DE69533634T2

DE69533634T2 - Geranylgeranyldiphosphate-Synthase und diese kodierende DNA

Info

Publication number: DE69533634T2
Application number: DE69533634T
Authority: DE
Inventors: Tokuzo Toyota-shi Nishino; Shinichi Toyota-shi Ohnuma; Manabu Toyota-shi Suzuki; Chikara Toyota-shi Ohto; Chika Toyota-shi Asada; Yuka Toyota-shi Higuchi; Yoshie Toyota-shi Takeuchi
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 1994-03-24
Filing date: 1995-03-23
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2015-03-24
Also published as: US5773273A; EP0674000A2; EP0674000B1; JPH07308193A; JP3198842B2; DE69533634D1; EP0674000A3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, für die Herstellung einer von Sulfolobus acidocaldarius stammenden Geranylgeranyl-Diphosphatsynthase und eine Transformante mit der DNA, als auch auf ein Verfahren für die Herstellung der Geranylgeranyl-Diphosphatsynthase und von Geranylgeranyl-Diphosphat unter Verwendung dieses Enzyms.
Geranylgeranyl-Diphosphat (GGDP) hat vier Doppelbindungen und umfasst acht geometrische Isomere. GGDP wird in vivo durch Kondensation von Isopentenyl-Diphosphat und Farnesyl-Diphosphat synthetisiert und ist ein wichtiges Intermediat für die Biosynthese von Isoprenoiden und Isoprenoid-haltigen Verbindungen, wie etwa Carotenoiden, Diterpenen, Vitaminen usw. GGDP-Synthasen werden in Bakterien, Pflanzen, Pilzen und Algen gefunden. Eine große Menge des nativen Isomers von Isoprenoiden wird durch Einführung eines Gens für GGDP-Synthase in einen geeigneten Wirt durch gentechnische Verfahren exprimiert, und wo GGDP-Synthase zu geringen Kosten vorgesehen wird, kann sie für die Herstellung des nativen Isomers von GGDP verwendet werden.
Von diesem Ausgangspunkt wurden Untersuchungen von Genen, die für bakterielle GGDP-Synthase kodieren und Manipulationen davon unternommen, als auch die Produktion der Synthase wurde versucht, und bisher sind zwei bakterielle Gene, die aus verschiedenen Quellen stammen, bekannt (photosynthetisches Bakterium Rhodopseudomonos capusulate (J. Bacteriol., 154, S. 580–590, 1983); und ein phytopathogenes Bakterium Erwinia uredovora (J. Bacteriol., 172, S. 6704–6712, 1990). Diese GGDP-Synthasen sind instabil und z. B. wird ein von Erwinia uredovora stammendes Enzym bei 55°C schnell inaktiviert (siehe Tabelle 3).
Die von diesen Mesophilen stammenden Enzyme sind nicht für die praktische Herstellung von GGDP geeignet und insbesondere ist es wesentlich eine thermostabile GGDP-Synthase herzustellen. Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Primärstruktur eines für eine thermostabile GGDP-Synthase kodierenden Gens für die Entwicklung eines Verfahrens für die Herstellung einer thermostabilen GGDP-Synthase zur Verfügung zu stellen, und Mikroorganismen zu modifizieren, die ursprünglich kein GGDP herstellen (wie etwa E. coli), um GGDP zu erzeugen.
Um die vorherige Aufgabe zu lösen, haben wir eine GGDP-Synthase gefunden, extrahiert aus einem DNA-Fragment von Sulfolobus acidocaldarius, welches als ein extrem thermophiles und azidophiles Archaebakterium bekannt ist. Wir waren darin erfolgreich, die GGDP-Synthase unter Verwendung von gentechnischen Verfahren zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung stellt eine DNA nach Anspruch 1 oder 2 zur Verfügung, die für eine von Sulfolobus acidocaldarius stammende GGDP-Synthase kodiert, einen rekombinanten Vektor mit dieser DNA, als auch rekombinante mikrobielle Zellen, in welchen das Gen durch den Vektor eingebracht wird, und die Verwendung davon für die Herstellung von GGDP-Synthase oder GGDP als solches.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 stellt ein eingefügtes DNA-Fragment und eine Restriktionsenzymkarte davon, in den Plasmiden pGGPS1 und pRVF-1 dar, die die vorliegende DNA-Sequenz enthalten. "E" und "H" stellen EcoRI- bzw. HindIII-Erkennungsstellen dar.
Die 2 stellt ein Ergebnis einer Analyse von Produkten einer Reaktion dar, katalysiert durch das Produkt des Plasmids, welches die DNA der vorliegenden Erfindung enthält. Das Feld A stellt ein Ergebnis einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer LKC-18 dar, und das Feld C stellt ein Ergebnis davon unter Verwendung von Kiesegel-60 TLC dar. Das Feld B ist für eine Kontrollprobe, analysiert durch LKC-18. Die Kreise a, b, c, d und e entsprechen Geraniol, (all-E) Farnesol, (all-E) Geranylgeraniol, (2Z, 6E, 10E) Geranylgeraniol bzw. (all-E) Decaprenol.
Die 3 stellt die Thermostabilität der vorliegenden GGDP-Synthase durch Bestimmung der verbleibenden Enzymaktivitäten dar. Die Symbole ausgefüllter Kreis, weißer Kreis, Kreuz, ausgefülltes Viereck und ausgefülltes Dreieck zeigen die Ergebnisse der Behandlung bei 60°C, 70°C, 80°C, 90°C bzw. 100°C.
Die 4 stellt die Reinigungsschritte der vorliegenden GGDP als ein Fusionsprotein mit MBP dar.
Die 5 ist eine graphische Darstellung, die die GGDP-Synthaseaktivität bei jedem in der 4 gezeigten Schritte zeigt.
Die 6 ist eine graphische Darstellung, die eine enzymatische Aktivität einer gereinigten MBP-GGDP-Synthase darstellt, bestimmt durch das Grindey-Nichol-Verfahren.
Die 7 ist ein Autoradiogramm einer TLC, die Produkte gebildet durch die Reaktion des vorliegenden Fusionsproteins mit verschiedenen alyllischen Substraten darstellt.
Erfindungsgemäß enthält eine für GGDP-Synthase kodierende DNA jede DNA, die für eine in der SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert, welche bei Expression davon ein Protein mit GGDP-Synthaseaktivität zur Verfügung stellt. Die vorliegende DNA umfasst ferner eine DNA, welche die in der SEQ ID NO: 1 gezeigte Nukleotidsequenz hat und für die Aminosäuresequenz und eine zusätzliche Aminosäuresequenz (z. B. als ein Fusionsprotein) kodiert.
Eine Ausführungsform des vorliegenden Gens ist dasjenige, das für eine Aminosäuresequenz kodiert, die mit dem ersten Met beginnt und beim 330. Lys in der SEQ ID NO: 1 endet. Jedoch gibt es einen Fall, wo das erste Met durch posttranslationale Prozessierung entfernt wird, oder das erwünschte Enzym wird als Fusionsprotein mit einem anderen Peptid hergestellt. In diesen Fällen ist das für das erste Met kodierende Codon nicht vorhanden. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kodiert das vorliegende Gen ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die mit dem zweiten Ser beginnt und mit dem 330. Lys in der SEQ ID NO: 1 endet.
Eine Ausführungsform des vorliegenden Gens umfasst eine Nukleotidsequenz, die mit dem ersten Nukleotid "A" beginnt und mit dem 990. Nukleotid "A" endet.
Es ist im Allgemeinen bekannt, dass gleiche Enzyme, welche von der gleichen Art oder aus dem gleichen Genus stammen, durch natürliche oder künstliche Mutation kleine Unterschiede in ihren Aminosäuresequenzen, wie etwa Substitution, Addition und/oder Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden, aufweisen.
Gemäß der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Erfindung ist es möglich ein Gen zu klonieren, das das gleiche Enzym mit einem Unterschied zur in der SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz hat. Eine von einem derartigen Gen abgeleitete Aminosäuresequenz kann eine sehr hohe Homologie mit der in der SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz zeigen, z. B. eine Homologie von wenigsten 90% und weiter wenigsten 98%. Demgemäß umfasst die vorliegende Erfindung nicht nur ein Gen, das für die GGDP-Synthase mit der in der SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert, sondern ebenfalls ein Gen, das ein Protein mit einer GGDP-Synthaseaktivität und einer Aminosäuresequenz mit wenigstens 95% Homologie, z. B. 98% Homologie zu der in der SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz kodiert.
Es ist bei Enzymen gut bekannt, dass in Abschnitten, die keine Abschnitte sind, welche notwendig für eine Funktion sind, bestimmte Aminosäurereste nicht essentiell sind. Modifikationen, wie etwa Substitution, Deletion und/oder Addition einer oder einiger Aminosäuren kann in derartigen nichtessentiellen Bereichen durchgeführt werden, wobei die Enzymaktivität erhalten bleibt. Unter Verwendung einer allgemeinen Technik, wie etwa ortsgerichtete Mutagenese mit einer Sonde mit einer künstlichen Sequenz, können wir bis zu 20 Aminosäuren modifizieren, z. B. bis zu 10 Aminosäuren.
Substitution, Deletion und/oder Addition einer Aminosäuresequenz kann unter Verwendung von Restriktionsenzymen und/oder verknüpfenden Enzymen, Ligasen durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Gen, welches ein Protein mit GGDP-Synthaseaktivität und eine in der SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert, die durch Substitution, Deletion und/oder Addition von bis zu 20 Aminosäuren, z. B. bis 10 Aminosäuren, modifiziert werden kann.
Das DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung kann gemäß dem als solches bekannten, hiernach ausführlich beschriebenen Verfahren, aus Sulfolobus acidocaldarius, erhältlich von Instituten, die verschiedene Mikroorganismen lagern, in der Form von verschiedenen Längen von DNA gemäß dem Zweck für die Verwendung der DNA präpariert werden.
Die vorliegende DNA kann nämlich durch Extraktion der genomischen DNA aus Sulfolobus acidocaldarius, Spalten der extrahierten DNA mit z. B. einem oder mehreren geeigneten Restriktionsenzymen um Fragmente zu bilden, Einfügen der Fragmente in Vektoren, um eine genomische Bibliothek zu erzeugen, und Auswahl eines Vektors mit einer DNA, die für ein erwünschtes Enzym kodiert, durch Nachweis der Expression des erwünschten Enzyms, präpariert werden. Ein bestimmtes Verfahren wird in den Beispielen 1. a) bis d) beschrieben.
Da die vorliegende Erfindung eine bestimmte, für GGDP-Synthase kodierende Nukleotidsequenz offenbart, kann sie DNA mit diese Nukleotidsequenz oder eine davon modifizierte Nukleotidsequenz durch chemische Synthese hergestellt werden. Dieses DNA-Fragment, oder ein Teil davon, kann als ein Primer für die Synthese einer modifizierten DNA verwendet werden, die ein Protein mit GGDP-Synthaseaktivität kodiert, gemäß einem herkömmlichen Verfahren, wie etwa ortsgerichtete Mutagenese oder das PCR-Verfahren.
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Vektoren mit dem vorher erwähnten DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung zur Verfügung. Der rekombinante Vektor kann einen Bereich enthalten, der Funktionen hat, um das GGDP-Synthasegen zu exprimieren.
Es ist bekannt, dass es zwei Regulationsschritte der Genexpression gibt, Transkription und Translation. Die herkömmliche Wirtszelle E. coli hat ebenfalls diese Regulationssysteme. Als Promotersequenzen, die die Transkriptionsinitiation von mRNA steuert, sind Wildtypsequenzen (z. B. lac, trp, bla, lpp, PL, PR, tet, T3, T7 usw.) als auch Mutanten davon (z. B. lacUV5) und künstliche Fusionssequenzen von Promotersequenzen (z. B. tac, trc usw.) bekannt, und können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Der Abstand zwischen der Ribosomenbindungsstelle (GAGG oder ähnliche Sequenz) und dem Initiationskodon ATG oder GTG ist in einigen Fällen wichtig als ein Faktor, welche die Translation eines Proteins aus mRNA reguliert. Es ist gut bekannt, dass eine Terminationsstruktur, welche die Transkription beenden kann, die Effizienz einer rekombinanten Proteinexpression beeinflusst (z. B. ein Vektor mit rrnBT1T2 ist kommerziell von Pharmacia erhältlich).
Vektoren, welche für die Konstruktion des vorliegenden rekombinanten Vektors verwendet werden können, enthalten kommerziell erhältliche Vektoren per se, und gemäß den Zwecken modifizierte Vektoren. Zum Beispiel pBR322, pBR327, pKK223-3, pKK233-2, pTrc99 mit einem Replikon abgeleitet von pMB1; pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pHSG298, pHSG396, welche modifiziert wurden, um die Kopienanzahl zu erhöhen; pACYC177, pACYC184 usw. mit einem von p15A abgeleiteten Replikon; als auch Plasmide abgeleitet von pSC101, Co1E1, R1, F-Faktor usw. können genannt werden.
Zusätzlich zu Plasmiden können virale Vektoren, wie etwa der λ-Phage, der M13-Phage usw. und ein Transposon für die Einführung eines Gens in einen Wirt verwendet werden. Diese Vektoren werden in Molecular Cloning (J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Cloning Vector (P. H. Pouwels, B. E. Enger-Valk, W. J. Brammer; Elsevier) und vielen, kommerziellen Produkten beigefügten, Katalogen beschrieben.
Wir können ein für GGDP-Synthase kodierendes DNA-Fragment und, wenn notwendig, ein DNA-Fragment, welches die Expression des Enzymgens steuert, in einen Vektor gemäß den bekannten Verfahren unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme und Ligasen einführen, wie ausführlich hiernach beschrieben. Die Plasmide PGGPS1 und pMAlGG1 sind repräsentative Beispiele der derartig konstruierten vorliegenden Plasmide.
Mit einem derartig erhaltenen Vektor zu transformierende Mikroorganismen schließen Escherichia coli oder Mikroorganismen ein, die zum Genus Bacillus gehören. Das CaCl₂-Verfahren, das Protoplastenverfahren usw., wie z. B. in Molecular Cloning (J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis; Cold Spring Harbor Laboratory Press), DNA Cloning Vol. I to III (D. M. Glover; IRL PRESS) usw. beschrieben, kann für die Transformation verwendet werden.
Als ein typischer Transformant der vorliegenden Erfindung kann pGGPS1/DH5α erhalten werden.
Wir beschrieben vorher ausführlich das erfindungsgemäße Verfahren für die Expression des erwünschten Gens in E. coli. Eine für eine GGDP-Synthase kodierende DNA kann in andere herkömmliche Expressionsvektoren gemäß den herkömmlichen Verfahren eingebracht werden, wie auch in andere prokaryotische Zellen, niedere eukaryotische Zellen einschließlich einzelligen Wirten, wie etwa Hefe, oder höheren eukaryotischen Zellen, wie etwa Zellen der Seidenraupe. Diese transformierten Wirtszellen können kultiviert werden, um das GGDP-Synthaseenzym zu erzeugen.
Diese transformierten oder rekombinanten mikrobiellen Zellen können GGDP-Synthase in den Zellen oder im Kulturmedium während der Kultur in einem Medium geeignet für derartige Zellen, wie etwa E. coli, anhäufen. Wir können die GGDP-Synthase aus den Zellen wie folgt präparieren; Lyse der Zellen mit physikalischem Aufbrechen oder durch Behandlung mit einem Zell-lysierenden Enzym, Entfernen der Zelltrümmer um einen Zell-freien Extrakt zu präparieren, der das Enzym enthält, und dann Isolierung und Reinigung der GGDP-Synthase. Wir empfehlen Lysozym als ein Zell-lysierendes Enzym und Ultraschallbehandlung als ein physikalisches Aufbrechen. Die meisten von E. coli stammenden Proteine werden bei Erwärmung auf 55°C denaturiert. Das Enzym kann durch verschiedene Chromatographieverfahren, einschließlich Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Umkehrchromatographie und Ultrafiltration und ähnliche, allein oder in Kombination isoliert und gereinigt werden. Reduzierende Mittel, wie etwa β-Mercaptoethanol, Dithiothreitol usw., Schutzmittel gegen Proteasen, wie etwa PMSF, BSA usw., oder Metallionen, wie etwa Magnesiumionen können verwendet werden, um als ein Enzymstabilisator das gewünschte Enzym während der Isolations- und Reinigungsprozesse zu stabilisieren.
Die Aktivität der GGDP-Synthase kann z. B. durch ein im Beispiel 1. e) beschriebenes Verfahren bestimmt werden. Es ist empfohlen die GGDP-Synthase zu isolieren und zu reinigen, während die Enzymaktivität überprüft wird.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren für die Produktion von GGDP zur Verfügung, kodiert durch eine DNA nach Anspruch 1 oder 2. Wir können einen Wirt mit einer GGDP-Synthase kodierenden DNA erzeugen, der DNAs enthält, die für andere Enzyme in einem GGDP-Biosyntheseweg kodieren. Diese Rekombinante kann GGDP durch Kultivierung synthetisieren, welche dann präpariert und gereinigt werden kann.
Erfindungsgemäß wird die vorher erwähnte Transformante kultiviert, um GGDP-Synthase zu erzeugen und das isolierte Enzym oder das Enzym-haltige Produkt, wie die etwa teilweise gereinigte Enzymprobe, Enzym-haltige Zellen usw., können mit Substraten verwendet werden, z. B. Isopentenyldiphosphat, Dimethylallyldiphosphat, Geranyldiphosphat oder Farnesyldiphosphat, um GGDP zu synthetisieren, welches dann gesammelt wird.
BEISPIELE
Im folgenden Teil zeigen wir sowohl die Primärstruktur einer Nukleotidsequenz, Plasmide und Transformanten als auch GGDP-Synthase und GGDP der vorliegenden Erfindung. Die vorliegende Erfindung wird durch diese Beispiele nicht beschränkt.
Beispiel 1
Wir verfuhren entsprechend dem vorher zitierten "Molecular Cloning" und "DNA Cloning" als auch den Katalogen von Takara Shuzo. Die meisten Enzyme wurden von Takara Shuzo bezogen. Die Umkehrphasedünnschichtchromatographie(TLC)-Platten LKC-18 wurden von Whatman bezogen, die Kieselgel-60-Dünnschichtchromatographie(TLC)-Platten LKC-18 wurden von Merck bezogen. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909 ist registriert und ohne Beschränkung von der America Type Culture Collection (ATCC) erhältlich.
a) Präparation chromosomaler DNA aus Sulfolobus acidocaldarius
Zellen des Stamms ATCC 33909 wurden in dem 1723-Medium, beschrieben im ATCC-Katalog, kultiviert. Genomische DNA wurde aus den kultivierten Zellen gemäß den Current Protocols in Molecular Biology, veröffentlicht durch Wiley Interscience, präpariert.
b) Präparation einer genomischen DNA-Bibliothek von Sulfolobus acidocaldarius
Die chromosomale DNA wurde teilweise mit einem Restriktionsenzym Sau3AI verdaut und einer Elektrophorese mit einem 0,5%igen Agarosegel unterzogen. Ein Block aus diesem Agarosegel mit DNA-Fragmenten von 3 kbp bis 6 kbp wurde fraktioniert und die DNA daraus extrahiert. 2,7 μg dieser größenfraktionierten DNA und 1,5 μg der mit BamHI gespaltenen und dephosphorylierten pUC119-Plasmid-DNA wurden unter Verwendung von DNA-Ligase ligiert. Der Ligationsansatz wurde verwendet, um E. coli DH5α zu transformieren. Diese Transformanten wurden dann bei –70°C gelagert. Die derartig konstruierte Bibliothek wurde überprüft.
c) Präparation von kompetenten Zellen, die das Plasmid pACYC-IB tragen
Ein 2,8 kbp SnaBI-HpaI-DNA-Fragment mit crtI (Phytoensynthasegen) und crtB (Phytoendesaturasegen) von Erwinia uredovora wurden aus pCAR25 (N. Misawa usw., J. Bacterial. 172. 6704–6712 (1990)) präpariert. Erwinia uredovora ist als ATCC 19321 erhältlich. Es wächst leicht in LB-Medium. Das 2,8 kbp-DNA-Fragment kann z. B. unter Verwendung der bekannten Southern-Analyse oder mit PCR mit DNA-Sonden synthetisiert von crtI- oder crtB-Nukleotidsequenzen, erhältlich aus dem GenBank Eintrag Nr. D90087m kloniert werden.
Dieses DNA-Fragment wurde mit EcoRI-Linkern legiert und mit einem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und unter Verwendung einer DNA-Ligase in ein Plasmid pACYC184 eingefügt, welches mit EcoRI verdaut und dephosphoryliert wurde. Der Ligationsansatz wurde dann verwendet, um E. coli pACYC-IB/pH5α zu transformieren. Kompetente Zellen wurden durch das CaCl₂-Verfahren präpariert.
d) Auswahl des GGDP-Synthasegens
Aus der in E. coli enthaltenen, genomischen DNA-Bibliothek von Sulfolobus acidocaldarius, konstruiert in dem vorher erwähnten Verfahren b), wurden gemäß einem alkalischen Verfahren Plasmid-DNAs gereinigt und 10 Nanogramm der DNA wurde verwendet, um E. coli zu transformieren, das die crtI- und crtB-Gene trägt, präpariert nach dem vorher erwähnten Verfahren c). Die Transformanten wurden auf LG-Agarplatten kultiviert mit 50 μg/ml Tetracyclin und 50 μg/ml Ampicillin.
10 positive rote Kolonien wurden durch visuelle Auswahl aus 4.000 Transformanten erhalten. Von diesen 10 Kolonien wurde ein pGGPS1 genanntes Plasmid aus einer Kolonie isoliert. Eine 2,3 kbp HindIII-Fragment einer in pGGPS1 eingefügten DNA wurde in pUC118 subkloniert. Dieser DNA-Subklon wurde dann in E. coli-Zellen eingebracht, die das crtI- und crtB-Gen tragen. Dieser Klon erzeugte rote Kolonien. Da die Anwesenheit des GGDP-Synthasegens in dem HindIII-Fragment nachgewiesen war, wurde die Nukleotidsequenz dieser 2,3 kbp mittels des Dideoxy-Kettenabbruchverfahrens bestimmt.
Als ein Ergebnis enthielt das 2,3 kbp-Fragment zwei offene Leserahmen (ORF-1 und ORF-2), wie in der 1 gezeigt.
Demgemäß wurde ein Plasmid pRV11-1, dem der ORF-2 stromabwärts fehlte, konstruiert, und die Enzymaktivität eines Expressionsproduktes wurde gemäß dem Verfahren e) bestimmt.
e) Untersuchung der GGDP-Synthaseaktivität
Das durch das vorher erwähnte Verfahren d) erhaltene Plasmid pRV11-1 wurde verwendet, um E. coli DH5α zu transformieren, welche dann in 100 ml LB-Medium mit 50 μg/ml Ampicillin bei 37°C über Nacht kultiviert wurden. Die Zellen wurden geerntet und durch Ultraschallbehandlung in 8 ml Ultraschallpuffer (10 mM 2-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl (pH 7)) aufgebrochen und das Homogenat wurde bei 55°C für 60 Minuten erwärmt und bei 10.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verwendet, um auf GGDP-Synthaseaktivität untersucht zu werden.
Die Untersuchungsmischung enthielt in einem Endvolumen von 1 ml 0,48 μmol [1-¹⁴C]-Isopentenyldiphosphat (1,92 GBq/mmol), 25 μmol (all-E) Farnesyldiphosphat, 5 μmol MgCl₂, 25 μmol Tris-HCl (pH 6,8) und 0,3 mg des vorher erwähnten ungereinigten Enzyms. Diese Mischung wurde bei 55°C für 30 Minuten inkubiert und in einem Eisbad gekühlt, um die Reaktion zu beenden. Die Reaktionsmischung wurde mit 3 ml Wasser gesättigtem 1-Butanol extrahiert, und die Radioaktivität in der 1-Butanol-Schicht wurde gemessen, um die GGDP-Synthaseaktivität zu bestimmen. Ein Ergebnis wird in der Tabelle 1 gezeigt. Es wurde gezeigt, dass alle der derartig erhaltenen Klone ein Gen hatten, von dem erwartet wurde, dass es eine thermostabile GGDP-Synthase kodiert. Zusätzlich zeigte eine Untersuchung eines Extrakts aus dem Klon, der pRV11-1 enthielt, dass der ORF-1 das GGDP-Synthasegen ist.
Tabelle 1 Ergebnis einer Untersuchung auf GGDP-Synthaseaktivität abgeleitet vom erfindungsgemäßen Plasmid (Radioaktivität des 1-Butanolextrakts gezeigt in dpm-Einheiten.)
f) Analyse des GGDP-Synthaseprodukts
Die Identifizierung eines Produkts, erzeugt durch den wärmedenaturierten Zell-freien Extrakt, wurde durchgeführt.
Die Produkte, erhalten aus der Inkubation von [1-¹⁴C]-Isopentenyldiphosphat und Farnesyldiphosprat mit einem Zellfreien Extrakt aus ausgewählten positiven Transformanten, wurden mit einer sauren Phosphatase gemäß einem Verfahren von Fujii usw. (Fujii usw., (1982) Biochim. Biophys. Acta 712, S. 716–718) hydrolysiert. Die hydrolysierten Alkohole wurden mit Pentan extrahiert. Die Pentan-löslichen Produkte wurden durch Umkehrphase-LKC-18-Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines gemischten Lösungsmittels aus Aceton/Wasser (9 : 1) und einer Normalphase-Kieselgel-60-Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines gemischten Lösungsmittels aus Benzol/Ethylacetat (9 : 1) analysiert. Ein Ergebnis wird in der 2 gezeigt. Es wird deutlich gezeigt, dass der aus dem rekombinanten Produkt abgeleitete radioaktive Alkohol (all-E) Geranylgeraniol ist, welches ein Derivat von (all-E)-GGDP ist.
Demgemäß wurde eine erfolgreiche Klonierung eines GGDP-Synthasegens aus Sulfolobus acidocaldarius bestätigt.
g) Teilweise Reinigung der vom klonierten Gen stammenden GGDP-Synthase
Ein wärmebehandelter Zell-freier Extrakt aus einem Zelllysat von rekombinanten E. coli, die ein GGDP-Synthasegen tragen, wurde mit 30–60%iger Sättigung von (NH₄)₂SO₄ ausgefällt. Die ausgefällte Proteinfraktion wurde dialysiert und auf einer DEAE-Toyopearl 650M-Säule (1,0 × 16 cm), equilibriert mit Puffer A (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 7,7)) chromatographiert; die Elution erfolgte mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,85 M NaCl in Puffer A. Die GGDP-Synthase enthaltenden Fraktionen wurde gesammelt und gegen Puffer A dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Mono-Q-Säule (5 × 50 mm), equilibriert mit Puffer A, aufgetragen; die Elution erfolgte mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,85 M NaCl in Puffer A. Eine GGDP-Synthase enthaltende Fraktion wurde durch Elektrophorese auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel analysiert und das Gel wurde mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt.
Nach diesen Vorgehen wurde eine spezifische Aktivität 8,7 nmol/min./mg Protein erreicht.
h) Substratspezifität der vom klonierten Gen stammenden GGDP-Synthase
Die Substratspezifität der vom klonierten Gen stammenden GGDP-Synthase wurde unter Verwendung von Allyldiphosphatsubstrat, gezeigt in der Tabelle 2, untersucht. Als Ergebnis wurde gefunden, dass Dimethylallyldiphosphat, Geranyldiphosphat und (all-E) Farnesyldiphosphat Substrate sein können.
Tabelle 2 Substratspezifität der vom klonierten Gen stammenden GGDP-Synthase der vorliegenden Erfindung
i) Thermostabilität der vom klonierten Gen stammenden GGDP-Synthase
Die vom den klonierten Gen aus Sulfolobus acidocaldarius stammendende GGDP-Synthase wurde wärmebehandelt und die verbleibende Aktivität wurde bestimmt. Nach Erwärmung auf 60°C für 100 Minuten blieb wenigsten 95% der Aktivität erhalten. Ein Ergebnis wird in der 3 gezeigt.
Zum Vergleich war die Thermostabilität der aus Erwinia uredovora stammenden GGDP-Synthase (Produkt von crtE) wie folgt.
Tabelle 3 Thermostabilität der aus Erwinia uredovora stammenden GGDP-Synthase (crtE-Produkt)
Beispiel 2. Herstellung von GGDP-Synthase
Eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde unter Verwendung des vorher erwähnten Plasmids pGGPS1 als eine Matrize mit den folgenden Primern:
GGPP-I BamHI (26mer. 5'-CGC CGA TCC ATG AGT TAC TTT GAC AA-3' (SEQ ID NO: 3), und
GGPP-T EcoRI (25mer. 5'-GG GAA TTC TTA TTT TCT CCT TCT TA-3') (SEQ ID NO: 4),
und der in der Tabelle 4 gezeigten Reaktionszusammensetzung durchgeführt, um das zu dem kodierenden Bereich des GGDP-Synthasegens der vorliegenden Erfindung entsprechende DNA-Fragment zu amplifizieren.
Tabelle 4 Reaktionszusammensetzung für die PCR
Die PCR-Bedingungen waren 30 Zyklen bei 90°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute. Nach Beendigung der Reaktion wurde die amplifizierte DNA mit Ethanol bei –80°C ausgefällt, mit einem Restriktionsenzym EcoRI gespalten, die Enden aufgefüllt und weiter mit einem Restriktionsenzym BamHI geschnitten, um ein DNA-Fragment von etwa 1 kbp zu erhalten, das für GGDP-Synthase kodiert.
Ein kommerziell erhältliches Plasmid pMAL-c2 (NEB, USA) wurde als ein Klonierungsexpressionsvektor verwendet. In diesem Plasmid ist ein DNA-Fragment (der Name des Gens: mal-E), das für ein Maltose-bindendes Protein kodiert (manchmal hiernach als MBP bezeichnet) stromabwärts vom tac-Promotor eingefügt und die Klonierungstellen für das erwünschte Gen (DNA) ist stromabwärts vom mal-E vorhanden. Demgemäß wird, wo ein für ein erwünschtes Polypeptid kodierendes Gen in die Klonierungsstelle eingefügt und das Gen exprimiert wird, dann ein Fusionsprotein des MBP und des erwünschten Polypeptids gebildet, und das Fusionsprotein kann in einem einzigen Schritt durch eine Amyloseharz-Affinitätschromatographie gereinigt werden.
Das Plasmid pMal-c2 wurde mit einem Restriktionsenzym HindIII geschnitten, die Enden aufgefüllt und mit einem Restriktionsenzym BamHI gespalten. Das resultierende DNA-Fragment wurde mit dem PCR-amplifizierten DNA-Fragment ligiert, das für die GGDP-Synthase kodiert, um so ein rekombinantes Plasmid pMalcGG1 zu erhalten. Das Ligieren und Enden-Auffüllen wurde unter Verwendung eines Ligations-Reagenziensatzes und eines Endauffüllung-Reagenziensatzes von Takara Shuzo durchgeführt.
Das rekombinante Plasmid wurde zur Transformation von E. coli TOPP-Zellen Nr. 2 (Stratagene) (kompetente Zellen) verwendet. Die transformierten Zellen wurden auf einer Platte mit Yt-Medium kultiviert, resultierend in der Bildung von 6 Kolonien. Diese Kolonien wurden in 2 × Yt-Flüssigmedium bei 37°C kultiviert und die Plasmid-DNA wurde präpariert. Durch Spaltung mit EcoRV untersuchten wir das rekombinante Plasmid, um sicher zu stellen, dass es richtig konstruiert war und untersuchten die Größe der DNA-Banden durch Elektrophorese. Es ist anzumerken, dass das mit EcoRV gespaltene, korrekte rekombinante Plasmid, zwei DNA-Fragmente von 5,1 kbp und 2,5 kbp aufweist.
Das Plasmid pMalcGG1 wurde verwendet, um E. coli pACYC-IB/DH5α (Ohnuma usw., J. Biol. Chem, 1994; 269 (20): 4792–4797) zu erhalten. Es ist zu bemerken, dass E. coli pACYC-IB/DH5α bereits das Plasmid pRCYC-IB hat, und dass pACYC-IB Enzyme enthält, welche zwei Geranylgeranyldiphosphate (GGDP) (die Anzahl der Kohlenstoffatome: 20) verknüpfen, um Phytoen zu bilden, und ferner Gene für die Desaturierung enthält, und diese Gene exprimiert.
Die Transformante wurde über Nacht in 100 ml LB-Medium kultiviert und dann in 1L LB-Medium inokuliert und bei 37°C unter Rührbedingungen bei 300 U/min kultiviert.
Wenn die Zellkonzentration einen vorgeschriebenen Wert von 30 bis 40 Kelett erreichte, wurden 10 ml 100 mM IPTG zu der Kultur zugegeben, um die Transkription zu induzieren und die Kultivierung wurde für weitere 4 Stunden durchgeführt. Als eine Kontrolle wurde eine Probe unmittelbar vor der Zugabe von IPTG genommen. Die Kultur wurde zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, die dann durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen wurden. Weiße Proteinproben nach Induktion der Expression mit IPTG und vor der Induktion der Expression mit IPTG wurden durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE), wie in 4 gezeigt, analysiert, wobei durch IPTG(+) bzw. IPTG(–) Bezug genommen wird. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass das Fusionsprotein von etwa 70 kb reichlich in der IPTG(+)-Spur vorhanden war. Die SDS-PAGE wurde gemäß Wiley usw., Current Protocols in Molecular Biology und unter Verwendung einer miniproteo-II-cell-Vorrichtung von Bio Rad durchgeführt, und das Gel wurde mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt und unter Verwendung eines Geltrocknungs-Reagenziensatzes von Promega getrocknet.
Der vorher erwähnte Zellaufschluss wurde zentrifugiert, um in einen Überstand und einen Niederschlag fraktioniert zu werden. Eine Analyse durch SDS-PAGE für diese Fraktionen werden in der 4 als "Ultraschallüberstand" bzw. "Ultraschallniederschlag" gezeigt. Es wurde gefunden, dass das Fusionsprotein von etwa 70 kb in den Überstand übergegangen ist. Der Überstand wurde für eine Stunde auf 60°C erwärmt und denaturiertes Protein wurde durch Zentrifugation entfernt, um so einen Überstand zu erhalten. Ein Analyseergebnis davon wird in der 4 als "Ultraschallüberstand (h+)" gezeigt. Es wurde bestätigt, dass Unreinheiten entfernt wurden, und dass das Fusionsprotein angereichert wurde.
Als Nächstes wurde das Fusionsprotein durch Affinitätschromatographie gereinigt. Für die Reinigung wurde der vorher erwähnte Überstand durch einen 0,45 μm- oder 0,2 μm-Filter filtriert und das Filtrat wurde durch eine Säule (2,5 × 10 cm) gefüllt mit 15 ml Amyloseharz geführt und die Elution wurde gemäß einem Protokoll durchgeführt, angehangen von NEB an das Plasmid pMAL-c2. Das Eluat wurde mit einer PD-10-Säule (Pharmacia) entsalzt, um etwa 3,4 mg Fusionsprotein zu erhalten. Das Fusionsprotein wurde für eine Stunde auf 60°C erwärmt. Ein Ergebnis einer SDS-PAGE für die Fusionsproteine vor und nach dem Erwärmen wird als "Fusion" bzw. "Fusion (h+)" gezeigt. Es wird bestätigt, dass das Fusionsprotein nicht durch Erwärmung denaturiert wurde.
Als Nächstes wurde das derartig erhaltene Fusionsprotein mit dem Faktor Xa gespalten, um die GGDP-Synthase freizusetzen. Ein Ergebnis der SDS-PAGE des gespaltenen Produkts wird in der 4 als "Fusion (verdaut)" gezeigt, und für das bei 60°C für eine Stunde erwärmte Spaltprodukt als "Fusion (verdaut) (h+)". Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass GGDP-Synthase teilweise freigesetzt wurde.
Zusätzlich wurde für jede vorher beschriebene Fraktion die GGDP-Synthaseaktivität durch das im Beispiel 1. e) beschriebene Verfahren gemessen. Diese Untersuchung wurde wie folgt durchgeführt. Eine Lösung mit 2 μg Protein, 5 mM MgCl₂, 10 mM KH₂PO₄/KOH (pH 5,8), 25 μM Substrat (Geranyldiphosphat, (all-E)-Farnesyldiphosphat, oder (2Z, 6E)-Farnesyldiphosphat) und 463 nM [¹⁴C]-Isopentenyldiphosphat (4 Ci/mol)/ml reagierte bei 55°C für eine Stunde und die Reaktionsmischung wurde mit 3 ml Wasser-gesättigtem Butanol extrahiert. Ein ml des Extrakts wurde für eine Untersuchung der Radioaktivität verwendet und der verbleibende Teil wurde mit saurer Phosphatase von der Kartoffel hydrolysiert, extrahiert und durch TLC analysiert. Ein Ergebnis wird in der 5 gezeigt.
Das Plasmid pMalcGG1 wurde verwendet, um E. coli JM105 zu transformieren, um eine Transformante pMalcGG1/JM105 zu erhalten. Die Transformante wurde in TYGPN-Medium (20 g Trypton, 10 g Hefeextrakt, 10 ml 80%iges Glycerol, 5 g Na₂HPO₄, 10 g KNO₃/L) für vier Stunden (klett = 32) kultiviert, die Expression durch IPTG induziert und für weitere 26 Stunden kultiviert. Das MBP-GGDP-Synthasefusionsprotein wurde wie vorher beschrieben gereinigt, um so 21,8 mg gereinigtes Fusionsprotein pro 1 L zu erhalten. Es ist zu bemerken, dass die Brühe, in welcher das MBP-GGDP-Synthasefusionsprotein erzeugt wurde, rot bis tiefrot in der Farbe war, und dass diese rekombinanten Zellen rotbraun im Vergleich mit Kulturmedium und Zelle waren, in welchen MBP alleine exprimiert wurde (pMAL-c2/JM109).
Die GGDP-Synthaseaktivität des MBP-GGDP-Synthasefusionproteins konnte ebenfalls durch Messung des anorganischen Phosphats gemäß dem Grindey-Nichol-Verfahren (Grindey & Nichol, Anal. Biochem. 1970, 33, 114–119) bestimmt werden. Eine Reaktionsmischung mit 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NH₄Cl, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 50 nmol Farnesyldiphosphat, 50 nmol Isopentenyldisphosphat und z. B. 200 μg zu untersuchende Enzymprobe reagierte bei 55°C für 3 Stunden und wurde auf 0°C gekühlt, um die Reaktion zu beenden. Das Protein in der Reaktionsmischung wurde mit Trichloressigsäure denaturiert und entfernt, und der Überstand mit NaOH neutralisiert und die Mengen an Orthophosphat und Diphosphat in der Reaktionsmischung wurden gemessen, um die Enzymaktivität zu bestimmen. Ein Ergebnis wird in der 6 gezeigt.
Es ist zu bemerken, dass, wenn der für die GGDP-Synthase kodierende Bereich in dem Expressionsplasmid pMalcGG1 sequenziert wurde, das 720. Nukleotid "A" zu "G" substituiert und das 740. Nukleotid "A" zu "G" geändert war, resultierend in einer Änderung der 247. Aminosäure Lys zu Arg. Es wird angenommen, dass die Änderungen während der PCR auftraten.
Wenn zusätzlich das gleiche wie vorher beschriebene Experiment unter Verwendung von pGEX-2T (Pharmacia) anstelle von pMAL-c2 wiederholt wurde, resultierend im Plasmid pGluTGG1, war das 823. Nukleotid "A" zu "G" geändert, resultierend in einer Änderung der 275. Aminosäure Met zu Val. Im Ergebnis wurde ein Glutathion-S-Transferase-GGDP-Synthasefusionsprotein mit einer Punktmutation an der 275. Position erhalten. Dies von pGluTGG1 stammende Fusionsprotein wies die gleiche Enzymaktivität wie das von pMalcGG1 stammende Enzym auf.
Andererseits, wo pGEX-3X (Pharmacia) anstelle von pMALc2 als ein Expressionsklonierungsplasmid verwendet wurde, resultierend in pGluXGG1, trat keine Mutation auf und ein Glutathion-S-Transferase-GGDP-Synthasefusionsprotein mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz wurde erhalten. Dieses pGluXGG1-abgeleitete Fusionsprotein wies ebenfalls die gleiche Enzymaktivität wie das pMalcGG1-abgeleitete Fusionsprotein auf.
Beispiel 3. Herstellung einer Geranylgeran 1-Verbindung
Fusionsproteine, welche Expressionsprodukte der vorher erwähnten Expressionsprodukte pMalcGG1, pGluTGG1 und pGluXGG1, als auch Spaltprodukte (Verdauungsprodukte) davon reagierten mit Substraten (Primern), d. h. Geranyldisphosphat (GPP), (all-E)-Farnesyldiphosphat ([All-E]-FPP), und (2Z, 6E)-Farnesyldiphosphat ([2Z, 6E]-FPP). Die resultierenden Produkte sind der 7 gezeigt.
In dieser Figur stellt "C" ein von pGluTGG1 abgeleitetes Protein, "D" stellt ein von pGluXGG1 abgeleitetes Protein und "E" stellt ein von pMalcGG1 abgeleitetes Protein dar. "(f)" stellt ein fusioniertes Protein, gereinigt mit einer Affinitätssäule, und "(d)" stellt ein Reaktionsprodukt, affinitätsgereinigt und mit Thrombin behandelt, für pGluTGG1 dar, und ein Produkt, affinitätsgereinigt und behandelt mit Faktor-Xa, für pGluXGG1 und pMalcGG1.
Erfindungsgemäß wird eine DNA-Sequenz zur Verfügung gestellt, die für eine aus Sulfolobus acidocaldarius stammende GGDP-Synthase kodiert. Rekombinante Zellen, wie etwa E. coli-Zellen, transformiert mit einem Expressionsplasmid, die das DNA-Fragment enthalten, erzeugen ein stabiles, insbesondere thermostabiles Enzym mit Geranylgeranyldisphosphataktivität und Geranylgeranyldiphosphat.
DNA, die für die thermostabile Geranylgeranyldisphosphat(GGDP)-Synthetase kodiert, und aus Sulfolobus acidocaldarius stammt wird zur Verfügung gestellt. Die DNA ist nützlich für die Herstellung von GGDP-Synthase, welche wiederum nützlich für die Herstellung von GGDP ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA, die für eine aus Sulfolobus acidocaldarius stammende, thermostabile Geranylgeranyldiphospat-Synthase (GGDP-Synthase) kodiert, wobei das Enzym aus der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz, einer durch Substitution, Deletion und/oder Addition von bis zu 20 Aminosäuren modifizierten Sequenz oder einer Aminosäuresequenz mit wenigstens 95% Homologie zu der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz besteht.
DNA, die für eine aus Sulfolobus acidocaldarius stammende, thermostabile Geranylgeranyldiphospat-Synthase (GGDP-Synthase) kodiert, wobei die DNA aus der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nukleotidsequenz besteht.
Rekombinanter Vektor mit der DNA nach Anspruch 1 oder 2 und einem DNA-Abschnitt, der eine Funktion hat, die Expression der DNA zu regulieren.
Rekombinante, mikrobielle Zelle, welche mit einem rekombinaten Vektor nach Anspruch 3 transformiert ist.
Rekombinante, mikrobielle Zelle nach Anspruch 4, wobei der Wirt zu dem Genus Escherichia gehört.
Verfahren für die Herstellung von GGDP-Synthase mit den Schritten der Kultivierung der rekombinanten mikrobiellen Zelle nach Anspruch 4 in einem Medium, und der Gewinnung einer Substanz mit GDDP-Synthase-Aktivität.
Verfahren für die Herstellung von Geranylgeranyldiphosphat (GGDP) mit den Schritten der Kultivierung der rekombinanten Zelle nach Anspruch 4 in einem Medium und der Gewinnung von GDDP.
Verfahren für die Herstellung von GDDP, mit der Reaktion einer Kultur der rekombinanten mikrobiellen Zelle nach Anspruch 4 mit einem Substrat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Isopentenyldiphosphat, Dimethylallyldiphosphat, Geranyldiphosphat und Farnesyldiphosphat.
Verfahren für die Herstellung von GDDP, mit der Reaktion einer Substanz mit Enzym-Aktivität, erhalten durch ein Verfahren nach Anspruch 6, mit einem Substrat ausgewählt aus der Gruppe, die Isopentenyldiphosphat, Dimethylallyldiphosphat, Geranyldiphosphat und Farnesyldiphosphat umfasst.