DE19983297B3 - Gene, die für β-Agarasen kodieren, und ihre Verwendung zur Herstellung von Enzymen für den biologischen Abbau von Agar - Google Patents

Abstract

Isoliertes agaA-Gen, das für eine β-Agarase kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass es die SEQ ID Nr. 1 hat.

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Gen, das für β-Agarase kodiert und seine Verwendung zur Herstellung von Enzymen für den biologischen Abbau von Agar.
• Sie betrifft gleichermaßen den Stamm Cytophaga drobachiensis, aus dem dieses Gen isoliert wurde.
• Die sulfatierten Galaktane von Rhodophyceae wie z. B. Agar und Carrageen stellen die Hauptpolysaccharide von Rhodophyceae dar und werden in großem Umfang als Geliermittel oder Verdickungsmittel auf verschiedenen Gebieten, insbesondere auf dem Gebiet der landwirtschaftlichen Lebensmittel eingesetzt. Etwa 6000 Tonnen Agar und 22000 Tonnen Carrageen werden zu diesem Zweck jährlich aus Rotalgen extrahiert. Agar wird industriell aus Rotalgen der Gattungen Gelidium und Gracilaria produziert. Carrageen wird in großem Umfang aus den Gattungen Chondrus, Gigartina und Euchema extrahiert.
• Agaro-Kolloide sind Polysaccharid-Komplexe, die hauptsächlich aus Agar und Agaroiden bestehen. Jedes Agaro-Kolloid hat einen unterschiedlichen Gehalt an jeder der obigen Verbindungen, so daß das Geliervermögen unterschiedlich ist. Agargel umfaßt eine Matrix aus Doppelhelix-Polymerketten, die durch Wasserstoff-Brückenbindungen zusammengehalten werden.
• Es gibt zwei Enzymtypen, die fähig sind, Agar abzubauen: Die α-Agarasen und die β-Agarasen. Die β-Agarasen wirken über die β-1,4-Bindung die α-Agarasen wirken über die α-1,3-Bindung.
• Es wurden bereits Mikroorganismen isoliert, die Enzyme produzieren, die fähig sind, Agar zu hydrolysieren. Diese Fähigkeit, Agar zu verdauen, wurde den folgenden Gattungen zugeschrieben: Pseudomonas (MORRICE et al., Eur. J. Biochem. 137, 149–154, (1983)), Streptomyces (HODGSON et CHATER, J. Gen. Microbiol. 124, 339–348 (1981)), Cytophaga (VAN DER MEULEN et HARDER, J. Microbiol. 41, 431–447 (1975)) und Vibrio (SUGANO et al., Appl. Environ. Microbiol. 59, 1549–1554, (1993)). Mehrere β-Agarase-Gene wurden bereits isoliert. So haben BELAS et al. das Gen einer Agarase bei Pseudomonas atlantica isoliert (Appl. Environ. Microbiol. 54, 30–37 (1988)). BUTTNER et al. haben eine Agarose bei Streptomyces coelicolor isoliert und das entsprechende Gen sequenziert (Mol. Gen. Genet. 209, 101–109 (1987)). SUGANO et al. haben zwei verschiedene Agarase-Gene bei Vibrio sp. JT0107 kloniert und sequenziert, die sie agaA (Appl. Environ. Microbiol. 59, 3750–3756 (1993)) und agaB (Biochimica et Biophysica Acta 1 218, 105–108 (1994)) genannt haben.
• Die Anmelderin hat nun aus der Rotalge Delesseria sanguinea einen Bakterienstamm isoliert, der Agarase-Aktivität aufweist.
• Dieser Stamm wurde bei der DSMZ-Collection (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) am 8. Mai 1998 unter der Nr. DSM 12170 hinterlegt. Er stellt den ersten Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar.
• Die taxonomische Untersuchung dieses Stamms, die durch dem Fachmann bekannte Techniken durchgeführt wurde, zeigt, daß er zur Gattung Cytophaga (Bakterien der Gruppe CFB, das heißt ”Cytophaga/Flexibacter/Bacteroide”) gehört. Tatsächlich entwickelt sich dieser Stamm unter Ausbreitung, zeigt gelbe Kolonien, die sich im Agar festsetzen, der dann flüssig wird. Die Bakterie ist Gram-negativ und hat die Form eines nicht mobilen Stäbchens von 0,3 bis 0,4 × 3,0 bis 8,0 μm × μm. Wenn ein Tropfen der Kultur des Stamms in der Mitte einer Agarschale eingeimpft wird, entwickelt sich die Kolonie unter konzentrischem Wachstum der Grenze und diese Beweglichkeit wird durch Diethylether, der ein Inhibitor des Geißelapparats ist, nicht gehemmt. Der Stamm ist aerob und besitzt einen oxidativen Metabolismus. Er produziert Flexirubin, das ein Pigment ist, das in den Isolaten mariner Cytophaga selten gefunden wird, das aber bei den nicht-marinen Bakterien der Gattung Cytophaga vorhanden ist. Er ist fähig, verschiedene Kohlenstoff-Quellen zu assimilieren und mehrere Typen von Makromolekülen abzubauen, z. B. Agar, Carrageen, Amidon und Gelatine.
• Die Anmelderin hat intensive Untersuchungen angestellt, um herauszufinden, zu welcher Spezies dieser Stamm gehört. Sie hat auch den Prozentgehalt von Guanin und Cytosin in der DNA des erfindungsgemäßen Stamms bestimmt und sie hat festgestellt, daß dieser zwischen 43 und 49% liegt. Sie hat auch die Sequenzierung seiner 16S DNA durch das Verfahren, das dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt ist, um die taxonomische Position eines Stamms zu bestimmen (FOX et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 22, 44–57 (1977)), durchgeführt. Das Sequenzierungsresultat zeigt, daß der erfindungsgemäße Stamm Cytophaga uliginosa sehr ähnlich ist (die Übereinstimmung in der Sequenz zwischen der 16S DNA von C. uliginosa und der des Stamms der Erfindung ist 99%). Dennoch zeigt die DNA/DNA-Hybridisierung zwischen den beiden Stämmen (45%), daß es sich um zwei unterschiedliche Spezies handelt.
• Darüber hinaus zeigt der erfindungsgemäße Stamm morphologische, biochemische und physiologische Charakteristika, die denen des Stamms Pseudomonas drobachiensis nov. comb., der von HUMM (Duke Univ. Mar. Stn. Bull. 3, 43–75 (1946)) isoliert wurde, entsprechen. Er wurde daher Cytophaga drobachiensis genannt.
• Barbeyron et al., ”The Kappa-Carrageenase of the marine bacterium Cytophaga drobachiens. Structural and phyhogenic relationships within family-16 glycoside hydrolases” (Mai 1998) Mol. Biol. Evol. Vol. 15(4), Seiten 528–537, betrifft ein Klonieren, Sequenzieren und eine Analyse von einer Aminosäure- und Nukleotidsequenz der Kappa-Carrageenase von Cytophaga drobachiensis. Es wird erklärt, dass dieses Enzym zur Familie 16 der Glycohydrolasen gehört, die insbesondere etliche β-Agarasen umfasst. Obwohl es scheint, dass diese Enzyme einen gemeinsam Vorläufer haben, sind sie im Hinblick auf ihre Struktur deutlich unterschiedlich und die Offenbarung dieses Dokuments gibt keinerlei Hinweis auf die Aminosäure oder Nukleinsäuresequenzen anderer Enzyme dieser Familie und insbesondere von Agarasen.
• Die Anmelderin hat aus Cytophaga drobachiensis DSM 12170 auch zwei Gene für β-Agarase-Aktivität isoliert.
• Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch das neue Gen agaA, das für eine β-Agarase kodiert, und das die DNA-Sequenz SEQ ID Nr. 1 hat.
• Dieses Gen kodiert für eine β-Agarase, die von C. drobachiensis DSM 12170 produziert wird, d. h. das β-Agarase genannte Protein AgaA.
• Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die Nukleinsäuren, d. h. die genomischen DNA-Sequenzen, die DNA-Sequenzen oder mRNA-Sequenzen, die eine Kettenbildung von Nukleotiden umfassen oder durch diese gebildet werden, welche für das Protein AgaA oder für eines ihrer Peptid-Fragmente, wie sie im Folgenden definiert sind, kodieren.
• Die Erfindung betrifft demnach:
• – Alle Nukleinsäuren, die für das Protein AgaA in seiner Gesamtheit kodieren. Diese Sequenzen werden vorzugsweise dargestellt durch: a) die DNA SEQ ID Nr. 1, die für das Protein AgaA kodiert, b) die DNA, die wegen der Degeneriertheit des genetischen Code von a) stammt und für das Protein AgaA kodiert; und c) die entsprechende mRNA.
• Die vorliegende Erfindung betrifft gleichermaßen die Nukleinsäure SEQ ID Nr. 5, die für das spezifische Peptid-Fragment AgaA', das im Folgenden beschrieben wird, kodiert. Diese Sequenz entspricht den Nukleinsäuren 223 bis 1050 der SEQ ID Nr. 1.
• Die Erfindung bezieht sich außerdem auf die Nukleinsäuren, die für das genannte Peptid-Fragment AgaA kodiert und die dargestellt werden durch:
• a) die DNA-Sequenz SEQ ID Nr. 5, die für das Peptid-Fragment AgaA' kodiert;
• b) die DNA-Sequenzen, die wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes von der obigen Sequenz a) stammt und für das Peptid-Fragment AgaA' kodiert; und
• c) die entsprechenden mRNA-Sequenzen.
• Die Nukleinsäuren gemäß der Erfindung können durch chemische Synthese oder durch Gentechnologie, wobei die dem Fachmann bekannten Techniken angewendet werden, die z. B. in SAMBROOK et al. („Molecular Cloning: a Laboratory Manual”, Herausgeber Cold Spring Harbor Press, N. Y., 1989) beschrieben sind, hergestellt werden.
• Z. B. kann die Synthese der DNA-Sequenzen gemäß der Erfindung durch Amplifikation der Gene von Cytophaga drobachiensis mit Hilfe der PCR (Polymerase Chain Reaction) erfolgen, wie es z. B. von GOBLET et al. (Nucleic Acid Research, 17, 2144 (1989)) beschrieben wird, durchgeführt werden, wobei als Primer synthetische Oligonukleotide verwendet werden, die ausgehend von der DNA-Sequenz SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 3 definiert sind.
• Das so amplifizierte Nukleinsäure-Fragment kann dann gemäß der Technik, die bei MANIATIS et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, NEW YORK (1982)) beschrieben ist, in einen Expressionsvektor geklont werden.
• Die Erfindung hat außerdem prokaryontische und eukaryotische Zellen zum Gegenstand, welche mit Hilfe eines Expressionsvektors, der eine Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung enthält, transformiert sind. Dieser Expressionsvektor, der z. B. in Form eines Plasmids vorliegen kann, muß zusätzlich zu der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz die notwendigen Mittel zu ihrer Expression enthalten, wie z. B. einen Promotor, einen Transkriptionsterminator, einen Replikationsursprung und vorzugsweise einen Selektionsmarker. Die Transformation der prokaryontischen Zellen und eukaryotischen Zellen ist eine Technik, die dem Fachmann wohlbekannt ist; dieser kann in einfacher Weise die Mittel, die zur Expression der DNA-Sequenz gemäß der Erfindung notwendig sind, in Abhängigkeit vom Organismus, der zu transformieren ist, bestimmen.
• Die für die Ziele der Erfindung bevorzugten prokaryontischen Mikroorganismen sind Escherichia choli und Bacillus subtilis.
• Als Beispiele für eukaryotische Zellen, die für die Ziele der Erfindung geeignet sind, können insbesondere die Zellen von Aspergillus niger, Trichoderma viridea oder Pichia pastoris genannt werden.
• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf das neue Protein AgaA von C. drobachiensis, das die SEQ ID Nr. 2 umfasst.
• Das neue Protein AgaA besteht aus 539 Aminosäuren und hat ein theoretisches Molekulargewicht von 60 001 kd. Nach Entfernung des Signalpeptids hat dieses Protein ein errechnetes Molekulargewicht von 57 768 kd.
• Die vorliegende Erfindung betrifft auch das Peptid-Fragment AgaA', das die SEQ ID Nr. 6 hat.
• Das Peptid-Fragment AgaA', das aus 276 Aminosäuren besteht, entspricht den Aminosäuren 20 bis 295 des Proteins AgaA.
• Die Proteine und Peptid-Fragmente gemäß der vorliegenden Erfindung können durch die Techniken der Gentechnologie erhalten werden, die folgende Stufen umfassen:
• – Kultur von prokaryontischen Zellen oder eukaryotischen Zellen, die durch einen Expressionsvektor transformiert wurden, der eine Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung besitzt und
• – Isolierung des Proteins oder des Peptid-Fragments, das durch diese Zellen produziert wurde.
• Diese Techniken sind dem Fachmann wohlbekannt. Details diesbezüglich kann man aus dem folgenden Werk entnehmen: Recombinant DNA, Technology I, Herausgeber Ales Prokop, Raskesh K Bajpai; Annals of the New York Academy of Sciences, Band 646, 1991.
• Die Peptid-Fragmente können gleichermaßen durch die klassische chemische Peptid-Synthese, die dem Fachmann bekannt ist, hergestellt werden.
• Die Erfindung wird nun detailliert anhand des folgenden experimentellen Teils beschrieben.
• Ein Großteil der Techniken, die in diesen Beispielen beschrieben werden und die dem Fachmann bekannt sind, ist detailliert in der Arbeit von SAMBROOK et al. (oben) oder in dem Werk von MANIATIS et al. (oben) dargelegt.
• Die folgende Beschreibung ist mit Hilfe der 1 bis 6 besser zu verstehen, wobei:
• 1 eine photographische Aufnahme eines SDS-PAGE-Elektrophoresegels des Kulturüberstands von C. drobachiensis gemäß der Erfindung ist;
• die 2A und 2B stellen physische Karten der genomischen Klone von Cytophaga drobachiensis, die Agarase-Aktivität aufweisen, dar;
• die 3A und 3B geben die Nukleotidsequenzen und die Aminosäuresequenzen, die von den Genen von Agarose A (3A) und Agarase B (3B) stammen, welche von C. drobachiensis stammen, an;
• 4 zeigt die Kette der Proteine AgaA (obere Reihe) und AgaB (untere Reihe), die von dem Stamm C. drobachiensis gemäß der Erfindung stammen;
• 5 ist eine Darstellung der Analyse hydrophober Anhäufungen (HCA-Analyse), die unter der englischen Bezeichnung ”Hydrophobic Cluster Analysis” bekannt ist, für die Gene von Agarase und andere Gene von Glycosid-Hydrolasen;
• die 6A bis 6C stellen Elutionsprofile der Hydrolyseprodukte von Neoagarododecaose durch die Agarasen dar, welche von dem Stamm C. drobachiensis gemäß der Erfindung stammen.
• BEISPIEL 1:
• Isolierung, Kultur des Stamms Cytophaga drobachiensis DSM 12170 und Extraktion seiner DNA
• Der Stamm DSM 12170 wurde aus lebenden Wedeln der Rotalge Delesseria sanguinea isoliert. Die Isolierung wurde in einer Petrischale auf Zobell-Medium (ZOBELL, J. Mar. Res. 4, 41–75 (1941)), das 2% 1-Carrageenan enthielt, durchgeführt.
• Die Kultur des Stamms erfolgte bei 25°C auf Zobell-Medium (ZOBELL, J. Mar. Res. 4, 41–75 (1941)).
• Das Protokoll, das zum Extrahieren der DNA des Stamms Cytophaga drobachiensis DSM 12170 verwendet wurde, ist von dem von Marmur (MARMUR, J. MOl. Biol. 3, 208–218 (1961)) abgeleitet und wird im folgenden detailliert beschrieben.
• Nach der Kultur wurden die Bakterien 15 min lang bei 3000 g zentrifugiert, dann in sterilem Meerwasser gewaschen. Die Zellen wurden einer letzten Zentrifugation, die mit der vorhergehenden identisch war, unterzogen und unverzüglich behandelt oder bei –20°C tiefgefroren.
• 5 bis 10 g Zellen, je nach Zellkonzentration (feuchtes Gewicht nach Zentrifugation), wurden in 25 ml Sph-Puffer (50 mmol/l Tris-HCl, pH 8; 25% Saccharose) und dann in 5 ml TES-Puffer (50 mmol/l Tris-HCl, pH 8; 5 mmol/l Ethylendiamintetraessigsäure; 50 mmol/l Natriumchlorid) aufgenommen; es wurden 50 mg Lysozym zugesetzt. Sphäroplasten traten nach einer Inkubation von 15 min bei Raumtemperatur auf.
• Die DNA wurde sogleich durch Zugabe von 100 mmol/l Ethylendiamintetraessigsäure (Endkonzentration) geschützt und die Inkubation wurde noch für 10 min in Eis fortgesetzt.
• Die Lyse wurde durch Zusatz von 2% Natriumdodecylsulfat (Endkonzentration) und 25 ml Lyse-Lösung (50 mmol/l Tris-HCl, pH 8; 100 mmol/l Ethylendiamintetraessigsäure; 100 mmol/l Natriumchlorid) zu Ende gebracht.
• Die Proteine wurden durch eine einstündige Inkubation bei 50°C in Gegenwart von 40 mg Proteinase K vollständig denaturiert. Am Ende dieser Inkubation wurde 1 mol/l (Endkonzentration) Natriumperchlorat zugesetzt, um die DNA/Protein-Bindungen zu unterbrechen.
• Die Lösung wurde durch 5-minütiges Rühren in Gegenwart von 0,5 Volumen gesättigtes Phenol entproteiniert. Das Rühren wurde manuell durchgeführt und war ausreichend kräftig, um eine Emulsion zu bilden (ohne daß eine Extraktion stattfinden konnte), aber nicht so kräftig, daß die DNA zerrissen wurde. Die Endproteinisierung wurde noch 5 min nach Zugabe von 0,5 Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24/l) fortgesetzt. Die Proteine wurden durch eine Zentrifugation bei 10000 g für 15 min bei Raumtemperatur an der Grenzfläche zwischen der wäßrigen Phase und der organischen Phase konzentriert.
• Die wäßrige Phase, die die Nukleinsäuren enthielt, wurde mit einer Pipette, deren Spitze vergrößert worden war, um die DNA nicht zu zerreißen, in ein sauberes Röhrchen übergeführt. Die Endproteinierung wurde fortgesetzt und die Spuren an Phenol wurden durch Rühren der Lösung für 5 min in Gegenwart 1 Volumens Chloroform/Isoamylalkohol (24/l) aus der wäßrigen Phase extrahiert.
• Nach einer 5-minütigen Zentrifugation bei 10000 g bei Raumtemperatur wurde die wäßrige Phase mit denselben Vorsichtsmaßnahmen wie vorher entnommen und die Nukleinsäuren wurden durch vorsichtiges Eingießen von 0,6 Volumen Isopropanol (unter Bildung von zwei Phasen) ausgefällt. Die DNA mit hohem Molekulargewicht wurde mit einem Glasstab gewonnen, mit 70%igem Ethänol gewaschen und in absolutem Alkohol dehydratisiert und in Luft getrocknet.
• Nach der Trocknung wurde die DNA in 20 ml TE-Puffer (10 mmol/l Tris-HCl, pH; 1 mmol/l Ethylendiamintetraessigsäure) gelöst. Die Auflösung nahm etwa 12 h in Anspruch und sie konnte durch ein Erwärmen auf 50°C erleichtert werden. Als die erhaltene Lösung opaleszierend geworden war – ein Zeichen für eine starke Verunreinigung mit Proteinen –, wurden die letzteren wirksam entfernt, indem eine Fraktion der DNA mit einem Caesiumchlorid-Gradienten in Gegenwart von Ethidiumbromid behandelt wurde. Die so erhaltene DNA wurde quantitativ bestimmt. Sie konnte bei 4°C konserviert oder bei –20°C gefroren werden.
• Die DNA-Zusammensetzung, ausgedrückt als Mol-%-Gehalt von Guanin plus Cytosin (Mol-% G + C) wurde nach dem spektroskopischen Verfahren von ULITZUR (Biochem. Biophys. Acta 272, 1–11 (1972)) und dem Verfahren des Caesiumchlorid-Gradienten in Gegenwart von 2'-[4-Hydroxyphenyl]-5-[4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-di-1H-benzimidazol (Hoechst 33258/Sigma) (KARLOVSKY et DE COCK, Anal. Biochem. 194, 192–197 (1991)) bestimmt. Im ersten Fall ist er 44 ± 1% (Mittel von zwei Versuchen) und im zweiten Fall 48,8%. Dieser Mol-%-Gehalt G + C wurde unter Verwendung der DNA von E. coli als Referenzstandard errechnet.
• BEISPIEL 2:
• Sequenzierung der 16S DNA von Cytophaga drobachiensis
• Die 16S DNA wurde durch PCR unter Verwendung der genomischen DNA des Stamms C. drobachiensis als Matrize und der Taq-Polymerase (Promega) als Enzym amplifiziert. Das typische PCR-Reaktionsgemisch mit einem Volumen von 50 μl hatte die folgende Zusammensetzung: 100 ng Matrize, 10 ng jedes der zwei Oligonukleotide, die für die 16S DNA des Bacteria-Reichs typsich sind, 200 mmol/l jedes der dNTP (dNTP ist das Desoxyribonukleosidtriphosphat), 1,5 mmol/l MgCl₂, Tag-Puffer und 2,5 U Enzym. Die verschiedenen Stufen der PCR waren wie folgt:
• • 6 min bei 95°C (1-mal)
• • 1,5 min bei 95°C; 1,5 min bei 54°C; 2,5 min bei 72°C (25-mal),
• • 8,5 min bei 72°C (Polymerisationsstufe).
• Das durch PCR erhaltene Produkt wurde entweder zuerst geklont und dann sequenziert oder direkt durch PCR sequenziert, wobei Thermosequenase (Amersham) als Enzym mit verschiedenen für die 16S DNA spezifischen Oligonukleotiden, die am 5'-Ende mit Texas-Rot markiert waren, verwendet wurde. Die verschiedenen PCR-Schritte waren die folgenden:
• • 5 min bei 97°C (1-mal)
• • 1 min bei 97°C; 1 min bei 54°C; 1 min bei 61°C (25-mal),
• Diese Sequenzierung, die die taxonomische Position des Stamms erkennen läßt, hat gezeigt, daß der Stamm gemäß der Erfindung Cytophaga uliginosa phylogenetisch sehr nahe steht.
• BEISPIEL 3:
• Demonstration und Reinigung der Agarase-Aktivitäten im Stamm Cytophage drobachiensis DSM 12170
• Die Agarase-Aktivität des Stamms wurde in Zobell-Medium, das mit 2,5 mg/l Agar ergänzt war, induziert. Man erwartet, daß ein Stamm Agarose-Aktivität zeigt, wenn er den Agar, auf dem er sich entwickelt, verdaut.
• Die Stämme mit Agarase-Aktivität wurden in dem obigen Medium bei 20°C kultiviert. Die Kultur wurde bei 1000 g für 20 min zentrifugiert. Der Kulturüberstand wurde gewonnen und durch tangentiale Ultrafiltration (Abschaltschwelle: 10 kd) konzentriert; auf diesen Vorgang folgte eine Ausfällung mit Ammoniumsulfat. Der Protein-Rückstand wurde in 9 ml MES-Puffer (MES ist 2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure) resuspendiert. Dann wurden 2 ml Sepharose CL6B zugefügt, um eine Affinitätschromatographie durchzuführen. Es wurden zwei Fraktionen gewonnen, von denen eine an der Sepharose-Säule gebunden waren.
• Die Agarose-Aktivität wurde untersucht, indem die reduzierenden Zucker nach der Technik von KIDBY D. K. & DAVIDSON DJ. (Annal. Biochem., Bd. 55, 321–325 (1973)) in dem Überstand vor der Affinitätschromatographie (was klar positiv ist) und in den zwei Fraktionen, die nach der Chromatographie erhalten wurden, bestimmt wurden. In jeder Fraktion wurde Agarose-Aktivität nachgewiesen.
• Mit der an der Säule gebundenen Fraktion wurde eine SDS-PAGE-Elektrophorese durchgeführt. Diese ergab eine Hauptbande mit einem mittlerem Molekulargewicht von 31 kd (1). Dieses Protein wurde mikrosequenziert. Die erhaltene Sequenz des internen Peptids wurde in der Aminosäuresequenz, die vom agaA-Gen abgeleitet ist, gefunden (3A).
• BEISPIEL 4:
• Klonen der Agarasegene
• Es wurde eine genomische DNA-Bibliothek des Stamms C. drobachiensis aufgebaut. Fragmente mit 4 bis 10 kb, die von der partiellen Verdauung der chromosomalen DNA durch NdeII stammten, wurden an einem Saccharose-Gradienten fraktioniert. Diese Fragmente wurden an der BamBI-Stelle des Plasmids pAT153 (TWIGG und SHERRATT, Nature, 283, 216 (1980)) eingesetzt.
• Die rekombinanten Klone (etwa 6000) des Stamms E. coli DH5α (SAMBROOK et al., oben) wurden unabhängig voneinander auf Mikrotiterplatten in LBA-Medium (Luria-Bertani-Medium (MANIATIS et al., oben), das mit Ampicillin in einer Konzentration von 50 μg/ml ergänzt war) inokuliert. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Klone bei 22°C auf Zd-Medium (5 mg/l Bacotrypton, 1 mg/l Hefeextrakt, 10 mg/l NaCl, pH 7,2), das mit 50 μg/ml Ampicillin ergänzt war, ausgebreitet, um die Agarase-Produktion zu beobachten (Loch in der Gelose, wenn eine Agarase-Produktion auftritt).
• In zwei Monaten der Kultur bei 22°C machten 4 unabhängige Kolonien, pAC1 bis pAC4 bezeichnet, ein Loch in das Substrat.
• Die Karten der Plasmide, die diesen Kolonien entsprechen, werden in den 2A und 2B dargestellt, wobei die feinen Linien die pAT153-Regionen darstellen, die verstärkten Segmente die C. drobachiensis-Inserts darstellen und die weißen Rechtecke, die Agarasegene darstellen;
• – die verschiedenen Abkürzungen, die folgende Bedeutungen haben:

B/S:	BamHI-Sau3A-Klonierungsstelle
B:	BamHI
Bg:	BglII
C:	ClaI
E:	EcoRI
H:	HindIII
K:	KnpI
Nc:	NcoI
Nd:	NdeI
Ps:	PstI
Pv:	PvuII
Sa:	SalI
Sp:	SphI
X:	XbaI

• Die Kartographie dieser Plasmide zeigt demnach das Vorliegen von zwei unterschiedlichen gemeinsamen Fragmenten, was das Vorliegen von mindestens zwei Agarasegenen im Genom von C. drobachiensis nahelegt. Die Plasmide pAC1 und pAC2 haben ein gemeinsames SalI-PstI-Fragment mit 5 kb (abgegrenzt durch die gepunkteten Linien in 2A) und die Plasmide pAC3 und pAC4 haben ein gemeinsames ClaI-PstI-Fragment mit 5 kb (abgegrenzt durch die gepunkteten Linien in 2B).
• Die beiden Fragmente wurden in das Phagemid pBluescript (Stratagene) subkloniert und werden pASP5 und pACP5 genannt, wie es in den 2A und 2B angegeben ist. Diese zwei Subklone haben einen Agarase +-Phänotyp.
• BEISPIEL 5:
• Analyse der Nukleotidsequenz der Agarosegene
• Die Plasmide pASP5 und pACP5 wurden verwendet, um an beiden Strängen die Nukleotidsequenzen der Agarase-Strukturgene zu bestimmen.
• Diese Sequenzierung wurde durch eine Technik durchgeführt, die dem Fachmann bekannt ist, nämlich das Sanger-Verfahren (SANGER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463–5467 (1977)), das auch Didesoxynukleotid-Verfahren genannt wird.
• Das pASP5-Insert wurde über 2980 bp ab der BamHI-Stelle bis zur HindIII-Stelle (begrenzt durch die Buchstaben B/S und H in 2A) sequenziert. Es enthält ein einziges offenes Leseraster (ORF) mit 1617 bp, agaA-Gen genannt. Dieses Gen hat die SEQ ID Nr. 1.
• Die erhaltene Nukleinsäuresequenz ist in 3A dargestellt. Zwei Hexamere TaGAaA und TATAtT, die mit den übereinstimmenden Promotoren ”–35” und ”–10” von E. coli kompatibel sind, wobei die Großbuchstaben dem übereinstimmenden Promotor von E. coli entsprechen (ROSENBERG, M & COURT, D., Ann. Bev. 13, 319–353, (1979)), und durch 15 Nukleotide getrennt sind, wurden 62 Nukleotide stromaufwärts von dem vermeintlichen Startcodon des agaA-Gens gefunden. In der untranslatierten 3'-Region wurde eine Transkriptionsterminationsschleife stromabwärts vom TAA-Stop-Codon, gefolgt von drei Tymidin-Resten, gefunden.
• Das pACP5-Insert wurde über 2440 bp zwischen den zwei EcoRI-Stellen (begrenzt durch die zwei Buchstaben E in 2B) sequenziert. Es enthält ein einziges vollständiges ORF mit 1059 bp, das agaB-Gen genannt wird, sowie ein partielles ORF. Das agaB-Gen hat die SEQ ID Nr. 3.
• Die erhaltene Nukleinsäuresequenz ist in 3B dargestellt. Zwei Hexamere, TTGAgA und TATtcT, die mit den übereinstimmenden Promotoren ”–35” und ”–10” von E. coli kompatibel sind und durch 17 Nukleotide getrennt sind, werden 43 Nukleotide stromaufwärts des vermutlichen Startcodons des agaB-Gens gefunden. In der nicht-translatierten 3'-Region wird eine Transkriptionsterminationsschleife stromabwärts des TAA-Stop-Codons, gefolgt von vier Thymidin-Resten, gefunden. Das zweite partielle ORF wird stromabwärts des agaB-Gens gefunden. Zwei Hexamere, TTGACc und TtaAtT, die durch 17 Nukleotide getrennt sind, werden ebenfalls gefunden, und zwar 39 Nukleotide stromaufwärts von dem vermeintlichen Startcodon des zweiten ORF.
• Der Chargaff-Koeffizient (GC%) jedes der Agarase-Gene A und B liegt zwischen 41 und 45%, was mit dem der Gattung Cytophaga übereinstimmt, der von REICHENBACH et al. gefunden wurde (30–45%; Genus Cytophaga, in Bergey's Manual of systematic bacteriology, 2015–2050 (1989)).
• BEISPIEL 6:
• Analyse der Aminosäuresequenz, die aus den Agarasegenen abgeleitet wird
• Das Translationsprodukt der agaA-Gens ist ein Protein mit 539 Aminosäuren, das ein theoretisches Molekulargewicht von 60001 kd aufweist. Die abgeleitete Aminosäuresequenz, SEQ ID Nr. 2, umfaßt das interne Peptid, das durch die Mikrosequenzierung der gereinigten Agarase A (in 3A unterstrichen) bestimmt wurde. Wie durch Analyse des Hydropathieprofils angegeben (KYTE et DOOLITLE, J. Mol. Biol., 157, 105–132 (1982)) entspricht der N-terminale Teil des Proteins einer sehr hydrophoben Domäne, was nahe legt, daß diese Domäne das Signalpeptid ist (VON HEIJNE, Eur. J. Biochem. 133, 17–21 (1983); J. Mol. Biol. 184, 99–105 (1985)). Nach der Von Heijne ”(–3, –1)”-Regel wird als die geeigneteste Spaltungsstelle der Signalpeptidase die zwischen Ala19 und Ala20 angegeben.
• Es soll betont werden, daß das Molekulargewicht des Proteins AgaA, das nach Entfernung des Signalpeptids, errechnet wird, das heißt etwa 57 768 kd, größer ist als das Molekulargewicht, das anfangs durch SDS-PAGE-Elektrophorese bestimmt wurde, das heißt 31 kd (siehe 1). Diese Differenz zeigt eine mögliche Transformation nach der Translation an, welche einen Großteil des C-terminalen Endes des Proteins entfernen würde.
• Das Translationsprodukt des agaB-Gens ist ein Protein mit 353 Aminosäuren, das ein errechnetes Molekulargewicht von 40 680 kd aufweist und das die abegleitete Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 4 hat. Die Analyse des Hydropathie-Profils zeigt ein sehr hydrophobes N-terminales Segment in einer Domäne von etwa 20 Aminosäuren. Allerdings gibt es keine Spaltungsstelle gemäß der von Heijne-”(–3, –1)”-Regel (oben). Dieses Segment scheint daher nicht spaltbar zu sein. Die Signalpeptid-Untersuchungsresultate, die mit der Software PSORT (Nakai's expert system PSORT) (NAKAI & KANEHISA, Proteins, Structure, Function and Genetics 11, 95–110 (1991)) erhalten wurden, legen nahe, daß das Protein eine nicht spaltbare N-terminale Signalsequenz aufweist, die als Transmembrananker wirkt. Es ist zu bemerken, daß die Sequenz LVFCCALLLGCGD in völliger Übereinstimmung mit der Signatur des N-terminalen Endes der prokaryontischen Lipoproteine steht (Prosite PS00013; BAIROCH et al., Nucl. Acids Res. 24, 189–196 (1995)). In diesem Fall wäre eine Spaltungsstelle zwischen den Resten G17 und C18 möglich. Diese Resultate legen nahe, daß AgaB ein Lipoprotein sein könnte, das in der internen Membran der Zelle lokalisiert ist.
• Das ORF, das auf das agaB-Gen folgt, kodiert für ein Protein, das eine signifikante Homologie mit der Protein-Familie DnaJ hat (OHKI et al., J. Biol. Chem. 261, 1778–1781 (1986)) (3B).
• BEISPIEL 7:
• Sequenzähnlichkeiten zwischen den Proteinen AgaA und AgaB von C. drobachiensis und mit anderen β-Glycanasen
• Die Sequenzähnlichkeiten zwischen den Proteinen AgaA und AgaB sind in 4 dargestellt. Das Protein AgaA zeigt eine 44,5%ige Identität und eine 65,7%ige Ähnlichkeit mit dem Protein AgaB. Zahlreiche Domänen sind in den Primärsequenzen von Ile110 bis Val287 ziemlich ähnlich (Numerierung der Agarase A-Sequenz). In einer der am besten konservierten Einheiten sind zwei Glutaminsäure-Reste vorhanden und durch 4 Aminosäuren getrennt (Glu147 und Glu152 in der AgaA-Sequenz und Glu184 und Glu189 in der AgaB-Sequenz, in 4 fettgedruckt). Diese Organisation ist charakteristisch für die katalytische Stelle der Familie 16 der Glycosid-Hydrolasen (HENRISSAT, Biochem. J. 280, 309–316 (1991)).
• Keine Sequenzähnlichkeit wurde mit den Agarasen des Stamms Vibrio sp. JT0107 gefunden (SUGANO et al., Appl. Environ. Microbiol. 59, 3750–3756 (1993); Biochim. Biophys. Acta 1218, 105–108 (1994)).
• Dennoch teilen die Agarasen (AgaA und AgaB) bedeutende Sequenzidentitäten mit den β-Agarasen von Alteromonas atlantica GenBank M73783 (BELAS et al., J. Bacteriol. 54, 30–37 (1988)) (53,5% und 48% mit AgaA bzw. AgaB) und von Streptomyces coelicolor (BUTTNER et al., Mol. Gen. Genet. 209, 101–109 (1987) (33% mit AgaA und mit AgaB).
• Diese Ähnlichkeiten werden auch nach dem HCA-Verfahren gezeigt (hydrophobic cluster analysis; LEMESLE-VARLOOT et al., Biochimie 72, 555–574 (1990)). 5 erläutert den HCA-Vergleich zwischen den Agarasen AgaA und AgaB, nämlich Agar A Cd bzw. Agar B Cd in der Figur, und anderen Enzymen der Familie 16 der Glycosid-Hydrolasen, das heißt β-Agarase von Altereomonas atlantica (Agar Aa), β-Agarase von Streptomyces coecicolor (AgarSc), κ-Carrageenase von C. drobachiensis (Kap Cd), Laminarinase von Rhodothermus marinus (Lam Rm), Lichenase von Bacillus macerans (Lich Bm) und Xyloglucanendotransglycosilase von Arabidopsis thaliana (XET At).
• Die zwei katalytischen Glu-Reste, die in der Lichenase von Bacillus macerans vorliegen, wurden als Ankerpunkte für den HCA-Vergleich angenommen und die Sequenzen wurden segmentiert, indem die bekannte dreidimensionale Struktur dieser Lichenase als Referenz genommen wurde.
• 13 Segmente unterschiedlicher Struktur (I–XIII) sind in 5 gezeigt, wobei die Segmente I, II, IX, X, XI und XIII am besten konserviert scheinen. Man kann sagen, daß das Segment VI für Agarasen in dieser Familie der Glycosid-Hydrolasen spezifisch ist und daß sich die katalytische Stelle im Struktursegment III befindet.
• BEISPIEL 8:
• Substratspezifitäten der rekombinanten Agarasen AgaA und AgaB
• Die Substratspezifitäten der Agarasen der Erfindung wurden untersucht, indem die Produkte, die aus dem Abbau von Neoagarododecaose durch die rekombinanten Agarasen AgaA und AgaB resultieren, analysiert wurden.
• Die Neoagarododecaose wurde wie folgt hergestellt: Agarose wurde durch Agarase unter Verwendung von 0,32 U/mg Polymer hydrolysiert. Die resistente Fraktion wurde in Isopropanol ausgefällt und die löslichen Oligosaccharide wurden durch präparative Ausschlußchromatographie an Bio-gel P2 (92 cm × 4,4 cm; 25°C; Elutionsmittel: destilliertes Wasser) fraktioniert. Die Detektion erfolgte mit einem Gerät zur Aufzeichnung des Differential-Brechungsindex (ROCHAS & HEYRAUD, Polymer Bull. 5, 81–86 (1981)). Die Oligomer-Fraktion, die Neoagardodecaose entspricht, wurde mit einem Rotationsverdampfer konzentriert und lyophilisiert.
• Die rekombinanten Klone von E. coli, die die Plasmide pAC1 und pAC4 (mit Agarase A- bzw. Agarase B-Aktivität) enthielten, wurden 12 h lang bei 37°C in 1 l LB-Medium (Luria-Bertani-Medium) kultiviert. Die Zellen wurden bei 2000 g für 20 min zentrifugiert, in 30 ml MES-Puffer resuspendiert und mit Hilfe einer French-Presse bei 20000 psi zum Platzen gebracht. Es wurde eine einstündige Zentrifugation bei 20000 g durchgeführt. Die Zellfragmente wurden verworfen und das Volumen des Überstands wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationszelle (Amicon, 10 kd-Abschaltgrenze) auf 5 ml reduziert.
• 500 μl jedes so erhaltenen Extrakts wurden zu 1 ml Neoagarododecaose in MES-Puffer (50 mg/ml) gegeben, dann wurde bei 37°C 18 h inkubiert. Der Polymerisationsgrad der Endprodukte wurde durch HPAE-Chromatographie bestimmt, wobei ein gepulster elektrochemischer Detektor und eine Anionenaustauschersäule (Carbo-PAC PA100, Dionex) unter den folgenden Bedingungen verwendet wurden:
  Durchflußgeschwindigkeit 1 ml/min; Puffer A: 150 mmol/l NaOH; Puffer B 500 mmol/l Natriumcetat in 150 mmol/l NaOH;
  Gradient:
• • 0 bis 5 min 70% A, 30% B;
• • 5 bis 16 min. 40% A, 60% B;
• • 16 bis 20 min 100% B.
• Die Resultate, die durch HPAE-Chromatographie (Hochdruck-Anionenaustauscher-Chromatographie) erhalten wurden, sind in den 6A bis 6C dargestellt, in denen die verschiedenen Abkürzungen die folgenden Bedeutungen haben:

  nC:	Nanocoulomb
  DP1:	Neoagarobiose
  DP2:	Neoagarotetraose
  DP3:	Neoagarohexaose
  DP4:	Neoagarooctaose
  DP5:	Neoagarodecaose
  DP6:	Neoagarododecaose
  DP7:	Neoagarotetradecaose
  DP8:	Neoagarohexadecaose

• Die Endprodukte aus der Hydrolyse von Neoagarododecaose durch Agarose A sind in 6B dargestellt und die durch Agarose B sind in 6C dargestellt. Durch Vergleich mit Neoagarodecaose ohne Enzym (6A) weist das Elutionsprofil nach 18-stündiger Verdauung in beiden Fällen (AgaA und AgaB) Neoagarotetraose (DP2) als Hauptprodukt und Neoagarohexaose (DP3) als Nebenprodukt auf.

  

  

  

  

  

  

  

  

  

Claims (10)

1. Isoliertes agaA-Gen, das für eine β-Agarase kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass es die SEQ ID Nr. 1 hat.
2. Isoliertes Gen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es für eine β-Agarase von Cytophaga drobachiensis, hinterlegt am 8. Mai 1998 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellen GmbH) unter der Nummer DSM 12170, kodiert.
3. Isoliertes Protein AgaA von C. drobachiensis DSM 12170, dadurch gekennzeichnet, dass es die SEQ ID Nr. 2 hat.
4. Peptid-Fragment AgaA' des Proteins nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es die SEQ ID Nr. 6 und β-Agarase-Aktivität hat.
5. Nukleinsäure, die für das Protein nach Anspruch 3 kodiert.
6. Nukleinsäure nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus a) der DNA-Sequenz SEQ ID Nr. 1, die für das Protein AgaA kodiert; b) einer DNA-Sequenz, die wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes von der SEQ ID NO: 1 stammt und für das Protein AgaA kodiert; oder c) einer entsprechenden mRNA-Sequenz besteht.
7. Nukleinsäure, die für das Peptid-Fragment nach Anspruch 4 kodiert.
8. Nukleinsäure nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus a) der DNA-Sequenz SEQ ID Nr. 5, die für das Peptid-Fragment AgaA' kodiert; b) einer DNA-Sequenz, die wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes von der SEQ ID NO: 5 stammt und für das Protein AgaA' kodiert; oder c) einer entsprechenden mRNA-Sequenz besteht.
9. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 bis 8 und die Mittel, die zu ihrer Expression notwendig sind, umfasst.
10. Wirts-Mikroorganismen oder -zellen, die durch einen Expressionsvektor nach Anspruch 9 transformiert sind, wobei die Zellen keine menschlichen embryonalen Stammzellen sind.

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