JP2000508538A

JP2000508538A - バシラスステアロテルモフィルスｄｎａポリメラーゼの生物学的に活性な断片

Info

Publication number: JP2000508538A
Application number: JP9537306A
Authority: JP
Inventors: スワミネーザン，ネーラ; ウィルコズ，リチャード，ケー．
Original assignee: モレキュラーバイオロジーリソーシーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-04-17
Filing date: 1997-04-16
Publication date: 2000-07-11
Also published as: AU2802197A; CA2251588A1; WO1997039113A1; EP0928331A1; AU735177B2; US5830714A

Abstract

(57)【要約】本願発明は、バシラスステアロテルモフィルスが保有する耐熱性を備えた全長のＤＮＡポリメラーゼＩ酵素での生物学的に活性な断片をコードする、単離および精製されたＤＮＡに関する。具体的には、本願発明は、約96,000ダルトンのバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩのＮ−末端の273個のアミノ酸を欠いている約66,000ダルトンのＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ、およびバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩ exo-断片と命名された該ＤＮＡによってコードされたタンパク質に関する。これら酵素断片は、ＤＮＡ配列決定、ｃＤＮＡの生産、好熱的ストランド置換増幅や、他の分子生物学的技術において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】バシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼの生物学的に活性な断片発明の背景Ａ．発明の分野本発明は、耐熱性組換えタンパク質断片、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ活性、3'-5'エキソヌクレアーゼ（校正）活性、逆転写酵素活性を有し、かつ5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている耐熱性組換えタンパク質断片に関する。本発明の耐熱性組換えポリペプチドは、ｃＤＮＡの生産、ストランド置換増幅や、ＤＮＡの配列決定などのバイオ技術において、向上したポリメラーゼ活性を呈することができるので有用である。Ｂ．背景バイオテクノロジーの分野は、組換えＤＮＡ技術によって変革を遂げ、そして、in vitro組換えＤＮＡの生物学的応用、例えば、ＤＮＡの配列決定；ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および多くのその変更法（例えば、Erlich et al.，Curren t Communications in Molecular Biology: Polymerase Chain Reaction．コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州(1989)；Innis et al.，PCR protocols:A guide to metho ds and applications，アカデミックプレス、サンディエゴ、カリフォルニア州( 1990)を参照されたい）；熱サイクル標識(TCL)（MeadとSwaminathan，1994年３月24日に出願された米国特許出願No．08/217,459；1994年３月24日に出願されたPCT出願No．US94/03246）；ランダムプライマー標識(RPL)；リガーゼ連鎖反応(LCR)(Wiedmann et al.，PCR Me thods and Applications 3:S51-S64(1994));ストランド置換増幅("SDA")(Walker ，T.G．Emperical Aspects of Strand Displacement Amplification,Becton Dic kenson Research Center）コールドスプリングハーバーラボラトリープレス(1993))や他の技術において、ＤＮＡポリメラーゼ酵素は不可欠な手段となっている。今日までに、研究者たちは、40種以上の多様なＤＮＡポリメラーゼを報告している。アミノ酸配列を比較することで、報告されたポリメラーゼ遺伝子は、４つの主要なファミリー、すなわち、Ａ、Ｂ、ＣおよびＸのファミリーに分類されている。ファミリーＡには、ＤＮＡの修復と、急速な成長過程での複製に関与する酵素である、E．coli ＤＮＡポリメラーゼＩを含む。ファミリーＢは、E．coli ＤＮＡポリメラーゼIIを含む。ファミリーＣは、主要な複製酵素である、E．col i ＤＮＡポリメラーゼIIIを含む。第四のグループである、ファミリーＸは、真核ＤＮＡポリメラーゼβおよび真核末端転移酵素（ItoとBraithwaite，Nucleic Acids Res．19:4045-4057(1991))のような酵素を含む。ＤＮＡポリメラーゼＩ(polI)(ファミリーＡ)酵素は、ＤＮＡの配列決定、PCR 、SDA、および当該技術分野で周知の他の技術への応用において非常に有用であることが実証されている。構造と機能の関連性に関する研究において、公知のＤＮＡ polＩ分子が、同様のモジュール組織を共有していることが指摘されている。5'-3'エキソヌクレアーゼ機能は、この酵素のＮ−末端の1/3の位置にある。この分子の残りの部分は、機能性サブドメインにさらに分類されるドメインを形成する。5'-3' エキソヌクレアーゼドメインに近接して、3'-5'エキソヌクレアーゼサブドメインが位置し、ポリメラーゼサブドメインがこれに続く(Blanco et al.，Gene 100 :27-38(1991))。上記したファミリーにＤＮＡポリメラーゼ酵素を分類することに加えて、これらポリメラーゼを、（常温性生物から単離した）常温性酵素、あるいは（好熱性生物から単離した）好熱性酵素に分類することも有用である。(例えば、Bessman et al.，J．Biol．Chem．233:171-177(1958);ButtinとKornberg，J．Biol．Che m．241:5419-5427(1966); Uemori et al.，Nucleic Acids Res．21:259-265(199 3);Lawyer et al.，J．Biol．Chem．264:6427-6437(1989);およびKaledin et al .，Biokhimiya 415:644-651(1980)を参照のこと)。常温性由来のＤＮＡポリメラーゼは、特定のＤＮＡの配列決定を含めた多くの生物学的技術への利用において有用である。しかしながら、重要な技術の多くが、鋳型ＤＮＡおよび／またはＲＮＡとこれらの伸長産物を繰り返し変性させるための熱サイクルを必要としている。常温性ＤＮＡポリメラーゼは、これら技術で用いられる高い温度条件や熱サイクルに耐えられないので、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、これら技術においては、常温性ＤＮＡポリメラーゼよりも有利に機能を発揮できる。ＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子の5'端側の1/3の削除、あるいはそれによってコードされたホロ酵素の部分をタンパク質分解して開裂し、次いで除去することで、研究者らはこれまでに、重合活性を保持しているが、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性が小さくなったＤＮＡ polI断片を調製してきた。(例えば、JoyceとGrind ley，Proc．Natl．Acad．Sci．80:1830-1834(1983)（E．coli ＤＮＡポリメラーゼ酵素のクレノウ断片）；Lawyer et al.，J Biol．Chem．264:6427-6437(1989) ； Gelfand et al.，米国特許第5,079,352（1992）;Lawyer et al.，PCR Methods a nd Applications 2:275-287(1993)(T.aquaticus(Taq)ＤＮＡポリメラーゼ酵素のストフェル(Stoffel)断片）；および、Banes，Gene 112:29-35(1992)(KlenTaq ＤＮＡポリメラーゼ)を参照のこと)。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとそれらの誘導体に関する他の報告は、ＤＮＡポリメラーゼが利用される生物学的技術によっては有利にも不都合にも機能する、別異の、予測し得ない特性を、これら酵素が保有することを示唆している（Myers とGelfand、Biochemistry 30:7661-7666(1991))。KlenTaq ＤＮＡポリメラーゼは、Taqホロ酵素とは異なる重要な特性を備えた酵素断片の一例である。KenTaq ＤＮＡポリメラーゼは、報告されたところでは、Taqポリメラーゼホロ酵素よりも約２倍低いPCR-誘導による相対変異率を有している。しかしながら、Taq ＤＮＡ polIを用いて生成したのと同様のPCR産物を得るためには、より多くの単位の KlenTaqがさらに必要となる。同様に、Lawyer et al．(1993)は、T．aquaticus ＤＮＡポリメラーゼＩの耐熱性は大きく、また、対応するホロ酵素よりも広範な Mg²⁺-値域にわたって活性を呈することを報告している。また、5'-3'エキソヌクレアーゼドメインを欠失しながらも、活性な3'-5'エキソヌクレアーゼ(校正)ドメインを保有しているUltma(登録商標)ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー社、ブランチバーグ、ニュージャージー州）にあっては、安定度の向上が認められることが報告されている。(Sninsky，GelfandおよびErdman．Amplifications ．パーキンエルマー社、1995)。上記の酵素断片の各々は、異なった有用な特性をもたらすものの、ポリメラーゼ酵素の断片が特定の特性を保有するかどうかは予測がつきかねる。しかしながら、当該技術分野にあっては、新規の分子生物学的技術に使用するための、新規の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素が待望されている。具体的には、高純度で、高いＤＮＡポリメラーゼ特異性、高い逆転写酵素活性、低レベルのエキソヌクレアーゼ活性を有し、そして、高い安定度（低い変異頻度）と良好な作用特性を備えた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素が待望されているのである。本発明の目的は、従前のものよりも、純度、収量および作用特性が改善された、ポリメラーゼ酵素調製物を提供することにある。さらに別の目的は、天然の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素の調製に伴う、高温下での大量の好熱性細菌の培養の必要性と軽費を解消することにある。さらに別の目的は、3'-5'エキソヌクレアーゼ（校正）活性と、現在市販されている酵素（Bcaポリメラーゼ、パンベラ、マジソン）の逆転写酵素活性よりも大きな逆転写酵素活性を有している組換えポリメラーゼを提供することにある。発明の要旨本発明は、多様な態様を有している。その最も単純な態様において、本発明は、所望のＤＮＡポリメラーゼ活性と3'-5'エキソヌクレアーゼ活性が保持および増強され、かつ不要なホロ酵素の5'-3'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に除去された、細菌のポリメラーゼ酵素（Bacillus stearothermophilus（バシラスステアロテルモフィルス）ＤＮＡポリメラーゼＩ）の耐熱性を備えた酵素的に活性な組換え断片に関する。本明細書で「rBst exo-」と称するこの組換えポリペプチド断片は、約66,000ダルトンの分子量を有し、また、配列番号:２の第264〜 876位のアミノ酸残基に対応する。予期せぬことに、rBst exo-は、顕著な逆転写活性、すなわち、逆転写酵素／ポリメラーゼの比率が１を超えることが知見されたのである。本発明の他の態様は、この組換えポリペプチド断片を調製する際に用いられる多様な中間体に関する。より具体的には、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するバシラスステアロテルモフィルスのＤＮＡポリメラーゼＩ酵素の耐熱性ポリぺプチド断片をコードする、単離および精製されたポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ配列、相補配列、およびそのＲＮＡ転写物）にも関する。好ましいＤＮＡとして、図2aに記載のヌクレオチド、配列番号：１の第316〜294 3位のヌクレオチド（ストップコドンを含まず）または配列番号：１の第316〜29 46位のヌクレオチド（ストップコドンを含む）、および、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する耐熱性ポリペプチドをコードするプラスミドpPEK(ATCC受託No.＃)の挿入体部分を含んだ、単離されたバシラスステアロテルモフィルス株10 ＤＮＡ poll遺伝子がある。配列番号：１の第316〜2946位のヌクレオチド（ストップコドンを含む）によってコードされるrBst poll（配列番号：２）も、本発明に包含される。Bst exo-断片(ストップコドンを含むものと含まないもの各々)をコードする(配列番号：１)の第1135〜2943位または第1135〜2946位のヌクレオチドを有する単離したＤＮＡまたはｃＤＮＡも、本発明に包含されるＤＮＡ分子である。本発明は、上記したＤＮＡ分子を含むプラスミド、例えば、pPEK5とpPRB5、そして、ＤＮＡベクターや本発明のプラスミドによって安定裏に形質転換された原核宿主細胞または真核宿主細胞のような宿主細胞にも関する。本発明の他の態様は、本発明のＤＮＡによってコードされた、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、耐熱性ポリペプチドを発現することができるように形質転換した宿主細胞に関する。他の態様にあっては、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する精製された耐熱性ポリペプチドを提供する。好ましいペプチドとして、5'-3'エンドヌクレアーゼ活性、または3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する他のバシラスステアロテルモフィルスのタンパク質を実質的に欠き、かつホロ酵素よりも小さな5'-3 'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている、バシラスステアロテルモフィルス exo- ＤＮＡポリメラーゼＩ断片がある。他の態様にあっては、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する耐熱性ポリペプチドを精製するための方法を提供するものであって、該方法は、本発明のＤＮＡで宿主細胞を形質転換して形質転換した宿主細胞を得；そのＤＮＡによってコードされた、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、耐熱性ポリペプチドの発現を促進する条件下で形質転換した該宿主細胞を培養し；および、耐熱性ポリペプチドを精製する工程を含む。好ましい方法によると、発現したポリペプチドを精製するために市販のクロマトグラフィ-カラムを使用する。他の態様にあっては、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ活性と3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を兼ね備え、かつ5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を欠いている組換え耐熱性ポリペプチドを得るための、本発明のＤＮＡ構築体の使用方法を提供する。かような方法の一例は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の活性断片を生成するためのＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードする、本明細書に記載したＤＮＡから選択した、ＤＮＡの使用に関するものであって、この方法は、制限エンドヌクレアーゼ開裂を介して修飾したＤＮＡを得るために該ＤＮＡの一部を削除し、ＤＮＡポリメラーゼ酵素断片を生成するために修飾したＤＮＡを発現し、このＤＮＡポリメラーゼ酵素断片をＤＮＡポリメラーゼ活性を検定し、および、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ酵素断片を選択する工程を含む。他の態様にあっては、本発明は、ＤＮＡ配列決定、ｃＤＮＡの生産、ストランド置換増幅、そして、当業者からして自明の他の技術や処理プロセスのような生物学的技術にて、本発明のタンパク質を使用する方法を提供する。図面の簡単な説明図１は、バシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩのexo-断片をコードするＤＮＡのクローニングの概略を図示している。ここで用いた略語は、ＤはDraI、ＨはHpaI、ＮはNcoI、Prはプロモーター、SaはSalIを示している。ギザギザ斜線（////////////）はベクターＤＮＡ、濃影の方形部分はBst exo-断片ＤＮＡ配列を、そして、淡影の方形部分は5'-3'エキソヌクレアーゼドメイン遺伝子配列を指し示している。この概略図には縮尺を記入しておらず、また、すべての工程について、利用可能なすべての制限部位も図示していない。図2aと2bに、本願発明の組成物のＤＮＡとアミノ酸配列を記載した。図2aには、Bst ＤＮＡ polIコード配列ならびに5'および3'非翻訳配列のＤＮＡ配列が記載されている。ホロ酵素とexo-断片の開始コドンを、インデントと太字で示した。757-830プローブ断片の配列には下線を付した。ストップコドン(TAA)を太字で示した。図2bには、Bst ＤＮＡ polＩコード領域の推定アミノ酸配列を記載した。太字のアミノ酸(M)は、Bst exo-断片をコードする、プラスミドpPEK5の翻訳にあたってまず最初に翻訳されると考えられるアミノ酸である。アステリスク(*)は、ストップコドン ATGを示す。図３には、天然のバシラスステアロテルモフィルスexo-(nBst exo-：実線)、組換えバシラスステアロテルモフィルスexo-(rBst exo-：破線)、および組換えバシラスカルドテナックス(Bacillus caldotenax)exo-断片(rBca exo-：点線、パンベラ、マジソン、ウィスコンシン州）による、様々な緩衝化pHレベルでの、ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性の相対活性を記している。図４には、天然のバシラスステアロテルモフィルスexo-(nBst exo-：実線)、組換えバシラスステアロテルモフィルスexo-(rBst exo-：破線)、および組換えバシラスカルドテナックスexo-断片(rBca exo-：点線、パンベラ、マジソン、ウィスコンシン州）による、様々な塩化マグネシウム濃度での、ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性の相対活性を記している。図5aと5bには、マンガンイオン(Mn⁺⁺)濃度の作用による、本願発明の酵素の様々な活性を対比的に記している。図5aには、天然のバシラスステアロテルモフィルスexo-(nBst exo-：実線)、組換えバシラスステアロテルモフィルスexo-（ rBst exo-：破線)、および組換えバシラスカルドテナックスexo-断片(rBca exo −:点線、パンベラ、マジソン、ウィスコンシン州）による、様々な塩化マンガン濃度での、ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性の相対活性を記している。図5bには、天然のバシラスステアロテルモフィルスexo-(nBst exo-：実線)、組換えバシラスステアロテルモフィルスexo-(rBst exo-：破線)、および組換えバシラスカルドテナックスexo-断片(rBca exo-：点線、パンベラ、マジソン、ウィスコンシン州）による、様々な塩化マンガン濃度での、逆転写酵素活性の相対活性を記している。図６には、天然のバシラスステアロテルモフィルスexo- (nBst exo-：実線)、組換えバシラスステアロテルモフィルスexo-（rBst exo- ：破線)、および組換えバシラスカルドテナックスexo-断片(rBca exo-：点線、パンベラ、マジソン、ウィスコンシン州）による、様々な温度での、ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性の相対活性を記している。図７には、天然のバシラスステアロテルモフィルスexo-断片(nBst exo-)、組換えバシラスステアロテルモフィルスexo-断片(rBst exo-)、および組換えバシラスカルドテナックスexo-断片（rBca exo-）を用いて、ポリrA:dTまたはｍＲＮＡ標的から得た逆転写酵素産物のオートラジオグラフィーの結果を写した写真の一部を示している。図７のレーン１〜６には、以下のものが置かれている。すなわち、レーン１にはｍＲＮＡのnBst exo-、レーン２にはｍＲＮＡのrBst exo- 、レーン３にはｍＲＮＡのrBca exo-、レーン４には1kbのＤＮＡラダー、レーン５にはポリrA:dTのnBst exo-、レーン６にはポリrA:dTのrBst exo-、レーン７にはポリrA:dTのrBca exo-が、それぞれ置かれている。図８には、銀染色した20.0％SDS-PAGEゲルでの、精製した天然のバシラスステアロテルモフィルスホロ酵素(nBst holo)、天然のバシラスステアロテルモフィルスexo-断片(nBst exo-)、組換えバシラスステアロテルモフィルスexo-断片 (rBst exo-)、および市販の組換えバシラスカルドテナックスexo-断片（rBca e xo-、パンベラ、マジソン、ウィスコンシン州）の純度を示す写真を示している。図８のレーン１〜６には、以下のポリペプチドが置かれている。すなわち、レーン１には低分子量マーカー、レーン２にはnBst holo、レーン３にはnBst exo -、レーン４にはrBst exo-、レーン５にはrBca exo-、そして、レーン６には低分子量マーカーが、それぞれ置かれている。図9aと9bには、図中に指し示したポリメラーゼを用いて得たＤＮＡ配列を示す、配列解析用ゲルでのオートラジオグラフィーの結果を写した写真の一部を示している。略語；天然のバシラスステアロテルモフィルスexo-断片（nBst exo-）；組換えバシラスステアロテルモフィルスexo-断片(rBst exo-)；組換えバシラスカルドテナックスexo-断片(rBca exo-)。図10には、図中に指し示したポリメラーゼを用いて得た産物の相違を示す、配列解析用ゲルでのオートラジオグラフィーの結果を写した写真の一部を示している。略語；天然のバシラスステアロテルモフィルスexo-断片(nBst exo-)；組換えバシラスステアロテルモフィルスexo-断片(rBst exo-)；組換えバシラスカルドテナックスexo-断片(rBca exo-)。図11には、組換えバシラスステアロテルモフィルスexo-断片（rBst exo-）を用いて得た好熱性ＳＤＡ産物のオートラジオグラフィーの結果を写した写真の一部を示している。発明の詳細な説明本発明の第一態様にあっては、生物学的に活性な、耐熱性を備えたバシラスステアロテルモフィルスの全長ＤＮＡポリメラーゼＩ酵素（"Bst polＩ")をコードする、単離および精製したＤＮＡ（配列番号：１の第316〜2946位のヌクレオチド）に関する。本明細書で使用する「耐熱性」の語は、65〜80℃、好ましくは、65〜70℃にて熱安定性を発現する酵素を意味する。本発明は、配列番号：１の第316〜2943位の（ストップコドンを含まない）ヌクレオチドまたは配列番号：１の第316〜2946位の（ストップコドンを含む）ヌクレオチドを有するBst po lＩ酵素をもたらすｃＤＮＡにも関する。他の態様にあっては、本発明は、約96,000ダルトンのバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩ（配列番号：２）のＮ−末端から273個のアミノ酸を欠失した約66,000ダルトンのＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ(配列番号：１の第1135〜2946位のヌクレオチド)、およびバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩ exo-断片（すなわち、配列番号：２の第274〜87 6位のアミノ酸残基）と命名された該ＤＮＡによってコードされたタンパク質に関する。この酵素断片は、ＤＮＡの配列決定、ｃＤＮＡの生産、好熱的ストランド置換増幅、そして、他の分子生物学的技術での使用において有用である。本発明のＤＮＡとポリペプチドの生成に向けた第一段階として、天然のバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩを、バシラスステアロテルモフィルス株10細胞（この細胞は、オクラホマ大学のブルースロー氏から受領した）から精製および単離し、そして、この90〜100キロダルトン(kD)の天然のホロ酵素のアミノ酸配列情報を決定した。（実施例１を参照のこと。）さらに、ファージλ Dash IIライブラリーにてバシラスステアロテルモフィルスのゲノムライブラリーを構築し、そして、増幅した。（実施例２を参照のこと。）様々なThermus種の遺伝子およびバシラスカルドテナックスＤＮＡ polＩ遺伝子の公表されたアミノ酸配列情報(Uemori et al.，J．Biochem．113:401-410(19 93))を、一組の変性した合成ＤＮＡプライマーを得るために用い、該合成ＤＮＡプライマーの中でも、プライマー757（配列番号：４）とプライマー830（配列番号：５）が、バシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子の一部を単離する上で有用であることが知見された。また、天然のBst ＤＮＡポリメラーゼＩのＮ−末端アミノ酸配列情報が決定され(実施例１を参照のこと)、そして、バシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子の5'端を同定するための合成プライマー、BCA（配列番号：３）を得るために用いた。バシラスステアロテルモフィルス株10 ＤＮＡ polＩ遺伝子のトップストランドに結合する配列を保有するようにして、757プライマー（配列番号：４）を合成した。対向する鎖に関するバシラスステアロテルモフィルス遺伝子の3'端に結合する配列を保有するようにして、830プライマー（配列番号：５）を合成した。プライマー7 57(配列番号：４)、プライマー830(配列番号：５)、およびバシラスステアロテルモフィルス株10ゲノミックＤＮＡを用いて、ＤＮＡ増幅反応を行った。この増幅反応によって、「757-830断片」と命名された、単一の増幅産物が生成した。この断片を、pTZ18Uベクターにクローニングし、大腸菌にて増幅し、そして、配列決定を行った。実施例４にて詳述したように、（実施例３で概説した手順に従って得た）757- 830断片をさらに増幅し、そして、熱サイクル標識(TCL)を介してプローブを得るためにこれを用いた。このプローブを、すでに構築したバシラスステアロテルモフィルスのゲノムライブラリー（実施例２を参照のこと）から、バシラスステアロテルモフィルスＤＮＡ polＩ遺伝子を単離するために用いた。増幅したバシラスステアロテルモフィルスのゲノムライブラリーを、2XTYプレートに置き、そして、プラークが形成されるまで成長せしめた。各プレートからプラークを二重に取得し、ハイボンド(Hybond)Ｎフィルターに適用し、そして、当該技術分野で周知のハイブリダイゼーション法を用い、上記のTCLプローブを利用して、これらフィルターをスクリーニングした。ポジティブプラークを選抜し、希釈して精製し、そして、757（配列番号：４）、プライマー830(配列番号：５)、およびBCA(配列番号：３)プローブを用いて再スクリーニングし、そして、さらに特徴付けを行った。特に、λ411およびλ511と命名された、14〜16kbの挿入体を保有する二つのクローンを、さらに分析を行うべく選抜した。クローンλ411とλ511を、完全なバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡ po lＩ遺伝子を組み立て、そして、配列決定を行うための出発点として利用した。実施例５に詳述したように、また、図１を参照すると、制限地図、サブクローニング、および部分的な配列決定によって、pB5X3と命名されたλ511のサブクローンがBst ＤＮＡ polＩ遺伝子（3'端）の約半分を有しているのに対し、pB4S6と命名されたλ411のサブクローンが、クローンpB5X3が保有するコード配列と重複する、Bst ＤＮＡ polＩ遺伝子の残りの5'部分を含んでいることが判明した。その遺伝子の完全配列を取得するために、プライマー移動法を用いた。具体的には、予め決定しておいた配列の端部に対して相同的または相補的なプライマーを合成し、そして、これを配列決定反応にて使用した。このプロセスを繰り返すことによって、遺伝子の全長が連続的に決定される。前述の結果は、本発明の一態様が、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する耐熱性ポリペプチドをコードし、図2aに記載のヌクレオチドを含む、精製および単離したＤＮＡに関するものであることを実証している。このＤＮＡは、当該技術分野で周知の発現ベクターのような、他のＤＮＡに作動可能に連結される。本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する耐熱性ポリペプチドをコードする、図2aに記載のヌクレオチドから必須的になる少なくとも１つの挿入体を保有するベクターにも関する。遺伝子配列が確定すると、バシラスステアロテルモフィルスＤＮＡ polＩ遺伝子の推定アミノ酸配列を並記して、バシラスカルドテナックスＤＮＡ polＩ遺伝子(Uemori et al.，J．Biochem．1j3: 401-410 (1993))とされる遺伝子の推定アミノ酸配列と比較した。rBca ＤＮＡ polＩ配列と比較したところ、rBca ＤＮＡ polＩアミノ酸配列にあっては、以下の置換または欠失とその存在位置、すなわち、Met₁₂₈、Trp₁₆₄、Trp₅₅₀、欠失₅₇₆が認められた。本発明の組換えバシラスステアロテルモフィルスexo-ＤＮＡ polＩタンパク質を得るために、バシラスステアロテルモフィルスＤＮＡ polＩ遺伝子クローンの全長を構築し、そして、大腸菌にて発現せしめた。実施例６と図１で詳述したように、プラスミドpB5X3とpB4S6の制限位置をさらに決定し、そして、5'と3' の非コード配列に沿って全Bst ＤＮＡ polＩ遺伝子を含む3.5kbの挿入体を保有するプラスミドpPRB５を生成するためにサブクローニングを行った。pPEK５と命名した5'を欠失したexo-断片を得るために、pPRB５から単離したDraI、HpaI制限断片を同様のベクターに連結した。大腸菌DH5αF'をプラスミドpPEK５で形質転換して、そして、バシラスステアロテルモフィルスexo-断片を組換え的に生成するために、この大腸菌を発酵槽で成長せしめた。実施例６で詳述するように、大腸菌タンパク質の熱変性、Mono Q およびMono Sクロマトグラフィーを利用した方法によって、この組換えタンパク質を溶解した大腸菌から精製した。この方法によって単離したバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡ exo-断片のＤＮＡポリメラーゼ特異活性の計算値は、約150,000単位／タンパク質(mg)と決定された。上記した方法と組換え細胞に関する記述は、本願発明が、ＤＮＡとポリペプチド以外にも及ぶことを実証している。本発明の他の重要な態様は、本願発明に関して前述したものを含む、ＤＮＡ、ベクター、またはプラスミドで形質転換した宿主細胞に関する。好ましくは、ＤＮＡで形質転換した宿主細胞は、そのＤＮＡでコードされた、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する耐熱性のポリペプチドを発現することができる。宿主細胞とは、大腸菌の細胞を包含する原核細胞と、真核宿主細胞との双方を意味する。ＤＮＡ形質転換細胞とポリペプチドに加えて、本発明は、ＤＮＡとポリペプチドを利用する様々な方法に関する。例えば、rBst exo-断片の精製プロトコールは、本発明の他の態様が、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する耐熱性ポリペプチドを精製する方法に関することを実証する。かような方法の一例は、本願発明のＤＮＡによってコードされたアミノ酸配列を有する耐熱性ポリペプチドを宿主細胞中にて発現し、そして、耐熱性ポリペプチド、宿主細胞タンパク質および細胞片を含んだ懸濁物を得るために細胞を溶解する工程を含む。好ましくは、この方法は、宿主細胞のタンパク質を変性するために懸濁物を加熱し、そして、細胞片と変性した宿主細胞のタンパク質を除去するために懸濁物を遠心分離する工程をさらに含む。Mono QとMono Sクロマトグラフィーのそれぞれによって、さらに精製することができる。実施例９に詳述し、また、表3Aにまとめたように、精製したバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡ polＩ exo-断片とバシラスカルドテナックスＤＮＡ po lI exo-断片の（非ポリメラーゼ関連の）エキソヌクレアーゼ活性の混入状態を特定するための幾つかの実験を行った。分析した5'-3'エキソキナーゼとエンドヌクレアーゼ活性は、非常に小さな活性であったり、検出限界に満たない活性でしかなかった。しかしながら、放出(％)/酵素単位の勾配を零に維持しながら、rBca exo-断片の3'-5'ェキソヌクレアーゼ分析と比較したnBst exo-とrBst exo-断片の3'-5'エキソヌクレアーゼ分析にて認められる標識基質の比較的高い放出性が、精製したBst exo-断片酵素での固有の3'-5'エキソヌクレアーゼ（校正）活性を示唆している。実施例８で詳述したように、精製されてきた組換えBst exo-断片タンパク質の特徴をさらに決定し、また、これらタンパク質と組換えバシラスカルドテナックスexo-断片（rBca exo-、パンベラ、マジソン、ウィスコンシン州）とを比較するために、幾つかの分析をさらに実施した。例えば、様々なpH値、そして、様々な塩化マグネシウム濃度と塩化マンガン濃度における、nBst 、rBst およびrB ca exo-断片のＤＮＡポリメラーゼ活性を検定した。図３（至適pH）；図４（至適塩化マグネシウム濃度）；図5aと5b（至適塩化マンガン濃度）；および図６（至適温度）は、これら検定の結果の一部である。組換えBst とBca exo-断片の至適値を、表１にまとめた。耐熱性を分析するために、その至適温度を規定すべく、これら酵素を、様々な温度で、10分間インキュベートした。nBst exo-、rBst exo-およびrBca exo-断片については、（90％を超える）最大の活性が70℃にて認められ、これら３つの断片を、80℃で、10分間インキュベートした後には約20％の活性が残存していた。逆転写酵素(RT)(ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ)活性は、３つのすべてのサンプルにおいて、50℃で、至適濃度である1.0mMの塩化マンガン濃度にて検出された。天然のBst exo-断片と組換えBst exo-断片は共に、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ／ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの単位比率が、それぞれ約1.4と2 .0であり、一方で、rBca断片では0.8もしくはそれ以下の比率であった。(図5b) 。精製したrBst exo-断片が、固有の3'-5'エキソヌクレアーゼ（校正）活性を有し、かつ検出可能な5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を欠いていることが認められた。20％SDS-PAGEによって、この調製物の純度が90％以上であると決定された( 図８)。SDS-PAGEによって決定された65kDの見かけの分子量は、計算で導かれた約65kDの分子量とよく符合している。rBst exo-調製物では、検出可能な二本鎖および一本鎖のヌクレアーゼ、ならびにエンドヌクレアーゼの混入による活性は認められなかった。等電点は、5.6と決定された。 nBst exo-、rBst exo-およびrBca断片の性能を、これらを一本鎖ＤＮＡの配列決定に利用して試験した(実施例９)。これら酵素は、[α³³P]-dATPによる内部ラベルを利用した配列決定用の反応での利用に有用である。試験したすべての反応において、exo-断片からは、150個以上のヌクレオチドからなる読み取り可能なＤＮＡ配列情報が得られた。しかしながら、強力なシグナルは、天然Bst exo-断片と組換えBst exo-断片にて認められた。さらに、nBst およびrBst exo-断片を二本鎖ＤＮＡの配列決定に利用して試験したところ、一本鎖ＤＮＡ標的の場合と同様の結果が得られた(実施例１１Ｂ)。以下の実施例は、本発明の様々な態様をさらに詳細に記載することを目的としている。具体的には、実施例１では、天然のバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩの精製とＮ−末端アミノ酸配列の決定が述べられている。実施例２では、バシラスステアロテルモフィルスのゲノムＤＮＡライブラリーの構築と増幅について記載されている。実施例３では、バシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子に特異的なプローブ断片のクローニングと配列決定が記載されている。実施例４では、遺伝子に特異的なプローブの調製と、バシラスステアロテルモフィルスＤＮＡ polＩ遺伝子を含んだクローンに関するバシラスステアロテルモフィルスのゲノムライブラリーのスクリーニングが詳述されている。実施例５では、プライマー移動によるバシラスステアロテル干フィルスＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子の配列決定が詳述されている。実施例６では、バシラスステアロテルモフィルスのホロ酵素のクローニングと、バシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩのexo-断片のクローニングと発現が詳述されている。実施例７〜13では、本発明のrBst exo-酵素の活性を、天然のBst exo-断片と従来の酵素rBca exo-（パンベラ、マジソン、ウィスコンシン州）の活性と比較した。実施例７では、組換えバシラスステアロテルモフィルスexo- ＤＮＡポリメラーゼＩエキソヌクレアーゼの活性の特徴決定が詳述されている。実施例７の結果をまとめた表3Aから、本願発明の酵素（rBst exo-）だけが、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性、一本鎖デオキシリボヌクレアーゼ活性、二本鎖デオキシリボヌクレアーゼ活性およびエンドヌクレアーゼ活性を欠いていることが伺える。これに対して、nBst exo-は、0.06％放出／単位の5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を呈しており、そして、rBca exo-は、0.3％放出／単位の5'-3'エキソヌクレアーゼ活性と、0.05％放出／単位の二本鎖デオキシリボヌクレアーゼ活性の酵素を呈していた。実施例８では、天然のバシラスステアロテルモフィルス、組換えバシラスステアロテルモフィルス、および組換えバシラスカルドテナックスexo- ＤＮＡポリメラーゼの活性に関する、塩化マグネシウム、塩化マンガン、pHおよび温度の効果を比較した。実施例８での表４では、nBst exo-、rBst exo-およびrBca exo -のpIが、それぞれ、5.4、5.6および5.3に決定されたことが報告されている。これら３つの酵素の各々の至適ポリメラーゼ活性は、1.0mMの塩化マグネシウムであると決定された(図４を参照のこと)。これに対して、nBst exo-、rBst exo-およびrBca exo-断片の至適活性は、0.5mMの塩化マンガンであることが認められた (図5Aを参照のこと)。図６に示したように、これら３つすべての酵素の至適温度は70℃であり、80℃になると活性は約20％しか残存していない。実施例９にて、逆転写酵素(RT)法での組換えexo-断片の有用性を実証した。実施例９は、約1.0mMの塩化マンガン濃度が至適値であると決定された逆転写酵素( RT)の酵素単位とポリメラーゼＩ(polI)の比率は、これら３つの酵素の間で大きく変化することを示している(図5bを参照のこと)。特に、rBca exo-でのRT:polI の比率が0.8であるのに対して、nBst とrBst exo-断片では、それぞれ、約1.4と 2.0であった。RT:polIの比率が１より大きくなることは考えにくく、ましては２以上になることは非常に考えにくい。Bst exo-断片が、約１〜３、好ましくは、 1.5〜2.5のRT/polI比率を有することも、本発明の範疇に包含される。実施例10では、組換えバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ配列の決定を行った。実施例10は、鋳型としてPoly rA:dT₅₀を用いて取得した沈殿性のｃＤＮＡは、2941cpmのrBst exo-が最大で、2421cpmのbBs t exo-と2001cpmのrBca exo-がこれに続く。あるいは、鋳型としてｍＲＮＡを用いることで、837,037cpm、691,545cpmおよび430,418cpmのnBst exo-、rBst exo- およびrBca exo-酵素がそれぞれ得られた(表６を参照のこと)。また、rBca exo- 断片酵素を用いて得たｃＤＮＡ産物よりも量と長さが勝っている、nBst exo-またはrBst exo-断片を用いた場合のｃＤＮＡをオートラジオグラフによって決定した。実施例11では、rBst exo-断片の作用特性（すなわち、鋳型に沿ったＤＮＡ重合の比率）を、天然のBst exo-とrBca exo-断片のそれと比較した。この検定において、ＤＮＡポリメラーゼ活性の最大の作用特性を有する酵素は、電気泳動に適用すると、比較的小さなＤＮＡよりも、ゆくっりと移動し、そして濃い影を落とす。これら３つのポリメラーゼによるポリメラーゼ産物を、配列決定用の６％ポリアクリルアミドゲルに置き、電気泳動させると、それらの作用特性は、rBst exo-＞nBst exo-＞rBca exo-の順で減少した。よって、本願発明の酵素、rBst exo-およびnBst exo-は、双方共に、従来の酵素であるrBca exo-よりも優れた作用特性を備えていることが実証された。(図10を参照のこと)。さらに、図10は、 nBst exo-とrBca exo-の双方と比較して、（レーン頂部に現れた濃い複数の線に見られるように）rBst exo-の作用特性が総合的に優れていることを実証している。実施例12では、rBst exo-断片を、好熱的ストランド置換増幅にて首尾良く利用した。従って、本出願人の酵素、特に、rBst exo-を好熱的ストランド置換分析に利用することは、本願発明の範疇に包含される。最後に、実施例13では、本出願人の発明の一態様に従ったBst exo-断片の精製を詳述している。本出願人の発明のこれら態様ならびに他の態様は、本明細書と以下の実施例の開示を根拠にすれば、当業者からして自明であろう。実施例１天然のBst ＤＮＡ polＩと天然のExo-断片の精製および天然のBst ＤＮＡ polＩのＮ−末端アミノ酸配列の決定天然のバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩを、バシラスステアロテルモフィルス株10細胞から単離し、そして、アミノ酸配列情報を得るために以下のように利用した。Ａバシラスステアロテルモフィルス株10（オクラホマ大学のブルースロー氏から受領した）を、以下のようにして培養した。55℃で一晩かけて成長させたLB プレートから単離したコロニーを、100mlの培養培地（0.1ｇニトリロトリ酢酸、３ｇNZアミンＡ、３ｇ酵母抽出物、５ｇ琥珀酸(遊離酸)、0.001ｇリボフラビン、0.522ｇK₂HPO₄、0.480ｇ硫酸マグネシウム、0.020ｇ塩化ナトリウム、２ml微量金属溶液（１リットル当たり、0.5ml硫酸、2.2ｇ硫酸マンガン、0.5ｇ硫酸亜鉛、0.5ｇオルトホウ酸、0.016ｇ硫酸銅、0.025ｇNa₂MoO₄、0.046ｇ硝酸コバルトを含み、水酸化ナトリウムでpHを8.0に調整した）に接種し、そして、この培養物を振とうしながら、終夜、55℃でインキュベートした。明け方に、終夜培養物の10mlを、1000ml の培地に接種するために用いた。この培養物を、55℃で、８時間成長せしめ、そして、ML4100コントローラーを具備したニューブルンスウィックの250リットル容の発酵槽での接種物として用いた。典型的な発酵のための条件として、55℃で、３ポンドの背圧、60リットル／分(lpm)の通気、100rpmの攪拌の各条件を設定した。600nmで測定した細胞の光学密度が２〜３に到達次第に、発酵を終了した。これら細胞を室温にまで冷却し、そして、CEPAタイプ61の連続フロー遠心分離機で、２lpmの流速条件下で、17,000rpmにて遠心分離して回収した。細胞ペーストを、−70℃で保存した。バシラスステアロテルモフィルス株10細胞（500ｇ）を、３倍体積の溶解用緩衝液（20mM Tris-塩酸、pH 7.5、0.5mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、１mMジチオトレイトール(DTT)、10mM塩化マグネシウム、0.02％Brij 35）で解凍し、そして均質化した。この懸濁物を、0.２ｇ/lのリゾチーム（溶解用緩衝液に予め溶解したもの）で、４℃で、45分間処理した。細胞を、マントングアリンホモジェナイザーにて、9000psiで、二回均質化し、また、機械を通る間の懸濁物は約1 0℃にまで冷却した。この試料をよく混合し、そして、13,500×ｇで、１時間遠心分離した。上清の試料を、至適PEI沈降を決定するために、10％ポリエチレンイミン(PEI)溶液で滴定した。実物大のPEI沈降物を、13,500で、１時間遠心分離した。回収した上清は、70％飽和で沈降したAmSO₄であり、そして、４℃で、少なくとも60分間攪拌を行った。9000rpmで、60分間遠心分離した後に、ペレットを、300mlのP-11緩衝液(20mM Kpi、pH 6.5、1.0mM DTT)に再懸濁した。この試料を、終夜、４℃で透析した。透析した試料を、9000rpmで、10分間遠心分離して清澄した後に、400mlの予め平衡化したP-11カラム(4.4×27cm)に、2.5ml/分の流速で適用した。このカラムを、１リットルのP-11緩衝液で洗浄した。300mM Kpi、pH 6.5 でのP-11緩衝液に対するP-11緩衝液の2800ml直線勾配を適用することで、酵素が溶出した。後述するようにしてBstポリメラーゼ活性に関して画分を分析し、そして、プールした。P-11プールは、14リットルの緩衝液Ｂ（20mM Tris-塩酸、pH 7.5、0.5mM EDTA、1.0mM DTT、10mM塩化マグネシウム、0.02％Brij 35）に対して、少なくとも３時間透析した。透析したP-11プールを回収し、そして、冷水で導電率を2.5ミリモーより小さくし、また、2N水酸化ナトリウムでpHを7.5に調整した。この試料を、200mlのMB Rブルーカラム（シバクロンブルー）に適用し、そして、600mlの緩衝液Ｂで洗浄した。1.80M塩化ナトリウムでの緩衝液Ｂに対する緩衝液Ｂの2800ml直線勾配を適用して、酵素を溶出した。後述するようにしてBstポリメラーゼ活性に関して画分を分析し、そして、プールした。MBRブループールを、14リットルの緩衝液Ｂに対して、少なくとも３時間透析した。透析したMBRブループールを回収し、そして、冷水で導電率を2.5ミリモーより小さくし、また、2N水酸化ナトリウムでpHを7.5に調整した。この試料を、100ml のヘパリン−アガロースカラムに適用し、そして、200mlの緩衝液Ｂで洗浄した。0.75M塩化ナトリウムでの緩衝液Ｂに対する緩衝液Ｂの1500ml直線勾配を適用して、酵素を溶出した。後述するようにしてBstポリメラーゼ活性に関して画分を分析し、そして、プールした。ヘパリン−アガロースプールを、14リットルの緩衝液Ｂに対して、少なくとも３時間透析した。透析したヘパリン−アガロースプールを回収し、そして、冷水で導電率を2.5ミリモーより小さくし、また、2N水酸化ナトリウムでpHを7.5に調整した。この試料を、0.8/0.2μmユニットで濾過し、そして、予め装填したファルマシア10×10 HP Q-セファロースカラムに適用した。100mlの緩衝液Ｂで洗浄した後に、0.25M塩化ナトリウムでの緩衝液Ｂに対する緩衝液Ｂの900ml直線勾配を適用して、酵素を溶出した。後述するようにしてBstポリメラーゼ活性に関して画分を分析し、そして、プールした。HP Q-セファロースプールを、後述するＮ−末端アミノ酸の配列決定のための天然のBst ＤＮＡpolIを単離するために用いた。 12.5％SDS-PAGEによって認められた、少なくとも80％の活性を保持している65 kDの産物を生成するための至適消化時間を決定するために、HP Q-セファロースプールの部分試料を、ズブチリシン（カールスバーグタイプ、シグマ社製）を用いて消化した。全プールを処置した後に、予め装填したファルマシア５×５ Mon oQカラムに適用することで、他の画分から65kDの断片を精製した。10mlの緩衝液Ｂで洗浄した後に、0.25M塩化ナトリウムでの緩衝液Ｂに対する緩衝液Ｂの60ml 直線勾配によって、酵素を溶出した。後述する活性と、プールする前の12.5％SD S-PAGEによる純度に関して画分を分析した。このプールを、２リットルの最終保存用緩衝液（20mM Kpi、pH6.8、1.0mM DTTおよび50％グリセロール）に対して透析した。ＤＮＡポリメラーゼ活性を定量するために、Kaledin et al.，Biokhimiya 45: 644-651(1980)に記載のプロトコールの変法を用いて、ＤＮＡポリメラーゼ活性の分析を行った。23℃でpH 8.6の50mM Tris-塩酸；100mM塩化カリウム；10mM塩化マグネシウム；1mM DTT；各0.2mMのdCTP、dGTP、dTTP、pH 7.0；0.2mM［α³³P ｝dATP、pH 7.0、 10pCi/ml；50μｇ BSA;15μg活性化ＤＮＡ(Bari et al.,Nucleic Acids Res．8:2641-2653(1977)）；および５ μlの希釈した酵素を含む50μlの反応混合物にて反応を進行せしめた。希釈緩衝液は、23℃でpH 8.0の50mM Tris-塩酸、１mM DTT、１mM EDTA、0.1％Brij-35および10％(v/v)グリセロールからなる。対照に供する目的で、既知の活性を持った天然のBst exo- ＤＮＡポリメラーゼを、20、40および80単位／mlにまで希釈した。初期控除のための負の対照として、酵素を用いない二つの反応を実施した。酵素をほとんど含まない45μlの反応混合物を調製し、5.0μlの酵素を添加することで反応を開始した。60℃で10分間インキュベーションした後に、その内の 40μlを除去し、酵母ＲＮＡ共沈降物（0.1M酢酸ナトリウム、pH 5.0にて10mg/ml ）の50μlに添加した。１mlの10.0％トリクロル酢酸(TCA)、2.0％ピロリン酸ナトリウムを添加し、そして、少なくとも10分間、試料を氷上に置いて沈降せしめた。この混合物を、ガラス繊維フィルターディスクで濾過し、そして、５％TCA/ ２％ピロリン酸ナトリウムで洗浄し、次いで、100％試薬級エタノール（Mallink rodt社)で洗浄した。乾燥したフィルターディスクに関して、5.0mlのシンチレーション液を用いて計数した。この標準活性検定において、30分間の内に、60℃で、10nmolの全ヌクレオチドを酸不溶性の形態に取り込むに必要な酵素の量を、活性の１単位と定義した。タンパク質濃度は、ブラッドフォードプロテインアッセイ（バイオラッド社、ヘラクレス、カリフォルニア州）によって決定した。nBst exo-断片のＤＮＡポリメラーゼ比活性の計算値は、約50,000単位／mgであった。Ｂ単離および精製した天然のバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼからアミノ酸配列の情報を引き出すために、約50μgの天然のBst ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素を、調製用7.5％SDS-ポリアクリルアミドゲルにて分離し、P VDF膜に付着せしめ、そして、Matsudaira，J．Biol．Chem．262:10035-10038(19 87)に記載の通り、アミドブラックを用いて染色した。約92kDでの主要バンドを切り出し、そして、アプライドバイオシステムズ社（フォスターシティ、カリフォルニア州）の477Aタンパク質の配列解析機を用いて配列を決定した。以下の配列が認められた。 Met,Lys,Lys,Lys,Leu,Val,Leu,Ile,Asp,Gly,Ser,Ser, Val,Ala,Tyr,Arg. この配列は、図2bに示したBst ＤＮＡpolIホロ酵素（配列番号：２）の推定アミノ酸配列の第１〜16位の位置にあることが判明している。実施例３にて説明するように、このアミノ酸配列の情報に関わる知見は、バシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子を単離するために用いた。実施例２バシラスステアロテルモフィルスのゲノミックＤＮＡライブラリーの構築と増幅バシラスステアロテルモフィルスのゲノミックライブラリーをファージλDas hIIで構築し、そして、以下の手順で増幅した。先述したように終夜培養したバシラスステアロテルモフィルス株10由来のゲノミックＤＮＡを、Ausubel et al.， Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiely & Sons，New York(1990)に記載の手順に従って単離した。一般に、 100〜900μgのゲノミックＤＮＡが、約1.5mlの培養物からなる細胞ペレットから得られる。バシラスステアロテルモフィルス株10のゲノミックＤＮＡの１μgを、全量10 0μlの１単位のSau 3A Iで消化した。０、５、10、15、20、25、30、35、40、4 5および50分の時点にて、５μlの試料を除去し、そして、10分間、70℃の条件下置いて、酵素を失活させた。各経過時間において、画分を1.2％アガロース／TBE ゲルで分析した。45分の時点にて、３〜20kb断片という所望のサイズ分布が認められた。20μgのバシラスステアロテルモフィルス株10のゲノミックＤＮＡと、全量250μlの20.0単位のSau 3A Iを用いて、大規模な消化を行った。 Sau 3A Iで消化した約2600pmolのバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡの5 '端を、20単位の子牛腸アルカリホスファターゼで、37℃にて、30分間処理した（CIP;Ausubel et al.，(1990)。Sau 3A Iで消化し、CIP処理したバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡを、フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿し、ペレット化し、そして、70％エタノールで洗浄した。このＤＮＡ溶液の２μlを、その量と信頼性を確認するために、1.2％アガロース／TBEゲルにて視覚化せしめた。このペレットを、−20℃で保存した。このＤＮＡを、「ＣＩＰＤＮＡ」と称する。ファージλDashII/BamHIクローニングキット（Stratagene社、ラヨラ、カリフォルニア州）を用いて、当該キットの製造業者の指示書の通りにして、バシラスステアロテルモフィルスライブラリーを構築した。対照として、pME/BamHI試験挿入体 (0.3μg)も併せて使用した。ライゲーション混合物を、４℃で、終夜、インキュベートした。ライゲーション試料の１μlを、ライゲーションの程度を確認するために、1.2％アガロース／TBEゲルに適用した。ファージλDashIIのアームに結合したバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡを、ストラタジーン社から入手したギガパックIIゴールドパッキングエクストラクトを用いて、製造業者の指定した条件下で、in vitroで取り込みを行った。製造業者が提供した対照のＤＮＡについても取り込みを行った。 λDashII/BamHIベクターキットに添付のストラタジーン社のプロトコールに続いて、宿主細菌、すなわち、野性型ファージ用のVCS257、バシラスステアロテルモフィルスライブラリーと対照用のSRBとSRB(P2)を調製した。VCS257は、NZY+ マルトース培地にて、また、SRBとSRB(P2)は、50μg/mlのカナマイシンを含んだ NZY+マルトース培地にて、37℃にて、６時間生育せしめた。2800×ｇで、10分間、遠心分離した後に、細胞を10mMの硫酸マグネシウムで再懸濁し、600nmでの吸光度が0.5になるようにした。以下の希釈液の１μlを、200μlのSRB細胞に添加した。対照のファージとCIP Bst ＤＮＡライブラリーから、二つの１：10連続希釈液を調製した。ファージの原液、１：10希釈液、１：100希釈液の10μlを、200μl のSRB細胞に添加した。これら細胞を、軽く振とうしながら、37℃で、15分間インキュベーションし、そして、寒天を添加した後に、この混合物をLB/M/Mプレートに注いだ。(1000mlの脱イオン水に対して、15ｇの寒天、10ｇのトリプトン、５ｇの酵母抽出物、10ｇの塩化ナトリウム、2.64ｇの硫酸マグネシウム、２ｇのマルトースを含み、0.1N水酸化ナトリウムでpHが7.0に調整した。)このプレートを、37℃で、終夜、インキュベーションした。37℃での、終夜インキュベーションの後、１ml当たりの平均プラーク形成単位(pfu/ml)の力価を決定した。 Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology(1990)に記載の技術を用いて、バシラスステアロテルモフィルスライブラリーを増幅した。当初のライブラリーと増幅したライブラリーを、SRB細胞に関して力価を決定した(表２)。増幅したライブラリーは、４℃で保存した。実施例３ Bst ＤＮＡ polI遺伝子に特異的なプローブ断片のクローニングとその配列の決定 Thermus(サーマス)種とバシラスカルドテナックス由来のＤＮＡ配列を、バシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子断片の増幅のための二つのプライマーの合成のためにデザインした。すなわち、プライマー757(25mer) (配列番号：４)およびプライマー830(23mer)(配列番号：５)(カリフォルニア州、サンジエゴに所在のシンセチックジェネティック社によって合成された)の合成のためにデザインした。プライマー757は、頭鎖（すなわち、ペプチド１に対して相同なBst ＤＮＡ polIタンパク質の一部をコードするＤＮＡ配列の一部)、つまり、バシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼのコーディング配列を示した配列番号：１の第2584〜2609位のヌクレオチドに対応する。プライマー830は、第2 794〜2816位にあるBst ＤＮＡ polI遺伝子の3'端にハイブリダイズし、そして、尾鎖と同一の配列を有している。バシラスステアロテルモフィルスのゲノミックＤＮＡに対するプライマー757 (配列番号：４)とプライマー830(配列番号：５)の特異性を、バシラスステアロテルモフィルス、 T.flavus(サーマスフラブス)、 T. rubrum(サーマスルブルム)、 T. thermophilus(サーマスステアロテルモフィルス)由来のゲノミックＤＮＡのサザーンブロット法でスクリーニングすることによって実証した。ビオチン-11 dUTPで末端をラベルしたプライマー757（配列番号：４）とプライマー830(配列番号：５)は共に、高度にストリンジェントな条件下（52℃、0.1×SSC、1.0％SDS）にて、バシラスステアロテルモフィルスのゲノミックＤＮＡに対して強力にハイブリダイズした。さらに、末端をラベルしたプライマー830(配列番号：５)は、消化したバシラスステアロテルモフィルスのゲノミックＤＮＡの痕跡を検出した。特に、BstゲノミックＤＮＡは、EcoRIやSau 3A Iのような異なる制限酵素を用いて、10、15、3 0および60分間かけて消化した。500ng/レーンの制限ＤＮＡを、0.7％アガロースゲルにて電気泳動した。このゲルからHybond-Nへのサザーン法も実施した。サザーンブロットにて変性したＤＮＡを、フィルターに対して、3.0分間、紫外線を照射して架橋した。一対のブロットを、熱封式ビニール袋内に置かれた２mlのハイブリダイゼーション用緩衝液（50％脱イオンホルムアルデヒド、７％SDS、120 mMリン酸ナトリウム、pH 7.2、250mM塩化ナトリウム、１mM EDTA および１mMセ7チルジメチルエチルアンモニウムブロミドおよび10mg/mlの変性サケ精子ＤＮＡ）にて、52℃で、１時間、プレハイブリダイゼーションした。１ブロット当たりに約250ngの末端を標識したプローブを添加し、そして、50℃で、終夜インキュベーションした。標識したプローブを利用したサザーンブロットを、52℃で、１時間、低度のストリンジェント緩衝液（1×SSC、1.0％SDS）でインキュベートし、52℃で、１時間、高度なストリンジェント緩衝液(0.1×SSC、1.0 ％SDS）で洗浄し、乾燥し、そして、アビジン−アルカリホスファターゼ接合体によって検出した。 0.2mM dNTPs、１×シータスAmpliTaq反応用緩衝液(10mMTris-塩酸、pH 8.4、5 00mM塩化カリウム、15mM塩化マグネシウム、0.01％ゼラチン)、30pmolの各プライマー、200ngのEcoRIで消化したBst ゲノミックＤＮＡ、５単位のAmpliTaq（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ(パーキンエルマーNo．N801-0060)、および50μl の重層用軽質鉱油を用いて、増幅反応(100μl)を行った。91℃で20秒間、55℃で 20秒間、そして72℃で２分間のサイクルを30回実施して、増幅を行った。このような条件下にて、プライマーセット757-830は、BstゲノミックＤＮＡから単一の増幅産物をもたらした。この増幅産物での232個の塩基対の長さの計算値は、0.7％アガロース／TBEゲルで認められた移動度と一致していた。この断片を、ファルマシアシュアクローンキットの説明書の通りにして、pTZ18Uに連結した。シークアルＤＮＡ配列決定用キット(CHIMERx、マジソン、ウィスコンシン州）によって配列決定されたクローンは、バシラスカルドテナックスＤＮＡポリメラーゼに対して相同性があると考えられる。それ故、この232bpの断片を、Z EPTO（登録商標）ラベル付けキットのマニュアル（CHIMERx、マジソン、ウィスコンシン州）に記載に従って、プローブを調製するために利用した。実施例４遺伝子特異的プローブの調製およびバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡ polI遺伝子を含むクローンに関するバシラスステアロテルモフィルスのゲノミックライブラリーのスクリーニング実施例３に記載の757-830断片を、Bstゲノミックライブラリー（実施例２を参照されたい）からBst ＤＮＡ polI遺伝子を単離するために用いた。鋳型としてのクローニングした757-830断片、プライマー757(配列番号：４)およびプライマー830(配列番号：５)を用いて、Bstゲノミックライブラリーをスクリーニングするためのプローブを調製するために用いる断片を大量に得るために、757-830断片をまず、上記した通りにしてＰＣＲによって増幅した。約240bpの位置に移動する増幅した757-830断片を、調製用0.7％アガロースTBEゲルから切り出し、溶出し、フェノール−クロロホルムで抽出し、そして、エタノールで沈殿せしめた。ZEPTO（登録商標）ラベリングマニュアルに記載のラベル付け用のプライマーに特異的な配列を生成するために、約１μｇの757-830断片を、Cvi JI'（CHIMER x、マジソン、ウィスコンシン州）で消化した。二重プラークのリフトまたは標的の各組を、[³³P]dCTPがラベルされた757-830断片を用いてスクリーニングした。Cvi JI^*による消化ならびにラベル付けの方法は、本明細書に参考までにその全文を取り入れた、共有に係る、係属中の、「制限エンドヌクレアーゼの利用のための方法と物質」という名称の、1994年3月25日に出願された、米国出願No．0 8/217,459に記載されている。この米国出願の対応ＰＣＴ出願は、1994年3月24日に出願された、国際出願No．US94/03426である。無傷の757-830断片を、ZEPTO（登録商標）ラベリングマニュアルの記載に従って、[³³P]dCTPでラベル付けした。１×10⁹cpm/μｇにて、全量で６×10⁷cpmの[³ ³ P]dCTPを利用した。プローブに関しては、各プラークリフトに対して、１〜５ ×10⁶cpmの放射標識したＤＮＡを添加した。増幅したバシラスステアロテルモフィルスのゲノミックライブラリー（実施例２）をスクリーニングするために、二つのプレートにそれぞれ、10⁵プラーク形成単位(pfu)/100mm 2XTYプレートの割合でファージライブラリーを接種した。当該技術分野で周知の方法(Sambrook，Fitsch and Maniatis，Molecular Clonin g，A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbour Press，Cold Spring Harbour，NY(1989))によるハイブリダイゼーションのために、各プレートからHy bond Nでの二重のプラークリフトを取得および調製した。プラークリフトに関するＤＮＡを、Hybond Nに対して、３分間、紫外線照射して架橋せしめ、そして、上記したようにして、ハイブリダイゼーションを行うために熱封式ビニール袋に入れた。１〜５×10⁸cpmの［³³P]dCTP 757-830 TCLプローブを、二つのフィルターに添加した。このフィルターを、52℃で、一晩インキュベートし、そして、その翌日に、先述の低度のストリンジェント緩衝液と高度なストリンジェント緩衝液で洗浄した。増幅したCIP Bst ＤＮＡライブラリーでの10⁵pfuの中から（ラベルしたプローブとハイブリダイズする）４つのポジティブなプラークが、二重のプラークリフトにて検出された。λB211、λB411、λB511およびλB711と命名されたこれら４つのファージのストックを、１ストック当たり５枚のプレートを準備し、５×10⁵pfu/2XTYプレートになるまで成長せしめた。標準的なプロトコール(Sambrook et al．(1989))に従って、プレートからファージを溶出した。溶出物を、20μg/mlのデオキシリボヌクレアーゼと50μg/mlのリボヌクレアーゼＡで、37℃で、１時間処理し、そして、フェノール−クロロホルムとクロロホルムの双方で抽出した。このＤＮＡを、エタノールで沈殿せしめ、ペレット化し、エタノールで洗浄し、１mlのTE緩衝液(10mM Tris、pH 8.0、１mM EDTA)で再懸濁し、そして、λＤＮＡ精製キット（CHIMERx、マジソン、ウィスコンシン州）の指示に従って精製した。ファージＤＮＡλB211をEcoRIで、λB411をSal Iで、λB511とλB711をXba I でそれぞれ制限消化した。消化処理を終えた後に、同様に消化され、自己ライゲーションを最小ならしめるために脱リン酸化処理したpTZ18U(Mead et al.，Prot ein Engineering 1:67-74(1986))に、各ファージＤＮＡを個別に連結せしめた。これらクローンのプラスミド誘導体を、それぞれ、pB2、pB4S、pB5XおよびpB7X と命名した。形質転換を終えた後に、Bca配列データとの配列の相同性の確認、および／または、先述したハイブリダイゼーション条件下にてラベルした757または830プライマーを用いたハイブリダイゼーションによって、これらクローンの検証を行った。この情報から、これらクローンが、真正のバシラスステアロテルモフィルス株10ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子配列と、その配向性を備えていることが確認された。実施例５バシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子の配列決定とバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩと exo-断片のクローニング Bst ＤＮＡ polI遺伝子の配列を得るために、プライマー移動配列決定法を採用した(Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spr ing Harbour Press(1989))。プライマー移動によってクローンから配列情報を得るために、予め決定した配列の端部と相同または相補性のプライマーを、先述したようにして合成し、そして、他の配列決定のための反応に供そいた(表２、Bse q1-25)。この手順を繰り返すことで、遺伝子の全長が順次決定される。クローンλB411とλB511が、実施例４に記載の5'と3'Bst ＤＮＡ pol Iコーディング配列の双方を含んでいることが確認された。これらクローンの配列解析によって、完全なBst ＤＮＡ pol Iをコードする挿入体を得る目的で5'と3'配列を接合するために用いられる、好適な制限エンドヌクレアーゼ部位がもたらされる。具体的には、共有した単一のSalI部位と、利用可能なNcoI部位が使用される。続いて完全なBst ＤＮＡ pol Iをコードする挿入体へ連結するために、pPRと命名した発現ベクターを、BspHIで消化した。BspHI制限部位は、NcoI制限部位とは同一の突出末端であるので、Ncol制限部位を用いた連結にあっては融和性の粘着端として機能できる。Bst polI挿入体の形質転換と検証を終えた後に、温度依存性のpRオペレーター／プロモーター領域を利用して、コードしたBst ＤＮＡ pol Iポリペプチドの発現が首尾良く実行できた。配列情報から、単一のDra I部位が、5'-3'エキソヌクレアーゼドメインと3'-5'プルーフリーディングドメインをコードするヌクレオチド配列の接合部に位置するものと決定された。よって、この酵素による制限と後続の再連結によって、pRオペレータ-／プロモーターと適合できる無傷のexo-断片を生成する。exo-断片挿入体の形質転換と検証を終えた後に、コードされたBst exo-断片ポリペプチドの発現が首尾良く実行できた。バシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子、exo-断片および（斜字で記載した）側方配列のＤＮＡ配列を、図2aに示した。ホロおよびex o-断片に関する翻訳した推定アミノ酸配列を、図2bに示した。Bst ＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子の3317塩基対のＤＮＡ配列（配列番号：１）の詳細が決定され、その内の2631塩基対（すなわち、（配列番号：１）の第316〜2946位のヌクレオチド）は、（TAAストップコドンを含む）887個のアミノ酸のnBst polIポリペプチド（配列番号：２）をコードするものと推定され、また、第1135〜2946位のヌクレオチドは、（TAAストップコドンを含む）Bst exo-断片をコードするものと推定される。実施例６バシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩのexo-断片のクローニングと発現 pRオペレーター／プロモーターに融合したＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子の3'側の2/3を含んだプラスミドpPEK5を用いた発現の検討を実施した。ＤＮＡ配列から推定して、プラスミドpPEK5の挿入体によってコードされると推定される最初のアミノ酸は、（太字で記載した）図2bのメチオニン、すなわち、配列番号：２の第285位の残基に対応する。pPEK5の挿入体は、該遺伝子の5'側の1/3を欠いていることから、5'-3'エキソヌクレアーゼドメインを欠いたＤＮＡポリメラーゼＩの断片（Bst exo-断片）をコードするものと考えられている。 50μg/mlのアンピシリンを補充したLB培地(Sambrook et al.，Molecular Clon ing，A Laboratory Manual，2nd ed．(1989))を収容した４リットル容の三角フラスコにて、30℃で、強力に通気して、大腸菌DH5αF'[pPEK5]を成長せしめた。 600nmでの吸光度が1.0の時に、培養物を42℃のインキュベーターに移し、そして、さらに２時間成長せしめた。この培養物を、シャープレス遠心分離機で遠心して、そして、−70℃で保存した。 1.25ｇの大腸菌[pPEK5]を、10mlの溶解用緩衝液(20mM Tris-塩酸、pH8.0、0.5 mM EDTA、50mM塩化ナトリウム、１mM DTT、0.02％Brij-35、0.1mg/mlリゾチーム、および1.0mM PMSF)にて解凍した。細胞懸濁液を、室温にて、30分間撹拌した。細胞溶解物を、65℃で、15分間加熱し、そして、氷上で５分間冷却した。細胞屑と変性したタンパク質を除去するために、12,000rpmで、30分間遠心分離した後に、上清を0.8/0.２μmの濾過ユニットに通して濾過し、そして、緩衝液Ａ、すなわち、20mM Tris-塩酸、pH7.5、1.0mM DTT、0.5mM EDTA、10mM塩化マグネシウムおよび0.02％Brij-35で平衡化されている、予め装填したファルマシアの５ ×５Mono Qカラムに適用した。20mlの緩衝液Ａで洗浄した後に、0.4M塩化ナトリウムでの緩衝液Ａに対する緩衝液Ａの90ml直線勾配を適用して、酵素を溶出した。１mlの画分を活性について検定し、そして、プールした。 Mono QプールをpH 6.0での緩衝液Ａで希釈して、導電率を５ミリモーにまで低減し、また、pHを6.0より低くした。そして、このプールを、pH 6.0での緩衝液Ａで平衡化されている、予め装填したファアルマシアの５×５Mono Sカラムに適用した。20mlの平衡用緩衝液で洗浄した後に、0.75M塩化ナトリウムにてpH 6.0の緩衝液Ａに対するpH 6. 0の緩衝液Ａの90ml直線勾配を適用して、酵素を溶出した。１mlの画分を活性について検定し、12.5％SDS-PAGEによって純度を測定し、そして、プールした。このMono Sプールは、１リットルの最終保存用緩衝液(20mM Kpi、pH 6.5、1.0mM D TTおよび50％グリセロール)に対して、４℃で、終夜、透析を行った。タンパク質濃度を、ブラッドフォードプロテインアッセイ（バイオラッド社、ヘラクレス、カリフォルニア州）によって決定した。rBst exo-断片のＤＮＡポリメラーゼ比活性の計算値は、約150,000単位／mgであった。従来の凍結乾燥技術を用いて、rBst exo-断片を含む溶液を保存のために凍結乾燥した。好ましくは、凍結乾燥溶液には、アルブミン、トレハロース、マルチトール、スクロース、ソルビトールおよびフィコールなどの安定化剤を一つ以上包含せしめる。一般的には、凍結乾燥溶液は、水性である。しかしながら、低温での長期保存のために、凍結乾燥溶液の溶媒の全部または一部にグリセロールを用いる。実施例７バシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩエキソヌクレアーゼ活性の特徴バシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼexo-断片とrBca exo-断片の純度および分子量を、ファルマシアふぁすとシステム（ピスキャタウェイ、ニュージャージー州）を用いて、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価した。図８には、銀染色した20.0％SDS-PAGEゲルでの、精製した天然のバシラスステアロテルモフィルスホロ酵素(nBst holo)、天然のバシラスステアロテルモフィルスexo-断片(nBst exo-)、組換えバシラスステアロテルモフィルスexo-断片(rBst exo-)、および市販の組換えバシラスカルドテナックスexo-断片（rBca exo-、パンベラ、マジソン、ウィスコンシン州）の純度を示す写真を示している。図８のレーン１〜６には、以下のポリペプチドが置かれている。すなわち、レーン１には低分子量マーカー、レーン２にはnBst holo 、レーン３にはnBst exo-、レーン４にはrBst exo-、レーン５にはrBca exo-、そして、レーン６には低分子量マーカーが、それぞれ置かれている。天然のBst exo-断片、組換えBst exo-断片、および組換えバシラスカルドテナックスexo-断片（パンベラ、マジソン、ウィスコンシン州）の内因性／外因性エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、およびデオキシリボヌクレアーゼ活性を決定するために分析を実施した。そのプロトコールは以下に記載の通りであり、また、その結果を表３Ａにまとめた。 50mM Tris-塩酸、pH 7.6、10mM塩化マグネシウム、１mM DTT、[3'-³H]dCTPとd GTPでラベルした0.15μｇのλDNA/Taq I断片、そして、５、10および20単位の酵素を含んだ最終体積10μlにて、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性についての分析を行った。各試料を、10μlの軽質鉱油で重層し、そして、60℃で、１時間インキュベートを行った。50μlの酵母t -RNAと200μlの10％TCAを添加して、反応を停止した。氷上での10分間のインキュベーションの後、マイクロ遠心機で、試料を７分間遠心分離した。上清(200μl)を除去し、６mlのシンチレーション液を加え、そして、シンチレーションカウンターにて計測を行った。その結果を、酵素単位当たりの放出したラベルの率（％）の勾配として、表３Ａにまとめた。Bst exo-断片では試料当たりの平均値が約5800cpmであったのに対して、rBcaexo-断片では試料当たりの平均値が約180 cpmであった。 5'-3'についての分析は、基質として[5'-³²P]λDNA/HaeIII断片を用いた以外は、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性についての分析と同一の方法で行った。基質として[³²P]λDNAを用いた以外は、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性についての分析でのプロトコールに従って、二本鎖および一本鎖のデオキシリボヌクレアーゼの分析を行った。一本鎖のデオキシリボヌクレアーゼの活性を検定する前に、ＤＮＡを100℃で３分間処理し、そして、直ちに氷上で冷却した。 50mM Tris-塩酸、pH 7.6、10mM塩化マグネシウム、１mM β−メルカプトエタノール、0.５μｇのpBR322、そして、５、10および20単位の酵素を含んだ最終体積10μｌにて、エンドヌクレアーゼ活性についての分析を行った。各試料を、10 μlの軽質鉱油で重層し、そして、60℃で、１時間インキュベートを行った。２ μlのブロモフェノールブルー、１mM EDTAおよび40％スクロースを添加して、反応を停止した。短時間の遠心分離の後に、下層の６μlを除去し、そして、１×T BEでの1.5％アガロースゲルにて電気泳動せしめた。pBR322の超螺旋形から線状形への変化に伴う移動度の変化が記録された。実施例８バシラスステアロテルモフィルスおよびバシラスカルドテナックスＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性の比較天然のバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡ polI exo-断片（nBst exo-、ロットNo．30419；CHIMERx社、カタログNo.1112-01、マジソン、ウィスコンシン州）、大腸菌[pPEK5]から精製した組換えバシラスステアロテルモフィルスexo- 断片(rBst exo-)、およびバシラスカルドテナックスexo-断片(rBca exo-、パンベラ社、マジソン、ウィスコンシン州）の生物学的特徴を、以下に記載した幾つかのプロトコールを用いて比較した。様々な酵素の調製物の分子量と純度を、電気泳動と銀染色のためのファルマシアファストシステム（ピスキャタウェイ、ニュージャージー州）を用いたアクリルアミドゲル電気泳動によって評価した。12.5％〜20.0％のアクリルアミドゲルから評価した見かけの分子量と、入手可能な配列データから算出した分子量の比較を、図３Ｂにて行った。90％を超える純度が、天然と組換えのBst exo-断片にて認められたが、分析を行った rBca exo-断片の純度は80％に満たなかった。ファルマシアファストシステムを用いて、ポリメラーゼと標準品を等電点の評価に供した。実験的に求めた試料のpI値を、アミノ酸配列情報から求めた計算値と比較した。その結果を、表４にまとめた。これら酵素のＤＮＡポリメラーゼ活性の相対値を、異なるpH値で、60℃で、分析した。選択した緩衝液のpHを、23℃で調整し、文献値との直接比較を可能にした。表５Ａには、23℃で滴定した１×緩衝液に関して60℃にて測定したpH値を示している。特に断りの無い限り、本明細書で報告したpH値は、約23℃で調整したものである。 50mM塩化カリウム、１mM DTT、10mM塩化マグネシウム、およびPIPES、Trisまたはトリエチルアミンの３つの内の１つである50mMの緩衝化合物を含んだ緩衝液と、0.1mM dCTP、dTTP、dGTP、[α³³P]dATP、0.3mg/mlの活性化子ウシ胸腺ＤＮＡおよび0.5mg/mlのBSAを含んだ、100ｐｌ（最終体積）の反応混合物にて活性の分析を行った。各ポリメラーゼ酵素の0.1単位/μｌの希釈液を調製し、そして、これら希釈液の５μlを反応混合物に添加し、次いで、60℃で、10分間インキュベーションを行った。個別に実験を実施し、反応曲線を得た。図３には、検討した酵素の相対活性が図示されており、この相対活性は、その酵素の最高値での１分当たりの計測数に対する測定時のpHでの１分当たりの（バックグラウンドと酵素の希釈因子を補正した）計測数との比率として算出している。試験した３つの酵素の至適値域（90％を超える活性）を、表５Ｂに示した。これら数値は、60℃にて測定した緩衝液のpH(表５Ａを参照)より、約１pH単位だけ大きかった。ＤＮＡポリメラーゼの活性に関する塩化マグネシウムの影響を検討するために、上記したpH用のプロトコールを変更した。反応用緩衝液には、50mM Tris-塩酸、pH 8.3(23℃)と、0.0〜20.0mMの濃度の塩化マグネシウムを入れた。個別に実験を実施し、そして、nBst exo-断片、rBs t exo-断片およびrBcaexo-断片の相対活性を示した反応曲線が得られた(図４)。これら３つの酵素の至適活性は、最終濃度が1.0mMの塩化マグネシウムにて認められた。ＤＮＡポリメラーゼの活性に関する塩化マンガンの影響を（マグネシウムイオンが欠如している条件下で）検討するために、上記プロトコールを変更した。反応用緩衝液には、0.0〜5.0mMの濃度の塩化マンガンを入れた。塩化マンガンの酸化生成物(MnO₂:二酸化マンガン)が沈殿するので、塩化マンガンの溶液は、分析の直前に調製した。個別に実験を実施し、そして、これら酵素の相対活性を示した反応曲線が得られた(図５ａ)。天然のBst、組換えのBst exo-断片および組換えのBca exo-断片の至適活性は、0.5mMの塩化マンガンにて認められた。ポリメラーゼ酵素(nBst exo-、rBst exo-およびrBca exo-)の至適温度を、先述した100μlのＤＮＡポリメラーゼ活性分析用液にて、1.0単位の酵素を、10分間、37、50、60、65、70、75および80℃の温度でインキュベーションすることによって決定した。図６には、先述したようにして算出した、温度との相関で％相対ポリメラーゼ活性が図示されている。図６に示されたように、これら３つすべての酵素の至適温度は70℃であり、80℃でも約20％の活性が残存していた。実施例９ＤＮＡポリメラーゼ酵素の逆転写活性の比較天然および組換えBst exo-断片ならびに組換えBca exo-断片のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ(逆転写酵素、R.T.)活性を比較した。各酵素に関する塩化マンガンの至適濃度（図５Ｂ）を決定した後、Poly rA:dT₅₀またはmRNA基質のいすれかを利用した逆転写酵素分析にて、1.0単位の酵素について比較を行った。この分析では、先述したガラス繊維沈殿法によって産物の定量を、また、反応産物を含んだ1.2％TBEアガロースゲルのオートラジオグラフによって産物の定性分析を行った。Ａ Meyers，T.W．and Gelfand，D.H.，Biochemistry 30:7661-7666(1991)に記載の方法の変法を用いて、0mM〜5.0mM塩化マンガンの存在下で、天然および組換え Bst exo-断片ならびに組換えBca exo-断片の逆転写酵素活性を比較した。この反応液(50μl)は、１×反応用緩衝液(50mM Tris-塩酸、pH 8.6、100mM塩化カリウム)、1.0mM DTT、0.2mM Poly rA:dT₅₀、0.5mM[3'-³H]dTTP(80μCi/ml)、0.5単位の酵素、および残余の水を含んでいた。酵素を含まない反応混合物を、酵素添加に先駆けて、１分間、50 ℃で、プレインキュベーションした。反応物の40μlを除去し、先述したように濾過沈殿せしめた後に、同反応物を、10分間、50℃で、プレインキュベーションした。図5bに示したように、これら３つの酵素すべてに関する塩化マンガンの至適濃度は1.0mMであった。また、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに対するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの比率は、天然および組換えBst exo-断片については、それぞれ約1.4と2.0であり、また、組換えBca exo-断片については、約0.8 であった。Ｂ 1.0単位の酵素を用いて、濾過沈殿法およびオートラジオグラフの各々によって、逆転写酵素活性の活性量と性状を比較するために、1.0mM塩化マンガンの存在下で、上述した分析法を様々な態様で用いた。50℃で、１時間、インキュベーションした後に、先述した濾過沈殿法に適用するために、15μlの試料を除去した。さらに別の15μlの試料を除去し、これを５μlの停止溶液（95％脱イオンホルムアルデヒド、10mM EDTA、0.05％キシレンシアノールFF、0.05％ブロモフェノールブルー）と混合し、次いで、0.５μｇの[γ³³P]でラベルした１kbのパーフェクトラダー(CHIMERx)に沿って1.2％のTBEアガロースゲルに載せ、そして、1 00Ｖの電圧を印加して、２時間、電気泳動せしめた。次に、ラボコンゴ(LaboCon go)ゲル乾燥器にて、30分間、ゲルを乾燥せしめた。そして、乾燥したゲルを、 −70℃で、３日間、オートラジオグラフにかけて、バンドを発色せしめた。約１ｇのハイブリドーマ細胞(Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and John Wi ley & Sons，New York(1990))から、メッセンジャーＲＮＡを単離した。実施例９Ａに記載の分析法において以下の変更を加えた。すなわち、Poly rA:dT₅₀に代えて0.5mMオリゴdT₅₀（スーパーテック、ベセスダ、メリーランド州）を、また、[3'-³H]dTTPに代えて0.05 mCi/ml［α³³P］dATPと混合したdNTPsを用いた。基質としてPoly rA:dT₅₀だけを用いた場合には、[3'-³H]dTTPを５mM[α³³P]dATPに代える置換のみを行った。各基質と各酵素の組み合わせでの、バックグラウンドを差し引いた沈殿数を、表６に示した。図７に示したように、組換えBca exo-断片による産物と比較して、天然および組換えBst exo-断片の双方による産物は、産物の量および長さの双方の点において大きかった。実施例10 nBst、rBstおよびrBcaExo-断片を用いたＤＮＡの配列決定一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡ鋳型を用いて内部ラベルするＤＮＡの配列決定において、Bst ＤＮＡ配列決定用キット（バイオラッド、ヘラクレス、カリフォルニア州）でのnBst、rBstおよびrBca Exo-を用いることで、天然および組換えBst exo-断片ならびに組換えBca exo-断片（パンベラ、マジソン）によるＤＮＡの配列決定の実行性を試験した。Ａ天然および組換えBst exo-断片ならびに組換えBca exo-断片のための一本鎖ＤＮＡの配列決定反応を、5.0単位の酵素を用いて実施した。まず、反応用カクテル溶液(12μl)、すなわち、2.0μlの一本鎖M13mp18ＤＮＡ(約0.4μｇ)、5.0μl の５×Bst配列決定反応用緩衝液(100mM Tris-塩酸、pH 8.6、100mM塩化マグネシウム)、1.0μlの[α³³P]-dATP(10mCi/ml)、5.0単位の酵素(2.5単位/溶液μlの2. 0μl)、および残余の水を含んだ反応用カクテル溶液を調製した。４つのd/ddNTP 混合物も調製した(Ａミックス：0.62μM dATP、62μM dCTP、62μM dGTP、62μM dTTP、25μM ddATP；Ｃミックス：0.8μMdATP、8μM dCTP、80pM dGTP、80μM dTTP、50μM ddCTP；Ｇミックス：0.8μM dATP、80pM dCTP、4μM dGTP、80μM dTTP、75μM ddGTP；Ｔミックス：0.８μM dATP、80pM dCTP、80μMdGTP、8μM dTTP、150μM ddTTP)。2.5μlの反応用カクテル溶液と予め適切にインキュベーションした２μlのd/ddNTP混合物を混合し、そして、65℃で、２分間、インキュベーションすることによって、配列決定のための反応を進行せしめた。インキュベーションを行った後に、２μlの１×チェース(Chase)溶液(0.5mM各dNTP)を添加し、緩やかに混合し、そして、さらに2.0分間インキュベーションを行った。4 .0μlの停止溶液（95％脱イオンホルムアルデヒド、10mM EDTA、0.05％キシレンシアノールFF、0.05％ブロモフェノールブルー）を添加して反応を終了し、そして、これを氷上に置いた。６％の配列決定用ゲルに載せる直前に、反応物を、90℃で、３分間加熱した。各試料の２μlをゲルに載せ、次に、2000 Ｖの電圧を印加して、1.5時間、電気泳動させた。このゲルをオートラジオグラフにかけて、解析を行った。図９Ａは、使用したすべての酵素について同じＤＮＡ配列が現れた、配列決定用ゲルの一部を示した写真である。３つすべての酵素について微小のバックグラウンドが、また、Bst酵素については強度の増大が認められた。Ｂ二本鎖ＤＮＡ鋳型を用いた内部ラベルを利用する配列決定での天然および組換えBst exo-断片の有用性を、[α³³P]dATPのラベル付けのプロトコールと二本鎖p UC19鋳型を用いた、配列決定法において実証した。プライマーの効率を向上すべく、２ug(18μl)のpUC19二本鎖ＤＮＡ鋳型を、２ μlの2M水酸化ナトリウムを添加して変性せしめ、次いで、室温にて、５分間インキュベーションした。この反応物を、２μlの2M酢酸ナトリウム、pH 4.6、を添加して中和し、沈殿せしめ、70％エタノールで洗浄し、風乾し、そして、７μ lの脱イオン水で再懸濁した。さらに、酵素を含まない反応用カクテル溶液を、7 0℃で、10分間加熱し、そして、室温にて、10分間冷却した。各酵素について、伸長／ラベル付けを利用した12μlの配列決定反応を、M13mp 18一本鎖ＤＮＡに代えて２μｇの変性したpUC18二本鎖ＤＮＡを用いた以外は、実施例10Ａに記載の方法と同一の方法で実施した。 6.0％の配列決定用ゲルにその２μlを載せる直前に、各反応物を、90℃で、３分間加熱した。その結果を、図9bに示した。微小のバックグラウンドと共に、15 0塩基を超える読み取り可能なpUC18の配列が認められた。実施例11 ＤＮＡポリメラーゼ酵素の作用特性の比較 Tabor et al.，J．Biol．Chem．262:16212-16213(1987)に記載の方法の変法を用いて、天然および組換えBst exo-断片ならびに組換えBca exo-断片の逆転写酵素活性の作用特性を比較した。ＤＮＡポリメラーゼ酵素の「作用特性」とは、酵素がＤＮＡ合成を触媒しつつ、鋳型に沿って作用する進度、すなわち、酵素の存在下でＤＮＡ重合が進行する速度である。分析の準備にあたって、反応用カクテル溶液、すなわち、2.5μｇM13mp18一本鎖ＤＮＡ、10μｌddATPミックス(2OμM dATP；各60μMのdCTP、dGTPおよびdTTP ；300μM ddATP)、2.5μ１γ³³Pでラベルした配列決定用の正プライマー(３μg/ μl)、10pｌ５×反応用緩衝液(100mM Tris-塩酸、pH8.6、100mM塩化マグネシウム)、および残余の水を含んだ反応用カクテル溶液を調製した。さらに、実施例１の記載に従って、希釈用緩衝液を用いて、0.25および0.025単位/mlの酵素溶液を得るべく、天然および組換えBst exo-断片ならびに組換えBca exo-断片の希釈液を調製した。分析を実施するために、7.0μlの反応用カクテル溶液を、2.0μlの希釈したＤＮＡポリメラーゼ酵素と混合した。一反応当たり、0.５または0.05単位のexo-断片を添加することで、酵素分子：鋳型分子＝約１：100と１：1000の比率にそれぞれ調整できる。かような低濃度のポリメラーゼを使用することで、ポリメラーゼ分子との拮抗による鋳型の「失活」を最小ならしめる。反応混合物を65℃でインキュベーションし、そして、1.0、3.0および6.0分後に2μlの試料を除去した。反応物に1.0μlの停止溶液（EDTA/DTT/ブロモフェノールブルー/キシレンシアノール）を添加して反応を停止し、90℃で、３分間加熱し、そして、６％の配列決定用ポリアクリルアミドゲルに載せた。このゲルを約２時間にわたって電気泳動し、そして、−70℃でオートラジオグラフにかけた。この分析では、作用特性の強いＤＮＡポリメラーゼ酵素は、オートラジオグラフにて、小さな移動度の（大きな）ラベルしたバンドが色濃く認められるが、作用特性の弱いＤＮＡポリメラーゼ酵素は、大きな移動度の（小さな）断片および／またはバンドが薄く認められるに過ぎない。酵素：基質＝１：1000の比率とし、6.0分間のインキュベーションを行った試験区に対応する、図10にて矢印で指し示したレーンを作用特性を決定するために用いた。図10は、rBca exo-が、電気泳動図の半分に至る速度が最も遅く、視覚で確認できる高分子量の産物を生成していないことを示している。これに対して、nBst exo-断片は、rBca exo-で生成された産物よりも、多くの高分子量および低分子量の産物を生成していた。さらに、図10は、rBst exo-断片が、動きが緩慢な高分子量のＤＮＡ分子を最も多く生成していることを示している。また、rBst exo-断片は、rBca exo-で生成された産物よりも、迅速に移動する低分子量のＤＮＡ分子も生成していた。作用特性に関しては、rBst exo-＞＞rBca exo-、およびrBst exo-＞nBst exo-の関係が認められる。図10に基づけば、作用特性は、rBst exo-＞nBst exo-＞rBca exo- の順で減少していった。よって、本願発明のrBst exo-断片（配列番号：２の第2 85〜876位のアミノ酸残基）が、試験した３つのexo-断片の中で最大の作用特性を発現したのである。実施例12 組換えバシラスステアロテルモフィルスexo-断片を用いた好熱的ストランド置換増幅 Walker，T.G．Emerial Aspects of Strand Displacement Amplification，Bec ton Dickenson Research Center，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1993)に記載の好熱的ストランド置換増幅(SDA)での、組換えBst exo-断片の機能性について試験を行った。このSDAの方法論は、米国特許第5,270,184号にも開示されている。改良されたSDA法は、米国特許第5,270,252 号と第5,455,166号にも開示されている。SDAの方法論に関するこれら３つの特許での開示は、参考までに、本明細書に取り入れた。結核菌のIS6110領域（ノースカロライナ州、リサーチトライアングルに所在のベクトンディッケンソン社のG.T．ウォーカー氏より取得）を含む標的プラスミドpSK4.3を、XbaI(MBR、ミルウォーキィー、ウィスコンシン州）で消化し、そして、ヒトの胎盤ＤＮＡ(Sigma)で連続的に希釈した。SDAを、50μlの反応物、すなわち、１×10⁶コピーの標的プラスミドＤＮＡ、500ngのヒトの胎盤ＤＮＡ、16 0単位のBsoB I(ニューイングランドバイオラボ)、８単位の組換えBst exo-ＤＮＡポリメラーゼ、各1.4mMのdCTPαS、dTTP、dGTP、dATP(ファルマシア、ミルウォーキィー、ウィスコンシン州)、35mM K₂PO₄、pH 7.6、0.1mg/mlの非アセチル化BSA、3mMTris-塩酸、10mM塩化マグネシウム、11mM塩化ナトリウム、0.3mM DTT 、４mM塩化カリウム、４％グリセロール、0.008mM EDTA、500mMのプライマーS1 とS2、そして、50nMのプライマーB1とB2（塩化カリウム、グリセロールおよびED TAには、BsoBI保存用緩衝液を利用した）を含む反応物にて実施した。BsoBIとrB st exo-ＤＮＡポリメラーゼの添加に先行して、不完全試料(35μl)を、100℃で、３分間加熱して変性せしめ、そして、60℃で、３分間、プライマーによるアニーリングを行った。BsoB IとBst ＤＮＡポリメラーゼを一緒に、ニューイングランドバイオラボ社の緩衝液(10mM Tris-塩酸、pH 7.9、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウム、１m M DTT)の15μlで、10.7単位/μlと0.53単位/μlにまで希釈した。SDAを、60℃で、20分間実行した。 100℃で５分間加熱することで、増幅を停止した。非SDAの対照試料は、試料を酵素添加後に直ちに沸騰水中で加熱することによって調製した。 SDAに続いて、増幅したIS6110標的配列の中央部分にハイブリダイズし、［γ-³² P]でラベルされた検出用プローブのＤＮＡポリメラーゼ伸長によって増幅産物を検出した。反応が完了した各SDA反応物の５μlを、反応混合物、すなわち、47 mMK₂PO₄、pH 7.6、各0.2mMのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、７mM塩化マグネシウム、0.1mg/ml BSAおよび[γ-³²P]でラベルした0.1μM検出用プローブを含む反応混合物の５μlに添加した。この試料を、100℃で２分間、次いで、37℃で２分間加熱した。1.0μl(９単位)のexo-クレノウポリメラーゼ(MBR、ミルウォーキィー、ウィスコンシン州)を添加し、そして、37℃で15分間インキュベーションすることによって、検出用プローブを診断レベルの長さにまで伸長した。11μlの変性停止溶液（95％脱イオンホルムアルデヒド、10mM EDTA、１mM DTT、0.05％ブロモフェノールブルー／キシレンシアノール）を添加し、そして、得られた各試料の11μlを、変性ゲル電気泳動法およびコダックX-ARSフィルムを用いて３時間にわたって行ったオートラジオグラフによって解析を行った。(図11を参照)。図 11に示したように、活性のrBst exo-断片(”rBst exo-”)の存在下では、59bpと40bpの間に増幅産物が認められたのに対して、負の対照("-C")では何ら検出されなかった。このように、本願発明のrBst exo-断片の好熱的ストランド置換増幅での有用性が明らかになった。実施例13 組換えBst exo-断片の大規模精製 35ｇの大腸菌[pPEK5]を、150mlの溶解用緩衝液(20mM Tris-塩酸、pH8.0、0.5m M EDTA、50mM塩化ナトリウム、１mM DTT、0.02％Brij-35、10mM塩化マグネシウム、0.1mg/mlリゾチーム、および1.0mMフェニルメチルスルホニルフルオリド）にて解凍した。細胞懸濁液を、４℃で、60分間攪拌した。均質な懸濁液を、超音波破砕を６回、すなわち、超音波破砕の間に30秒間の冷却時間を挟んで、超音波破砕を各30秒間行った。そして、熱不安定性のタンパク質を変性するために、細胞溶解物を、65℃で、15 分間加熱し、そして、氷上で15分間冷却した。細胞屑と変性したタンパク質を除去するために、9,000rpmで、60分間遠心分離した後に、上清を0.8/0.２μmの濾過ユニットに通して濾過し、そして、緩衝液Ａ、すなわち、20mM Tris-塩酸、pH 7.5、1.0mM DTT、0.1mM EDTA、10mM塩化マグネシウムおよび0.02％Brij-35で平衡化されている、予め装填したファルマシアの10×10Mono Qカラムに適用した。 100mlの緩衝液Ａで洗浄した後に、0.4M塩化ナトリウムでの緩衝液Ａに対する緩衝液Ａの90ml直線勾配を適用して、酵素を溶出した。１mlの画分を活性について検定し、そして、プールした。緩衝液Ａを濃縮して、Mono Sでの適用条件（pH 6.0での導電率が10ミリモー未満の緩衝液Ａ）に適合するために、pH 6.0での緩衝液Ａを用いて、Mono Qプールを30kD（分離）膜に通して濾過した。そして、このプールを、pH 6.0での緩衝液Ａで平衡化されている、予め装填したファルマシアの５×５Mono Sカラムに適用した。20mlの平衡用緩衝液で洗浄した後に、0.3M塩化ナトリウムにてpH 6.0の緩衝液Ａに対するpH 6.0の緩衝液Ａの90ml直線勾配を適用して、酵素を溶出した。１mlの画分を活性について検定し、12.5％SDS-PAGEによって純度を測定し、そして、プールした。このMono Sプールは、20倍体積の最終保存用緩衝液(20mMリン酸ナトリウム、pH 6.5、1.0 mM DTTおよび50％グリセロール）に対して、４℃で、終夜、透析を行った。タンパク質濃度は、ブラッドフォードプロテインアッセイ（バイオラッド社、ヘラクレス、カリフォルニア州）によって決定した。rBst exo-断片のＤＮＡポリメラーゼ比活性の計算値は、約150,000単位／mgであった。前述してきたプロトコールによって精製した組換え酵素の生物学的活性を、前出の実施例に記載の分析法を用いて検討した。実施例９に記載のエンドヌクレアーゼ活性の分析では、５，10および20単位の酵素で試みたところ、超螺旋のpBR3 22から線状への転換率は5.0％に満たなかった。実施例９に記載の他の分析による結果を、表８にまとめた。生物学的試料の寄託：以下のプラスミドは、ブダペスト条約の規定に従って、（米国）20852メリーランド州ロックビルパークローンドライブ12301に所在のアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に寄託されている。この寄託試料が入手できることは、いかなる国であっても、その国内特許法令に従って付与された権利に抵触する本発明の実施許諾とは解釈されない。特定の実施例と実施態様に関して本願発明を説明してきた。しかしながら、本願発明の要旨と特許請求の範囲を逸脱せずに、出願人の開示に基づいて、当業者からして自明であり、また当業者が想到するであろう本願発明の変更と置換までをも包含することを、本出願では意図している。

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Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：１に記載の精製および単離されたＤＮＡ。２．配列番号：１の316〜2946位のヌクレオチドからなる請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。３．配列番号：１の1135〜2946位のヌクレオチドからなる請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。４．請求の範囲第３項に記載のＤＮＡがプロモーターに作動可能に結合しているベクター。５．1135〜2946位のヌクレオチドからなるｃＤＮＡ。６．プラスミドｐＰＥＫ５。７．配列番号：１の316〜2946位のヌクレオチドおよび配列番号：１の1135〜294 6位のヌクレオチドから選択された発現可能な部分を保有するＤＮＡで形質転換した宿主細胞。８．前記宿主細胞が、前記ＤＮＡによってコードされた耐熱性ポリペプチドを発現でき、前記ポリペプチドが、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有している、請求の範囲第７項に記載の宿主細胞。９．前記宿主細胞が、原核細胞である請求の範囲第８項に記載の宿主細胞。 10．前記宿主細胞が、大腸菌(E．coli)の細胞である請求の範囲第９項に記載の宿主細胞。 11．配列番号：１の1135〜2946位のヌクレオチドに作動可能に結合しているプロモーターを含む発現ベクター。 12．配列番号：１の1135〜2946位のヌクレオチドから必須的になる挿入体を少なくとも１つ有する、請求の範囲第10項に記載の発現ベクター。 13．配列番号：２に記載のバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩタンパク質の精製した断片であって、前記断片が、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性と、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有しており、また、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いており、かつポリメラーゼに対する逆転写酵素の比率が１〜３の間である精製した断片。 14．前記断片が、rBst exo^-である請求の範囲第13項に記載の断片。 15．プラスミドpPEK５の挿入体によってコードされたバシラスステアロテルモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩタンパク質の精製した断片。 16．前記断片が、50,000単位／タンパク質(mg)〜500,000単位／タンパク質(mg) のＤＮＡポリメラーゼ活性を有している請求の範囲第15項に記載の精製した断片。 17.単離および精製した耐熱性の組換えポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有しており、また、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド。 18．配列番号：２に記載の274〜876位のアミノ酸残基から必須的になる組換えポリペプチド。 19．凍結乾燥形態の請求の範囲第18項に記載のポリペプチド。 20．溶液形態の請求の範囲第18項に記載のポリペプチド。 21．ｃＤＮＡを熱サイクル的に増幅する方法において、該方法が、水性サンプル中にて前記ＤＮＡを増幅するために、好熱性のTaqＤＮＡポリメラーゼまたはその断片を利用することを含み、その改良が、前記TaqＤＮＡポリメラーゼまたはその断片を、配列番号：２に記載の274〜876位のアミノ酸残基を有する耐熱性の組換えポリペプチドと置換することを含むｃＤＮＡを増幅する方法。 22．ＤＮＡの熱サイクル的増幅が、ストランド置換増幅によって実施される請求の範囲第21項に記載の方法。 23．ＤＮＡの熱サイクル的増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される請求の範囲第21項に記載の方法。