DE69233253T2

DE69233253T2 - Verfahren zum Klonieren eines Pol-I-Typ DNS-Polymerase-Gens

Info

Publication number: DE69233253T2
Application number: DE69233253T
Authority: DE
Inventors: Yoshizumi Takatsuki-shi Ishino; Kayo Koga-gun Fujita; Takashi Otsu-shi Uemori; Ikunoshin Uji-shi KATO
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1991-06-03
Filing date: 1992-05-27
Publication date: 2004-08-26
Anticipated expiration: 2012-05-28
Also published as: EP0517418A3; DE69233253D1; US5436326A; US5753482A; EP0517418A2; EP0517418B1; EP1233061A2; EP1233061A3

Description

Gewerbliches Verwendungsgebiet
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren, wie die Gene für Pol-I-Typ DNS-Polymerasen kloniert werden, welche sehr nützlich sind für die Gentechnikforschung (genetic engineering research), und sie betrifft auch Gene, die für eine neue Pol-I-Typ DNS-Polymerase kodieren.
Stand der Technik
Basierend auf segmentellen Ähnlichkeiten in den Aminosäurensequenzen wurden DNS-Polymerasen in zwei Hauptgruppen klassifiziert; die Escherichia coli DNS-Polymerase-I-Familie (Pol-I-Typ) und die eukaryotische DNS-Polymerase-α-Familie (α-Typ).
DNS-Polymerasen, die weithin als Reagenz in der Gentechnikforschung verwendet werden, beinhalten gegenwärtig DNS-Polymerase-I von Escherichia coli; Klenow-Fragment, welches eine modifizierte Form ist; DNS-Polymerase von T4-Phagen; DNS-Polymerase von T7-Phagen; hitzestabile DNS-Polymerase von Thermus aquaticus (Tag-Polymerase) etc. Die meisten von diesen gehören zur Pol-I-Familie. Diese Enzyme werden dazu verwendet, spezifische DNS zu markieren oder um DNS-Basensequenzen zu identifizieren, entsprechend ihren enzymatischen Eigenschaften.
Durch die Erfindung zu lösendes Problem
Gewöhnlich unterscheiden sich die Verfahren für die Verwendung von DNS-Polymerase, abhängig von der Spezifität des Enzyms, welche für Enzyme unterschiedlicher Ursprünge variieren. Zum Beispiel hat Bacillus caldotenax eine optimale Wachstumstemperatur von ungefähr 70°C, so daß die Pol-I-Typ DNS-Polymerase von diesem Bakterium wahrscheinlich bei hohen Temperaturen stabil ist, und sie sollte nützlich sein als eine Reagenz zur Verwendung in der Gentechnikforschung.
Jedoch sind Details über die Eigenschaften dieser DNS-Polymerase nicht bekannt, und ein Verfahren für seine Bereitstellung ist nicht verfügbar. Die Struktur des Gens, das für diese DNS-Polymerase kodiert, und die Aminosäurensequenz des Enzyms sind nicht bekannt, und es ist kein Verfahren etabliert worden, durch das das Gen, ligiert mit einem Vektor und exprimiert durch die Gentechnik, isoliert werden kann.
Diese Erfindung kann ein simples und effizientes Verfahren zur Klonierung von Genen bereitstellen, die für neuartige Pol-I-Typ DNS-Polymerasen kodieren, und kann die Sequenz des Gens, das für eine neue Pol-I-Typ DNS-Polymerase kodiert, bereitstellen.
Schritte, die zum Lösen des Problems vorgenommen wurden
Diese Erfindung stellt ein isoliertes Gen bereit, das für eine Pol-I-Typ DNS-Polymerase kodiert, die resistent gegen Wärmebehandlung bei 60 °C für 20 min. ist und die eine 3'→5'-Exonukleaseaktivität aufweist, worin das isolierte Gen von dem Plasmid pUI101 erhältlich ist. Die Erfindung stellt weiterhin ein isoliertes Gen bereit, das für eine Pol-I-Typ DNS-Polymerase kodiert, die resistent gegen Wärmebehandlung bei 60°C für 20 min. ist, und welche von dem Plasmid pUI205 erhältlich ist. Das Plasmid pU101 ist beherbergt in Escherichia coli HB101/pUI101, hinterlegt unter FERM BP-3721. Das Plasmid pUI205 ist beherbergt in Escherichia coli HB101/pUI205, hinterlegt unter FERM BP-3720.
Das Verfahren zur Klonierung der Gene der vorliegenden Erfindung kann einfach und effektiv ausgeführt werden, auch wenn die Struktur des Gens und die Aminosäuresequenzen des Genprodukts des erwünschten Pol-I-Typ DNS-Polymerasegens unbekannt sind. Durch Gestaltung eines Primerpaares für die Verwendung in der Amplifikation der DNS-Polymerasegene durch die PCR, und mit der Verwendung dieser Primerpaare, ist es möglich, einen Teil von unbekannten DNS-Polymerasegenen zu amplifizieren, und das erwünschte Pol-I-Typ DNS-Polymerasegen kann durch die Verwendung des amplifizierten Gens als Probe kloniert werden; durch die Klonierung des Gens ist es möglich, Pol-I-Typ DNS-Polymerase durch die Verfahren der Gentechnik bei hoher Ausbeute zu erhalten.
Im folgenden ist diese Erfindung im Detail beschrieben.
Als Verfahren für die Auswahl der erwünschten DNS-Fragmente werden zuerst die publizierten Aminosäurensequenzen der bekannten Pol-I-Typ DNS-Polymerasen miteinander verglichen, und basierend auf gemeinsame Aminosäuresequenzen, die gefunden wurden, werden Oligodeoxyribonucleotide synthetisiert. Die Aminosäurensequenzen für Pol-I-Typ DNS-Polymerasen können beispielsweise gefunden werden im Journal of Biological Chemistry, Ausgabe 257, 1958–1964 (1982), Journal of Molecular Biology, Ausgabe 166, 477–535 (1983), Journal of Biological Chemistry, Ausgabe 264, 6427–6437 (1989) und Journal of Biological Chemistry, Ausgabe 264, 4255–4263 (1989). Es sind die Sequenzen für DNS-Polymerasen von Escherichia coli bzw. T7-Phage, Thermus aquaticus und Streptococcus pneumoniae.
Die Sequenzen, die als SEQ ID NO 1 und 2 in der Sequenzliste gezeigt werden, sind die Sequenzen von gemischten Primern zur Verwendung in der PCR, die durch die Erfinder dieser Erfindung entwickelt wurden basierend auf konservierten Sequenzen in Pol-I-Typ DNS-Polymerasen. Die Sequenz, die als SEQ ID NO 1 in der Sequenzliste gezeigt ist, ist ein gemischter Primer, der von den Erfindern als konservierte Sequenz in Pol-I-Typ DNS-Polymerasen gefunden wurde; d. h., er wurde entwickelt basierend auf Aminosäurensequenzen, die als SEQ ID NO 3 bis 6 in der Sequenzliste gezeigt sind. Die Sequenz, die als SEQ ID NO 2 in der Sequenzliste gezeigt ist, ist ein gemischter Primer, der als konservierte Sequenz in einer anderen Region von Pol-I-Typ DNS-Polymerasen gefunden wurde; d. h., er wurde basierend auf Aminosäurensequenzen, die als SEQ ID NO 7 bis 10 in der Sequenzliste gezeigt sind, gefunden. Diese Primerpaare können dazu verwendet werden, das Pol-I-Typ DNS-Polymerasegen von beispielsweise Escherichia coli, T7-Phage, Thermus aquaticus und Streptococcus pneumoniae mit Effizienz zu amplifizieren. Es ist möglich, dieses Primerpaar als Primer in der PCR zu verwenden, die zur Klonierung des Pol-I-Typ DNS-Polymerasegens gemacht wurde. Die Primer, die in dieser Erfindung verwendet werden können, können beliebige Primer sein, die mit den konservierten Sequenzen dieser Gene hybridisieren und diese Gene mit Effizienz amplifizieren, beliebige Primer, die von den oben beschriebenen gemischten Primern abgeleitet sind, beliebige Primer, die basierend auf andere konservierte Sequenzen entwickelt wurden, oder beliebige Kombinationen von Primern, die von konservierten Sequenzen und Vektoren konzipiert sind.
Klonierung der Gene für Pol-I-Typ DNS-Polymerasen, Transformation des E. coli-Wirtsstamms durch das Plasmid, das die Gene für die Polymerasen enthält, und die Reinigung der Polymerasen kann durch die folgenden Schritte, die als Beispiel angegeben sind, ausgeführt werden.

1. Chromosomale DNS wird von Zellen, die beliebige Pol-I-Typ DNS-Polymerase enthalten, isoliert.
2. Oligonukleotidprimer zur Verwendung in der Pol-I-Typ DNS-Polymerasegenamplifikation, die als SEQ ID NO 1 und 2 in der Sequenzliste gezeigt sind, deren Sequenzen auf die Region, die für DNS-Polymerase kodiert, basieren, werden vorbereitet, und die Polymerasekettenreaktion (PCR) wird mit der DNS durchgeführt, die im obigen Schritt 1 als Vorlage (template) erhalten wurde.
3. Die DNS, die im obigen Schritt 1 erhalten wurde, wird mit geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten, die erhaltenen Fragmente werden als Proben zum Screenen der DNS-Fragmente, die in Schritt 2 erhalten wurden, verwendet, und die erwünschten DNS-Fragmente werden erhalten.
4. Vektoren werden mit passenden Restriktionsenzymen geschnitten, und die DNS, die in Schritt 3 erhalten wurde, wird in die Schnittstelle ligiert.
5. Vektoren mit den ligierten DNS-Fragmenten werden in Wirtszellen eingeführt, und Transformanten, die die erwünschten DNS-Fragmente enthalten, werden ausgewählt.
6. Aus den Transformanten, die in Schritt 5 hergestellt wurden, werden Plasmide isoliert, die erwünschten DNS-Fragmente werden, wenn notwendig, entfernt, und basierend auf der Restriktionskarte (restriction map) wird das erwünschte Gen vollkommen durchgängig als genomisches Fragment wiederhergestellt, und dieses wird, wie in Schritt 4 zusammengefaßt ist, in einen Expressionsvektor ligiert.
7. Expressionsvektoren, die das erwünschte DNS-Fragment enthalten, werden, wie in Schritt 5 beschrieben, in Wirtszellen eingeführt, um Transformanten zu ergeben.
8. Die Transformanten, die in Schritt 7 erhalten wurden, werden kultiviert und produzieren DNS-Polymerase in E. coli-Zellen.
9. Exonuklease III wird, wenn notwendig, verwendet, um Polymerase herzustellen, in welcher die 5'→3'-Exonuklease kodierende Region von der Region, die für die vollständige DNS-Polymerase kodiert, fehlt.
10. Die Expressionsvektoren, die in Schritt 9 erhalten wurden, werden in Wirtszellen eingeführt um Transformanten herzustellen, und die Transformanten stellen mutierte DNS-Polymerase her.
11. Der Transformant, der in Schritt 10 erhalten wurde, wird kultiviert, und die mutierte DNS-Polymerase wird aus den kultivierten Zellen gereinigt.

Der verwendete Bakterienstamm kann beliebiger DNS-Polyrnerase herstellender Bakterienstamm sein, wie beispielsweise Bacillus caldotenax YT-G (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Zugangsnummer (accession number) DSM406).
Verwendend als ein Beispiel B. caldotenax YT-G ist nachfolgend die Erläuterung.
DNS von dem Stamm, der zur Produktion der erwünschten DNS verwendet wird, B. caldotenax YT-G (DSM406) wird aus einer Bakterienkultur, die unter Schütteln bei 70°C kultiviert wurde, extrahiert. Extraktion, Reinigung, das Schneiden mit Restriktionsenzymen und dergleichen kann mit beliebigen der publizierten Verfahren durchgeführt werden, wie beispielsweise die in Molecular cloning: A laboratory manual von T. Maniastis et al., auf Seite 75–178 (Cold Spring Harbor Press, 1982) publizierten.
Die Erfinder dieser Erfindung verwendeten als Primer die zwei Oligonukleotide mit den SEQ ID NO 1 und 2 in der Sequenzliste, welche auf gemeinsame Aminosäurensequenzen, die durch Vergleich gefunden wurden, basieren. Die Erfinder verwendeten DNS von B. caldotenax für die Vorlage (template) in der PCR, um spezifische DNS-Fragmente zu amplifizieren, und sie fanden, daß die Aminosäurensequenz, die abgeleitet war von der Basensequenz der erhaltenen DNS-Fragmente, sehr ähnlich war zu der von anderen bekannten DNS-Polymerasen. Diese DNS-Fragmente können als Hybridisierungsproben verwendet werden, um die erwünschte DNS auszuwählen.
Das für die Auswahl verwendete Hybridisierungsverfahren kann ein beliebiges der publizierten Verfahren sein, wie das auf Seite 309 des oben erwähnten Buches, Molecular Cloning; A laboratory manual.
Das Gen für die erwünschte DNS-Polymerase kann sich durch Southern Hybridisierung in Restriktionsfragmenten von B. caldotenax befinden, und die ausgewählten Restriktionsenzyme, wie EcoRI, BamHI, HincII, HindIII, XhoI, PstI und PvuII können zum Verdau der B. caldotenax DNS verwendet werden, welche dann in Plasmidvektoren ligiert wird. Die Plasmidvektoren können beliebige der bekannten sein, wie beispielsweise pUC18, pUC19, pTV118N etc.; die Plasmidvektoren, die verwendet werden können, sind nicht auf diese Liste beschränkt. Die verwendete Vorgehensweise, um das DNS-Fragment einzufügen, kann beliebiges der bekannten Verfahren sein, wie die Verwendung einer Enzymreaktion mit DNS-Ligase für die Einfügung (insertion).
Als nächstes werden die rekombinanten Plasmide in Wirtszellen von Escherichia coli oder in beliebigem Wildstamm oder mutiertem Stamm von Wirtszellen, die transformiert werden können, eingebracht; es ist wünschenswert, einen Mutanten zu verwenden, der in dem Restriktionssystem defekt ist (Restriktion^–, Modifikation⁺). Die verwendete Vorgehensweise für die Einführung kann ein beliebiges der bekannten Verfahren sein, wie das auf Seite 250 des oben erwähnten Buches Molecular Cloning; A laboratory manual.
Auf diese Art und Weise wird das erwünschte DNS-Fragment in Wirtszellen eingeführt, und die Klone werden entsprechend den Charakteristikas des verwendeten Plasmidvektors ausgewählt; wenn z. B. pUC18 verwendet wird, werden Kolonien auf Ampicillinresistenz ausgewählt. Durch dieses Verfahren ist es möglich, Gruppen von Zellen zu erhalten, in welchen die erwünschte DNS kloniert ist. Von den erhaltenen Kolonien können Klone, die das erwünschte Fragment haben, ausgewählt werden. Das Selektionsverfahren ist die Koloniehybridisierung mit einer Vielfalt an Vektoren, und wenn die Plaquehybridisierung verwendet wird, kann beliebiges der veröffentlichten Verfahren verwendet werden.
Drei Klone wurden ausgewählt; und Verdau mit Restriktionsenzymen und Analyse der erhaltenen Ergebnisse (daß sie HincII-Fragmente, HindIII-Fragmente oder XhoI-Fragmente hatten) ergab die Basis, auf welcher die drei Fragmente in dem Teströhrchen erneut verbunden wurden, was ein durchgängiges DNS-Fragment erbrachte, das DNS-Fragment wurde mit dem Expressionsvektor pTV118N ligiert, was einen erwünschten Klon erbrachte. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wurde pUI101 genannt.
E. coli-Zellen, die das Plasmid pUI101 enthalten, wurden kultiviert, und ein unverarbeitetes Extrakt der abgeernteten Zellen wurde erhalten.
Das Extrakt wurde bei 60°C für 20 min. behandelt, danach wurde wärmebehandelte DNS-Polymeraseaktivität weiterhin gefunden, obwohl ein Zellextrakt von E. coli allein mit dem Expressionsvektor (ohne das erwünschte DNS-Fragment) keine solche Aktivität hatte. Dies zeigte, daß die pUI101 tragenden Bakterienzellen eine hitzeresistente DNS-Polymerase herstellen, und daß das Gen für die Kodierung von diesem Enzym in der Tat in den Zellen von E. coli exprimiert wurde.
Die Konstruktion des Plasmids pUI101 war wie in 1 gezeigt. Das Gen, das für die DNS-Polymerase kodierte, war in einem NcoI-Fragment von ungefähr 3,5 Kilobasen im Plasmid pUI101, und die Restriktionskarte dieses NcoI-Fragments ist in 2 gezeigt. Seine Basensequenz ist als SEQ ID NO 11 in der Sequenzliste gezeigt. Die Zellen von E. coli, die am besten als Wirtszellen wuchsen wenn sie mit pUI101 transformiert wurden, waren E. coli HB101, und die transformierten Zellen wurden als Escherichia coli HB101/pUI101 benannt, und sie wurden als FERM BP-3721 an dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt.
Wenn pUI101 tragende E. coli-Zellen kultiviert werden, ist es möglich hitzeresistente DNS-Polymerase von den kultivierten Zellen zu erhalten, die eine große Menge solch einer hitzeresistenten DNS-Polymerase exprimieren. Das Verfahren für die Reinigung der DNS-Polymerase kann beispielsweise sein, Beschallung der kultivierten Zellen, Wärmebehandlung der beschallten Suspension, Säulenchromatographie auf DEAE-Zellulose, Säulenchromatographie auf Phosphozellulose, um eine einzelne Bande an DNS-Polymerase auf SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) zu ergeben.
Die erhaltene DNS-Polymerase ist ein Polypeptid, das in der Position des Molekulargewichts von 100.000 in der SDS-PAGE ist. Seine DNS-synthetische Aktivität beinhaltet die von 3'-5'-Exonuklease und die von 5'→3'-Exonuklease.
Die Aminosäuresequenz des erhaltenen gereinigten Proteins wurde analysiert, und es war möglich, die N-terminale Aminosäuresequenz zu identifizieren. Die Sequenz ist als SEQ ID NO 12 in der Sequenzliste gezeigt. Die Aminosäuresequenz wurde in dem Translationsrahmen des oben erwähnten NcoI-Fragments gefunden, die Sequenz, welche SEQ ID NO 13 in der Sequenzliste ist. Das Strukturgen der DNS-Polymerase dieser Erfindung wurde identifiziert, und seine vollständige Aminosäuresequenz wurde gefunden, und sie ist als SEQ ID NO 14 in der Sequenzliste gezeigt.
Wenn DNS-Polymerase von E. coli-Transformanten studiert wurde, schien es, daß die 5'→3'-Exonukleaseaktivität in einer Amino-terminalen Domäne des Polypeptids anwesend war, so daß DNS-Fragmente von B. caldotenax in pUI101 angesetzt wurden, denen ein definierter Teil des DNS-Fragments fehlten, und diese wurden dazu verwendet, E. coli zu transformieren, welche nach wie vor DNS synthetische Aktivität hatten, aber Klone, denen die 5'→3'-Exonukleaseaktivität fehlte, konnten ausgewählt werden. Um das Selektionsplasmid bereitzustellen, kann das Verfahren von Henicoff, veröffentlicht in Gene, Ausgabe 28, 351–359 (1982), verwendet werden. Das ausgewählte Plasmid wurde pUI205 benannt, und es wurde zur Transformation von E. coli-Zellen verwendet, welche als Escherichia coli HB101/pUI205 (FERM BP-3720) an dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt wurden.
Die pUI205 tragenden E. coli-Zellen können kultiviert werden, und hitzeresistente DNS-Polymerase kann von den kultivierten Zellen erhalten werden, welche eine große Menge solch hitzeresistenter DNS-Polymerase exprimieren. Es ist möglich, die DNS-Polymerase von den kultivierten Zellen durch die oben beschriebenen Verfahren oder dergleichen zu reinigen, bis das Enzym eine einzelne Bande auf einem SDS-PAGE ergibt.
Durch Aminosäureanalyse des gereinigten Proteins ist es möglich, die N-terminale Aminosäuresequenz zu identifizieren. Diese Sequenz ist als SEQ ID NO 15 in der Sequenzliste gezeigt. Dieser Sequenz fehlen die 284 Aminosäuren von Met1 bis Lys284 der SEQ ID NO 14 der Sequenzliste. Die vollständige Aminosäuresequenz des Gens, das für diese mu tierte Form der DNS-Polymerase kodiert, wurde identifiziert. SEQ ID NO 16 der Sequenzliste ist die Basensequenz, die für die mutierte DNS-Polymerase kodiert, und SEQ ID NO 17 der Sequenzliste ist die Aminosäuresequenz der mutierten Form des Enzyms.
Es ist möglich, die hitzeresistenten Enzyme in industriellem Maßstab bereitzustellen, weil durch die Kultivierung von E. coli HB101/pUI101 oder E. coli HB101/pUI205 1 ml der Kulturbrühe 127 Units oder 212 Units der DNS-Polymeraseaktivität erbrachte (die nicht-mutierte Form bzw. die mutierte Form).
Wie im Detail oben beschrieben, sind die folgenden üblichen Schritte zur Klonierung des Gens für Pol-I-Typ-Polymerase nicht notwendig:

(a) Überprüfung der Produktion von Pol-I-Typ-DNS-Polymerase;
(b) Isolierung des Enzyms;
(c) Identifikation einer partiellen Aminosäuresequenz;
(d) Synthese einer Probe aus der identifizierten Aminosäuresequenz.

Ohne die Verwendung dieser Schritte kann das Gen für die erwünschte Pol-I-Typ-DNS-Polymerase einfach und effektiv erhalten werden.
1 ist ein Schaubild der verwendeten Vorgehensweise, um pUI101 zu gestalten. 2 ist eine Restriktionskarte (restriction map) des Gens für DNS-Polymerase, das in pUI101 kloniert wurde. 3 ist eine Restriktionskarte des Gens für DNS-Polymerase, das in pUI205 kloniert wurde.
Beispiele.
Nachfolgend wird die Erfindung mit Bezugnahme zu Beispielen erklärt, aber die Erfindung ist nicht dahingehend zu verstehen, daß sie auf diese Beispiele begrenzt ist.
Beispiel 1.
Zwei Oligodeoxyribonukleotide, die die Sequenzen haben, die als SEQ ID NO 1 und 2 in der Sequenzliste gezeigt sind, wurden synthetisiert und als PCR-Primer gereinigt. Im nächsten Schritt wurde die PCR durchgeführt, verwendend genomische DNS, die von E. coli, T7-Phage, T. aquaticus, T. thermophilus, S. pneumoniae, Bacillus subtilis, B. stearothermophilus, B. caldolyticus, Lactobacillus bulgaricus, L. homohiochii und L. heterohiochii als Vorlagen aufbereitet wurden. Jedes Reaktionsgemisch enthielt 100 pmol von jedem Oligonukleotidprimer und 1 ng der genomischen DNS in 100 μl Volumina. 30 Durchläufe der PCR wurden durchgeführt, mit jedem Durchlauf bestehend aus 30 sec. bei 95°C, 1 min. bei 55°C und 2 min. bei 72°C. Danach wurden 5 μl Portionen von jedem Reaktionsgemisch direkt auf ein 0,8%iges Agarosegel aufgetragen. Alle diese PCR-Reaktionen führten zu einem ungefähr 800 bp-Produkt. Diese Fragmente wurden in eine SmaI-Stelle eines M13-Vektors kloniert, und die Nukleotidsequenzen wurden untersucht.
Beispiel 2.
2-1. Zubereitung chromosomaler DNS von B. caldotenax
Zuerst wuchs B. caldotenax YT-G in 125 ml L-Medium (10 g/l Bactotrypton, 5 g/l Hefeextrakt und 5 g/l NaCl, bei pH 7,2) unter Schütteln bei 65 °C über Nacht, und die bakteriellen Zellen wurden abgeerntet und in 4 ml von 25% Sucrose enthaltend 0,05 M Tris-HCl (pH 8,0) suspendiert. Zu der Suspension wurden 800 μl Lysozym (5 mg/ml) hinzugegeben, und das Gemisch wurde bei 20°C für 1 Std. stehengelassen. Danach wurden 24 ml SET-Lösung (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA und 150 mM NaCl) hinzugegeben, gefolgt von 4 ml 5% SDS und 400 μl Proteinase K (10 mg/ml) Zugabe, und das Gemisch wurde bei 37°C für 1 Std. verwahrt. Nach Phenolextraktion und Chloroformextraktion wurde Ethanol hinzugegeben, um große DNS-Fragmente zu präzipitieren, welche von der Suspension mit einem sterilen Zahnstocher entfernt wurden. Durch diese Vorgehensweise wurde 3,1 mg DNS erhalten.
2-2. Amplifikation spezifischer DNS durch die PCR
Mit 100 pmol von jedem der zwei Oligodeoxyribonukleotide, die in der Sequenzliste als SEQ ID NO 1 und 2 gezeigt sind, und mit 1 ng DNS von B. caldotenax in einem Totalvolumen von 100 μl wurden 30 Durchläufe der PCR durchgeführt, mit jedem Durchlauf bestehend aus 30 sec. bei 95°C, 1 min. bei 55°C und 2 min. bei 72°C. Danach wurden 5 μl des Reaktionsgemisches als Probe entnommen und durch eine Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Analyse zeigte, daß ein 600 Basenpaar großer DNS-Fragment spezifisch amplifiziert wurde. Dieses DNS-Fragment wurde in M13mp18 ligiert, wobei der Phagenvektor mit SmaI geschnitten war. Die Basensequenz wurde mit dem Dideoxyverfahren festgestellt.
2-3. Detektion des erwünschten Gens durch das genomische Southern Verfahren
DNS von B. caldotenax wurde mit 5 μg von jedem der folgenden Enzyme verdaut: EcoRI, BamHI, HindIII, HincII, XhoI, PstI und PvuII. Der Verdau wurde durch Agarosegelelektrophorese behandelt. Die DNS in dem Gel wurde auf eine Nylonmembran übertragen, und dann wurde die Hybridisierung mit dem oben beschriebenen 600 Basenpaar DNS-Fragment durchgeführt, das als Probe bei der PCR erhalten wurde. Die Probe wurde durch das zufällige Primingverfahren (random priming method) radioaktiv markiert. Die Hybridisierung wurde in 6 × SSC durchgeführt, das 1% SDS, 5 × Denhardtslösung und 10 μg/ml Kälberthymus-DNS enthielt, bei 65°C für 5 Std. Danach wurde die Membran in 1 × SSC, enthaltend 0,1% SDS, für 1 h gewaschen und dazu verwendet einen Röntgenfilm zu belichten, der ein Autoradiogramm ergab.
2-4. Klonierung der DNS-Fragmente enthaltend die Gene für DNS-Polymerase
Um die während der genomischen Southern Analyse als positiv festgestellten DNS-Fragmente zu klonieren, wurde das 2,40-kb HindIII-Fragment, das 1,45-kb HincII-Fragment und das 2,1-kb XhoI-Fragment der DNS von B. caldotenax durch Verdau von 100 μg von jeder DNS mit dem erforderlichen Restriktionsenzym (HindIII, HincII oder XhoI), wie angemessen, erhalten, und die DNS der erwünschten Größen wurden durch Elektrophorese auf einem Agarosegel erhalten. Die Einsammlung erfolgte durch Absorption auf Glasperlen. Das Plasmid pTV118N wurde mit den gleichen drei Enzymen linearisiert, und Alkalinphosphatase wurde verwendet, um die phosphorylierten Reste an den Enden zu entfernen. Danach wurde die DNS mit DNS-Ligase in den Vektor ligiert, und die Vektoren wurden in Zellen von E. coli JM109 eingeführt. Die erhalte nen Transformanten wurden dann durch Koloniehybridisierung behandelt zur Auswahl der erwünschten Klone.
Ab 50 bis 200 Kolonien der Rekombinanten, die auf einer Nylonmembran wuchsen, wurden in einem Gemisch aus 0,5 N Natriumhydroxid und 1,5 M Natriumchlorid denaturiert, und sie wurden dann in ein Gemisch aus 1 M Tris-HCl und 1,5 M Natriumchlorid (pH 7,0) neutralisiert. Die DNS wurde auf der Membran mit ultraviolettem Licht fixiert. Die Zubereitung der Probe und die Hybridisierungsbedingungen waren die gleichen wie jene, die in der genomischen Southern Analyse verwendet wurden.
2-5. Restriktionsanalyse der klonierten Fragmente und Rekonstitution des DNS-Polymerasegens
Von den Ergebnissen der Restriktionskarte der drei erhaltenen DNS-Fragmente wurde festgestellt, daß die Fragmente überlappten, wenn sie in der Anordnung des HincII-Fragments, des HindIII-Fragments und des XhoI-Fragments angeordnet wurden. Die Fragmente bildeten einen fortlaufenden Teil der chromosomalen DNS. Die Restriktionsstellen wurden so ausgewählt, daß unnötige Teile soweit als möglich beseitigt werden konnten, und die drei DNS-Fragmente wurden in den Vektor pTV118N gleichzeitig ligiert, wie in 1 gezeigt. Auf diese Art und Weise wurde ein Plasmid, das ungefähr 3,5 kb des DNS-Fragments enthielt, beinhaltend das Gen für DNS-Polymerase, konstruiert und pUI101 benannt.
1 zeigt den Aufbau von pUI101. 2 zeigt die Restriktionskarte des NcoI-DNS-Fragments, welches das Gen für DNS-Polymerase beinhaltete, das in pUI101 kloniert wurde.
Als nächstes wurde dieses Plasmid dazu verwendet, Zellen von E. coli HB101 zu transformieren, und die Transformanten wurden als Escherichia coli HB101/pUI101 (FERM BP-3721) hinterlegt.
2-6. Kultivierung der Transformanten und Zubereitung eines groben Extraktes
Zellen von E. coli HB101 (FERM BP-3721), welche das oben beschriebene rekombinante Plasmid pUI101 beinhalteten, wurden bei 37°C in 5 ml L-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, kultiviert. Wenn die optische Dichte der Kulturbrühe 0,6 (A₆₀₀) erreichte, wurde Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG), das Derivat der Substrate für β-Galactosidase, zu der Kultur hinzugegeben, und die Kultivierung wurde für weitere 15 Std. fortgesetzt.
Zellen in 1 ml der Kulturbrühe wurden abgeerntet und in 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), enthaltend 25% Sucrose, gewaschen. Die Zellen wurden erneut in der gleichen Lösung lysiert, zu der das gleiche Volumen an Lysislösung (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 25% Sucrose, 60 mM Spermidin-HCl, 20 mM Natriumchlorid und 12 mM Dithiothreitol) hinzugegeben wurde, und das Gemisch wurde für 45 min. bei 4°C stehengelassen. Dann wurden 20 ml 5% (Gewicht/Volumen) Triton X100 zu dem Gemisch hinzugegeben, welches für 5 min. bei 37°C stehengelassen wurde. Der durch Zentrifugation erhaltene Überstand wurde für 20 min. bei 60°C inkubiert und erneut zentrifugiert. Der in diesem Schritt erhaltene Überstand war das grobe Extrakt.
2-7. Assay für DNS-Polymeraseaktivität
Ein Reaktionsgemisch wurde vorbereitet, das 67 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 6,7 mM Magnesiumchlorid, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 20 μM aktivierte DNS, 33 μM jedes dATP, dCTP, dGTP und TTP, und 60 nM [³H] TTP enthielt. Eine angemessene Menge des groben Extrakts wurde zu 150 μl dieser Lösung hinzugegeben, und der Reaktion wurde erlaubt, für 5 min. bei 60°C stattzufinden, nach der die Reaktion durch Zugabe von 1 ml eines Gemisches aus 50 mM Pyrophosphorsäure und 10% Trichloressigsäure gestoppt wurde. Das Reaktionsgefäß wurde für 5 min. auf Eis plaziert, und das vollständige Reaktionsgemisch wurde auf einem Glasfilter unter reduziertem Druck filtriert. Der Filter wurde mehrere Male mit 10% Trichloressigsäure und bevor er getrocknet wurde mit 70 Ethanol gewaschen, und zur Auszählung der Radioaktivität in einen Flüssigszintillationszähler gelegt. Es waren 127 Units DNS-Polymeraseaktivität in 1 ml der Kulturbrühe.
2-8. Herstellung von hitzeresistenter DNS-Polymerase durch Plasmid pUI101 tragende E. coli-Zellen
Aus 2,2 g E. coli HB101/pUI101-Zellen wurden 20 ml des groben Extraktes durch die in Beispiel 2–6 beschriebenen Verfahren erhalten. Dieses Extrakt wurde bei 60°C für 30 min. inkubiert, und das durch Wärme denaturierte Protein wurde durch Zentrifugation für 10 min. bei 10.000 × g entfernt. Zu dem Überstand wurde Ammoniumsulfat hinzugegeben, und die bei 30 bis 80% Sättigung präzipitierte Fraktion wurde gegen DE-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,0, 0,2 mM 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerol und 4 μM Phenylmethansulfonylfluorid) dialysiert. Danach wurde der gleiche Puffer dazu verwendet, eine 15 ml DE52 (Whatman)-Säule zu equilibrieren, und das Extrakt wurde aus der Säule mit einem linearen Gradienten aus NaCl-Konzentration von 0 bis 300 mM eluiert. Dann wurde die DNS-Polymeraseaktivität durch das Verfahren aus Beispiel 2-7 untersucht. Die Aktivität enthaltenden Fraktionen des DE-Puffers wurden vereinigt und auf eine 15 ml P11 (Whatman)-Säule aufgetragen, die mit DE-Puffer equilibriert wurde. Die Elution wurde mit einem linearen Gradienten von NaCl-Konzentrationen von 0 mM bis 300 mM durchgeführt, und die Fraktionen mit Aktivität wurden vereinigt. Die P11-Fraktionen wurden durch SDS-PAGE untersucht, und eine einzelne Bande bei einem Molekulargewicht von 100.000 wurde gefunden.
2-9. Identifikation der N-terminalen Aminosäuresequenz durch einen Aminosäureanalyzer
Die in Beispiel 2-8 erhaltene DNS-Polymerase wurde mit einem Aminosäureanalyzer untersucht, und die Aminosäuresequenz der N-terminalen Region war diejenige, die als SEQ ID NO 12 in der Sequenzliste gezeigt ist.
Beispiel 3.
3-1. Erstellung von Plasmiden mit einer örtlich begrenzten Deletion (regional deletion)
Um die 5'→3'-Exonukleaseaktivität zu entfernen, von der angenommen wurde sich in einer Domäne in der Amino-terminalen Seite des DNS-Polymeraseproteins zu befinden, wurden Plasmide mit örtlich begrenzten Deletionen von dem 5'-Ende des Gens erstellt. Um das Verfahren anwenden zu können, das die Exonuklease III verwendet, wurde zunächst das ungefähr 3,5 kb lange NcoI-Fragment, das von pUI101 getragen wurde, herausgeschnitten und blunt-ended gemacht, danach wurde es in die HincII-Seite von pTV118N ligiert. Danach wurde ein Doppelverdau der 3'-überstehenden Enden mit KpnI und der 5'-überstehenden Enden mit XbaI durchgeführt, und Exonuklease III wurde dazu verwendet, nur die 3'-überstehenden Enden zu verdauen. Mungbohne-Nuklease wurde dazu verwendet, blunt-ends zu erzeugen, und dann wurde DNS-Ligase dazu verwendet, die ursprüngliche zirkuläre Gestalt wiederherzustellen. Durch Einstellung der Häufigkeit der Exonukleasereaktion konnten Mutanten mit einer Vielzahl an Deletionsgrößen erhalten werden. Durch Ligierung mit NcoI-Linker vor der Rezirkularisierung konnte das Initiierungskodon an einen geeigneten Ort eingeführt werden, und abhängig vom Deletionsort kam heraus, daß der Leserahmen in einem Drittel der Fälle der des DNS-Polymerasegens war (d. h. die Wahrscheinlichkeit, daß die Leserahmen passen, war ein Drittel).
Das Plasmid, das wie oben beschrieben erzeugt wurde, wurde in E. coli-Zellen eingeführt. Von den erhaltenen Transformanten wurden zufällig 20 Klone ausgewählt, und ihr grobes Extrakt wurde aufbereitet und auf DNS-Polymeraseaktivität untersucht. Es gab DNS synthetische Aktivitäten bei 60°C, so daß die Basensequenzen untersucht wurden. Einer der Klone mit Aktivität wurde ausgewählt, und das getragene Plasmid wurde pUI205 benannt. Das 2-kb DNS-Fragment, das in 3 gezeigt ist, war in pUi205 eingeführt. Als nächstes wurde das Plasmid dazu verwendet, E. coli HB101-Zellen zu transformieren, und diese wurden Escherichia coli HB101/pUI205-Zellen benannt (FERM BP-3720).
3 ist eine Restriktionskarte des Gens für DNS-Polymerase, das in pUI205 kloniert wurde.
3-2. Kultivierung von Rekombinanten und Aufbereitung von grobem Extrakt
Die oben beschriebenen Rekombinanten FERM BP-3720 wurden kultiviert, und ein grobes Extrakt aus den kultivierten Zellen wurde durch das Verfahren aus Beispiel 2-6 aufbereitet.
3-3. Assay der DNS-Polymeraseaktivität
Das oben gewonnene grobe Extrakt wurde auf DNS-Polymeraseaktivität durch die Verfahren aus Beispiel 2-7 untersucht. Das grobe Extrakt hatte 212 Units DNS-Polymeraseaktivität in 1 ml Kulturbrühe.
3-4. Assay der 5'→3'-Exonukleaseaktivität
Als ein Substrat wurde das Plasmid pBR322 mit PvuII geschnitten, und das 322-Basenpaar lange Fragment wurde mit [γ-³²P]ATP und Polynukleotidkinase behandelt, um es zu phosphorylieren. Dann wurde der Enzymstandard, der in Beispiel 3-2 aufbereitet wurde, mit einer Lösung enthaltend 67 mM Kaliumphospat (pH 7,4), 6,7 mM Magnesiumchlorid und 1 mM 2-Mercaptoethanol und mit dem Substrat gemischt, und es wurde der Reaktion erlaubt, für 5 min. bei 60°C stattzufinden. Dann wurde durch die Zugabe von Ethanol die Substrat-DNS dazu gebracht, zu präzipitieren.
Die Radioaktivität im Überstand wurde in einem Flüssigszintillationszähler gemessen, und die Menge des durch die Exonuklease hergestellten Produktes wurde kalkuliert. In dem verwendeten Enzym wurde keine 5'→3'-Exonukleaseaktivität detektiert.
3-5. Erzeugung von hitzeresistenter DNS-Polymerase durch Plasmid pUI205 tragende E. coli-Zellen
Durch die Verfahren in Beispiel 2-8 wurde Standardenzym von E. coli HB101/pUI205-Zellen erhalten. Das erhaltene Enzym wurde durch SDS-PAGE untersucht, und es ergab eine einzelne Bande bei einem Molekulargewicht von 67.000.
3-6. Sequenzierung der N-terminalen Sequenz durch einen Aminosäureanalyzer
Durch die Verfahren aus Beispiel 2-9 wurde gefunden, daß die N-terminale Aminosäuresequenz des Standardenzyms die ist, die in SEQ ID NO 15 in der Sequenzliste gezeigt ist.
Beispiel 4
4-1. Ermittlung der Basensequenz der chromosomalen DNS von B. caldotenax beinhaltend das strukturelle Gen für DNS-Polymerase
Durch die Verfahren aus Beispiel 3-1 wurden eine Anzahl von Deletionsmutanten mit einer Vielzahl an Größen aufbereitet, und ihre Basensequenzen wurden durch das Dideoxyverfahren identifiziert. Die erhaltenen Daten wurden untersucht, und es wurde gefunden, daß die Basensequenz des vollständigen NcoI-NcoI-Fragments, das von pUI101 erhalten wurde, die der SEQ ID NO 11 in der Sequenzliste ist. Es wurde gefunden, daß die Sequenz von pUI205 die Basennummern 1032–3252 des NcoI-Fragments von pUI101 war, die als SEQ ID NO 11 in der Sequenzliste gezeigt ist.
Auf diese Weise, basierend auf die N-terminate Aminosäuresequenz, die wie in Beispiel 2-9 und Beispiel 3-6 beschrieben wurde, und die in diesem Beispiel identifizierte Basensequenz, identifizierten wir das strukturelle Gen für die DNS-Polymerase dieser Erfindung und die Aminosäuresequenz der DNS-Polymerase dieser Erfindung.
Wie im Detail oben erklärt, stellt diese Erfindung ein einfaches und leistungsfähiges Verfahren zur Klonierung von Genen bereit, die für neuartige Pol-I-Typ-DNS-Polymerasen kodieren, und es stellt diese Gene bereit. Diese Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer Pol-I-Typ-DNS-Polymerase bereit, welche nützlich ist als Reagenz in der Gentechnikforschung (genetic engineering research).
SEQUENZLISTE

Claims

Isoliertes, eine DNA-Polymerase vom Pol-I-Typ kodierendes Gen, welches gegenüber Wärmebehandlung bei 60°C für 20 Minuten resistent ist und eine 3'→5'-Exonukleaseaktivität aufweist, und welches von dem in Escherichia coli HB101/pUI101 (hinterlegt unter FERM BP-3721) beherbergten Plasmid pUI101 erhältlich ist.
Isoliertes, eine DNA-Polymerase vom Pol-I-Typ kodierendes Gen, welches gegenüber Wärmebehandlung bei 60°C für 20 Minuten resistent ist, und welches von dem in Escherichia coli HB101/ pUI205 (hinterlegt unter FERM BP-3720) beherbergten Plasmid pUI205 erhältlich ist.