga 6 60 ctggaaacta cggcctctgg aagtacgcga ccgacatgat gacggctggg gtggcggtcg 7 20 ctggcatcaa gaagaagggc ttcgttaaga tctacccacc taagacgata aagctcctca 7 80 ccgagagcaa ggaggagcgt tcgctcaggg actcagtaat caagaagata atgagcgaga 8 40 tgcacatgag taagctccag 860

【００５８】 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.2 <400> 17 actgcgcaac tcgtgaaagg tagg 24

【００５９】 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.2 <400> 18 tgccgagaat aacgagtgga tctg 24

【００６０】 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.2 <400> 19 gacatggtca agggcatcgg gaag 24

【００６１】 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.2 <400> 20 cgcttgagga ttttcttgaa ctgg 24

【００６２】 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.2 <400> 21 cgcttgagga ttttcttgaa ctgg 23

【００６３】 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.2 <400> 22 tctgcctcat caaggaagat tatc 24

【００６４】 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.2 <400> 23 ttcgttaaga tctacccacc taag 24

【００６５】 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.2 <400> 24 ttgtcagcct cgtcaaggaa tatc 24

【００６６】 <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.3,5 <400> 25 ggaattccat atgtccgagg aagtgaagga ag 32

【００６７】 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.3 <400> 26 cagcggttgt cttcccgacg ccgggtggc 29

【００６８】 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.3 <400> 27 cgtcgggaag acaaccgctg cactggcttt ag 32

【００６９】 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.3,5 <400> 28 gctctagatc acttacccat aatcgtgaac 30

【００７０】 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.4 <400> 29 ggaattccat atgccgttcg aagttgtttt 30

【００７１】 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.4 <400> 30 gctctagatc actcctcaac gcgcggagcg 30

【００７２】 <210> 31 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.4 <400> 31 ggaattccat atgacggaag tcccatgggt tg 32

【００７３】 <210> 32 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.4 <400> 32 gctctagatc acttcttgag gaagtcgaac ag 32

【００７４】 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.5 <400> 33 taatacgact cactatagg 19

【００７５】 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.5 <400> 34 gactagtcac ttcttgagga agtcgaacag 30

【００７６】 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide, described in example No.9 <400> 35 cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

【００７７】 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.11 <400> 36 ggtgttccct tgatgtagca ca 22

【００７８】 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.11 <400> 37 acatgtattt gcatggaaaa caactc 26

【図面の簡単な説明】

【図1】Thermococcus kodakaraensis KOD1由来DNAポリ
メラーゼ関連因子の遺伝子のクローニング手順の要約で
ある。

【図2】KOD-RFCS、KOD-RFCL遺伝子の構造を示す模式図
である。

【図3】KOD-RFCSとMethanobacterium thermoautotropic
umのRFCSのアミノ酸配列の比較を示す図である。

【図4】matureRFCS発現ベクターの構築手順の要約であ
る。

【図5】PCNA発現ベクターの構造を示す模式図である。

【図6】mRFCS、RFCL発現ベクターの構造を示す模式図で
ある。

【図7】mRFCS-RFCL共発現ベクターの構造を示す模式図
である。

【図8】KOD-PCNAの精製フローと該精製標品のSDS-PAGE
電気泳動の写真の代用図面である。

【図9】KOD-RFC複合体の精製フローと該精製標品のSDS-
PAGE電気泳動の写真の代用図面である。

【図10】HPLCを用いたPCNA,RFCの分子量分析で得られた
チャート図である。なお、それぞれのピークについて
は、それに相当する部分を分取し、SDS-PAGEによる泳動
パターン分析から、それぞれRFC複合体、PCNAに相当す
ることを確認している。

【図11】DNAポリメラーゼ反応系にKOD-PCNAを添加した
場合のDNA合成活性に及ぼす影響を示す電気泳動写真の
代用図面である。

【図12】DNAポリメラーゼ反応系にKOD-PCNA、KOD-RFC複
合体を添加した場合のDNA合成活性に及ぼす影響を示す
電気泳動写真の代用図面である。

【図13】KOD-PCNAを添加した場合のPCRの比較を示す電
気泳動写真の代用図面である。

【図14】KOD-RFC複合体を添加した場合のPCRの比較を示
す電気泳動写真の代用図面である。

【図15】KOD-PCNA、KOD-RFC複合体を添加した場合のPCR
の比較を示す電気泳動写真の代用図面である。

【図16】混合型DNAポリメラーゼを用いたPCRにおいてKO
D-PCNA、KOD-RFC複合体を添加した場合のPCRの比較を示
す電気泳動写真の代用図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者小松原秀介福井県敦賀市東洋町10番24号東洋紡績株式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者西矢芳昭福井県敦賀市東洋町10番24号東洋紡績株式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者岡正則福井県敦賀市東洋町10番24号東洋紡績株式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者川村良久福井県敦賀市東洋町10番24号東洋紡績株式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者今中忠行大阪府吹田市藤白台２―28−11 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA03 CA09 CA20 DA06 EA04 EA06 GA11 HA03 HA13 HA14 4B064 AG01 CA02 CA19 CC01 CC24 CD30 CE02 CE03 CE07 CE11 DA13 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA11 EA50 FA74 GA01 GA05 GA15 GA22 GA23

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】DNAポリメラーゼのDNA合成活性を促進する
Thermococcus sp.由来の耐熱性のDNAポリメラーゼ関連
因子。
【請求項２】DNAポリメラーゼのDNA合成活性を促進する
超好熱始原菌KOD1株由来の耐熱性のDNAポリメラーゼ関
連因子。
【請求項３】DNAポリメラーゼのDNA合成活性を促進する
Thermococcus kodakaraensis由来の耐熱性のDNAポリメ
ラーゼ関連因子。
【請求項４】DNAポリメラーゼが耐熱性である請求項１
〜３いずれか記載の耐熱性のDNAポリメラーゼ関連因
子。
【請求項５】Thermococcus sp.由来DNAポリメラーゼのD
NA合成活性を促進する請求項１〜３いずれか記載の耐熱
性のDNAポリメラーゼ関連因子。
【請求項６】超好熱始原菌KOD1株由来DNAポリメラーゼ
のDNA合成活性を促進する請求項１〜３いずれか記載の
耐熱性のDNAポリメラーゼ関連因子。
【請求項７】Thermococcus kodakaraensis由来DNAポリ
メラーゼのDNA合成活性を促進する請求項１〜３いずれ
か記載の耐熱性のDNAポリメラーゼ関連因子。
【請求項８】配列番号１に示されるアミノ酸配列を有す
るDNAポリメラーゼ構成タンパク質を含有するDNAポリメ
ラーゼのDNA合成活性を促進する耐熱性のDNAポリメラー
ゼ関連因子。
【請求項９】DNAポリメラーゼに結合する活性を有するT
hermococcus sp.由来の耐熱性のDNAポリメラーゼ関連因
子。
【請求項1０】DNAポリメラーゼに結合する活性を有する
超好熱始原菌KOD1株由来の耐熱性のDNAポリメラーゼ関
連因子。
【請求項１１】DNAポリメラーゼに結合する活性を有す
るThermococcus kodakaraensis由来の耐熱性のDNAポリ
メラーゼ関連因子。
【請求項１２】DNAポリメラーゼが耐熱性である請求項
９〜１１いずれか記載の耐熱性のDNAポリメラーゼ関連
因子。
【請求項１３】Thermococcus sp.由来DNAポリメラーゼ
に結合する活性を有する請求項９〜１１いずれか記載の
耐熱性のDNAポリメラーゼ関連因子。
【請求項１４】超好熱始原菌KOD1株由来DNAポリメラー
ゼに結合する活性を有する請求項９〜１１いずれか記載
の耐熱性のDNAポリメラーゼ関連因子。
【請求項１５】Thermococcus kodakaraensis由来DNAポ
リメラーゼに結合する活性を有する請求項９〜１１いず
れか記載の耐熱性のDNAポリメラーゼ関連因子。
【請求項１６】配列番号１に示されるアミノ酸配列を有
するDNAポリメラーゼ構成タンパク質を含有するDNAポリ
メラーゼに結合する活性を有する耐熱性のDNAポリメラ
ーゼ関連因子。
【請求項1７】配列表の配列番号：２，４，6からなる群
より選択されたアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列に
おいて、１個以上のアミノ酸が置換、欠失、付加若しく
は挿入されたアミノ酸配列を含有してなる請求項１〜1
６いずれか記載のDNAポリメラーゼ関連因子。
【請求項１８】配列表の配列番号：２，４，6からなる
群より選択されたアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列
において、１個以上のアミノ酸が置換、欠失、付加若し
くは挿入されたアミノ酸配列を含有し、DNAポリメラー
ゼの有するDNA合成活性を促進する活性を有するDNAポリ
メラーゼ関連因子をコードする遺伝子。
【請求項１９】配列表の配列番号：３，５，７からなる
群より選択された塩基配列、又は該塩基配列において、
１個以上の塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入された
塩基配列を含有してなる請求項１８記載の遺伝子。
【請求項２０】請求項１８又は１９記載の遺伝子とハイ
ブリダイズし、かつDNAポリメラーゼの有するDNA合成活
性を促進する活性を有するDNAポリメラーゼ関連因子を
コードする遺伝子。
【請求項２１】請求項１８〜２０いずれか記載の遺伝子
を含有させた形質転換体を培養し、該培養物からDNAポ
リメラーゼの有するDNA合成活性を促進する耐熱性のDNA
ポリメラーゼ関連因子を採取する工程を含むことを特徴
とする、DNAポリメラーゼ関連因子の製造方法。
【請求項２２】請求項１〜１７いずれか記載のDNAポリ
メラーゼ関連因子の存在下にDNAを合成することを特徴
とする、DNAポリメラーゼを使用するDNAの合成方法。
【請求項２３】２種以上のDNAポリメラーゼ関連因子の
存在下でDNAを合成する請求項２２記載のDNAの合成方
法。
【請求項２４】DNAポリメラーゼ関連因子として、KOD-P
CNA (Proliferating cell nuclear antigen)、KOD-RFCS
(replication factor C small subunit) 、KOD-RFCL(re
plication factor C large subunit)の存在下にDNAの合
成を行う請求項２３記載のDNAの合成方法。
【請求項２５】DNAポリメラーゼが、耐熱性DNAポリメラ
ーゼである請求項２２〜２４いずれか記載のDNA合成方
法。
【請求項２６】PCR法により実施される請求項２５記載
のDNA合成方法。
【請求項２７】試験管内DNA合成に使用されるキットで
あって、請求項１〜１７いずれかに記載のDNAポリメラ
ーゼ関連因子及びDNAポリメラーゼを含有してなるキッ
ト。
【請求項２８】さらにDNA合成反応に必要な試薬を含有
してなる請求項２７記載のキット。
【請求項２９】２種以上のDNAポリメラーゼ関連因子を
含有してなる請求項２７および２８記載のキット。
【請求項３０】DNAポリメラーゼ関連因子として、KOD-P
CNA(Proliferating cellnuclear antigen)、KOD-RFCS(r
eplication factor C small subunit) 、KOD-RFCL(repl
ication factor C large subunit)を含有してなる請求
項２７および２８記載のキット。
【請求項３１】DNAポリメラーゼとして、耐熱性DNAポリ
メラーゼを含有してなる請求項２７〜３０いずれか記載
のキット。