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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine neue Agarase, die eine Agarase-Aktivität bei einer
hohen Temperatur besitzt, und ein Verfahren zur Herstellung und
Verwendung derselben. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein
Polypeptid, das eine Agarase-Aktivität bei einer hohen Temperatur
besitzt und ein Gen, das für dieses
Polypeptid kodiert. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das eine Agarase-Aktivität bei einer
hohen Temperatur besitzt, durch genetische Manipulation unter Verwendung
dieses Gens.
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Insbesondere
wird eine α-Agarase
mit einer Aktivität
bei einer hohen Temperatur beschrieben, die zur Herstellung von
Agarooligosacchariden mit niedrigen Polymerisationsgraden und verschiedenen
physiologischen Aktivitäten
aus Agarose verwendbar ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung
derselben und die Verwendung dieses Enzyms. Die vorliegende Erfindung
betrifft eine β-Agarase
mit einer Aktivität
bei einer hohen Temperatur, die zur Extraktion von einer Nukleinsäure oder
dergleichen aus einem Agarosegel nach einer Agarosegel-Elektrophorese
verwendbar ist sowie ein Verfahren zur Herstellung derselben, die
Verwendung dieses Enzyms und ein Verfahren zum Extrahieren einer
Nukleinsäure
oder dergleichen aus einem Agarosegel unter Verwendung dieses Enzyms.
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Hintergrund
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Agarose
ist der Grundbestandteil von Agar. Agarose ist ein Polysaccharid,
das eine Struktur besitzt, bei der D-Galaktose und 3,6-Anhydro-L-Galaktose
alternativ miteinander über α-1,3-Bindungen
und β-1,4-Bindungen
verbunden sind. Man muss Agarose in kleinere Moleküle abbauen,
um Oligosaccharide aus Agar zu isolieren. Zu diesem Zweck sind Verfahren,
bei denen Agarose chemisch abgebaut wird und Verfahren, bei denen
Agarose enzymatisch verdaut wird, üblicherweise bekannt. In einem
chemischen Abbauverfahren kann Agarose unter Verwendung einer Säure hydrolysiert
werden. In diesem Fall werden hauptsächlich α-1,3-Bindungen gespalten. Zwei
Arten von Enzymen, β-Agarasen,
welche β-1,4-Bindungen
in Agarose spalten und α-Agarasen,
welche α-1,3-Bindungen
in Agarose spalten, sind dafür
bekannt, dass sie Agarose spalten.
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Oligosaccharide,
die durch Spaltung von Agarose bei β-1,4-Bindungen erhalten wurden,
werden als Neoagarooligosaccharide bezeichnet. Neoagarooligosaccharide
besitzen D-Galaktose an ihren reduzierenden Enden und ihre Polymerisationsgrade
werden durch ganze Zahlen angegeben. Andererseits werden Oligosaccharide,
die durch Spaltung von Agarose an den α-1,3-Bindungen erhalten werden,
als Agarooligosaccharide bezeichnet. Agarooligosaccharide besitzen
eine 3,6-Anhydro-L-Galaktose an ihren reduzierenden Enden und ihre
Polymerisationsgrade werden durch ganze Zahlen angegeben. Kürzlich wurde
gezeigt, dass Agarooligosaccharide, die 3,6-Anhydro-L-Galaktose
an ihren reduzierenden Enden besitzen, physiologische Aktivitäten aufweisen,
wie eine Apoptose-induzierende Aktivität, eine karzinostatische Aktivität, verschiedene
Antioxidanzien-Aktivitäten,
eine immunregulatorische Aktivität,
eine antiallergene Aktivität,
eine antiinflammatorische Aktivität und eine Aktivität zur Inhibierung
von α-Glycosidase
(WO 99/24447, japanische Patentanmeldung Nr. 11-11646). Basierend
auf den physiologischen Aktivitäten
können
pharmazeutische Zusammensetzungen und funktionelle Nahrungsmittel
oder Getränke,
welche die Agarooligosaccharide als ihre Wirkstoffe enthalten, bereitgestellt
werden.
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Es
ist schwierig, die Größen von
produzierten Oligosacchariden in einem Verfahren zu kontrollieren, bei
dem Agarose chemisch abgebaut wird. Insbesondere ist es ziemlich
schwierig, kleinere Oligosaccharide mit niedrigen Polymerisationsgraden
selektiv herzustellen (z.B. T. Tokunaga et al., Bioscience & Industry, 49: 734
(1991)). Wenn eine β-Agarase
verwendet wird, können
nur Neoagarooligosaccharide, die nicht die oben genannten physiologischen
Aktivitäten
besitzen, erhalten werden, da dieses Enzym lediglich β-1,4-Bindungen spaltet.
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Es
wird erwartet, dass Agarooligosaccharide mit physiologischen Aktivitäten unter
Verwendung einer α-Agarase
hergestellt werden, welche eine Aktivität zur Spaltung von α-1,3-Bindungen
besitzt. Bekannte α-Agarasen
umfassen Enzyme, die durch einen marinen gramm-negativen Bakterienstamm
GJ1B (Carbohydrate Research, 66: 207–212 (1978) hergestellt werden
(dieser Stamm wird im European Journal of Biochemistry, 214: 599–607 (1993)
als Alteromonas agarlyticus GJ1B bezeichnet), und ein Bakterium
des Genus Vibrio (JP-A 7-322878; Stamm JT0107-L4). Jedoch ist es
nicht möglich
Agarobiose herzustellen, die nennenswerte physiologische Aktivitäten besitzt,
indem die α-Agarase,
die von Alteromonas agarlyticus GJ1B abstammt, verwendet wird, da
das Enzym keine Hexasaccharide oder kürzere Oligonukleotide verdauen
kann. Auch kann die α-Agarase,
die von dem Bakterium des Genus Vibrio abstammt, nicht zur Herstellung
von Agarooligosacchariden verwendet werden, wenn Agarose als Ausgangsmaterial
verwendet wird, da dieses Enzym dessen Aktivität nur auf Hexasacchariden und
kürzeren
Oligosacchariden ausübt
und auf Agarose überhaupt nicht
wirkt.
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Die
Erfinder haben intensiv geforscht, um ein Enzym zu erhalten, das α-1,3-Bindungen
in Agarose spaltet und Agarooligosaccharide mit bemerkenswerten
physiologischen Aktivitäten
erzeugt, und fanden zwei Mikroorganismen, die Enzyme mit Eigenschaften
produzieren, die für
diesen Zweck geeignet sind. Die durch diese Mikroorganismen hergestellten
Enzyme wurden isoliert und es wurden deren physikalischen und chemischen
sowie enzymatischen Eigenschaften gezeigt. Weiter isolierten die
Erfinder Gene für
die beiden Enzyme und fanden ein Verfahren zur einfachen Herstellung
von Polypeptiden mit α-Agarasen-Aktivitäten mittels
einer genetischen Manipulation unter Verwendung der Gene (WO 00/50578).
Wenn man beabsichtigt Agarooligosaccharide zu erhalten, indem gelöste Agarose
mit einer der beiden α-Agarasen
behandelt wird, muss die Reaktionstemperatur auf ungefähr 40°C erniedrigt
werden, da die optimalen Reaktionstemperaturen der Enzyme ungefähr 40°C betragen.
In einem solchen Fall kann, wenn die Agarose-Konzentration hoch
ist, Agarose erstarrt werden und die enzymatische Reaktion kann
verhindert werden. Wenn ein solches Enzym verwendet werden soll,
muss daher die Behandlung unter Verwendung von einer niedrigen Konzentration
durchgeführt werden.
Demgemäß kann Agarose
bei einer hohen Konzentration nicht behandelt werden und die Produktivitäten von
Agarooligosacchariden sind niedrig. Daher ist eine thermostabile α-Agarase
wünschenswert,
die eine Aktivität
bei einer hohen Temperatur besitzt, bei der Agarose nicht erstarrt
ist, selbst wenn Agarose bei einer hohen Konzentration gelöst ist.
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Andererseits
ist die Extraktion einer Nukleinsäure oder dergleichen, die einer
Behandlung mit einem Restriktionsenzym oder einer Amplifikationsreaktion
ausgesetzt war, aus einem Agarosegel nach einer Agarosegel-Elektrophorese
auf dem Ge biet der Genmanipulation weit verbreitet. Eine β-Agarase
mit einer optimalen Temperatur von ungefähr 37°C wird für dieses Verfahren konventionellerweise
verwendet. Auch muss in diesem Fall die Reaktionstemperatur erniedrigt
werden, was von der optimalen Temperatur des Enzyms abhängt, und
die Agarose-Konzentration muss erniedrigt werden, indem ein Agarosegel,
das eine Nukleinsäure
oder dergleichen enthält,
durch Behandlung in einem großen
Volumen Wasser gelöst
wird, um zu verhindern, dass Agarose erstarrt. In diesem Fall wird
die Konzentration der Nukleinsäure
oder dergleichen, die gewonnen werden soll, in gleicher Weise vermindert.
Die verminderte Konzentration kann Probleme verursachen, da sie
zu einer geringeren Ausbeute und geringeren Wirksamkeit des Agarose-Verdaus
sowie einem längeren
Verfahren führt.
Eine Agarase kann dann für
eine Reaktion bei einer Temperatur verwendet werden, die höher ist
als die konventionelle Temperatur, die notwendig ist, um die Probleme
zu lösen.
Eine β-Agarase,
die von dem Flavobakterium sp. Stamm NR19 stammt, der in dem US-Patent
Nr. 5,869,310 beschrieben wurde, kann als eine solche Agarase angesehen
werden, obwohl deren optimale Temperatur nicht so hoch ist und die
Thermostabilität
nicht ausreichend ist. Daher ist eine thermostabile β-Agarase
mit einer Aktivität
bei einer hohen Temperatur, bei der Agarose bei einer hohen Konzentration
nicht erstarrt, wünschenswert.
EP 0743363 betrifft zwei β-Agarasen,
die von einer zuvor unbekannten Spezies von Vibrio identifiziert
wurden. WO 9966052 betrifft zwei β-Agarasen
von Cytophagus drobachiensis und der EMBL-Datenbankeintrag Nr. M73783
betrifft die β-Agarase
von Pseudoalteromonas atlantica.
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Wie
oben beschrieben, bestehen im Stand der Technik Probleme hinsichtlich
der Herstellung von Agarooligosacchariden und der Extraktion eines
Stoffes, wie einer Nukleinsäure
aus einem Agarosegel.
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Aufgabe der
Erfindung
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Die
Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Polypeptid mit
einer Agarase-Aktivität,
das zur effizienten Herstellung von Agarooligosacchariden, einer
effizienten Extraktion eines Stoffes, wie einer Nukleinsäure aus
einem Agarosegel oder dergleichen verwendet werden kann, eine Aminosäuresequenz
dieses Polypeptids, ein Gen, das für dieses Polypeptid kodiert,
ein Verfahren zur Herstellung dieses Polypeptids, ein Verfahren
zur Herstellung eines Agarooligosaccharids und ein Verfah ren zum
Extrahieren eines Stoffes, wie einer Nukleinsäure aus einem Agarosegel, bereitzustellen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Aufgrund
der oben beschriebenen Probleme haben die Erfinder intensiv geforscht
und Recherchen durchgeführt,
um ein Enzym, das α-1,3-Bindungen
in Agarose bei einer hohen Temperatur spaltet und zur Herstellung
von Agarooligosacchariden mit nennenswerten physiologischen Aktivitäten verwendbar
ist und ein Enzym, das β-1,4-Bindungen in
Agarose bei einer hohen Temperatur spaltet und für eine effiziente Extraktion
von einer Nukleinsäure
oder dergleichen aus einem Agarosegel verwendbar ist, zu erhalten.
Als Ergebnis haben die Erfinder erfolgreich einen Mikroorganismus
entdeckt, der zwei Enzyme produziert, welche die Eigenschaften aufweisen,
die für
die erwähnten
Zwecke geeignet sind. Die Enzyme wurden aus dem Mikroorganismus isoliert
und deren physikalischen und chemischen sowie enzymatischen Eigenschaften
wurden bestimmt.
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Die
Erfinder haben weiter erfolgreich Gene isoliert, die für die Enzyme
kodieren und fanden Verfahren zur einfachen Herstellung des Polypeptids
mit einer α-Agarase-Aktivität und dem
erfindungsgemäßen Polypeptid
mit einer β-Agarase-Aktivität mittels
genetischer Manipulation unter Verwendung der Gene. Auf diese Weise
wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt.
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Die
vorliegende Erfindung wird wie folgt beschrieben. Der erste Aspekt
der vorliegenden Erfindung betrifft eine neue Agarase, die eine
Aminosäuresequenz
enthält,
die von den folgenden ausgewählt
ist oder eine Aminosäuresequenz
enthält,
in der eine oder mehrere Aminosäuren
substituiert, deletiert, hinzugefügt und/oder in diese Aminosäuresequenz
eingeführt
wurden: eine Aminosäuresequenz,
die aus 417 Resten von der Aminosäurezahl 21 bis zur Aminosäurezahl
437 in der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 22 besteht.
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Die
Agarase wird beispielhaft durch ein Enzym mit einer Aktivität der Hydrolyse
einer β-1,4-Bindung zwischen
D-Galaktose und 3,6-Anhydro-L-Galaktose veranschaulicht.
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Der
zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Gen, das für ein Polypeptid
mit einer Agarase-Aktivität
kodiert. Das Gen kodiert für
die Agarase gemäß dem ersten
Aspekt. Das Gen wird beispielhaft durch ein Gen, das aus einer Nukleotidsequenz
bestehend aus 1251 Nukleotiden von der Nukleotidzahl 61 bis zur
Nukleotidzahl 1311 in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 20 oder
einer Nukleotidsequenz, in der ein oder mehrere Nukleotide substituiert,
deletiert, hinzugefügt
und/oder in diese Nukleotidsequenz bestehend aus 1251 Nukleotiden
eingeführt
wurden, besteht.
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Der
dritte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Gen, das an
das Gen gemäß dem zweiten
Aspekt unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, und das
für das
Polypeptid mit einer Agarase-Aktivität gemäß dem ersten Aspekt kodiert.
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Der
vierte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein rekombinantes
DNA-Molekül,
das das Gen gemäß dem zweiten
oder dritten Aspekt enthält.
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Der
fünfte
Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Transformante, die
das rekombinante DNA-Molekül
gemäß dem vierten
Aspekt beherbergt.
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Der
sechste Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Herstellung eines Polypeptids mit einer Agarase-Aktivität, wobei
das Verfahren das Kultivieren eines Mikroorganismus, das zur Herstellung einer
Agarase fähig
ist (z.B. einem Mikroorganismus, der zu demselben Genus gehört wie der
Mikroorganismus NAB2-1-1 (FERM BP-7855)), und Einsammeln der Agarase
gemäß dem ersten
Aspekt von der Kultur, umfasst.
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Der
siebte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Herstellung eines Polypeptids mit einer Agarase-Aktivität, wobei
das Verfahren das Kultivieren der Transformante gemäß dem fünften Aspekt und
das Einsammeln der Agarase gemäß dem ersten
Aspekt aus der Kultur umfasst.
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Der
achte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Extraktion eines Stoffes aus einem Agarosegel, wobei das Verfahren
den Verdau eines Agarosegels mit der Agarase gemäß dem ersten Aspekt umfasst.
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Der
neunte Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit, der
für das
Verfahren zur Extraktion eines Stoffes aus einem Agarosegel gemäß dem achten
Aspekt verwendet wird und der die Agarase gemäß dem ersten Aspekt enthält.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Wie
hier verwendet bezeichnet ein Oligosaccharid ein Saccharid, das
aus zwei oder mehreren und 10 oder weniger Monosacchariden aufgebaut
ist. Ein Agarooligosaccharid bezeichnet ein Oligosaccharid, das eine
Struktur besitzt, bei der D-Galaktose und 3,6-Anhydro-L-Galaktose
abwechselnd miteinander über α-1,3-Bindungen
und β-1,4-Bindungen
verbunden sind und 3,6-Anhydro-L-Galaktose an dessen reduzierendem
Ende besitzt. Ein Neoagarooligosaccharid bezeichnet ein Oligosaccharid,
das eine Struktur besitzt, bei der D-Galaktose und 3,6-Anhydro-L-Galaktose
abwechselnd miteinander über α-1,3-Bindungen
und β-1,4-Bindungen
miteinander verbunden sind und 3,6-Anhydro-L-Galaktose an dessen
nicht-reduzierenden Ende besitzt.
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Ein
Polysaccharid bezeichnet ein Saccharid, das ein anderes ist als
Monosaccharide und Oligosaccharide.
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Die
Agarase der vorliegenden Erfindung ist eine, die eine Aminosäuresequenz
enthält,
die aus 417 Resten von der Aminosäurezahl 21 bis zur Aminosäurezahl
437 in der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 22 besteht.
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Eine
Ausführungsform
betrifft ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz enthält, in der
ein oder mehrere Aminosäuren
substituiert, deletiert, hinzugefügt und/oder in die oben genannte
Aminosäuresequenz eingeführt wurden.
Zum Beispiel ist eines mit einer Region, die mindestens 70% oder
mehr, vorzugsweise 80% oder mehr oder am meisten bevorzugt 90% oder
mehr Homologie zu der Aminosäuresequenz
aufweist, eingeschlossen. Die Homologie kann gemäß einem bekannten Verfahren
unter Verwendung eines Computerprogramms für eine solche Berechnung, wie
DNASIS (Takara Shuzo) berechnet werden.
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Die
erfindungsgemäße Agarase
kann sowohl auf Polysaccharide (z.B. Agarose) als auch auf Oligosaccharide
(z.B. Agarooligosaccharide und Neoagarooligosaccharide) wirken.
Zum Beispiel beträgt
die optimale Reaktionstemperatur 45°C oder höher.
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Es
gibt keine spezifische Beschränkung
hinsichtlich der erfindungsgemäßen Enzyme,
so lange sie die erwähnten
Eigenschaften besitzen. Beispiele hierzu umfassen eine Agarase,
die von einem marinen Mikroorganismus NAB2-1-1 (FERM BP-7855) produziert
wird.
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Es
gibt auch keine spezifische Beschränkung hinsichtlich dem Spaltungsmodus
der Agarase. Zum Beispiel kann die Agarase eine α-Agarase sein, die eine α-1,3-Bindung
zwischen 3,6-Anhydro-L-Galaktose und D-Galaktose hydrolysiert oder
eine β-Agarase sein, die
eine β-1,4-Bindung
zwischen D-Galaktose und 3,6-Anhydro-L-Galaktose hydrolysiert.
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Die α-Agarase
ist ein Enzym, das eine α-1,3-Bindung
zwischen 3,6-Anhydro-L-Galaktose und D-Galaktose hydrolysiert und
sowohl auf Polysaccharide (z.B. Agarose) als auch auf Oligosaccharide
(z.B. Agarohexaose) wirken kann. Beispiele hierzu umfassen Agarase
II, die eine α-Agarase
ist, die von einem marinen Mikroorganismus NAB2-1-1 (FERM BP-7855)
produziert wird.
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Agarase
II, die durch den Mikroorganismus NAB2-1-1 produziert wird, ist
ein Enzym, das eine α-1,3-Bindung
zwischen 3,6-Anhydro-L-Galaktose und D-Galaktose in einem Polysaccharid
oder einem Oligosaccharid hydrolysiert. Das Enzym wirkt auf Agarose,
Agarohexaose und Agarooligosaccharide, die länger sind als Agarohexaose
(z.B. Agarooctaose), sowie auf Neoagarohexaose und Neoagarooligosaccharide,
die länger
sind als Neoagarohexaose.
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Die
erfindungsgemäße β-Agarase
ist ein Enzym, das eine β-1,4-Bindung
zwischen D-Galaktose und 3,6-Anhydro-L-Galaktose hydrolysiert und
sowohl auf Polysaccharide (z.B. Agarose) als auch Oligosaccharide (z.B.
Agarohexaose) wirkt. Es gibt keine spezifische Beschränkung hinsichtlich
des erfindungsgemäßen Enzyms,
so lange es die oben genannten Eigenschaften aufweist. Beispiele
hierzu umfassen Agarase I, die eine β-Agarase ist, die durch einen
marinen Mikroorganismus NAB2-1-1 (FERM BP-7855) produziert wird.
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Agarase
I, die durch den Mikroorganismus NAB2-1-1 produziert wird, ist ein
Enzym, das eine β-1,4-Bindung
zwischen D-Galaktose und 3,6-Anhydro-L-Galaktose in einem Polysaccharid
oder einem Oligosaccharid hydrolysiert. Das Enzym wirkt auf Agarose,
Neoagarohexaose und Neoagarooligosaccharide, die länger sind
als Neoagarohexaose (z.B. Neoagarooctaose) sowie Agarohexaose und
Agarooligosaccharide, die länger
sind als Agarohexaose.
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Ein
Verfahren zur Messung der Aktivitäten der oben genannten Enzyme
und die physikalischen und chemischen sowie enzymatischen Eigenschaften
der Enzyme sind unten beschrieben.
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(1) Enzymologisches Messverfahren
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Die
Aktivität
der erfindungsgemäßen Agarase
wird durch Durchführung
einer enzymatischen Reaktion unter Verwendung von Agarose L03 (Takara
Shuzo) als Substrat gemessen und die entstehende Agarotetraose oder
Neoagarotetraose wird dann unter Verwendung von Hochleistungsflüssigchromatographie
quantifiziert. Genauer gesagt besteht das hier verwendete Verfahren
zur Messung einer enzymatischen Aktivität zur Messung einer Aktivität von einer
gereinigten Enzympräparation
oder einem Enzym im Verlauf der Aufreinigung aus folgenden Schritten:
Eine
Lösung,
die eine Agarase bei einer Konzentration von 0,2% (w/v) oder 0,5%
(w/v) enthielt, in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid
(im Falle von Agarase I) enthält
oder 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Calciumchlorid und
10 mM Natriumchlorid (im Falle von Agarase II) enthält, wird
hergestellt. 180 μl
dieser Lösung
wird als Substrat mit 20 μl
einer Enzymlösung
vermischt. Das Gemisch wird bei 50°C für 5 bis 30 Minuten reagieren
gelassen, vorzugsweise für
10 Minuten, und dann in kochendes Wasser gegeben oder bei 75°C für 1 Minute
zum Abstoppen der Reaktion erhitzt. 30 μl des Reaktionsgemisches werden
auf eine TSKgel-α-2500-Säule (innerer
Durchmesser: 7,8 mm; Länge:
300 mm; Tosoh) aufgetragen. Agarotetraose, die bei einer Verzögerungszeit
von ungefähr
25 Minuten eluiert wird oder Neoagarotetraose, die bei einer Verzögerungszeit
von ungefähr
24 Minuten eluiert wird, wird unter Verwendung von 70% Acetonitril-Lösung als
ein Eluent bei einer Durchflussrate von 0,8 ml/Minute quantifiziert.
Eine Einheit (1 U) wird als die Menge des Enzyms definiert, die
1 μmol Agarotetraose
in 10 Minuten produziert.
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(2) Optimaler pH
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Einem
Enzym wurde es ermöglicht,
auf Agarose als ein Substrat in einem Reaktionsgemisch zu wirken,
das unter Verwendung eines Acetatpuffers (pH 4,5), eines Malatpuffers
(pH 5,5), eines Acetatpuffers (pH 6,0, 6,5) oder eines Tris-HCl-Puffers
(pH 7,0, 7,5, 8,8) präpariert
wurde. Als Ergebnis wurde gezeigt, dass sowohl Agarase I als auch
Agarase II ihre Aktivitäten
zum Verdau von Agarose unter schwach sauren bis schwach basischen
Bedingungen ausüben
konnten.
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(3) Optimale Temperatur
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Agarase
II besitzt eine hohe enzymatische Aktivität bei Temperaturen im Bereich
von 45 bis 55°C
und weist eine maximale Aktivität
bei ungefähr
50°C auf.
Die erfindungsgemäße Agarase
I weist eine hohe enzymatische Aktivität bei Temperaturen im Bereich
von 54 bis 70°C
auf und weist eine maximale Aktivität bei ungefähr 55 bis 65°C auf.
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(4) Thermostabilität
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Es
wurden die verbleibenden Aktivitäten
der Enzympräparationen
nach einer Behandlung bei 48°C, 50°C, 55°C, 60°C oder 65°C für einen
gegebenen Zeitraum gemessen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass Agarase
II 40% ihrer Aktivität
nach einer Behandlung bei 55°C
für 10
Minuten aufwies. Agarase I wies 100% ihrer Aktivität nach einer
Behandlung bei 60°C
für 10
Minuten auf; 100% ihrer Aktivität
nach einer Behandlung bei 60°C
für 20
Minuten; 98% ihrer Aktivität
nach einer Behandlung bei 60°C
für 30
Minuten; 100% ihrer Aktivität
nach einer Behandlung bei 65°C
für 10
Minuten; 95% ihrer Aktivität
nach einer Behandlung bei 65°C
für 20
Minuten; 90% ihrer Aktivität
nach einer Behandlung bei 65°C
für 30
Minuten; und 90% ihrer Aktivität
nach einer Behandlung bei 65°C
für 60
Minuten.
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(5) Ca-Ionen-Erfordernis
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Bekannte
Agarasen benötigen
Calcium zur Ausübung
ihrer Aktivitäten.
Die Calcium-Ionen-Erfordernisse der vorliegenden Erfindung wurden
untersucht. Als Ergebnis wurde gezeigt, dass in der Abwesenheit
eines Calcium-Ions Agarase II 60% der Aktivität aufwies, die in der Gegenwart
eines Calcium-Ions ausgeübt
wurde. In der Abwesenheit eines Calcium-Ions besaß Agarase
I 100% der Aktivität,
die in der Gegenwart eines Calcium-Ions ausgeübt wurde. Daher übten sowohl
Agarase II als auch Agarase I ihre Aktivitäten ohne den Zusatz eines Calcium-Ions
aus.
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Agarase
II wird in der Gegenwart von CaCl2 stabilisiert,
während
es nicht durch ein Mangan-Ion oder ein Magnesium-Ion beeinflusst
wird.
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(6) Molekulargewicht
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Die
Molekulargewichte von Agarase II und Agarase I wurden auf ungefähr 117000
bzw. auf ungefähr 48000
anhand von SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) bei Verwendung
eines 10–20%
Polyacrylamid-Gradientengels geschätzt.
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(7) Aminosäuresequenzierung
gemäß dem Edman-Abbauverfahren
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Die
N-terminalen Aminosäuresequenzen
von Agarase II und Agarase I, die gemäß dem Edman-Abbauverfahren
bestimmt wurden, waren Glu-Thr-Ile-Val-Leu-Gln-Ala-Glu-Ser-Phe bzw. Ala-Asp-Xaa-Asp-Gly-Val-Pro-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly.
Die N-terminalen Aminosäuresequenzen
von Agarase II und Agarase I sind in SEQ ID NO: 2 bzw. 1 gezeigt.
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Wie
unten beschrieben, wurden sowohl ein Gen, das für Agarase II kodiert, als auch
ein Gen, das für Agarase
I kodiert, isoliert. Es wurden auch die Aminosäuresequenzen, die für diese
Gene kodieren, bestimmt. Aminosäuresequenzen,
die durch das Agarase II-Gen und das Agarase I-Gen kodiert werden,
sind in der SEQ ID NO: 23 bzw. 22 gezeigt. Ein Polypeptid, das aus
772 Aminosäuren
von der Aminosäurezahl
318 bis zur Aminosäurezahl
1089 in der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 23 besteht, weist die Aktivität der α-Agarase auf und ein Polypeptid,
das aus 417 Aminosäuren
von der Aminosäurezahl
21 bis zur Aminosäurezahl
437 in der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 22 besteht, weist die Aktivität der erfindungsgemäßen β-Agarase auf.
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Die
erfindungsgemäße Agarase
kann von einer Kultur aufgereinigt werden, die durch Kultivierung
eines Mikroorganismus NAB2-1-1 (FERM BP-7855) erhalten wurde. NAB2-1-1
wurde von Meereswasser als Bakterium isoliert, das Agar assimiliert.
Es hat die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften.
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(Mikrobiologische Eigenschaften)
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(I) Morphologie
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Künstliches
Meereswasser (Produktname: Jamarin S; Jamarin Laboratory) wurde
präpariert.
Pepton (Difco) wurde bei einer Konzentration von 0,3% (w/v) und
Hefeextrakt (Difco) bei einer Konzentration von 0,02% (w/v) dazu
zugegeben. Der pH wurde dann auf 7,8 mit 3 M Natriumcarbonat eingestellt.
Agarose L03 (Takara Shuzo) wurde bei einer Konzentration von 0,1%
(w/v) dazu zugegeben. Nach der Sterilisation in einem Autoklav wurde
der oben genannte Mikroorganismus in das Gemisch angeimpft und bei
37°C über Nacht
bei 120 UpM kultiviert. Der Mikroorganismus wuchs in der Kultur
als ein gramm-negatives Bazillus, das beweglich war, ein polares
Flagellum aufwies, aerob war und Salz benötigte.
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(2) Wachstum
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Künstliches
Meereswasser (Produktname: Jamarin S; Jamarin Laboratory) wurde
präpariert.
Pepton (Difco) wurde bei einer Konzentration von 0,3% (w/v) und
Hefeextrakt (Difco) bei einer Konzentration von 0,02% (w/v) dazu
zugegeben. Der pH wurde dann auf 7,8 mit 3 M Natriumcarbonat eingestellt.
Agar (Nacalai Tesque) wurde bei einer Konzentration von 1,5% (w/v)
dazu zugegeben. Das Gemisch wurde autoklaviert, um Platten herzustellen.
Wenn der oben genannte Mikroorganismus auf die Platten angeimpft
wurde, wurde gezeigt, dass
- (i) er bei 30 bis
40°C gut
wuchs;
- (ii) das Agar-Gel flüssig
wurde, als die Zellen wuchsen; und
- (iii) er bei einem pH von 6,0 bis 8,0 gut wuchs.
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NAB2-1-1
wurde am 10. Januar 2001 (das Datum der ursprünglichen Hinterlegung) bei
der International Patent Organism Depositary, National Institute
of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central
6, 1-1, Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM
BP-7855 hinterlegt.
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Informationen
bezüglich
der taxonomischen Einordnung des oben genannten Mikroorganismus
kann erhalten werden, indem die Nukleotidsequenz des Gens, das für die ribosomale
16S-RNA (16s rRNA) kodiert, analysiert wird. Es ist bekannt, dass
die Nukleotidsequenz des Gens für
die 16s rRNA spezifisch für
jeden mikrobiellen Stamm ist. Insbesondere wird chromosomale DNA
von dem Mikroorganismus NAB2-1-1 extrahiert. Es wird eine PCR unter
Verwendung von Primern durchgeführt,
die verwendet werden können,
um eine Region des Gens oder eines Teils davon zu amplifizieren.
Eine Nukleotidsequenz des amplifizierten DNA-Fragments wird bestimmt.
Eine Homologie-Recherche, bei der die GeneBank-Datenbank eingesetzt
wird, wird gegen die bestimmte Sequenz durchgeführt. Dadurch können Mikroorganismen,
die ähnliche
Nukleotidsequenzen in der Region aufweisen, d.h. taxonomisch nahe
Mikroorganismen, gefunden werden.
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Ein
DNA-Fragment, das sich von einem Gen für die ribosomale 16S RNA in
dem Mikroorganismus NAB2-1-1 ableitet, wurde gemäß einem Verfahren, wie es in
der Bekanntmachung der japanischen Gesellschaft für mikrobielle Ökologie,
10: 31–42
(1995) beschrieben wurde, amplifiziert. Die in der Literatur beschriebenen
Primer 27f und 1492r wurden für
die PCR verwendet (Nukleotidsequenzen der Primer 27f und 1492r sind
in den SEQ ID NO: 32 bzw. 33 gezeigt). Die Nukleotidsequenz des
entstehenden amplifizierten DNA-Fragments wurde analysiert. Als
Ergebnis wurden die folgenden Mikroorganismen gefunden, die jeweils
die höchste
Homologie von ungefähr
90% der oben genannten Region mit dem Mikroorganismus aufweisen,
der die erfindungsgemäße Agarase
produziert:
Pseudoalteromonas sp. KT0812A
Aeromonas schubertii
-
Die
erfindungsgemäße Agarase
kann von NAB2-1-1 erhalten werden sowie von einer spontanen oder künstlichen
Mutante von NAB2-1-1 oder einem Organismus, der zu dem Genus gehört, zu dem
NAB2-1-1 gehört
und in der Lage ist, die erfindungsgemäße Agarase herzustellen.
-
Eine
künstliche
Mutante kann gemäß einem
bekannten Verfahren erhalten werden, wie Bestrahlung, ultraviolette
Bestrahlung oder Behandlung mit einem mutagenen Agens.
-
Es
ist bekannt, dass die Homologie zwischen den Nukleotidsequenzen
von Genen für
die 16S rRNA von Mikroorganismen, die zu demselben Genus gehören, im
Allgemeinen ungefähr
99% oder mehr beträgt. Daher
kann ein Mikroorganismus, bei dem dessen Nukleotidsequenz des Gens
für die
16S rRNA eine Homologie von 99% oder mehr aufweist, im Vergleich
zu dem Mikroorganismus NAB2-1-1, wie der erfindungsgemäße Mikroorganismus
NAB2-1-1 verwendet werden.
-
Ein
Medium, das eine Stickstoffquelle, eine anorganische Substanz und
dergleichen enthält,
kann durch den Mikroorganismus, ebenso wie Agar, Agarose oder dergleichen
als Kohlenstoffquelle verwendet werden kann, als Medium zur Kultivierung
des Mikroorganismus benutzt werden. Ein kommerziell erhältliches Agar
oder Agarose kann verwendet werden. Beispiele von Stickstoffquellen
umfassen Fleischextrakt, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat, Trypton
und Pepton. Hefeextrakt und Pepton werden bevorzugt verwendet. Eine
solche Stickstoffquelle kann auch als Kohlenstoffquelle neben Agar
oder Agarose verwendet werden. Weiterhin können Natriumchlorid, Eisencitrat,
Magnesiumchlorid, Natriumsulfat, Calciumchlorid, Kaliumchlorid,
Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumbromid, Strontiumchlorid,
Natriumborat, Natriumsilicat, Natriumfluorid, Ammoniumnitrat, Dinatriumhydrogenphosphat
und dergleichen in Kombination als Salze verwendet werden.
-
Insbesondere
kann ein Medium, das durch Zusatz von Pepton, Hefeextrakt und Agar
oder Agarose präpariert
wird und ein Medium, das aus künstlichem
Meerwasser Jamarin S besteht, vorzugsweise verwendet werden. Es
ist bevorzugt Agar oder Agarose bei einer Konzentration von 0,1
bis 2,0% zuzugeben. Festes oder flüssiges Medium kann hergestellt
werden, indem die Konzentration von Agar oder Agarose in geeigneter
Weise verändert
wird. Eine Flüssigkultur
unter Verwendung einer Konzentration von 0,1 bis 0,3% ist für die Zwecke der
Herstellung des Enzyms bevorzugt, wohingegen eine Festkultur unter
Verwendung einer Konzentration von 1,2 bis 2,0% für die Zwecke
der Konservierung von Zellen bevorzugt ist. Wenn Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt
für eine
Flüssigkultur
verwendet wird, kann sie bei einer Konzentration von 0,1 bis 1,0%
verwendet werden.
-
Beispielsweise
kann die Kultivierungstemperatur 30 bis 40°C, der pH des Mediums 6,0 bis
8,0 und die Kultivierungszeit 12 bis 48 Stunden betragen, obwohl
die Kulturbedingungen mehr oder weniger in Abhängigkeit von der Zusammensetzung
des Mediums variieren können.
-
Die
während
der Kultivierung hergestellte α-Agarase
und/oder die β-Agarase
wird, wie oben beschrieben, in das Äußere der Zellen sekretiert.
Die Zellen werden dann nach der Kultivierung mittels Zentrifugation, Filtration
oder dergleichen entfernt, um einen Kulturüberstand zu erhalten.
-
Der
entstehende Kulturüberstand
kann unter Verwendung von Vakuumkonzentration oder Ultrafiltration
konzentriert werden, um ein flüssiges
Enzym herzustellen. Alternativ kann der Kulturüberstand zu einem pulverigen
Enzym mittels Lyophilisierung, Sprühtrocknung oder dergleichen
umgewandelt werden, um eine Enzym-Rohpräparation herzustellen. Die α-Agarase
und/oder die β-Agarase
kann teilweise durch ein konventionelles Aufreinigungsverfahren
aufgereinigt werden, wie z.B. durch Entsalzung mit Ammoniumsulfat
oder durch Lösungsmittelpräzipitation.
Weiter kann eine gereinigte Enzympräparation, die nach einer Elektrophorese
eine einzelne Bande ergibt, unter Verwendung von bekannten Aufreinigungsverfahren
erhalten werden, wie z.B. Säulenchromatographien
(z.B. Anionenaustauschsäule
und Gelfiltrationssäule)
in Kombination.
-
Agarooligosaccharide
wie Agarobiose, Agarotetraose und Agarohexaose können durch Reaktion der so
erhaltenen Kultur oder der α-Agarase
mit einem variierenden Aufreinigungsgrad mit einem Polysaccharid, das
in der Rotalge enthalten ist (z.B. Agar oder Agarose), als Substrat
umgesetzt werden.
-
Agarose
ist ein Polysaccharid, das eine Struktur besitzt, bei der D-Galaktose
und 3,6-Anhydro-L-Galaktose abwechselnd über α-1,3-Bindungen und β-1,4-Bindungen
miteinander verbunden sind. Eine β-Agarase
ist ein Enzym, das β-1,4-Bindungen
in Agarose hydrolysiert. Oligosaccharide mit D-Galaktose an ihren
reduzierenden Enden, die durch die Wirkung dieses Enzyms hergestellt
werden, werden als Neoagarooligosaccharide bezeichnet, die nicht
die physiologischen Aktivitäten
aufweisen, wie sie die Agarooligosaccharide besitzen. Wenn eine α-Agarase,
die α-1,3-Bindungen
spaltet, in Agarose verwendet wird, können Agarooligosaccharide mit
3,6-Anhydro-L-Galaktose an deren reduzierenden Enden hergestellt
werden. Es sind zwei Enzyme, die sich von Alteromonas agarlyticus
GJ1B ableiten, und ein Bakterium des Genus Vibrio (Stamm JT0107-L4)
als α-Agarasen
bekannt. Jedoch kann die von Alteromonas agarlyticus GJ1B produzierte α-Agarase
nicht auf Agarohexaose oder kürzere
Oligosaccharide wirken, wohingegen die α-Agarase, die von dem Bakterium
des Genus Vibrio abstammt, keine Agarose verdauen kann. Daher ist
es nicht möglich,
Agarobiose oder Agarotetraose aus Agarose als Ausgangsstoff unter
Verwendung einer α-Agarase
effizient herzustellen.
-
Die
kürzlich
durch die Erfinder gefundenen α-Agarasen,
die in der WO 00/50578 beschrieben sind, sind Enzyme, die auf Agarose,
Agarohexaose und Agarooligosac charide wirken, die länger sind
als Agarohexaose. Daher wirken sie auf Agarose, um Agarooligosaccharide
zu produzieren. Weiter können
sie die einzelne α-1,3-Bindung
in Agarohexaose spalten, welche als Erzeugnis dieser Aktivität erzeugt
wird. Indem diese Enzyme verwendet werden, ist es möglich, Agarobiose
und Agarotetraose, ein Disaccharid und ein Tetrasaccharid, die unter
Verwendung von konventionellen Verfahren kaum hergestellt werden,
herzustellen. Die optimalen Reaktionstemperaturen von diesen Enzymen
betragen ungefähr
40°C. Agarose
wird oft bei einer Konzentration von 1% (w/v) verwendet. Bei einer
solchen Konzentration ist sie bei 50°C nicht erstarrt, aber sie ist bei
40°C erstarrt.
Das bedeutet, dass, wenn ein konventionelles Enzym verwendet wird,
Agarose bei einer hohen Konzentration bei der optimalen Reaktionstemperatur
für das
Enzym erstarrt ist und die enzymatische Reaktion verhindert werden
kann. Daher war es schwierig Agarobiose oder Agarotetraose effizient
herzustellen.
-
Andererseits
kann sie für
eine Reaktion einer Temperatur, bei der Agarose nicht erstarrt ist,
verwendet werden, da die optimale Reaktionstemperatur oder α-Agarase
50°C beträgt. Daher
ermöglicht
sie eine effiziente Herstellung von Agarooligosacchariden.
-
Die α-Agarase
ist ein Enzym, das auf Agarose, Agarohexaose und Agarooligosaccharide
wirkt, die länger
sind als Agarohexaose, wie anhand der oben genannten physikalischen
Eigenschaften gezeigt. Daher wirkt sie auf Agarose, um Agarooligosaccharide
herzustellen. Weiter kann sie α-1,3-Bindungen
in Agarooligosacchariden spalten, die als Ergebnis der Wirkung erzeugt
werden, um kleinere Agarooligosaccharide zu erzeugen, wie z.B. Agarobiose
und Agarotetraose. Zusätzlich
ist ihre optimale Temperatur hoch und sie ist in exzellenter Weise
thermostabil. Daher ist es unter Verwendung der α-Agarase möglich, Agarobiose und Agarotetraose
zu erhalten, d.h. ein Disaccharid und ein Tetrasaccharid, die bislang
mit den konventionellen Verfahren in großen Mengen ohne Vermeidung
der Reaktion einer Erstarrung von Agarose schwierig herzustellen waren.
-
Substratspezifitäten der
konventionellen α-Agarasen
und der α-Agarase
sind in Tabelle 1 gezeigt. In der Tabelle bezeichnet + und – die Fähigkeit
bzw. Unfähigkeit
des Enzyms, das Substrat zu verdauen.
-
-
Die
Agarooligosaccharide, die unter Verwendung der α-Agarase produziert werden,
enthalten Agarobiose und Agarotetraose. Die Agarooligosaccharide
können
Agarohexaose oder Agarooligosaccharide enthalten, die länger sind
als Agarohexaose, so lange deren Vorkommen nicht mit dem Verwendungszweck
interferiert. Zum Beispiel kann Agar, Agarose oder Oligosaccharide,
die von Agar oder Agarose stammen als Ausgangsstoff zur Herstellung
von Agarobiose, Agarotetraose und Agarohexaose unter Verwendung
der α-Agarase
verwendet werden. Die verwendeten Bedingungen für die Wirkung der α-Agarase
sind nicht besonders beschränkt,
so lange das Enzym dessen Aktivität unter den verwendeten Bedingungen
ausübt.
Zum Beispiel ist es bevorzugt, dass Agarase II bei einem pH von
6,0 bis 8,0 bei 45°C
bis 55°C
gehalten wird. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches ist nicht
spezifisch beschränkt,
so lange sie für
die Wirkung des Enzyms geeignet ist.
-
Wie
oben beschrieben, sind die unter Verwendung der α-Agarase produzierten Oligosaccharide
hauptsächlich
Hexasaccharide oder kürzere
Oligosaccharide mit niedrigen Polymerisationsgraden. Jedoch ist
es möglich,
gegebenenfalls Oligosaccharide mit unterschiedlichen Polymerisationsgraden
zu produzieren, indem die Reaktionsbedingung oder dergleichen zweckmäßig ausgewählt werden.
Es ist auch möglich
Agarobiose, Agarotetraose und Agarohexaose unabhängig zu erhalten, indem die
so erhaltenen Oligosaccharide aufgetrennt und aufgereinigt werden.
-
Agar
oder Agarose kann in Agarooligosaccharide, wie Neoagarobiose, Neoagarotetraose
und Neoagarohexaose verdaut werden, indem es der Kultur oder der
erfindungsgemäßen β-Agarase,
die wie oben beschrieben erhalten wurden, bei verschiedenen Aufreinigungsgraden
erlaubt wird, auf ein Polysaccharid, das in der Rotalge enthalten
ist (z.B. Agar oder Agarose), zu wirken.
-
Enzyme,
die von Vibrio sp. JT0107-1,4 (JP-A 8-38172) und Pseudomonas atlantica
stammen (Morrice, L. M. et al., Eur. J. Biochem., 135, 553–558 (1983)),
sind als β-Agarasen bekannt.
Die optimalen Reaktionstemperaturen davon betragen ungefähr 30°C. Wenn ein
solches Enzym für
eine Extraktion einer Nukleinsäure oder
dergleichen aus einem Agarosegel verwendet wird, wird die Reaktion
verhindert, da Agarase bei einer Temperatur, bei der das Enzym dessen
Aktivität
ausüben
kann, erstarrt ist. Daher kann es nicht in praktischer Anwendung
verwendet werden. Enzyme, die von Flavobakterium sp. Stamm NR19
(US-Patent Nr. 5,869,310), Pseudomonas sp. N-7 (JP-B 7-97987) und
Vibrio sp. PO-303 (JP-A 8-294389) abstammen, sind dafür bekannt,
dass ihre optimale Reaktionstemperaturen höher sind als die der oben genannten
Enzyme. Da jedoch ihre optimalen Temperaturen (55°C oder darunter)
niedriger sind als der Schmelzpunkt eines Agarosegels mit niedrigem
Schmelzpunkt (65°C),
können
noch Probleme hinsichtlich der praktischen Verwendung bestehen.
-
Andererseits
besitzt die erfindungsgemäße β-Agarase
eine hohe Aktivität
in einem weiten Temperaturbereich (50°C bis 70°C) und übt deren maximale Aktivität bei 55°C bis 65°C aus. Daher
ermöglicht
sie eine Reaktion, bei der ein Agarase-Gel vollständig geschmolzen
ist. Weiter verbleibt 98% der Aktivität der erfindungsgemäßen β-Agarase
nach einer Behandlung bei 65°C
für 30
Minuten, was darauf hindeutet, dass sie in exzellenter Weise thermostabil
ist. Daher ermöglicht
die Verwendung der erfindungsgemäßen β-Agarase
eine effiziente Extraktion einer Nukleinsäure oder dergleichen aus einem
Agarosegel, ohne dass eine Erstarrung von Agarose verhindert werden
muss. Eine solche Extraktion ist mit konventionellen Verfahren nur
schwierig durchführbar.
-
Das α-Agarase-Gen
ist ein Gen, das für
Polypeptid kodiert, das die oben genannte α-Agarase-Aktivität besitzt.
Daher betrifft es eine Nukleinsäure,
die eine Nukleotidsequenz enthält,
die für
eine Aminosäuresequenz
für ein
Polypeptid mit einer α-Agarase-Aktivität kodiert.
Beispiele von α-Agarasen-Gene
umfassen ein Gen, das eine Nukleotidsequenz enthält, das für Agarase II kodiert, die von
dem Mikroorganismus NAB2-1-1 (FERM BP-7855) stammt. Gene, die für Agarase
II kodieren, sind beispielhaft durch ein Gen mit einer Nukleotidsequenz,
die für
ein Polypeptid bestehend aus 772 Aminosäureresten von der Aminosäurezahl
318 bis zur Aminosäurezahl
1089 in SEQ ID NO: 23 kodiert, veranschaulicht.
-
Die α-Agarase-Gene
umfassen auch eine Nukleinsäure,
die eine Nukleotidsequenz enthält,
die für
ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz besitzt, bei der
eine oder mehrere Aminosäuren
substituiert, deletiert, hinzugefügt oder in die oben genannte
Aminosäuresequenz
eingeführt
wurden, und eine α-Agarase-Aktivität besitzt.
-
Auch
umfassen die Gene ein Gen mit einer Nukleotidsequenz, die aus 2316
Nukleotiden von der Nukleotidzahl 952 bis zur Nukleotidzahl 3267
in SEQ ID NO: 21 besteht. Die Gene umfassen auch eine Nukleinsäure, die
eine Nukleotidsequenz enthält,
die eine Nukleotidsequenz besitzt, bei der ein oder mehrere Nukleotide
substituiert, deletiert, hinzugefügt oder in die oben genannte
Nukleotidsequenz eingeführt
wurden, und für
ein Polypeptid mit einer α-Agarase-Aktivität kodiert.
-
Weiter
umfassen die Gene eine Nukleinsäure,
die eine Nukleotidsequenz enthält,
die an das oben genannte Gen unter stringenten Bedingungen hybridisiert
und für
ein Polypeptid mit einer α-Agarase-Aktivität kodiert.
Eine Hybridisierung kann gemäß einem
Verfahren, wie es beispielsweise von T. Maniatis et al. (Hrsg.), Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, 1989, Cold Spring Harbor
Laboratory, beschrieben wurde, durchgeführt werden. Die stringenten
Bedingungen umfassen z.B. die Inkubation mit einer Sonde bei 65°C über Nacht
in einer Lösung,
die 6 × SSC
(1 × SSC:
0,15 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0), 0,5% SDS,
5 × Denhardt's und 100 mg/ml Herings-Spermien-DNA
enthält.
-
Das
erfindungsgemäße β-Agarase-Gen
ist ein Gen, das für
ein Polypeptid mit der oben genannten β-Agarase-Aktivität kodiert.
Es betrifft daher eine Nukleinsäure,
die eine Nukleotidsequenz enthält,
die für
eine Aminosäuresequenz
für ein
Polypeptid mit einer β-Agarase-Aktivität kodiert.
Beispiele der erfindungsgemäßen β-Agarase-Gene umfassen ein
Gen, das eine Nukleotidsequenz enthält, das für Agarase I kodiert, die von
dem Mikroorganismus NAB2-1-1 (FERM BP-7855) stammt. Gene, die für Agarase
I kodieren, sind z.B. ein Gen mit einer Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid,
das aus 417 Aminosäureresten
von der Aminosäurezahl
21 bis zur Aminosäurezahl
437 in SEQ ID NO: 22 besteht, kodiert.
-
Die
erfindungsgemäßen β-Agarase-Gene
umfassen auch eine Nukleinsäure,
die eine Nukleotidsequenz enthält,
die für
ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz besitzt, bei der
eine oder mehrere Aminosäuren
substituiert, deletiert, hinzu gefügt oder in der oben genannten
Aminosäuresequenz
eingeführt wurden,
und eine β-Agarase-Aktivität besitzt.
-
Auch
umfassen die erfindungsgemäßen Gene
ein Gen mit einer Nukleotidsequenz, die aus 1251 Nukleotiden von
der Nukleotidzahl 61 bis zur Nukleotidzahl 1311 in SEQ ID NO: 20
besteht. Die erfindungsgemäßen Gene
umfassen auch eine Nukleinsäure,
die eine Nukleotidsequenz enthält,
die eine Nukleotidsequenz besitzt, bei der ein oder mehrere Nukleotide
substituiert, deletiert, hinzugefügt oder in der oben genannten
Nukleotidsequenz eingeführt
wurden und für
ein Polypeptid mit einer β-Agarase-Aktivität kodiert.
-
Weiter
umfassen die erfindungsgemäßen Gene
eine Nukleinsäure,
die eine Nukleotidsequenz enthält, die
an das oben genannte Gen unter stringenten Bedingungen hybridisiert
und für
ein Polypeptid mit einer β-Agarase-Aktivität kodiert.
Die stringenten Bedingungen sind beispielsweise solche wie oben
beschrieben.
-
Zum
Beispiel kann das erfindungsgemäße Agarase-Gen
wie folgt kloniert werden.
-
Eine
genomische DNA wird von einem Mikroorganismus, der eine Agarase
produziert, präpariert.
Die genomische DNA kann gemäß einem
geeigneten bekannten Verfahren präpariert werden. Zum Beispiel
kann sie präpariert
werden, indem Verfahren wie eine Lysozymbehandlung, Proteasebehandlung,
RNAse-Behandung, Phenolbehandlung und Ethanolpräzipitation in Kombination verwendet
werden. Die so erhaltene genomische DNA wird durch geeignete bekannte
Mittel, wie Sonifizierung oder Verdau mit einem Restriktionsenzym abgebaut.
Die entstehenden DNA-Fragmente werden entsprechend einem konventionellen
Verfahren in einen Vektor eingebaut (z.B. einem Plasmidvektor),
um rekombinante DNA-Moleküle
zu konstruieren. Die rekombinanten DNA-Moleküle werden dann in einen geeigneten
Wirt eingeführt,
um Transformanten zu erhalten (z.B. Escherichia coli). Verfahren
zur Konstruktion von rekombinanten DNA-Molekülen, Transformation und dergleichen,
die für
die Verwendung mit dem Vektor und dem Wirt geeignet sind, können beispielsweise
von konventionellen Verfahren ausgewählt werden, z.B. solche, die
in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, beschrieben
werden. Auf diese Weise wird eine genomische Bibliothek, die eine
Transformante, die ein Agarase-Gen
beherbergt, erhalten.
-
Als
nächstes
wird die genomische Bibliothek durchmustert, um die Transformante,
die das Agarase-Gen beherbergt, auszuwählen. Das Agarase-Gen kann
von der Transformante isoliert werden. Beispiele von Screening-Verfahren
sind wie folgt.
-
(1) Screening unter Verwendung
der Expression der Agarase-Aktivität als Index
-
Eine
genomische Bibliothek wird auf Agarplatten wachsen gelassen. Eine
Transformante, die ein Agarase-Gen beherbergt, exprimiert ein Polypeptid
mit einer Agarase-Aktivität.
Das Polypeptid lysiert ein Agar-Gel durch die Wirkung von dessen
Agarase-Aktivität.
Folglich wird eine Kolonie oder ein Plaque ausgewählt, die ein
Agar-Gel in einer
Agarplatte lysiert.
-
(2) Screening unter Verwendung
von Antikörpern
-
Eine
teilweise aufgereinigte oder gereinigte Roh-Enzympräparation
von einer Agarase wird, wie oben beschrieben, hergestellt. Ein Anti-Agarase-Antikörper wird
unter Verwendung der Präparation
als ein Antigen gemäß einem
konventionellen Verfahren hergestellt.
-
Eine
genomische Bibliothek wird auf Platten wachsen gelassen. Die gewachsenen
Kolonien oder Plaques werden auf Nylon- oder Nitrocellulosefiltern übertragen.
Exprimierte rekombinante Proteine werden auf den Filtern zusammen
mit den Kolonien oder Plaques übertragen.
Die rekombinanten Proteine auf den Filtern werden mit dem Anti-Agarase-Antikörper reagieren
gelassen, um einen Klon zu identifizieren, der mit dem Antikörper reagiert.
-
Der
Klon, der mit dem Antikörper
reagiert, kann gemäß einem
bekannten Verfahren identifiziert werden, z.B. durch Reaktion eines
Peroxidase-konjugierten sekundären
Antikörpers
mit den Filtern, die mit dem Anti-Agarase-Antikörper reagiert haben, Inkubation
des Filters mit einem homogenen Substrat und anschließendes Nachweisen
der entwickelten Farbe.
-
Wenn
ein Expressionsvektor, der eine starke Expression von einem Gen
in einer DNA, die in den Vektor eingebaut ist, bewirkt, für die Konstruktion
der genomischen Bibliothek verwendet wird, die in den oben beschriebenen
Verfahren (1) oder (2) eingesetzt wird, kann eine Transformante,
die das Gen von Interesse beherbergt, leicht ausgewählt werden.
-
(3) Screening durch Hybridisierung
unter Verwendung einer DNA-Sonde
-
Eine
genomische Bibliothek wird auf Platten wachsen gelassen. Wachsende
Kolonien oder Plaques werden auf Nylon- oder Nitrocellulosefiltern übertragen.
DNA wird auf den Filtern durch Denaturierung immobilisiert. Die
DNA auf den Filtern wird an eine markierte Sonde gemäß einem
konventionellen Verfahren hybridisiert, um einen Klon zu identifizieren,
der an die Sonde hybridisiert.
-
Sonden,
die für
dieses Screening verwendet wurden, umfassen ein Oligonukleotid,
das auf der Basis der Information von der oben genannten Aminosäuresequenz
der Agarase hergestellt wurde, ein Oligonukleotid, das auf der Basis
der Information einer anderen Aminosäuresequenz hergestellt wurde
und ein PCR-Fragment, das unter Verwendung von Primern amplifiziert
wurde, die auf der Basis der Information einer solchen Aminosäuresequenz
hergestellt wurden. Beispiele von Markierungen, die für die Sonden
verwendet werden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
eine radioaktive Markierung, eine Fluoreszenzmarkierung, eine Digoxigeninmarkierung
und eine Biotinmarkierung.
-
Eine
genomische Bibliothek, die auf Transformanten angereichert wurde,
die ein Agarase-Gen beherbergen, das wie folgt hergestellt wurde,
kann als genomische Bibliothek zur Verwendung für das Screening verwendet werden.
-
Eine
genomische DNA wird von einem Mikroorganismus, der eine Agarase
produziert, präpariert,
mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut, durch Agarosegel-Elektrophorese
aufgetrennt und dann auf einen Nylon- oder Nitrocellulosefilter
gemäß einem
konventionellen Verfahren geblottet. Die DNA auf dem Filter wird
an die oben genannte markierte Sonde gemäß einem konventionellen Verfahren
hybridisiert, um ein DNA-Fragment nachzuweisen, das an die Sonde
hybridisiert. DNA-Fragmente,
die dem Signal entsprechen, werden extrahiert und von dem Agarosegel
aufgereinigt.
-
Die
so erhaltenen DNA-Fragmente werden in einen Vektor (z.B. einen Plasmidvektor)
gemäß einem konventionellen
Verfahren eingebaut, um rekombinante DNA-Moleküle zu konstruieren. Die rekombinanten DNA-Moleküle werden
dann in einem geeigneten Wirt (z.B. Escherichia coli) eingeführt, um
Transformanten zu erhalten. Ein Transformationsverfahren, das für den zu
verwendenden Vektor geeignet ist, kann aus konventionellen Verfahren
ausgewählt
werden, beispielsweise solchen, die in Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2. Ausgabe, beschrieben wurden. Auf diese Weise wird eine genomische
Bibliothek, die auf Transformanten angereichert ist, die ein Agarase-Gen
beherbergen, erhalten.
-
Es
kann ein Screening unter Verwendung einer genomischen Bibliothek
effizienter durchgeführt
werden.
-
Das
Gen von Interesse wird kloniert, indem Transformanten in dem Verfahren
1–3, wie
oben beschrieben, durchmustert werden. Unter Verwendung einer PCR
kann eine Klonierung in vitro ohne Verwendung von Transformanten
durchgeführt
werden.
-
Genomische
DNA wird von einem Mikroorganismus präpariert, der eine Agarase produziert.
Eine PCR wird unter Verwendung von genomischer DNA als Template
und einem Primerpaar, das auf der Basis der Aminosäuresequenzinformation
der Agarase hergestellt wurde, durchgeführt. Somit kann ein DNA-Fragment,
das ein Agarase-Gen enthält,
erhalten werden. Weiter kann das Agarase-Gen mit voller Länge erhalten
werden, beispielsweise durch Hybridisierung, indem das Fragment
als eine Sonde verwendet wird oder einer PCR, in der Primer verwendet
werden, die basierend auf der Nukleotidsequenz des Fragments hergestellt
wurden. Die Nukleotidsequenz des oben wie beschrieben erhaltenen
Gens kann gemäß einem
bekannten Verfahren bestimmt werden. Wenn der Klon nicht für das vollständige Agarase-Polypeptid kodiert,
kann das gesamte offene Leseraster (ORF) für die Agarase erhalten werden,
indem in wiederholter Weise eine Prozedur angewendet wird, welche
die Präparation
einer neuen Sonde, basierend auf der bestimmten Nukleotidsequenz
und Screening einer Genombibliothek unter Verwendung der Sonde umfasst,
um so einen neuen Klon zu erhalten. Ein Klon, der das vollständige ORF
enthält,
das für
die Agarase kodiert, kann beispielsweise basierend auf der so erhaltenen
Information hergestellt werden.
-
Ein
Polypeptid mit einer Agarase-Aktivität kann in großen Mengen
durch genetische Manipulation hergestellt werden, indem das Gen,
das für
die Agarase kodiert und das, wie oben beschrieben, erhalten wurde, mit
einem geeigneten Expressionsvektor verbunden wird.
-
Ein
Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Gens wird unten kurz beschrieben.
-
Zellen,
die durch Kultivierung des Mikroorganismus NAB2-1-1 erhalten wurden,
werden unter Verwendung von Lysozym lysiert, Proteine werden entfernt,
es wird eine Ethanolpräzipitation
und dergleichen durchgeführt,
um eine chromosomale DNA zu erhalten. Die chromosomale NAB2-1-1-DNA
wird vollständig
mit einem Restriktionsenzym verdaut. Ein Adapter, der dem Restriktionsenzym
entspricht, wird an die verdaute DNA ligiert. Es wird eine PCR unter
Verwendung der entstehenden chromosomalen DNA als Template sowie
einem Primer, der auf der Basis der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz
der erfindungsgemäßen Agarase
I hergestellt wurde und einem Primer, der der Nukleotidsequenz des
Adapters entspricht, durchgeführt.
-
Die
Nukleotidsequenz, die für
die erfindungsgemäße Agarase
kodiert, kann durch Analysieren der Nukleotidsequenz des, wie oben
beschrieben, erhaltenen PCR-Produkts bestimmt werden. Wenn die vollständige Sequenz
nicht bestimmt werden kann, kann das oben genannte Verfahren wiederholt
werden. Alternativ kann ein Primer-Waking durchgeführt werden,
indem die chromosomale DNA als Template verwendet wird.
-
Die
auf der Basis der Aminosäuresequenz
der Agarase entworfenen Primer können
gemischte Primer sein. Alternativ ist es möglich, neue Primer zu verwenden,
die auf der Basis einer Nukleotidsequenz von einem Amplifikationsprodukt
hergestellt werden, das mittels einer PCR unter Verwendung von Primern,
die auf der Basis der N-terminalen
und internen Aminsäuresequenzen
und der chromosomalen NAB2-1-1-DNA
als Template präpariert
werden, erhalten wird.
-
Das
Gen, das für
Agarase II kodiert, hat ein ORF, das für ein Polypeptid kodiert, das
aus 1089 Aminosäuren
besteht. Die Nukleotidsequenz des ORF ist in SEQ ID NO: 21 gezeigt.
Die durch die Nukleotidsequenz des ORFs kodierte Aminosäuresequenz
ist in SEQ ID NO: 23 gezeigt. Eine Nukleotidsequenz, die dem P2
entspricht (der N-terminalen Aminosäuresequenz von Agarase II),
eine stromaufwärts
gelegene Nukleotidsequenz, die für
26 Aminosäuren
mit einer Signalpeptid-ähnlichen
Sequenz kodiert und eine SD-ähnliche
Sequenz in einer weiter stromaufwärts gelegenen Region sind in
der Nukleotidsequenz des Gens vorhanden.
-
Daher
ist die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 23 ein Beispiel der α-Agarase. Ein Vergleich dieser Aminosäuresequenz
mit der zuvor bestimmten N-terminalen Aminosäuresequenz von Agarase II zeigt,
dass Agarase II ein Polypeptid ist, das aus einer Aminosäuresequenz
besteht, beginnend von der Aminosäurezahl 27 bis zur Aminosäurezahl
1089 in der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 23 und dass die Aminosäuresequenz durch eine Nukleotidsequenz
kodiert wird, beginnend von der Nukleotidzahl 79 bis zur Nukleotidzahl 3270
(einschließlich
dem Terminations-Codon) in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 21.
-
Es
sind drei vermeintliche Ca-Bindungsregionen (171–184, 271–283 und 987–999) in
dem ORF vorhanden.
-
Das
Gen, das für
Agarase I kodiert, hat ein ORF, das für ein Polypeptid kodiert, das
aus 438 Aminosäuren
besteht. Die Nukleotidsequenz des ORFs ist in SEQ ID NO: 20 gezeigt.
Die Aminosäuresequenz,
die durch die Nukleotidsequenz des ORFs kodiert wird, ist in SEQ
ID NO: 22 gezeigt. Eine Nukleotidsequenz, die dem P1 entspricht
(der N-terminalen Aminosäuresequenz
von Agarase I), eine stromaufwärts
gelegene Nukleotidsequenz, die für
20 Aminosäuren
kodiert und eine SD-ähnliche
Sequenz in einer weiter stromaufwärts gelegenen Region sind in
der Nukleotidsequenz des Gens vorhanden.
-
Daher
ist die Aminosäuresequenz
von SEW ID NO: 22 ein Beispiel der erfindungsgemäßen Agarase. Ein Vergleich
dieser Aminosäuresequenz
mit der zuvor bestimmten N-terminalen Aminosäuresequenz von Agarase I zeigt,
dass Agarase I ein Polypeptid ist, das aus einer Aminosäuresequenz
besteht, beginnend von der Aminosäurezahl 21 bis zur Aminosäurezahl
438 in der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 22 und dass die Aminosäuresequenz durch eine Nukleotidsequenz
kodiert wird, beginnend von der Nukleotidzahl 61 bis zur Nukleotidzahl
1314 (einschließlich
dem Terminations-Codon) in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 20.
-
Die
Aminosäuresequenz
von Agarase I, die wie oben beschrieben erhalten wurde, besitzt
lediglich eine Homologie von 33% mit einer Aminosäuresequenz
einer bekannte β-Agarase
des Flavobakteriums sp. Stamm NR19. Daher muss die erfindungsgemäße Agarase
I als eine vollständig
neue Sequenz angesehen werden.
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Ein
rekombinantes DNA-Molekül
kann hergestellt werden, indem ein Gen, das für die erfindungsgemäße Agarase
kodiert (z.B. das Gen, das für
Agarase I kodiert) oder Agarase II kodiert, mit einem geeigneten Vektor
verknüpft
wird. Weiterhin kann eine Transformante hergestellt werden, indem
das rekombinante DNA-Molekül
in ei nen geeigneten Wirt eingeführt
wird. Die erfindungsgemäße Agarase
wird in einer Kultur hergestellt, die erhalten wird, indem die Transformante
kultiviert wird. Es ist daher möglich,
die erfindungsgemäße Agarase
(z.B. Agarase I) oder Agarase II in großen Mengen mittels der Transformante
herzustellen.
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Eine
mutierte Agarase kann erzeugt werden, indem eine Mutation in ein
Gen, das für
eine Agarase kodiert, gemäß einem
bekannten Verfahren eingeführt
wird. Beispiele von Verfahren zum Einführen einer Mutation, die verwendet
werden können,
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf das Oligonukleotid-"Double-Amber"-Verfahren (Hashimoto-Gotoh,
T. et al., Gene, 152: 271–275
(1995)), das "gapped
duplex"-Verfahren (Kramer,
W. et al., Nucl. Acids Res., 12: 9441 (1984); Kramer, W. et al.,
Methods in Enzymology, 154: 350 (1987)) und das Kunkel-Verfahren
(Kunkel, T. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488 (1985); Kunkel,
T. A., Methods in Enzymology, 154: 367 (1987)).
-
Die
Agarase von Interesse kann außerhalb
einer Transformante sekretiert werden, indem ein Gen exprimiert
wird, das für
ein Polypeptid kodiert, in dem eine Signalsequenz an den N-Terminus
einer zu exprimierenden Agarase hinzugefügt wird. Die Signalsequenz
ist nicht auf eine bestimmte beschränkt und kann beispielsweise
die Signalsequenz für
Agarase I sein, wie sie von der Aminosäurezahl 1 bis zur Aminosäurezahl 20
in der SEQ ID NO: 22 dargestellt ist. Diese Signalsequenz wird durch
eine Nukleotidsequenz beginnend von der Nukleotidzahl 1 bis zur
Nukleotidzahl 60 in der SEQ ID NO: 20 kodiert. Alternativ kann es
sich z.B. um die Signalsequenz für
Agarase II handeln, wie sie durch die Aminosäurezahl 1 bis zur Aminosäurezahl
26 in der SEQ ID NO: 23 dargestellt ist. Diese Signalsequenz wird
durch eine Nukleotidsequenz beginnend von der Nukleotidzahl 1 bis
zur Nukleotidzahl 78 in der SEQ ID NO: 21 kodiert.
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Beispiele
von Vektoren, die verwendet werden können, um die rekombinanten
DNA-Moleküle herzustellen,
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Plasmidvektoren, Phagenvektoren und Virusvektoren. Ein geeigneter
Vektor kann in Abhängigkeit
von dem Zweck, für
den die rekombinante DNA verwendet werden soll, ausgewählt werden.
Wenn ein rekombinantes DNA-Molekül
konstruiert wird, um eine Agarase herzustellen, ist ein Vektor,
der einen Promotor und/oder andere Regionen zur Expressionskontrolle
enthält,
bevorzugt. Beispiele von solchen Plasmidvektoren umfassen, sind
aber nicht beschränkt
auf pKF19k, pT7BlueT und pET16b. Wirte, die zur Herstellung von
Transformanten verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht
beschränkt
auf Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen und filamentöse Pilze
sowie kultivierte Zellen von Säugetieren,
Fischen, Insekten und dergleichen. Ein rekombinantes DNA-Molekül, das unter
Verwendung eines Vektors konstruiert wird, der für den Wirt geeignet ist, wird
zur Herstellung einer Transformante verwendet.
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Ein
Verfahren zur Herstellung von Agarase I durch eine genetische Manipulation
ist unten kurz beschrieben.
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Ein
DNA-Fragment, das eine Nukleotidsequenz enthält, die für ein Polypeptid kodiert, das
beispielsweise eine Aminosäuresequenz,
beginnend von der Aminosäurezahl
21 in der SEQ ID NO: 22 besitzt, wird in einen geeigneten Plasmidvektor
eingeführt
(z.B. pKF19k (Takara Shuzo), pT7BlueT (Takara Shuzo) oder pET16b
(Takara Shuzo)), um ein Plasmid zu konstruieren. Escherichia coli
(z.B. Escherichia coli JM 109 oder BL21 (DE3)pLysS), das mit einem
solchen Plasmid transformiert wurde, wird in einem geeigneten Flüssigmedium
kultiviert. Die Induktion wird unter Verwendung von IPTG oder dergleichen,
falls notwendig, durchgeführt. Es
wird das Polypeptid, das von dem DNA-Fragment kodiert wird, das
in das Plasmid eingefügt
wurde, exprimiert. Die β-Agarase-Aktivität, die durch
eine solche Transformante in einem Einheitsvolumen der Kultur exprimiert
wird, ist gewöhnlicherweise
höher als
die einer Kultur von NAB2-1-1.
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Bei
der Agarase II kann eine Transformante, die Agarase II exprimiert,
durch genetische Manipulation, wie oben für Agarase I beschrieben, unter
Verwendung eines DNA-Fragments, das eine Nukleotidsequenz enthält, das
für ein
Polypeptid kodiert, das beispielsweise eine Aminosäuresequenz
beginnend von der Aminosäurezahl
27, 181 oder 318 in der SEQ ID NO: 23 besitzt, hergestellt werden.
Die entstehende Transformante exprimiert eine α-Agarase-Aktivität und die
Aktivität
in einem Einheitsvolumen der Kultur ist gewöhnlicherweise höher als
die einer Kultur von NAB2-1-1.
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Die
erfindungsgemäße Agarase,
die wie oben durch genetische Manipulation hergestellt wurde, kann durch
ein konventionelles Aufreinigungsverfahren wie Entsalzung oder Ammoniumsulfat-
oder Lösungsmittelpräzipitation
partiell aufgereinigt werden. Weiter kann eine gereinigte Enzympräparation
erhalten werden, die eine Einzelbande nach einer Elektrophorese
ergibt, indem bekannte Aufreinigungsver fahren, wie Säulenchromatographien,
in Kombination verwendet werden (z.B. Anionen-Austauschsäule und
Gelfiltrationssäule).
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Wenn
die durch genetische Manipulation hergestellte erfindungsgemäße Agarase
unlöslich
ist, kann sie gemäß einem
bekannten Verfahren löslich
gemacht werden und isoliert werden.
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Agarooligosaccharide,
wie Agarobiose, Agarotetraose, Agarohexaose und Agarooctaose können hergestellt
werden, indem die so erhaltene rekombinante α-Agarase in einem variierenden
Aufreinigungsgrad mit einem Polysaccharid, das in der Rotalge enthalten
ist (z.B. Agar oder Agarose), als Substrat reagieren gelassen wird.
-
Zum
Beispiel können
die Agarooligosaccharide durch eine Reaktion bei 50°C für 16 Stunden
unter Verwendung von 1% (w/v) Agarose als Substrat hergestellt werden.
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In ähnlicher
Weise kann ein Stoff (z.B. eine Nukleinsäure) in einem Agarosegel effizient
extrahiert werden, indem es der so erhaltenen erfindungsgemäßen rekombinanten β-Agarase
mit einem variierenden Aufreinigungsgrad ermöglicht wird, auf ein Agarosegel
einzuwirken, das einer Elektrophorese mit einer Nukleinsäure oder
dergleichen unterzogen wurde.
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Zum
Beispiel kann im Falle einer Elektrophorese eines 1% (w/v) oder
3% (w/v) Agarosegels ein Stoff in dem Gel effizient extrahiert werden,
indem es der erfindungsgemäßen rekombinanten β-Agarase
ermöglicht wird,
auf das Agarosegel, das den Stoff von Interesse enthält, bei
67°C für 10 Minuten
einzuwirken.
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Die
Thermostabilität
der Agarase kann verbessert werden, indem bis zu 30% des ORF von
dem N-Terminus deletiert wird. Die zu entfernende Region ist nicht
spezifisch beschränkt,
so lange sie bis zu 30% (z.B. 10%, 20% etc.) des ORF beträgt. Zum
Beispiel kann die Thermostabilität
der Agarase II verbessert werden, indem 29,1% (d.h. 317 Aminosäuren) von
dem N-Terminus der Agarase II deletiert werden. Eine besonders bemerkenswerte
Verbesserung bei der Thermostabilität wird in der Gegenwart von
Calcium beobachtet.
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Es
gibt keine spezifische Beschränkung
hinsichtlich des Verfahrens zum Entfernen eines N-terminalen Teils
zur Verbesserung der Thermostabilität. Es kann durch Be handlung
mit einer Protease oder unter Verwendung von genetischen Manipulationstechniken
durchgeführt
werden.
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Beispiele
-
Die
folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung genauer,
sollen jedoch nicht deren Umfang beschränken.
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Beispiel 1
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Verfahren
zur Aktivitätsmessung
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Nach
der Aufreinigung der erfindungsgemäßen Agarase wurde die Aktivität der gereinigten
oder partiell gereinigten Enzympräparation gemessen, indem eine
Enzymreaktion unter Verwendung von Agarose L03 (Takara Shuzo) als
Substrat durchgeführt
wurde und dann die entstandene Agarotetraose oder Neoagarotetraose
unter Verwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie quantifiziert
wurde. Das Verfahren ist weiter unten im Detail beschrieben.
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Es
wurde eine Lösung,
die Agarose bei einer Konzentration von 0,2% (w/v) oder 0,5% (w/v)
enthält,
in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid (im
Falle von Agarase I) enthält
oder in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Calciumchlorid
und 10 mM Natriumchlorid (im Falle von Agarase II) enthält, hergestellt.
180 μl dieser
Lösung
wurde als Substrat mit 20 μl
einer Enzymlösung
vermischt. Das Gemisch wurde bei 50°C für 5 bis 30 Minuten, vorzugsweise
10 Minuten umgesetzt und dann in kochendes Wasser oder bei 75°C für eine Minute
erhitzt, um die Reaktion abzustoppen. 30 μl des Reaktionsgemisches wurden
auf einer TSKgel-α-2500-Säule aufgetragen
(innerer Durchmesser: 7,8 mm; Länge:
300 mm; Tosoh). Die Elution wurde unter Verwendung einer 70% Acetonitril-Lösung als
ein Eluent bei einer Durchflussrate von 0,8 ml/Minute durchgeführt. Agarotetraose,
die mit einer Verzögerungszeit
von ungefähr
25 Minuten eluiert wurde oder Neoagarotetraose, die mit einer Verzögerungszeit
von ungefähr
24 Minuten eluiert wurde, die beide durch die Enzymreaktionen erzeugt
wurden, wurde quantifiziert. Eine Einheit (1 U) wird als eine Enzymmenge
definiert, welche 1 μmol
Agarotetraose oder Neoagarotetraose in 10 Minuten produziert.
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Beispiel 2
-
Herstellung von Agarase
von NAB2-1-1
-
100
ml künstliches
Meerwasser (Produktname: Jamarin S; Jamarin Laboratory) wurde hergestellt. Pepton
(Difco) und Hefeextrakt (Difco) wurden mit Konzentrationen von 0,3%
(w/v) bzw. 0,02% (w/v) dazu zugegeben. Der pH wurde dann auf 7,8
unter Verwendung von 3 M Natriumcarbonat eingestellt. Das entstehende Gemisch
wurde in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben überführt. 0,4 g NuSieve GTG Agarose
(Takara Shuzo) wurden dazu zugegeben. Nach der Sterilisation, bei
der ein Autoklav verwendet wurde, wurde NAB2-1-1 in das Gemisch
angeimpft und bei 37°C
bei 120 UpM über
Nacht kultiviert. Die entstehende Kultur wurde als eine Präkultur verwendet.
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Die
Hauptkultivierung wurde wie folgt durchgeführt. 3000 ml künstliches
Meerwasser (Produktname: Jamarin S; Jamarin Laboratory) wurde in
einem 5000 ml-Glasgefäß-Fermenter
hergestellt. Pepton (Difco) und Hefeextrakt (Difco) wurden bei Konzentrationen
von 0,3% (w/v) bzw. 0,02% (w/v) dazu zugegeben. Der pH wurde dann
auf 7,8 eingestellt. 12 g NuSieve GTG Agarose (Takara Shuzo) wurde
dazu zugegeben. Das Gemisch wurde unter Verwendung eines Autoklaven
sterilisiert. 30 ml der Präkultur
wurden in das Gemisch angeimpft und bei 37°C bei 250 UpM für 18 Stunden
kultiviert. Die Kultur wurde dann bei 8000 × g für 20 Minuten zentrifugiert,
um ungefähr
3000 ml eines Überstandes,
von dem Zellen entfernt wurden, zu isolieren.
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Die
folgenden Verfahren wurden bei 4°C
oder darunter durchgeführt.
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Der Überstand
wurde auf eine Dialysemembran (Sanko Junyaku) gegeben und dann in
ungefähr
500 g Polyethylenglykol für
zwei Nächte
getaucht, um ihn ungefähr
um das 10-fache zu konzentrieren. 300 ml des Konzentrats wurden
gegen Puffer I (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Calciumchlorid
und 10 mM Natriumchlorid enthält)
zur Entsalzung dialysiert.
-
Das
Dialysat wurde auf eine Säule
geladen (φ 2,0
cm × 12
cm), die mit einem Anionen-Austauschharz DEAE Toyopearl 650M (Tosoh)
mit dem Puffer äquilibriert
wurde. Die Säule
wurde mit ungefähr
120 ml Puffer I gewaschen. Die nicht-adsorbierte Fraktion und die
Waschfraktion (ungefähr
400 ml) wurden gesammelt und als eine Agarase I-Fraktion kombiniert.
Die Elution wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten bestehend
aus 10 mM bis 1000 mM Natriumchlorid durchgeführt (gesamtes Elutionsvolumen:
400 ml). Eine Fraktion von ungefähr
160 ml, die bei einer Natriumchloridkonzentration zwischen 300 mM
und 600 mM eluiert wurde, wurde als eine Agarase II-Fraktion gesammelt.
-
Die
Agarase I-Fraktion und die Agarase II-Fraktion wurden gegen Puffer
II (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Calciumchlorid, 10
mM Natriumchlorid, 5% Glycerol und 1 mM PMSF enthält) zur
Entsalzung dialysiert.
-
Die
Agarase II-Fraktion wurde weiter einer Aufreinigung wie folgt unterzogen.
Die dialysierte Agarase II-Fraktion wurde auf eine Säule geladen
(φ 2,0
cm × 8,0
cm), die mit 25 ml QAE Toyopearl 550C (Tosoh) gefüllt war.
In diesem Fall wurde die Elution unter Verwendung eines linearen
Gradienten bestehend aus 10 mM bis 800 mM Natriumchlorid durchgeführt (gesamtes
Elutionsvolumen: 250 ml). Eine Fraktion von ungefähr 70 ml, die
bei ungefähr
500 mM eluierte, wurde erhalten. Diese Fraktion wurde gegen Puffer
II dialysiert und auf ein Volumen von ungefähr 1 ml unter Verwendung von
einer Zentrifugations-Ultrafiltrationsmembran CENTRIPREP-10 (Amicon)
konzentriert. Das Konzentrat wurde einer Gelfiltration ausgesetzt,
bei der eine Säule
(φ 0,8 cm × 50 cm),
die mit Sephadex G-100 (Pharmacia) gefüllt war und die mit Puffer
II äquilibriert
worden war, verwendet wurde. Eine Agarase II-Fraktion von ungefähr 20 ml
wurde erhalten. Diese Fraktion wurde auf ein Volumen von ungefähr 1 ml
konzentriert, indem wiederum eine Ultrafiltrationsmembran verwendet
wurde.
-
Die
Elektrophorese des gereinigten Proteins auf einem Polyacrylamidgel,
das Natriumdodecylsulfat (SDS) enthielt, zeigte, dass es beinahe
vollständig
bis zur Homogenität
gereinigt war. Die Gesamtaktivität
betrug ungefähr
150 U.
-
Die
Agarase I-Fraktion wurde weiter einer Aufreinigung wie folgt unterzogen.
-
Die
dialysierte Agarase I-Fraktion (ungefähr 400 ml) wurde an eine Säule (φ 2,0 cm × 9,5 cm)
adsorbiert, die mit CM Toyopearl 650 (Tosoh) gefüllt war und die mit Puffer
II äquilibriert
worden ist. Die Elution wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten
aus 10 mM bis 1000 mM Natriumchlorid durchgeführt (gesamtes Elutionsvolumen:
300 ml). Eine Agarase I-Fraktion von ungefähr 90 ml, die bei einer Natriumchloridkonzentration
von bis zu 300 mM eluierte, wurde gesammelt. Diese Fraktion wurde über Nacht
gegen Puffer II dialysiert, der 1,0 M Ammoniumsulfat enthielt und
auf eine Säule
geladen (φ 2,0
cm × 9,5
cm), die mit 30 ml Butyl Toyopearl 650M (Tosoh) gefüllt war
und mit demselben Puffer äquilibriert
wurde. Die Elution wurde unter Verwendung eines Gradienten von 1,0
M bis 0 M Ammoniumsulfat durchgeführt (gesamtes Elutionsvolumen:
300 ml). Eine Agarase I-Fraktion (ungefähr 60 ml), die mit Konzentrationen
im Bereich von 300 mM bis 0 M eluiert wurde, wurde gewonnen. Wie
Agarase II wurde die Fraktion gegen Puffer II dialysiert und auf
ein Volumen von ungefähr
1 ml unter Verwendung einer Zentrifugations-Ultrafiltrationsmembran
CENTRIPREP-10 (Amicon) konzentriert.
-
Die
Elektrophorese des gereinigten Proteins auf einem Polyacrylamidgel,
das Natriumdodecylsulfat (SDS) enthielt, zeigte, dass es fast bis
zur Homogenität
aufgereinigt war. Die Gesamtaktivität betrug ungefähr 310 U.
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Beispiel 3
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Untersuchen von verschiedenen
Eigenschaften der Enzyme
-
[Identifikation von Reaktionsprodukten
mit Agarase I und Agarase II]
-
20 μl einer Lösung, die
Agarose mit einer Konzentration von 0,5% (w/v) enthielt, in 20 mM Tris-HCl-Puffer
(pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid (im Falle von Agarase I) enthielt,
oder 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Calciumchlorid und
10 mM Natriumchlorid (im Falle von Agarase II) enthielt, wurde einem
Verdau unter Verwendung des gereinigten Agarase I- und Agarase II-Enzyms
ausgesetzt. Das Spaltungsprodukt wurde auf eine Gelfiltrationssäule (Tosoh,
TSKgel α-2500)
aufgetragen und es wurden 70% Acetonitril als ein Eluent verwendet.
Als Ergebnis wurden Hauptspitzen nach ungefähr 24 Minuten und nach ungefähr 28 Minuten
für Agarase
I festgestellt. Es wurde vermutet, dass diese Spitzen der Neoagarotetraose
bzw. Neoagarohexaose entsprachen, basierend auf den Verzögerungszeiten,
die für
die Standards ermittelt wurden. Für das Spaltungsprodukt mit
Agarase II wurden Hauptspitzen bei Verzögerungszeiten von ungefähr 22 Minuten,
ungefähr
25 Minuten und ungefähr
29 Minuten ermittelt. Es wurde vermutet, dass diese Spitzen Agarobiose,
Agarotetraose bzw. Agarohexaose entsprachen, basierend auf den Verzögerungszeiten,
die für die
Standards ermittelt wurden. Das Reaktionsprodukt wurde bestätigt, indem
es einer Dünnschichtchromatographie
unterzogen wurde, indem ein Entwicklungslösungsmittel mit einer Zusammensetzung
von Chloroform:Methanol:Essigsäure
= 3:3:1 mit zwei Entwicklungsrunden verwendet wurde. Es wurden drei
Agarooligosaccharide, d.h. Agarobiose (Rf-Wert = 0,76), Agarotetraose
(Rf-Wert = 0,50) und Agarohexaose (Rf-Wert = 0,33) sowie zwei Neoagarooligosaccharide,
d.h. Neoagarotetraose (Rf-Wert = 0,59) und Neoagarohexaose (Rf-Wert
= 0,41) als Kontrollen verwendet. Als Ergebnis wurden farbbildende
Substanzen unter Verwendung von Orcinol-Schwefelsäure an Positionen,
die den Neoagarooligosacchariden für das Reaktionsprodukt, das unter
Verwendung von Agarase I erhalten wurde, entsprachen, festgestellt.
Farbbildende Substanzen wurden an Positionen, die den Agarooligosacchariden
entsprachen, für
das Reaktionsprodukt, das unter Verwendung von Agarase II erhalten
wurde, festgestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Agarase I eine β-Agarase
ist, die eine β-1,4-Bindung
zwischen D-Galaktose und 3,6-Anhydro-L-Galaktose in einem Agarose-Molekül hydrolysiert,
um Neoagarooligosaccharide herzustellen, wohingegen Agarase II eine α-Agarase
ist, die eine α-1,3-Bindung
in einem Agarose-Molekül
hydrolysiert, um Agarooligosaccharide herzustellen.
-
[Ca-Ionen-Erfordernis]
-
Die
Agarase I-Lösung
und die Agarase II-Lösung
wurden gegen einen Calcium-freien Puffer (20 mM Tris-HCl-Puffer
(pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid und 1 mM EDTA enthält, über Nacht
dialysiert. Eine Lösung,
die Agarose bei einer Konzentration von 0,2% (w/v) in einem 20 mM
Tris-HCl-Puffer (pH 7,2) enthält,
der 10 mM Natriumchlorid und 1 mM EDTA enthält, wurden dazu zugegeben.
Das Gemisch wurde bei 50°C
für 10 Minuten
umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Erhitzen in kochendem Wasser
für 1 Minute
(im Falle von Agarase I) oder bei 75°C für 1 Minute (im Falle von Agarase
II) abgestoppt. Dann wurden die Aktivitäten gemessen. Die Aktivität, die gemessen
wurde, wenn die Reaktion unter Verwendung eines konventionellen
Puffers durchgeführt
wurde, der Calcium enthält,
wurde als 100% festgelegt. Als Ergebnis zeigten Agarase I und Agarase
II ungefähr
100% bzw. ungefähr
60% ihrer Aktivitäten.
-
[Optimale Temperatur]
-
Die
Temperaturen, bei denen eine Inaktivierung der Enzyme unterdrückt wurde
und bei denen die Reaktionen für
Agarase I und Agarase II schnell abliefen, betrugen 50 bis 65°C bzw. 45
bis 55°C.
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[Thermostabilität]
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Die
Enzymlösung
wurde auf 48°C,
50°C, 55°C, 60°C oder 65°C für einen
bestimmten Zeitraum erhitzt. Eine Lösung, die Agarose bei einer
Konzentration von 0,2% (w/v) in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2) enthielt, der
10 mM Natriumchlorid (im Falle von Agarase I) oder 20 mM Tris-HCl-Puffer
(pH 7,2), der 10 mM Calciumchlorid und 10 mM Natriumchlorid (im
Falle von Agarase II) enthielt, wurden zu der erhitzten Lösung zugegeben.
Das Gemisch wurde bei 50°C
für 10
Minuten umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Erhitzen in kochendes Wasser
für 1 Minute
(im Falle von Agarase I) oder bei 75°C für 1 Minute (im Falle von Agarase
II) abgestoppt. Dann wurden die Aktivitäten gemessen. Die gemessene
Aktivität
für eine
konventionelle Reaktion bei 50°C
für 10
Minuten wurde als 100% festgesetzt. Als ein Ergebnis zeigte Agarase
I ungefähr
85% von ihrer Aktivität nach
einer Behandlung bei 65°C
für 60
Minuten und Agarase II zeigte ungefähr 40% ihrer Aktivität nach einer Behandlung
bei 55°C
für 10
Minuten.
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[Molekulargewicht]
-
Das
Molekulargewicht wurde unter Verwendung einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
bestimmt. Die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese wurde gemäß einem
konventionellen Verfahren durchgeführt, indem ein 10–20% Polyacrylamidgel,
das SDS zusammen mit einem Molekulargewichtsmarker enthielt (Bio-Rad,
Myosin (MW 200 000), β-Galactosidase
(MW 116 250), Phosphorylase b MW 97 400), Rinderserumalbumin (MW
66 200), Ovalbumin (MW 45 000), Kohlenstoffanhydrase (MW 31 000),
Trypsin-Inhibitor (MW 21 500), Lysozym (MW 14 400)), durchgeführt wurde.
Die Molekulargewichte von Agarase I und Agarase II betrugen ungefähr 48 000
bzw. ungefähr
117 000, was anhand der Mobilität
bestimmt wurde.
-
[Aminoterminale Aminosäuresequenz]
-
Die
aminoterminalen Aminosäuresequenzen
von Agarase I und Agarase II wurden gemäß dem Edman-Abbauverfahren
bestimmt. Eine Lösung
einer gereinigten Enzympräparation,
die Agarase I und Agarase II enthielt, und die ungefähr 10 pmol
des Enzymproteins entsprach, wurde einer SDS-PAGE unter Verwendung eines
10–20%
Polyacrylamidgradientengels ausgesetzt. Nach der Elektrophorese
wurde das auf dem Gel aufgetrennte Enzym auf einem Membran-ProBlot
geblottet (Applied Biosystems). Ein Teil der Membran, an der das
Enzym adsorbiert worden ist, wurde unter Verwendung eines Proteinsequenzierers
G 1000A (Hewlett Packard) analysiert. Als Ergebnis wurden die aminoterminalen
Aminosäuresequenzen
von Agarase I (P1; SEQ ID NO: 1) und Agarase II (P2; SEQ ID NO:
2) als Ala-Asp-Xaa-Asp-Gly-Val-Pro-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly bzw. als Glu-Thr-Ile-Val-Leu-Gln-Ala-Glu-Ser-Phe
bestimmt.
-
[Bestimmung der partiellen
Aminosäuresequenz]
-
Es
wurde eine Carboxymethylierung von Cysteinresten unter Verwendung
von 2 nmol der gereinigten Agarase I oder II durchgeführt. Die
Peptidfragmente wurden aufgetrennt und unter Verwendung von HPLC
aus einem Spaltungsprodukt, das durch Verdau mit Lysylendopeptidase
erhalten wurde, aufgereinigt. Es wurde μBondasphare C8 (Waters) für die Säule verwendet
und Lösung
A (0,1% TFA) und Lösung
B (0,1% TFA, das 80% Acetonitril enthält) wurden für die Elution
verwendet. Die Elution wurde bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/Minute
durch Erhöhen
des Verhältnisses
der Lösung
B von 0% auf 100% in 50 Minuten auf lineare Weise durchgeführt. Die
Detektion wurde bei 214 nm mit den gesammelten Fraktionen durchgeführt. Die
entsprechenden Peptidfraktionen wurden Aminosäuresequenzanalysen unterzogen.
Für Agarase
I wurden die partiellen Aminosäuresequenzen
PI3 (SEQ ID NO: 3) und PI4 (SEQ ID NO: 4) bestimmt. Für Agarase
II wurden die partiellen Aminosäuresequenzen
PII5 (SEQ ID NO: 5), PII6 (SEQ ID NO: 6) und PII7 (SEQ ID NO: 7)
bestimmt.
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Vergleichsbeispiel 4
-
Herstellung
von Agarooligosacchariden
-
Agarose
L03 wurde zu 2 ml Reaktionspuffer (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2),
der 10 mM Calciumchlorid und 10 mM Natriumchlorid enthielt), bei
einer Endkonzentration von 1,0% (w/v) zugegeben. Es wurden ungefähr 1,0 U
der gereinigten Agarase II-Präparation
weiter dazu zugegeben. Das Gemisch wurde bei 50°C für 16 Stunden umgesetzt. Nach
der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch über einen 0,22 μm-Filter
(Millipore) filtriert. Das filtrierte Reaktionsgemisch wurde unter
Verwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
unter Verwendung derselben Reaktionsbedingungen, wie sie oben zur
Messung der Aktivität
des Enzyms der vorliegenden Erfindung in Beispiel 1 verwendet wurden,
analysiert, um die erzeugten Agarooligosaccharide zu bestimmen.
Als Ergebnis wurden Agarobiose, Agarotetraose und Agarohexaose in
dem Reaktionsgemisch nachgewiesen. Es wurde somit bestätigt, dass
die oben genannte Enzymreaktion diese kleineren Agarooligosaccharide
produziert.
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Beispiel 5
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Herstellung
von Neoagarooligosacchariden
-
Agarose
L03 wurde zu 2 ml Reaktionspuffer (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2),
der 10 mM Natriumchlorid enthielt) bei einer Endkonzentration von
1,0% (w/v) zugegeben. Ungefähr
1,0 U der gereinigten Agarase I-Präparation wurden weiter dazu
zugegeben. Das Gemisch wurde bei 65°C für 16 Stunden umgesetzt. Nach der
Reaktion wurde das Gemisch über
einen 0,22 μm-Filter
(Millipore) filtriert. Das filtrierte Reaktionsgemisch wurde unter
Verwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
unter denselben Bedingungen, die zur Messung der Aktivität des Enzyms
der vorliegenden Erfindung in Beispiel 1 verwendet wurden, durchgeführt, um
die erzeugten Neoagarooligosaccharide zu bestimmen. Als Ergebnis
wurden Neoagarotetraose und Neoagarohexaose in dem Reaktionsgemisch
nachgewiesen. Es wird somit bestätigt,
dass die oben genannte Enzymreaktion diese kleinen Neoagarooligosaccharide
produziert.
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Beispiel 6
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Gewinnung von Nukleinsäure aus
einem Agarosegel unter Verwendung von Agarase I
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1 μg eines DNA-Molekulargewichtsmarkers, λ-HindIII
(Takara Shuzo) wurde auf einem 1,0% (w/v) SeaPlaque GTG-Agarosegel
einer Elektrophorese unterzogen. Ein Gel, das die aufgetrennten
DNA-Fragmente mit Größen von
ungefähr
4,4 kbp und ungefähr
6,6 kbp enthielt, wurde ausgeschnitten und in ein 1,5 ml-Eppendorf-Gefäß gegeben.
1 ml des Reaktionspuffers (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 50
mM Natriumchlorid enthielt) wurden dazu zugegeben. Das Gemisch wurde
bei Raumtemperatur für
10 Minuten stehen gelassen. Der Puffer wurde dann entfernt und das
Gel wurde in dem Gefäß gelassen.
Das Gefäß wurde
bei 67°C für 5 Minuten
zum Schmelzen des Gels inkubiert. 1,0 U des gereinigten Agarase
I-Enzyms wurden dazu zugegeben. Das Gemisch wurde bei der Temperatur
für 10
Minuten inkubiert. Das Eppendorf-Gefäß wurde auf Eis gegeben, um
sicherzustellen, dass das Agarosegel vollständig gelöst war. Es wurde dann eine
Ethanolpräzipitation
gemäß einem
konventionellen Verfahren durchgeführt, um die DNA-Fragmente zu
gewinnen. In ähnlicher
Weise wurde ein DNA-Molekulargewichtsmarker, 100 bp Ladder-Marker
(Takara Shuzo) behandelt, um DNA aus einem 3,0% (w/v) NuSieve GTG
Agarosegel zu gewinnen. In diesem Fall wurden DNA-Fragmente mit
400 bp und 500 bp gewonnen. Vergleichsergebnisse der DNA-Gewinnungsraten,
mit denen einer kom merziell erhältlichen β-Agarase,
die von Pseudoalteromonas atlantica (Takara Shuzo) stammt, sind
in Tabelle 2 gezeigt.
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Wenn
die kommerziell erhältliche β-Agarase
verwendet wird, sollte die Temperatur, die zum Schmelzen eines Agarosegels
verwendet wird, auf eine Temperatur, bei der das Enzym vor dem Zusatz
des Enzyms wirken kann, abgesenkt werden. Da die Reaktionstemperatur
niedrig ist, wird eine lange Reaktionszeit benötigt, und die Zeit, die für das Verfahren
benötigt
wird, wird verlängert.
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Wenn
die erfindungsgemäße Agarase
I verwendet wird, kann andererseits das Enzym sofort nach dem Schmelzen
des Agarosegels dazugegeben werden. Da die Reaktion bei einer hohen
Temperatur durchgeführt
werden kann, ohne die Temperatur abzusenken, ist nur ein kurzer
Zeitraum für
das Verfahren erforderlich. Tabelle
2
- * Menge gewonnener DNA/Menge eingesetzter
DNA × 100.
- ** Zeit, die bis zu Ethanolpräzipitation benötigt wird.
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Beispiel 7
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Präparation von chromosomaler
DNA aus NAB2-1-1
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Ein
Liter künstliches
Meerwasser (Produktname: Jamarin S; Jamarin Laboratory) wurde hergestellt. Pepton
(Difco) und Hefeextrakt (Difco) wurden bei Konzentrationen von 0,3%
(w/v) bzw. 0,02% (w/v) dazu zugegeben. Der pH wurde dann auf 7,8
unter Verwendung von 3 M Natriumcarbonat eingestellt. Agar (Nacalai Tesque)
wurde bei einer Konzentration von 0,1% (w/v) dazu zugegeben. Das
Gemisch wurde unter Verwendung eines Autoklaven sterilisiert. 10 μl einer Glycerinkultur
des Agarase-produzierenden Stamms NAB2-1-1 wurden in 2 ml Medium
angeimpft und über
Nacht bei 37°C
kultiviert. 1 ml der Kultur wurden in 100 ml desselben Mediums angeimpft
und über
Nacht bei 37°C
kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifuga tion bei 8000 × g für 10 Minuten
gesammelt. Die Zellen wurden in 10 ml Puffer A (100 mM Tris-HCl-Puffer
(pH 8,0), der 100 mM NaCl und 10 mM EDTA (pH 8,0) enthielt) suspendiert.
0,25 ml einer Lysozym-Lösung
(20 mg/ml) wurden dazu zugegeben. Das Gemisch wurde bei 37°C für 1 Stunde
inkubiert. 2,5 ml des Puffers A, der SDS bei einer Konzentration
von 5,0% enthielt, wurde dann dazugegeben. Das entstehende Gemisch
wurde bei 60°C
für 20 Minuten
unter Schütteln
inkubiert. 1,5 ml einer Protease K-Lösung (20 mg/ml) wurden dazu
zugegeben. Das Gemisch wurde über
Nacht bei 37°C
inkubiert. Es wurde dann ein beinahe gleiches Volumen Phenol zu
dem Gemisch zugegeben und das entstandene Gemisch wurde bei Raumtemperatur
für ungefähr 10 Minuten
vorsichtig geschüttelt.
Das Gemisch wurde bei 2000 × g
für 10
Minuten zentrifugiert. Der Überstand
wurde in kaltes Ethanol überführt. Chromosomale
DNA wurde unter Verwendung eines Glasstabs aufgewickelt. Beinahe dasselbe
Volumen Phenol wurde zu der Lösung,
aus der die chromosomale DNA herausgewickelt worden ist, zugegeben
und ein ähnliches
Verfahren wurde durchgeführt,
um die chromosomale DNA wiederum aufzuwickeln. Die chromosomale
DNA wurde in 10 μl
Puffer A suspendiert. 50 μl
einer RNAse A-Lösung
(10 mg/ml) wurde dazu zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37°C für 10 Minuten
inkubiert. Die chromosomale DNA wurde von der Lösung durch Ethanolpräzipitation
gewonnen und in 5 ml Puffer B (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend
140 mM NaCl und 1 mM EDTA (pH 7,5)) suspendiert. Die Suspension
wurde gegen denselben Puffer über
Nacht dialysiert. Dann wurden ungefähr 5,0 mg der chromosomalen
DNA erhalten. Die Reinheit der DNA wurde basierend auf OD260 nm/280
nm untersucht. Der Wert betrug in jedem Fall ungefähr 1,8.
Die chromosomale DNA wurde zur Klonierung von Agarase I und Agarase
II, wie oben beschrieben, verwendet.
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Beispiel 8
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Klonierung
des Agarase I-Gens
-
Gemischte
Primer 1 und 2 (SEQ ID NO: 8 und 9) wurden auf der Basis der N-terminalen
Aminosäuresequenz
von Agarase I, P1 (SEQ ID NO: 1), wie sie in Beispiel 3 bestimmt
wurde, entworfen, unter Verwendung eines DNA-Synthetisierers synthetisiert
und gereinigt. Insbesondere entsprechen die gemischten Primer 1
und 2, die durch SEQ ID NO: 8 und 9 repräsentiert sind, den Aminosäuresequenzen
der Aminosäurezahlen
4 bis 10 bzw. 4 bis 13 in der Aminosäuresequenz P1. Die Klonierung
des Agarase I-Gens wurde unter Verwendung dieser Primer und eines
LA-PCR-in-vitro-Klonierungskits
(Takara Shuzo) durchgeführt.
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Eine
primäre
PCR wurde wie folgt durchgeführt.
Die in Beispiel 7 präparierte
chromosomale DNA wurde vollständig
mit einem Restriktionsenzym BamHI verdaut. Ein BamHI-Adapter wurde
an die Termini der verdauten DNA unter Verwendung eines DNA-Ligationskits
(Takara Shuzo) ligiert. Ein Teil davon wurde in ein 0,5 ml-Gefäß zur PCR
gegeben. 5 μl
10 × La
PCR-Puffer, 8 μl
eines dNTP-Gemisches, 1 μl
des gemischten Primer 1, 1 μl
des Primer C1 (ein Primer, der in LA PCR in vitro Klonierungskit
vorhanden ist (Takara Shuzo)), 0,5 μl TaKaRa LA Taq und steriles
Wasser auf 50 μl
wurden dazu zugegeben. Nachdem die Lösung mit 50 μl Mineralöl überlagert
wurde, wurde das Gefäß einer
Reaktion ausgesetzt, indem ein automatisiertes Gen-Amplifikationsgerät Thermo
Cycler (Takara Shuzo) verwendet wurde. Nach einer Denaturierung
bei 94°C
für 2 Minuten wurden
30 PCR-Zyklen durchgeführt.
Jeder Zyklus bestand aus einer Denaturierung bei 94°C für 1 Minute, Anlagerung
von Primern bei 50°C
für 2 Minuten
und einer Synthesereaktion bei 72°C
für 2 Minuten.
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Als
nächstes
wurde eine sekundäre
PCR unter Verwendung des Reaktionsgemisches als Template durchgeführt. Eine
PCR wurde unter denselben Bedingungen wie die der primären PCR
durchgeführt,
außer dass
1 μl des
Reaktionsgemisches, das durch die primäre PCR als Template erhalten
wurde, sowie eine Kombination der gemischten Primer 2 und des Primers
C2 (einem Primer, der in dem LA-PCR-in-vitro-Klonierungskit (Takara Shuzo)
vorhanden ist) verwendet wurde. Nach der PCR wurde die obere Mineralölschicht
entfernt und 5 μl
des Reaktionsgemisches wurde eine Elektrophorese auf einem 1,0%
Agarosegel unterzogen, gefolgt von einer Färbung der DNA mit Ethidiumbromid,
um das Amplifikationsprodukt nachzuweisen. Als Ergebnis wurde ein
ungefähr
0,8 kb DNA-Fragment nachgewiesen. Das DNA-Fragment wurde als βN bezeichnet.
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Das
amplifizierte βN-Fragment,
das von dem Agarosegel ausgeschnitten wurde, wurde in einen pT7Blue-Vektor
ligiert und verwendet, um Escherichia coli JM 109 zu transformieren.
Die Nukleotidsequenzen der terminalen Regionen des amplifizierten
Fragments βN
wurden unter Verwendung einer Transformante gemäß des Didesoxykettenterminationsverfahrens
bestimmt. Primer 3 und 4 (SEQ ID NO: 10 und 11) wurden basierend
auf der Sequenz der N-terminalen Region entworfen. Primer 5 und
6 (SEQ ID NO: 12 und 13) wurden basierend auf der Sequenz der terminalen
Region, die eine andere als die N-terminale Region ist, entworfen. Sie
wurden unter Verwendung eines DNA-Synthetisierers synthetisiert
und dann gereinigt.
-
DNA-Fragmente
stromaufwärts
und stromabwärts
von βN wurden
auf ähnliche
Wiese kloniert, indem diese Primer und der LA-PCR-in-vitro-Klonierungskit
(Takara Shuzo) verwendet wurden. In diesem Fall lagerten sich die
Primer bei 55°C
für eine
Minute an.
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Für die stromaufwärts gelegene
Region wurden die Primer 3 und 4 verwendet, um ein DNA-Fragment von
ungefähr
0,6 kb zu erhalten, das als βUN
bezeichnet wurde. Für
die Region stromabwärts
von βN wurden die
Primer 5 und 6 verwendet, um ein DNA-Fragment von ungefähr 1,3 kb
zu erhalten, das als βC
bezeichnet wurde. Sowohl βUN
als auch βC
wurden in den pT7Blue-Vektor (Novagen) ligiert. Die Nukleotidsequenzen wurden
gemäß dem Didesoxykettenterminationsverfahren
bestimmt. Die Nukleotidsequenzen der DNA-Fragmente βN, βUN und βC wurden
analysiert und aneinander gelagert. Als Ergebnis wurde ein ORF,
das für
ein Protein kodiert, das aus 438 Aminosäuren besteht, gefunden.
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Die
Nukleotidsequenz des ORF und die Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz
des ORF kodiert wurde, sind in SEQ ID NO: 20 bzw. 22 gezeigt. Es
wurde festgestellt, dass in βUN
eine Nukleotidsequenz für
die Aminosäuresequenz
P1, eine Nukleotidsequenz, die für
20 Aminosäuren
stromaufwärts
der Aminosäuresequenz
P1 kodiert, und eine SD-ähnliche
Sequenz in einer weiter stromaufwärts gelegenen Region vorhanden
ist.
-
Die
in Beispiel 3 bestimmte N-terminale Aminosäuresequenz P1 entspricht der
Sequenz ausgehend von der 21. bis zur 33. Aminosäure in der SEQ ID NO: 22. Die
partiellen Aminosäuresequenzen
PI3 (SEQ ID NO: 3) und PI4 (SEQ ID NO: 4), die in Beispiel 3 bestimmt
wurden, stimmen mit den Sequenzen ausgehend von der 265. bis zur
272. Aminosäure
bzw. der 367. bis zur 376. Aminosäure in der SEQ ID NO: 22 überein.
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Vergleichsbeispiel 9
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Klonierung des Agarase
II-Gens
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Die
gemischten Primer 7 und 8 (SEQ ID NO: 14 und 15) wurden auf der
Basis der N-terminalen Aminosäuresequenz
von Agarase II, P2 (SEQ ID NO: 2) und PII6 (SEQ ID NO: 6) entworfen,
die, wie in Beispiel 3 beschrieben, bestimmt wurden. Sie hybridisieren
an Stränge,
die sich voneinander unterscheiden. Die gemischten Primer wurden
unter Verwendung eines DNA-Synthetisierers synthetisiert und dann
gereinigt.
-
Insbesondere
entspricht der gemischte Primer 7, der durch SEQ ID NO: 14 repräsentiert
ist, den Aminosäurezahlen
1–8 in
der Aminosäuresequenz
P2 und der gemischte Primer 8, der durch SEQ ID NO: 15 repräsentiert
ist, entspricht einem komplementären
Strang einer DNA, die für
die Aminosäurezahlen
2–10 in
der Aminosäuresequenz
PII6 kodieren.
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Die
Klonierung des Agarase II-Gens wurde unter Verwendung dieser Primer
und des LA-PCR-in-vitro-Klonierungskits (Takara Shuzo) durchgeführt.
-
Eine
primäre
PCR wurde wie folgt durchgeführt.
10 ng der chromosomalen NAB2-1-1-DNA,
die in Beispiel 7 präpariert
wurde, wurde in ein 0,5 ml-Gefäß für eine PCR
gegeben. 5 μl
von 10 × LA
PCR-Puffer, 8 μl eines
dNTP-Gemisches, 40 pmol von jedem der gemischten Primer 7 und 8,
0,5 μl TaKaRa
LA Taq und steriles Wasser auf 50 μl wurden dazu zugegeben. Nachdem
die Lösung
mit 50 μl
Mineralöl überlagert
wurde, wurde das Gefäß unter
Verwendung eines automatisierten Gen-Amplifikationsinstruments Thermo
Cycler (Takara Shuzo) einer Reaktion ausgesetzt. Nach der Denaturierung
bei 94°C
für 2 Minuten
wurde eine PCR mit 30 Zyklen durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus
einer Denaturierung bei 94°C
für 1 Minute,
einer Anlagerung von Primern bei 50°C für 2 Minuten und der Synthesereaktion
bei 72°C
für 2 Minuten.
Die Überlagerungsschicht des
Mineralöls
wurde entfernt und 5 μl
des Reaktionsgemisches wurde einer Elektrophorese auf einem 1,0% Agarosegel
unterzogen, gefolgt von einer Färbung
der DNA mit Ethidiumbromid, um das Amplifikationsprodukt nachzuweisen.
Als Ergebnis wurde ein DNA-Fragment mit ungefähr 600 bp nachgewiesen. Das
DNA-Fragment wurde als αN
bezeichnet.
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Das
amplifizierte Fragment αN,
das aus dem Agarosegel ausgeschnitten wurde, wurde in den Vektor pT7Blue
ligiert und verwendet, um Escherichia coli JM 109 zu transformieren.
Die Nukleotidsequenzen der terminalen Regionen des amplifizierten
Fragments αN
wurden unter Verwendung einer Transformante gemäß dem Didesoxykettenterminationsverfahren
bestimmt. Die Primer 9 und 10 (SEQ ID NO: 16 und 17) wurden auf der
Basis der Sequenz der N-terminalen Region entworfen. Die Primer
11 und 12 (SEQ ID NO: 18 und 19) wurden auf der Basis der Sequenz
der terminalen Region, die eine andere ist als die N-terminale Region,
entworfen. Sie wurden unter Verwendung eines DNA-Synthetisierers
synthetisiert und dann gereinigt.
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DNA-Fragmente
stromaufwärts
und stromabwärts
von αN wurden
auf ähnliche
Weise kloniert unter Verwendung dieser Primer und einem LA-PCR-in-vitro-Klonierungskit
(Takara Shuzo).
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In
diesem Fall wurde eine PCR wie folgt durchgeführt. Die chromosomale NAB2-1-1-DNA, die in Beispiel
7 präpariert
wurde, wurde vollständig
mit einem Restriktionsenzym BamHI verdaut. Ein BamHI-Adapter wurde
an die Termini der verdauten DNA unter Verwendung eines DNA-Ligationskits
(Takara Shuzo) ligiert. Ein Teil davon wurde in ein 0,5 ml-Gefäß zur PCR
gegeben. Es wurden 5 μl
von 10 × LA
PCR-Puffer, 8 μl
eines dNTP-Gemisches, 1 μl
des Primers 9, 1 μl
des Primers C1, 0,5 μl
TaKaRa LA Taq und steriles Wasser auf 50 μl dazu zugegeben. Nachdem die
Lösung
mit 50 μl
Mineralöl überlagert
wurde, wurde das Gefäß einer
Reaktion unter Verwendung eines automatisierten Gen-Amplifikationsinstruments
Thermo Cycler (Takara Shuzo) unterzogen. Nach der Denaturierung
bei 94°C
für 2 Minuten
wurde eine PCR mit 30 Zyklen durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus
einer Denaturierung bei 94°C
für 1 Minute,
eine Anlagerung von Primern bei 50°C für 2 Minuten und einer Synthesereaktion
bei 72°C
für 3 Minuten.
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Als
nächstes
wurde eine sekundäre
PCR unter Verwendung des Reaktionsgemisches als Template durchgeführt. Eine
PCR wurde unter denselben Bedingungen durchgeführt wie diejenigen der primären PCR, außer dass
1 μl des
Reaktionsgemisches, das durch die primäre PCR als Template erhalten
wurde sowie eine Kombination des Primers 10 und des Primers 2 verwendet
wurde. Die Überlagerungsschicht
aus Mineralöl wurde
entfernt und 5 μl
des Reaktionsgemisches wurde einer Elektrophorese auf einem 1,0%
Agarosegel unterzogen, gefolgt von einer Färbung mit DNA-Ethidiumbromid,
um das Amplifikationsprodukt nachzuweisen. Als Ergebnis wurde ein
DNA-Fragment von ungefähr
500 bp nachgewiesen. Das DNA-Fragment wurde als αUN bezeichnet.
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In ähnlicher
Weise wurden die Primer 11 und 12 verwendet, um ein ungefähr 2 kb
DNA-Fragment stromabwärts
von αN zu
erhalten, das als αC
bezeichnet wurde. Sowohl αUN
als auch αC
wurden in den Vektor pT7Blue (Novagen) ligiert. Die Nukleotidsequenzen
wurden gemäß dem Didesoxykettenterminationsverfahren
bestimmt. Die Nukleotidsequenzen der DNA-Fragmente αN, αUN und αC wurden
analysiert und aneinander angelagert. Als Ergebnis wurde ein ORF
gefunden, das für
ein Protein kodiert, das aus 1089 Aminosäuren besteht. Die Nukleotidsequenz
des ORF und die Aminosäuresequenz,
die von der Nukleotidsequenz des ORFs kodiert wird, ist in den SEQ
ID NO: 21 bzw. 23 gezeigt. Es wurde festgestellt, dass in αUN eine Nukleotidsequenz
für die
Aminosäuresequenz
P2, eine Nukleotidsequenz, die für
26 Aminosäuren
mit einer Signalpeptid-ähnlichen
Sequenz stromaufwärts
der Aminosäuresequenz
P2 und eine SD-ähnliche
Sequenz in einer weiter stromaufwärts gelegenen Region vorkommt.
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Die
Aminosäuresequenz
P2 entspricht der Sequenz ausgehend von der 27. bis zur 36. Aminosäure in SEQ
ID NO: 23. Die partiellen Aminosäuresequenzen
PII5 (SEQ ID NO: 5), PII6 (SEQ ID NO: 6) und PII7 (SEQ ID NO: 7),
die in Beispiel 3 bestimmt wurden, stimmen mit den Sequenzen ausgehend
von der 129. bis zur 138. Aminosäure,
der 640. bis zur 649. Aminosäure
bzw. der 738. bis zur 747. Aminosäure in SEQ ID NO: 23 überein.
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Weiter
wurden drei vermeintliche Ca-Bindungsregionen (171–184, 271–283 und
987–999
in SEQ ID NO: 23) gefunden.
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Beispiel 10
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Konstruktion
eines Plasmids zur Expression von Agarase I
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Ein
Primer 13 (SEQ ID NO: 24) ist eine synthetische DNA, die eine Erkennungssequenz
für ein
Restriktionsenzym EcoRI mit den Nukleotidzahlen 12 bis 17 und eine
Nukleotidsequenz, die den Aminosäurezahlen
21 bis 27 in der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 22 an den Nukleotidzahlen 19 bis 38 besitzt. Es wurde
eine PCR durchgeführt
unter Verwendung des Primers 13 und eines Primers 14 (SEQ ID NO:
25), der eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym PstI
von den Nukleotidzahlen 11 bis 16 hat und an einen Strang hybridisiert,
der komplementär
ist zu einem Teil einer ungefähr
300 bp stromabwärts
gelegenen Region von dem Leseraster für Agarase I auf dem Chromosom.
10 pmol von jedem Primer 13 und 14, 10 ng der chromosomalen DNA
von NAB2-1-1-Template, 5 μl
10 × ExTaq-Puffer,
8 μl eines
dNTP-Gemisches, 0,5 μl
TaKaRa ExTaq und steriles Wasser auf 50 μl wurden in ein 0,5 ml-Gefäß zur PCR
zugegeben. Das Gefäß wurde
in ein automatisiertes Gen-Amplifikationsinstrument Thermo Cycler
(Takara Shuzo) gegeben. Nach der Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten
wurde eine PCR mit 25 Zyklen durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus
94°C für 1 Minute,
55°C für 2 Minuten
und 72°C
für 2 Minuten.
Das PCR-Produkt wurde konzentriert und durch Ethanolpräzipitation
entsalzen, mit den Restriktionsenzymen EcoRI (Takara Shuzo) und
PstI (Takara Shuzo) doppelt verdaut und dann einer Elektrophorese
auf einem 1,0% Agarosegel unterzogen. Der EcoRI-PstI-Verdau wurde
extrahiert und aufgereinigt. Das gereinigte Produkt wurde mit pUC
18 (Takara Shuzo), das mit denselben Enzymen verdaut wurde, gemischt
und die Ligation wurde unter Verwendung des DNA-Ligationskits (Takara
Shuzo) durchgeführt.
10 μl des
Ligationsgemisches wurden verwendet, um Escherichia coli JM 109
zu transformieren. Die Transformanten wurden auf LB Medium, das
Agar bei einer Konzentration von 1,5% (w/v) und Ampicillin bei einer
Konzentration von 50 μg/ml
enthält,
wachsen gelassen. Plasmide wurden aus weißen Kolonien präpariert
und eine DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt. Ein Plasmid, in das das
PCR-Produkt richtig eingeführt
wurde, wurde ausgewählt
und als pNB 101 bezeichnet. pNB 101 ist ein Plasmid, das für eine Aminosäuresequenz
ausgehend von den Aminosäurezahlen
21 bis 437 in der Aminosäuresequenz
von Agarase I kodiert (SEQ ID NO: 22). Escherichia coli, das mit
dem Plasmid pNB 101 transformiert wurde, wurde als Escherichia coli
JM109/pNB101 bezeichnet und am 10. Januar 2001 (dem Datum der ursprünglichen
Hinterlegung) bei der International Patent Organism Depositary,
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology,
AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki
305-8566, Japan,
unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-7854 hinterlegt.
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Die
Transformante mit pNB101, die eingeführt wurde, wurde in 2,5 ml
LB-Brühe,
die 50 μg/ml
Ampicillin enthielt, angeimpft und über Nacht bei 37°C kultiviert.
Einμl Teil
der Kultur wurde in 2,5 ml desselben frischen Mediums angeimpft
und bei 37°C
kultiviert, bis eine exponentielle Wachstumsphase erreicht wurde.
Zur selben Zeit wurde IPTG mit einer Endkonzentration von 1,0 mM
dazu zugegeben. Die Kultivierung wurde bei einer Temperatur von
20°C für weitere
2 Stunden fortgesetzt, um die Expression des Proteins von Interesse einzuleiten.
Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation gesammelt und in 150 μl einer Zellzertrümmerungslösung (20
mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid enthielt),
resuspendiert. Die Zellen wurden durch Sonifizierung aufgebrochen.
Ein Extrakt als Überstand
und ein Präzipitat
wurden voneinander durch Zentrifugation aufgetrennt und als Proben
für die
Messungen der β-Agarase-Aktivitäten unter
Verwendung von Agarose als Substrat eingesetzt. Dann wurde eine
Aktivität
für den
Extrakt als Überstand
nachgewiesen. Die Aktivität,
die in 100 ml Kultur enthalten war, war ungefähr um das 25-fache höher als
die des Wildtyp-Stamms NAB2-1-1.
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Beispiel 11
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Expressionssystem für Agarase
I unter Verwendung von pET16b
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Eine
PCR wurde unter Verwendung eines Primers 15 (SEQ ID NO: 26) und
eines Primers 16 (SEQ ID NO: 27) sowie der chromosomalen NAB2-1-1-DNA
als Template unter den Bedingungen, wie in Beispiel 10 beschrieben,
durchgeführt.
Der Primer 15 ist ein Primer, der eine Nukleotidsequenz besitzt,
die den Aminosäurezahlen
21 bis 27 in der Aminosäuresequenz
der Agarase I (SEQ ID NO: 22) an den Nukleotidzahlen 20 bis 39 entspricht
und eine Erkennungssequenz für
ein Restriktionsenzym NdeI an den Nukleotidzahlen 14 bis 19 enthält. Der
Primer 16 ist ein Primer, der eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym
XhoI an den Nukleotidzahlen 12 bis 17 enthält und an einen Strang hybridisiert,
der zu einem Teil ungefähr
300 bp stromabwärts
von dem Leseraster für
Agarase I auf dem Chromosom komplementär ist. Das amplifizierte Fragment wurde
durch Ethanolpräzipitation
konzentriert, mit NdeI (Takara Shuzo) und XhoI (Takara Shuzo) verdaut,
extrahiert und aufgereinigt. Das Produkt wurde in pET16b (Takara
Shuzo) ligiert, das mit denselben Enzymen verdaut wurde. Das entstandene
Plasmid wurde als pNB201 bezeichnet. pNB201 ist ein Plasmid, das
für eine Aminosäuresequenz
ausgehend von den Aminosäurezahlen
21 bis 437 in der Aminosäuresequenz
von Agarase I (SEQ ID NO: 22) kodiert.
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PNB201
wurde verwendet, um Escherichia coli BL21(DE3)pLysS zu transformieren
und die entstandene Transformante wurde verwendet, um die β-Agarase-Aktivität, wie oben
in Beispiel 10 beschrieben, zu bestimmen. Dann wurde eine Aktivität für den Extrakt
nachgewiesen. Die Aktivität,
die in 100 ml der Kultur enthalten war, war ungefähr um das
50-fache höher
als die von NAB2-1-1.
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Vergleichsbeispiel 12
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Konstruktion
eines Plasmids zur Expression von Agarase II
-
Ein
Primer 17 (SEQ ID NO: 28) ist eine synthetische DNA, die eine Erkennungssequenz
für ein
Restriktionsenzym EcoRI an den Nukleotidzahlen 10 bis 15 und eine
Nukleotidsequenz, die den Aminosäurezahlen 27
bis 33 in der Aminosäuresequenz
von Agarase II (SEQ ID NO: 23) an den Nukleotidzahlen 17 bis 37
entspricht, enthält.
Es wurde eine PCR unter Verwendung des Primer 17 und eines Primers
18 (SEQ ID NO: 29) durchgeführt,
der eine Erkennungssequenz für
ein Restriktionsenzym BamHI an den Nukleotidzahlen 11 bis 16 besitzt
und an einen Teil ungefähr 250
bp stromabwärts
von dem Leseraster für
Agarase II auf dem Chromosom hybridisiert. 10 pmol von jedem Primer
17 und 18 sowie 10 ng chromosomale DNA von dem Wildtyp-Stamm NAB2-1-1
als Template wurden für
die PCR in einem Reaktionssystem unter Verwendung von ExTaq (Takara
Shuzo) verwendet. Nach der Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten, wurde eine PCR
mit 30 Zyklen durchgeführt.
Jeder Zyklus bestand aus 94°C
für 1 Minute,
50°C für 2 Minuten
und 72°C
für 3 Minuten. Das
PCR-Produkt wurde durch Ethanolpräzipitation konzentriert, mit
den Restriktionsenzymen EcoRI (Takara Shuzo) und BamHI (Takara Shuzo)
verdaut, und dann einer Elektrophorese auf einem 1,0% Agarosegel
unterzogen. Der EcoRI-BamHI-Verdau
wurde extrahiert und aufgereinigt. Ein Hybridplasmid mit pUC 18
wurde, wie in Beispiel 10 beschrieben, konstruiert und verwendet,
um Escherichia coli JM 109 zu transformieren. Das Hybridplasmid
wurde als pNA 101 bezeichnet. pNB 101 ist ein Plasmid, das für eine Aminosäuresequenz
von den Aminosäurezahlen
27 bis 1089 in der Aminosäuresequenz
von Agarase II (SEQ ID NO: 23) kodiert.
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Escherichia
coli, das mit dem Plasmid pNA 101 transformiert wurde, wurde als
Escherichia coli JM109/pNA101 bezeichnet und am 10. Januar 2001
(dem Datum der ursprünglichen
Hinterlegung) am International Patent Organism Depositary, National
Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba
Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566,
Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-7853 hinterlegt.
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Die
Transformante mit pNA101, die eingeführt wurde, wurde Bemessungen
von den α-Agarase-Aktivitäten, wie
in Beispiel 10 beschrieben, unterworfen, außer dass 10 mM Calciumchlorid
in dem Zellaufbruchprodukt enthalten war. Es wurde eine Aktivität für den Extrakt
nachgewiesen. Die Aktivität,
die in 100 ml der Kultur enthalten war, war ungefähr um das
15-fache höher
als die des Wildtyp-Stamms NAB2-1-1.
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Vergleichsbeispiel 13
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Aktivität des Agarase
II-Proteins mit Deletion
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Ein
modifiziertes Protein wurde mittels genetischer Manipulation, wie
unten beschrieben, präpariert. Die α-Agarase-Aktivität des modifizierten
Proteins wurde bestimmt.
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Ein
Primer 19 (SEQ ID NO: 30) ist ein Primer, der eine Nukleotidsequenz
entsprechend den Aminosäurezahlen
181 bis 188 in der Aminosäuresequenz
von Agarase II (SEQ ID NO: 23) von den Nukleotidzahlen 19 bis 40
und eine Erkennungssequenz für
ein Restriktionsenzym EcoRI von den Nukleotidzahlen 12 bis 17 besitzt.
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Es
wurde eine PCR unter Verwendung des Primers 19 und des Primers 18
(SEQ ID NO: 29) sowie der chromosomalen NAB2-1-1-DNA als Template
durchgeführt.
Das Produkt wurde an pUC 18 ligiert und es wurde eine Transformation
von Escherichia coli JM 109 wie in Beispiel 12 beschrieben, durchgeführt. Ein
Hybridplasmid, das erhalten wurde, indem die DNA-Sequenz an der
Verbindungsstelle bestätigt
wurde, wurde als pNA201d bezeichnet. Ein Protein, das aus pNA201d
exprimiert wurde, entspricht einem Protein, bei dem ein Teil bis
zu der Aminosäurezahl
180 in der Aminosäuresequenz
von Agarase II (SEQ ID NO: 23) deletiert wurde. Mit anderen Worten,
pNA201d ist ein Plasmid, das für
eine Aminosäuresequenz
ausgehend von den Aminosäurezahlen
181 bis 1089 in der Aminosäuresequenz
von Agarase II (SEQ ID NO: 23) kodiert. Nach der Induktion der Expression
unter Verwendung von IPTG, wurden Messungen der Aktivitäten wie
in Beispiel 10 durchgeführt,
außer
dass 10 mM Calciumchlorid in dem Zellzertrümmerungsprodukt enthalten war.
Eine α-Agarase-Aktivität wurde
für den
Extrakt nachgewiesen. Die Aktivität, die in 100 ml der Kultur
enthalten war, war ungefähr
um das 2-fache höher
als die von NAB2-1-1.
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Ein
Primer 20 (SEQ ID NO: 31) besitzt eine Nukleotidsequenz, die den
Aminosäurezahlen
318 bis 325 in der Aminosäuresequenz
von Agarase II (SEQ ID NO: 23) entsprechen von den Nukleotidzahlen
19 bis 40 und eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym EcoRI
von den Nukleotidzahlen 12 bis 17 besitzt. Es wurde eine PCR unter
Verwendung des Primers 20 und des Primers 18 (SEQ ID NO: 29) sowie
der chromosomalen NAB2-1-1-DNA als Template durchgeführt, um
ein Hybridplasmid mit pUC18, pNA301d zu konstruieren. Ein Protein,
bei dem ein Peptid bis zu der Aminosäurezahl 317 in der Aminosäuresequenz
von Agarase II (SEQ ID NO: 23) deletiert wurde, wurde in Escherichia
coli JM 109, bei dem pNA301d eingeführt wurde, exprimiert. Mit
anderen Worten, pNA301d ist ein Plasmid, das für eine Aminosäuresequenz
ausgehend von den Aminosäurezahlen
318 bis 1089 in der Aminosäuresequenz
von Agarase II (SEQ ID NO: 23) kodiert. Messungen der Aktivitäten wurden,
wie in Beispiel 10 beschrieben, durchgeführt, außer dass 10 mM Calciumchlorid in
dem Zellzertrümmerungsprodukt
enthalten war. Eine α-Agarase-Aktivität wurde
für den
Extrakt nachgewiesen. Die Aktivität, die in 100 ml der Kultur
enthal ten war, war ungefähr
um das 15-fache höher
als die von NAB2-1-1. Weiter wurde ein Extrakt, der von einer Transformante
stammte, bei der pNA301d eingeführt
war, gegen einen Calcium-freien Puffer dialysiert (20 mM Tris-HCl-Puffer
(pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid und 1 mM EDTA (pH 7,2) enthielt)
und dann mit einer Lösung,
die Agarose bei einer Konzentration von 0,2% enthielt, in 20 mM
Tris-HCl-Puffer
(pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid und 1 mM EDTA enthielt (pH 7,2)
umgesetzt. Als ein Ergebnis wurde eine Spaltungsaktivität ähnlich der,
bei der ein Puffer, der Calcium enthielt, verwendet wurde, festgestellt.
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Beispiel 14
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Vergleich mit AgarACE-Enzym
(Promega)
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[Optimale Temperatur]
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Die
enzymologischen Eigenschaften von Agarase I der vorliegenden Erfindung
wurden mit denen des AgarACE-Enzyms, einer β-Agarase, die von dem marinen
Flavobakterium stammt, die von Promega verkauft wird, verglichen.
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10 μ von Agarase
I des AgarACE-Enzyms (Promega, entsprechend 0,29 Einheiten gemäß dem beiliegenden
Datenblatt) wurden zu 40 μl
1,0% (w/v) NuSieve GTG Agarose gegeben, die durch Erhitzen in 20 mM
Tris-HCl-Puffer (pH 7,3) (FMC) gelöst wurde. Das Gemisch wurde
bei 45°C,
50°C, 55°C, 60°C oder 65°C für 10 Minuten
umgesetzt. Die Aktivitäten
beider Enzyme wurden vorher gemäß dem in
Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gemessen. Dann wurden die Enzyme
dazugegeben, so dass dieselben enzymatischen Aktivitäten in den
entsprechenden Reaktionen vorhanden waren. Nach der Reaktion wurden
die enzymatischen Aktivitäten,
wie in Beispiel 1 beschrieben, berechnet. Die maximale enzymatische
Aktivität
wurde als 100% festgesetzt, die Ergebnisse sind als relative Werte
in Tabelle 3 gezeigt. Wie aus diesen Ergebnissen hervorgeht, ist
die optimale Temperatur von Agarase I 50°C bis 65°C und die optimale Temperatur
des AgarACE-Enzyms 45°C
bis 50°C.
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[Thermostabilität]
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10 μl von Agarase
I oder des AgarACE-Enzyms (entsprechend 0,29 Einheiten gemäß dem beiliegenden
Datenblatt) wurden bei 60°C
oder 65°C
für einen
gegebenen Zeitraum inkubiert und dann zu 40 μl 1,0% (w/v) NuSieve GTG Agarose
zugegeben, die durch Erhitzen in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,3)
(FMC) gelöst war.
Die Enzyme wurden so dazugegeben, dass dieselben enzymatischen Aktivitäten in den
entsprechenden Reaktionen, wie oben beschrieben, enthalten waren.
Das Gemisch wurde bei 55°C
für 10
Minuten (im Falle von Agarase I) oder 45°C für 10 Minuten (im Falle von
AgarACE-Enzym) umgesetzt. Die enzymatischen Aktivitäten wurden,
wie in Beispiel 1 beschrieben, berechnet. Die Aktivität ohne Erhitzen
wurde als 100% festgesetzt, die Ergebnisse sind als relative Werte
in Tabelle 4 gezeigt. Wie aus diesen Ergebnissen hervorgeht, wurden
fast 100% der Aktivität
von Agarase I nach der Inkubation bei 65°C für 10 Minuten beibehalten, während das
AgarACE-Enzym fast vollständig
nach der Inkubation bei 65°C
für 10
Minuten inaktiviert war.
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Beispiel 15
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Veränderung der Thermostabilität des Enzyms
durch Calcium
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Escherichia
coli JM109, das mit pNA101 (Beispiel 11) oder pNA301d (Beispiel
13) transformiert war, wurde in 2,5 ml LB-Brühe, die 50 μg/ml Ampicillin enthielt, angeimpft
und über
Nacht bei 37°C
kultiviert. Ein Teil der Kultur wurde in 100 ml desselben Mediums
angeimpft und bei 37°C
kultiviert, bis sie die exponentielle Wachstumsphase erreichte.
Nach dieser Zeit wurde IPTG bei einer Endkonzentration von 1,0 mM
dazugegeben. Die Kultivierung wurde bei einer Temperatur von 20°C für weitere
2 Stunden fortgesetzt, um die Expression des Proteins von Interesse
zu induzieren. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation gesammelt,
in 5 ml einer Zellzertrümmerungslösung (20
mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid und 1 mM Calciumchlorid
enthielt) suspendiert. Die Zellen wurden durch Sonifizierung zertrümmert. Ein Überstand
wurde durch Zentrifugation gesammelt. Die α-Agarase-Aktivität in dem Überstand
wurde gemessen. Der Überstand wurde
mit der Zellzertrümmerungslösung so
verdünnt,
dass dieselbe enzymatische Aktivität in einem Einheitsvolumen
für jede
Probe vorhanden war. Der so erhaltene Extrakt für jedes Enzym wurde über Nacht
gegen Puffer A (20 mM Tris-HCl-Puffer
(pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid und 10 mM Calciumchlorid enthielt),
der Calcium enthielt, oder Puffer B (20 mM Tris-HCl (pH 7,2), der
10 mM Natriumchlorid und 1 mM EDTA (pH 7,2) enthielt), der kein
Calcium enthielt, dialysiert. 20 μl
der Enzymlösung
wurde bei 55°C
oder 50°C
für 10
Minuten inkubiert und dann mit 180 μl einer Lösung, die Agarose bei einer
Konzentration von 0,2% in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10
mM Natriumchlorid enthielt, umgesetzt. Die verbleibende α-Agarase-Aktivität wurde
gemäß dem in
Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gemessen. Die Ergebnisse sind
in Tabelle 5 gezeigt.
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Native
Agarase II, die von NAB2-1-1 erhalten wurde, wurde als eine Kontrolle
verwendet. Tabelle
5
- * Die verbleibende Aktivität nach Behandlung
bei 50°C
in Puffer A wurde für
jedes Enzym als 100 definiert.
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Vergleichsbeispiel 15
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Aktivität von Agarase
II-Protein mit Deletion
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Ein
modifiziertes Protein wurde mittels genetischer Manipulation, wie
unten beschrieben, präpariert. Die α-Agarase-Aktivität des modifizierten
Proteins wurde bestimmt.
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Ein
Primer 21 (SEQ ID NO: 34) besitzt eine Nukleotidsequenz, die den
Aminosäurezahlen
290 bis 297 in der Aminosäuresequenz
von Agarase II (SEQ ID NO: 23) entspricht von den Nukleotidzahlen
19 bis 40 und eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym EcoRI
von den Nukleotidzahlen 12 bis 17 besitzt.
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Eine
PCR wurde unter Verwendung des Primers 21 und des Primers 18 (SEQ
ID NO: 29) sowie der chromosomalen NAB2-1-1-DNA als Template durchgeführt. Das
Produkt wurde an pUC 18 ligiert und eine Transformation von Escherichia
coli JM 109 wurde, wie in Beispiel 12 beschrieben, durchgeführt. Ein
Hybridplasmid, das erhalten wurde, indem die DNA-Sequenz an der
Verbindungsstelle bestätigt
wurde, wurde als pNA401d bezeichnet. Ein Protein, das aus pNA401d
exprimiert wurde, ist eines, bei dem ein Teil bis zu der Aminosäurezahl
289 in der Aminosäuresequenz
von Agarase II (SEQ ID NO: 23) deletiert wurde. Mit anderen Worten,
pNA401d ist ein Plasmid, das für
eine Aminosäuresequenz
ausgehend von den Aminosäurezahlen 290
bis 1089 in der Aminosäuresequenz
von Agarase II (SEQ ID NO: 23) kodiert. Escherichia coli JM 109,
das mit pNA301d, das in Beispiel 13 erhalten wurde, oder mit pNA401d,
das, wie oben beschrieben, erhalten wurde, transformiert wurde,
wurde in 2,5 ml LB-Brühe,
die 50 μg/ml
Ampicillin enthielt, angeimpft und über Nacht bei 37°C kultiviert.
Ein Teil der Kultur wurde in 100 ml desselben Mediums angeimpft
und bei 37°C
kultiviert, bis sie die exponentielle Wachstumsphase erreichte.
Zu dieser Zeit wurde IPTG bei einer Endkonzentration von 1,0 mM
dazugegeben. Die Kultivierung wurde bei einer Temperatur von 20°C für weitere
2 Stunden fortgesetzt, um die Expression des Proteins von Interesse
zu induzieren. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation gesammelt,
in 5 ml einer Zellzertrümmerungslösung (20
mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 10 mM Natriumchlorid und 10 mM
Calciumchlorid enthielt) suspendiert. Die Zellen wurden durch Sonifizierung
zertrümmert.
Ein Überstand
wurde durch Zentrifugation gesammelt. Die α-Agarase-Aktivität in dem Überstand wurde gemessen. Der Überstand
wurde mit der Zellzertrümmerungslösung so
verdünnt,
dass dieselbe enzymatische Aktivität in einem Einheitsvolumen
für jede
Probe enthalten war. 20 μl
der Enzymlösung
wurden bei 55°C
oder 60°C
für 10
Minuten inkubiert und dann mit 180 μl einer Lösung, die Agarose bei einer
Konzentration von 0,2% enthielt, in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2),
der 10 mM Natriumchlorid enthielt, umgesetzt. Die verbleibende α-Agarase-Aktivität wurde
gemäß dem Verfahren,
wie in Beispiel 1 beschrieben, gemessen. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 6 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Thermostabilität des Produkts
von pNA401d gleich oder höher
als die von pNA301d ist.
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Native
Agarase II, die von NAB2-1-1 erhalten wurde, wurde als eine Kontrolle
verwendet. Tabelle
6
- * Die verbleibende Aktivität nach der
Behandlung bei 50°C
wurde für
jedes Enzym als 100 definiert.
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Weiter
wurde ein Überstand
durch Zentrifugation nach Induktion mit IPTG bei 37°C über Nacht
gesammelt, gefolgt von einer Zertrümmerung der Zellen durch Sonifizierung,
wie oben beschrieben. Der Proteingehalt des Überstandes wurde quantifiziert.
Der Überstand
wurde einer SDS-PAGE ausgesetzt, so dass dieselbe Menge von Protein
geladen wurde. Zusätzlich
wurde das erhaltene Präzipitat
nach Sammeln des Überstandes in
die Zellzertrümmerungslösung suspendiert
und einer SDS-PAGE auf ähnliche
Weise ausgesetzt. Als ein Ergebnis wurde festgestellt, dass die
Menge des Proteins von Interesse in dem Überstand, der unter Verwendung
von pNA401d erhalten wurde, bei der Induktion höher war als die Menge des Proteins
von Interesse in dem Überstand,
der unter Verwendung des nativen Typs oder pNA301d erhalten wurde.
Daher wurde gezeigt, dass die mutante α-Agarase, die durch Induktion
von Escherichia coli JM109, das mit pNA401d transformiert war, exprimiert
wurde, leicht gelöst
werden konnte.
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Industrielle
Anwendbarkeit
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Die
vorliegende Erfindung liefert eine neue Agarase. Die optimale Temperatur
der erfindungsgemäßen Agarase
ist höher
als die einer konventionellen Agarase und die Agarase ist hervorragend
thermostabil. Daher kann sie für
eine Reaktion bei einer hohen Temperatur verwendet werden. Daher
ist die erfindungsgemäße Agarase
hervorragend wirksam, weil sie eine Reaktion in der Gegenwart von
Agarose bei einer hohen Konzentration ohne Erstarren ermöglicht.
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Es
ist möglich,
Agarooligosaccharide mit niedrigen Polymerisationsgraden mit 3,6-Anhydro-L-Galaktose
an deren reduzierenden Enden (z.B. Agarobiose und Agarotetraose)
oder Neoagarooligosaccharide mit 3,6-Anhydro-L-Galaktose an deren
nicht-reduzierenden Enden (z.B. Neoagarobiose und Neoagarotetraose) direkt
aus Agarose unter Verwendung der erfindungsgemäßen Agarase effizient herzustellen.
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Eine
Nukleinsäure
oder dergleichen kann aus einem Agarosegel unter Verwendung der
erfindungsgemäßen Agarase
effizient extrahiert werden.
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Die
unter Verwendung der erfindungsgemäßen Agarase hergestellten Agarooligosaccharide
besitzen physiologische Aktivitäten,
wie z.B. eine Apoptose-induzierende Aktivität, eine karzinostatische Aktivität, verschiedene
Antioxidanzien-Aktivitäten,
eine immunoregulatorische Aktivität und eine antiallergene Aktivität. Daher
sind sie auf den Gebieten von pharmazeutischen Zusammensetzungen,
Nahrungsmitteln und Getränken verwendbar.
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Die
vorliegende Erfindung offenbart zum ersten Mal die Aminosäuresequenz
und die Nukleotidsequenz der Agarase. Daher ist es möglich ein
Gen bereitzustellen, das für
ein Polypeptid mit einer Agarase-Aktivität kodiert. Die vorliegende
Erfindung liefert auch ein industriell vorteilhaftes Verfahren zur
Herstellung eines Polypeptids mit einer Agarase-Aktivität durch
genetische Manipulation unter Verwendung dieses Gens.
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Weiter
wird der Zusatz von Agarose zu einem Medium zur Induktion der Herstellung
der Agarase in dem Herstellungsverfahren durch genetische Manipulation
unter Verwendung dieses Gens nicht benötigt. Daher kann nach der Kultivierung
viel Arbeit erspart werden und das Enzym ist leicht aufgereinigt.
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Zusätzlich liefert
die vorliegende Erfindung aufgrund der Tatsache, dass sie das Agarase-Gen
zum ersten Mal beschreibt, auf Grundlage der Information über dieses
Gen, einem rekombinanten Polypeptid, das durch das Gen kodiert wird,
einen Antikörper,
der spezifisch an das Polypeptid oder ein Fragment davon bindet,
sowie eine Sonde oder ein Primer, der spezifisch an die Agarase
hybridisiert.
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Sequenzprotokoll
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- SEQ ID No: 1: N-terminale Aminosäuresequenz von Agarase I
- SEQ ID No: 2: N-terminale Aminosäuresequenz von Agarase II
- SEQ ID No: 3: Partielle Aminosäuresequenz von Agarase I
- SEQ ID No: 4: Partielle Aminosäuresequenz von Agarase I
- SEQ ID No: 5: Partielle Aminosäuresequenz von Agarase II
- SEQ ID No: 6: Partielle Aminosäuresequenz von Agarase II
- SEQ ID No: 7: Partielle Aminosäuresequenz von Agarase II
- SEQ ID No: 8: PCR-Primer 1
- SEQ ID No: 9: PCR-Primer 2
- SEQ ID No: 10: PCR-Primer 3
- SEQ ID No: 11: PCR-Primer 4
- SEQ ID No: 12: PCR-Primer 5
- SEQ ID No: 13: PCR-Primer 6
- SEQ ID No: 14: PCR-Primer 7
- SEQ ID No: 15: PCR-Primer 8
- SEQ ID No: 16: PCR-Primer 9
- SEQ ID No: 17: PCR-Primer 10
- SEQ ID No: 18: PCR-Primer 11
- SEQ ID No: 19: PCR-Primer 12
- SEQ ID No: 20: Nukleotidsequenz von ORF in Agarase I
- SEQ ID No: 21: Nukleotidsequenz von ORF in Agarase II
- SEQ ID No: 22: Aminosäuresequenz
von Agarase I
- SEQ ID No: 23: Aminosäuresequenz
von Agarase II
- SEQ ID No: 24: PCR-Primer 13
- SEQ ID No: 25: PCR-Primer 14
- SEQ ID No: 26: PCR-Primer 15
- SEQ ID No: 27: PCR-Primer 16
- SEQ ID No: 28: PCR-Primer 17
- SEQ ID No: 29: PCR-Primer 18
- SEQ ID No: 30: PCR-Primer 19
- SEQ ID No: 31: PCR-Primer 20
- SEQ ID No: 32: Konstruierter Oligonukleotidprimer zur Amplifikation
eines DNA-Fragments
aus ribosomaler 16S
- SEQ ID No: 33: Konstruierter Oligonukleotidprimer zur Amplifikation
eines DNA-Fragments
aus ribosomaler 16S
- SEQ ID No: 34: PCR-Primer 21
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